universidade federal de sergipe centro de ciências

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
VIVIANE CORREIA CAMPOS ALMEIDA
FREQUÊNCIA DE DOENÇAS INFECCIOSAS E AVALIAÇÃO DA RESPOSTA
IMUNE HUMORAL E CELULAR EM ADULTOS NÃO TRATADOS COM
DEFICIÊNCIA CONGÊNITA E ISOLADA DE GH
ARACAJU
2016
VIVIANE CORREIA CAMPOS ALMEIDA
FREQUÊNCIA DE DOENÇAS INFECCIOSAS E AVALIAÇÃO DA RESPOSTA
IMUNE HUMORAL E CELULAR EM ADULTOS NÃO TRATADOS COM
DEFICIÊNCIA CONGÊNITA E ISOLADA DE GH
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe
como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em
Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira
Co-orientador: Prof. Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus
ARACAJU
2016
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA BISAU
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
A447f
Almeida, Viviane Correia Campos
Frequência de doenças infecciosas e avaliação da
resposta imune humoral e celular em adultos não
tratados com deficiência congênita e isolada de GH /
Viviane Correia Campos Almeida; orientador Manuel
Hermínio de Aguiar Oliveira ; co-orientadora Amélia
Maria Ribeiro de Jesus. – Aracaju, 2016.
123 f.: il. color.
Tese (doutorado em Ciências da
Universidade Federal de Sergipe, 2016.
Saúde)
–
1. Imunidade. 2. Hormônio do Crescimento Humano.
3. Doenças Transmissíveis. 4. Testes Cutâneos. 5.
Vacinas. I. Oliveira, Manuel Hermínio de Aguiar, orient.
II. Jesus, Amélia Maria Ribeiro de, co-orient. III. Título.
CDU 612.017
VIVIANE CORREIA CAMPOS ALMEIDA
FREQUÊNCIA DE DOENÇAS INFECCIOSAS E AVALIAÇÃO DA RESPOSTA
IMUNE HUMORAL E CELULAR EM ADULTOS NÃO TRATADOS COM
DEFICIÊNCIA CONGÊNITA E ISOLADA DE GH
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe
como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em
Ciências da Saúde.
Aprovada em: _____/_____/_____
_________________________________________
Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira
_________________________________________
1º Examinador: Prof. Dra. Ângela Maria da Silva
_________________________________________
2º Examinador: Prof. Dra. Carla Raquel Oliveira Simões
_________________________________________
3º Examinador: Prof. Dr. Cesar Luiz Boguszewski
_________________________________________
4º Examinador: Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida
Dedico este trabalho a meus amores eternos Sofia e
Clarice.
AGRADECIMENTOS
Foi tão difícil chegar até aqui, que a sensação é que o tempo parou um pouco nesses quatro
anos. Ai meu Deus! Quantas vezes repeti este chamado e o Senhor que sabe tudo o que passa
em meu coração sempre me segurou, foi arrumando o caminho, mesmo eu não sabendo,
muitas vezes, compreender. Muito obrigada!!!
Minhas pequenas Sofia e Clarice, tantas vezes mamãe ausentou-se mesmo presente em casa.
Vocês são tesouros maravilhosos, fontes de inspiração com suas brincadeiras e dizeres sábios,
que enchem de alegria a vida da gente. A Silvio, pela compreensão, paciência e ajuda diária,
principalmente com as nossas filhas, enquanto eu estava desligada por muitas horas de estudo
e trabalho. Vocês são meus amores!
Aos meus pais, Pinheiro e Valda, que foram os responsáveis pela formação do meu caráter,
pelo exemplo de dedicação a família, de importância ao trabalho e de procurar sempre fazer o
melhor. Cada vitória minha é a vitória de vocês! Amo-os muito!! A meus irmãos, Elaine,
grande companheira e amiga, a Pinheirinho, Daniela e especialmente a minha cunhada
Vanessa, que esteve sempre presente ajudando-me em cada formatação do trabalho e a meus
lindos sobrinhos que trazem alegria a nossa família, Vitória e João.
Digo sempre a mim mesma, Deus é tão bom comigo, que me colocou ao lado de dois anjos,
muito parecidos na simplicidade, na alegria com que desempenham o seu trabalho e na
competência e presteza de idéias e soluções. Obrigada professores Dr. Hermínio e Dra.
Amélia.
Ao Professor Hermínio por ter me aceitado novamente como orientanda, agora no Doutorado,
obrigada pelos ensinamentos, pela compreensão e pelas palavras de incentivos nos diversos
momentos. A sua competência profissional, aliada a sua simplicidade, calma e sabedoria de
vida são inspiradores e passam uma tranquilidade e certeza de que tudo dará certo. Muito
obrigada!
À Professora Amélia, que me recebeu com todo carinho no laboratório de Biologia Molecular,
obrigada pela compreensão, pelo incentivo e pela grande ajuda diante de tantas informações
novas que recebi nesses anos. A imunologia com suas tantas siglas assusta muito no início!
Rsss
À grande companheira de pesquisa Mônica, pela ajuda diária, pelo carinho, é muito bom
trabalhar com você!
Aos professores, Dr. Roque Pacheco e Dra. Tatiana Moura pela atenção e carinho sempre
dispensados.
A Dr. Roberto Salvatori pela parceria e grande colaboração, muito obrigada!
Agradeço a todos os alunos, pós-graduandos, professores e funcionários que fazem parte do
laboratório de Biologia Molecular, e aos que passaram por ele. É muito prazeroso estar na
companhia de vocês! Em especial quero agradecer a Rodrigo, Aline, Priscila, Fabrícia,
Márcio, Ricardo, Lucas, Lays, Nalu, Luana, Michele, Murilo, Roseane, Nanci, Meirielly,
Mirella, Sueli, Juciene, as professoras Shirley, Patrícia e Cris, Cecília, Daniela, Pedro, entre
outros, não só pela ajuda constante, mas pela alegria, carinho, palavras animadas. O trabalho
por mais árduo que seja, fica muito mais fácil com um ambiente prazeroso e vocês
possibilitam isso.
Ao grupo da Endocrinologia e pós-graduandos que trabalham direta e indiretamente junto à
comunidade de Itabaianinha, sob a orientação do Professor Dr. Hermínio, em especial a Carla
Raquel, Rossana Pereira, Ívina, Raquel Diniz, Alécia Oliveira, Virgínia Gurgel, Elenilde
Barretto, Eugênia Oliveira, Francisco Pereira, Miburge Góis, Franciele Temer, Marta Regina
Alcântara, Paula Alcântara, Valéria Barreto, Menilson Menezes, Carlos Pereira, Roberto
Ramalho, Diana Matos, Adriana Prata, Ana Denise Costa, Naira Horta, Catarine Farias,
Ângela Leal, Karine e, em especial, a querida professora Dra. Karla Freire, que me orientou
em minha primeira pesquisa científica.
A Secretaria de Saúde do Município de Itabaianinha, em especial, a Ana Célia e sua equipe do
Posto de Saúde, pela grande ajuda com os experimentos.
A Daniela Félix e a Toinho, que sempre estavam lá em Itabaianinha, esperando-me, ajudando
a contactar com as pessoas. Muito obrigada! Tenho um carinho especial por vocês!
Às pessoas que fazem parte do laboratório do Hospital Universitário, muito obrigada por
tudo!
Aos queridos amigos que alegram e deixam a minha vida mais suave, em especial a minha
amiga Martha Lícia, que mesmo distante, sempre está presente!
Ao Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX) e à Fundação de Apoio à Pesquisa e à
Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe (FAPITEC) pelo apoio financeiro.
E aos personagens principais, os anões de Itabaianinha, que são grandes em disponibilidade,
simpatia e disposição!
Enfim, a todos que direta e indiretamente, ajudaram-me e torceram por mim! Fica a
lembrança de que o trabalho, por mais árduo que seja, deve sempre ser desempenhado com
alegria! Alegria de viver!!
“Antes que você possa alcançar o topo de uma
árvore e entender os brotos e as flores, você terá de
ir fundo nas raízes, porque o segredo está lá. E,
quanto mais fundo vão as raízes, mais alto vai a
árvore.”(Nietzsche)
RESUMO
Frequência de doenças infecciosas e avaliação da resposta imune celular e humoral em
adultos não tratados com deficiência congênita e isolada de GH. Viviane Correia Campos
Almeida. Aracaju-SE. 2016.
O hormônio do crescimento (GH) é importante para o desenvolvimento e função do
sistema imunológico, mas há controvérsias se a deficiência do GH (DGH) é associada a
distúrbios imunes. Um modelo de deficiência isolada do GH (DIGH), sem outros déficits ou
reposições hormonais, excluiria efeitos confundidores na análise das ações do GH na
imunidade, podendo esclarecer se a ausência do GH é associada a uma maior susceptibilidade
a infecções ou a uma alteração na resposta imunológica. Nosso objetivo foi estudar a
frequência de doenças infecciosas e a resposta imune celular e humoral em adultos com
DIGH congênita e não tratada. O estudo foi realizado em duas partes: na primeira, estudo
transversal com 35 adultos DIGH devido à mutação homozigótica (C.57 + 1G > A) no gene
do receptor do hormônio liberador do GH (GHRH) e 31 controles, que foram submetidos a
um questionário clínico para avaliar a história prévia e atual de doenças infecciosas, exame
físico e foram dosadas as sorologias para doença de Chagas, leishmaniose, HIV, tétano,
hepatites B e C. O único critério de exclusão para esta primeira etapa foi ter menos de 20 anos
de idade. Na segunda parte, foi feito um estudo de casos com grupo controle para comparação
da resposta imunológica celular e humoral entre os grupos. Os critérios de exclusão foram ter
menos do que 20 e mais do que 65 anos de idade, diagnóstico de HIV, infecções agudas,
malignidades, doenças autoimunes como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, uso
de medicações antialérgicas e glicocorticóides ou condições como gravidez. A resposta imune
foi avaliada em um subgrupo destes indivíduos através das dosagens das imunoglobulinas
séricas: IgG total, IgA, IgE e IgM, de testes cutâneos (Derivado Proteico Purificado (PPD),
estreptoquinase e candidina), e da resposta à vacinação para hepatite B e tétano (nos
indivíduos com sorologia negativa) e ao bacilo Calmette-Guérin (BCG), nos indivíduos que
tivessem PPD negativo. Não houve diferença entre os grupos na história de doenças
infecciosas e dados sorológicos basais. Indivíduos com DIGH apresentaram menores níveis
de IgG total, mas dentro da variação normal e menor diâmetro da induração no teste cutâneo
com estreptoquinase, embora sem diferença na positividade a este teste (DIGH 2 em 21;
controles 5 em 20). Também não houve diferença na positividade ao PPD (DIGH 4 em 24;
controles 10 em 28) e à candidina (DIGH 3 em 21; controles 1 em 19) nem na resposta às
vacinações entre os grupos. Os controles tiveram uma maior frequência de um teste cutâneo
positivo. Em conclusão, adultos com DIGH não tratada não apresentaram uma maior
frequência de infecções ou alterações significantes nos testes imunológicos, mas apresentaram
menores níveis de IgG total e menor positividade a pelo menos um teste cutâneo, embora sem
impacto clínico.
