claudio henrique magalhães aranha influência da senescência

CLAUDIO HENRIQUE MAGALHÃES ARANHA
INFLUÊNCIA DA SENESCÊNCIA SOBRE ASPECTOS
HISTOPATOLÓGICOS HEPÁTICOS E ESPLÊNICOS NA
ESQUISTOSSOMOSE MANSONI MURINA
GOVERNADOR VALADARES
AGOSTO DE 2009
CLAUDIO HENRIQUE MAGALHÃES ARANHA
INFLUÊNCIA
DA
SENESCÊNCIA
HISTOPATOLÓGICOS
HEPÁTICOS
SOBRE
E
ASPECTOS
ESPLÊNICOS
NA
ESQUISTOSSOMOSE MANSONI MURINA
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciências Biológicas da
Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas na
área de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
ORIENTADORA: Drª Elaine Speziali
CO-ORIENTADORAS: Drª Cláudia Martins Carneiro
Drª Alda Maria Soares Silveira
GOVERNADOR VALADARES
AGOSTO DE 2009
CLAUDIO HENRIQUE MAGALHÃES ARANHA
INFLUÊNCIA
DA
HISTOPATOLÓGICOS
SENESCÊNCIA
HEPÁTICOS
SOBRE
E
ASPECTOS
ESPLÊNICOS
NA
ESQUISTOSSOMOSE MANSONI MURINA
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciências Biológicas da
Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas na
área de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Governador Valadares, ___ de ________________ de ______.
Banca Examinadora:
_____________________________________________
Examinador(a)
____________________________________________
Examinador(a)
Dedico esse trabalho a Deus, Pai sempre presente,
por me dar forças e me permitir buscar a felicidade
e a meus pais por sempre estarem ao meu lado,
me mostrando o caminho certo,
e me ajudarem incondicionalmente nessa busca.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, professora doutora Elaine Speziali, cuja orientação permitiu a realização
deste estudo.
Às minhas co-orientadoras, professora doutora Cláudia Martins Carneiro e Alda Maria Soares
Silveira, pelas informações, ensinamentos e pela amizade.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Imunologia da UNIVALE e do Laboratório de
Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas da UFOP pelo constante apoio e incentivo.
Aos professores do curso de Mestrado em Ciências Biológicas da UNIVALE pelos
ensinamentos que contribuíram para meu crescimento e formação profissional.
À minha irmã Thereza pelo exemplo em toda vida.
Aos meus pais e familiares, por sempre acreditarem em mim.
Àqueles participantes deste estudo, pela oportunidade de me integrar ao projeto e adquirir
conhecimento.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
EXECUÇÃO DO TRABALHO:
Laboratório de Pesquisa em Imunologia da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE),
Governador Valadares, MG.
Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto (NUPEB – ICEB UFOP), Ouro Preto, MG.
COLABORADORES:
Dra. Ana Maria Caetano de Faria
Depto de Bioquímica e Imunologia - UFMG
Dr. Paulo Marcos Z. Coelho
Centro de Pesquisas René Rachou – Fiocruz- MG
Dra. Andréa Teixeira de Carvalho
Centro de Pesquisas René Rachou
Dr. Olindo Assis Martins Filho
Centro de Pesquisas René Rachou- Fiocruz- MG
Dra. Débora Negrão Corrêa
Grupo Intradepartamental de Estudos sobre Esquistossomose (GIDE) - UFMG
ÓRGÃOS FINANCIADORES:
Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG
Centro de Pesquisas René Rachou – CPqRR / FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz/Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
FIOCRUZ/CNPq (PAPES IV)
Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE
RESUMO
A senescência e o processo de envelhecimento são o resultado complexo de interações entre a
genética do indivíduo e o meio ambiente. Esse processo é marcado por alterações funcionais
bem descritas tanto em humanos quanto em uma variedade de animais, principalmente em
roedores. As alterações funcionais e estruturais dos tecidos associadas ao processo de
envelhecimento indicam uma menor capacidade de fornecer um ambiente propício para
respostas imunes. Essas alterações são observadas em infecções por doenças parasitárias e a
esquistossomose é uma das doenças parasitárias humanas de maior distribuição, acometendo
histopatologicamente o fígado e o baço. Evidenciam-se diferenças em aspectos relacionados
tanto à prevalência quanto à intensidade de infecção da esquistossomose com o
envelhecimento. O modelo murino é importante nesse aspecto, pois apresenta semelhanças
aos acometimentos demonstrados em humanos e vantagens para realização dos estudos. O
objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da senescência sobre os aspectos
histopatológicos hepáticos e esplênicos na esquistossomose mansoni murina. Os resultados
demonstraram que jovens apresentam maior número de granulomas hepáticos na fase crônica
em relação aos jovens na fase aguda. Em relação à área dos granulomas hepáticos, jovens na
fase crônica apresentaram granulomas com menor área que jovens na fase aguda e que idosos
na fase crônica. Quanto ao processo inflamatório no fígado, idosos na fase aguda
apresentaram maior inflamação que jovens na mesma fase de infecção. Em relação à
neoformação de colágeno, no tecido hepático não houve diferença entre os grupos de animais
infectados jovens e idosos. Entretanto, no baço, animais idosos na fase aguda de infecção
apresentaram maior neoformação de colágeno que jovens na mesma fase. Além disso, animais
jovens na fase crônica da infecção apresentaram maior neoformação de colágeno no baço que
jovens na fase aguda. O estudo fornece evidências que suportam a hipótese de uma
capacidade do organismo senescente de modular sua resposta já no início da infecção por S.
mansoni e uma menor capacidade desse organismo de amplificar sua resposta a novos
antígenos.
Palavras chave: senescência, esquistossomose, granuloma, fígado, baço, inflamação,
colágeno.
ABSTRACT
Senescence and aging are the result of complex interactions between genetic individual and
the environment. This process is marked by functional changes well described both in humans
and in a variety of animals, especially rodents. The functional and structural changes of the
tissues associated with the aging process indicate a lower capacity to provide an environment
conducive for immune responses. These changes are observed in infections and parasitic
diseases and the schistosomiasis is a human parasitic diseases of major distribution, affecting
histopathologically the liver and spleen. Are striking differences in aspects related to both
prevalence and intensity of schistosomiasis infection with aging. The mouse model is
important in this aspect, because it shows similarities to the affection demonstrated in humans
and advantages for the studies. The aim of this study was to evaluate the influence of
senescence on the histopathological hepatic and splenic aspects of the murine schistosomiasis
mansoni. The results showed that young animals have a higher number of hepatic granulomas
in chronic phase in comparison to animals in the acute phase. Regarding the area of the
hepatic granulomas, animals in chronic phase showed smaller granulomas area than youth in
the acute phase and than elderly animals in chronic phase. On the hand, elderly animals in the
acute phase showed more inflammation than young animals in the same stage of infection.
Regarding the neoformation of collagen, in the liver tissue, there was no difference between
young and old infected groups. However, in the spleen, the elderly animals in the acute phase
of infection had higher neoformation of collagen than young animals in the same phase.
Furthermore, young animals in the chronic phase of infection showed larger amount of
neoformation of collagen in the spleen than young animals in the acute phase. The study
provides evidence supporting the hypothesis that a senescent organism has the ability to
modulate its response in the early phase of the infection by S. mansoni and has also a lower
capacity to amplify its response to new antigens.
Key words: senescence, schistosomiasis, granuloma, liver, spleen, inflammation, collagen.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens e idosos infectados por
Schistosoma mansoni--------------------------------------------------------------------------------------
31
Figura 2 – Fotos da quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens e idosos
infectados por Schistosoma mansoni--------------------------------------------------------------------
32
Figura 3 – Determinação da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens e idosos
infectados por Schistosoma mansoni--------------------------------------------------------------------
33
Figura 4 – Fotos da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens e idosos
infectados por Schistosoma mansoni--------------------------------------------------------------------
34
Figura 5 – Análise da inflamação no fígado de camundongos jovens e idosos infectados por
Schistosoma mansoni--------------------------------------------------------------------------------------
36
Figura 6 – Fotos da inflamação no fígado de camundongos jovens e idosos infectados por Schistosoma
mansoni------------------------------------------------------------------------------------------------------
37
Figura 7 – Análise da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens e idosos infectados
por Schistosoma mansoni----------------------------------------------------------------------------------
39
Figura 8 – Fotos da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens e idosos infectados
por Schistosoma mansoni----------------------------------------------------------------------------------
40
Figura 9 – Análise da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens e idosos infectados
por Schistosoma mansoni----------------------------------------------------------------------------------
42
Figura 10 – Fotos da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens e idosos infectados
por Schistosoma mansoni----------------------------------------------------------------------------------
43
Figura 11 – Análise dos dados parasitológicos referentes à infecção por Schistosoma mansoni em
animais idosos e jovens------------------------------------------------------------------------------------
44
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------------------- 10
2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA-------------------------------------------------------- 20
3 OBJETIVO GERAL---------------------------------------------------------------------------- 22
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS----------------------------------------------------------------- 22
4 METODOLOGIA------------------------------------------------------------------------------- 23
5 RESULTADOS---------------------------------------------------------------------------------- 30
5.1 NÚMERO E TAMANHO DE GRANULOMAS HEPÁTICOS DE CAMUNDONGOS
JOVENS E IDOSOS ------------------------------------------------------------------------------ 30
5.2 ANÁLISE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA PRESENTE NO FÍGADO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS------------------------------------------------------ 35
5.3
ANÁLISE
DA
NEOFORMAÇÃO
DE
COLÁGENO
NO
FÍGADO
DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS------------------------------------------------------- 38
5.4 ANÁLISE DA NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO BAÇO DE CAMUNDONGOS
JOVENS E IDOSOS------------------------------------------------------------------------------- 41
5.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS---------------------------------------- 44
6 DISCUSSÃO------------------------------------------------------------------------------------ 45
6.1 NÚMERO E TAMANHO DE GRANULOMAS HEPÁTICOS DE CAMUNDONGOS
JOVENS E IDOSOS -----------------------------------------------------------------------------
47
6.2 ANÁLISE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA PRESENTE NO FÍGADO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS-----------------------------------------------------
50
6.3 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO FÍGADO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS-----------------------------------------------------
52
6.4 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO BAÇO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS-----------------------------------------------------
52
6.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS---------------------------------------
53
7 CONCLUSÃO---------------------------------------------------------------------------------- 54
REFERÊNCIAS----------------------------------------------------------------------------------- 55
10
1 INTRODUÇÃO
1.1 ALTERAÇÕES ASSOCIADAS AO PROCESSO DE ENVELHECIMENTO
O envelhecimento é o resultado complexo de interações entre a genética do indivíduo e
o meio ambiente no qual está inserido. Esse processo afeta uma grande variedade de funções
fisiológicas, incluindo o desenvolvimento e manutenção do sistema imune. O processo de
senescência, como fonte de alterações funcionais, tem sido bem descrito em humanos e em
uma variedade de espécies animais, principalmente em roedores. Essas modificações podem
ser observadas tanto nos órgãos linfóides quanto em células do sistema imune. Um dos
principais efeitos do envelhecimento pode ser observado no timo. Tal órgão representa o sítio
de maturação dos linfócitos T a partir de seus precursores da medula óssea. O timo é dividido
em medula interna e córtex externo, sendo a ultima, a porção que sofre atrofia com o processo
de senescência. A atrofia tímica associada ao progressivo envelhecimento, leva a redução do
tecido tímico funcional e ao declínio na geração de células T aí presentes (Takeoka et al.,
1996;Gruver et al., 2007;Jenkinson et al., 2008).
