clarissa favero demeda análise do comportamento das

CLARISSA FAVERO DEMEDA
ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DAS LINHAGENS CELULARES SCC25, SAS E HSC-3 FRENTE À PRESENÇA DOS EXOSSOMOS DERIVADOS
DOS MACRÓFAGOS DOS SUBTIPOS M1 E M2.
NATAL-RN
2016
CLARISSA FAVERO DEMEDA
ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DAS LINHAGENS CELULARES SCC25, SAS E HSC-3 FRENTE À PRESENÇA DOS EXOSSOMOS DERIVADOS
DOS MACRÓFAGOS DOS SUBTIPOS M1 E M2.
NATAL-RN
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
CLARISSA FAVERO DEMEDA
ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DAS LINHAGENS CELULARES SCC-25, SAS
E HSC-3 FRENTE À PRESENÇA DOS EXOSSOMOS DERIVADOS DOS
MACRÓFAGOS (TAMS) DOS SUBTIPOS M1 E M2
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de
Pós-graduação em Patologia Oral do
Departamento de Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como parte
dos requisitos para a obtenção de Título do
Doutor em Patologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto
Co-Orientadora: Profa. Dra. Tuula Anneli
Salo
NATAL-RN
2016
Catalogação na Fonte. UFRN/Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Demeda, Clarissa Favero.
Análise do comportamento das linhagens celulares SCC-25, SAS e HSC-3 frente à
presença dos exossomos derivados dos macrófagos (TAMs) dos subtipos M1 e M2 /
Clarissa Favero Demeda. Natal, RN, 2016.
104 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto.
Co-orientadora: Prof. Dra. Tuula Anneli Salo.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de PósGraduação em Patologia Oral.
1.
I. Pinto, Leão Pereira, II. Título.
RN/UF/BSO
Black D74
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, por todo amor, dedicação e coragem que me foi ensinado.
Por mostrarem que o verdadeiro caminho da vida se faz pelo conhecimento, honestidade,
humildade e caridade.
Aos meus irmãos, meus melhores amigos.
Ao meu marido, com todo amor que se pode sentir, naquele lugar mais
profundo, entre a sombra e a alma.
AGRADECIMENTOS
Era uma vez, uma garota repleta de sonhos que não sabia exatamente para onde ia,
mas sabia que iria. Ela pensava que não cabia dentro de um lugar só, mas sim, um dia teria
que percorrer uma parte do mundo. A educação sempre foi seu ponto forte, sempre tendo força
e coragem para perseverar, mesmo quando tudo parecia tão difícil. Dedicação para atingir
seus objetivos era sua principal característica. Um dia, essa garota cresceu, e seus sonhos
acabaram se apagando, a vida a levou a diferentes caminhos. Queria ser bióloga, fez
Odontologia. Queria estudar os oceanos, acabou estudando a cavidade oral e toda a sua
influência em um ser humano. Queria ser professora, mas foi convencida de que não seria
a melhor escolha.
Hoje, depois de tantas mudanças de percurso, essa garota aprendeu que sonhos devem
ser sonhados e, o mais importante, deve-se lutar para realizá-los. Em meio a tantas idas e
vindas, a Odontologia criou um novo caminho, no qual o estudo, dedicação, alegrias e
sonhos se completavam. Na busca de se tornar uma professora, talvez por ter nascido e
crescido tão curiosa com o mundo, ingressou precocemente na iniciação científica, que trouxe
bons frutos, como o amor pela Patologia Oral. Esse amor a levou a enfrentar grandes
batalhas, sim, muitas superações e aprendizados.
Acima disso, desde pequena ela sabia que seu lugar não era um só. Alguma voz lá
no fundinho da sua cabeça dizia, seu lugar não é aqui. E graças às oportunidades dadas
pelo Programa de Pós-graduação em Patologia Oral e pelos grandes mestres que tive em
minha vida acadêmica, comecei a conhecer o mundo. À professora Lélia e professora Roseana
meu profundo agradecimento por me darem a oportunidade de ir a Istanbul participar da
IAOP, essa viagem me ajudou a perceber que eu era capaz de muito mais coisas que poderia
imaginar.
Ao Programa de Pós-graduação agradeço profundamente o dia em que convidaram
professora Tuula Salo e seu esposo Leo Tjäderhane para ministrarem uma palestra em
comemoração aos 30 anos do Programa. Neste dia, conheci as pessoas mais brilhantes,
amigáveis e amáveis. E essa garota que já sabia que não poderia mais ficar no mesmo lugar,
tomou coragem e perguntou se poderia acompanhar a professora Tuula em Oulu para realizar
sua tese de doutorado. Sim, pois até mesmo a Tuula pensou: O que será que essa maluca
quer fazer em Oulu. Será que ela está sendo apenas educada ou é doida mesmo?
Ela não estava sendo educada, e sim, era doida mesmo. Sabia que devia perguntar e
sabia que devia tentar. E essa professora com um enorme coração e uma mente brilhante a
acolheu, em sua cidade, em seu laboratório e até em sua casa.
E assim.. com altos e baixos, alegrias e tristezas, encontros e desencontros, chegadas
e partidas, fez-se um doutorado....
Agradeço de forma muito especial e primeiramente a Deus, nosso Pai e Criador,
Grande em seu poder e bondade por ter me dado forças, garra, coragem para não me desviar
do caminho que me foi proporcionado. A Ele, agradeço, ainda, imensamente e
incondicionalmente a família que me foi cedida como presente.
Aos meus pais, Sergio e Clenice, que sempre me proporcionaram a oportunidade de
crescer e aprender, nunca medindo esforços e que sempre foram meu alicerce e exemplo de
coragem, luta, dedicação, perseverança e amor. Por eles e com eles estou chegando ao caminho
sonhado.
Ao meu marido, grande companheiro de jornada que esteve comigo desde os primeiros
devaneios, pensamentos e decisões me acompanhando, dando força, torcendo, acreditando e
apoiando. Sem ele, não teria chegado tão longe. Como um alicerce, uma grande rocha, firme
em suas estruturas e sólido, que suporta todas as intempéries a que lhe são submetidos, ele
esteve ao meu lado, não importa como, onde, nem quando, mesmo que por um bom tempo
um oceano e um continente nos separassem ele se manteve ao meu lado, com toda sua força.
Ao meu amor, meu muito obrigado.
Aos meus irmãos, Vanessa e Vinícius, meus fiéis cumplices, que mesmo o tempo
tendo tratado de nos manter separados sempre estiveram me dando apoio, em todos os
momentos. Desde sempre e para sempre, obrigada. Amo vocês.
À minha tia Clezita, minha segunda mãe, que sempre torceu e me acompanhou nas
batalhas. Querida tia, que sorte a minha de tê-la ao meu lado.
Aos meus sogros, Suely e José Maria, e aos meus cunhados, Danielle e Marcelo,
obrigada por compartilharem comigo e com Rodrigo nossos momentos de vitória durante
esses quatro anos.
Aos meus amigos de vida: Cristiane, Delmir, Débora, Natália, Isabel, Danielle e
Roberta. Que são responsáveis pelos momentos de distração, alegrias e descontração na
minha vida. Sorte daqueles que tem amigos como vocês.
Aos amigos distantes, aqueles que sinto por perto e que sempre guiam meus
pensamentos.
Aos amigos que jamais pensaria que os colocaria aqui, companheiros da jornada em
Rio Branco, Nany, Thiago, Letícia, Vivian, Cil, Marianna, Luis, Iná, Marino, Paula, Mário,
Érico e todos os que passaram tão rápido por nós, mas que deixaram suas marcas. Obrigado
por tornarem os nossos dias em Rio Branco mais leves, mais alegres e por estarem ao lado de
Rodrigo num período que não pude acompanhá-lo. Beijo no coração.
Às amigas de curso e companheiras de vários anos e histórias de uma vida, Géorgia
e Ariza, obrigada por compartilharem comigo as alegrias e tristezas, principalmente pelas
gargalhadas e pelas horas de conversa despretensiosa e agradável.
Às companheiras de sofrimentos, de aprendizado, de angústias, de vitórias, de
crescimento e conquistas, aquelas que o destino juntou para que pudessem aprender melhor
a patologia e destrinchar os segredos das lesões de cavidade oral, se é que conseguiremos um
dia, Rose, Jamile, Melka, Denise, Natalia e Ana Luiza. Que nossos caminhos sejam
iluminados. Sem esquecer da já doutora e competente professora Bárbara, que me ouvia nas
horas de angústia e que sempre me deu força. Obrigada.
Aos queridos colegas da Patologia Oral, Luciana, Maria Luiza, Andréia, Tiago,
Jadson, Marcelo, Mariana, Rodrigo, Thalita, Viviane, Vilson Júnior, Fernanda e Adriana,
Keila, Águida, Joabe e tantos outros não menos importantes, obrigada pelas horas de
aprendizado, descontração e por compartilharem seus conhecimentos comigo.
À Cynthia e Ana Rafaela, por terem me ajudado ainda enquanto iniciava meus
passos no mestrado e me dado a oportunidade de aprender.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Professora
Roseana, Professora Hébel, Professor Costa, Professora Márcia, Professora Éricka, Professor
Carlos Augusto e Professor Bruno. Meus mais profundos agradecimentos por terem
participado desses importantes anos na minha conquista por uma gota no oceano de
conhecimentos.
Ao querido professor Leão, por ter sido o responsável por me apresentar a Patologia
Oral ainda quando acadêmica, por ter me deixado sonhar e acreditar que conseguiria
trabalhar na minha tese na Finlândia. Por sempre me aconselhar na minha vida acadêmica
e pessoal. Por ter sido um verdadeiro mestre.
À professora Lélia Batista, por demonstrar todos os dias sua dedicação pela Patologia
Oral, por ter me apoiado na decisão de ir para Finlândia, por ter me dado a oportunidade de
acompanhá-la na IAOP em Istanbul, por todas as oportunidades geradas, pelo seu empenho
para que tudo dê certo. Meus mais sinceros reconhecimentos.
Ao professor Cassiano Nonaka, pelo exemplo de profissional e pelo auxílio a mim
dedicado durante meu mestrado e, ainda, durante o doutorado. Ainda levo seus
ensinamentos comigo.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN,
Gracinha, Idelzuite, Hévio, Sandrinha, Lourdinha e Ricardo, por serem sempre nosso apoio
e pelos profissionais gentis que sempre foram, vocês são um ponto de luz na Patologia Oral.
E por último, mas não menos importante, agradeço a professora Tuula Salo e toda
sua equipe por terem me acolhido de forma doce, amável e acolhedora em seu país. Oulu
acabou se tornando uma parte de meu coração, que levarei sempre para aonde for. Os
conhecimentos adquiridos nunca serão esquecidos e fica aqui a saudade e a vontade de
voltar para continuar um aprendizado importante não só para minha vida acadêmica
quanto para minha vida pessoal.
Agradeço de forma especial a Johanna Korvala, minha amiga, orientadora, chefinha,
encantadora, meu porto seguro e anjo de guarda enquanto estava em Oulu. Meu mais
profundo carinho e agradecimento por tudo que compartilhou comigo. Você é um exemplo de
competência, inteligência, humildade e bondade.
À minha também orientadora Emma Pirilä, agradeço por compartilhar as ideias de
nosso estudo, por todas as sugestões e conversas. Por ter aguentado dividir sua sala com
uma brasileira falante por 6 meses e por ter me dado a oportunidade de conhecer e me
aproximar da princesa Ella.
A todos os membros do grupo da professora Tuula, Majia Risteli, Mallu, Meeri
Sutinen, Pirjo Åström, Ilkka Alahuhta, Ehsanul Hoque, Abdirisak Ahmed, por todo o tempo
a mim dedicado e por todos os momentos de aprendizado, descontração e por tudo que me
ensinarem a viver como vocês.
Aos amigos brasileiros Priscila Campioni e Maurício Dourado, por toda a ajuda que
me foi dada, na moradia, no laboratório, nos momentos de descontração. Priscila, obrigada
pelo seu empenho em me ajudar quando cheguei, pelas nossas conversas e por compartilhar
seu conhecimento comigo. Mauricio, depois da sua chegada Oulu ficou mais divertida,
continue com esse seu brilho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelos auxílios
financeiros que possibilitaram a realização deste curso.
“Mesmo com tantos motivos
pra deixar tudo como está
Nem desistir, nem tentar,
agora tanto faz...
Estamos indo de volta pra casa”
RESUMO
O carcinoma epidermóide (CE) de língua representa uma das lesões malignas mais comuns em
cavidade oral e caracteriza-se por apresentar um comportamento localmente invasivo e
agressivo. Os exossomos são responsáveis pela comunicação célula-célula e podem influenciar
na progressão tumoral, metástase e eficácia terapêutica. Dentre as células capazes de secretar
exossomos estão as células tumorais e as células imunes. Sabe-se que a presença das células
imunes é importante para erradicar os tumores. No entanto, achados recentes demonstram que
a inflamação pode promover o crescimento tumoral. Os macrófagos associados a tumores
(TAMs) são conhecidos por apresentarem diferentes subtipos, M1 e M2, capazes de secretarem
exossomos. O presente estudo se propôs a observar o comportamento dos exossomos derivados
dos TAMs, dos subtipos 1 e 2, frente a cultura de células humanas SCC-25, HSC-3 e SAS
derivadas de CE de língua, por meio da análise da capacidade de invasão, proliferação e
viabilidade das células tumorais na presença dos exossomos. Observou-se que as
microvesículas derivadas dos TAMs apresentam positividade para CD63, caracterizando-as
como exossomos. Os exossomos dos TAMs do subtipo M2 foram os únicos a apresentarem
marcação para TGF-β, quando em comparação com os exossomos M1, THP1 e das linhagens
celulares de CE, sugerindo que os exossomos M2 podem ser responsáveis pela expressão de
TGF-β nas células tumorais, uma vez que são internalizados. Nos ensaios de migração,
observou-se que as células SCC-25 em presença de meio de cultura DMEM F/12, apresentaram
maior capacidade de invasão frente aos exossomos M2 (p≤0,001), para concentração de 0,1
µg/ml. Para as células HSC-3 e SAS, não foi observada relação estatisticamente significante
entre a presença de exossomos cultivados juntamente com as células tumorais e a capacidade
de invasão celular (p>0,05). Quando os exossomos foram colocados no compartimento inferior
do transwell, as células HSC-3 em presença dos exossomos M2 (1,0 µg/ml) apresentaram maior
capacidade de invasão (p≤0,001). O teste de viabilidade demonstrou que as células HSC-3
tornam-se mais viáveis frente à presença dos exossomos M2 (p≤0,001) na concentração de 50
µg/ml. Para as células SCC-25, o resultado foi o mesmo (p≤0,05). A imunofluorescência
demonstrou a internalização dos exossomos nas linhagens celulares estudadas. Os achados
sugerem que a presença de exossomos M2, frente às culturas de células de CE de língua, pode
ser um campo de pesquisa importante para futuros estudos com terapias-alvo.
Palavras-chaves: exossomos; carcinoma de células escamosas; macrófagos.
ABSTRACT
Squamous cell carcinoma (SCC) of the oral tongue is one of the most common malignant
lesions in the oral cavity and is characterized by presenting a locally invasive and aggressive
behavior. The exosomes are responsible for cell-cell communication and may influence tumor
progression, metastasis and therapeutic efficacy. Among the cells that can secrete exosomes are
tumor cells and immune cells. It is known that the presence of immune cells is important to
eradicate tumors. However, recent findings suggest that inflammation may promote tumor
growth. The tumor associated macrophages (TAMs) are known to have subtypes, M1 and M2,
that secrete exosomes. This study’s goal was to observe the behavior of derivatives TAMs
exosomes, subtypes 1 and 2, against human cell culture SCC-25, HSC-3 and SAS derived from
SCC of oral tongue, through the analysis of invasiveness, proliferation and viability of tumor
cells in the presence of exosomes. It was observed that the microvesicles derived from TAMs
are positive for CD63, characterizing them as exosomes. The exosomes of the M2 subtype
TAMs were the only ones to present TGF-β marking, as compared with M1 exosomes, THP1
and SCC cell lines, suggesting that M2 exosomes may be responsible for TGF-β expression in
tumor cells. In the migration tests, it was found that the SCC-25 cells in the presence of culture
medium DMEM F / 12 showed higher invasion capacity in the presence of M2 exosomes
(p≤0,001) to a concentration of 0.1 µg/ml. For HSC-3 and SAS cells, there was no significant
statistical relationship between the presence of exosomes and invasiveness (p> 0.05) for the
exosomes derived from TAMs. When the exosomes were placed in the lower compartment of
the transwell, the HSC-3 cells in the presence of M2 exosomes (1.0 µg/ml) had higher
invasiveness (p≤0,001). The viability test showed that HSC-3 cells became more viable in the
presence of M2 exosomes (p≤0.001) at a concentration of 50 µg/ml. For SCC-25 cells, the result
was the same (p≤0.05). Immunofluorescence showed the internalization of exosomes in the cell
lines studied. These findings suggest that the presence of M2 exosomes in the SCC of the oral
tongue cell cultures may be an important research field for future studies of targeted therapies.
Keywords: exosomes; squamous cell carcinoma; macrophages.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Exossomos são pequenas vesículas (30-100nm) liberadas por diversos
tipos celulares, contendo DNA, RNA, miRNA, proteínas e lipídios.
Apresentando marcadores de membrana como CD9, CD81 e CD63
(BENITO-MARTIN et al., 2015)...............................................................
Figura 2
Esquema da transferência de proteínas e RNA pelas vesículas
extracelulares (RAPOSO; STOORVOGEL, 2013)....................................
Figura 3
30
32
Estrutura da proteína tetraspanina. Os resíduos conservados estão
indicados, assim como as localizações das palmitoilações (vermelho) e
das glicolizações (verde) (LAZO, 2007)....................................................
Figura 4
Visão esquemática mostrando a presença do CD63 na via endossomal.
(POLS; KLUMPERMAN, 2009)..............................................................
Figura 5
34
35
Mecanismo proposto no qual EGCG inibe a infiltração de TAMs e a
polarização em M2 no microambiente tumoral (JANG et al.,
2003)...........................................................................................................
42
Figura 6
Experimento grupo 1..................................................................................
53
Figura 7
Experimento grupo 2..................................................................................
63
Figura 8
Caracterização dos exossomos isolados dos macrófagos pelo método
clássico da ultracentrifugação (WX ultra 90 - Thermo electron
corporation). Marcadas com anti-CD63. As figuras A-D mostram
exossomos THP1, B-E exossomos subtipos M1 e C-F exossomos dos
macrófagos tipo 2.......................................................................................