Descritores: imunidade; deficiência isolada do hormônio de crescimento; vacinas; testes
cutâneos; doenças infecciosas.
ABSTRACT
Frequency of infectious diseases and evaluation of cellular and humoral responses in
adult subjects with lifetime congenital growth hormone deficiency. ALMEIDA, V. C. C.
Sergipe: UFS, 2016.
GH is important for the development and function of the immune system, but there is
controversy on whether GH deficiency (GHD) is associated to immune disorders. A model of
isolated GHD (IGHD), without others deficits or hormones replacement, may exclude if the
lack of GH is associated with increased susceptibility to infections or with an altered
responsiveness of the immune response. Our objective was to study the frequency of
infectious diseases and the cellular and humoral immune response in adults with congenital,
untreated IGHD. The study was performed in two steps: in the first, a cross-sectional study,
35 adults IGHD due to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene and 31 controls
were submitted to a clinical questionnaire to evaluate past and current history of infectious
diseases, physical examination, and serology for tripanosomiasis, leishmaniasis, HIV, tetanus,
hepatitis B and C. The only exclusion criterion for this first step was age less than 20 years
old. In the second step, a study of cases with a control group for comparison of immune
cellular and humoral response between the groups. The exclusion criteria were age less than
20 and more than 65 years old; diagnosis of HIV, infection or acute diseases; history of
malignancies; autoimmune diseases; glucocorticoid and anti-allergic medications use; or
current pregnancy. The immune response was evaluated in a subset of these subjects by serum
total IgG, IgM, IgE and IgA measurement, skin tests (Protein Purified Derived (PPD),
streptokinase and candidin), and response to vaccination for hepatitis B and tetanus (in
individuals with negative serology), and to bacillus Calmette-Guérin (BCG) in subjects nonreactive to PPD. There was no difference between the groups in history of infectious diseases
and baseline serologic data. IGHD subjects had lower total IgG, but within normal range, and
a smaller induration diameter in streptokinase skin test, but no difference in the frequency of
positivity to streptokinase (IGHD 2 in 21; controls 5 in 20). There was no difference in the
positivity to PPD (IGHD 4 in 24; controls 10 in 28) and to candidin (IGHD 3 in 21; controls 1
in 19), or in the response to any of the vaccinations between the groups. The controls had a
higher frequency of one positive skin test. In conclusion, adult untreated IGHD did not
present an increased frequency of infections or significant alterations in the immunological
tests, but we found lower total IgG levels and lower positivity to at least one skin test, without
detectable clinical impact.
Key Words: immunity; isolated GH deficiency; vaccines; skin tests; infectious diseases.
LISTA DE ABREVIATURAS
ALS = subunidade do ácido lábil
APCs = células apresentadoras de antígenos
CCR4 = receptor de quimiocinas com o domínio C-C tipo 4
CCR5 = receptor de quimiocinas com o domínio C-C tipo 5
CCR6 = receptor de quimiocinas com o domínio C-C tipo 6
CCR8 = receptor de quimiocinas com o domínio C-C tipo 8
CD = cluster de diferenciação
CD4 = cluster de diferenciação (grupo de diferenciação) 4
CD8 = cluster de diferenciação (grupo de diferenciação) 8
CXCL8 = quimiocinas ligante 8
CXCR3 = receptor de quimiocinas tipo 3
CXCR3A = receptor de quimiocinas tipo 3 A
DGH = deficiência do hormônio do crescimento
DIGH = deficiência isolada do hormônio do crescimento
DTP = difteria-tétano-pertussis
Fab = fragmento de ligação do antígeno
GATA-3 = proteína 3 ligada ao fator de transcrição GATA
GH = hormônio do crescimento
GHR = receptor do hormônio do crescimento
GHRH = hormônio liberador do hormônio do crescimento
GHRHR = receptor do hormônio liberador do hormônio do crescimento
GM-CSF = fator estimulador de colônias granulócitos-macrófagos
IFN-γ = interferon-gama
IgA = imunoglobulina A
IgD = imunoglobulina D
IgE= imunoglobulina E
IGFBP = proteína ligadora do fator de crescimento insulina-símile
IGF-I = fator de crescimento insulina-símile tipo I
IGF-II = fator de crescimento insulina-símile tipo II
IgG = imunoglobulina G
IgM = imunoglobulina M
IL = interleucina
ILC1 = células linfóides inatas tipo 1
ILC2 = células linfóides inatas tipo 2
iNOS = óxido nítrico sintase induzida
JAK-2 = Janus kinase 2
MEF = fator de transcrição da família ETS (E26 transformador
específico)
MHC = complexo principal de histocompatibilidade
NK = natural killer
RMN = Ressonância Magnética Nuclear
RNAm = ácido ribonucleico mensageiro
SI = Sistema imunológico
SL = Síndrome de Laron
SOCS = supressores de sinalização de citocina
STAT = transdutor de sinal e ativador da transcrição
STAT1 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 1
STAT3 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 3
STAT4 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 4
STAT5B = transdutor de sinal e ativador do gene transcripcional 5B
Tc1 = T citotóxicas tipo 1
Tc2 = T citotóxicas tipo 2
Tc17 = T citotóxicas tipo 17
Tfh = T auxiliares foliculares
TGF-β = fator de crescimento transformante beta
Th1 = T auxiliadores (helper) 1
Th2 = T auxiliadores (helper) 2
Th17 = T auxiliadores (helper) 17
TNF = fator de necrose tumoral
Treg = T reguladora
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 14
2.1
Sistema imunológico................................................................................................... 14
2.1.1 Vacinas ....................................................................................................................... 22
2.1.2 Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia ................................................................ 23
2.2
Sistema GH/IGFs ........................................................................................................ 24
2.3
DGH ........................................................................................................................... 27
2.4
DIGH em Itabaianinha ................................................................................................ 32
2.5
Sistemas endócrino e imunológico .............................................................................. 33
3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 40
4 METODOLOGIA ........................................................................................................... 41
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................................. 49
6 RESULTADOS ............................................................................................................... 51
7 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 65
8 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 71
9 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................... 72
10 PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 73
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 74
ANEXO ............................................................................................................................... 92
12
1
INTRODUÇÃO
O hormônio de crescimento (GH) e seu principal mediador o fator de crescimento
insulina-símile tipo I (IGF-I) têm efeitos sinérgicos no crescimento somático e efeitos
complexos em várias funções do corpo, inclusive na resposta imune, que é essencial para a
sobrevivência, defendendo o homem contra patógenos perigosos e células atípicas (1).
Há uma complexa interação entre a resposta imune inata e a adaptativa e entre as
respostas humoral e a mediada por células, relacionadas respectivamente a função das células
B e T. A resposta imune inata atua rapidamente contra patógenos ou agentes agressores ao
organismo, e através das células apresentadoras de antígenos (APCs) ativam e induzem a
proliferação e migração das células B e T para o sítio da inflamação. As células B produzem
anticorpos que têm como alvos principais patógenos extracelulares e vírus. A população de
células T incluem células T citotóxicas CD8+ que lisam células infectadas por agentes
intracelulares e células tumorais, e as células T auxiliadoras CD4+ que secretam uma ampla
variedade de citocinas e regulam positiva ou negativamente outros componentes da resposta
imune (2). O conhecimento da interação entre a glândula pituitária e o sistema imune datam
de quase 90 anos atrás, quando foi visto que ratos hipofisectomizados tinham atrofia do timo
(3) .
GH, IGF-I, ghrelina e seus receptores foram demonstrados em várias células imunes
de roedores e humanos (4-10), sugerindo produção autócrina e parácrina destes e de outros
peptídeos como as proteínas ligadoras do IGF (IGFBP), o fator de crescimento insulinasímile tipo II (IGF-II) e o receptor do IGF-II (11, 12). É possível que pequenas concentrações
locais destes peptídeos já sejam suficientes para a manutenção das funções imunes,
superando a atividade do GH pituitário e do IGF-I circulante (5-7, 9). De fato, a função do
sistema imunológico é mais relevante para a sobrevivência do que o tamanho do corpo, que
reflete a resposta óssea ao GH pituitário e ao IGF-I circulante.
Várias evidências indiretas ligam o eixo GH/IGF-I ao sistema imunológico. A geração
de IGF-I requer a ligação do GH ao receptor do hormônio de crescimento (GHR), um
receptor de citocina tipo 1 que engatilha a fosforilação da Janus Kinase 2 (JAK-2), e a
ativação do transdutor de sinal e ativador do gene-5b transcripcional (STAT5B) (13-16). A
prolactina, o interferon-gama (IFN-γ) e várias interleucinas (IL) também se ligam a
receptores das citocinas e ativam a família STAT (16). A ligação da IL-2 a seu receptor e a
ativação do STAT5B leva a ativação dos linfócitos T e a inibição de sua apoptose
(protegendo contra infecções), e ao desenvolvimento e proliferação de células T regulatórias
13
(que controlam a resposta imune e protegem contra a autoimunidade) (14). Distúrbios
imunológicos são bem descritos em alguns defeitos do eixo GH/IGF-I, como nas mutações
em homozigose no STAT5B (13-16) e na hipogamaglobulinemia associada a deficiência
isolada de GH ligada ao X (17, 18). Curiosamente, ratos com deleções no gene do hormônio
liberador do GH (GHRH) são menos propensos a desenvolver encefalite experimental
autoimune. Este efeito é devido primariamente a deficiência de GH (DGH), sugerindo um
papel essencial do GH na regulação do sistema imunológico (19).