Há evidências na literatura de que o envelhecimento também estaria relacionado a
mudanças arquiteturais nos tecidos linfóides secundários como o aumento do peso do baço
devido à infiltração de fibroblastos, além da diminuição do córtex linfóide e dos centros
germinativos com a idade. Além disso, nos linfonodos há um declínio nas zonas medular e
paracortical, aumento do tecido adiposo e uma menor evidência de formação de centros
germinativos em idosos. Essas mudanças indicam uma menor capacidade de fornecer um
ambiente propício para respostas imunes, mas o impacto disso na resposta efetiva ainda é
desconhecido (Gruver et al., 2007).
Existem relatos de alterações no fenótipo das células T periféricas com a idade em
modelo murino. Tais alterações poderiam incluir mudanças em receptores de adesão (CD44),
receptores ligados a migração de linfócitos para linfonodos periféricos (CD62L) e marcadores
característicos dos fenótipos de “memória” ou “virgem” (CD45R) das células T CD4+ e
CD8+. Connoy e colaboradores (2001) encontraram mudanças associadas ao envelhecimento
na composição de esplenócitos (em murinos), incluindo aumento na freqüência de células B e
células TCD4 de memória, diminuição nas células T γ/δ e células T CD4 virgem. Outras
mudanças também foram documentadas em células do sistema imune de camundongos
11
associadas ao envelhecimento, tais como mudanças na quantidade de linfócitos T CD4+ e na
proporção de células CD4+/CD8+ em tecidos periféricos (Ernst et al., 1993;Barrat et al.,
1995;Kurashima and Utsuyama, 1997;Timm and Thoman, 1999;Gruver et al., 2007;Pinchuk
and Filipov, 2008).
Como relatado anteriormente, há uma modificação no percentual de células T virgens e
de memória na periferia. Há relatos de que células T virgens de camundongos idosos exibam
uma ativação, diferenciação e produção de citocinas reduzidas. Especificamente, células Th1
e Th2 de memória derivadas de células T virgens de animais idosos produzem muito menos
IL-2, IL-4 e IL-5, respectivamente, que células jovens (Haynes et al., 2003;Haynes et al.,
2005). O aumento dramático na produção constitutiva de IL-6 e IL-10 observada em animais
e humanos idosos parece estar relacionado a vários distúrbios na reatividade imunológica
relacionados ao processo de senescência (Daynes et al., 1993). Além disso, observou-se que
as alterações no perfil de citocinas relacionadas ao envelhecimento ocorrem gradualmente ao
longo da vida do animal ou do indivíduo e não abruptamente no animal já senil (Hobbs et al.,
1993).
Essa alteração no perfil de citocinas produzidas reflete mudanças importantes
observadas durante o envelhecimento como: o acúmulo de linfócitos T expressando um
fenótipo de células ativadas, resultado do processo natural e cumulativo de ativação e da
diminuição no aporte de células virgens do timo; mudanças nas interações com as células
apresentadoras de antígeno que também apresentam alterações com o envelhecimento;
alterações na transmissão de sinais nos linfócitos durante o envelhecimento que poderiam
afetar a forma como o indivíduo ou animal interagem com o ambiente externo, principalmente
no caso de injúrias (Daynes et al., 1993; Hobbs et al., 1993; Gruver et al., 2007).
Uma série de trabalhos tem relatado também modificações na resposta humoral
associadas ao envelhecimento. Essa resposta reduz com a idade, mesmo que não haja
mudanças no número de células B periféricas. Ocorrem modificações no repertório de
anticorpos com o envelhecimento, diminuição na produção de células B virgens na medula
óssea (Shi and Miller, 1992;Miller and Cancro, 2007;Gruver et al., 2007).
A literatura também aponta uma forte associação entre resistência a infecções e
reinfecções por parasitos helmínticos, especialmente por helmintos do gênero Schistosoma e
senescência em humanos (Ndhlovu et al., 1996), entretanto há uma escassez de trabalhos na
literatura com essa associação em camundongos. Foi demonstrado que a prevalência e a
intensidade de infecção, dada pela presença e quantificação, respectivamente, dos ovos nas
fezes ou urina dos indivíduos infectados, aumentam progressivamente com a idade
12
alcançando um pico máximo entre dez e vinte anos. Nas subseqüentes décadas de vida, tanto a
prevalência quanto a intensidade de infecção diminuem progressivamente (Wilkins et al.,
1987;Butterworth et al., 1988;Gryseels, 1994;Fulford et al., 1998;Ouma et al., 1998;Naus et
al., 2003). A explicação para essa característica epidemiológica ainda é controversa. Alguns
autores acreditam que essa diferença se deve a uma mudança de comportamento, ou seja, uma
redução dos níveis de exposição à água contaminada com a idade. Embora haja um consenso
que ocorra uma pequena redução nos níveis de exposição dos indivíduos com a idade, ela é
insuficiente para explicar a grande redução na intensidade de infecção, cuja causa foi
atribuída ao desenvolvimento de uma resistência adquirida com a idade (Butterworth et al.,
1988). Diante dessas evidências, fica clara a necessidade de se estabelecer correlações entre o
processo de senescência e o desenvolvimento das lesões associadas à esquistossomose
(Wilkins et al., 1987;Butterworth et al., 1988;Gryseels, 1994;Fulford et al., 1998;Ouma et al.,
1998;Naus et al., 2003). Além disso, trabalhos que associem o desenvolvimento da morbidade
da esquistossomose com o envelhecimento no modelo murino podem ser muito úteis na
investigação dessa doença, pois vários trabalhos mostram semelhanças tanto no
desenvolvimento da doença, quanto nas alterações associadas ao envelhecimento entre
humanos e murinos.
1.2 A ESQUISTOSSOMOSE MANSONI
A esquistossomose mansônica é uma das doenças parasitárias humanas de maior
distribuição, sendo a segunda doença tropical em importância em todo o mundo, precedida
apenas pela malária (WHO 1985). Cerca de 200 milhões de pessoas estão infectadas e 700
milhões sob risco de infecção, causando em torno de 500 mil mortes anualmente (Chitsulo et
al., 2000;Wilson et al., 2007). É uma doença prevalente em várias regiões do mundo e no
Brasil, particularmente no estado de Minas Gerais, e representa um dos principais problemas
de saúde pública (Savioli et al., 1997;Chitsulo et al., 2000b). De acordo com a Organização
Mundial de Saúde, 74 países são endêmicos para a esquistossomose mansônica (WHO 1985).
No Brasil, cerca de 12 a 14 milhões de pessoas estão infectadas pelo Schistosoma mansoni (S.
mansoni), (Conceição et al., 2007).
13
Além do Schistosoma mansoni, única espécie encontrada no Brasil, outras espécies do
gênero Schistosoma também podem infectar o homem como Schistosoma haematobium,
Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum e Schistosoma mekongi (Neves 2005).
Sua transmissão ocorre pelo contato com água contaminada com a forma infectante do
parasito, a cercária que penetra ativamente na pele do hospedeiro definitivo, perde a cauda e
transforma-se em esquistossômulo. Este migra através da corrente sanguínea e/ou vasos
linfáticos para os pulmões, e localizando-se, posteriormente, na veia porta, onde se
transformam em vermes adultos, macho e fêmea. Nas veias mesentéricas inferiores, os vermes
se acasalam e as fêmeas iniciam a postura de ovos. Cada fêmea elimina aproximadamente 400
ovos por dia na parede de capilares e vênulas, sendo que a maioria chega à luz intestinal (esse
período dura aproximadamente seis dias), onde são eliminados junto com o bolo fecal. Parte
dos ovos fica retido nos tecidos onde se tornam alvo da resposta imune do hospedeiro,
induzindo uma reação inflamatória do tipo granulomatosa. Quando eliminados pelas fezes e
em contato com a água, os ovos eclodem liberando o miracídio que infecta o caramujo, seu
hospedeiro intermediário (Biomphalaria glabrata). No caramujo, há o desenvolvimento do
esporocisto em cercária, a forma infectante da esquistossomose. Ao entrar em contato com a
água contaminada, a cercária penetra na pele do indivíduo reiniciando o ciclo. (BOGLIOLO,
1959;Warren, 1968;Pearce and MacDonald, 2002).
As manifestações clínicas da esquistossomose variam, dependendo da localização e
intensidade do parasitismo, da capacidade de resposta do indivíduo à infecção ou do
tratamento prescrito. A doença em humanos é caracterizada clinicamente pelas fases aguda e
crônica. A fase aguda pode ser dividida em pré e pós-postural. Na fase pré-postural, que
ocorre cerca de 10-30 dias após a infecção e algumas horas após a penetração das cercarias
na pele, observa-se um infiltrado de leucócitos polimorfonucleares ao redor dos parasitos.
Inicialmente, após a penetração das cercárias, pode ocorrer um quadro de dermatite
cercariana, caracterizado por dermatite urticariforme com eritema, edema e prurido (Torres,
1976;Boros, 1989). A fase aguda propriamente dita aparece em torno de 50 dias e dura até
cerca de 120 dias após a infecção. Na fase pós-postural ocorre a disseminação dos ovos,
principalmente na parede do intestino e no fígado, provocando, então, a formação de
granulomas cujo volume pode chegar até 100 vezes o volume do ovo. Os sintomas
característicos desta fase são: febre acompanhada de sudorese, calafrios, emagrecimento,
diarréia, cólica e alterações nas funções hepáticas. Também são observadas lesões
hepatoesplênicas, devidas principalmente a uma reação de hipersensibilidade do hospedeiro
aos antígenos solúveis secretados pelos ovos presentes no fígado. Essa reação que é mais
14
intensa no início da infecção decresce espontaneamente na fase crônica da doença. A fase
crônica apresenta variações clínicas dependendo dos órgãos atingidos. Inicia-se por volta do
6º mês após a infecção e é caracterizada pela redução do tamanho dos granulomas em torno
dos ovos, por uma modulação da reatividade imunológica inflamatória, que aparece de
maneira mais esparsa no fígado e também na mucosa e submucosa do intestino. As principais
formas clínicas da fase crônica são: intestinal, hepatointestinal e hepatoesplênica. A forma
intestinal é a mais freqüentemente encontrada em pacientes infectados. Nesta forma, os
sintomas são geralmente brandos: com perda de apetite, dispepsia e desconforto abdominal.
Embora não existam estudos detalhados relacionados à forma hepatointestinal, pacientes
portadores dessa forma clínica apresentam uma hepatomegalia não associada à
esplenomegalia. A forma hepatoesplênica é a forma mais grave da esquistossomose mansoni e
caracteriza-se pelo aumento considerável do baço e do fígado em conseqüência da fibrose
periportal, central e periférica, que pode levar a complicações significativas como hipertensão
porta e pulmonar (Lambertucci et al., 2000).