Figura 9
63
Imagem representativa da marcação pelo método de imunofluorescência
utilizando Vybrint Dilo (células tumorais-verde) e Exo-GLOW
(exossomos – vermelho). As imagens as colorações amarelas e
alaranjadas correspondem a internalização dos exossomos nas linhagens
celulares......................................................................................................
77
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Concentração de exossomos utilizada no estudo, calculadas com base nos
resultados no teste de Bradford.....................................................................
51
Quadro 2 Especificidade, Nº do catálago, fabricante, diluição, anticorpo secundário
e tempo de incubação do anticorpo primário utilizado na
imunoeletromicroscopia................................................................................ 52
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SCC-25 em meio de
cultura DMEMF/12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01, (***) p≤0,001.
NATAL-RN, 2016............................................................................... 64
Gráfico 2
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SCC-25 em meio de
cultura livre de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01 (***), p≤0,001.
NATAL-RN, 2016............................................................................... 65
Gráfico 3
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SCC-25 com
exossomos no compartimento inferior do transwell (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016......................................... 66
Gráfico 4
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular HSC-3 em meio de
cultura DMEMF/ 12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01 (***), p≤0,001.
NATAL-RN, 2016............................................................................... 67
Gráfico 5
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular HSC-3 em meio de
cultura meio de cultura com ausência de FBS. (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016......................................... 68
Gráfico 6
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular HSC-3 contendo
exossomos no compartimento inferior do transwell. (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016......................................... 69
Gráfico 7
Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SAS meio de cultura
com ausência de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01, (***) p≤0,001.
NATAL-RN, 2016............................................................................... 70
Gráfico 8
Ensaio de proliferação BrdU utilizando linhagem celular HSC-3 e
exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50
µg/ml, em meio de cultura DMEMF/12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01
(***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016..................................................... 71
Gráfico 9
Ensaio de proliferação BrdU utilizando linhagem celular HSC-3 e
exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50
µg/ml, em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01
(***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016..................................................... 72
Gráfico 10
Ensaio de viabilidade celular MTT utilizando linhagem celular HSC3 e exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50
µg/ml, em meio de cultura DMEMF/12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01
(***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016..................................................... 73
Gráfico 11
Ensaio de viabilidade celular MTT utilizando linhagem celular HSC3 e exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50
µg/ml, em meio de cultura com ausência de FBS. (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016......................................... 74
Gráfico 12
Ensaio de proliferação BrdU utilizando linhagem celular SSC-25 e
exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50
µg/ml, em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05 (**), p≤0,01
(***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016..................................................... 75
Gráfico 13
Ensaio de viabilidade celular MTT utilizando linhagem celular SCC25 e exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml,
50 µg/ml, em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01,
(***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016...................................................... 76
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – Graus Celsius.
µl – Microlitro.
µg – Micrograma.
AML – Leucemia Mielóide Aguda.
BrdU – 5-bromo-2-deoxiuridina.
CD – Células dendríticas.
CD63 – Do inglês, Cluster designation ou Cluster of differentiation (Grupo de designação ou
Grupo de diferenciação).
CE – Carcinoma Epidermóide.
CÉLULAS THP1 – Linhagem celular derivada do sangue periférico de paciente com leucemia
monocítica aguda.
CEO – Carcinoma Epidermóide Oral.
DMEM/F12 – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium e Ham’s F-12 Nutrient Mixture.
ECGC – Epigalocatenina galato.
EDTA – Do inglês, Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido etilenodiamino tetra-acético).
EpCAM – Do inglês, Epithelial cell adhesion molecule (Molécula de adesão celular epitelial).
FBS – Do inglês, Fetal Bovine Serum (Soro fetal bovino).
HK – Hidrocortisona.
HSC-3 – Linhagem de células de carcinoma de células escamosas de língua.
KRAS – Do inglês, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (Homólogo do oncogene de
sarcoma viral Kirsten rat).
LAPs – associação do TGF-β com sua proteína latente.
LLC – Porção de proteína que se liga ao TGF-β, causando sua inatividade.
M1 – Macrófagos associados a tumores do subtipo M1
M2 – Macrófagos associados a tumores do subtipo M2
MCP-1 – Do inglês, Monocyte Chemoattractant Protein 1 (Proteína quimioatrativa de
monócitos 1).
miRNA – Abreviatura para small non-coding RNA Molecule (Micro-RNA).
MMP – Do inglês, Matrix Metalloproteinases (Metaloproteinases de matriz).
MTT – Da sigla, (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide.
NF-Κb – Do inglês, Nuclear factor Kappa B (Fator nuclear Kappa B).
NK – Células Natural Killers.
PBS – Do inglês, Phosphate buffered saline (Salina tamponada com fosfato).
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas.
PMA – Do inglês, phorbol myristate acetate (Acetato de forbol miristato).
qRT-PCR – Do inglês, Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa).
RNA – Ácido ribonucleico.
RPM – Rotações por minuto.
SAS – Linhagem de células de carcinoma de células escamosas de língua.
SCC-25 – Linhagem de células de carcinoma de células escamosas de língua.
TAM – Do inglês, Tumor associated macrophage (Macrófago associados a tumores).
TGF-β – Do inglês, Transforming growth factor (Fator transformante de crescimento).
VEGF-1 – Do inglês, Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento endotelial
vascular).
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO.............................................................................................
19
2
REVISÃO DA LITERATURA....................................................................
22
2.1
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA..............................................
23
2.2
RELAÇÃO DOS TAMS COM NEOPLASIAS MALIGNAS.......................
25
2.3
EXOSSOMOS.................................................................................................
29
2.3.1
Composição da superfície celular dos exossomos.......................................
32
2.4
PAPEL DOS EXOSSOMOS NO MICROAMBIENTE TUMORAL E NAS
CÉLULAS TUMORAIS.................................................................................
2.5
36
ATIVIDADE IMUNOSSUPRESSORA DOS EXOSSOMOS ATRAVÉS
DA EXPRESSÃO DO TGF-β......................................................................... 40
3
OBJETIVO GERAL.....................................................................................
44
3.1
OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................
45
4
MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................
46
4.1
CONSIDERAÇÕES ÉTICAS.........................................................................
47
4.2
CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO.............................................................
47
4.3
CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS THP1 E POLARIZAÇÃO EM
MACRÓFAGOS DOS SUBTIPOS M1 E M2................................................
48
4.4
CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES............................ 48
4.4.1
Cultura de células........................................................................................... 49
4.5
ULTRACENTRIFUGAÇÃO DOS EXOSSOMOS DERIVADOS DAS
CÉLULAS THP1, DOS MACRÓFAGOS TIPO 1, MACRÓFAGOS TIPO
2 E DAS CÉLULAS TUMORAIS.................................................................. 49
4.6
TESTE DE PROTEÍNA – TESTE DE BRADFORD (BIO-RAD, USA)......... 51
4.7
IMUNOELETROMICROSCOPIA.................................................................
52
4.8
ENSAIO DE INVASÃO UTILIZANDO MIOGEL.......................................
52
4.8.1
Medição do grau de invasão.........................................................................
54
4.9
ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO E VIABILIDADE CELULAR...................
55
4.9.1
BrdU (Bromodeoxiuridina – ROCHE)........................................................ 55
4.9.2
Determinação do crescimento celular baseado no kit MMT (SIGMAALDRICH).....................................................................................................
56
4.10
IMUNOFLUORESCÊNCIA DOS EXOSSOMOS DERIVADOS DOS
TAMS
E
DAS
LINHAGENS
CELULARES
DERIVADAS
DE
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA..............................................
57
4.10.1
Preparação da amostra das linhagens celulares HSC-3, SAS e SCC-25..
57
4.10.2
Preparação da amostra de exossomos derivados dos TAMs.....................
57
5
ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................................
59
6
RESULTADOS..............................................................................................
61
6.1
ANÁLISE
DA
IMUNOELETROMICROSCOPIA
PARA
OS
ANTICORPOS ANTI-CD63 E TGF-β...........................................................
62
6.2
ANÁLISE DO ENSAIO DE INVASÃO UTILIZANDO MIOGEL..............
64
6.2.1
Análise do ensaio de invasão utilizando com utilizando a linhagem
celular SCC-25...............................................................................................
6.2.2
64
Análise do ensaio de invasão com miogel utilizando a linhagem celular
HSC-3.............................................................................................................. 66
6.2.3
Análise do ensaio de invasão com miogel utilizando a linhagem celular
SAS.................................................................................................................. 69
6.3
ANÁLISE DOS ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO (BrdU / MTT)...............
6.3.1
Ensaio de proliferação BrdU/ Ensaio de viabilidade celular (MTT) –
linhagem celular HSC-3................................................................................
6.3.2
70
70
Ensaio de proliferação BrdU/ Ensaio de viabilidade celular (MTT) –
linhagem celular SCC-25..............................................................................
71
6.4
ANÁLISE DESCRITIVA DA IMUNOFLUORESCÊNCIA.........................
72
7
DISCUSSÃO..................................................................................................
78
8
CONCLUSÕES..............................................................................................
REFERÊNCIAS............................................................................................
Introdução
20
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma epidermóide oral (CEO) é uma neoplasia maligna originada no epitélio
pavimentoso estratificado (BRENER et al., 2007), representando o oitavo câncer mais comum
no mundo. Anualmente, 640.000 novos casos são diagnosticados em todo o mundo (SCULLY;
BAGAN, 2009). A Organização Mundial da Saúde (2015) prevê um aumento na incidência do
CEO nas próximas décadas (SCULLY; BAGAN, 2009).
O sítio mais comumente afetado pelo CEO é a língua, local no qual é particularmente
agressivo. A taxa de sobrevida de 5 anos para os pacientes com câncer de língua é de
aproximadamente 50% (SANO; MYERS, 2007).
No microambiente tumoral, as células e moléculas inflamatórias influenciam em quase
todos os aspectos na progressão do câncer, incluindo a habilidade das células tumorais
metastatizarem (MANTOVANI et al., 2006). A presença de macrófagos associados a tumores
(TAMs) do subtipo M2 vem sendo associada ao pior prognóstico da lesão. Estas células
inflamatórias têm o potencial de expressar atividades antitumorais e pró-tumorais
(MANTOVANI; SICA, 2010).
Os TAMs do subtipo M2 podem orquestrar vários aspectos importantes na progressão
tumoral, incluindo: desvio da resposta imune; angiogênese; deposição de matriz; e
remodelamento e desenvolvimento de metástase. Os macrófagos classicamente ativados,
caracterizados como subtipo M1, exibem um comportamento antitumoral (MORI et al., 2011).
Sugere-se que a presença dos macrófagos M2 em CE de língua pode ser um processo
crítico para a metástase destes tumores (HADLER-OLSEN et al., 2010). A presença de TAMs
tem sido relacionada com o pior prognóstico em tumores de esôfago (KOIDE et al., 2002),
orofaringe e cavidade oral (COSTA et al., 2013). Um alto percentual de TAMs em CEO
metastáticos pode contribuir para uma diminuição da sobrevida do paciente (COSTA et al.,
2013).
Uma contínua comunicação entre as células cancerígenas e o microambiente tumoral é
requerida para um efetivo crescimento do tumor e disseminação metastática (KALLURI;
ZEISBER, 2006). Evidências têm sugerido que os exossomos apresentam um papel importante
na comunicação célula-célula, local e sistêmica, nos tumores malignos. Os exossomos são
microvesículas liberadas por uma grande variedade de células, sejam malignas ou não,
incluindo macrófagos, células dendríticas e células epiteliais (BENITO-MARTIN et al., 2016).
21
O interesse nos exossomos é um campo em crescimento e com potencial para diferentes
aplicações (SPARKS, 2014). Na atualidade, essas microvesículas são consideradas mediadores
e reguladores-chave para as respostas imunes. Os exossomos podem ainda apresentar um papel
bimodal no câncer. No papel pró-tumor, os exossomos podem manipular o microambiente local
e sistêmico possibilitando o crescimento e disseminação do câncer ou programar o sistema
imune para impedir uma resposta antitumoral, levando a uma rede de interações complexas
(KAHLERT; KALLURI, 2013). Já em sua feição antitumoral, as microvesículas podem atuar
ativando a resposta imune contra as células transformadas (TAYLOR; GERCEL-TAYLOR,
2013).
Os exossomos são compostos por diversas proteínas derivadas de células parentais, com
numerosas funções, incluindo proteínas de transporte e de fusão celular, como mRNA,
microRNA e fragmentos de DNA. As proteínas da família das tetraspaninas encontram-se
abundantes na superfície dos exossomos, como o CD63. Trata-se da primeira proteína a ser
relacionada com o maior potencial invasivo de tumores como melanoma e carcinoma de colo
(LAZO, 2007).
Umas das proteínas que podem ser secretadas pelos exossomos é o Fator Transformante
de Crescimento β (TGF-β), que é caracterizado por seu papel na carcinogênese e na progressão
tumoral, podendo causar a supressão da resposta imune inflamatória através da polarização dos
macrófagos no fenótipo M2 (SZCZEPANSKI et al., 2011).
O presente estudo teve a finalidade de avaliar o comportamento de exossomos derivados
de macrófagos, dos subtipos 1 e 2, frente a cultura de células humanas SCC-25, SAS e HSC-3
derivadas de CE de língua. Por meio desta análise, pretendeu-se avaliar a capacidade de
invasão, proliferação e viabilidade da/s células tumorais na presença dos exossomos. Também,
foi avaliada a capacidade dos exossomos em secretar Fator transformante de crescimento β,
tanto derivados das linhagens celulares, quanto dos TAMs e a capacidade de internalização dos
exossomos derivados dos TAMs nas células tumorais.
Revisão da Literatura
23
2 REVISÃO DA LITARATURA
2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA
O carcinoma epidermóide oral (CEO) está entre os 15 cânceres mais comuns em todo o
mundo, com mais de 300.000 novos casos diagnosticados no ano de 2012 (2% do total).
(FERLAY et al., 2013).
A língua é o sítio mais comum e que apresenta maior índice de morbidade para o
carcinoma de células escamosas de cavidade oral. Particularmente, a sua porção móvel é o local
onde o tumor tende a apresentar um comportamento mais agressivo devido à alta frequência de
metástase linfonodal regional.
O CE de língua é conhecido por ser uma doença agressiva, apresentando metástase na
fase inicial do tumor. Está bem estabelecido que as recorrências loco-regionais são as maiores
causas da falha no tratamento (CHATZISTAMU et al., 2010). Nos últimos anos, diferentes
características morfológicas e clinicopatológicas têm sido sugeridas como fator prognóstico do
CE de língua (PATEL, et al., 2009; YUEN, 2002).
A língua apresenta características estruturais distintas das outras áreas acometidas pelo
CEO, incluindo um alto e denso feixe de fibras musculares e uma rica rede de vasos linfáticos,
fatores que podem influenciar na propagação do tumor (ALMANGUSH et al., 2014). CE da
língua é conhecido por desenvolver, com frequência, metástase subclínica nos estágios iniciais
do tumor (PATEL, et al., 2009). O controle do carcinoma de língua é relacionado com a
extensão do tumor primário e o estado dos linfonodos regionais (PATEL, et al., 2009; YUEN,
2002).
A metástase linfonodal regional é uma importante causa de morte pelo carcinoma de
língua. Entre os pacientes com tumores T1 / T2 da língua, 41% desenvolvem metástase no
pescoço, clinicamente evidente (WOOLGAR, 2006).
As respostas da imunidade inata e adaptativa podem ser superadas pelos tumores, com
o objetivo de suas células evadirem-se dos seus efeitos (GAJEWSKI; SCHREIBER; FU, 2013).
Os macrófagos estão intimamente envolvidos nas respostas inflamatórias observadas na
metástase e no desenvolvimento tumoral. Os TAMs podem apresentar diversas funções prótumorais, incluindo a expressão de fatores de crescimento, MMPs, a promoção da angiogênese
e a supressão da resposta imune adaptativa (BENITO-MARTIN, 2015).
24
A identificação de determinados parâmetros que possuam um valor preditivo, continua
a ser imperativo. Isto é de particular importância para os CEs de língua, no qual a metástase
loco-regional é comum. O tratamento da lesão inicial com possível metástase oculta no pescoço
ainda não está bem estabelecido, variando desde o esvaziamento cervical eletivo ao
acompanhamento do paciente (KESKI-SANTII et al., 2006; SPIRO; STONG, 2006).
Existem diferentes fatores que podem promover a progressão tumoral e levar à
metástase, como o desequilíbrio nas vias de sinalização e crescimento celular, a alteração do
ciclo celular, a mutação genômica e a evasão do sistema imune. A metástase é um evento
complexo que corresponde a mais de 90% das mortes relacionadas à doença. Isso reflete a
evolução do tumor primário através de interações entre o microambiente tumoral e os órgãos à
distância (DUNN; KOEBEL; SCHREIBER, 2006).
Os tumores usam diferentes estratégias para escapar da vigilância do sistema imune.
Uma dessas estratégias é a edição tumoral, na qual as células tumorais menos imunogênicas são
selecionadas, estabelecendo uma supressão ativa da resposta imune e criando condições no
microambiente tumoral que facilitam o crescimento desta lesão (DUNN; KOEBEL;
SCHREIBER, 2006).
O microambiente tumoral tem demonstrado desempenhar um papel importante na
progressão do câncer, através do fornecimento, para as células neoplásicas, de um ambiente
rico em nutrientes e fatores de crescimento que facilitam a proliferação das células do câncer
(LIU et al., 2008).
De forma geral, a associação entre a presença aumentada do número de TAMs e um
mal prognóstico do CEO tem sido demonstrada. No entanto, esses achados ainda são limitados,
no que diz respeito ao CE de língua (LIU et al., 2008; CHATZISTAMOU et al., 2010).
De forma geral, os exossomos secretados pelas células tumorais podem promover a
ativação dos macrófagos, através da secreção de fatores que podem modular a ativação e
polarização dos macrófagos nos subtipos M1 e M2, como por exemplo, a ativação do fator
nuclear- κB (NF-κB). No entanto, esses mecanismos ainda não se encontram devidamente
esclarecidos (PIRILÄ et al., 2015).
25
2.2 RELAÇÃO DOS TAMS COM NEOPLASIAS MALIGNAS
O desenvolvimento tumoral e a metástase são influenciados pelo estroma, por vasos
sanguíneos e linfáticos, e ainda, pela resposta imune inata e adaptativa. O conceito de vigilância
imune do tumor foi primeiramente contemplado por Paul Ehrlich em 1909, o qual postulou que
o sistema imune pode restringir o crescimento das células transformadas pela sua identificação
e eliminação (DUNN; OLD; SCHREIBER, 2004; GHABLY et al., 2015).
