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FUNDAMENTOS DE CITOMETRIA DE FLUXO
Dayane Alves Costa
Priscilla Ramos Costa
Programa de Alergia e Imunopatologia- LIM 60
USP
CITOMETRIA DE FLUXO
CITO METRIA DE FLUXO
CÉLULA
MEDIDA
MOVIMENTO
Caracterização de célula em movimento
Primeiro Citômetro 1970- Henzenberg
O QUE É A CITOMETRIA DE FLUXO?
•É uma tecnologia que permite a medida simultânea de múltiplas
características de uma única célula.
•
FACS
•Tamanho relativo
•Complexidade interna
•Intensidade de fluorescência
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO
LABORATÓRIO CLÍNICO
• Análise de subpopulação linfocitária;
•Acompanhamento de pacientes HIV+
• Imunofenotipagem
de
células
tumorais
(leucemias
linfomas);
• Análise de DNA (Ciclo celular e ploidia de tumor);
• Contagem de reticulócitos;
• Quantificação de células progenitoras “stem cell”;
•Análises de moléculas de sinalização intracelular;
•Fatores de transcrição
e
CITOMETRIA DE FLUXO
•
Tipos de Amostras: Células; bactérias; Cromossomos; Beads
BD Biosciences
CITOMETRIA DE FLUXO
•
Tamanho da Amostra: 0,5 mm- 14mm
BD Biosciences
Vantagens
•Mede vários parâmetros em uma única célula;
• Muitas células analisadas simultaneamente;
•Variedade de anticorpos específicos;
•Analisar
simultaneamente
antígenos
intracitoplasmáticos e intranucleares ;
de
superfície,
» ~320 Anticorpos Monoclonais- proteínas identificadas
(moléculas de superfície, citocinas, moléculas de sinalização
intracelular e Intranuclear).
CITOMETRIA DE FLUXO
CD- Cluster of differentiation:
Moléculas – antígenos – que se expressam na superfície das células
específicas do sistema hematopoiético que as identificam e têm funções
diversas.
COMO SÃO DETECTADAS AS
CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA?
Detector de dispersão
de luz frontal
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente:
Laser de Argon a 488 nm
Clontech

Discovery Labware
Detector de dispersão de
luz em ângulo reto
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)

Immunocytometry Systems

Pharmingen
BD Biosciences
DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA
Fonte de Luz Incidente:
Laser de Argon a 488 nm
Laser Diode (vermelho) a
633 nm, 2º LASER
Detectores de
fluorescência:
FL1
FL2
FL3
DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA
Fonte de Luz Incidente:
Laser de Argon a 488 nm
Laser Diode (vermelho) a
633 nm, 2º LASER
Detectores de
fluorescência:
FL1
FL2
FL3
FLUORESCÊNCIA
É o comprimento de onda gerado pela excitação dos
fluorocromos após atingir a absorção máxima da luz do laser.
l = 488 nm
Fluoresceína
O
H
O
CO2H
Luz Incidente de
maior energía
Fluorocromo
l = 530 nm
Luz Fluorescente emitida
de menor energia e maior
comprimento de onda
Slide da Karina
ESPECTRO DE EMISSÃO
1000
800
FITC: ISOTIOCIANATO DE
FLUORESCEÍNA
600
PI
400
FITC
PE: FICOERITRINA
PerCP: PERIDININ CLOROPHIL
PROTEIN
PE
APC
200
APC: ALOFICOCIANINA
PerCP
PI: IODETO DE PROPÍDEO
0
400
450
500
550
600
650
Comprimento de onda (nm)
700
COMO SÃO DETECTADAS AS
CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA?
O CITÔMETRO NECESSITA DE UM
COMBINADO DE SISTEMAS
SISTEMA
FLUXO DA AMOSTRA
Aumentando a pressão da amostra aumenta a velocidade do fluxo,
permitindo que mais partículas passem através da célula de fluxo, NÃO PERDE
a qualidade da detecção mas Aumenta o numero de eventos eliminados por
causa da sobreposição .