O estabelecimento da doença em camundongos infectados também se dá pelo
desenvolvimento de uma resposta granulomatosa, caracterizada pela formação de granulomas,
induzidos por antígenos solúveis do ovo (SEA), compostos por linfócitos T, linfócitos B,
macrófagos, eosinófilos e células epitelióides e gigantes. Ao longo do curso da infecção, na
qual há a passagem da fase aguda (70 dias) para a fase crônica (120 dias) também se observa
a modulação desses granulomas. Os animais apresentam alguns sintomas, tais como diarréia
durante a fase aguda e, pequenas lesões na mucosa intestinal que podem levar a morte através
do seu sangramento. Além disso, observam-se lesões glomerulares e insuficiência renal. Mas,
não são observadas varizes esofageanas. Em relação à hipertensão portal, ela está associada ao
número e tamanho dos granulomas (Wynn et al., 2004).
1.3 ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DA ESQUISTOSSOMOSE
Parasitos adultos de Schistosoma mansoni vivem na vasculatura portal, onde as fêmeas
realizam a ovoposição. Os ovos passam da parede intestinal para o lúmen desse órgão e a
partir daí para meio externo juntamente com as fezes. Além disso, como o sistema porta é
responsável pela irrigação sanguínea do fígado, com a oviposição que ocorre nessa
15
vasculatura muitos dos ovos são transportados para esse órgão (Dunne and Doenhoff,
1983;Amiri et al., 1992;Cheever et al., 2000;Pearce and MacDonald, 2002).
O fígado é um órgão bem localizado e recebe 25% do debito cardíaco e é a maior fonte
de linfa do corpo, contribuindo com 25 a 50% do fluxo do Ducto Torácico. Ele tem sido
considerado um órgão relativamente inerte no seu estado normal, não inflamado, sob ponto de
vista imunológico. Entretanto essa visão tem mudado nos últimos anos. Pesquisadores têm
observado que o fígado possui propriedades distintas (Bertolino et al, 2002 apud Crispe IN &
Mehal WZ, 1996; O’Farrelly C & Crispe IN, 1999; Bertolino P et al, 2000). A função
fisiológica do fígado – tais como remover patógenos e antígenos do sangue, síntese de
proteínas e metabolismo – requer uma resposta imune que é adaptada a essas necessidades e é
localmente regulada (Knolle & Gerken, 2000). A maior parte do suprimento sanguíneo
hepático é provido pela veia Porta, que leva nutrientes, toxinas e antígenos derivados do trato
gastrointestinal, assim como substâncias derivadas do baço. Isso permite que moléculas
absorvidas pelo intestino passem pelo fígado, onde são metabolizadas ou degradadas se
tóxicas. Como o fígado recebe uma variedade de antígenos estranhos, é importante evitar uma
ativação desnecessária do sistema imune. Isso é conseguido através da tolerância a esses
antígenos. O contato com esses antígenos leva a uma tolerância antígeno-específico que
previne uma ativação excessiva do sistema imune evitando dano tecidual. A infecção do
fígado por microrganismos patogênicos deve levar a uma indução de uma resposta imune
efetiva que elimina a infecção e previne o desenvolvimento de cronicidade. Assim, o fígado
parece ser um órgão imune privilegiado que favorece a indução da tolerância periférica assim
como a indução da imunidade (Bertolino et al, 2002; Knolle & Gerken, 2000).
O fígado é constituído principalmente por células hepáticas, os hepatócitos. Estes se
agrupam em placas que se anastomosam entre si formando unidades morfológicas chamadas
lóbulos hepáticos. Estas placas possuem capilares, chamados de sinusóides, que se
caracterizam pelas suas dilatações irregulares. Suas paredes são revestidas de células
endoteliais típicas e macrófagos que, no fígado, recebem o nome de células de Kupffer e
possuem função fagocitária. Além dos hepatócitos e células de Kupffer, o fígado possui um
subtipo incomum de linfócitos; mais de 50% dos linfócitos intra-hepáticos em um fígado de
camundongo normal expressa níveis intermediários de receptor de células T α/β (TCR) e o
marcador de células NK, NK1.1 (células T NK). Uma população equivalente também é
descrita em humanos (Bertolino et al, 2002 apud MacDonald, 2002; Bertolino et al, 2002
apud Doherty et al, 1999). Essa intrigante população de células T NK é também encontrada
com alta freqüência no timo e medula óssea. A maioria das células T CD4+NK são CD1-
16
restritas e podem prontamente secretar ambos os tipos de citocinas Th1 e Th2 após o estímulo
(Bendelac et al, 1997). A interação entre essas diferentes populações celulares encontradas no
fígado e os antígenos liberados pelos ovos do parasito, também presentes nesse órgão,
favorece uma adequada modulação da resposta granulomatosa desenvolvida durante o
processo da esquistossomose. Além disso, recentes relatos têm mostrado que a falta de células
T NK favorece a autoimunidade, entretanto a função dessas células no fígado ainda é
desconhecida (Bertolino et al, 2002 apud Hammond et al, 1998).
As lesões histopatológicas da esquistossomose são resultantes da reação inflamatória
granulomatosa aos ovos do parasito localizados nos tecidos hepáticos (Boros, 1989;Abath et
al., 2006;Gryseels et al., 2006;Lins et al., 2008). Essa resposta inflamatória granulomatosa, o
granuloma, resulta da reatividade do hospedeiro aos antígenos solúveis do ovo (Weinstock
and Blum, 1987). Antígenos liberados pelos de ovos induzem uma marcada resposta imune
caracterizada pela presença de células Th2 que guia o desenvolvimento de lesões
granulomatosas no fígado. A natureza protetora dessas lesões tem sido demonstrada por
estudos no modelo de infecção em camundongos (Dunne and Doenhoff, 1983;Amiri et al.,
1992;Cheever et al., 2000;Pearce and MacDonald, 2002).
Inflamação é uma resposta protetora do organismo à lesão tecidual e celular por
patógenos, sendo uma resposta primordial para eliminar ou neutralizar organismos ou
substâncias estranhas (Lawrence and Gilroy, 2007). Na esquistossomose mansônica, a reação
inflamatória granulomatosa tem uma função protetora para o hospedeiro, pois caso os ovos de
S. mansoni e suas toxinas não sejam neutralizados ou seqüestrados efetivamente, podem
causar danos aos tecidos afetados (Damian et al., 1984;Pearce and MacDonald, 2002).
Os granulomas hepáticos são iniciados após os ovos serem depositados nos capilares
pré-sinusoidais (Boros, 1989). Os ovos do S. mansoni excretam um antígeno solúvel
responsável pelo desencadeamento de um complexo fisiopatológico reacional que promoverá
a formação do granuloma em torno dos ovos (Lukacs et al., 1993;Lins et al., 2008). O
granuloma esquistossomótico é uma coleção compacta e organizada de células migrantes, que
junto com as células do órgão afetado, dispõem-se em meio a componentes de uma matriz
extracelular heterogênea, formando uma estrutura esférica que circunda cada ovo
individualmente (Lenzi et al., 1991). Nos estágios iniciais de formação do granuloma, há uma
produção de citocinas que certamente é importante para o desenvolvimento do granuloma por
recrutar células inflamatórias para o local de seqüestro do ovo do parasito (Lukacs et al.,
1993;Pearce and MacDonald, 2002;Wynn et al., 2004;Lins et al., 2008). Esse granuloma é
caracterizado pela presença de macrófagos, eosinófilos e linfócitos (Weinstock and Blum,
17
1987;Weinstock, 1992). Tal inflamação gera uma resposta de reparo tecidual, desencadeando
a deposição de colágeno tecidual, que quando em excesso é a expressão da fibrose (Warren,
1968;Cheever et al., 1985;Chiaramonte et al., 2001).
No início da resposta granulomatosa, a síntese de colágeno e a atividade das colagenases
ocorrem de forma equilibrada. Com o progresso da inflamação, a atividade dessas
colagenases diminui, mas a síntese de colágeno continua, levando a uma fibrose pronunciada
(Dunn et al., 1979;Takahashi et al., 1980;Singh et al., 2004). A lesão da esquistossomose
resulta de um excessivo depósito de colágeno nos espaços periportais, levando ao
desenvolvimento de uma fibrose periportal (fibrose de Symmer) característica da
esquistossomose mansônica (Cheever, 1968;Abath et al., 2006). Essa fibrose pode levar a
uma progressiva oclusão dos vasos portais, hipertensão portal, esplenomegalia e
hepatomegalia (Costa et al., 2003;Gryseels et al., 2006).
1.4 SENESCÊNCIA E ESQUISTOSSOMOSE
Existem algumas evidências na literatura mostrando modificações no desenvolvimento
de doenças parasitárias ao longo do processo de envelhecimento no que diz respeito a
gravidade e intensidade de infecção (Ndhlovu et al., 1996;Ouma et al., 1998;Naus et al.,
1999). Na esquistossomose humana, em particular, a intensidade de infecção, medida por
número de ovos nas fezes, geralmente aumenta muito nas duas primeiras décadas de vida
como resultado do contato com águas contaminadas pelos indivíduos vivendo em áreas
endêmicas. A partir de 30-40 anos de idade, esses mesmos indivíduos apresentam um declínio
progressivo na intensidade de infecção que aparentemente é concomitante à aquisição de
mecanismos de imunoproteção e ao desenvolvimento da fase crônica da doença (Naus et al.,
1999). Em estudos realizados em uma comunidade rural localizada no Zimbabwe (África),
mostrou-se que indivíduos jovens entre 10 e 14 anos de idade apresentaram um pico máximo
na intensidade da infecção pelo parasito S. haematobium (30,4 ovos/ml de urina)
acompanhado pela diminuição gradual da intensidade da infecção em indivíduos acima de 44
anos de idade (5,3 ovos/ml de urina) (Ndhlovu et al., 1996).
A ênfase dos estudos relacionando a idade e infecção pelo Schistosoma sp. tem sido
nesse perfil: um aumento na intensidade de infecção nas duas primeiras décadas de vida e o
declínio subseqüente. Essa diminuição poderia ser devido a uma resposta imune adquirida
18
pelos indivíduos idosos. Há alguns relatos mostrando que, em indivíduos acima de 60 anos,
especificamente, ocorre também um súbito aumento na intensidade de infecção (Fulford et al.,
1998). No entanto, a ausência de estudos sistemáticos da reatividade imunológica de
indivíduos idosos à infecção por S. mansoni tem impedido o entendimento dessa aparente
perda da imunidade adquirida em indivíduos vivendo em áreas endêmicas por toda a sua vida.
Um estudo importante realizado em populações africanas sugere uma relação entre
idade, intensidade da infecção e duração da infecção (Naus et al., 1999). Nesse estudo, os
autores foram capazes de se aproveitar de uma situação rara: analisar os índices de infecção
entre indivíduos de diversas idades de uma população recentemente assentada em uma área
endêmica. O fato de que os indivíduos infectados vivem na área desde a infância geralmente
impede uma correlação direta entre infecção e idade, pois os dados obtidos pela contagem de
ovos nas fezes normalmente se referem a re-infecção. Nos estudos relatados por Naus e
colaboradores, duas populações foram avaliadas: um “grupo estabelecido” que era exposto
durante anos ao parasito e um “grupo imigrante” vindo de uma área não endêmica. No “grupo
estabelecido”, observou-se um pico máximo da infecção nos indivíduos jovens (15-20 anos)
acompanhada de uma drástica diminuição a partir dos 30 anos que se manteve constante até
os 55 anos de idade. Já no “grupo imigrante”, o padrão da intensidade da infecção foi bem
mais baixo. Além disto, esse grupo apresentou um pico na intensidade da infecção mais
tardiamente (indivíduos adultos de 30 anos). Similarmente ao “grupo estabelecido”, a partir
dos 30 anos ocorria um declínio nessa intensidade que se mantinha constante até os 55 anos
de idade. Um ano após a chegada do “grupo imigrante”, os estudos mostraram um aumento
acentuado na intensidade da infecção nos indivíduos jovens (10 anos) desse grupo em relação
aos primeiros estudos, com uma diminuição dessa intensidade a partir dos 20 anos de idade.