Atualmente, observa-se que o sistema imune pode atuar tanto contra as neoplasias
malignas, quanto a favor (SHANKARAN et al., 2001; DUNN et al, 2002). Em 2001, foi
demonstrado que o interferon-γ e os linfócitos colaboram para prevenir o crescimento tumoral
(SHANKARAN et al., 2001).
Na resposta imune contra os tumores, as células natural killers (NK) são as células
imunes efetoras que são ativadas para eliminar as células transformadas, além de promover a
maturação e a migração de células dendríticas, com o consequente aumento da apresentação de
antígenos para as células T. Desta forma, a ativação das células imunes poderia resultar na
erradicação das células transformadas e ativação crônica da resposta imune inata, o que poderia
promover a progressão do câncer (POLLARD, 2004).
Dentre as células inflamatórias recrutadas para o microambiente tumoral, os macrófagos
podem ser chamados de “jogadores-chave”. Estes são capazes de produzir fatores angiogênicos,
proteases e fatores de crescimento que resultam em um ambiente que estimula a migração,
proliferação e sobrevivência das células epiteliais transformadas (POLLARD, 2004; BENITOMARTIN, 2015).
Os macrófagos estão intimamente envolvidos nas respostas inflamatórias no câncer e
na metástase. Diversas observações indicam que os TAMs têm diversas funções pró-tumorais,
incluindo a expressão de fatores de crescimento, MMPs, promoção de angiogênese e a
supressão da resposta imune adaptativa (POLLARD, 2004; TANAKA et al. 2012; MARTIN et
al., 2015; PIRILÄ et al., 2015). Os fatores secretados pelas células cancerígenas, ativam e
polarizam os macrófagos em M2 (SOKI et al.,2010). Tem sido demonstrado que exossomos
secretados por macrófagos podem regular a invasividade das células de câncer através da
entrega de miRNAs oncogênico, sugerindo que aqueles de origem M2 podem atuar (BENITOMARTIN et al., 2015).
A inflamação passou a ser compreendida como um componente do microambiente
tumoral. Seis fatores caracterizam a carcinogênese: potencial de replicação ilimitado; sinais de
26
crescimento autossuficiente; evasão da morte celular programada; insensibilidade aos
inibidores de crescimento; habilidade de desenvolver novos vasos sanguíneos; e invasão
tecidual e metástase. Atualmente, a inflamação relacionada ao câncer, surge como o sétimo
fator responsável pela progressão tumoral (HAHAHAN; WEINBERG, 2011).
Duas vias do componente inflamatório participam da ligação entre o câncer e a
resposta imune do hospedeiro. A via intrínseca, responsável pela ativação de diferentes classes
de oncogenes que levam à construção da resposta inflamatória nas proximidades do tumor, e a
via extrínseca, na qual a inflamação promove o desenvolvimento do câncer. Assim, a
inflamação é um componente-chave do microambiente tumoral e alvo para intervenções
farmacológicas (MANTOVANI, 2009).
Estudos anteriores sugerem que os oncogenes, como o RAS, MET ou EGFR, levam à
formação das vesículas extracelulares. Esses oncogenes podem trafegar entre as células,
processo este mediado pelos exossomos (LEE; CHENNAKISHNAIAH; RAK, 2015). A
encapsulação de miRNA´s específicos pelas vesículas extracelulares parece protege-los de
enzimas com capacidade de degradação que estão em quantidades elevadas no sangue. Diante
disso, os sinais de crescimento, progressão tumoral, metástase e angiogênese podem ser
transmitidos para as células recipientes através da membrana ou pela internalização das
vesículas (AKERS et al., 2013). Ainda, a ativação de oncogenes pode orquestrar a produção de
citocinas inflamatórias e o recrutamento de células inflamatórias (LE BITOUX et al., 2008).
Os tumores sólidos consistem tanto de células malignas como de outros tipos celulares
(WITZ, 2008). Atualmente, os TAMs presentes no microambiente tumoral, constituem um tipo
celular que tem despertado grande interesse. Essas células são recrutadas para o tumor como
monócitos, a partir dos vasos sanguíneos, pela liberação de quimiocinas, como o MCP-1 e o
fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), produzidos pelas células malignas e pelo
estroma (POLLARD, 2004; LEWIS; POLLARD, 2006).
Os monócitos recrutados da circulação para tecidos saudáveis ou para sítios que sofrem
com injúrias como inflamação, infecção ou neoplasias malignas, sofrem diferenciação para
macrófagos (GORDON, 2003), os quais se caracterizam como células altamente versáteis e
multifuncionais, cuja função depende da sua localização anatômica, bem como do contexto em
que estão inseridos (HAGEMAN et al., 2009).
Os TAMs são descritos como sendo “classicamente” ativados por produtos
microbianos ou interferon γ (IFN-γ), assumindo um fenótipo M1, que expressam altos níveis
de citocinas pró-inflamatórias e são capazes de destruir patógenos e células tumorais (SICA;
ALLAVENA; MANTOVANI, 2008). Por outro lado, o estímulo por citocinas, como as
27
interleucinas IL-4, IL-10 e IL-13, levam os macrófagos a uma via de ativação “alternativa” ou
fenótipo M2. Nesse estágio, eles são responsáveis pela regulação da resposta inflamatória,
promovendo angiogênese e remodelação tecidual (MANTOVANI et al., 2002).
Os macrófagos podem ser polarizados pelo microambiente tumoral. O fenótipo M2
pode ser subdivido em M2a, quando exposto as IL-4 e/ou IL-13, adquirindo função em
processos alérgicos e na encapsulação e morte de parasitas; M2b, quando induzido pela
exposição combinada a complexos imunes, receptor toll-like e o receptor antagonista da IL-1R,
ou M2c, induzido pela IL-10, que está mais relacionado com a supressão da resposta imune
antitumoral e remodelação tecidual (MANTOVANI et al., 2004; WITZ, 2008).
Diversos estudos têm indicado que os monócitos recrutados pela vasculatura tumoral
assumem o fenótipo M2. Os TAMs com fenótipo M2 têm baixa capacidade de apresentar
antígenos e expressar MHC de classe II. Além disto, possuem reduzida capacidade
antimicrobiana e atividade tumoricida (VAN GINDERACHTER, et al., 2006). No entanto,
apresentam aumento na produção de mediadores que promovem angiogênese, como VEGF,
bem como citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10. Outra característica marcante para os
TAMs do subtipo M2 é a reduzida capacidade de expressarem IL-12 (MANTOVANI et al.,
2002).
A concentração de IL-10 derivada dos tumores pode promover a diferenciação dos
monócitos em macrófagos em diferentes localizações do tumor, podendo-se observar a
ocorrência desta situação em câncer de mama, tireoide e ovário (SICA, et al., 2006;
CONDEELIS; POLLARD, 2006).
Os TAMs encontram-se difusamente distribuídos entre o tumor e podem residir entre
as células neoplásicas, ao redor de vasos e no estroma (BISWAS et al., 2008). Deve ser
ressaltado que o status de ativação dos TAMs pode variar de acordo com o tipo de tumor,
enquanto que o estágio de desenvolvimento, é moderado por sinais locais provenientes do
microambiente tumoral, como a hipóxia (LEWIS; POLLARD, 2006; BISWA; SICA; LEWIS,
2008). Esta diversidade de funções torna-se evidente a partir da observação das diversas
moléculas expressas pelos TAMs, atuando tanto com função pró-inflamatória, no subtipo M1,
quanto características imunossupressoras, no fenótipo M2. Pode-se observar, ainda, a presença
das duas funções em uma mesma célula (VAN GINDERACHTER, et al., 2006). Na maioria
dos tumores investigados, os TAMs apresentam um fenótipo M2 (VAN GINDERACHTER, et
al., 2006; MANTOVANI; SICA, 2010).
A presença de TAMs nos sítios tumorais tem sido considerada como uma das
principais marcas da inflamação associada aos tumores (ALLAVENA et al., 2007). A atividade
28
pró-tumoral desses macrófagos está relacionada com características cruciais para o crescimento
das células neoplásicas, como: proliferação, migração, metástase, sobrevivência em ambientes
hipóxicos e evasão da resposta imune, através da supressão da imunidade antitumoral (SICA;
ALLAVENA; MANTOVANI, 2008). Esses macrófagos auxiliam no comportamento maligno
das células tumorais, não apenas por produzirem citocinas, como também por secretarem
fatores de crescimento e enzimas responsáveis por degradar a matriz extracelular (WYCKOFF,
2007).
Os TAMs possuem a habilidade de estimular tanto positiva quanto negativamente o
crescimento celular. A sobrevivência das células tumorais pode ser promovida pela ativação
dos macrófagos com a consequente liberação de VEGF, que é responsável pelo aumento na
demanda de nutrientes e oxigênio (BARBERA-GUILLEM et al., 2002; KATAKI et al., 2002;
BLOT et al., 2003). Outro mecanismo pelo qual os TAMs podem favorecer o crescimento
tumoral é a partir da sua citotoxicidade (GURUVAYOORAPPAN, 2011). Diversos estudos
reportaram que os macrófagos que apresentam fenótipo M1 podem mediar a produção de IL-2
e fator de necrose tumoral (TNF-α), capazes de ativar as células NK, que são efetoras contra as
células transformadas. Entretanto, os macrófagos M2 têm demonstrado produzir altos níveis de
IL-10, que é um inibidor de macrófagos ativados, o que lhe cabe um importante papel no
controle homeostático das reações da imunidade inata e da imunidade celular. Eles ainda têm a
capacidade de inibir a produção de IL-12 e TNF-α pelos macrófagos ativados, inibir a expressão
de co-estimuladores e das moléculas do MHC de classe II nos macrófagos, inibindo a atividade
Th1, resultando na inibição das células natural killers (AKDIS; BLAZER, 1999; SICA et al.,
2000).
O alto número de TAMs em tumores primários tem sido correlacionado com o
estabelecimento de metástase precoce em carcinomas de mama e bexiga (LEEK; LEWIS, 1996;
HANDA, 2000). Esses macrófagos atuam em áreas nas quais podem promover a motilidade da
célula maligna, como o estroma e a região perivascular, levando à metástase
(GURUVAYOORAPPAN, 2011). De forma geral, na interação entre os TAMs e as células
neoplásicas há uma prevalência da sua função pró-angiogênica, o que é observado pelo aumento
na produção de VEGF e do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (LEWIS, 1995).
Os TAMs podem estar envolvidos, ainda, na promoção de metástase à distância. Em
diversos tipos de tumores, o elevado número de macrófagos está correlacionado com o
envolvimento linfonodal (HANADA et al., 2000; OHNO et al., 2004). Gorelik et al. (1982)
demonstraram pela primeira vez que os macrófagos aumentam a formação de nódulos tumorais
nos pulmões. A inibição dos TAMs em tumores, a partir da neutralização de quimiocinas,
29
responsáveis pelo recrutamento de monócitos, diminui a ocorrência de metástase à distância
(ROLNY et al., 2008).
2.3 EXOSSOMOS
Recentemente, o estudo das vesículas extracelulares está focado principalmente em um
tipo de vesícula secretada através de um compartimento extracelular, o qual passou a se chamar
exossomos. Johnstone et al. (1987) foram os primeiros a isolaram exossomos através de
reticulócitos ovinos e os descreveram como de origem endocítica.
As vesículas extracelulares são constitutivamente liberadas por diversos tipos celulares,
incluindo neurônios, células tumorais, células do sistema imune, entre outros. Elas também
podem ser encontradas em diferentes fluidos corporais, como o leite materno, saliva, soro
plasmático, sêmen, urina (LÄSSER et al., 2011; STREET et al., 2012; MADSON, 2014; DE
TORO, et al., 2015).
O seu desenvolvimento começa, quando os endossomos carregados com proteínas
ubiquitinadas são reconhecidos pelo complexo de triagem endossomal necessário para o
transporte. Este reconhecimento permite a formação de vesículas intraluminais, o que dá origem
a corpos multivesiculares, contendo proteínas. Esse processo continua com a fusão desses
corpos multivesiculares com a membrana plasmática, liberando o seu conteúdo no espaço
extracelular. Este processo é caracterizado por um brotamento através da membrana dos
endossomos, o qual tem como função encapsular moléculas de RNA e proteínas funcionais nos
exossomos. Em seguida, os endossomos multivesiculares se fusionam com a membrana celular
e liberam as microvesículas no espaço extracelular (KAHLERT; KALLURI, 2013). Essas
microvesículas liberadas são chamadas de exossomos (KELLER et al., 2006; PANT et al.,
2012; DE TORO et al., 2015).
30
Figura 1 – Exossomos são pequenas vesículas (30-100nm)
liberadas por diversos tipos celulares, contendo DNA, RNA,
miRNA, proteínas e lipídios. Apresentando marcadores de
membrana como CD9, CD81 e CD63 (BENITO-MARTIN et al.
2015).
A maioria dos tipos celulares secretam vesículas que apresentam uma quantidade
variada de funções biológicas. O termo exossomo foi inicialmente utilizado para classificar
vesículas com tamanhos que variavam de 40 – 100 nm, liberadas por uma variedade de culturas
de células, definidas por serem esfoliadas de membranas vesiculares. No entanto, mais tarde,
este termo foi adotado para vesículas menores (30-100 nm) com origem endossomal, liberadas
através da fusão dos corpos multivesiculares com a membrana plasmática (THÉRY et al.,
2006). Dentre as funções biológicas dos exossomos, pode-se citar apresentação de antígenos,
regulação da morte celular programada, angiogênese, inflamação, comunicação célula-célula e
coagulação (FIGURA 1). A maioria dos estudos com exossomos foca os seus efeitos potenciais
nas células tumorais e nas células imunes (BENITO-MARTIN et al., 2015).
Os exossomos são caracterizados por vesículas com tamanho e densidade conservada.
Acredita-se que eles apresentam um papel importante nas comunicações intercelulares,
podendo, também, modular a motilidade celular. Existe um vasto número de proteínas que
podem estar envolvidas no processo de migração e invasão celular localizadas nos exossomos.
Essas microvesículas afetam a motilidade celular por meio da sua ligação direta com a
membrana plasmática da célula-alvo e pela internalização através da endocitose (HEE DOO et
al., 2013).
31
A figura 2 mostra a formação dos exossomos, originados diretamente através de botões
formados pela membrana plasmática. O maquinário celular envolvido na sua formação e
liberação, provavelmente, são diferentes. No entanto, alguns mecanismos podem ser
compartilhados (RAPOSO; STOORVOGEL, 2013).
Quando os exossomos são secretados para fora das células, eles podem seguir por três
caminhos: 1 – podem ser capturados pelas células vizinhas ou pelas mesmas células que deram
origem a eles; 2 – podem ser internalizados por células distantes; ou, alternativamente 3 –
podem entrar na corrente sanguínea e serem absorvidos por diferentes tecidos (PANT et al.,
2012; DE TORO, et al., 2015).
As proteínas associadas à membrana, localizadas na região transmembrana, e os RNAs
são seletivamente incorporados dentro das vesículas intraluminais das microvesículas
endossomais ou das microvesículas que estão brotando da membrana plasmática. As
multivesículas endossomais se fusionam com a membrana plasmática, liberando os exossomos
no meio extracelular. Os exossomos ligam-se à membrana plasmática da célula alvo por
receptores específicos e fusionam-se. O resultado da internalização dos exossomos gera a
liberação de seu conteúdo, contendo proteínas e RNA, na membrana ou no citosol (FIGURA
2) (RAPOSO; STOORVOGEL, 2013).
32
Figura 2 – Esquema da transferência de proteínas e RNA pelas vesículas extracelulares (RAPOSO; STOORVOGEL, 2013).
2.3.1 Composição da superfície celular dos exossomos
Exossomos de diferentes tipos celulares contém um conjunto básico de proteínas
idênticas, que incluem os membros da família tetraspanina (CD9, CD63, CD81 e CD82). Além
dessas proteínas, essas estruturas também podem conter algumas proteínas específicas, que
refletem suas células de origem. Os tumores de origem epitelial, por exemplo, são capazes de
secretar exossomos contendo a proteína EpCAM, responsável pela adesão epitelial (RUNZ,
2007).
A família de moléculas tetraspaninas são proteínas de superfície celular com 4 domínios
transmembrana, que são chamados de teias de tetraspaninas, as quais se associam com diversas
moléculas de adesão, receptores e outras moléculas de tetraspanina. Sabe-se que essas
moléculas apresentam várias funções, como adesão celular, sinais de transdução, proliferação
celular, movimentação, diferenciação celular, ativação de células imunes e fusão celular em
eventos como a fertilização e infecção viral (LE NAOUR et al., 2006; LAZO e al., 2007;
HIRANO et al; 2009).
33
Os domínios transmembrana (FIGURA 3) com pequenas regiões intracitosólicas N- e
C- terminais e dois loops extracelulares. O loop extracelular 1 (EC1) é pequeno e se encontra
entre o primeiro e segundo domínios transmembrana. O loop extracelular 2 (EC2) é grande e é
encontrado entre a terceira e quarta regiões transmembrana, apresentando mais de 100
aminoácidos e algumas características distintas, como diversos domínio de cisteínas altamente
conservados em todos os membros da família. Esses resíduos permitem a identificação celular
por conferirem assinaturas às proteínas. A estrutura da EC2 identifica pelo menos 3 proteínas
do subgrupo das tetraspaninas. A região transmembrana hidrofóbica contém resíduos polares
conservados. A região terminal C promove um link para moléculas de sinalização intracelular
(LAZO, 2007).
Na família das tetraspaninas existem 33 diferentes tipos de proteínas expressas em
diferentes células. As proteínas associadas à membrana podem ser modificadas covalentemente
pela palmitoilação, o que pode controlar sua associação e organização em diferentes membranas
celulares. As tetraspaninas CD9, CD37, CD 63, CD81, CD82 e CD 151, são proteínas
hidrofóbicas que podem formar microdomínios ricos em colesterol, distintos dos
microdomínios de glicolipídios, na superfície celular de uma maneira dinâmica e reversível
(HIRANO et al., 2007).
A palmitoilação determina a formação dos microdomínios de colesterol. As proteínas
associadas às membranas podem ser modificadas covalentemente pela palmitoilação, a qual
pode controlar a organização e diferenciação em diferentes membranas celulares. O CD63,
usado neste estudo, é uma molécula palmitoilada, podendo, através desse processo, exercer a
função de interação com as integrinas, característica importante para adesão célula-célula
(NISHIUCHI et al., 2005).