A DGH é frequentemente adquirida, acompanhando neurocirurgia e radioterapia,
estando associada a outros déficits hormonais (hormônios tireoidianos e sexuais, cortisol,
prolactina), o que requer terapias de reposição. Tanto os déficits de outros hormônios
pituitários como as terapias de reposição destes hormônios podem confundir a análise das
consequências da DGH na resposta imune. Assim, idealmente, um grupo homogêneo com
DGH isolada (DIGH) permite esclarecer se a DGH causa uma alteração na resposta do
sistema imunológico e aumenta a susceptibilidade a infecções. Na cidade de Itabaianinha, no
nordeste do Brasil, há um grupo de indivíduos com DIGH severa causada por mutação
homozigota nula (C.57 + 1G > A) no gene do receptor do GHRH (GHRHR) (20). Apesar de
um aparente aumento nas mortes na infância, não há diferença significante na expectativa de
vida destes sujeitos com DIGH em relação aos seus parentes com estatura normal ou com a
população geral quando eles alcançam a idade de 20 anos (21). Diante da longevidade
normal, a hipótese é que sua imunidade não seja alterada significativamente na vida adulta.
Sendo assim, a existência de um grupo populacional adulto com DIGH vitalícia e não tratada
justifica a avaliação da frequência de infecções neste grupo, e se há alguma alteração na
resposta imune humoral e celular desses indivíduos, a fim de esclarecer o impacto da DIGH
na função imunológica, sem as interferências das deficiências e reposições de outros
hormônios hipofisários.
14
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Sistema imunológico
O sistema imunológico (SI) tem papel fundamental na defesa contra agentes
infecciosos e contra fatores endógenos alterados como células cancerosas. Dois tipos de
resposta são evidentes: a resposta imune inata e a adaptativa (2). A resposta imune inata é
essencial na defesa contra infecções, pois é a primeira linha de defesa e está presente em
todos os organismos multicelulares. Esta linha de defesa é formada pelas barreiras protetoras
(pele, mucosas, epitélios respiratório, gastrointestinal e urinário), pelas secreções do corpo
como a saliva com suas funções antimicróbicas e pelas suas células efetoras: monócitos,
macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e natural killer (NK), que reconhecem os
patógenos por meio de receptores de reconhecimento padrão, que identificam padrões
moleculares ligados aos patógenos (22). Os macrófagos são as principais células atuantes na
ligação entre as respostas imune inata e adaptativa (2), e funcionam como APCs para os
linfócitos T auxiliadores (Th). Os linfócitos Th ao serem ativados, a depender de sinais
ocorridos no momento de sua ativação, podem se diferenciar para subtipos de linfócitos Th
com funções efetoras diferentes. O direcionamento da diferenciação é influenciado pelas
APCs (23).
As APCs são as células que capturam os antígenos e apresentam-nos aos linfócitos.
As células dendríticas dão início às respostas das células T; os macrófagos, à fase efetora da
resposta celular e as células dendríticas foliculares apresentam os antígenos aos linfócitos B,
mas estes linfócitos também podem reconhecer o antígeno diretamente (24).
Os macrófagos teciduais, em contato com antígenos próprios ou de patógenos,
produzem sinais co-estimulatórios e citocinas, que atuam na resposta imune adaptativa,
estimulando-a (resposta pró-inflamatória, relacionada a morte de patógenos) ou inibindo-a
(resposta anti-inflamatória, relacionada ao reparo tecidual). Assim, macrófagos que foram
estimulados por auto antígenos são anti-inflamatórios, pois produzem IL-10, citocina que
suprime a resposta imune (macrófagos chamados M2 ou alternativamente ativados), já os
macrófagos, que respondem aos antígenos dos patógenos, produzem citocinas próinflamatórias IFN-γ, fator de necrose tumoral (TNF), óxido nítrico sintase induzida (iNOS),
sendo chamados M1 ou classicamente ativados. Desta forma, inicia-se a inflamação para a
defesa do organismo, com secreção de citocinas e quimiocinas e ativação e recrutamento de
outras células imunológicas de acordo com o tipo de resposta principal (M1 ou M2),
15
orquestrando-se o caminho da diferenciação das células Th, que gera uma resposta duradoura
de memória: a resposta imune adaptativa (25, 26).
Os linfócitos são as células que possuem receptores específicos para antígenos, sendo
os principais mediadores da imunidade adquirida. Eles são diferenciados pelas proteínas que
estão na sua superfície, denominada numericamente CD (cluster de diferenciação). Os
linfócitos B expressam o CD19 e o receptor de célula B = BCR, anticorpos de superfície que
reconhecem antígenos solúveis e antígenos na superfície de patógenos, e são os mediadores
da imunidade humoral; os linfócitos T são os mediadores da imunidade celular e expressam o
CD3 e o receptor de células T = TCR, que reconhecem fragmentos peptídicos de antígenos,
que estão nas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II,
presente na superfície das APCs (24); e as células NK expressam CD56 e receptores que
reconhecem moléculas do MHC de classe I. Estas células são importantes para a imunidade
inata e defesa contra infecções virais e células tumorais. As células NK distinguem as células
infectadas e tumorais das células normais pelo reconhecimento de alterações nos níveis ou na
estrutura da molécula do MHC de classe I (27).
Quando as células do SI são ativadas, tornam-se responsáveis pela destruição do
patógeno diretamente ou através da modulação de outras células do SI: linfócitos, macrófagos
e monócitos e granulócitos (neutrófilos, eosinófilos). Os linfócitos B ativados diferenciam-se
em plasmócitos, que produzem anticorpos. Além disso, linfócitos B ativados de memória
podem produzir anticorpos nos órgãos linfóides periféricos e até na medula, sobrevivendo por
muito tempo na ausência do antígeno. As células de memória não apresentam função efetora,
a não ser que sejam estimuladas novamente pelo antígeno (24).
Os anticorpos são produzidos nos órgãos linfóides periféricos após estímulo dos
linfócitos B pelos antígenos e podem alcançar qualquer local periférico onde ocorra a
infecção. Eles podem agir tanto como receptores de membrana dos linfócitos B como podem
desempenhar funções efetoras.
As moléculas dos anticorpos são compostas por quatro cadeias polipeptídicas, duas
leves e duas pesadas. Cada molécula da imunoglobulina apresenta duas regiões idênticas: os
fragmentos de ligação do antígeno (Fab), onde se liga o antígeno e uma região central (Fc),
que é a responsável pelas funções efetoras e pela maioria de suas ações biológicas. Os
anticorpos são classificados de acordo com as cadeias pesadas que apresentam. Os principais
isotipos de anticorpos são: IgG, IgA, IgE, IgM e IgD (24).
A IgG tem como funções: opsonizar antígenos para fagocitose por macrófagos e
neutrófilos, neutralizar microorganismos e toxinas, ativar o complemento, participar na
16
citotoxidade celular dependente de anticorpos mediada por células NK, na imunidade
neonatal (transferência de anticorpos maternos), além de inibir as células B por feedback
(24).
A IgA desempenha função de imunidade a nível de mucosa, neutralizando
microorganismos e toxinas no trato gastrointestinal e respiratório e também participando da
imunidade passiva neonatal. A IgE ativa mastócitos (reações de hipersensibilidade mediada)
e participa da citotoxidade celular dependente de anticorpos mediada por eosinófilos,
importante mecanismo de proteção contra agentes multicelulares, a exemplo dos helmintos.
A IgD e a IgM têm função de receptor de antígenos em células B virgens, além disso, a IgM é
produzida nos primeiros momentos de uma infecção e participa da ativação da via clássica do
complemento, promovendo lise do patógeno (24).
Todos os linfócitos originam-se de células-tronco na medula óssea, os linfócitos B
amadurecem na medula e os linfócitos T, no timo. Após seu desenvolvimento no timo, os
linfócitos T apresentam duas classes principais: uma que expressa a proteína de superfície
celular CD8 e outra, que expressa a proteína de superfície CD4 (28). As células efetoras T
CD4 produzem citocinas, que ativam as células B e os macrófagos, exercendo função auxiliar
(T helper (Th)) e as células T CD8, chamadas células T citotóxicas, destroem as células
infectadas. As células T CD8 diferenciam-se no timo, após serem ativadas por antígenos
apresentados pela molécula do MHC classe I, mas a ativação destas células requer o auxílio
da célula T CD4, na maioria das infecções virais (23). As células T CD4 virgens podem se
diferenciar em 4 tipos de células efetoras, a partir da ativação inicial pelo antígeno: células
Th1, Th2, Th17 e células T auxiliares foliculares ou células Tfh, estas últimas localizam-se
nos folículos linfóides e fornecem sinais aos linfócitos B, auxiliando-os na produção de
anticorpos (23).
A diferenciação das células T CD4 virgens para células efetoras será determinada
pelas citocinas produzidas pelas células do sistema imune inato em resposta ao patógeno. O
primeiro sinal (sinal 1) para ativação das células T virgens advém da interação de um
complexo peptídico específico/MHC com o TCR. Em paralelo, moléculas co-estimuladoras
presentes na superfície das APCs fornecem o segundo sinal (sinal 2) que estimula a
proliferação das células T virgens. A molécula co-estimuladora presente na superfície de
células dendríticas é a B7 e seu receptor na célula T é o CD28. Essas células T ativadas têm
sua proliferação dirigida pela IL-2 e a posterior diferenciação para células efetoras (Th1, Th2,
Th17, Treg ou Tfh) vai depender do tipo de citocinas produzidas ou proteínas expressas pelas
APCs (sinal 3). A produção da IL-2 pelas células T depende da presença dos sinais co-
17
estimuladores, mas uma vez que a célula T tenha se diferenciado em uma célula T efetora,
um encontro posterior com um antígeno específico resulta em um ataque imune sem a
necessidade de co-estimulação (23).
Quando maduros, os linfócitos circulam no sangue ou na linfa e podem migrar para os
órgãos linfóides periféricos: baço, linfonodos, tecidos linfóides cutâneos e da mucosa (24). O
controle efetivo de infecções pelo SI é assegurado pela estrutura bem organizada dos órgãos
linfóides periféricos, que permitem capturar, processar e apresentar antígenos, levando a
eliminação dos patógenos e indução da imunidade adaptativa (29).
Os linfonodos são agregados nodulares de tecido linfóide e se localizam ao longo dos
canais linfáticos em todo o corpo. As APCs podem reconhecer antígenos que estejam na linfa
e que drenam para os linfonodos assim como células dendríticas podem capturar antígenos de
microorganismos do epitélio, levando-os para os linfonodos da região. Os tecidos linfóides
cutâneos e da mucosa são os locais onde acontecem as respostas imunológicas aos antígenos
reconhecidos no epitélio (24).