Esses resultados sugerem que os indivíduos jovens do “grupo imigrante” apresentaram
possivelmente um padrão de resposta aguda para a infecção pelo S. mansoni.
Alguns trabalhos também demonstraram que a reatividade imunológica do indivíduo
frente aos antígenos liberados pelo parasito também pode ser influenciada pelo
envelhecimento. Webster e colaboradores (1997), estudando populações de áreas endêmicas,
mostraram alterações nos níveis de anticorpos em indivíduos jovens e idosos infectados pelo
parasito S. mansoni. Foi observado um aumento significativo nos níveis de IgE nos indivíduos
idosos (50 anos) quando comparado àqueles apresentados por indivíduos jovens (10-20 anos).
Entretanto, esse aumento foi evidenciado somente para os antígenos do verme adulto (SWAP)
já os níveis de IgE produzido por indivíduos idosos (50 anos) frente aos antígenos do ovo
(SEA), apresentaram-se mais baixos quando comparados com aqueles produzidos pelos
19
indivíduos jovens. Com relação aos níveis de IgG4, houve um aumento significativo na
produção deste isotipo para ambos os antígenos em indivíduos idosos (50 anos). Esses
resultados mostram a influência do envelhecimento na resposta imune do individuo frente à
esquistossomose (Webster et al., 1997).
Bethony e colaboradores (2001) também obtiveram resultados interessantes em relação
à intensidade de infecção por S. mansoni em indivíduos idosos na região endêmica de
Melquíades, Minas Gerais. Os autores estudaram uma população de 634 indivíduos
distribuídos em intervalos de 10 anos. Eles observaram, em acordo com a literatura, um
aumento na intensidade da infecção, medida pela contagem de ovos nas fezes, em indivíduos
jovens (10-20 anos), seguida de um declínio em indivíduos adultos (30-49 anos) e idosos (5059 anos) sugerindo novamente a aquisição de imunidade adquirida na idade adulta.
Surpreendentemente, eles também observaram que indivíduos acima de 60 anos de idade
apresentaram um novo pico da intensidade de infecção, sugerindo uma possível perda dessa
imunidade com o envelhecimento (Bethony et al., 2001).
Uma hipótese plausível para explicar esse aumento súbito poderia ser um maior contato
com águas contaminadas por parte dos indivíduos mais idosos. No entanto, dados do próprio
autor e de outros mostram, ao contrário, uma diminuição drástica no contato com águas
contaminadas em indivíduos acima de 60 anos (Ouma et al., 1998;Gazzinelli et al., 2001).
Como a esquistossomose é uma doença crônica cujo desenvolvimento se sobrepõe ao
processo também progressivo do envelhecimento, a avaliação da resposta granulomatosa
desenvolvida em camundongos jovens e idosos é de grande importância, uma vez que
poderemos analisar
parcialmente o
real impacto
do
envelhecimento
durante o
desenvolvimento da esquistossomose mansoni experimental. Assim, o estudo de parâmetros
histopatológicos apresentados por camundongos jovens e idosos infectados, nos permite
traçar associações mais claras entre envelhecimento e o desenvolvimento da resposta
granulomatosa.
20
2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
Recentemente, estudos em populações de áreas endêmicas brasileiras têm demonstrado
alterações associadas à intensidade de infecção em indivíduos idosos. Bethony et al.(2001)
mostram em Melquíades, uma área endêmica para a esquistossomose localizada no Estado de
Minas Gerais, o aumento da intensidade da infecção (ovos por grama de fezes) de uma
população de 634 indivíduos. Nessa população ocorre um pico na intensidade da infecção
entre 10-19 anos, um declínio após os 20 anos, uma diminuição acentuada entre 50-59, e
outro aumento estatisticamente significativo na intensidade da infecção (p< 0.005) após os 60
anos de idade. Quando foram analisados os mesmos grupos de indivíduos, o grupo acima de
60 anos que tem um comportamento de contato com águas contaminadas menor em relação às
outras faixas etárias, apresentou um aumento na quantidade de ovos presentes nas fezes
quando comparado com o grupo de indivíduos entre 20 e 49 anos. Essa diferença foi mais
acentuada quando comparada com os indivíduos entre 50-59 anos de idade (Bethony et al.,
2001).
As evidências citadas acima mostram um aumento na intensidade da infecção durante o
envelhecimento frente à infecção pelo S. mansoni, o que nos leva a acreditar que o
envelhecimento afeta o curso da doença e que alterações biológicas ocorridas durante a
senescência também podem interferir na forma pela qual o indivíduo responde à
esquistossomose. Entretanto, existem poucos dados na literatura mostrando quais as
diferenças no desenvolvimento da patologia da esquistossomose entre indivíduos jovens e
idosos, assim como em modelo murino.
Entender a histopatologia da esquistossomose, especialmente os mecanismos associados
ao granuloma e conseqüente formação da fibrose é de suma importância. Esses mecanismos
não são facilmente pesquisados em humanos por questões éticas e operacionais (Abath et al.,
2006). Não é possível definir claramente quando o indivíduo idoso se infectou, tornando,
então mais difícil a avaliação do real impacto do envelhecimento na patologia da
esquistossomose em seres humanos.
Infecções esquistossomóticas experimentais têm sido freqüentemente utilizadas como
modelo das características anatomopatológicas e fisiopatológicas da infecção em seres
humanos, bem como para o estudo da imunidade e tratamento (Costa et al., 2003;Abath et al.,
2006). Em camundongos infectados, o estabelecimento da patologia também se dá pelo
desenvolvimento de uma resposta granulomatosa, caracterizada pela formação de granulomas,
21
induzidos por antígenos solúveis do ovo (SEA), compostos por linfócitos T, linfócitos B,
macrófagos, eosinófilos e células epitelióides e gigantes. Ao longo do curso da infecção, na
qual há a passagem da fase aguda (70 dias) para a fase crônica (120 dias) também se observa
a modulação desses granulomas. Os animais apresentam alguns sintomas, tais como diarréia
durante a fase aguda e, pequenas lesões na mucosa intestinal que podem levar a morte dos
animais através do seu sangramento. Além disso, observam-se lesões glomerulares e
insuficiência renal. Mas, não são observadas varizes esofageanas. Em relação à hipertensão
portal, ela está associada ao número e tamanho dos granulomas (Wynn et al., 2004).
Portanto, o estudo da infecção pelo parasito S. mansoni em modelos murinos é
fundamental, uma vez que ela reproduz, em muitos aspectos, a patogenia em humanos,
permitindo desta forma, estudar mais detalhadamente todas as fases da doença e avaliar o real
impacto da senescência nessas fases (Cheever et al., 2000;Singh et al., 2004).
Neste trabalho, estudamos o papel das alterações associadas com a senescência no que
diz respeito à histopatologia da infecção por S. mansoni em camundongos idosos. Para isso, a
utilização do modelo murino possui algumas vantagens em relação ao modelo humano, tais
como: a) possuir menor período entre a juventude e a senescência (1 ano e meio); b) poder
sacrificar os animais e avaliar vários órgãos; c) poder caracterizar histológica e
morfometricamente os granulomas presentes no fígado de animais idosos comparando-os com
animais jovens; d) e o mais importante, poder avaliar separadamente as duas variáveis
infecção e envelhecimento, permitindo estudar a influência da senescência na resposta
granulomatosa e na evolução do processo fibrótico desenvolvidos por camundongos idosos
frente à infecção pelo parasito S. mansoni. Neste modelo foi analisado o desenvolvimento da
resposta granulomatosa em camundongos jovens e idosos, nas fases aguda e crônica de
infecção por S. mansoni, o que nos permitiu avaliar as alterações histológicas apresentadas
por animais jovens e idosos e associá-las aos parâmetros referentes à proteção em diferentes
momentos da infecção.
22
3 OBJETIVO GERAL
Estudar
aspectos
histopatológicos
compartimentalizada durante o
relacionados
desenvolvimento
à
resposta
granulomatosa
da esquistossomose mansoni em
camundongos jovens e idosos nas fases aguda e crônica da infecção.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A) Avaliar a resposta granulomatosa através da quantificação do número de granulomas e
mensuração da área dos mesmos;
B) Analisar o processo inflamatório hepático;
C) Avaliar a neoformação de colágeno nos tecidos hepático e esplênico.
23
4 METODOLOGIA
4.1 ANIMAIS, PARASITOS E INFECÇÃO
Nesse estudo foram utilizados camundongos C57BL/6 jovens (7 semanas de idade)
fêmeas e camundongos idosos (70 semanas de idade) fêmeas, obtidos no Biotério do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB – UFMG) e mantidos
no biotério do Grupo Intradepartamental de Estudos sobre Esquistossomose da Universidade
Federal de Minas Gerais (GIDE - UFMG) sob a Coordenação da Professora Doutora Débora
Negrão.
Os animais foram infectados com 19 cercárias de S. mansoni por inoculação
subcutânea. Para a infecção foram utilizadas cercárias da cepa LE do S. mansoni, obtidas a
partir de caramujos (B. glabrata) infectados experimentalmente, mantidos no mesmo Biotério.
Para a análise comparativa entre camundongos jovens e idosos e entre infecção aguda
(70 dias de infecção) e crônica (120 dias de infecção), os animais foram agrupados da
seguinte maneira: 1) grupo de camundongos jovens infectados com o S. mansoni,
eutanasiados 70 dias após a infecção (J70); 2) grupo de camundongos jovens infectados com
o S. mansoni, eutanasiados 120 dias após a infecção (J120); 3) grupo de camundongos idosos
infectados com o S. mansoni, eutanasiados 70 dias após a infecção (I70); 4) grupo de
camundongos idosos infectados com o S. mansoni, eutanasiados 120 dias após a infecção
(I120); e seus respectivos controles negativos. Cada grupo representa a análise de 3 animais.
O fígado desses animais foi analisado para os parâmetros referentes a número e tamanho
de granulomas em cada animal, aumento da celularidade dos infectados frente aos respectivos
grupos controle e aumento da neoformação de colágeno dos infectados frente aos respectivos
grupos controle. O baço desses animais foi analisado para o parâmetro de aumento da
neoformação de colágeno dos infectados frente aos respectivos grupos controle.
24
4.2 NECROPSIA, COLETA, FIXAÇÃO E PROCESSAMENTO DO MATERIAL PARA
MICROSCOPIA ÓPTICA
Os animais foram eutanasiados em dois períodos distintos. Para definição de animais no
período agudo da infecção por S. mansoni, os mesmos foram eutanasiados no 70° dia após a
infecção (DAI). Nesse período, foram também eutanasiados animais não infectados para
definição de um grupo controle 70 dias. Para definição de animais no período crônico da
infecção por S. mansoni, outros animais também infectados foram eutanasiados no 120° dia
após infecção (DAI). Nesse período, foram também eutanasiados animais jovens e idosos não
infectados para definição de um grupo controle 120 dias. Os animais foram sacrificados com
0,5 mL/Kg de massa corporal de tiopental sódico (0,03g/ml de solução salina 0,8%), por via
endovenosa. Durante a necropsia foram coletados o fígado, o baço, além do intestino,
linfonodo inguinal, linfonodo mesentérico e placa de Peyer. Neste trabalho, foram analisados
somente fígado e baço. As amostras foram fixadas em formol a 10% tamponado (pH 7.2).