As tetraspaninas são sintetizadas no retículo endoplasmático (RE). Suas regiões
transmembranas são importantes para sua saída do RE e, sua palmitoilação, ocorre no complexo
de Golgi. Após esse processo, essas proteínas são transportadas para a superfície celular com a
função de formar uma rede de conexões com diversas proteínas, chamada de microdomínio
enriquecido de tetraspaninas (ANDRE et al., 2007).
34
Figura 3 – Estrutura da proteína tetraspanina. Os resíduos conservados
estão indicados, assim como as localizações das palmitoilações
(vermelho) e das glicolizações (verde) (LAZO, 2007).
As tetraspaninas também são encontradas no sistema endossomal. A endocitose tem
início com o brotamento de vesículas endofíticas a partir da membrana plasmática, que se
fusionam e passam a caracterizar endossomos imaturos. A partir destes endossomos imaturos
as proteínas ligam-se à superfície celular ou tornam-se incorporadas em vesículas intraluminais
(VIs) que brotam para o lúmen endossomal. Durante sua maturação, os endossomos adquirem
um aumentado número de VIs, motivo pelo qual os endossomos maduros são também
chamados de corpos multivesiculares. Os corpos multivesiculares podem sofrer maturação ou
fusão com os lisossomos (FIGURA 4). As tetraspaninas são encontradas de forma abundante
nos corpos multivesiculares e nos lisossomos, sugerindo que essas proteínas têm função
protetora contra a proteólise lisossomal (LUZIO et al., 2007; MEEL et al., 2008).
As tetraspaninas CD37, CD53, CD63, CD81 e CD82 são encontradas no interior dos
exossomos. Acreditava-se que os exossomos derivados de tumores poderiam ter um importante
papel em iniciar uma resposta imune anti-tumoral, pois eles podem entregar específicos
antígenos tumorais às células apresentadoras de antígenos (APCs). Mais recentemente, no
entanto, as evidências demonstram que os exossomos podem apresentar função supressora da
resposta imune tumoral, por carregarem proteínas envolvidas na angiogênese e responsáveis
pela resistência a drogas, promovendo a progressão tumoral (POLS; KLUMPERMAN, 2009).
35
Figura 4 – Visão esquemática mostrando a presença do CD63 na via endossomal (POLS;
KLUMPERMAN, 2009).
O gene responsável por codificar CD63 é localizado no cromossomo humano 12q13 e
foi à primeira tetraspanina caracterizada. Originalmente, a CD63 foi descoberta como uma
proteína presente na superfície celular das plaquetas. Esta proteína interage com diversas
integrinas, incluindo, 4β1, α3β1, α6β1, LFA-1e β2, além de outras tetraspaninas, como D81,
CD82, CD9, CD151, e ainda com receptores de superfície, como MHCII e CD3.
A maioria dos antígenos da CD63 é usualmente detectada em uma alta concentração nas
partículas endossomais. Essa molécula tem despertado grande atenção por suas características
na sua função de sinalização celular. A região C- terminal intracelular da CD63 interage com o
domínio PDZ da sintetina – 1, molécula que está relacionada na regulação da endocitose e
diminui a internalização do CD63. A CD63 localizado na superfície celular é utilizado como
um marcador de superfície. Este é um marcador claro de funções biológicas, afetando a
disseminação tumoral. A CD63 foi a primeira tetraspanina a ser relacionada com o maior
potencial invasivo de tumores como melanoma e carcinoma de colo (LAZO, 2007).
A captação dos exossomos ocorre de uma forma não aleatória e é dependente de
proteínas transmembrana. Estudos recentes indicam que o complexo integrina-tetraspanina
contribui consideravelmente, na habilidade dos exossomos ligarem-se as células-alvo, através
da interação ligante-receptor. Assim, os exossomos se fundem com a membrana plasmática,
resultando em uma liberação direta de seu conteúdo no interior do citoplasma. A internalização
dos exossomos pode ocorrer, também, por fagocitose (FEVRIER; RAPOSO, 2004).
36
Uma comparação entre a composição dos exossomos e suas células de origem indica a
existência de um processo de enriquecimento seletivo nos exossomos, ou seja, há um perfil
específico de mRNAs e miRNAs no exossomos, não se caracterizando como um evento
aleatório. O empacotamento específico de certas moléculas nos exossomos pode ser útil para
descartar mRNAs específicos, aumentando, assim, o potencial oncogênico das células
cancerígenas (HESSVIK et al., 2012).
2.4 PAPEL DOS EXOSSOMOS NO MICROAMBIENTE TUMORAL E NAS CÉLULAS
TUMORAIS
Os tumores malignos são estruturas complexas constituídas tanto por células
cancerígenas, quanto pelo estroma. A interação entre essas células e o microambiente do
hospedeiro é requerida para um crescimento tumoral efetivo e sua disseminação sistêmica
(KAHLERT; KALLURI, 2013). Evidências sugerem que os exossomos podem desempenhar
um importante papel na comunicação célula-célula no câncer (HURLEY; ODORIZZI, 2012).
A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um processo morfogenético altamente
conservado, definido pela supressão das características epiteliais e aquisição do fenótipo
mesenquimal. As células epiteliais transformadas adquirem a capacidade de invadirem,
resistirem a apoptose e disseminarem-se pelos tecidos (GREENING et al, 2015).
A cascata metastática consiste no processo em que as células tumorais se distanciam do
sítio tumoral primário, através da supressão da adesão célula-célula e célula-matriz extracelular,
degradação e invasão da matriz extracelular. O aumento da motilidade celular e da penetração
das células tumorais na circulação também está associado à disseminação das células na
circulação para órgãos distantes, sugerindo que a TEM pode facilitar o desenvolvimento de
metástases.
As células tumorais liberam fatores que modulam a microambiente tumoral (MT) e
aumentam a transformação celular durante a TEM. Esse processo inclue fatores de crescimento,
citocinas e quimiocinas, ou, ainda, ligantes e receptores que podem mediar a comunicação entre
as células tumorais e as células do estroma tumoral. Esses fatores são responsáveis por gerar
um microambiente celular favorável à metástase. Numerosas vias de sinalização que se
relacionam entre si são conhecidas por regularem a TEM. Moduladores extracelulares do MT
37
podem influenciar o estado celular e seu potencial invasivo (MATHIAS; GOPAL; SIMPSON
et al., 2013; GREENING et al., 2015).
A medida que o câncer progride, o microambiente localizado ao redor do tumor cria um
circuito dinâmico de sinalização que promove a inicialização e crescimento celular, levando ao
desenvolvimento da doença. Hanahan e Weinberg (2000) propuseram que os tumores não agem
de forma isolada e, sim, subsistem num microambiente rico em fibroblastos, células endoteliais,
células imunes e matriz extracelular (PIETRAS; ÖSTMAN, 2010).
O estroma tumoral caracteriza-se como uma parte integral da iniciação do câncer. Os
componentes do estroma tumoral podem estar relacionados com o prognóstico e, ainda,
previsão da resposta ao tratamento (PIETRAS; ÖSTMAN, 2010). A progressão tumoral, a
metástase e a quimioresistência dependem da habilidade do tumor e do seu microambiente em
comunicarem-se (BRINTON et al., 2015).
Os exossomos podem manipular o microambiente local e sistêmico, possibilitando o
crescimento e disseminação do câncer. Os exossomos podem programar o sistema imune para
impedir uma resposta antitumoral, levando a uma rede de interações complexas (KAHLERT;
KALLURI, 2013).
Os exossomos derivados de tumores podem ser isolados tanto das neoplasias malignas
quanto de fluidos corporais dos pacientes. Diversos tumores reportados possuem capacidade de
liberar exossomos, como os localizados na mama, cavidade oral, colo retal, cérebro, ovário,
bexiga, próstata e pele (ZHANG et al., 2012).
Via exossomos, as células tumorais podem fazer o intercâmbio de proteínas com
atividade oncogênicas. Os exossomos podem mediar, por exemplo, o intercâmbio de KRAS
mutante, induzindo, assim, o aumento no crescimento celular. Resultados preliminares sugerem
que os exossomos podem mediar a transferência de proteínas entre as células cancerígenas,
podendo provocar a quimiorresistência (DEMORY et al., 2004).
Os tumores possuem mecanismos que impedem a ativação do sistema imune, podendo
causar a supressão do sistema imune, o que facilita o seu crescimento e progressão (ZHANG et
al., 2012). As células cancerígenas recrutam células do sistema imune para aumentar a invasão
tumoral, angiogênese e disseminação do tumor. A comunicação entre as células tumorais e as
células imunes pode ser mediada por exossomos e estar envolvida no recrutamento de células
imunes pró-tumorigênese. As células cancerígenas são capazes de inibir as funções
antitumorais da imunidade do hospedeiro através das sinalizações induzidas pelos exossomos.
Os exossomos derivados das células tumorais podem contribuir para o recrutamento e
38
reprogramação do microambiente tumoral e formar um ambiente pró-tumoral (KAHLERT;
KALLURI, 2013).
Estudos recentes demonstraram que os macrófagos são capazes de produzir exossomos
que introduzem proteínas ou microRNAs (miRNA) nas células adjacentes. Yang et al. (2011)
demonstraram que a transfecção de miRNA 223 exógenos em macrófagos M2, ativados pela
IL-4, podem ser introduzidos em células de câncer de mama na ausência do contato direto dos
macrófagos com as células tumorais. Os exossomos contendo miRNA-223 são liberados pelos
macrófagos e, então, internalizados pelas células que não expressavam miRNA. Essa
internalização promoveu um aumento da capacidade invasiva das células malignas. Essa
internalização resulta em células malignas com características mais invasivas, com maior
capacidade de metástase e pior prognóstico para o paciente. A prevenção da comunicação entre
os exossomos derivados de macrófagos e as células epiteliais malignas pode inibir a metástase
durante a progressão tumoral e, assim, contribuir para novas terapias contra o câncer de mama.
Ismail e colaboradores (2013) observaram que os exossomos derivados dos macrófagos
se comunicam com uma variedade de tipos celulares, sugerindo que o impacto dessas estruturas
pode ser difundido entre diferentes tecidos. O tratamento de células-alvo com exossomos pode
induzir mudanças genéticas e fenotípicas, as quais não requerem a utilização do seu maquinário
transcricional.
A identificação de biomarcadores dos exossomos pode ser útil na sua detecção, no
diagnóstico precoce e para determinar o prognóstico dos tumores. Assim, a liberação dos
exossomos tanto pelas células tumorais quanto pelas células circulantes pode ser novo alvo de
terapia. Os exossomos podem representar um veículo de entrega seletiva de drogas
quimioterápicas, pequenas moléculas terapêuticas ou agentes para gene terapia contra as células
tumorais. E ainda, as moléculas presentes nos exossomos podem servir como biomarcadores
para a detecção precoce e o diagnóstico de neoplasias malignas, podendo ser um fator
determinante para o prognóstico e para prever a eficácia terapêutica (ZHANG et al., 2011).
A caracterização dos exossomos tem sido facilitada pela sua purificação através de
sobrenadantes em culturas usando diversas procedimentos, incluindo a ultracentrifugação
(MIGNOT et al., 2006; LAMPARSKI et al., 2002). As análises dos exossomos purificados têm
sido realizadas através da imunoeletromicroscopia, western blotting, espectrometria de massa
e pela técnica de cromatografia (THERY et al., 1997; THERY et al., 2001; MIGNOT et al.,
2006).
Jakobsen et al. (2015) realizaram um estudo para observar se as proteínas exossomais
apresentam potencial como marcadores de prognóstico em carcinoma de pulmão avançado.
39
Para isso, foi isolado o plasma de 109 pacientes com estágios avançados, III e IV, e 110 casoscontrole, que apresentavam suspeitas inicias de câncer, porém o diagnóstico final foi de
ausência da doença. Para o estudo, os exossomos foram isolados diretamente do plasma. Os
autores identificaram 37 proteínas-alvo para o câncer de pulmão, através da técnica de arranjo
de vesículas extracelulares (Extracellular Vesicle Array), dentre elas CD9, CD63 e CD81. Essa
análise foi capaz de detectar e fenotipar os exossomos através do plasma sanguíneo. A presença
desse painel de marcadores resultou na identificação correta da presença tumoral em 75% dos
pacientes. Como resultado, observou-se que essa técnica foi capaz de detectar o fenótipo dos
exossomos em todas as amostras, fornecendo o conteúdo exossomal com um requerimento
mínimo de amostra, procedimento este que pode ser ajustado e otimizado para avaliações
individuais com o potencial de identificar os pacientes com câncer de pulmão.
Recentemente, as células-tronco do câncer têm se mostrado promissores no tratamento
e diagnóstico da lesão. Kumar et al. (2014) observaram que o microambiante tumoral é um
importante campo para o entendimento, detecção e tratamento do câncer. Esses autores
propuseram que as células-tronco do câncer de próstata e mama secretam exossomos, os quais
mostram função na comunicação entre as células neoplásicas e células normais, suprimindo o
sistema imune e regulando o crescimento neoplásico e a metástase. Os exossomos derivados
das células-tronco tumorais podem ser usados como biomarcadores para diversos tumores. Os
autores detectaram a presença de tetraspaninas como CD9, CD63 e CD81, e, ainda, constataram
a indução de genes de autofagia, como o Atg7, nessas microvesículas. Concluindo, assim, que
os constituintes exossomais podem ser importantes para a compreensão do mecanismo de
formação, liberação e função dos exossomos, bem como podendo propor uma nova estratégia
de terapia para o tratamento e prevenção do câncer.
As células endoteliais e o recrutamento de leucócitos durante a inflamação são
fortemente controlados pelas funções das integrinas. Doo Lee et al. (2014) relataram que os
exossomos liberados pelos macrófagos humanos podem regular negativamente a migração das
células endoteliais por meio do controle do tráfico das integrinas. Os exossomos derivados dos
macrófagos promovem a internalização das integrinas β1 para os compartimentos lisossomais
com uma correspondente diminuição das integrinas destinadas para reciclagem endossomal,
resultando na degradação proteolítica da integrina. Além disso, a ubiquitinação das integrinas
β1 das células humanas endoteliais da veia umbilical é aumentada pelos exossomos e a
degradação que é induzida pelos exossomos derivados dos macrófagos é inibida pela
bafilomicina A, um inibidor de degradação lisossomal. Os autores concluíram, com essas
40
observações, que os exossomos derivados dos macrófagos apresentam função significante na
regulação do tráfego das integrinas.
2.5 ATIVIDADE IMUNOSUPRESSORA DOS EXOSSOMOS ATRAVÉS DA EXPRESSÃO
DO TGF-β
O fator transformante de crescimento β (TGF-β) é um membro de uma superfamília
de mais de 40 citocinas, que incluem as proteínas morfogenéticas do osso, fatores de
diferenciação, entre outros. Essas citocinas pleotrópicas controlam numerosas funções
biológicas, como proliferação, apoptose, manutenção das células-tronco, diferenciação celular
e regulação do sistema imune (PAPAGEORGIS, 2015).
A molécula de TGF-β é inicialmente sintetizada em uma forma inativa, que consiste
na associação do TGF-β com proteínas latentes. O complexo TGF-β latente encontra-se
associado à matriz extracelular via sua região N-terminal. A presença desse complexo mantém
a citocina inativa prevenindo a interação com seu receptor (ANNES; MUNGER; RIFKIN,
2003).
O TGF-β pode ser ativado de diferentes formas. Primeiro, as proteínas latentes podem
passar por mudanças conformacionais, seguidas pela clivagem mediada por proteases, como as
MMPs. Alternativamente, as integrinas, que se tornam superreguladas em processos de
cicatrização ou inflamação, ligam-se ao TGF-β e os tornam ativados (DUBOIS, et al., 1995;
YU; STAMENKOVIC, 2000).
É aceito que TGF-β tem um papel fundamental na carcinogênese e na progressão
tumoral. No entanto, estudos têm demonstrado claramente que o TGF-β age como uma “faca
de dois gumes” durante esse processo. Inicialmente, o TGF-β pode suprimir o crescimento das
células normais e das células pré-malignas. Contudo, frente ao acúmulo de alterações genéticas
e epigenéticas nas células tumorais, esse mecanismo muda para promover um fenótipo próinvasivo e pró-metastático, acompanhado por um aumento na secreção dos níveis de TGF-β.
Esse aumento pode variar de acordo com o tipo celular e o microambiente tecidual (WIPFF et
al., 2007).
Em diversos tumores, a secreção excessiva de TGF-β é comumente detectada
localmente no microambiente tumoral e no estroma que promove a invasão do front e a
metástase. O TGF-β pode derivar tanto das células tumorais, das células estromais, quanto dos
41
fibroblastos, macrófagos e leucócitos. Essa citocina pode ser armazenada na matriz extracelular
dos ossos, tornando-se biologicamente ativo durante o desenvolvimento de metástases
osteolíticas. Dentro do microambiente tumoral, o TGF-β exibe uma interação dinâmica com
vários componentes do estroma. Isto tem um papel importante na diferenciação de fibroblastos
em miofibroblastos. Posteriormente, os miofibroblastos são capazes de secretar α-SMA, que
por sua vez estimula a secreção de TGF-β (MASSAGUÉ, 2008; QUAIL; JOYCE, 2013).
O TGF-β pode apresentar, ainda, forte função imunossupressora através da inibição da
função de diferentes células do sistema imune. Acredita-se que TGF-β é capaz de inibir a
proliferação e de suprimir a função antitumoral das células TCD8 e TCD4, tanto in vivo, quanto
in vitro. TGF-β também é capaz de induzir a apoptose das células B e inibir a ativação das
células T, através da supressão da apresentação de antígenos pelas CD, que são responsáveis
pela estimulação das células T durante a resposta imune. Em adição, TGF-β bloqueia a
produção de IFN-γ pelas células NK, enfraquecendo sua habilidade de reconhecer e eliminar as
células de câncer (GORELINK; FLAVELL, 2001; RAMESH, 2009).
Além disso, o TGF-β pode promover o crescimento tumoral induzindo a polarização
dos macrófagos do tipo 1 para o tipo 2, o que corresponde a uma redução na produção de
citocinas inflamatórias, como IL-6 e IL-11. Deste modo, o TGF-β tem um papel crítico em
suprimir o sistema imune do hospedeiero para facilitar a progressão do tumor
(PAPAGEORGIS, 2015).
Young Jong et al. (2013) avaliaram exossomos derivados de células de câncer tratadas
com epigalocatenina galato (EGCG), que é conhecida pelos seus efeitos anti-tumorais. Para os
estudos, os autores utilizaram a linhagem celular de câncer de mama 4T1. Os exossomos foram
extraídos das células tumorais tratadas com EGCG, através da RT-qPCR (transcrição reversa
quantitativa de cadeia da polimerase). As células tumorais e os TAMs isolados do tumor foram
encubados com os exossomos derivados das células 4T1 tratadas com a EGCG. Essas células
também foram tratadas com miR-16, que atua como inibidor da expressão da EGCG, e seus
exossomos também foram isolados.