O baço é o principal órgão que elimina patógenos que chegam pelo sangue. Ele possui
uma população heterogênea de macrófagos que atuam para eliminar os agentes infecciosos
circulantes e induzir respostas imunes efetivas. Os macrófagos da zona marginal e os
metalocíticos marginais têm grande habilidade para internalizar patógenos (bactérias e vírus)
e localizam-se adjacentes a áreas esplênicas ricas em células T e B, favorecendo o rápido
contato com as células da imunidade adaptativa. Os macrófagos metalocíticos marginais
podem ativar células T CD8. Já os macrófagos da polpa vermelha fagocitam bactérias do
sangue, eritrócitos envelhecidos e os infectados, células apoptóticas, LDL oxidado, sendo
também importantes no metabolismo do ferro (29).
É possível se distinguir quatro maiores tipos de resposta imune efetora mediada pelas
células T: a tipo 1 (Th1), a tipo 2 (Th2), a Th17 e a tipo T reguladora (Treg) (30, 31). A
imunidade efetora mediada por células tipo 1 provê uma resposta efetiva contra
microorganismos intracelulares (bactérias intracelulares, vírus e protozoários) e compreende
células helper produtoras de IFN-γ (células CD4 Th1 e células linfóides inatas tipo 1 (ILC1)),
assim como linfócitos citotóxicos: células CD8 T1 citotóxicas (Tc1) e células NK (30). A
imunidade tipo 2 é principalmente dedicada para proteção contra helmintos e venenos
animais e é composta de células CD4 Th2, células CD8 T2 citotóxicas (Tc2) e células
linfóides inatas tipo 2 (ILC2), que produzem IL-4, IL-5 e IL-13. A imunidade Th17 é dirigida
para proteção contra bactérias extracelulares e fungos e as citocinas principais são a IL-17 e a
IL- 22, que são produzidas pelas células CD4 Th17, células CD8 T17 citotóxicas (Tc17) e
18
células linfóides inatas tipo 3 (ILC) (30). Já a imunidade Treg, através da produção de
citocinas como a IL-10 e o TGF-β, modula tanto a apresentação de antígenos, inibindo as
APCs, bem como as respostas tipo 1 e tipo 2. Não foi avaliada a sua inibição sobre a resposta
Th17. Um resumo da resposta imunológica primária mediada por células e os quatro tipos de
respostas efetoras são ilustradas na figura 1, e cada um dos quatros tipos de resposta efetora
será melhor definido nos próximos tópicos.
Figura 1: Resposta imunológica primária mediada por células.
Células dendríticas (APCs especializadas) apresentam receptores que reconhecem padrões
moleculares associados aos patógenos (PAMP). A célula T virgem reconhece o antígeno na
forma de um complexo peptídico: MHC na superfície da célula dendrítica. A ativação
específica pelo antígeno do receptor de células T (TCR) libera o sinal 1. A interação com
moléculas co-estimuladoras das APCs libera o sinal 2, e as citocinas que controlam a
diferenciação em diferentes tipos de células efetoras emitem o sinal 3. A depender de sinais
ocorridos no momento da ativação das células T e das citocinas produzidas em resposta ao
patógeno, essas células poderão se diferenciar em subtipos de linfócitos com funções efetoras
diferentes. Se houver um predomínio na produção das citocinas IL-12 e IFN-γ, essas células
vão desencadear uma resposta Th1, com diferenciação e proliferação para linfócitos do tipo
Th1, que atuam na proteção a vírus, fungos e patógenos intracelulares. Se há um predomínio
na produção de IL-4, vai haver uma diferenciação e proliferação de linfócitos que
desempenham uma resposta do tipo Th2, importante na defesa contra helmintos e bactérias
extracelulares; a produção de IL-10 é responsável pela resposta T reguladora, que regula
negativamente tanto a resposta do tipo Th1 como a Th2, sendo importante para evitar uma
resposta inflamatória excessiva, protegendo o organismo. Mais recentemente foi descrito a
resposta Th17 que está relacionada a proteção contra bactérias extracelulares (Desenhado por
Amélia Maria Ribeiro de Jesus, baseado em (23, 32)).
19
Resposta efetora Th1
As bactérias intracelulares têm a capacidade de sobreviver e replicar dentro de
fagócitos mononucleares e algumas vezes dentro de outras células hospedeiras, pois são
dotadas de mecanismos evasores potentes que as capacitam sobreviver em um ambiente
hostil. Por sua vez, os fagócitos mononucleares são células efetoras potentes capazes de
fagocitar e matar várias células estranhas. Essas proteínas bacterianas, que sobrevivem nos
fagócitos, são processadas e apresentadas, levando a ativação das células T. Células Th1,
células Tc1 e ILC1 secretam IFN-γ e TNF, ativando fagócitos mononucleares e convertendoos para potentes células efetoras.
Microorganismos intracelulares interagem com receptores de reconhecimento de
patógenos nas células dendríticas, na presença de IL-12 e IL-18 derivadas destas células e de
IFN-γ derivado de células NK e ILC1, e induzem o desenvolvimento de células Th1 e células
Tc1, a partir de células T precursoras. Citocinas derivadas das células Th1, Tc1 e ILC1
ativam fagócitos mononucleares para produzirem matriz metalopeptidase, óxido nítrico e
citocinas que permitem a morte dos microorganismos invasores (30).
A ativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição tipo 1 (STAT1) pelo IFN-γ
e da STAT4 pela IL-12 é o marco da transcrição para célula Th1. Os principais receptores de
quimiocinas das células Th1 são CXCR3A e CCR5 (33). As células Th1 são capazes de
auxiliar os linfócitos B na produção de anticorpos IgM, IgG e IgA em humanos.
Resposta efetora Th2
Os helmintos induzem liberação pelas células epiteliais da IL-25, IL-33 e
linfopoietina estromal tímica, que podem diretamente ativar eosinófilos, basófilos e células
linfóides inatas tipo 2 a produzirem IL-5, IL-13 e pequenas quantidades de IL-4. Células
dendríticas ativadas na presença da IL-4 induzem o desenvolvimento das células Th2 e
células Tc2, a partir de células T precursoras. Estas células Th2 e Tc2 produzem IL-4, IL-5 e
IL-13. As células CD4 Th2 diferem fundamentalmente das células Th1 porque elas são
incapazes de secretar IFN-γ e linfotoxina-alfa (30).
Tanto a IL-4 quanto a IL-13 são essenciais para a produção de IgE e todas as outras
classes de imunoglobulinas pelas células B. Já a IL-5 tem um papel importante na
diferenciação, ativação e sobrevida dos eosinófilos (30).
20
A interação entre a IL-4 e seu receptor resulta na ativação do STAT6, que promove a
expressão do fator de transcrição GATA-3. A GATA-3 induz transativação do promotor da
IL-4 e também diretamente regula a expressão gênica da IL-5 e IL-13 (34). Células Th2
humanas expressam receptores quimiocinas diferentes daqueles expressados pelas células
Th1, tal como CCR3, CCR4 e CCR8 (33).
As células Th2 humanas também expressam a cadeia beta 2 do receptor da IL-12, que
é a razão porque mesmo as células Th2 alérgeno-específicas podem ser revertidas para a
produção de IFN-γ na presença da IL-12 (35), então sugerindo a possibilidade da plasticidade
dos subconjuntos de células Th (30).
A imunidade tipo 2 é associada a proteção contra nematódeos intestinais, que é
dependente da via da IL-13 fornecida pelas células Th2 e ILC2. Os mecanismos protetivos da
imunidade tipo 2 são diferentes e podem incluir o realce da contratilidade da musculatura lisa
intestinal, mudanças na função da célula epitelial e aumento da secreção de muco intestinal
tão bem quanto indução de mastocitose intestinal, que favorecem a expulsão do parasita (36).
O marco patológico humano das desordens relacionadas a imunidade tipo 2 são a alergia e
asma (37).
Resposta efetora Th17
As subpopulações de células Th17 parecem ser induzidas precocemente na resposta
imune adaptativa e sua principal função parece ser a de auxiliar na proteção contra bactérias
extracelulares e fungos, por meio da estimulação da resposta de neutrófilos (23).
Estas células surgem quando as citocinas IL-6 e o TGF-β estão presentes, mas a IL-4
e a IL-12 estão ausentes. O desenvolvimento das células Th17 envolve a produção inicial da
citocina IL-21 pelas células T, que atua de forma autócrina, para ativar o STAT3, que é um
fator de transcrição necessário para o desenvolvimento destas células (23). O fator de
transcrição RORγT (receptor γT órfão relacionado) também é primordial, promovendo a
diferenciação de células T virgens em células Th17, provavelmente por regular
negativamente a IL-2 (38) e coordenar a expressão das citocinas características das células
Th17 (23). As células Th17 expressam o receptor para a citocina IL-23 no lugar do receptor
para IL-2, que é típico das células Th1, sendo que a IL-23 é necessária para a expansão e
desenvolvimento da atividade efetora das células Th17 (23).
As células Th17 são distinguidas pela capacidade de produzir citocinas da família IL17 (IL-17A, IL-17F). Estas citocinas atuam como receptores em células do epitélio ou
21
estromais e respondem produzindo quimiocinas como a IL-8, que recruta células efetoras
inativas, principalmente os neutrófilos. Estas células também produzem IL-22, que atua em
receptores expressos no intestino, na pele e nos pulmões, promovendo as defesas inatas
contra os patógenos (23).
As células Th17 humanas produzem também TNF e fator estimulador de colônias de
granulócitos-monócitos (GM-CSF), que contribuem para a ativação, sobrevida e
recrutamento de neutrófilos (39).
Uma das particularidades das células Th17 quando comparadas com as Th1 e Th2 é a
sua raridade nos sítios de inflamação. Uma razão para esta raridade no local da inflamação é
a sua alta plasticidade, que permite que estas células produzam IFN-γ e então rapidamente
desviem para o fenótipo Th1 (30).
Assim, o principal papel protetor da imunidade Th17 é contra as bactérias
extracelulares e fungos por causa da habilidade da IL-17 para promover o recrutamento de
neutrófilos e de fagócitos mononucleares nos tecidos (28) e para induzir a produção de
peptídeos antimicróbicos por células epiteliais.
Resposta efetora T reguladora
A resposta T reguladora tem o papel de modular a resposta imune e impedir que haja
uma lesão tecidual muito intensa, mesmo em resposta a patógenos, evitando situações de
hipersensibilidade, além de proteger o organismo contra a autoimunidade. As células Treg
apresentam o fator de transcrição FOXp3 (23), sem o qual não há geração dessas células e
sua deficiência está associada à doença autoimune do sistema IPEX (Imunodesregulação,
Poliendocrinopatia e Enteropatia ligada ao X), síndrome que apresenta doença inflamatória
intestinal e diversas doenças autoimunes em glândulas endócrinas (40).