4.3 HISTOPATOLOGIA E COLORAÇÕES EMPREGADAS
Um segmento de aproximadamente 0,5 cm foi retirado da amostra de fígado e baço
previamente fixado em formol 10% tamponado e processado, conforme a técnica descrita a
seguir para tecidos em parafina. As amostras foram desidratadas em concentrações crescentes
de álcool (70, 80, 90 e 100%), diafanizadas em dois banhos de xilol, e embebidas em parafina.
Após o processamento, as amostras foram incluídas em parafina. Os blocos obtidos foram
submetidos à microtomia para a obtenção de quatro cortes com espessura de quatro µm e para
cada análise foi utilizado um único corte histológico de fígado e de baço por animal.
Dos dois cortes obtidos para o estudo do fígado e do baço, o primeiro foi corado pelo
método de Hematoxilina-Eosina (HE) para análise rotineira das alterações histopatológicas,
tais como presença de granuloma hepático, análise da quantidade e da área desses granulomas
e análise do infiltrado celular inflamatório local no fígado por animal; o segundo foi corado
pelo método Tricrômico de Gomori (TG) para detecção da neoformação de colágeno no
fígado e no baço por animal.
25
4.3.1 Hematoxilina-Eosina (HE)
A coloração de HE foi utilizado para análise rotineira das alterações histopatológicas,
incluindo a quantificação do processo inflamatório. Os cortes foram desparafinizados em duas
trocas de xilol, hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) e
então lavados em água corrente. Em seguida, foram corados pela Hematoxilina, por 10
minutos e lavados em água corrente, para retirada do excesso do corante. Os cortes foram
diferenciados em álcool acidulado (100 mL de álcool absoluto e 10 gotas de ácido clorídrico)
e novamente lavados em água corrente para evitar acidificação excessiva. Posteriormente,
foram corados pela Eosina, por 30 segundos. Após a última lavagem em água corrente, foram
desidratados, em 2 banhos de álcool absoluto e levados à estufa a 56º C para secagem e
montados com lamínula e Entellan (Caliari et al., 2002).
4.3.2 Tricrômico de Gomori (TG)
Para observação do processo de neoformação de colágeno, os cortes histológicos do
fígado e do baço foram corados pela técnica de Tricrômico de Gomori. Essa técnica permitiu
a identificação do tecido conjuntivo fibroso pela sua tonalidade azul. Após desparafinização e
hidratação, os cortes foram corados pela Hematoxilina de Harris, por 5 minutos e lavados em
água corrente. Em seguida, os cortes foram mantidos, por 15 minutos, imersos em solução de
Tricrômico de Gomori, lavados em água corrente, desidratados e levados à estufa a 56°C para
secagem e montados com lamínula e Entellan (Caliari et al., 2002).
26
4.4 ANÁLISE QUANTITATIVA DE GRANULOMAS
Para quantificação dos granulomas hepáticos presentes nas amostras de fígado foram
contados o número de granulomas visualizados por microscopia óptica. A contagem foi
realizada em 20 campos microscópicos aleatórios (objetiva de 20X) de cada animal infectado
do estudo. As imagens visualizadas pela objetiva de 20x em microscópio Leica DM5000B
foram digitalizadas através da microcâmera Leica e do programa Leica Application Suite
(Versão 2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin
V3. A média do número de granulomas de cada grupo foi comparada entre os animais jovens
infectados e os animais idosos infectados com S. mansoni, tanto na fase aguda quanto na fase
crônica de infecção.
4.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DA ÁREA DO GRANULOMA HEPÁTICO
O processo de formação do granuloma foi avaliado, nesse estudo, através da medição da
área dos granulomas hepáticos apresentados pelos animais infectados, tanto jovens quanto
idosos. A área dos granulomas, em cada animal infectado do estudo, foi observada em cada
corte histológico de fígado obtido. As imagens visualizadas pela objetiva de 20x em
microscópio Leica DM5000B foram digitalizadas através da microcâmera Leica e do
programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi
utilizado o programa Leica QWin V3. A média das áreas dos granulomas hepáticos do grupo
de animais infectados jovens foi comparada com a média das áreas dos granulomas hepáticos
do grupo de animais infectados idosos, nas fases aguda e crônica da infecção por S. mansoni.
27
4.6 ANÁLISE DA CELULARIDADE E DO INFILTRADO CELULAR PRESENTE NOS
CORTES HISTOLÓGICOS HEPÁTICOS
Os cortes histológicos para a análise da celularidade de cada animal foram submetidos à
coloração pelo método de Hematoxilina-Eosina (HE) conforme descrito anteriormente. Para
quantificação da celularidade e do infiltrado de células inflamatórias presentes nos cortes
histológicos do fígado de cada animal, foi definida uma marcação que possibilitasse capturar,
processar imagens e definir condições morfométricas para contagens de todos os núcleos
contidos em cada imagem. Os núcleos de células residentes do tecido hepático, bem como os
leucócitos recentemente recrutados foram, então, contados (Pacheco et al., 2008). Os núcleos
celulares presentes nesses segmentos foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias
(área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2) de cada animal do estudo. As imagens
visualizadas pela objetiva de 20x em microscópio Leica DM5000B foram digitalizadas
através da microcâmera Leica e do programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1). Para
a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin V3. O processo
inflamatório foi determinado pela diferença entre o número de núcleos das células presentes
nos animais infectados com o S. mansoni e o número de núcleos celulares dos animais nãoinfectados ± desvio padrão evidenciados em toda a amostra de tecido de cada animal, não
somente nos granulomas. Os resultados apresentados graficamente referem-se aos valores de
aumento da celularidade apresentado pelos grupos de animais infectados quando comparados
com seus respectivos grupos controle (média do valor total da celularidade do grupo infectado
menos a média do valor total da celularidade do respectivo grupo controle). Portanto os
gráficos mostram apenas as barras referentes aos valores de aumento da celularidade média
dos grupos de animais infectados jovens e idosos nas fases aguda e crônica da doença.
28
4.7 ANÁLISE DO PROCESSO DE NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO FÍGADO E
BAÇO DOS ANIMAIS
A área ocupada por tecido conjuntivo fibroso foi obtida por análise de imagem de 20
campos aleatórios por lâmina dos cortes corados por TG de cada animal do estudo. As
imagens visualizadas pela objetiva de 20x em microscópio Leica DM5000B foram
digitalizadas através da microcâmera Leica e do programa Leica Application Suite (Versão
2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin V3. Os
pixels com tons de azul foram selecionados para a criação de uma imagem binária e posterior
cálculo da área total ocupada por fibrose ou tecido conjuntivo fibroso normal. O processo
fibrótico foi determinado pela diferença estatisticamente significativa entre as áreas de
neoformação de colágeno presentes nos animais infectados com o S. mansoni e as áreas de
colágeno dos animais não-infectados ± desvio padrão evidenciados em toda a amostra de
tecido do fígado e do baço de cada animal, não somente nos granulomas. Os resultados
apresentados graficamente referem-se aos valores de neoformação de colágeno apresentado
pelos grupos de animais infectados quando comparados com seus respectivos grupos controle
(média do valor total de colágeno do grupo infectado menos a média do valor total de
colágeno do respectivo grupo controle). Portanto os gráficos mostram apenas as barras
referentes à média dos valores de neoformação de colágeno dos grupos de animais infectados
jovens e idosos nas fases aguda e crônica da doença, tanto do fígado quanto do baço.
As áreas obtidas foram comparadas entre os camundongos jovens infectados,
camundongos idosos infectados e animais do grupo controle estudados, tanto na fase aguda
quanto na fase crônica da infecção (Caliari et al., 2002).
29
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental do software GraphPad
Prism 4.03 (Prism Software, Irvine, CA, USA). Para comparação do processo inflamatório,
número de granulomas, área ocupada por granulomas hepáticos e neoformação de colágeno
foi realizada análise estatística pelo teste t de Student para determinar as diferenças estatísticas
entre as médias de dois grupos. As comparações foram realizadas entre camundongos de
mesma faixa etária em fases diferentes da doença (jovens na fase aguda e na fase crônica ou
idosos na fase aguda e na fase crônica), ou na mesma fase da doença sendo de faixas etárias
diferentes (jovens e idosos na fase aguda ou jovens e idosos na fase crônica). As análises de
correlação foram executadas através do teste t de Student com intervalo de confiança de 95%.
Diferenças entre médias com valores de p menores que 0,05 foram consideradas
estatisticamente significativas.
30
5 RESULTADOS
A apresentação dos resultados foi realizada em três partes: a primeira refere-se aos
dados obtidos através da quantificação do número e tamanho dos granulomas hepáticos; a
segunda refere-se aos dados obtidos através da quantificação do processo inflamatório,
avaliando-se a celularidade e o infiltrado celular presente no tecido hepático como um todo; e
a terceira refere-se aos dados obtidos através da quantificação do processo de neoformação de
colágeno no fígado e no baço de camundongos infectados pelo Schistosoma mansoni.
Animais não infectados foram utilizados como controle negativo (dados não mostrados).
5.1 ANÁLISE DO NÚMERO E TAMANHO DE GRANULOMAS HEPÁTICOS DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS.
Os cortes histológicos de fígado de camundongos jovens e idosos infectados por
Schistosoma mansoni foram avaliados quanto ao desenvolvimento dos granulomas
esquistossomóticos. O número de granulomas no fígado durante as fases aguda e crônica da
infecção por Schistosoma mansoni foi quantificado em 20 campos microscópicos por
camundongo (Figuras 1 e 2). O grupo de camundongos jovens eutanasiados com 120 dias (J
120) apresentou maior número de granulomas que o grupo de camundongos jovens
eutanasiados em 70 dias (J 70) (p=0,0008). Os grupos de camundongos idosos não
apresentaram diferença.
31
Número de Granulomas
hepáticos/campo
P= 0,0008
3
2
1
0
J 70
I 70
J 120
I 120
Figura 1 - Quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados por
Schistosoma mansoni, eutanasiados durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da doença. Diferenças
significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre J 120 e J 70
(p=0,0008). As barras representam a média dos 3 animais de cada grupo ± desvio padrão.
32
Figura 2 – Fotos representativas da quantificação dos granulomas hepáticos em camundongos jovens (J) e idosos
(I) infectados por Schistosoma mansoni, eutanasiados durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da
doença. Hematoxilina Eosina, 330X. A: fígado de jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J 70). B: fígado de
idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). C: fígado de jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J
120). D: fígado de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120).
33
Analisando-se a área do granuloma hepático presente em camundongos jovens e idosos,
observam-se diferenças significativas entre esses dois grupos (Figuras 3 e 4). O grupo de
camundongos jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J120) apresentou granulomas com
área menor que camundongos jovens eutanasiados em 70 dias (J 70) (p= 0,0486). Além disso,
camundongos idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120) apresentaram granulomas
maiores que os camundongos jovens eutanasiados em 120 dias (J 120) (p=0,0022). Por outro
lado, não foram observadas alterações com relação a área do granuloma hepático entre a fase
Area do granuloma (µm2)
aguda e crônica da doença, no grupo de animais idosos.