Como resultado, os autores observaram que o crescimento tumoral foi suprimido pela
presença dos exossomos das células tratadas com EGCG e foi associado com a diminuição da
infiltração de TAMs e macrófagos M2. As citocinas expressas pelos TAMs deixaram de
apresentar características do fenótipo tipo 2, através da diminuição de IL-6 e TGF-β, passando
para o aumento do TNF-α, que caracteriza o fenótipo M1. Foi observado, ainda, que na presença
do inibidor de EGCG, miR-16, as características inicias foram restauradas (FIGURA 5).
42
Figura5 – Mecanismo proposto no qual EGCG inibe a infiltração de TAMs e a polarização em M2 no
microambiente tumoral (JANG et al., 2003).
Para Hong et al. (2014), os exossomos isolados do plasma de pacientes que apresentam
leucemia mielóide aguda (AML) têm elevada quantidade de proteínas e TGF-β, inibindo a
capacidade citotóxica das células NK. Em seus estudos, os autores avaliaram um papel
potencial dos exossomos em prever respostas à quimioterapia em pacientes com AML durante
o tratamento. Para tanto, os autores avaliaram a presença de exossomos no plasma de 5 grupos
de pacientes: no primeiro grupo, o plasma foi coletado no momento do diagnóstico da AML;
no segundo grupo, após a quimioterapia; no terceiro grupo, durante a consolidação da
quimioterapia; no quarto, durante o período de remissão; e no quinto, era composto por
voluntários saudáveis. Os níveis de TGF-β1 exossomais foram avaliados através do teste
ELISA, cujo objetivo é a quantificação de proteínas. Os resultados demonstraram que, no
momento do diagnóstico, os níveis de TGF-β eram maiores no plasma dos pacientes com AML
do que no grupo de controle (p < 0.009 e p < 0.004). Esses valores diminuíram depois das
sessões de quimioterapia (p <0,05 e p <0,004), aumentando após a consolidação da
quimioterapia (p <0,02 e p <0,005), e voltaram aos valores iniciais durante a fase de remissão.
Apenas o complexo de TGF-βl, o qual se encontra em estado inativo, foi visto nos exossomos
do grupo controle e nos pacientes no período de remissão da quimioterapia. Como conclusão,
os autores observaram que as mudanças nos níveis de TGF-β nos exossomos podem refletir as
diferentes respostas para quimioterapia. Este perfil de exossomos pode sugerir a presença
residual da doença em pacientes em que foram considerados em completa remissão.
As microvesículas derivadas do tumor presentes no sangue dos pacientes podem exercer
efeito sobre as células imunes, influenciando na progressão tumoral. Szczepanski et al. (2011)
43
sugeriram que a citotoxicidade das células NK em pacientes com AML é diminuída em
comparação com pacientes saudáveis. Para isso, os autores investigaram o nível de proteínas, o
perfil molecular e a atividade das células NK em pacientes diagnosticados com AML. Como
resultado, observou-se que o sangue dos pacientes com AML apresentou maior nível de
microvesículas quando comparados com o grupo controle, composto por pacientes saudáveis.
As microvesículas isoladas apresentaram um perfil molecular distinto, em adição ao perfil
molecular dos marcadores convencionais. Os exossomos continham TGF-β1, CD34, CD33 e
CD137. O estudo revelou que as microvesículas diminuíam a citotoxicidade das células NK
(p<0,002), através da diminuição da expressão de NKG2D (células natural killer do grupo 2)
(p<0,001), responsável por ligar-se à célula, atuando como um receptor de reconhecimento e
tornando a célula suscetível à ação das células NK. O plasma de pacientes com AML
apresentavam altos níveis de TGF-β. Para os autores, a liberação do TGF-β1 pelos tumores é
considerada um mecanismo de escape do sistema imune e as células NK são altamente sensíveis
ao TGF-β1. A observação das microvesículas isoladas de pacientes com AML sugere
fortemente que as microvesículas suprimem a atividade das células NK, utilizando as vias TGFβ1.
Objetivos
45
3 OBJETIVO GERAL
O presente estudo propôs-se a observar o comportamento dos exossomos derivados de
macrófagos associados a tumores (TAMs), dos subtipos 1 e 2, frente a cultura de células
humanas SCC-25, SAS e HSC-3, derivadas de carcinoma epidermóide de língua humana, por
meio da análise da capacidade de invasão, proliferação e viabilidade das células tumorais na
presença dos exossomos.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar os exossomos derivados dos macrófagos, subtipo M1 e M2, e das
células SCC25, HSC3 e SAS utilizando o anticorpo anti-CD63;

Observar a presença do anticorpo anti-TGF-β nos exossomos derivados dos
TAMs, subtipo M1 e M2, e nas células SCC-25, HSC-3 e SAS;

Avaliar comparativamente a capacidade de invasão das células SCC-25, HSC-3
e SAS quando em contato com os exossomos derivados dos TAMs, subtipos M1
e M2;

Avaliar comparativamente a proliferação e a viabilidade das células tumorais
SCC-25 e HSC-3 quando em presença dos exossomos derivados dos TAMs,
subtipos M1 e M2;

Observar a captação dos exossomos derivados dos TAMs, subtipos M1 e M2,
pelas células tumorais SCC-25, HSC-3 e SAS.
Materiais e Métodos
47
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O presente estudo não necessitou de submissão ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP),
considerando que foram utilizadas apenas linhagens celulares imortalizadas (SCC-25, SAS,
HSC-3) derivadas de carcinoma epidermóide de língua humano, comercialmente disponíveis.
Todos os procedimentos de biossegurança foram adotados nas diversas etapas dos
experimentos, garantindo a integridade física dos pesquisadores envolvidos.
Os experimentos foram realizados no laboratório de biologia molecular do Centro de
Pesquisa Médica de Oulu, na Universidade de Oulu - Finlândia.
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Este estudo caracteriza-se como uma investigação experimental in vitro, para observar
a influência dos exossomos derivados dos TAMs nas células derivadas de carcinoma
epidermóide de língua humana: SCC-25, SAS, HSC-3.
4.3 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS THP1 E POLARIZAÇÃO EM MACRÓFAGOS,
DOS SUBTIPOS M1 E M2
As células THP1 são derivadas de leucemia, (ARCC, VA, USA, Cat no.TIB-202),
comumente usadas para diferenciação de modelos de monócitos/macrófagos, como
previamente descrito por Tiju et al. (2009). As células foram cultivadas em meio RPMI
suplementado com 10% de soro fetal bovino (Life Technologies, CA, USA), no qual adicionouse 2mM de L-Glutamina (Life Technologies, CA, USA), 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de
streptomicina e 250 ng/ml de fungizone (todos da Sigma-Aldrich), de acordo com a
metodologia utilizada pelos autores supracitados.
48
As células THP1 polarizadas em macrófagos foram adicionadas em meio contento 200
ng/ml de phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma-Aldrich), por um período de 6 horas.
As células foram, então, polarizadas em M1 através da incubação por 18 horas com 20 ng/ml
de IFN-γ (ProSpec, Israel) e 100 ng/ml de lipopolissacarídeo (LPS; Sigma-Aldrich). Para a
polarização dos macrófagos em M2, as células foram submetidas a incubação com 20 ng/ml de
IL-4 (ProSpec) e 20ng/ml de IL-3 (ProSpec) por 18 horas. A incubação foi realizada em
temperatura de 37ºC, em 5% de CO2.
Os exossomos das células THP1 foram utilizados como grupo de controle.
4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES
A linhagem celular HSC-3 (Japanese Collection of Research Bioresources - Tokyo,
Japão) é derivada do carcinoma epidermóide oral de origem humana com alto potencial
metastático, proveniente de um paciente do sexo masculino de 64 anos e que não apresentava
nenhum problema sistêmico preexistente.
A SCC25 foi estabelecida a partir de um paciente do sexo masculino com 70 anos de
idade, o qual não foi submetido a nenhum tratamento prévio à biópsia (RHEINWALD
EBECKET, 1981).
A linhagem de de células SAS, também derivadas de tumor primário de carcinoma
epidermóide, são altamente tumorigênicas e com elevada capacidade de crescimento (Japanese
Collection of Research Bioresources - Tokyo, Japão).
4.4.1 Cultura de células
As células foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F-12 (Ref. 31330, Life
Technologies); contendo 57 ml de soro fetal bovino inativado (FBS, Life Technologies), 5,7 ml
de penicilina/streptomicina, 5,7 ml de vitamina C, 0,570 ml Fungizone (FZ) e 0,057 ml de
hidrocortisona (HK) (todos da Sigma-Aldrich).
As células SCC-25, SAS e HSC-3 foram cultivadas até atingirem confluência entre 70
e 90%, o que acontece em até 72 horas. As linhagens celulares em meio de cultura são
armazenadas em incubadora a +37ºC, em atmosfera contendo 5% de CO2.
49
O crescimento celular foi monitorado diariamente com o auxílio do microscópio
invertido de fase (NIKON – CFI60, Spectrum – Bioengenharia médica hospitalar LTDA).
Para o estudo, as células tumorais foram submetidas a tripsinização (tripsina-EDTA
diluída em 10x PBS). A tripsina-EDTA é diluída em 10x PBS. Utilizou-se 6 ml de tripisinaEDTA no meio de cultura, este meio é incubado a +37ºC durante 5 minutos. Para inativar a
tripsina foi utilizado 18 ml de meio de cultura DMEM/F12.
4.5 ULTRACENTRIFUGAÇÃO DOS EXOSSOMOS DERIVADOS DAS CÉLULAS THP1,
DOS MACRÓFAGOS TIPO 1, MACRÓFAGOS TIPO 2 E DAS CÉLULAS TUMORAIS
Para isolar os exossomos, utilizou-se amostras de meio de cultura dos macrófagos 1 e
2, das células THP e das linhagens celulares SCC-25, SAS e HSC-3. A amostra foi colocada
em tubos específicos para ultracentrifugação (Modelo WX Ultra 90 – Thermo electron
Corporation), feitos de vinil. A quantidade de amostra colocada em cada tubo foi a mesma,
calibradas em balança de precisão.
Os tubos são colocados em um carrossel e as amostras foram submetidas a dois
processos de ultracentrifugações. O primeiro para remover organelas residuais e fragmentos de
células, realizado em temperatura de +4ºC, realizado durante 90 minutos a 7600 rotações por
minuto (RPMs).
Ao fim da primeira ultracentrifugação, o sobrenadante é removido e submetido a uma
nova ultracentrifugação, seguindo os mesmos métodos citados acima. Esta última etapa foi
realizada a 24200 RPMs, em temperatura de +4ºC, durante 90 minutos. Após este
procedimento, os exossomos ficam localizados no fundo dos tubos. A amostra é, então, coletada
em eppendorfs estéreis e armazenada em temperatura de -70ºC.
4.6 TESTE DE PROTEÍNA – TESTE DE BRADFORD (BIO-RAD, USA)
O teste de proteína Bio-Rad é um teste colorimétrico que quantifica a concentração de
proteína através da solubilização de detergente. A reação atinge cerca de 90% do seu máximo
50
de cor em 1 hora. Após esse período, a cor não muda mais do que 5% depois de 1 hora e 10%
após 2 horas da adição dos reagentes.
O teste é baseado na reação da proteína com uma solução de tartarato de cobre alcalino
e o reagente Folin, que é um reagente alcalino, usado para medir os níveis de aminoácidos,
produz uma cor vermelha brilhante e fluorescente em soluções alcalinas. O teste foi realizado
para medir a concentração de proteínas presentes nas amostras de exossomos derivados das
células THP1, M1 e M2, as quais foram utilizadas para fazer os testes funcionais de invasão,
proliferação, viabilidade celular e imunofluorescência.
As amostras utilizadas foram diluídas em concentrações de 1:1 (5 µl da amostra para 5
µl de solução de PBS). Essas amostras foram pipetadas dentro de poços em uma placa de cultura
celular de 96 poços. Para a reação, foi utilizado o leitor de absorbância. Após acrescentar os
reagentes, a placa foi submetida ao leitor de absorbância com comprimento de onda 750 nm. A
tabela 1 apresenta de forma resumida as concentrações de exossomos utilizadas no presente
estudo, que foram calculadas através do teste de proteína – teste de Bradford (BIO-RAD, USA).
Exossomos
Concentração
dos exossomos
por estoque
(µg/µl)
Concentração
utilizada nos
testes (µg/ml)
Quantidade de
exossomos
pipetada /
Apenas em um
teste (µl)
Concentrações
usadas nos
testes
THP1
0.406
0.1
0.05
0.406µg/µl *
0.05µl = 0.0203
µg
M1
0.44
0.1
0.045
0.44µg/µl *
0.045µl =
0.0198µg
M2
0.55
0.1
0.04
0.55µg/µl *
0.04µl =
0.022µg
THP1
0.406
1.0
0.5
0.406µg/µl *
0.5µl = 0.203
µg
0.45
0.44µg/µl *
0.45µl =
0.198µg
M1
0.44
1.0
51
M2
0.55
1.0
0.4
0.55µg/µl *
0.4µl = 0.22µg
THP1
0.406
10.0
5
0.406µg/µl *
5µl = 2.03 µg
M1
0.44
10.0
4.5
0.44µg/µl *
4.5µl = 1.98µg
M2
0.55
10.0
3.6
0.55µg/µl *
3.6µl = 2.2µg
Quadro 1 – Concentração de exossomos utilizada no estudo, calculadas com base nos resultados no teste de Bradford.
4.7 IMUNOELETROMICROSCOPIA
A imunoeletromicroscopia foi realizada com os anticorpos primários anti-CD63 e antiTGF-β. O anti-CD63 foi utilizado para identificar e confirmar a presença dos exossomos nas
amostras derivadas das células THP1 e dos macrófagos M1 e M2, após a ultracentrifugação.
Os exossomos provenientes das linhagens celulares SCC-25, SAS e HSC-3, derivados
das células THP1 e dos macrófagos M1 e M2, foram marcados com o anticorpo anti-TGF-β,
com o objetivo de observar a secreção desta proteína pelas referidas microvesículas.
Para o anticorpo monoclonal anti-CD63, a diluição utilizada foi de 1:100 (AbD Serotec).
Já para o anticorpo policlonal anti-TGF-β (Cell Signaling Technology), a diluição empregada
foi de 1:200, baseado no estudo de Jan Van Deun et al., 2014.
Os exossomos isolados foram depositados em uma grade de níquel revestido “formvar”,
material este composto por uma resina termoplástica, formada a partir de polímeros de álcool
polivinílico. O “formvar” é comumente utilizado como material de revestimento e adesivo. Sua
função é estabilizar o filme de carbono antes da aplicação da amostra. A grade de níquel
juntamente com a amostra de exossomos é incubada em meio contento PBS e 1% de BSA.
As microvesículas foram expostas aos anticorpos primários durante 20 minutos. Em
seguida, utiliza-se o anticorpo secundário anti-IgG (Zymed, San Francisco, CA, EUA)
52
associado à proteína conjugada com ouro de 10 nm (SLOT et al.,1985), por um período de 20
minutos.
As grades foram coradas com 2% uranilacetato neutro. As imagens foram examinadas
em microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2 Spirit (FEI Europa, Eindhoven, Países
Baixos). As imagens foram capturadas pela câmera Quemesa CCD e analisadas utilizando Item
software (Olympus Imaging Solutions macio GMBH, Munster, Alemanha). A ausência do
anticorpo primário foi utilizada como controle negativo.
Especificidade
Nº DO
CATÁLOGO
CD 63
557305
TGF β
3711
FABRICANTE
DILUIÇÃO
ANTICORPO
SECUNDÁRIO
INCUBAÇÃO
Becton
Dickinson®
1:200
IgG (Zymed,
San Francisco,
CA, USA)
20 min
1:1000
IgG (Zymed,
San Francisco,
CA, USA)
20 min
Cell Signaling
Technology®
Quadro 2 – Especificidade, Nº do catálago, fabricante, diluição, anticorpo secundário e tempo de incubação do anticorpo
primário utilizado na imunoeletromicroscopia.
4.8 ENSAIO DE INVASÃO UTILIZANDO MIOGEL
Para investigar os efeitos que os exossomos derivados dos macrófagos, M1 e M2, e das
células THP1 exercem sobre a característica de invasão das linhagens celulares SCC-25, SAS
e HSC-3, foi utilizado o modelo de invasão previamente caracterizado por Salo et al. (2015).
Este modelo tem como principal característica o fato de mimetizar o microambiente tumoral.
Para isso, o ensaio de invasão foi realizado utilizando placas de cultura de 24 poços,
usando o modelo organotípico baseado em mioma humano, o miogel. Para este teste, foi
preparado um meio de cultura contendo 50 ml DMEM/F-12 1:1 (Gibco; REF. 31330) com
adição de 0,5 ml de penicilina/estreptomicina, 0,5 ml de vitamina C, 50 µl de FZ e 5 µl de HK,
sem adicionar FBS. E, ainda, solução contendo 1% de solução agarose e solução contendo 2,4
mg/ml de miogel.
53
Para o preparo do miogel, é feito o descongelamento do material de forma lenta. Cada
poço da placa de cultura deve conter 50 µl da solução preparada contendo miogel. Composta
por 0,2% da solução de agarose e 2,4 mg/ml de miogel diluído em meio de cultura livre de FBS.
Para a preparação do miogel, utilizou-se um eppendorf, no qual as substâncias foram
adicionadas em ordem, primeiro o meio de cultura livre de soro, em seguida o miogel,
acrescentando por último a agarose, diluída em PBS estéril. Em cada poço coloca-se 50 µl deste
preparo. Em seguida, o miogel é deixado descansando, para que a membrana pudesse tomar
consistência, por um período de 30 minutos.
Para o teste de invasão, as células foram tripsinizadas normalmente, e a tripsina-EDTA
deve ser inativada utilizando DMEM/F12, como previamente descrito.