Existem células Treg que são formadas no timo – T reguladora natural, sendo
produtoras de IL-10 e TGF-β, citocinas principais em controlar a autoimunidade e células
Treg identificadas na periferia (chamadas T reguladoras induzidas ou adaptativas), que
podem ou não expressar FOXp3 e produzem também IL-10, modulando a resposta imune,
através do equilíbrio entre a destruição dos patógenos por células efetoras e a modulação por
células Treg, mesmo havendo persistência de alguns patógenos (23).
A IL-10 e o TGF-β inibem a proliferação de células T. A IL-10 inibi a secreção de IL12 e afeta a diferenciação das células dendríticas, prejudicando a capacidade dessas células de
ativar as células T e de promover a diferenciação de células Th1. Além disso, a IL-10 inibe a
22
produção na célula T de IL-2, TNF-α e IL-5 e a secreção de IL-12, inibe também as APCs,
reduzindo a expressão das moléculas co-estimuladoras e do MHC. Já o TGF- β bloqueia a
produção de citocina pelas células T, a divisão celular e a capacidade dessas células
destruírem os agentes estranhos. Nem todos os efeitos da IL-10 e do TGF-β são
imunossupressores, a IL-10 pode aumentar a sobrevivência de células B, a sua maturação em
plasmócitos e a atividade das células T CD8, apesar disso, os efeitos imunossupressores são
os que prevalecem in vivo (23).
2.1.1
Vacinas
A vacinação tem o objetivo de induzir uma primeira ativação do SI que resultará em
uma memória específica, protegendo o indivíduo de infecções secundárias pelo patógeno cujo
antígeno estava presente na vacina (41).
A vacinação clássica é baseada na resposta adaptativa. Inicialmente, as células
efetoras do sistema imune inato reconhecem padrões moleculares do patógeno através dos
seus receptores de reconhecimento padrão, ativando rapidamente a produção de citocinas e
quimiocinas, a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e outros
antimicróbicos, além de apresentar os antígenos às células do sistema adaptativo: os
linfócitos B e T (42), que reconhecem especificamente o antígeno, induzindo células de
memória (após dias a semanas) para que em uma infecção futura por aquele patógeno, haja
uma resposta rápida e realçada à infecção (41).
Além da indução de células de memória protegendo o hospedeiro contra um segundo
contato com um microorganismo específico, as vacinas têm efeitos benéficos não específicos,
estabelecidos em dias, que são conferidos pela imunidade inata e que aumentam a resposta a
outras infecções não relacionadas a vacina: a imunidade treinada (43). Os efeitos da
imunidade treinada têm duração menor do que a memória imune adaptativa, mas são
importantes protegendo contra patógenos não relacionados ao agente específico da vacina
(44), reduzindo mortalidade (45), embora haja publicações que associam o aumento de
mortalidade em crianças em período próximo ao uso da vacina difteria-tétano-pertussis
(DTP) em países de alta mortalidade (46).
23
2.1.2
Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia
Testes de hipersensibilidade tardia são uma forma para avaliar in vivo a imunidade
mediada por células, que inclui o processamento do antígeno inoculado pelos macrófagos, a
ativação de linfócitos T de memória e a liberação de fatores que levam a induração. Para uma
resposta positiva, os macrófagos e a função das células T precisam estar intactos. Estas
reações ocorrem no período de 24 a 72 h, dependendo do tempo necessário para a ativação de
um número suficiente de células T e macrófagos ativados, no local de deposição do antígeno,
capazes de produzir a induração (47).
Estes testes são mais frequentemente utilizados para a triagem de anergia, onde se
avalia a competência do SI mediado por células (48), mas podem ser também úteis para testar
alérgenos responsáveis por hipersensibilidade de contato e para o diagnóstico de infecções.
Há variabilidade na resposta aos diferentes antígenos utilizados nos testes de acordo
com a exposição prévia ao antígeno, a vacinações prévias e a idade. Estudo utilizando
sistemas Multitest®, dispositivo de punção descartável onde se aplicou simultaneamente sete
antígenos de memória padronizados, mostrou que indivíduos com mais de 65 anos tinham
menor positividade aos antígenos dos testes (49). É importante que os antígenos utilizados
sejam comuns à maioria da população e que variações na exposição e situação vacinal de um
determinado antígeno sejam superadas, utilizando-se um maior número de antígenos no teste
(49).
Problemas relacionados ao teste podem ser consequentes à inapropriada aplicação e
leitura, à potência dos antígenos e à natureza do diluente. Há estudos que mostram uma
correlação positiva entre anergia ou diminuída resposta aos testes cutâneos e sepse pósoperatória (50), enquanto outros, não mostraram relação (51). A formação de uma induração
entre 1 a 4 mm correlaciona-se com uma resposta proliferativa de linfócitos presente e
achados histológicos podem ser encontrados em reações com menos de 5 mm de induração
(52, 53).
24
2.2 Sistema GH/IGFs
O GH humano é uma cadeia polipeptídica única de 191 aminoácidos com 2 pontes
dissulfídicas entre os aminoácidos 53-165 e 182-189 (54), codificado pelo gene do GH (GHN), localizado no braço longo do cromossomo 17 e sintetizado e secretado pelos
somatotrofos. Há duas isoformas principais, ambas são expressas na pituitária anterior, uma
com 22 kDa e outra com 20 kDa, que perde os aminoácidos de 32 a 46 e que corresponde a 510% do GH circulante. A prolactina e o lactogênio placentário apresentam estrutura similar
ao GH (54).
A regulação da secreção do GH é feita pelo hipotálamo e por fatores periféricos que
agem nos somatotrofos (55). Esta secreção é pulsátil e é estimulada pelo hormônio liberador
do GH (GHRH), que aumenta a transcrição do GH e promove a secreção do GH estocado
(56) e, em menor intensidade, pela ghrelina e esteróides sexuais (57), e é inibida pela
somatostatina (58), IGF-I e glicocorticoides em excesso (59, 60). Tanto o GHRH como a
somatostatina agem através de receptores acoplados a proteína G. O receptor do GHRH
(GHRHR) é localizado no braço curto do cromossomo 7 (7p14) e consiste de 13 éxons. O
fator de transcrição Pit-1 parece ser o principal responsável pelo desenvolvimento tecidual
dos somatotrofos e expressão do GH (61) e do GHRHR nos somatotrofos (62). A
representação esquemática do eixo GH/IGF-I é mostrada na figura 2.
25
Figura 2: Regulação hipotálamo-pituitária do eixo GH/IGF-I
Adaptado de Aguiar-Oliveira & Salvatori, 2012 (63).
A secreção do GH alcança seu pico dentro de uma hora do início do sono profundo e é
também influenciada por fatores nutricionais, sendo aumentada na desnutrição e no jejum
(59), na atividade física, no trauma e na sepse (62) e acompanhando refeições com alto
conteúdo proteico e aminoácidos intravenosos (64), e sendo inibida pela hiperglicemia e
leptina (65).
Na circulação, 40 a 60% do GH se liga a proteína ligadora do GH (GHBP), que é
gerada pela clivagem do domínio extracelular do receptor do GH (GHR) (66). A GHBP age
prolongando a meia-vida do GH de 11 para 80 minutos, mantendo a concentração circulante
de GH nos vasos e controlando a disponibilidade do GH para a ligação aos GHRs periféricos.
A isoforma com 22 kDa tem maior afinidade à GHBP do que a de 20 kDa (67).
O GH liga-se ao GHR, que é membro da família dos receptores de citocinas e
apresenta um domínio extracelular, uma porção transmembrânica e um domínio
citoplasmático. O receptor existe como um dímero in vivo inativo, mantidos juntos por suas
hélices transmembrana, sendo que duas moléculas associadas da proteína JAK-2 interagem
de um modo inibidor (68). A ligação do GH provoca uma mudança estrutural no receptor,
com movimento dos domínios intracelulares do receptor, reduzindo a inibição das moléculas
26
de JAK-2 e lhes permitindo a ativação, iniciando assim a resposta celular ao hormônio (68).
A ativação do GHR induz a sinalização intracelular via JAK/STAT (69). As proteínas STATs
são proteínas citoplasmáticas fosforiladas pela JAK-2 e uma vez fosforiladas, são
translocadas para o núcleo onde se ligam ao DNA, promovendo a ação biológica do GH,
entre elas o estímulo para a síntese hepática e secreção do IGF-I (69). O GH também se liga
ao receptor da prolactina (70).
Há dois fatores de crescimento insulina-símile (IGFs): o IGF-I e o IGF-II. O GH
exerce seus efeitos direta ou indiretamente mediados pela síntese do IGF-I. O IGF-I é gerado
em vários tecidos, principalmente no fígado (71). Estudo anterior em camundongo, observou
que a deleção específica do IGF-I do fígado não resultou em comprometimento do
crescimento apesar da redução em 75% nas concentrações séricas do IGF-I, concluindo que o
IGF-I autócrino/parácrino foi mais importante para o crescimento do que o endócrino (72).
Dois anos mais tarde, foi demonstrado que camundongos com deleção dupla no gene do IGFI e da subunidade do ácido lábil (ALS) e que tinham uma maior redução do IGF-I,
apresentaram redução do crescimento corpóreo significante. O uso do IGF-I por 4 semanas
restaurou a altura total da placa proximal da cartilagem de crescimento da tíbia destes
camundongos, mostrando que para um crescimento normal é necessário um limite mínimo de
IGF-I,
confirmando
a
participação
do
IGF-I
endócrino
(circulante)
e
local
(autócrino/parácrino) no crescimento longitudinal (73).
Os níveis de IGF-I variam com a idade, sendo baixos no nascimento e aumentando
lenta e progressivamente, atingindo pico na puberdade (74). Com o avançar da idade há
redução nos níveis de IGF-I coincidente com a redução na secreção de GH (75).
O IGF-I é transportado na corrente sanguínea ligado a uma das 6 proteínas ligadoras
do fator de crescimento insulina-símile (IGFBPs), principalmente a IGFBP-3. Noventa e
nove por cento do IGF-I está na forma ligada. A IGFBP-3 é a mais abundante das IGFBPs e
75% do IGF-I está ligado à mesma. A IGFBP-3 e o IGF-I ligados à ALS constituem o
complexo ternário, que é mais estável no plasma e aumenta a meia-vida do IGF-I para 16
horas (76).