P= 0,0486
40000
30000
P= 0,0022
20000
10000
0
J 70
I 70
J 120
I 120
Figura 3 – Determinação da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I)
infectados por Schistosoma mansoni, durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da doença. Diferenças
significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre J 120 e J 70
(p=0,0486). Diferença entre I 120 e J 120 (p=0,0022). As barras representam a média dos 3 animais de cada
grupo ± desvio padrão.
34
Figura 4 – Fotos representativas da área dos granulomas presentes no fígado de camundongos jovens (J) e idosos
(I) infectados por Schistosoma mansoni, durante as fases aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da doença. A:
fígado de jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J 70). B: fígado de idosos infectados eutanasiados em 70
dias (I 70). C: fígado de jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). D: fígado de idosos infectados
eutanasiados em 120 dias (I 120).
35
5.2 ANÁLISE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA NO FÍGADO DE CAMUNDONGOS
JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE INFECÇÃO.
Sabe-se que a maioria do sangue proveniente do intestino passa pelo fígado via sistema
porta antes de atingir a circulação periférica e grandes quantidades de antígenos entram nesse
órgão, podendo ser capturados por células apresentadoras de antígeno. No fígado, são
encontradas várias populações celulares residentes, incluindo células de Kupffer, células
estreladas, células dendríticas e linfócitos (Tsutsui, et al., 1996, Matsui, et al., 1997, Doerty, et
al., 1999). Entretanto, durante o desenvolvimento da resposta granulomatosa na
esquistossomose, observa-se principalmente eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos
(Weinstock, 1992, Rumbley, et al., 1999).
Nesse contexto, após a análise do número e tamanho dos granulomas hepáticos, nosso
próximo objetivo foi avaliar a resposta inflamatória caracterizada pelo aumento da
celularidade em todas as amostras de tecido hepático dos animais infectados em relação à
celularidade presente também nas amostras de tecido hepático dos respectivos animais do
grupo controle. Observamos diferenças significativas entre os grupos de animais, com relação
ao processo inflamatório gerado pela formação dos granulomas durante a fase aguda e crônica
da infecção.
A análise da celularidade e do aumento do infiltrado celular no fígado dos camundongos
foi observada, inicialmente, comparando-se os grupos infectados com os grupos controle
(dados não mostrados graficamente). Os camundongos jovens infectados eutanasiados em 70
dias (J 70) apresentaram celularidade maior que os jovens não infectados eutanasiados no
mesmo período (p=0,0168). Da mesma maneira, camundongos idosos infectados eutanasiados
em 70 dias (I 70) apresentaram maior celularidade que os idosos não infectados eutanasiados
no mesmo período (p=0,0022). Entre os animais eutanasiados em 120 dias, camundongos
jovens infectados (J 120) apresentaram maior celularidade que camundongos jovens não
infectados (p=0,0312) e camundongos idosos infectados (I 120) apresentaram a mesma
tendência em comparação com idosos não infectados (p=0,0835) (dados não mostrados
graficamente).
Comparando-se os aumentos na celularidade apresentados pelos grupos infectados
(Figuras 5 e 6), observou-se que idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70)
apresentaram celularidade maior que jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J 70)
(p=0,0305). Essa diferença é observada como tendência entre o grupo de idosos infectados
36
eutanasiados em 70 dias (I 70) e idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120)
(p=0,0582).
Inflamação no fígado
(infiltrado inflamatório)
8000
P= 0,0305
6000
4000
2000
0
J 70
I 70
J 120
I 120
Figura 5 - Análise da inflamação no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados, eutanasiados
durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose. Diferenças significativas foram
determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre I 70 e J 70 (p=0,0305). As barras
representam a média de células inflamatórias dos 3 animais de cada grupo ± desvio padrão.
37
Figura 6 – Fotos representativas da inflamação no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados,
eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada pelo aumento
da celularidade desses grupos em relação aos respectivos grupos controle. A: fígado de jovens infectados
eutanasiados em 70 dias (J 70). B: fígado de idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). C: fígado de
jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). D: fígado de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I
120).
38
5.3
ANÁLISE
DA
NEOFORMAÇÃO
DE
COLÁGENO
NO
FÍGADO
DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE
INFECÇÃO.
A análise do aumento da neoformação de colágeno no fígado dos camundongos foi
observada, inicialmente, comparando-se os grupos infectados com os grupos controle
negativo (dados não mostrados graficamente). Os camundongos jovens infectados
eutanasiados em 70 dias (J 70) apresentaram maior neoformação de colágeno que os jovens
não infectados eutanasiados no mesmo período (p=0,0448). Da mesma maneira,
camundongos idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70) apresentaram maior
neoformação de colágeno que os idosos não infectados eutanasiados no mesmo período
(p=0,0032). Entre os animais eutanasiados em 120 dias, camundongos jovens infectados (J
120) apresentaram maior neoformação de colágeno que camundongos jovens não infectados
(p=0,0237) e camundongos idosos infectados (I 120) apresentaram maior neoformação de
colágeno que camundongos idosos não infectados (p=0,0275) (dados não mostrados
graficamente).
Comparando-se os aumentos na neoformação de colágeno apresentados pelos grupos
infectados (Figuras 7 e 8), não foi observada diferença entre os grupos de animais jovens (J)
e idosos (I) nas fases aguda (70) e crônica (120) da infecção.
Neoformação de colágeno
no fígado (µ m2)
39
8.0×10 07
6.0×10 07
4.0×10 07
2.0×10 07
0.0
J 70
I 70
J 120
I 120
Figura 7 - Análise da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados,
eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada pelo aumento
da presença de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle.
Diferenças significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. As barras
representam a média de colágeno dos 3 animais de cada grupo ± desvio padrão.
40
Figura 8 – Fotos representativas da neoformação de colágeno no fígado de camundongos jovens (J) e idosos (I)
infectados, eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada
pelo aumento de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle. A:
fígado de jovens não infectados eutanasiados em 70 dias (controle). B: fígado de jovens infectados eutanasiados
em 70 dias (J 70). C: fígado de jovens não infectados eutanasiados em 120 dias (controle). D: fígado de jovens
infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). E: fígado de idosos não infectados eutanasiados em 70 dias
(controle). F: fígado de idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). G: fígado de idosos não infectados
eutanasiados em 120 dias (controle). H: fígado de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120).
41
5.4 ANÁLISE DA NEOFORMAÇÃO DE COLÁGENO NO BAÇO DE CAMUNDONGOS
JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE INFECÇÃO.
Analisando-se a deposição de colágeno no baço como aspecto determinante da fibrose
tecidual, foi possível observar alterações significativas quando os grupos foram comparados.
A análise do aumento da neoformação de colágeno no baço dos camundongos foi
observada, inicialmente, comparando-se os grupos infectados com os grupos controle (dados
não mostrados graficamente). Os camundongos jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J
70) não apresentaram maior neoformação de colágeno que os jovens não infectados
eutanasiados no
mesmo
período. Diferentemente, camundongos idosos infectados
eutanasiados em 70 dias (I 70) apresentaram maior neoformação de colágeno que os idosos
não infectados eutanasiados no mesmo período (p=0,0430). Entre os animais eutanasiados em
120 dias, camundongos jovens infectados (J 120) apresentaram maior neoformação de
colágeno que camundongos jovens não infectados (p=0,0220) enquanto camundongos idosos
infectados (I 120) apresentaram a mesma tendência de maior neoformação de colágeno que
camundongos idosos não infectados (p=0,0583) (dados não mostrados graficamente).
Comparando-se os aumentos na neoformação de colágeno no baço apresentados pelos
grupos infectados (Figuras 9 e 10), observou-se que idosos infectados eutanasiados em 70
dias (I 70) apresentaram maior neoformação que jovens infectados eutanasiados em 70 dias (J
70) (p=0,0107). Além disso, camundongos jovens infectados eutanasiados em 120 dias (J
120) apresentaram maior neoformação de colágeno que jovens infectados eutanasiados em 70
dias (J 70) (p=0,0088). Entre os grupos de jovens e idosos infectados eutanasiados em 120
dias (J 120 e I 120, respectivamente) não houve diferença.
Neoformação de colágeno
no baço (µ m2)
42
8.0×10 07
6.0×10 07
P= 0,0088
P= 0,0107
4.0×10 07
2.0×10 07
0.0
J 70
I 70
J 120
I 120
Figura 9 - Análise da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens (J) e idosos (I) infectados,
eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada pelo aumento
da presença de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle.
Diferenças significativas foram determinadas por valores de p<0,05 pelo Teste t de Student. Diferença entre I 70
e J 70 (p=0,0107). Diferença entre J120 e J 70 (p=0,0088). As barras representam a média de colágeno dos 3
animais de cada grupo ± desvio padrão.
43
Figura 10 – Fotos representativas da neoformação de colágeno no baço de camundongos jovens (J) e idosos (I)
infectados, eutanasiados durante a fase aguda (70 dias) e crônica (120 dias) da esquistossomose, demonstrada
pelo aumento de colágeno nesses grupos em relação ao colágeno constitutivo dos respectivos grupos controle. A:
baço de jovens não infectados eutanasiados em 70 dias (controle). B: baço de jovens infectados eutanasiados em
70 dias (J 70). C: baço de jovens não infectados eutanasiados em 120 dias (controle). D: baço de jovens
infectados eutanasiados em 120 dias (J 120). E: baço de idosos não infectados eutanasiados em 70 dias
(controle). F: baço de idosos infectados eutanasiados em 70 dias (I 70). G: baço de idosos não infectados
eutanasiados em 120 dias (controle). H: baço de idosos infectados eutanasiados em 120 dias (I 120).
44
5.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS.
A análise dos dados parasitológicos, referentes à carga parasitária, foi realizada por parte
dos colaboradores, simultaneamente a este projeto.
Essa análise permitiu avaliar a real influência do processo de senescência sobre os dados
e análises obtidos por este projeto, excluindo diferenças na carga parasitária como causa dos
resultados observados.
Analisando-se os dados referentes à carga parasitária nos animais jovens e idosos, não
foi observada diferença estatística entre os grupos.
Número de ovos
Dados Parasitológicos do Fígado
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
jovens
velhos
Animais
Figura 11 - Análise dos dados parasitológicos no fígado de animais jovens e velhos referentes à infecção por
Schistosoma mansoni.
45
6 DISCUSSÃO
O objetivo desse trabalho foi estudar aspectos relacionados à resposta granulomatosa
compartimentalizada durante o
desenvolvimento
da esquistossomose mansoni em
camundongos jovens e idosos nas fases aguda e crônica da infecção. Para tal foram utilizadas
infecções por Schistosoma mansoni de camundongos jovens (7 semanas de idade) e idosos
(70 semanas de idade) eutanasiados com 70 dias de infecção (fase aguda) ou 120 dias de
infecção (fase crônica) e seus respectivos controles.
Infecções de camundongos têm sido freqüentemente utilizadas como modelos de
características anatomopatológicas e patofisiológicas de infecções parasitárias, como a
esquistossomose, em humanos assim como no estudo do tratamento e das características
imunes dessas infecções (Cheever et al., 2000;Cheever et al., 2002).