Neste estudo, foram realizados dois tipos de experimento:
1. Para este ensaio, apenas as linhagens celulares SCC-25 e HSC3 foram colocadas no
compartimento superior do poço. Os três diferentes tipos de exossomos derivados de
TAMs (THP1, M1 e M2), com as três diferentes concentrações estudas (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml), foram colocados no compartimento inferior, com o intuito de a
investigar a existência de quimiotaxia por parte dos exossomos em relação às células
tumorais No compartimento inferior, foi realizado o teste tanto com o meio de cultura
livre de FBS, quanto com meio de cultura;
Well
Well
Transwell
Transwell
Linhagem celular de câncer
Linhagem celular de câncer
+ exossomos
Miogel
Miogel
Meio de cultura
Meio de cultura
+ exossomos
Figura 6 – Experimento grupo 1
Figura 7 – Experimento grupo 2
Para cada poço, foram utilizadas 80000 células, esse valor foi multiplicado por 40,
número que corresponde ao número de poços utilizados. Assim, para cada tipo celular (SCC25, SAS e HSC-3), foram utilizadas ao todo 3.200.000 células em 8.000 µl de meio de cultura
livre de FBS, para todo o conteúdo de suspensão celular. Cada transwell recebeu 200 µl de
células suspensas em meio sem FBS. O mesmo teste foi realizado com as células suspensas em
54
meio de cultura DMEM/F-12 (Ref. 31330, Life Technologies), substituindo o meio de cultura
livre de FBS, com o intuito de observar se havia diferenças entre os meios.
2. No segundo ensaio, utilizou-se as linhagens celulares SCC-25, HSC-3, SAS juntamente
com os três diferentes tipos de exossomos derivados de TAMs (THP1, M1 e M2), com
as três diferentes concentrações estudas (0,1µg/ml, 1µg/ml, 10µg/ml), colocadas no
compartimento superior do poço, para investigar se os exossomos possibilitam que as
células migrem mais rapidamente através do miogel e ultrapassem a membrana
microporosa do transwell para o compartimento inferior. No compartimento inferior, o
teste foi realizado tanto com meio de cultura livre de FBS, quanto com meio de cultura
DMEM/F-12 (Ref. 31330, Life Technologies).
Para este segundo experimento, foram utilizadas 80.000 células (SCC-25, HSC-3, SAS)
em cada poço, contabilizando 4.000.000 de células no total de 50 poços utilizados para cada
linhagem celular. Para o teste, utilizamos 40 µl de exossomos por poço nas concentrações de
0,1 µg/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml associados às células tumorais mais 160 µl de meio de cultura
livre de FBS. No compartimento inferior, foram adicionados 500 µl de meio de cultura livre de
FBS. O mesmo teste foi realizado adicionando 500 µl de meio de cultura DMEM/F-12 (Ref.
31330, Life Technologies).
Todos os testes foram feitos em triplicatas. As placas do teste de invasão foram
incubadas por 72 horas a temperatura de +37°C, a 5% de CO2 para permitir que as células
invadam o miogel.
4.8.1 Avaliação do grau de invasão
Para avaliar o grau de invasão celular foi utilizada a coloração de azul de toluidina. Para
isso, após o período de incubação de 72 horas, o meio de cultura contido no compartimento
inferior dos poços é drenado e, em seguida, adiciona-se 500 µl de formol a 4%, deixando-se a
amostra fixar durante 1 hora em temperatura ambiente.
Com a amostra fixada na membrana microporosa do transwell, lava-se os poços com
PBS a 1% e remove-se com sucção o excesso de células que não ficaram aderidas e o gel. As
células aderidas são, posteriormente, coradas com 500 µl de solução de azul de toluidina. O
excesso de solução é removido dos transwells com lavagens com água deionizada.
55
Após a lavagem, adiciona-se 500 µl de solução de 1% SDS (Dodecil sulfato de sódio)
em cada poço. De cada poço, 150 µl desta solução é transferida para uma placa contendo 96
poços. Cada amostra foi feita em triplicada. A placa foi submetida à leitura de absorbância com
comprimento de onda de 650 nm.
4.9 ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO E VIABILIDADE CELULAR
4.9.1 BrdU (bromodeoxiuridina - ROCHE)
Para o teste de proliferação BrdU (ROCHE), foram utilizadas as linhagens celulares
HSC-3 e SCC-25, no qual se adicionou 5.000 células/poço. Estas células foram adicionadas
tanto em meio de cultura livre de FBS, quanto em meio de cultura DMEM/F-12 (Ref. 31330,
Life Technologies).
O seguinte protocolo para o ensaio de proliferação BrdU (ROCHE) foi seguido:
1. Meio de cultura livre de FBS: HSC3 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml);
2. Meio de cultura DMEM/F-12: HSC3 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml);
3. Meio de cultura livre de FBS: SCC-25 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml);
4. Meio de cultura DMEM/F-12: SCC-25 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml,
1 µg/ml, 10 µg/ml).
Para o ensaio, foi utilizada uma placa contendo 96 poços. O volume final de meio de
cultura e células adicionados em cada poço foi de 100 µl e o período de incubação foi de 24
horas, para que as células entrassem em sincronismo. O experimento foi realizado em
quadruplicata.
56
Adicionou-se 10 µl/poço do marcador BrdU, com posterior incubação da placa por 3
horas. Após esse período, removeu-se o meio com o marcador e foi adicionado 200 µl da
substância FixDenat, presente no kit, e a placa foi incubada em temperatura ambiente.
Após, removeu-se a solução fixadora (FixDenat) e foi adicionado 100 µl/poço da
solução de anticorpo anti-BrdU-POD, com período de incubação de 1h30 min, em temperatura
ambiente. Para remover essa solução, foram realizadas lavagens com PBS 10x. Ao remover
pela última vez o PBS 10x, adicionou-se 100 µl/poço da solução de substrato ou de parada que
já vem com o próprio Kit. A solução fica em temperatura ambiente por 10 minutos e em seguida,
observa-se a mudança de cor em cada poço.
A absorbância é medida em comprimento de onda de 450 nm.
4.9.2 Determinação do crescimento celular baseado no kit MTT (SIGMA-ALDRICH)
O
componente
chave
deste
teste
é
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
Diphenyltetrazolium Bromide) ou MTT.
Este teste foi conduzido de forma semelhante ao ensaio de proliferação BrdU:
1. Meio de cultura livre de FBS: HSC3 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml);
2. Meio de cultura DMEM/F-12: HSC3 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml);
3. Meio de cultura livre de FBS: SCC-25 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml, 1
µg/ml, 10 µg/ml);
4. Meio de cultura DMEM/F-12: SCC-25 + exossomos derivados dos TAMs (0,1 µg/ml,
1 µg/ml, 10 µg/ml).
Como protocolo, adicionamos 10 µl da solução de MTT e retornamos à incubadora por
3 horas. Após esse período, remove-se os cristais formados pelo MTT, através de sucção,
adicionando-se, a seguir, 100 µl de solvente para MTT em cada poço, seguido de agitação
durante 10 minutos a 300 RPMs. Por fim, mede-se a absorbância em comprimento de onda de
570 nm.
57
4.10 IMUNOFLUORESCÊNCIA DOS EXOSSOMOS DERIVADOS DOS TAMS E DAS
LINHAGENS CELULARES DERIVADAS DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE
LÍNGUA
4.10.1 Preparação da amostra das linhagens celulares HSC-3, SAS e SCC-25
Para a marcação das linhagens celulares HSC-3, SAS e SCC-25, utilizou-se o marcador
Vybrant DIL (Life Technology). Após a ressuspensão das células, elas passam por processo de
centrifugação durante 4 minutos a 1.000 RPM.
Posteriormente, o meio é descartado e as células foram suspensas em meio de cultura
livre de FBS. As células foram diluídas em uma concentração de 1x 106 células/ml. Nesse meio,
foram adicionados 5µl da solução Vybrant DIL às células em suspensão em um período de
incubação de 20 minutos, em temperatura de +37ºC a 5% de CO2.
Após o período de incubação, as células foram lavadas 3 vezes com meio de cultura
DMEM/F-12. Enquanto foi realizada a preparação da amostra dos exossomos derivados dos
TAMs, as células foram deixadas na incubadora em temperatura de 37ºC a 5% de CO2.
4.10.2 Preparação da amostra de exossomos derivados dos TAMs
O kit Exo-Glow permite que os exossomos isolados sejam marcados por
imunofluorescência para medir absorção e interação celular. Os exossomos isolados são
ressuspensos e incubados em Exo-Red. O marcador Exo-Red é baseado no composto Laranja
de Acridina (Acridine Orange - AO). As membranas dos exossomos são permeáveis ao laranja
de acridina. Esta coloração é responsável pela marcação imunofluorescente de RNAs de cadeia
simples dentro dos exossomos. Os RNAs marcados pelo Exo-Red podem, então, ser
monitorados, possibilitando a observação da entrega dos exossomos às células-alvo através dos
exossomos usando microscópio de imunofluorescência.
Para o experimento, os exossomos isolados são ressuspensos em 500 µl de PBS. A
quantidade de exossomos utilizada foi de 100 µg para reação de marcação. Adicionou-se 50 µl
de Exo-Red para 500 µl de suspensão de exossomos em PBS 10x. Em seguida, a solução de
exossomos foi incubada a 37ºC em 5% de CO2 por 10 minutos.
Para interromper a reação de marcação, adicionou-se 100 µl do reagente ExoQuick-TC
à solução de exossomos marcados. A amostra de exossomos marcados foi mantida no gelo por
58
trinta minutos. Posteriormente, as amostras foram submetidas a microcentrifugação durante três
minutos a 14.000 RPM. Em seguida, foi removido o excesso de marcador flutuante e os pellets
de exossomos marcados foram ressuspendidos em 500 µl de PBS 10x.
Os exossomos foram, então, adicionados às placas de 24 poços, juntamente com as
linhagens celulares marcadas com o Vybrant DIL e a incubação foi realizada por 2 horas. O
monitoramento das células foi realizado após este período com um microscópio com filtro para
imunofluorescência. Os testes foram realizados em triplicatas e avaliados no programa Leica
Qwin Standard.
Análise Estatística
60
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados do estudo foram tabulados e submetidos a testes apropriados. No presente
estudo, foram avaliados três diferentes tipos de linhagens celulares com diferentes
concentrações de exossomos. Após os tratamentos, as células foram avaliadas de acordo com a
viabilidade (MTT), proliferação (BrdU) e invasão. Para essas análises, foi utilizado o programa
IBM SPSS Statistics v21.0 (IBM corp. Armol, NY, USA).
Utilizou-se o teste paramétrico para avaliar a distribuição da amostra e para identificar
as diferenças entre os grupos. Para a análise de variância no ensaio de invasão celular,
viabilidade e proliferação celular, utilizou-se teste ANOVA, seguido do teste Scheffe’s Post
Hoc. A avaliação das amostras não paramétricas foi realizada através do teste Kruskal-Wallis,
para identificar a diferença entre os grupos.
Os gráficos foram construídos utilizando o OriginPro 9.1.0 program (©1991-2013
OriginLab Corporation). A análise da imunofluorescência e das marcações do CD63 e TGF-β
foi realizada de forma descritiva.
Para os testes estatísticos utilizados, o nível de significância atribuído foi de 5%
(p≤0,05).
Resultados
62
6 RESULTADOS
6.1 ANÁLISE DA IMUNOELETROMICROSCOPIA PARA OS ANTICORPOS ANTI-CD63
E TGF-β
Os exossomos derivados dos macrófagos e das células THP1 foram submetidos à
marcação utilizando a técnica da imunoeletromicroscopia, com o anticorpo anti-CD63, com o
objetivo de identificar a secreção de microvesículas por essas células. Ao avaliar as imagens,
observou-se que todos os exossomos derivados dos TAMs e das células THP1 apresentaram
marcação pelas partículas de ouro associadas ao anticorpo primário anti-CD63 (FIGURA 7),
confirmando que as células isoladas pelo processo de ultracentrifugação apresentam forma e
tamanho compatíveis com essas microvesículas. Entre as amostras analisadas, os exossomos
derivados dos macrófagos do subtipo M2 foram os que se apresentaram em maior número.
A imunomarcação para o TGF-β foi realizada tanto nos exossomos derivados das
linhagens celulares estudadas (SCC-25; SAS e HSC3), quanto nos exossomos derivados dos
TAMs e das células THP1. De forma descritiva, observou-se que os exossomos derivados dos
TAMs e das células THP1 apresentaram marcação para este anticorpo de forma escassa.
Ao comparar as imagens obtidas pela microscopia eletrônica de transmissão, utilizando
o software iTEM (Olympus Soft Imaging Solutions GMBH, Munster, Germany), constatou-se
que as microvesículas derivadas das células tumorais não apresentavam qualquer marcação para
o TGF-β, demonstrando que, nas amostras avaliadas, os exossomos derivados dos tumores não
expressaram esta proteína.
Quando analisadas as amostras de exossomos derivados dos macrófagos, percebe-se, no
presente estudo, que estas microvesículas derivadas de M1, M2 e das células THP1
apresentaram secreção de TGF-β de forma variada entre si. No entanto, as microvesículas
derivadas de M2 foram as únicas capazes de apresentar uma forma expressiva e mais
consistente de marcação para TGF-β (FIGURA 8).
63
Figura 7 – Caracterização dos exossomos isolados dos macrófagos pelo método clássico da ultracentrifugação (WX ultra 90Thermo electron corporation), marcadas com anti-CD63. As figuras A e D apresentam exossomos THP1, B e E exossomos
subtipos M1 e C e F exossomos dos macrófagos tipo 2.
A
B
C
D
E
F
Figura 8 – Ausência de marcação para TGF-β dos exossomos derivados das linhagens celulares HSC-3 (FIGURA A) e SCC5 (FIGURA B) e nos exossomos derivados das células THP 1 (FIGURA D) e M1 (FIGURA E). Presença de marcação para
TGF-β dos exossomos derivados dos TAMs M2 (FIGURA F).
64
6.2 ANÁLISE DO ENSAIO DE INVASÃO UTILIZANDO MIOGEL
6.2.1 Análise do ensaio de invasão utilizando com utilizando a linhagem celular SCC-25
A análise do teste de invasão demonstrou que, para a linhagem celular SCC-25,
cultivada juntamente c om os exossomos derivados dos macrófagos e das células THP1,
utilizando meio de cultura DMEM/F 12 no compartimento inferior do poço, o ensaio de invasão
realizado sem exossomos apresentou menor invasão celular, quando comparado aos outros
grupos. Com relação ao grupo de exossomos apresentando concentração de 10 µg/ml,
observou-se que todas as amostras apresentaram significância estatística (p≤0,001). Os
resultados estatísticos mostraram, também, a relação entre a invasão celular sem exossomos e
com a presença de exossomos do tipo THP1 e M2 na concentração de 0,1 µg/ml com p≤0,01;
já para as amostras contendo exossomos do subtipo M1 a significância estatística foi de p≤0,001
(GRÁFICO 1).
GRÁFICO 1 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SCC-25 em meio de cultura DMEMF/12. (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
65
O GRÁFICO 1 mostra que entre os ensaios de invasão com concentração de exossomos
0,1 µg/ml, houve diferença estatisticamente significativa entre os ensaios utilizando os
exossomos THP1 e M1 (p≤0,001). No teste de invasão utilizando 1,0 µg/ml, observou-se
relação estatisticamente significativa entre as amostras apresentando os exossomos M1 e M2
(p≤0,05).
O GRÁFICO 2 apresenta a relação entre os grupos contendo exossomos e a linhagem
celular SCC-25, em meio de cultura sem FBS, no qual, observou-se relação estatisticamente
significativa entre o grupo que apresenta exossomo do subtipo M2, em concentração de 1,0
µg/ml ( p≤0,01), em relação ao grupo em que há ausência de exossomos. Para o grupo com
exossomos em concentração 0,1 µg/ml, M2 apresentou significância estatística (p≤0,001)
também em relação à amostra que apresenta ausência de exossomos.
No grupo com concetração 0,1 µg/ml, observou-se diferença entre os exossomos do
subtipo M2 e M1 (p≤0,01) e entre os exossomos M2 e THP1 (p≤0,001). Para os testes realizados
com os exossomos localizados no compartimento inferior, não houve significância estatística
entre os grupos (p>0,05) (GRÁFICO 3).
GRÁFICO 2 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SCC-25 em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
66
GRÁFICO 3 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SCC-25 com exossomos no compartimento inferior do transwell
(*) p≤0,05, (**) p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
6.2.2 Análise do ensaio de invasão com miogel utilizando a linhagem celular HSC-3
Ao avaliar os resultados com a linhagem celular HSC-3, observa-se que o grupo em que
há ausência de exossomos apresentou maior invasão celular em presença de meio de cultura
DMEM/F12. Em relação aos grupos contendo as diferentes concentrações de exossomos (0,1
µg/ml; 1,0 µg/ml; 10 µg/ml), constatou-se que, na invasão celular, há relação estatisticamente
significativa entre a invasão celular na ausência de exossomos e na presença dos exossomos
THP1, M1 e M2. Neste aspecto, sugere-se que a presença dos exossomos diminuiu a capacidade
invasiva das células HSC-3 em presença de meio de cultura DMEM/F12 (GRÁFICO 4).
67
GRÁFICO 4 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular HSC-3 em meio de cultura DMEMF/ 12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01
(***), p≤0,001. NATAL-RN, 2015.
Quando o ensaio foi realizado em presença de meio de cultura livre de FBS, os
resultados obtidos foram semelhantes aos observados em presença de meio de cultura
DMEMF/12. Observou-se com o ensaio um maior potencial de invasão das células na ausência
de exossomos, quando comparado com a quantidade de invasão obtida em presença das
diferentes concentrações de exossomos (p≤0,001) (GRÁFICO 5).
68
GRÁFICO 5 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular HSC-3 em meio de cultura meio de cultura com ausência de
FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
Ao observar os resultados da análise do ensaio em que as células HSC-3 localizaram-se
no compartimento superior dos poços e os exossomos na região inferior, é possível observar
que foi observada uma menor capacidade de invasão das células com a ausência de exossomos
quando comparadas com as amostras de células com exossomos. Neste ensaio, constatou-se
que a presença de exossomos M2, na concentração 10 µg/ml, no compartimento inferior,
demonstrou relação estatisticamente significativa em relação ao grupo que apresenta na
ausência de exossomos (p≤0,001). O mesmo foi observado para M1. Entre as amostras de
concentração 0,1 µg/ml percebe-se que há uma maior capacidade invasiva de M1 em relação
aos exossomos derivados das células THP1 (GRÁFICO 6).
69
GRÁFICO 6 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular HSC-3 contendo exossomos no compartimento inferior do
transwell. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
6.2.3 Análise do ensaio de invasão com miogel utilizando a linhagem celular SAS
A análise de invasão mostra que as células da linhagem SAS, em meio de cultura livre
de FBS, obtiveram maiores níveis de invasão quando comparadas às amostras de células
tumorais associadas aos exossomos derivados dos TAMs, M1 e M2, nas concentrações 10
µg/ml (p≤0,001). O mesmo resultado foi observado para os exossomos M1 e M2 em
concentração de 1,0 µg/ml (p≤0,001). No entanto, observou-se que os exossomos derivados das
células THP1 (10 µg/ml) apresentaram um maior grau de invasão quando comparados a M1
(p≤0,05) e a M2 (p≤0,01), o mesmo se aplicando à concentração de 1,0 µg/ml (GRÁFICO 7).