O receptor do IGF-I apresenta homologia ao receptor de insulina e tanto o IGF-I
quanto o IGF-II ligam-se ao receptor do IGF tipo 1 (IGF-R1), que é constituído por duas
cadeias α e duas cadeias β, às isoformas A e B do receptor de insulina (RI-A e RI-B) e a
híbridos deles. A ligação do IGF-I ao seu receptor ativa a tirosina-quinase, fosforilando a
tirosina e levando a ativação de várias proteínas sinalizadoras, incluindo o substrato receptor
de insulina 1 e 2 (IRS1 e IRS2). A ativação deste receptor leva ao estímulo da síntese de
27
proteínas, proliferação e diferenciação celular, estímulo para angiogênese e, inibição da
apoptose (74).
Já o IGF-II tem 67% de homologia com o IGF-I. O fígado também é o principal
produtor do IGF-II no adulto, mas várias outras células sintetizam-no. O IGF-II regula o
desenvolvimento e a diferenciação fetal, mas seu papel no adulto é bem menos compreendido
(76).
A concentração do IGF-II é estável na idade adulta e declina na velhice. No adulto,
sua concentração é mais abundante que a do IGF-I, sendo a proporção molar IGF-II/IGF-I de
3:1. O IGF-II liga-se ao IGF-R1 e a RI-A, exercendo seus efeitos biológicos, além de se ligar
ao IGF-R tipo 2, que tem função importante na sua depuração. A afinidade de ligação do
IGF-II ao RI-A é maior do que a do IGF-I e ele tem principalmente efeitos mitogênicos
quando se liga a este receptor (77). A ligação do IGF-II às IGFBPs controla sua concentração
livre, que parece independer da idade (74). Na DIGH por mutação no GHRHR, o IGF-II livre
e total são diminuídos, porém com níveis superiores em relação às concentrações de IGF-I.
Este dado sugere que a influência do GH na secreção de IGF-II é pequena (78).
No sistema imune, o IGF-II promove aumento da expansão de colônias granulócitosmacrófago (79) e formação dos precursores mielóides e eritróides (80). O IGF-II promove
também proliferação e sobrevida das células beta pancreáticas em camundongos (81) e tem
efeito anabólico no osso (82). No fígado e nos tecidos, o IGF-II tem ação insulina-símile, mas
é menos potente do que a insulina e o IGF-I. Nos adipócitos humanos, é secretado em maior
concentração do que o IGF-I (83). Nas células granulosas, estimula a proliferação e síntese de
estrógeno e progesterona (84), e nas células da teca, aumenta a produção de andrógenos (85).
O excesso de IGF-II tem sido implicado no diabetes, câncer e síndrome dos ovários
policísticos (85-87).
2.3 DGH
O GH possui efeitos diretos ou indiretos mediados pela síntese hepática de IGF-I. As
ações do sistema GH/IGF-I vão muito além do crescimento corpóreo, atuando no
metabolismo de proteínas (síntese proteica), carboidratos (GH age como um antagonista da
insulina) e lípides (lipólise e oxidação lipídica) (88, 89), na composição corpórea (90),
retenção de sódio, água e fosfato, na aquisição de massa óssea (91), no sistema
cardiovascular, na proliferação celular e na redução da apoptose.
28
A DGH é rara, sendo geralmente adquirida, mas uma porcentagem significante destes
casos está associada a distúrbios genéticos. Essas alterações genéticas podem ocorrer por
redução na síntese do GH, por função alterada nas moléculas do GH (GH bioinativo) ou por
diminuição na responsividade ao GH (Insensibilidade ao GH) (62). As causas genéticas ainda
podem ocorrer devido a mutações nos fatores de transcrição da pituitária anterior e outros
fatores envolvidos no sistema nervoso central, levando ao desenvolvimento pituitário
anormal e a deficiência hormonais múltiplas.
Até 26% dos casos de DIGH apresentam anormalidades na Ressonância Magnética
Nuclear (RMN), particularmente hipoplasia pituitária anterior e hipófise posterior ectópica
(92) e um crescente número de causas genéticas têm sido identificadas. As causas genéticas
mais frequentes levando a DIGH são a tipo IA e a tipo IB. A tipo II e III são mais raras.
A DIGH tipo IA é herdada de forma autossômica recessiva e ocorre devido a deleções
em homozigose e mutações nonsense no gene GH1 levando a ausência absoluta da proteína
GH no sangue. Apesar de responder bem a terapia inicial com GH, muitos pacientes
desenvolvem anticorpos anti-GH, que levam a perda da eficácia do GH e a opção de
tratamento é o uso de IGF-I (93).
A DIGH tipo IB é autossômica recessiva e causada por mutações no GH1 ou por
mutações no GHRHR, como a encontrada em Itabaianinha. O fenótipo da DIGH tipo IB é
mais suave do que a DIGH tipo IA com a presença de baixos níveis de GH nos testes de
estímulos, mas detectáveis, e a resposta ao tratamento com GH é boa, sem desenvolver
anticorpos anti-GH.
A DIGH tipo II é mais comumente causada por mutações tipo splicing no GH1,
particularmente splicing do éxon 3 (94). A exclusão do éxon 3 leva a produção de uma
isoforma do GH de 17.5 kDa. Esta variante do GH reduz a estabilidade da isoforma 22kDa do
GH (95). Pode haver perda de outros hormônios pituitários, causadas pelo fluxo hormonal
interrompido e por inflamação e destruição pituitária. Atualmente, não há tratamento
específico para melhorar os efeitos desta isoforma defeituosa.
A DIGH tipo III tem herança recessiva ligada ao X e os homens descritos foram
deficientes em GH e imunoglobulina (hipo ou agamaglobulinemia). Os primeiros quatro
pacientes da mesma família descritos com hipogamaglobulinemia ligada ao X e DGH tinham
um quadro clínico com infecções recorrentes (pneumonias, sinusite, otite média, entre outras)
típicas de pacientes com nenhuma ou pouca células B e baixíssimos níveis de
imunoglobulinas, e tinham função normal das células T (17). No entanto, não foram
identificadas mutações no gene da proteína tirosina-quinase de Bruton (BTK), presentes na
29
agamaglobulinemia ligada ao X (96). Mais tarde, foi descrito um paciente com mutação no
BTK com agamaglobulinemia e DGH (97).
Foi
identificado
também,
em
todos
os
homens
de
uma
família
com
hipogamaglobulinemia ligada ao X e DGH, uma mutação no gene MEF (fator de transcrição
da família ETS (E26 transformador específico)) (18). A mutação no MEF pode causar uma
inibição acentuada no desenvolvimento das células B na medula óssea e nos somatotrofos
produtores de GH na pituitária (18). Isto pode ocorrer porque o GH-N é imediatamente
adjacente ao gene para o receptor do antígeno da célula B (98).
Há várias outras causas genéticas envolvendo mutações nos fatores de transcrição da
pituitária anterior, que embora raras, levam a DGH associado ao desenvolvimento pituitário
anormal e a deficiência de vários outros hormônios pituitários associada a alterações típicas
na RMN (99). Um dos fatores de transcrição específicos mais precoces, que desempenha um
papel crítico no desenvolvimento da hipófise, encéfalo e linha média é o HESX1 (gene
homeobox da bolsa de Rathke). O HESX1 e o PROP1 desempenham papéis distintos no
desenvolvimento pituitário, sendo o HESX1 um repressor da transcrição, e o PROP1, um
ativador. A atenuação da expressão do HESX1 coincide com o aumento da expressão do
PROP1 e a progressão da diferenciação celular pituitária (100). O PROP1 é requerido para a
formação de quatro linhagens celulares: as dependentes do Pit-1 (somatotrofos, lactotrofos e
tireotrofos) e os gonadotrofos (101). Mutações no HESX1 são associadas com displasia do
septo-óptico e pan-hipopituitarismo, podendo ser herdadas de forma autossômica recessiva
ou dominante. Na RMN, além da hipoplasia pituitária anterior, pode haver também hipófise
posterior ectópica e agenesia do septo pelúcido (102).
Mutações no fator de transcrição PROP-1 são a causa genética mais comum de
deficiências hormonais pituitárias múltiplas, sendo responsável por cerca de 50% dos casos
familiais (103). Mutações no PROP-1 são associadas a deficiência de GH, Prolactina, TSH,
LH/FSH e raros casos de deficiência de ACTH. A primeira causa genética de deficiência
hormonal pituitária múltipla identificada foi relacionada a mutações no Pit-1 (104). Estas
mutações levam a deficiência de GH, TSH e Prolactina. Vários outros genes estão envolvidos
no controle genético do desenvolvimento da pituitária e podem apresentar mutações levando
a DGH (99).
A baixa estatura pode também estar associada a presença de moléculas de GH
bioinativas com níveis normais ou altos de GH e baixas concentrações de IGF-I. Mutações na
molécula do GH resultam em diminuição da ligação do GH mutante ao GHR (105). Nem
sempre há boa resposta a reposição do GH nesta situação (106, 107).
30
Não só mutações na molécula de GH poderiam afetar a sua ligação aos sítios do GHR.
A presença em excesso de isoformas não 22-kDa foi identificada em crianças com baixa
estatura idiopática, pequena para idade gestacional (PIG) e na Síndrome de Turner (108)
através de ensaio inicial imunomagnético, na qual se extraiu as formas monoméricas e
diméricas do GH 22kDa do soro, quantificando-se em seguida as formas de GH não 22kDa
através de ensaio com anticorpo policlonal para o GH (109). A proporção aumentada de
isoformas não 22-kDa, inativa ou parcialmente ativa, pode modular a atividade do GH in vivo
agindo como agonistas parciais, agonistas completos ou antagonistas (110).
Em 1966, foi descrito a clássica Síndrome da insensibilidade ao GH, conhecida como
Síndrome de Laron (SL), causada por mutações no GHR levando a perda de função deste
receptor (111). A maioria é herdada de forma autossômica recessiva, mas é descrita herança
autossômica dominante em menor número de casos (112). Esses indivíduos têm baixa
estatura severa, com tamanho normal ao nascimento, fronte olímpica, hipoplasia de face,
micropênis, hipoglicemia ao nascimento, obesidade centrípeta e bioquimicamente apresentam
baixos níveis de IGF-I, IGFBP-3 e ALS, mas o GH basal é normal ou inapropriadamente
elevado e há aumento do pico de GH quando estimulado. Como o defeito no GHR pode ser
também no domínio transmembrana ou intracelular do GHR, níveis de GHBP marcadamente
baixos indicam ausência do componente extracelular do GHR, mas níveis normais, não
excluem o diagnóstico da SL. Para o diagnóstico, além dos achados clínicos e bioquímicos, o
padrão é um teste de geração de IGF-I (113), seguindo a seleção de indivíduos para o estudo
genético.