Uma VELOCIDADE DE FLUXO MENOR é geralmente usada para aplicações
onde uma RESOLUÇÃO MAIOR É CRÍTICA, como nos estudos quantitativos e
para medidas de DNA.
Uma ALTA VELOCIDADE DO FLUXO é geralmente usada para medidas
qualitativas, tais como imunofenotipagem, onde os dados requerem menor
resolução, mas são adquiridos mais rapidamente.
FLUXO DA AMOSTRA
SISTEMA
COMO SÃO DETECTADAS AS
CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA?
Fonte de Luz Incidente:
Laser de Argon a 488 nm
BD Biosciences
SISTEMA
DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA
Fonte de Luz Incidente:
Laser de Argon a 488 nm
Laser Diode (vermelho) a
633 nm, 2º LASER
Detectores de
fluorescência:
FL1
FL2
FL3
Ativação Células T CD4+ e CD8+
250K
10
5
250K
250K
250K
200K
200K
200K
150K
150K
150K
200K
104
3
0
100K
50K
95.9
0
0
50
100
0
150
Time
50K
100K
50K
50K
0 10
100K 150K 200K 250K
2
10
3
5
0.415
10
CD38
<AmCyan-A>: CD8
CD8+
4
10
3
10
14.6
30.1
4
10
3
10
2
10
2
10
CD4+
0
4.4
2
0 10
3
10
4
10
<Pacific Blue-A>: CD4
5
10
10
2
5
3
0 10
10
4
10
5
10
<PE-Texas Red-A>: CD3
CD3
5
10
31.9
4.44
250K
200K
4
10
150K
3
10
100K
3.15
2
10
0
52.8
4
CD4+
<PerCP-Cy5-5-A>: CD38
42.4
<PerCP-Cy5-5-A>: CD38
5
10
Live/dead
FSC-A
FSC-A
0
0
0
53.8
50K
50K
56.1
0
100K 150K 200K 250K
150K
100K
100K
CD8+
10
SSC-A
94.2
SSC-A
FSC-H
PE
10
99.9
50K
0
37.6
17.7
2
0 10
3
10
4
5
10
10
<Alexa Fluor 700-A>: HLA-DR
HLA-DR
57.4
6.24
2
0 10
3
10
4
10
<Alexa Fluor 700-A>: HLA-DR
5
10
0
0 10
2
CCR5
10
3
10
4
10
5
IMUNOFENOTIPAGEM
Exemplos
anti-CD3 FITC
anti-CD4 PE
anti-CD8 PerCP
anti-IL-4 APC
Células
Análise no
Citômetro
+
Lavar
Incubar
Células marcadas
Anticorpos
IMUNOFENOTIPAGEM
Quanto maior o número de marcadores de
superfície, maior a intensidade de fluorescência
+
Intensidade de fluorescência
BD Biosciences
+
Slide da Karina
IMUNOFENOTIPAGEM
Quanto maior o número de marcadores de
superfície, maior a intensidade de fluorescência
BD Biosciences
Caracterização de células do
Sistema Imune
•Detecção de marcadores de superfície de células;
•Detecção de fatores intracelulares;
•Detecção de fatores detectados pelas células;
•Detecção do conteúdo de DNA.
IMUNOFENOTIPAGEM
IDENTIFICAÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES
PELOS SEUS MARCADORES DE SUPERFÍCIE.