Muitos estudos têm demonstrado a semelhança no padrão da resposta imune frente à
infecção pelo Schistosoma mansoni, bem como na patologia associada a ela em camundongos
e humanos (Cheever et al., 2000;Cheever et al., 2002). Portanto optou-se por utilizar o modelo
murino de infecção esquistossomótica experimental, pois o mesmo permite avaliar, de
maneira geral, o efeito direto e isolado do envelhecimento sobre a resposta imune à infecção,
fibrose e o detalhamento da ativação inflamatória em vários órgãos, inclusive o fígado e o
baço que foi nosso objeto de estudo.
Como já mencionamos, o envelhecimento está associado a várias modificações
funcionais do sistema imune. Tais alterações podem estar relacionadas à involução tímica,
bem como às alterações no fenótipo, perfil de citocinas e no repertório de linfócitos. De um
modo geral, animais e seres humanos idosos apresentam uma reatividade imunológica
comprometida e uma diminuição na sua capacidade de reagir a antígenos novos. Está bem
documentada na literatura a dificuldade em vacinar indivíduos idosos assim como sua maior
suscetibilidade a infecções (Miller, 1996). E, todas essas alterações poderiam, de alguma
maneira, influenciar na forma como o indivíduo ou o animal responderia às doenças de caráter
infeccioso ou não.
Estudos também relatam modificações no desenvolvimento de doenças parasitárias
durante o processo de envelhecimento (Ndhlovu et al., 1996; Ouma et al., 1998; Naus et al.,
1999). Na esquistossomose humana, por exemplo, a intensidade de infecção geralmente
aumenta nas duas primeiras décadas de vida diminuindo progressivamente a partir da segunda
década de vida (Naus et al., 1999). Na literatura existe um consenso de que, embora ocorra
46
uma pequena redução nos níveis de exposição dos indivíduos com a idade, ela é insuficiente
para explicar a grande redução na intensidade de reinfecção, cuja causa foi atribuída ao
desenvolvimento de uma resistência adquirida com a idade (Butterworth et al., 1985).
Conseqüentemente, esforços têm sido realizados no sentido de elucidar os diferentes
mecanismos envolvidos na resistência ao Schistosoma mansoni (Butterworth et al.,
1985;Wilkins et al., 1987;Gryseels, 1994;Ndhlovu et al., 1996).
A morbidade da esquistossomose resulta da infecção com o parasito Schistosoma
mansoni e a severidade da doença é conseqüência da fibrose causada pela resposta imune aos
ovos que se encontram presos no sistema porta hepático, seqüestrados em lesões
granulomatosas (Cheever and Andrade, 1967;Warren, 1968;Chiaramonte et al., 2001;Abath et
al., 2006). O principal papel da reação granulomatosa na esquistossomose é proteger os
tecidos do hospedeiro, isolando as toxinas em potencial secretadas pelo ovo. Essa inflamação
gera uma resposta de reparação tecidual, desencadeando a deposição de colágeno tecidual,
que quando em excesso é a expressão da fibrose. Esse é um processo dinâmico em que o
tamanho e a composição celular das lesões variam com o tempo e é coordenado pela
influência de uma rede de mediadores inflamatórios como células inflamatórias e citocinas
(Conlon, 2005; Chiaramonte et al. 2001; Wynn & Cheever, 1995; Weinstock, 1992; Warren,
1972; Warren 1968; Cheever & Andrade 1967).
A resposta granulomatosa crônica que ocorre em torno dos ovos do parasito, agravada
pela fibrose, é o maior responsável pelo desenvolvimento da patologia. Os ovos do
Schistosoma mansoni excretam um antígeno solúvel responsável pelo desencadeamento de
um complexo fisiopatológico reacional que promoverá a formação do granuloma em torno
dos ovos (Lenzi et al., 1991;Lukacs et al., 1993;Pearce and MacDonald, 2002;Lins et al.,
2008). A resposta granulomatosa, e não somente a ação direta dos antígenos dos ovos do
parasito, pode ser responsável pelas manifestações patológicas teciduais. Estudos em microcirculação têm mostrado que os granulomas formados em torno dos ovos nos capilares présinusoidais impedem o fluxo de sangue hepático. Tal bloqueio no sistema Porta hepático
induz a hipertensão portal (Boros, 1989). Outro fator que contribui para hipertensão portal é a
fibrose de Symmers, que desenvolve em torno de ramos da veia porta.
Com o
desenvolvimento do granuloma e da fibrose, juntamente com valores elevados de pressão
portal e intensa atividade imunológica do hospedeiro, pode levar ao desenvolvimento de
hepatosplenomegalia, forma clinica mais grave da doença (Boros, 1989). Apesar do papel na
patologia da esquistossomose, o granuloma também possui um papel protetor para o
hospedeiro. Os ovos do S. mansoni liberam toxinas que são tóxicas para as células teciduais.
47
Portanto, caso os ovos de S. mansoni e suas toxinas não sejam neutralizados ou seqüestrados
efetivamente, podem causar danos aos tecidos afetados (Damian et al., 1984;Pearce and
MacDonald, 2002).
Nesse contexto foi de interesse analisar a histopatologia do fígado e baço dos grupos de
camundongos jovens e idosos. Avaliou-se o número e tamanho dos granulomas, o infiltrado
celular (expressão da inflamação) e depósito de colágeno (expressão da fibrose) nesses
órgãos.
6.1 NÚMERO E TAMANHO DE GRANULOMAS HEPÁTICOS DE CAMUNDONGOS
JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE INFECÇÃO.
Na presente análise, os camundongos jovens apresentaram maior número de granulomas
durante a infecção crônica (J 120) quando comparado a infecção aguda (J 70) (p=0,0008).
Entretanto, não foi observada essa diferença nos animais idosos (I 70 - I 120) (Figuras 1 e 2).
Segundo Hernandez e colaboradores (Hernandez et al., 2004), o desenvolvimento dos
parasitos da forma de cercária infectante para vermes adultos produtores de ovos depende de
um sistema
imune
intacto.
Esses autores demonstraram que em camundongos
imunodeficientes, o sistema imune do hospedeiro tem um papel fundamental no
desenvolvimento dos machos de S. mansoni e este, por sua vez, são essenciais ao
desenvolvimento da fêmea do parasito.
O envelhecimento está associado a mudanças no sistema imune, tanto na arquitetura dos
tecidos dos órgãos linfóides, como no fenótipo de células do sistema imunológico e alterações
no padrão de citocinas produzidas, tais mudanças poderiam afetar, de alguma forma, a postura
de ovos nos animais idosos (Ernst et al., 1993;Barrat et al., 1995;Kurashima and Utsuyama,
1997;Timm and Thoman, 1999;Gruver et al., 2007). Isso permitiria uma maior retenção dos
ovos no tecido hepático já no início da infecção, que se mantém na fase crônica nos animais
idosos. Embora não se tenha observado um aumento significativo entre J 70 e I 70, o que
poderia ser explicado pelo número de animais estudados.
Com relação à área dos granulomas, camundongos jovens apresentaram granulomas
menores na fase crônica (J 120) quando comparado com a fase aguda (J 70) (p= 0,0486)
(Figuras 3 e 4). Essa diferença não foi observada no grupo de camundongos idosos (I 70 – I
120). Durante a infecção por Schistosoma mansoni, há o desenvolvimento de uma resposta
48
inflamatória granulomatosa devido à deposição de ovos no tecido. Ao longo do curso da
infecção, durante a passagem da fase aguda para a fase crônica, observa-se uma modulação
desse granuloma, exercida por diversos fatores dentre eles a interleucina-10. A IL- 10 é uma
citocina moduladora produzida por uma diversidade de células tais como células
TCD4+CD25+ (células T reguladoras – Treg) além de macrófagos e células TCD4+ e TCD8+.
As células T reguladoras têm papel crucial na supressão da resposta imune a auto-antígenos e
na prevenção de doenças auto-imunes, além de controlarem a resposta imune a bactérias,
vírus, parasitos e fungos (de Waal et al., 1991;Mills, 2004). Em indivíduos idosos, não está
claro se o pool de Treg é significativamente diferente daquele encontrado em indivíduos
jovens, entretanto, alguns autores têm demonstrado que idosos têm um aumento nas Tregs em
comparação aos jovens (Kozlowska et al., 2007). Além disso, pode ocorrer uma produção
aumentada de IL-10 em animais idosos. Spencer e colaboradores (1996) demonstraram que o
tratamento de animais idosos com sulfato dehidroepiandosterona (DHEAS), um esteróide
natural, reverteu as alterações associadas ao envelhecimento na produção de citocina,
rendendo ao camundongo tratado total similaridade a adultos maduros controle (Spencer et
al., 1996). Sugere-se então que em animais idosos ocorreria uma modulação do granuloma já
na fase aguda da infecção que é mantida na fase crônica, enquanto que em animais jovens tal
modulação ocorreria na fase crônica. Tal fato estaria relacionado à patologia, e em animais
idosos a modulação possivelmente estaria associada tanto à patologia quanto ao
microambiente senescente, sabidamente alterado nesses animais. Interessantemente, em
animais jovens com 120 dias de infecção ocorre uma modulação da resposta granulomatosa
ao ponto que o seu granuloma fica significativamente menor que dos idosos no mesmo
período (p=0,0022) (Figuras 3 e 4). Esse fato pode ser explicado pelo grande pool de células
virgens de camundongos jovens comparado aos idosos. Isso possibilita ao animal jovem
ampliar sua resposta moduladora frente à inflamação granulomatosa existente em comparação
aos animais idosos.
O principal efeito do envelhecimento no sistema imune pode ser observado no timo
(sítio de maturação das células T). A atrofia tímica associada ao progressivo envelhecimento,
leva a uma redução de tecido tímico funcional e um declínio na geração de células T. Há
então, uma diminuição no aporte de células virgens desse órgão. Associado a essa diminuição,
o acúmulo de linfócitos T expressando um fenótipo de células ativadas - resultado do
processo natural e acumulativo de ativação - as mudanças nas interações com as células
apresentadoras de antígeno que também apresentam alterações com o envelhecimento,
sugerem que animais idosos possuam um perfil de citocinas diferente do perfil de animais
49
jovens, uma vez que as células T "virgens" secretam um perfil de citocinas diferente das
células T memória. Isso leva a crer que animais idosos apresentariam uma diminuição na sua
capacidade de reagir a antígenos novos (Jenkinson et al, 2008; Gruver et al, 2007; Miller,
1996; Takeoka et al., 1996; Hobbs et al., 1993, 1994). Assim, sugere-se que, por possuírem
um repertorio de células T memória inicial maior que o de animais jovens, os camundongos
idosos responderiam aos antígenos de ovo do S. mansoni já durante a fase aguda de infecção,
inclusive através de citocinas moduladoras como a IL-10, que já sabidamente se encontra
elevada no envelhecimento. Entretanto, animais jovens possuem uma maior capacidade de
responder a novos antígenos e evoluem para um granuloma com área menor que a de idosos
na infecção crônica. Além disso, estudos sugerem que animais idosos possuem um maior pool
de células T reguladoras, principal fonte de IL-10 - uma citocina reguladora produzida por
varias células tais como macrófagos e células TCD4+ (Kozlowska et al, 2007; Saverino et al,
2008). Isso sugere que os animais idosos podem ter uma regulação da resposta inflamatória
granulomatosa, mantendo assim a mesma área de granuloma durante a evolução da infecção
aguda para a crônica.