Outras alterações que levam à insensibilidade ao GH com baixa estatura são as
mutações em homozigose no STAT5B. Em 2003, foi descrito o primeiro caso com mutação
na proteína STAT5B e insensibilidade ao GH associada à deficiência imune (13). Esse
distúrbio é herdado de forma autossômica recessiva e várias mutações já foram descritas (13,
114, 115). O crescimento é comparável ao das crianças com SL, a idade óssea e puberdade
são atrasadas, refletindo também o estado de doença crônica. Os achados bioquímicos são
semelhantes à SL, mas os níveis de GHBP são normais e divergem também pelo quadro de
imunodeficiências, com infecções de repetição e doenças autoimunes como a pneumonite
intersticial linfocítica, doença pulmonar crônica grave e de início precoce. Estes indivíduos
também apresentam hiperprolactinemia. A disfunção imunológica ocorre pelo defeito na ação
da IL-2, cuja sinalização intracelular também é dependente da STAT5B, e que é envolvida na
proteção da apoptose e ativação dos linfócitos T, e no desenvolvimento dos linfócitos T
31
reguladores (14). A figura 3 representa a ativação do receptor do GH e da IL-2 via ativação
da JAK2 e fosforilação da STAT5B e consequentes ações biológicas do GH e IL2
Figura 3: Ativação do receptor do GH e da IL2 via ativação da Janus Kinase 2 (JAK2) e
fosforilação do transdutor de sinal e ativador do gene transcripcional 5B (STAT5B) e
consequentes ações biológicas do GH e IL2.
Adaptado de Scalco, Pugliese-Pires, Jorge, 2013 (15) e Brooks e col., 2014 (68).
Outras causas de doenças relacionadas ao GH/IGF-I são: a deficiência da ALS (116),
onde há baixa estatura moderada e baixas concentrações de IGF-I, IGFBP-3 e ALS e altos
níveis de GH; as mutações no gene do IGF-I, que são extremamente raras e além da
diminuição no crescimento, parte dos casos apresentam microcefalia, perda auditiva
sensorioneural e atraso no desenvolvimento, com baixos a indetectáveis níveis de IGF-I, GH
alto e, IGFBP-3 e ALS normais; e as alterações no receptor do IGF-I, cujo fenótipo é um
pouco mais suave ou semelhante ao fenótipo dos indivíduos com mutações no gene do IGFI, mas estes pacientes têm IGF-I acima da variação para a idade (117).
As deficiências adquiridas de GH são mais frequentes, principalmente nos adultos, e
podem acontecer por tumores da região hipotálamo/pituitária, por traumas externos e por
doenças inflamatórias como a histiocitose e a hipofisite. Nesses casos, geralmente a DGH
vem acompanhada de outros déficits hormonais, o que confunde a análise sobre o impacto
isolado da DGH sobre os diferentes sistemas do organismo (cardiovascular, imunológico...),
principalmente considerando que esses casos de DGH adquirido muitas vezes requerem uso
32
de esteróides sexuais, hormônios tireoidianos e glicocorticoides, e que essas reposições não
necessariamente mimetizam as produções endógenas.
2.4 DIGH em Itabaianinha
Em Sergipe, no município de Itabaianinha, foi identificada em 8 gerações de uma
mesma família, um grupo de 105 indivíduos com acentuada baixa estatura por DIGH devido
a mutação homozigótica C.57 + 1G > A. Esta mutação impede a formação do RNA
mensageiro do GHRHR, abolindo completamente sua expressão e consequentemente a
proliferação celular e secreção do GH (118). Este grupo mostra níveis muito baixos de GH e
IGF-I. O maior valor de GH com os testes da hipoglicemia e clonidina foi 1 μg/l,
caracterizando deficiência grave de GH (119).
Estes indivíduos apresentam massa muscular diminuída, aumento da porcentagem de
massa gorda, da relação cintura/quadril, dos níveis de colesterol total e LDL colesterol, de
proteína C reativa de alta afinidade e menor índice de massa ventricular esquerda, apesar de
aumento na pressão sanguínea sistólica. Embora tenham fatores de riscos cardiovasculares
associados, não foi evidenciado aterosclerose prematura pelo ecocardiograma de estresse e
pela medida da espessura da íntima média da carótida (120-123).
Oliveira e colaboradores (2010), buscando entender a dissociação entre a não
ocorrência de aterosclerose prematura apesar de fatores de risco associados, encontraram
maiores níveis de adiponectina e níveis normais de leptina e de excreção urinária de albumina
em indivíduos adultos com DIGH. Este perfil de adipocinas favorável contribuiria para a
maior sensibilidade à insulina, protegendo estes indivíduos da aterosclerose prematura
mesmo na presença de fatores de riscos cardiovasculares adversos (124, 125).
A maior sensibilidade à insulina é um marco da longevidade em indivíduos
centenários saudáveis associada a uma relação molar IGFI/IGFBP3 elevada (126). Os
indivíduos com DIGH de Itabaianinha têm níveis muito baixos do IGF-I no soro, com uma
redução na proporção IGF-I/IGFBP-3 e um nível proporcionalmente maior do IGF-II,
levando a um aumento na relação molar IGF-II/IGFBP-3, tal que a razão molar do IGF total
(IGF-I + IGF-II)/IGFBP-3 é elevada, de alguma maneira similar ao que ocorre com
indivíduos centenários saudáveis (78). Embora os anões de Itabaianinha tenham maior
sensibilidade insulínica, eles não são protegidos do diabetes devido a uma menor função das
células beta (125, 127).
33
Vale ressaltar que a DIGH não afeta a qualidade de vida deste grupo que apresentou
índice total do questionário de satisfação da vida semelhante ao dos controles da mesma
região (128). A puberdade é frequentemente atrasada (129), mas a fertilidade é normal e as
mulheres são capazes de amamentar. Nem micropênis nem hipoglicemia neonatal têm sido
encontrados, possivelmente devido a secreção residual de GH (118).
Três achados em estudos nesta população sugeriram que a deficiência severa de GH
poderia estar influenciando a função imunológica nestes indivíduos: o menor volume do
baço, mesmo quando corrigido pela superfície corporal (130), a ocorrência de mais
sangramentos e inflamação gengival (131) e o achado de maior freqüência de morte em
mulheres com DIGH com idade entre 4 e 20 anos, por provável causas infecciosas, apesar de
longevidade normal (21). Estes trabalhos levaram ao interesse em avaliar se a DIGH e o
consequente baixíssimo nível de IGF-I estão associados a uma menor capacidade de resposta
do sistema imune e maior predisposição às infecções, considerando a peculiaridade desta
população apresentar um grupo de adultos com DIGH, que não foram tratados com GH e que
não possuem outros déficits hormonais e as interferências dos tratamentos de reposição.
2.5 Sistemas endócrino e imunológico
Desde a descrição em 1930, que ratos hipofisectomizados apresentavam atrofia do
timo, vários trabalhos também começaram a mostrar as relações dos hormônios pituitários
com o sistema imune (3).
Ratos hipofisectomizados, com deficiência de todos os hormônios pituitários, tinham
diferentes compartimentos do sistema imune comprometidos e houve restauração da resposta
imune celular e humoral com a administração de GH ou prolactina (132). Camundongos com
mutação no fator de transcrição pituitário Pit-1 tiveram o número de células e a resposta
imune humoral e celular restituídas de forma variada com a reposição de um dos hormônios
deficientes (132-136). Em camundongos, o tratamento com GH foi capaz de reverter a
celularidade tímica (137).
Células secretoras de GH na pituitária mostram expressão abundante de receptores
tipo I e II da IL-1 em murinos (138). O GH, a prolactina e várias interleucinas têm receptores
que pertencem à mesma família de receptores citocina classe I e que ativam a mesma via
JAK/STATs. Mutações em homozigose na proteína STAT5B são causas de DGH em
humanos, devido à resistência ao GH, associada a deficiências imunológicas, com aumento
34
no número de infecções e doenças autoimunes (13-16, 114). Estas observações reforçam a
relação já descrita entre os hormônios e o sistema imunológico (139).
Os receptores de GH e prolactina mostram forte homologia. O GH em altas
concentrações liga-se ao receptor da prolactina e altas concentrações de prolactina também
podem deslocar o GH de sítios de ligação de alta afinidade nas células imunes (139).
Trabalho prévio verificou que as ações de GH nos neutrófilos humanos ocorriam não pela
ligação ao GHR, mas preferivelmente ao receptor da prolactina (140).
A prolactina é sintetizada e secretada por células do sistema imunológico (133). Além
disso, foi mostrado que a expressão do gene da prolactina em células linfóides era regulada
independentemente do fator de transcrição pituitário Pit-1, o que sugeria que a prolactina em
células imunes humanas poderia ser regulada por citocinas (141) e outros agonistas imunes.
A expressão de receptores de prolactina de alta afinidade em monócitos, células T e B
e células NK possibilita que esse hormônio tenha efeitos diretos no sistema imune (142, 143).
O agonista da dopamina, bromocriptina, tem ação imunossupressora e foi visto que em ratos
reduzia a produção de IFNγ e a resposta de células T a macrófagos (132). A administração de
prolactina (132) e mesmo a do GH reverteu estas alterações, sendo mais uma evidência de
que estes hormônios têm ações redundantes no sistema imunológico (144).
Camundongos com knockout na prolactina (145) e no seu receptor (146) não
apresentaram anormalidades no desenvolvimento do sistema imunológico. A semelhança no
receptor e nas propriedades imunorregulatórias do GH e prolactina e de citocinas específicas
poderiam ser responsáveis pela ausência de alterações imunes nestes camundongos, assim
como poderiam justificar a ausência de significantes imunodeficiências na DGH (139).
Em humanos, a prolactina também tem sido relacionada com doenças autoimunes
como artrite reumatóide (147) e lúpus (148), onde cerca de 20% dos pacientes apresentam
hiperprolactinemia (139).
O hormônio tireoidiano e o cortisol também têm ações bem definidas no sistema
imunológico. Camundongos com hipotiroidismo e com nanismo por mutação no fator de
transcrição Pit-1 (Snell-Bagg) apresentavam depleção de células pré-B. O tratamento com T4
restaurou os níveis destas células nos camundongos Snell-Bagg, associando um papel do eixo
pituitário-tireoidiano no desenvolvimento das células B em murinos (149).