IMUNOFENOPTIPAGEM
SANGUE TOTAL
PBMC
Slide da Karina
Marcação INTRACELULAR
Slide da Karina
Ontogenia de células T
CD4+
5
10
73.9
CD8+
2.29
CD45RA+
250K
10
2.29
CD45RA+
200K
1
5
10
<FITC-A>: CD45RA
CD45RA
4
10
10
1
22.8
0
<PE-Cy7-A>: CCR7
2
3
10
4
10
5
10
<FITC-A>: CD45RA
5
6
5
10
0 10
10
3
10
10
0
96.2
CD45RA
2.91
CD45RA-
0.0753
2
CD27
4
10
78.2
50K
0.171
3
0 10
5
CD27
3
10
20.3
10
2
2
5
5
10
0 10
3
10
4
5
10
10
<PE-Cy7-A>: CCR7
81.7
CD45RA-
3
2
0.425
4
10
3
4
3
<PE-A>: CD27
2
150K
100K
23.1
50K
0 10
<PE-A>: CD27
6
2
0
4
3
10
10
0
22.1
73.4
10
SSC-A
<PE-A>: CD27
150K
<PE-A>: CD27
SSC-A
200K
100K
74.8
5
250K
4
2
10
10
3
10
2
10
0
2
0.868
4
10
0
0.0431
2
3
0 10
10
4
10
17.6
5
10
<PE-Cy7-A>: CCR7
4
CCR7
0.0759
2
0 10
3
10
4
5
10
10
<PE-Cy7-A>: CCR7
1Naïve
2-Memória
Central
3-Memória
transicional
4-Memória
Efetora
CCR7
5-Efetora
Terminal
CD45RA
+
-
-
-
+
+
CD27
+
+
+
-
-
+
CCR7
+
+
-
-
-
-
Naive/Memória
6-??
5
250K
250K
250K
250K
200K
200K
200K
200K
150K
150K
150K
99.2
100K
100K
100K
95.9
102
live
150K
100K
76
96.4
50K
50K
SSC-A
SSC-A
103
SSC-A
FSC-H
104
50K
50K
0
100
0
150
50K
100K
150K
200K
50K
100K
150K
200K
250K
0 10
FSC-A
CD3+
0
0
0
250K
FSC-A
Time
2
10
3
10
4
10
0 10
5
2
Células T CD4+ reguladoras (Tregs)
5
104
0.867
T reg supressor
CD25high
103
68
CD127
CD25
<PE-Cy7-A>: CD25
10
102
0
0 10
2
CD4
10
3
10
4
10
46.7
50
T regs
5
CD39
FoxP3
<Pacific Blue-A>: CD4
Células T CD4+ indutoras (Tind)
10
5
10
4
10
3
10
2
10
5
10
4
4.89
2.2
7.77
53.6
CD25
103
0
0 10
2
CD3
10
3
10
4
10
5
10
2
0
90.3
0 10
2.57
2
FoxP3
10
3
10
4
10
5
CD39
10
3
10
4
<PE-Texas Red-A>: CD3
<Indo-1 (Violet)-A>: UV
CD4
50
69
0
0
0
CD4
<PE-A>: Foxp3
10
10
5
Ativação Células T CD4+ e CD8+
10
100
5
250K
250K
250K
200K
200K
200K
150K
150K
93.2
SSC-A
FSC-A
FSC-H
103
95.7
150K
100K
100K
100K
50K
50K
50K
102
85.5
0
0
40
Time
60
0
0
80
50K
100K
150K
FSC-A
200K
0
0
250K
10
2
3
4
10
10
<AmCyan-A>: LIVE/DEAD
10
5
0
3
4
10
10
<PE-Texas Red-A>: CD3
10
10
10
5
60.2
0.128
<PerCP-Cy5-5-A>: CD38
20
5
5
29.5
5.26
104
103
102
0
104
61.7
0
3.57
2
3
4
10
10
10
<Alexa Fluor 700-A>: HLA-DR
10
5
103
10
102
0
10.6
0
29.1
10
2
3
4
10
10
<Pacific Blue-A>: CD 4
10
5
<PerCP-Cy5-5-A>: CD38
0
<APC-A>: CD8
<PE-A>: CD27
104
5
35.2
1.54
104
103
102
0
61
2.33
0
2
3
4
10
10
10
<Alexa Fluor 700-A>: HLA-DR
10
5
AGRADECIMENTOS
Prof. Dr. Esper G. Kallas
Nádila Millan
Todos os colaboradores