Quanto às análises realizadas em meio de cultura contendo DMEM/F12, não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas entre as amostras. O mesmo resultado foi
constatado para o ensaio de invasão realizado com os exossomos localizados no compartimento
inferior dos poços de cultura celular.
70
GRÁFICO 7 – Ensaio de invasão utilizando linhagem celular SAS meio de cultura com ausência de FBS. (*) p≤0,05, (**)
p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
6.3 ANÁLISE DOS ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO (BrdU / MTT)
6.3.1 Ensaio de proliferação BrdU/ Ensaio de viabilidade celular (MTT) – linhagem
celular HSC-3
No gráfico 8, observa-se os resultados inerentes ao estudo de proliferação, utilizando
meio de cultura DMEMF/12, revelaram que as células HSC-3 quando cultivadas com ausência
de exossomos apresentaram um maior índice de proliferação quando comparada ao grupo teste
(50 µg/ml). Para a linhagem celular HSC-3 cultivada com exossomos derivados das células
THP1 (p≤0,001), M1 (p≤0,001) e M2 (p≤0,01), observou-se diferença estatisticamente
significativa em relação às células cultivadas sem exossomos, para a concentração 50 µg/ml.
No que diz respeito aos testes intergrupos, para a linhagem celular HSC-3, observou-se
que os exossomos (0,1 µg/ml) derivados das células THP1 apresentaram maior função na
atividade de proliferação das células em relação aos exossomos derivados dos TAMs do subtipo
M2 (p≤0,001).
71
Para o grupo teste com exossomos na concentração 1 µg/ml, os testes estatísticos
realizados entre os grupos demonstraram que as linhagens celulares cultivadas em meio
contendo exossomos M2, apresentaram maior capacidade de proliferação quando comparados
aos exossomos M1 (p≤0,001), o mesmo sendo observado com os exossomos das células THP1
(p≤0,001) (GRÁFICO 8).
GRÁFICO 8 – Ensaio de proliferação BrdU utilizando linhagem celular HSC-3 e exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml;
1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, em meio de cultura DMEMF/12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
Ao avaliar a proliferação das células HSC-3 na presença dos exossomos derivados das
células THP1, M1 e M2, em meio de cultura apresentando ausência de FBS, observou-se que
as células cultivadas apresentaram maior capacidade de proliferação, quando associadas a
exossomos do subtipo M2, na concentração de 50 µg/ml, quando comparadas com as outras
concentrações de exossomos avaliadas. As células HSC-3 cultivadas com exossomos M2
também apresentaram maior capacidade proliferativa quando comparadas às células cultivadas
com ausência de exossomos, constatando-se relação estatisticamente significativa (p≤0,01)
(GRÁFICO 9).
72
GRÁFICO 9 – Ensaio de proliferação BrdU utilizando linhagem celular HSC-3 e exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml;
1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
73
GRÁFICO 10 – Ensaio de viabilidade celular MTT utilizando linhagem celular HSC-3 e exossomos nas concentrações 0,1
µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, em meio de cultura DMEMF/12. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN,
2016.
Quanto ao estudo de viabilidade celular, na presença de meio de cultura DMEMF/12,
utilizando a linhagem celular HSC-3, constatou-se que não houve diferença estatisticamente
significativa entre os grupos e entre as células cultivadas na ausência de exossomos (p>0,05)
(GRÁFICO 10). Ao avaliar os resultados inerentes à viabilidade celular, em presença de meio
de cultura com ausência de FBS, também foi observada ausência de relação estatisticamente
significativa (p>0,05) (GRÁFICO 11).
Viabilidade HSC 3
Meio de cultura sem FBS
74
GRÁFICO 11 – Ensaio de viabilidade celular MTT utilizando linhagem celular HSC-3 e exossomos nas concentrações 0,1
µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, em meio de cultura com ausência de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01, (***) p≤0,001.
NATAL-RN, 2016.
6.3.2 Ensaio de proliferação BrdU/ Ensaio de viabilidade celular (MTT) – linhagem
celular SCC-25
O ensaio de proliferação realizado com a linhagem celular SCC-25, utilizando meio de
cultura DMEM F/12, exossomos derivados das células THP1, M1 e M2, em suas diversas
concentrações, não apresentou diferença estatisticamente significativa (p>0,05) em relação às
amostras cultivadas na ausência de exossomos (GRÁFICO 12).
No entanto, pôde-se verificar relação estatisticamente significativa entre os grupos. A
cultura de células SCC-25 realizada juntamente com os exossomos M2, em concentração de
0,1 µg/ml, demonstrou uma maior capacidade de proliferação destas células quando
comparadas com as células cultivadas com exossomos THP1, nas concentrações 10 µg/ml e 50
µg/ml (p≤0,05) (GRÁFICO 12).
75
GRÁFICO 12 – Ensaio de proliferação BrdU utilizando linhagem celular SCC-25 e exossomos nas concentrações 0,1 µg/ml;
1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05 (**), p≤0,01 (***), p≤0,001. NATAL-RN, 2016.
Em relação ao ensaio realizado com meio de cultura apresentando ausência de FBS, não
foi possível observar relações estaticamente significativas entre os grupos, nem entre a cultura
celular com ausência de exossomos (p>0,05).
Quanto à viabilidade celular, também foi observada presença de diferenças estatísticas
entre o grupo contendo M2 (concentração de 50 µg/ml) e entre os grupos e as células cultivadas
sem a presença de exossomos, tanto em meio de cultura ausência de FBS (p≤0,05) (GRÁFICO
13).
76
GRÁFICO 13 – Ensaio de viabilidade celular MTT utilizando linhagem celular SCC-25 e exossomos nas concentrações 0,1
µg/ml; 1,0 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, em meio de cultura livre de FBS. (*) p≤0,05, (**) p≤0,01, (***) p≤0,001. NATAL-RN,
2016.
6.4 ANÁLISE DESCRITIVA DA IMUNOFLUORESCÊNCIA
A análise realizada pela imunofluorescência teve como objetivo observar se haveria ou
não a internalização dos exossomos derivados dos TAMs para o interior das células tumorais,
nas linhagens estudadas. Ao analisar as amostras utilizadas no teste de imunofluorescência, foi
possível observar que houve a internalização dos exossomos derivados tanto das células THP1
quanto dos TAMs, M1 e M2, para o interior das células tumorais. Deste modo, evidenciou-se
que há uma comunicação entre exossomos e célula.
É possível perceber, ainda, de forma descritiva, que a capacidade de interação entre os
diferentes tipos celulares é diferente. Ao se observar a diferença de coloração entre as diferentes
linhagens celulares, percebe-se que há uma tendência maior das células SCC-25 a
internalizarem os exossomos. Isso é evidenciado pela coloração amarela nas imagens. As
células em verde representam as linhagens celulares e as em vermelho representam os
exossomos. Durante a comunicação célula-exossomo, momento em que os exossomos passam
seu conteúdo para o interior celular, essa coloração fica sobreposta, caracterizando a cor
amarela. Essa coloração foi melhor observada e de maneira mais intensa nas células SCC-25,
quando em cultura com os exossomos do subtipo M2 (FIGURA 9).
77
Figura 9 – Imagem representativa da marcação pelo método de imunofluorescência utilizando Vybrint Dil (células tumoraisverde) e Exo-GLOW (exossomos – vermelho). As imagens as colorações amarelas e alaranjadas correspondem a internalização
dos exossomos nas linhagens celulares.
Discussão
79
7 DISCUSSÃO
Diante da escassez de estudos que relacionam a presença de exossomos derivados dos
TAMs no microambiente tumoral e o comportamento das células de CE de língua frente a essas
microvesículas, torna-se relevante realizar análises objetivando compreender o mecanismo pelo
qual os exossomos derivados dos TAMs atuam frente às linhagens de CE de língua.
Sabe-se que a lesão maligna vem sendo compreendida como inserida em um
microambiente, no qual as interações entre os elementos celulares e moleculares que o
compõem são determinantes na progressão tumoral. Componentes presentes no microambiente
tumoral podem influenciar no processo de crescimento da lesão. Entre esses integrantes,
encontram-se os elementos da imunidade, cuja modulação tem sido demonstrada, tanto no
sentido da vigilância imunológica, quanto no favorecimento da progressão tumoral
(ONUCHIC; CHAMMAS, 2010).
A hipótese da imunoedição proporcionou um melhor entendimento sobre o mecanismo
de escape tumoral. Esta hipótese parte da idéia de que o sistema imune tem um duplo papel no
processo tumoral (DUNN; OLD; SCHREIBER, 2004; SCHEREIBER, 2005). A imunoedição
pode ser dividida nas fases eliminação, equilíbrio e escape. A fase de eliminação representa o
conceito clássico de imunovigilância, em que as células e moléculas da resposta imune inata e
adaptativa reconhecem e destroem os tumores, protegendo o hospedeiro contra o câncer. Esta
fase inicial pode erradicar uma grande quantidade de células transformadas. Porém algumas
podem resistir e a persistência destas células caracteriza a segunda etapa, denominada fase de
equilíbrio (BENITO-MARTIN et al., 2015).
A fase de equilíbrio representa um tipo de dormência na qual o crescimento tumoral é
controlado pela imunidade (SCHREIBER; OLD; SMYTH, 2011). Nesta fase, muitas células
tumorais são eliminadas e poucas sofrem mutação, tornando-se resistentes ao ataque do sistema
imune devido a mutações sofridas. Assim, no fim da fase de equilibrio, surge uma nova
população de clones tumorais sobreviventes, cuja característica principal é a baixa
imunogenicidade em continuidade instala-se o que é chamado de fase de escape, na qual as
células que sofreram mutações tornam-se resistentes à resposta imune e sobrevivem. Em
seguida, ocorre um crescimento celular exagerado, de maneira descontrolada, iniciando assim
a progressão tumoral (ZITVOGEL; TESNIERE, KROMER, 2006).
Tais achados evidenciam a importância do sistema imune no controle do
desenvolvimento tumoral. Entre as células componentes do sistema imune que infiltram o
80
tumor, a participação de macrófagos vem ganhando importância e complexidade crescente. Os
macrófagos são envolvidos em processos de inflamação crônica e parecem estar associados à
progressão tumoral e metástase. Densidades elevadas de macrófagos no tecido neoplásico
foram relacionadas a mau prognóstico e à superexpressão de CSF-1 (colony-stimulating factor
-1, um fator de crescimento de macrófagos), já encontrada em tumores de mama, útero, e ovário,
está correlacionada a um alto grau de malignidade (CONDEELIS; POLLARD, 2006).
Os macrófagos associados a tumores (TAMs) podem secretar substâncias como
citocinas e quimiocinas, promovendo a migração e infiltração de leucócitos que podem
contribuir para o crescimento tumoral. Os macrófagos estão entre as células em maior número
no tumor primário e nas metástases. Elas servem para reconhecer, fagocitar e destruir as células
invasoras (CHOW et al., 2014).
Estudo recente tem indicado a presença de dois tipos de macrófagos, M1 e M2. Os
TAMs associados a tumores do subtipo M1 são caracterizados por uma alta expressão de
citocinas pró-inflamatórias como a IL 1, IL 6 e IL 12, células efetivas contra microrganismos e
células tumorais. Em contraste, os macrófagos M2 são caracterizados pela alta expressão de IL4 e IL-10, com capacidade de promoverem a angiogênese, remodelação tecidual e reparo, e
podem estar relacionados com a maior capacidade de resistência à terapia e pior prognóstico
(SUGIMURA et al., 2015).
O CE e os TAMs parecem apresentar uma estreita relação no microambiente tumoral.
No entanto, ainda não está bem esclarecido como essas células podem interagir entre si. Pirilä
e colaboradores (2015) observaram que os TAMs do subtipo M2 podem exercer importante
papel como reguladores da adesão, migração, invasão e produção de citocinas, que, por sua vez,
podem favorecer o crescimento tumoral. Esses autores sugerem que os pacientes com CE de
língua poderiam se beneficiar com terapias-alvo utilizando os TAMs.
Sabe-se que tanto as células tumorais quanto as células que se encontram no
microambiente tumoral podem ser capazes de secretar microvesículas que apresentam diversas
funções biológicas (BENITO-MARTIN et al., 2015). Por serem responsáveis por descartar
detritos celulares, os exossomos constituem motivo de continuados estudos, o que tem
permitido demonstrar a sua função na comunicação celular, particularmente na capacidade de
mediar a interação célula-célula (COLOMBO; RAPOSO; THERY, 2014).
Os exossomos podem ser responsáveis por carrear moléculas que se encontram nas suas
células de origem. Dentre estas, pode-se citar DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios
derivados das células mães (COLOMBO; RAPOSO; THERY, 2014). Alguns desses
componentes podem ser usados como marcadores para exossomos (ZLOTOGORSKI-
81
HURVITZ et al., 2015). Os estudos relacionados aos exossomos estão focando, principalmente,
na relação dos exossomos derivados de tumores e das células inflamatórias e sua função em
modular as interações com a resposta imune do hospedeiro (PEINADO et al., 2012).
A membrana celular dos exossomos pode conter receptores responsáveis pela
identificação da célula-alvo. Essa interação possibilita que os exossomos possam liberar seu
conteúdo no interior celular. A capacidade dos exossomos de se ligarem à membrana de células
específicas pode ativar sinais transmembrana, estando envolvidas em coordenar processos
fisiológicos e patológicos (COCUCCI; RACCHETTI; MELDOLESI, 2009).
É um motivo de preocupação a técnica a ser utilizada para isolar essas microvesículas.
O método de ultracentrifugação tem sido reportado na literatura como o mais utilizado (LI et
al., 2015). É de especial atenção utilizar métodos que minimizem o isolamento de agregados
de proteínas, o que pode diminuir a acurácia do método (THERY et al., 2006).
Dentre os métodos mais estudados e utilizados, atualmente, pode-se citar a
ultracentrifugação, ultrafiltração e kits comerciais, como o ExoQuick™, A ultracentrifugação
tem sido utilizada como padrão ouro para isolar exossomos (LOBB et al., 2015).
Observou-se que a técnica utilizada para isolar exossomos exerce influência no
procedimento de isolamento de exossomos. A ultracentrifugação pode ser capaz de isolar
melhor as microvesículas sem contaminação. Quanto ao ExoQuick, este apresenta significante
presença de agregados de proteínas não exossomais (LOBB et al., 2015; YAMASHITA et al.,
2016). Diante desses achados, optou-se por utilizar a ultracentrifugação para isolar os
exossomos estudados.
Uma das proteínas observadas na superfície dos exossomos é a CD63, membro da
família das tetraspaninas, utilizada como um dos marcadores de identificação dos exossomos.
Esta proteína apresenta função no intercâmbio celular, através da sua interação com receptores,
como a integrina. Por meio da adesão mediada pela interação integrina-CD63, esta proteína tem
papel na adesão das células à matriz extracelular (NISHIUCHI et al., 2005).
Um dos objetivos abordados no presente estudo foi o de observar se os TAMs, sejam
eles M1 ou M2, seriam capazes de secretar exossomos. Para tanto, utilizou-se o marcador de
superfície CD63. Através da análise utilizando imunoeletromicroscopia, pôde-se observar a
presença dessas microvesículas, derivadas dos TAMs. Este achado é de relevância para o
presente estudo, considerando ser possível a identificação dos exossomos, uma vez que se pode
realizar os ensaios propostos, com finalidade de ajudar elucidar o comportamento das células
derivadas de CE de língua frente a essas microvesículas.
82
Sabe-se que as tetraspaninas são as proteínas mais abundantes na superfície dos
exossomos e que tanto as células tumorais quanto as células imunes são capazes de secretar
essas microvesículas. Diante deste fato, o achado da marcação pelo anti-CD63 no presente
estudo encontra-se de acordo com os dados observados na literatura (MIGNOT et al., 2006;
LAZO et al., 2007; HIRANO et al., 2009). A presença de altos níveis da CD63 em pacientes
com câncer vem sendo relacionada a um pior prognóstico (JAKOBSEN et al., 2015).
No interior dos exossomos é possível observar diferentes proteínas, dentre elas, o TGFβ, que pode apresentar importante função. Sabe-se que esta proteína pode atuar como uma
potente molécula imunossupressora, capaz de inibir a citotoxidade das células NK, importantes
na eliminação das células tumorais (SZCZEPANSKI et al., 2011).
Cai e colaboradores (2013) observaram a capacidade inibitória do TGF-β na
proliferação celular e demonstraram que seu efeito é dose-dependente. Com a estimulação do
TGF-β, macrófagos são recrutados para o local do tumor e polarizados em TAMs do subtipo
M2, apresentando propriedades relacionadas com o suporte do crescimento tumoral.
Em diversos tipos tumorais, a superexpressão de TGF-β é localmente detectada no
microambiente ao redor da lesão e no seu estroma, promovendo a invasão no front tumoral,
facilitando assim a formação de metástase. Essa proteína pode ser derivada tanto das células
tumorais, quanto das células infiltradas no estroma tumoral, como fibroblastos, macrófagos e
leucócitos. O TGF-β pode, ainda, ser armazenado na matriz extracelular do osso, tornando-se
biologicamente ativo durante a progressão de lesões osteolíticas de natureza metastáticas
(PICKUP; NOVITSKIY; MOSES, 2013; PAPAGEORGIS, 2015).
No presente estudo, pôde-se observar que os exossomos derivados das linhagens
celulares SCC-25, SAS e HSC-3, apresentaram ausência de marcação para o TGF-β, enquanto
que para os exossomos derivados dos TAMs foi possível perceber a presença desta proteína, de
forma escassa. Os TAMs do subtipo M2, quando comparados com M1, apresentaram marcação
em maior número de microvesículas. Os achados apresentados pela imunoeletromicroscopia
sugerem que os TAMs do subtipo M2 podem apresentar capacidade aumentada de secreção de
TGF-β, o que pode representar a habilidade que esses macrófagos possuem na sua atividade
pró-tumoral.
Por outro lado, a ausência da secreção de TGF-β pelos exossomos das células tumorais
pode sugerir que a captação desta proteína para o interior da célula transformada pode estar
relacionada com o microambiente tumoral e na interação célula-célula que os exossomos
apresentam como função, o que facilitaria a progressão e crescimento tumoral.
83
Esses achados estão de acordo com os autores Gholamin et al. (2009) e Malkoski et al.
