determinação de doseamento e taxa de encapsulação de anti

DETERMINAÇÃO DE DOSEAMENTO E TAXA DE ENCAPSULAÇÃO DE
ANTI-INFLAMATÓRIOS EM NANOPARTÍCULAS.(1)
Carlos Eduardo da Rosa Silva(2),Kelly Ayumi Nakama(3), Sandra Elisa Haas(4)
(1)
Trabalho executado com recursos do Edital Universal 2013/Edital Pesquisador Gaúcho Fapergs 2013, Bolsa
Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Tecnológica e Inovação (PROBITI)/Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPqUNIPAMPA).
(2)Estudante de Graduação; Bolsista CNPq; Universidade Federal do Pampa; Uruguaiana-RS; [email protected]
(3) Estudante de Graduação; Bolsista PBDA; Universidade Federal do Pampa; Uruguaiana-RS; [email protected]
(4) Orientadora; Universidade Federal do Pampa; Uruguaiana-RS; [email protected].
RESUMO:
Para o tratamento da Doença de Alzheimer a terapia com anti-inflamatórios é emergente, a associação de
Curcuminóides(CUR) e inibidores da COX(MLX) em Nanopartículas(NP) é uma estratégia interessante para contornar a
baixa Biodisponibilidade e melhorar a eficácia. O Objetivo é desenvolver um método por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência(CLAE) capaz de quantificar CUR e MLX simultaneamente em NP e determinar o Doseamento(DO) e a Taxa
de Encapsulação(TE). As Nanopartículas foram preparadas pelo método de Nanoprecipitação. TE foi determinada pelo
método de ultra-filtração/ultra-centrifugação usando Ultrafree®. O DO foi obtido pela dissolução das NP em metanol. Foi
utilizado CLAE com uma coluna C18, Água/Metanol/Acetonitrila como fase móvel realizando a detecção em 424nm
(CUR) e 325nm (MLX). O processo de validação foi realizado conforme os guias do ICH e da Re nº899(ANVISA),
apresentando linearidade com r>0,999, precisão com coeficiente de variância máximo <2,0%, exatidão com
recuperação entre 98,00% e 102,00%, especificidade quando comparada uma formulação placebo não houve
interferentes e robustez quando alterações no pH e no fluxo da fase móvel não causaram grande variação na
recuperação(máx:<5,00%). Como TE obtivemos aproximadamente 100%, como DO valores próximos a 95%. Portando,
obtivemos um método como ferramenta simples e fácil para posteriores estudos com CUR e MLX.
Palavras-Chave: Nanotecnologia, CLAE, Alzheimer.
INTRODUÇÃO
O Processo ao qual a Doença de Alzheimer (DA) afeta as células nervosas é estimado que envolva
certos processos : inflamação, dano oxidativo, formação de placas beta-amilóides e presença de metais
tóxicos, e a Curcumina(CUR) popularmente conhecida como Açafrão-da-Terra possui amplos efeitos
terapêuticos sobre a DA como evidenciado por diversos estudos vistos neste artigo de revisão feito por
Mishra et. al, (2008) sendo anti-oxidante, anti-inflamatória, diminui carga de placas de beta-amilóide e
também é um quelante de metais, porém seu uso é limitado devido a sua baixa solubilidade aquosa
(Ravindranath V, 1981).
Meloxicam é um Anti-inflamatório Não-Esteroidal (AINE). Seu mecanismo é através da inibição
preferencial de COX-2 em relação a COX-1, e consideráveis evidências mostram que níveis elevados de
COX-2 estão associados com ativação da microglia pelo peptideo beta-amiloide na DA.( Fujimi, K et. al,
2007). MLX também possui baixa solubilidade aquosa e devido à isso também pode causar irritações
gástricas. (Martindale, 1999).
Buscando contornar essas limitações, usar a nanotecnologia é uma estratégia promissora para
melhorar a biodisponibilidade oral de farmácos pouco solúveis em água e também aumentar a penetração
na barreira hemato-encefálica reduzindo os efeitos adversos e aumentando a eficácia. (Fakes et al, 2009;
Cerdeira et al, 2010; Pardeike & Müller, 2010
Assim, o objetivo é desenvolver um método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)
capaz de quantificar a CUR e o MLX contidos em NP simultaneamente, para caracterizar o
Doseamento(DO) e a taxa de encapsulação (TE) destas NP.
METODOLOGIA
Foi utilizado CLAE com uma coluna C18, água/metanol/acetonitrila como fase móvel e as detecções
forem realizadas em 424nm(CUR) e 325nm(MLX). Preparou-se uma solução padrão de CUR e MLX em
metanol. Todo o processo de validação foi executado de acordo com os guias do ICH e a Renº899/2003
(ANVISA). A linearidade foi obtida com a média de 3 curvas independentes com 7 pontos de concentração
(na faixa de 0.5 a 9μg/mL).Avaliou-se a precisão intra-dia(n=9) e inter-dia(n=27) pela determinação de 3
diferentes concentrações. A exatidão foi investigada pela taxa de recuperação após a adição dos fármacos
em formulações placebo submetidas aos mesmos processos.