O presente estudo faz parte de um projeto mais abrangente que analisa a influência da
senescência na resposta imune frente à esquistossomose em modelo murino. Outros dados
foram obtidos pelos estudos adjacentes referentes ao mesmo projeto, determinando uma
análise fenotípica das populações celulares e das citocinas presentes no fígado de animais
jovens e idosos, nas fases aguda e crônica da esquistossomose experimental. Observou-se que
animais idosos apresentaram elevada concentração de interleucina-10 (IL-10) desde a fase
aguda de infecção, mantendo esses altos níveis na fase crônica de infecção. Já animais jovens
apresentaram maior flexibilidade, com aumento da IL-10 frente à exposição ao novo antígeno,
tanto do ovo (SEA) quanto do verme (SWAP) de S. mansoni. Em relação ao IFNγ, altos
níveis foram apresentados pelos animais idosos, sugerindo uma ativação precoce, com
pequena alteração frente ao antígeno e leve aumento na fase crônica de infecção, enquanto
que animais jovens apresentaram aumento de IFNγ frente aos antígenos tanto na fase aguda
quanto na fase crônica de infecção por S. mansoni. Dados complementares forneceram
informações referentes ao percentual de células virgens e ativadas nos animais. Animais
jovens apresentaram maior nível percentual de células virgens que animais idosos (T
CD4+CD62L+, por exemplo). Além disso, há leve diminuição desse percentual nos animais
jovens da fase aguda para a fase crônica, demonstrando mais uma vez a flexibilidade, em
contraste a uma manutenção de mesmos níveis percentuais de células virgens em animais
idosos nas fases aguda e crônica de infecção. Em relação às células ativadas (T
50
CD4+CD45RBhi+, por exemplo), jovens apresentam a mesma característica de flexibilidade
demonstrada pelo aumento no percentual dessas células da fase aguda para a fase crônica de
infecção enquanto animais idosos apresentaram pequena alteração nesse percentual de células
ativadas. Esse perfil apresentado pelos animais jovens sugere então maior adaptabilidade e
flexibilidade fenotípica frente a um novo antígeno e um padrão parcialmente modulado e
refratário por parte dos animais idosos, que pode ser explicado em parte pela supressão de
moléculas co-estimuladoras devidos aos altos níveis de IL-10 (Speziali et al., 2009).
6.2 ANÁLISE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA PRESENTE NO FÍGADO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE
INFECÇÃO.
Após a deposição dos ovos nos tecidos, eles são rapidamente cercados por infiltrados de
células inflamatórias, resultando no granuloma. Esse é um processo dinâmico no qual o
tamanho e a composição celular do granuloma variam com o tempo sendo regulado por uma
rede de mediadores inflamatórios. Durante o desenvolvimento da resposta granulomatosa na
esquistossomose, observa-se um recrutamento celular intenso (infiltrado inflamatório) cuja
composição principal é de eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos (Conlon, 2005;
Rumbley, et al., 1999; Wynn & Cheever, 1995; Weinstock, 1992). O extenso infiltrado
celular (expressão da inflamação) foi avaliado, neste estudo, através da diferença entre a
celularidade presente no tecido hepático dos animais infectados em relação ao tecido hepático
dos animais não infectados (controle).
Ao analisar a celularidade tecidual de animais jovens e idosos com 70 e 120 dias de
infecção, notou-se que a celularidade e infiltrado celular foi maior nos camundongos
infectados que no grupo controle, exceto para o grupo de idosos durante a fase crônica de
infecção (dados não mostrados graficamente). A análise realizada dessa maneira permite
caracterizar como processo inflamatório, o aumento da celularidade, marcado pelo aumento
do infiltrado celular no tecido hepático. Esse resultado já era esperado, uma vez que a
presença dos ovos do parasito desencadeia uma resposta inflamatória do tipo granulomatosa
caracterizada pela presença de macrófagos, eosinófilos e linfócitos (Chiaramonte et al. 2001;
Weinstock, 1992; Warren, 1972; Warren 1968; Cheever & Andrade 1967).
51
Comparando-se os grupos de camundongos infectados durante a fase aguda da infecção,
observou-se que a celularidade tecidual foi maior nos camundongos idosos (I 70) quando
comparado à celularidade tecidual dos animais jovens (J 70) (p=0,0305) (Figuras 5 e 6). Não
houve diferenças entre os grupos de camundongos jovens e idosos com 120 dias de infecção
(J 120 – I 120). Entretanto, pode-se notar uma leve tendência de diminuição de celularidade
no grupo de animais idosos da fase aguda para a fase crônica de infecção (P= 0,0583)
(Figuras 5 e 6).
Corroborando com a hipótese de que os animais idosos, por terem um repertório de
células T de memória maior que o de indivíduos jovens, poderiam responder à infecção de
uma forma mais rápida. E que a redução na geração de células T virgens, poderia levar a uma
incapacidade parcial do sistema imune senescente de amplificar a sua resposta. Além disso,
existem relatos de alterações nos fenótipos das células T periféricas com a idade, tais como
mudanças em receptores de adesão (CD44), nos receptores ligados a migração de linfócitos
para linfonodos periféricos (CD62L) e a diminuição na expressão das cadeias γ e β do
receptor de IL-2 (importante na proliferação celular). Essas alterações poderiam justificar a
diferença de migração leucocitária para o local da infecção entre animais idosos e jovens.
Vale salientar que o aumento de células inflamatórias ocorre para aumentar a modulação do
granuloma e diminuir seu tamanho (Timm & Thoman, 1999; Kurashima & Utsuyama, 1997;
Wakikawa et al, 1997; Barrat et al., 1995; Ernst, 1993).
É importante salientar que alterações nos fenótipos de células T podem levar a uma
mudança no perfil de citocinas, gerando assim, uma alteração da resposta aos antígenos pela
modificação no ambiente imunológico. Estudos sugerem que células T virgens de
camundongos idosos tenham uma reduzida ativação, diferenciação e produção de citocinas.
Células Th1 e Th2 de memória derivada de células T virgens senescentes produzem muito
menos IL-2 e, IL-4 e IL-5, respectivamente, que células jovens (Haynes et al, 2005, 2003).
52
6.3 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO FÍGADO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE
INFECÇÃO.
A análise da neoformação de colágeno no fígado dos animais infectados mostrou que
animais infectados apresentaram um maior deposito de colágeno quando comparado aos seus
controles (dados não mostrados graficamente). Resultado esperado, pois a neoformação de
colágeno ocorre em resposta aos antígenos do ovo durante a infecção pelo S. mansoni.
Entretanto não houve diferenças entre os grupos de animais infectados jovens e idosos,
durante infecção aguda e crônica (Figuras 7 e 8). Houve uma leve tendência de aumento de
depósito de colágeno tecidual em animais idosos na fase crônica (I 120), entretanto não foram
encontradas diferenças estatisticamente significativas, devido, provavelmente, ao número de
animais.
6.4 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO PROCESSO FIBRÓTICO NO BAÇO DE
CAMUNDONGOS JOVENS E IDOSOS NAS FASES AGUDA E CRÔNICA DE
INFECÇÃO.
O baço é um órgão linfóide secundário que responde a antígenos sistêmicos por receber
antígenos drenados pelo sistema vascular (Pinchuk and Filipov, 2008). O sangue entra no
baço por uma rede de vasos, esses antígenos são seqüestrados e concentrados por células
dendríticas e macrófagos, e então apresentados aos linfócitos, iniciando assim uma resposta
ao antígeno apresentado (Pinchuk and Filipov, 2008).
Comparando a neoformação de colágeno no baço, observou-se que todos os animais
infectados apresentaram maior deposição de colágeno comparado aos seus controles, com
exceção do grupo de jovens eutanasiados com 70 dias de infecção. Da mesma forma que nos
outros aspectos histopatológicos já analisados, a resposta de deposição de colágeno é esperada
que seja maior nos infectados que nos animais não infectados, sugerindo que essa deposição
seja desencadeada pela infecção (dados não mostrados graficamente). Ao analisar os grupos
de animais infectados entre si, observou-se que os animais jovens apresentaram uma maior
deposição de colágeno no baço durante a infecção crônica (J 120) quando comparado a jovens
53
na fase aguda (J 70) (Figuras 9 e 10). Durante a infecção aguda de animais jovens, a resposta
é observada mais localmente no tecido hepático e não sistemicamente. Mas com a passagem
da fase aguda para a fase crônica, inicia-se, então uma maior resposta no baço. Isso sugere
que, enquanto na fase aguda, os antígenos estimulariam células mais localmente no tecido
hepático, com o decorrer da infecção, esses antígenos se espalhariam pelo sistema vascular,
gerando assim, uma resposta mais sistêmica expressa pela resposta esplênica a esses
antígenos, como por exemplo, ativação de fibroblasto e conseqüente produção de colágeno.
Durante a fase aguda de infecção, o grupo de camundongos idosos (I 70) apresentou
maior neoformação de colágeno quando comparado com camundongos jovens (J 70) (Figuras
9 e 10). Reforçando, então, a idéia de que o sistema imune senescente possui um repertório de
células ativadas maior, possibilitando a esses animais responderem precocemente já numa
fase aguda da infecção.
Diferentemente do observado em animais jovens, os animais idosos não apresentam
modificação no que diz respeito à deposição de colágeno. Tal resultado sugere que os animais
jovens com maior pool de células virgens amplificariam sua resposta ao longo da infecção
enquanto os idosos possuem uma menor capacidade de aumentar sua resposta, permanecendo
com a mesma resposta da fase aguda para a crônica. Isso pode ser reflexo de uma
adaptabilidade e flexibilidade do jovem de uma fase aguda para crônica. Sabe-se que o
processo de envelhecimento é acompanhado de uma modificação no padrão celular quando
comparamos animais jovens e idosos. Há uma modificação de um padrão de maior quantidade
de células virgens, maior contribuição do Timo, maior diversidade celular e menor quantidade
de células de memória em animais jovens, passando para um padrão de maior fenótipo de
células de memória, mínima contribuição do Timo e pequena diversidade celular nos animais
idosos (Berzins et al., 2002).
6.5 ANÁLISE DOS DADOS PARASITOLÓGICOS.
Os dados parasitológicos demonstraram que as diferenças observadas no presente estudo não
se devem à carga parasitária. Dessa forma, torna-se ainda mais relevante o processo de
senescência como fator responsável pelas alterações observadas.
54
7 CONCLUSÃO
O estudo proposto fornece evidências que suportam a hipótese de uma capacidade do
organismo senescente de modular sua resposta já no inicio da infecção por S. mansoni e uma
menor capacidade desse organismo de amplificar sua resposta a novos antígenos. Além disso,
sugere que essa menor capacidade pode ser resultado das mudanças no sistema imune, tanto
na arquitetura de tecidos de órgãos linfóides, como no fenótipo de células do sistema
imunológico. Sugere-se também uma refratariedade parcial no que diz respeito à resposta
imune apresentada pelos animais idosos frente à resposta granulomatosa. Essas características
determinam o desenvolvimento histopatológico diferenciado da resposta granulomatosa e
inflamação no fígado, e da fibrose hepática e esplênica de animais idosos quando comparados
com animais jovens, possibilitando inferir uma grande influência do processo de senescência
no desenvolvimento da esquistossomose mansoni murina.
55
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