(2012), quando sugerem que a maior fonte de TGF-β está nos macrófagos, linfócitos B e T. As
células tumorais podem, também, secretarTGF-β, relacionando-se este fato com um pobre
prognóstico, representado pelo aumento na proliferação e invasão tumoral, aumento da
densidade dos vasos sanguíneos e pobre sobrevida em casos de adenocarcinoma de pulmão,
câncer gástrico e CEO (MINCIONE et a., 2008; MA et al., 2013; GONÇALVES et al., 2015).
O que se pode sugerir com os achados da presente pesquisa é que talvez as células
tumorais, através da internalização dos exossomos derivados dos TAMs, subtipo M2, passem a
apresentar o TGF-β em seu interior, por meio da comunicação célula-célula.
O meio utilizando o tecido derivado de mioma tem sido relatado pela sua capacidade de
mimetizar o microambiente tumoral in vivo, melhor que os meios que utilizam colágeno. O
padrão de invasão das células no miogel parece ser similar à invasão das células de CE nos
tecidos humanos (SALO et al., 2015).
Diante desses achados, o presente estudo optou por utilizar o meio organotipico
derivado de miomas humanos, miogel, para realizar o ensaio de invasão, com o objetivo de
observar o comportamento das células tumorais de CE de língua frente aos exossomos
derivados dos TAMs. Foi analisada a invasão dessas células em presença dos exossomos das
células THP1, M1 e M2, em diferentes concentrações e em diferentes meios de cultura.
Em primeira análise, observou-se que as células SCC-25 apresentaram uma maior
capacidade de invasão quando cultivadas conjuntamente com os exossomos, comparada com
os poços em que as células foram cultivadas em ausência de microvesículas, em meio de cultura
DMEM / F12. Dentre as concentrações avaliadas, as células associadas aos exossomos M2,
concentração 10 µg/ml, apresentaram maior capacidade de invasão. Para as concentrações 0,1
µg/ml e 1,0 µg/ml, as células SCC-25 apresentaram maior capacidade de invasão quando em
presença dos exossomos M1.
Ao observar a linhagem celular HSC-3, foi possível perceber que, na presença dos
exossomos, as células apresentaram menor capacidade invasiva, em meio DMEM / F12, quando
em comparação com as células cultivadas em ausência de exossomos. A quantidade de células
com capacidade de invasão foi ligeiramente maior no grupo de concentração 1,0 µg/ml para os
exossomos THP1.
Entre as linhagens celulares cultivadas em meio de cultura DMEM / F12, foi possível
perceber que as células SCC-25, apesar de apresentarem, originalmente, menor capacidade de
invasão, comportaram-se de forma distinta em relação às células HSC-3. Diante deste achado,
84
especula-se que, possivelmente, essas células apresentem uma maior sensibilidade à presença
dos exossomos em seu meio de cultura.
Fatores ambientais, como os que constituem o meio de cultura, podem afetar a produção
e o comportamento dos exossomos (LI et al., 2015). Esses fatores podem impactar na forma
que essas microvesículas interagem com as células tumorais (LI et al., 2015). Diante disto,
optou-se por realizar os ensaios deste estudo utilizando diferentes meios de cultura.
Ainda em relação ao ensaio de invasão, o presente estudo objetivou analisar o
comportamento celular frente aos exossomos na ausência de meio DMEM F/12, através da
utilização de meio de cultura livre de FBS. Para as células SCC-25, os resultados demonstraram
que essa linhagem apresentou um maior grau de invasão, quando em cultura com os exossomos
do tipo M2 nas concentrações 0,1 µg/ml e 1,0 µg/ml, quando comparadas às células cultivadas
na ausência de exossomos. Para a concentração de 10 µg/ml, constatou-se que os exossomos
do subtipo M1 apresentaram capacidade de influenciar na invasão de forma positiva, quando
comparado com os grupos M2 e THP1 com a mesma concentração.
Para as células HSC-3, observou-se que, quantitativamente, um maior número de células
foi capaz de invadir o miogel. No entanto, ainda foi possível observar que em meio de cultura
com ausência de FBS, as células cultivadas com ausência dos exossomos ainda apresentaram
um potencial de invasão aumentado quando comparadas aos grupos-teste.
Com o objetivo de verificar de forma mais precisa a diferença da capacidade de invasão
das células de CE de língua, utilizou-se a linhagem celular SAS para os testes em ausência de
FBS e em presença de DMEM/F12. Esta linhagem celular apresentou uma grande variação em
sua capacidade invasiva de acordo com as diferentes concentrações, em meio de cultura
apresentando ausência de FBS. Com os exossomos derivados das células THP1 apresentando
maior participação no processo de invasão, nas três diferentes concentrações estudadas, as
células cultivadas com ausência de exossomos apresentaram, ainda, uma maior capacidade de
invasão. Ao avaliar os testes realizados em presença de DMEM F/12, os resultados não
apresentaram relações estatisticamente significativas com grandes variações entre as
concentrações.
A aquisição de um comportamento que facilita a mobilidade celular e a disseminação
tumoral constitui um degrau importante à metástase do tumor. Tem sido extensivamente
estudada a migração celular via TEM, mecanismo caracterizado pela secreção de MMPs,
reduzida adesão intercelular e aumento da invasividade (KALLURI; WEINBERG, 2009).
O gene regulador do citoesqueleto, DIAPH3, fica perdido com frequência elevada em
tumores de próstata. Esse silenciamento leva a um fenótipo ameboide das células tumorais,
85
acompanhado por um aumento na invasão, migração e metástase. A perda deste gene também
está associada ao aumento da liberação de exossomos, fato este que se relaciona com o aumento
na proliferação tumoral e supressão das células imunes infiltradas no tumor (KIM et al., 2014).
Harshyne e colaboradores (2015) analisaram a presença de exossomos derivados das
células tumorais do gliobastoma presentes no soro do sangue periférico. Os autores relataram
haver uma alta concentração na presença de monócitos exibindo positividade para CD63 no
sangue dos pacientes quando comparados com o de pacientes saudáveis. O soro destes pacientes
apresentava uma mistura complexa de exossomos e fatores solúveis. Esse complexo levaria à
polarização in vitro dos monócitos em macrófagos M2. Neste contexto, a análise de múltiplas
citocinas revelou altos níveis de fatores de diferenciação de monócitos, assim como citocinas
relacionadas às células Th2; IL-2, -4, -13. Estes resultados sugerem que altos níveis de CD63 e
IL-4 e IL-3 são potenciais indicadores para demonstrar o estado imune desregulado em
portadores de gliobastoma, bem como a resposta Th2 estaria envolvida em mecanismo
antitumoral, contribuindo para as células tumorais se evadirem da resposta imune.
Farahani et al. (2015) realizaram estudo que descreve os exossomos derivados das
células de leucemia linfocítica crônica, demonstrando que essas vesículas apresentam tamanhos
entre 50-100 nm. O estudo avaliou o fenótipo dos exossomos e observou a presença de
marcação para CD63, CD81 e TGS-101. Estes autores demonstraram que a secreção dos
exossomos tem implicações nas células do microambiente tumoral e apresentam um importante
papel no comportamento biológico da leucemia linfocítica crônica. Foi observado, ainda, que
esses exossomos foram capazes de internalizar miRNA 202-3P, capaz de alterar a capacidade
de transcrição e o comportamento das células recipientes, implicando na proliferação tumoral.
Neste contexto, Chow et al. (2014) relataram que os exossomos derivados do câncer de
mama podem ativar a via de sinalização NF-κB e promover a secreção de citocinas
inflamatórias pelos monócitos. Os exossomos derivados do tumor podem ser internalizados
pelos macrófagos no microambiente tumoral, sendo que a ausência do receptor Toll like 2 (Th2)
resulta na falha da ativação do fator de transcrição NF-κB, o que impede o efeito dos exossomos
derivados da lesão.
A segunda parte do ensaio de migração consistiu em observar se os exossomos
apresentaram capacidade de atrair as linhagens celulares de CE de língua através do meio
organotípico miogel. Para isto, os exossomos foram adicionados em suas diferentes
concentrações, na porção inferior do transwell.
86
Para as células SSC-25, observou-se uma grande variação entre a capacidade de invasão
celular e as concentrações avaliadas sem, no entanto, ser observada a relação de significância
estatística entre esses achados.
As células HSC-3 apresentaram maior capacidade de invadir pelo miogel quando os
exossomos estavam localizados no compartimento inferior do transwell, especialmente quando
as células HSC-3 foram cultivadas apresentando os exossomos do subtipo M2, na região
inferior do transwell (1,0 µg/ml). De forma semelhantemente aos resultados com a linhagem
celular, houve uma grande variação na capacidade de invasão entre as concentrações,
oportunidade em que foi possível se verificar que os exossomos, quando utilizados em menores
concentrações, podem direcionar a célula para invadir os tecidos.
Para formar metástase à distância, as células tumorais devem completar diversos passos,
incluindo invasão da membrana basal, invasão dos vasos sanguíneos, com consequente
disseminação pela circulação, extravasar para os tecidos distantes e adaptar-se ao local onde
será desenvolvida a metástase (CHAFFER; WEINBERG, 2011).
O acúmulo de evidências sugere que os exossomos são capazes de levar a metástase à
distância. No entanto, esse mecanismo, que é descrito em diversos tipos tumorais, ainda é pouco
esclarecido (ZHANG; WANG, 2015).
Pela primeira vez, Costa-Silva et al. (2015) realizaram um estudo objetivando
demonstrar que os exossomos derivados de lesões pancreáticas malignas apresentam
importante papel na iniciação de nichos metastáticos. Neste estudo, os autores delinearam os
passos para formação de metástase pelos exossomos derivados de adenocarcinoma ductal
pancreático e observaram que essas microvesículas podem induzir a via de sinalização do TGFβ, levando à remodelação da ME, promovendo um maior fluxo de macrófagos em direção ao
fígado, promovendo um microambiente favorável para metástase nesse órgão. Diante destes
fatores, os autores relatam ser a primeira vez que se observou que os exossomos derivados de
tumor podem atuar nas células tumorais para possíveis metástases utilizando, para isto, a via de
sinalização TGF-β.
No presente estudo, foram realizados testes para observar se a presença dos exossomos
não seria um indicador de citotoxicidade, ou seja, se essas microvesículas apresentariam
capacidade de inviabilizar o crescimento das células. Para isto, foi utilizado o ensaio de MTT.
A primeira linhagem celular avaliada foi HSC-3. Tanto para os testes em meio de cultura
DMEM F/12, quanto para os ensaios realizados em meio de cultura com ausência de FBS, não
se observou diferença estatisticamente significativa. No entanto, foi possível observar que
houve um discreto aumento na viabilidade celular quando se tratou da linhagem celular
87
associada a exossomos M2 (1,0 µg/ml) em meio de cultura DMEM F/12. Apesar da pouca
diferença entre grupos, pode-se sugerir que, possivelmente, a presença dos exossomos
derivados de TAM com fenótipo M2 (1,0 µg/ml) podem tornar as células mais viáveis para
proliferação, quando comparados aos resultados dos outros grupos.
Ante essa realidade, o mesmo não foi observado quando em presença de meio sem FBS.
Isto esclarecido, é importante consignar que os exossomos de TAMs com fenótipo M2 não
apresentaram função no aumento da viabilidade celular quando comparado entre os outros
grupos e entre o meio contento a linhagem celular com a ausência de exossomos.
Para a linhagem celular SCC-25, quando em meio de cultura livre de FBS, observou-se
durante o teste de viabilidade que, para todas as concentrações, houve um aumento na
proliferação das células em presença dos exossomos, quando comparado com as células
cultivadas em ausência das microvesículas. Dentre os exossomos que mais influenciou
positivamente na viabilidade celular está o M2 (50 µg/ml).
Para o teste de viabilidade celular realizado com meio de cultura DMEM F/12, percebese que os exossomos M2 (10 µg/ml, 50 µg/ml) levaram a um ligeiro aumento da proliferação
celular quando comparados com as células testadas com ausência de exossomos. Outro fator
que deve ser destacado é que, de forma semelhante, os exossomos M1 induziram a um aumento
na viabilidade celular, quando comparados com os outros grupos e com as células em ausência
das micropartículas (10 µg/ml, 50 µg/ml).
Menck et al. (2013) demonstraram que em sistemas de co-cultura em que não há o
contato direto célula-célula, as células tumorais podem induzir à superexpressão da proteína
Wnt 5a em macrófagos, aumentando a capacidade de invasão tumoral. Através da análise dos
exossomos derivados tanto de linhagem celular de câncer de mama, quanto dos exossomos
derivados de macrófagos, presentes no sangue, observou-se que as microvesículas derivadas do
tumor podem induzir a invasão através da modulação dos macrófagos. Por meio da microscopia
eletrônica, sugere-se que Wnt 5a se encontra localizada na superfície dos exossomos, tanto
tumorais, quanto das células imunes estudadas, sugerindo que esses exossomos podem
internalizar a proteina Wnt 5a presente nos tumores. Concluíram os autores que os exossomos
derivados de macrófagos apresentam papel crítico em mediar a invasão celular.
Ainda neste estudo, através da imunofluorescência, observou-se a internalização dos
exossomos nas células SCC-25, SAS, HSC-3. Embora a análise tenha sido realizada apenas de
forma descritiva, pôde-se perceber diferenças entre as diversas linhagens celulares e a sua
capacidade de internalização.
88
A tetraspanina CD63, encontrada na superfície dos exossomos, tem como uma de suas
funções guiar o tráfego intracelular dos exossomos. As microvesículas liberadas possuem
capacidade de interagir com as células vizinhas ou com células distantes, através do plasma, e
de serem internalizadas por células receptoras. Sabe-se que este mecanismo não é aleatório. A
membrana dos exossomos é composta por uma vasta variedade de proteínas pela comunicação
célula-célula, como moléculas de adesão (integrinas), moléculas apresentadoras de antígeno
(MHC classe I e II) e receptores transmembrana, o que os torna suscetíveis a internalização em
tipos celulares que apresentem receptores compatíveis em sua membrana (CAI et al., 2012;
SCHAWAB et al., 2015; YANG et al., 2015).
O estudo dos exossomos derivados dos TAMs apresenta papel relevante para possível
função terapêutica dessas microvesículas. Sabendo de sua maior habilidade de ligar-se a certos
tipos de células tumorais, é razoável admitir seu uso em diversos tipos celulares, com a função
de internalizar substâncias e proteínas que possam ser entregues para as células transformadas,
possibilitando o tratamento de tumores.
Atualmente, uma das técnicas utilizadas com intuito de tratamento através dos
exossomos é a introdução da curcumina no interior dos exossomos. Através da internalização
desta substância, tem sido observada uma melhora na permeabilidade da membrana das células,
facilitanto a entrada de quimioterápicos no seu interior (KALANI et al., 2014).
A imunoterapia refere-se ao tratamento de tumores através da ativação ou
imunossupressão da resposta imune. Este método estimula o sistema imune a reconhecer e
erradicar as células tumorais, uma vez que no microambiente tumoral o sistema imune é
suprimido pela presença de citocinas inibitórias e células imunossupressoras. A importância da
imunoterapia é devida à sua capacidade de matar as células tumorais com mínimos danos às
células saudáveis (CHATENOUD, 2006; PAULIS et al., 2013).
Sabe-se que os exossomos apresentam capacidade de expressar moléculas de adesão
que facilitam sua internalização pelas células. Dependendo da origem dos exossomos, eles
podem expressar diferentes marcadores de superfície, como MHC classe I e II, CD68, CD3 nos
exossomos derivados das células T e EpCAM em exossomos derivados de células de câncer de
ovário (PENG et al., 2013).
Os exossomos apresentam vantagens na imunoterapia por ser bem tolerada pelo corpo,
haja vista que possuem origem endógena e apresentam uma excelente biodistribuição e
biocompatibilidade e, ainda, apresentam habilidade em suprimir os efeitos da IL-10 e TGF-β,
que apresentam potencial em suprimir a resposta imune (QUAH; O´NEIL, 2005; TRAN et al.,
2015).
89
Conclui-se, que o estudo dos exossomos derivados dos macrófagos associados a
tumores é de grande relevância para possíveis investigações a respeito do tratamento do CE de
língua, diante da escassez de estudos nessa área. A necessidade de conhecer o comportamento
das diferentes linhagens celulares existentes no CE de língua disponíveis tornou este estudo de
grande relevância, por contribuir com futuras imunoterapias, com a utilização de exossomos
nestas lesões.
Conclusões
91
8 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que:
1. Os TAMs são capazes de secretar exossomos quando diferenciados em monócitos a
partir de células THP1 e quando polarizados em macrófagos M1 e M2. Este achado foi
confirmado pela presença de exossomos positivos para o marcador de superfície CD63;
2. Os exossomos derivados de TAMs M1 e das células THP1 apresentaram escassa
marcação para TGF-β. Não obstante os exossomos derivados dos macrófagos M2
apresentarem positividade para TGF-β. No que concerne ao exossomos derivados das
linhagens celulares SCC-25, SAS e HSC-3, não foi possível observar a presença de
marcação para esta proteína, sugerindo que os exossomos das células de CE de língua
não apresentam TGF-β em seu interior;
3. As células SCC-25 cultivadas juntamente com os exossomos, no ensaio de invasão
utilizando o meio de cultura DMEM F/12, apresentaram maior tendência de invasão
através do miogel para a concentração 10 µg/ml dos exossomos derivados de M2. A
linhagem celular HSC-3 apresentou menor capacidade invasiva em meio DMEM F/12.
No meio de cultura com ausência de FBS, percebeu-se que houve uma maior capacidade
invasiva pelas células HSC-3, de forma quantitativa, apesar da ausência de relação
estatisticamente significativa. A linhagem de células SAS não apresentou maior
capacidade invasiva quando comparados os diferentes meios de cultura;
4. Quanto à capacidade de atração das linhagens celulares pelos exossomos, foi possível
inferir que a linhagem celular SCC-25 não apresentou maior capacidade de invasão
quando os exossomos estavam localizados no compartimento inferior do transwell. Ao
passo que a linhagem HSC-3 apresentou maior capacidade de invadir quando em
presença dos exossomos M2 (1,0 µg/ml) no compartimento inferior do transwell;
5. Os ensaios de proliferação e viabilidade celular utilizando a linhagem HSC-3
apresentaram discreto aumento na viabilidade celular em presença de exossomos M2
(1,0 µg/ml) em meio de cultura DMEM F/12. A linhagem celular SCC-25 apresentou
aumento na proliferação em presença de exossomos M2 (50 µg/ml) para ambos os meios
de culturas estudados;
6. O estudo da imunofluorescência possibilitou a observação de que exossomos derivados
de TAMs apresentam capacidade de internalização nas células de CE de língua.
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93
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