O teste de especificidade foi realizado comparando a presença de picos interferentes no mesmo
tempo de retenção da CUR e do MLX, analisando uma solução placebo relativa a solução das NP. A
robustez foi avaliada quando comparamos a recuperação com poucas variações do método no pH e no
Anais do VII Salão Internacional de Ensino, Pesquisa e Extensão – Universidade Federal do Pampa
fluxo da fase móvel comparando com as condições padrões.Finalmente o Limite de Quantificação e
Detecção foram calculados conforme as equações sugeridas pelo ICH.
As NP foram preparadas pelo método de nanoprecipitação. A TE foi determinada pelo método de
ultrafiltração/ultracentrifugação usando Ultrafree®. DO foi obtido da dissolução das NP em metanol.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na validação do método obtivemos resultados positivos que se enquadram no que rege a legislação
e guias vigentes. Na linearidade avaliamos se a resposta analítica conferida pelo equipamento é
proporcional à concentração testada, com a média das curvas, obtivemos valores de correlação linear
adequados com r²>0,9990. A exatidão mostra a relação entre a concentração teórica e a concentração real
das amostras, onde formulações de NP placebo foram batizadas com solução padrão dos fármacos para
obtermos concentrações pré-determinadas,. A precisão foi avaliada intra e inter-dia, onde os valores
utilizados são demonstrados como coeficiente de variação(CV) onde não foram encontrados valores de
CV>2,0 como visa a legislação.
Na Robustez, quando comparamos os resultados obtidos da robustez com os resultados das
condições normais obtivemos um máximo de CV<5,0%, o que condiz que o método é robusto, ou seja,
apresenta resultados semelhantes mesmo que ocorra desvio de alguns parâmetros como fluxo e pH. Os
Limites de Quantificação (LQ) e Limite de Detecção (LD) foram calculados conforme as equações sugeridas
pelo ICH, segue a eq (1). Onde 𝜎 é o desvio padrão e 𝑆 é o coeficiente angular da curva obtidos de uma
curva de calibração.
Eq(1) :
𝐿𝐷= 3.3 × 𝜎 / 𝑆 𝐿𝑄= 10 × 𝜎 / 𝑆
Para LQ obtivemos inferiores a 0,001ng/mL tanto para CUR quanto para MLX. Para LD
obtivemos0,002 ng/mL(CUR) e 0,003 ng/mL (MLX). Foram valores bastante baixos o que confere ao
método uma boa sensibilidade. Na especificidade não foi encontrado nenhum pico interferente no mesmo
tempo de retenção da CUR e MLX
Com o método previamente validado, podemos avaliar o DO, partindo de concentrações teóricas de
3mg/mL(MLX) e 6mg/mL(CUR), avaliamos a real concentração das nanopartículas . Para CUR obtivemos
valores superiores a 93% e para o MLX acima de 95%. Na TE submetemos a formulação de NP ao
processo de ultra-filtração/ultra-centrifugação, e retiramos um alíquota do ultra-filtrado, porém foi muito difícil
de quantificar pois havia uma baixa concentração de fármaco na amostra, o que significa que obtivemos
quase que a totalidade dos compostos encapsulados sendo a TE próxima de 100% para Ambos.
CONCLUSÕES
O Método foi validado conforme a legislação e guias vigentes, se tornando uma ferramenta simples,
sensível e rápida para quantificação dos antiinflamatórios em formulações de NP. Obtivemos um
doseamento e taxa de encapsulação que nos encorajam a seguir com os próximos estudos, como os testes
de fotoestabilidade, liberação in vitro e teste de absorção do saco intestinal invertido.
REFERÊNCIAS
FAKES, M.G., VAKKALAGADDA, B.J., QIAN, F., DESIKAN, S., GANDHI, R.B., LAI, C., HSIEH, A., FRANCHINI, .K.,
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FUJIMI, K.; NODA, K.; SASAKI, K.; WAKISAKA, Y.; TANIZAKI, Y.; IIDA, M.; KIYOHARA, Y.; KANBA, S.; IWAKI, T.
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Hisayama study. Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 23, 423–431, 2007.
CERDEIRA, A.M., MAZZOTTI, M., AND GANDER, B. Miconazole nanosuspensions: Influence of formulation variables
on particle size reduction and physical stability.Int. J. Pharm., 396, pp. 210-218. 2010
MISHRA, S. AND PALANIVELU, K. The effect of curcumin (turmeric) on Alzheimer's disease: An overview . Ann Indian
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PARDEIKE, J., AND MÜLLER, R.H. Nanosuspensions: A promising formulation for the new phospholipase A2inhibitor
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RAVINDRANATH V, CHANDRASEKHARA N. In vitro studies on the intestinal absorption of curcumin in rats. Toxicol.;
20:251–257, 1981.
MARTINDALE The Extra Pharmacopoeia, 32nd ed.: The Pharmaceutical Press, London, England, 1999.
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