O corticóide tem efeitos anti-inflamatórios, podendo desviar a resposta imune
adaptativa do tipo Th1 para Th2, através da inibição da produção da IL-12 pelas células
dendríticas e macrófagos, que é a citocina que induz a uma resposta predominante do tipo
Th1 (150). Doses mais elevadas de corticóide em linfócitos humanos inibiram a proliferação
35
de linfócitos T e induziram apoptose de linfócitos T CD4+ periféricos. O GH diminuiu a
apoptose dos linfócitos T CD4+ induzida pela dexametasona e os efeitos da inibição na
proliferação dos linfócitos T provocado pelo corticóide. O GH melhorou parcialmente a
inibição provocada pelo excesso de corticóide na síntese de DNA em linfócitos T periféricos
humanos (151). Esses efeitos dos glicocorticóides são importantes nos casos de
hipopituitarismo com necessidade de reposição, pois tanto o excesso leva a imunossupressão
como a falta pode levar a uma resposta inflamatória exacerbada, com excesso de citocinas
pró-inflamatórias (152), impactando na morbidade e mortalidade dos pacientes. Os efeitos
imunossupressores dos glicocorticóides são antagonizados pelas ações do GH e também da
prolactina, possibilitando a homeostasia imune durante os períodos de doença (153).
As células imunes (154, 155) possuem receptores intracelulares para o estradiol. O
estrógeno tem ações anti e pró-inflamatórias. Nas mulheres, a prevalência das ações próinflamatórias é vantajosa nas situações de infecções mas faz com que tenham maior risco de
doenças autoimunes (156). Ratos orquiectomizados tinham mais tireoidite autoimune e a
administração de testosterona reduziu o desenvolvimento de doenças autoimunes (157). Em
humanos, os níveis de estrógenos podem influenciar a resposta imune no hipopituitarismo,
aumentando os supressores de sinalização de citocina tipo 2 (SOCS-2), que atuam
negativamente na via JAK/ STAT, envolvida na sinalização do GH e da prolactina, e assim
regulando negativamente estes hormônios pró-inflamatórios (158). A IL-1 beta parece
também suprimir o hormônio liberador das gonadotrofinas (159).
O GHR (160), o RNAm de ambos GH (8) e GHRH (161), o GHRHR (162), o
receptor da somatostatina (163), a ghrelina e o receptor do secretagogo do GH (GHR-S) (8)
são expressos em células mononucleares do sangue periférico humano (4, 8). GH (164),
GHR, GHR-S e ghrelina são expressos também em neutrófilos humanos (8, 10). Um estudo
encontrou GHR em mais de 90% de linfócitos B e monócitos humano e em menor quantidade
nos linfócitos T. Neste estudo, a expressão do GHR nos linfócitos B de 9 crianças com DGH,
diagnosticadas pela baixa velocidade de crescimento e pela não resposta do GH em 2 testes
de estímulo, foi semelhante a controles normais (160). A expressão do GHR e do RNAm do
GH foram mais encontrados nos linfócitos B (8) e a forma expressa foi a GH-N (expressa
também na pituitária anterior) e com peso molecular de 22kDa, 20 kDa e outras variantes
(165). A presença destes hormônios e seus receptores nas células do sistema imunológico
mostra que eles agem nestas células e que as interações entre o sistema endócrino e imune
podem ocorrer também através de mecanismos autócrino e parácrino.
36
Receptores de IGF-I são encontrados em células mononucleares do sangue periférico
humano, mas há variações nos estudos em relação a concentração da expressão nas diferentes
células. Um estudo encontrou expressão em 97% dos monócitos e 88% em linfócitos B e só
2% em linfócitos T (166); ao contrário, Kooijman e colaboradores (167) encontraram
receptores de IGF-I em cada subpopulação de linfócitos, com relativo alto número de
receptores nos monócitos, nas células NK, nas células T helper CD4+, intermediário número
nas células T citotóxicas/supressoras CD8+ e um menor número nos linfócitos B.
Estudo in vitro, em linfonodo não tumoral humano, localizou o gene e a proteína do
IGF-I em células dendríticas foliculares e, principalmente, em macrófagos. Nas células
dendríticas foliculares, a expressão do RNAm do IGF-I foi mais forte do que a expressão da
proteína, sugerindo que à medida que o IGF-I é produzido, ele é liberado para o ambiente ao
redor, exercendo efeitos parácrinos nos linfócitos B, onde não foi encontrado IGF-I
imunorreativo. Muitos poucos linfócitos T exibiram imunoreatividade para o IGF-I neste
estudo (7).
É sugerido que o sistema IGF tenha um papel na regulação da apoptose via gene
supressor tumoral p53, que faz estímulo para a produção de IGFBP-3, que por sua vez
diminui a biodisponibilidade de IGF-I, levando ao aumento da apoptose (168). Por outro
lado, a produção autócrina de IGF-I em células como macrófagos (7, 169), que atuam na
imunidade inata e lidam com numerosos desafios contra os diversos patógenos, indica um
papel particular do IGF-I na modulação imune, inclusive como fator anti-apoptótico para
estas células (7).
Curiosamente, Hattori e colaboradores (170, 171), em estudos in vitro, encontraram
que linfócitos T e B humanos, não estimulados, sintetizaram e secretaram espontaneamente
GH, similar no peso e imunogenicidade ao GH pituitário. Concentrações fisiológicas de
GHRH e somatostatina não tinham efeito na secreção espontânea de GH desses linfócitos,
mas houve aumento da secreção de GH quando os linfócitos foram estimulados por
mitógenos e por GH exógeno adicionado aos linfócitos com fitohemaglutinina. O GH
exógeno não aumentou o número de células (171).
Estudo in vitro, comparando células mononucleares do sangue periférico de humanos
adultos normais e de indivíduos com DGH de início na idade adulta, após cirurgia por um
adenoma pituitário, demonstrou que havia secreção de IGF-I e IGFBPs nestas células. A
secreção do IGF-I foi estimulada pelo GH exógeno, mas a das IGFBPs não, e o padrão de
secreção das células dos normais foi semelhante ao das células dos adultos com DGH (9).
37
Malarkey e colaboradores (172) demonstraram in vitro que cândida e IL-12 realçaram
a expressão do RNAm do GH em células mononucleares do sangue periférico humano,
sugerindo que o GH produzido em linfócitos têm um papel na via Th1 da resposta imune
celular. Já concentrações de cortisol e norepinefrina, semelhantes às presentes em situações
de estresse, suprimiram a expressão do RNAm do GH nestas células.
Estes resultados sugeriram que a regulação da secreção do GH e das IGFBPs no
sistema imunológico pode ser diferente daquela do sistema endócrino (9, 10, 170-172) e que
há produção autócrino/parácrina do GH, do IGF-I e das IGFBPs (9, 170, 171). Há duas
diferenças importantes entre as células imunes e as células da pituitária: células imunes não
podem estocar os seus produtos em grânulos e elas se movem livremente no corpo (10). É
possível que citocinas e o próprio GH possam ter um efeito feedback positivo nas células
imunes, aumentando a secreção de GH dessas células, que são constantemente mobilizadas
para os sítios de inflamação, o que possibilita manter localmente o nível deste hormônio até
que a inflamação se resolva (10, 171).
Muitos investigadores têm mostrado ação endócrina e autócrino/parácrina do GH e/ou
IGF-I em estimular a linfopoiese e a granulopoiese (173-175). A adição de GH recombinante
humano a células da medula óssea humana incubadas com GM-CSF dobrou o número de
células precursoras que se diferenciaram em granulócitos. O IGF-I quando foi adicionado a
esta cultura também causou o mesmo efeito e o uso de anticorpo específico para o receptor do
IGF-I bloqueou o aumento nos granulócitos. Células da medula óssea podem secretar IGF-I
após estímulo com GH e este IGF-I derivado destas células foi o responsável pela
diferenciação dos granulócitos (173). GH estimulou a proliferação de linfócitos T de
humanos normais, mas não fez isso nos linfócitos de pessoas com Síndrome de Laron (175).
Estudos em animais, mostram que o GH e o IGF-I levam a aumento absoluto e
relativo do baço e do timo e têm efeitos linfoproliferativos nas células imunocompetentes
destes órgãos (176, 177). No timo, aumentou o número de células T progenitoras CD4 e CD8
(177). Esses efeitos foram bloqueados por anticorpo anti-receptor de IGF-I e anticorpo antiIGF-I, o que sugere que o GH tem efeitos diretos e indiretos via IGF-I, provavelmente por
secreção autócrino-parácrina de IGF-I (178, 179).
Os efeitos linfoproliferativos do GH em órgãos como o timo sugeriam que o GH
poderia ter alguma função como agente terapêutico em situações de imunodeficiências de
células T, como no tratamento da AIDS (180), de pacientes transplantados e no
envelhecimento (139).
38
O GH é um fator ativador de macrófagos em humanos (181). O GH e o IGF-I agem in
vitro e in vivo nos neutrófilos para aumentar a produção de radicais livres de oxigênio (181,
182). Essa capacidade do GH de ativar macrófagos para produzir radicais livres de oxigênio
capazes de matar bactérias intracelulares, levou a proteção de ratos normais e
hipofisectomizados contra a mortalidade induzida pela bactéria Salmonella typhimurium
(183, 184). Este efeito do GH em ativar macrófagos só poderia ser engatilhado se houvesse
um estímulo para a produção de radicais livres como a presença de uma proteína relacionada
à bactéria.
Há evidências de que o IGF-I é também um importante fator patogênico. Em
camundongos, o IGF-I favoreceu a infecção e aumentou as lesões na leishmaniose cutânea
(185, 186). As formas promastigotas da leishmania têm um receptor antigenicamente similar
a cadeia alfa do receptor do IGF-I do homem e com habilidade para se ligar especificamente
ao mesmo (187). Na leishmaniose, o IGF-I induz o crescimento das formas parasitárias in
vitro por promover a sobrevida e proliferação nos macrófagos do hospedeiro (185, 186)
através da ativação da arginase diretamente no parasita e nos macrófagos infectados,
suprindo–o com poliaminas, que é um nutriente essencial ao parasita, e reduzindo os níveis
de óxido nítrico, que tem efeito leishmanicida (188, 189).
Os experimentos com camundongos lit/lit (com mutação no GHRHR) e com deleção
do IGF-I mostraram que a linfopoiese primária dessas estirpes é normal (149). Além disso, as
respostas imune celular, humoral e inata nos camundongos lit/lit foram similares às respostas
da ninhada controle normal (190). Assim, Dorshkind e Horseman (153) defendem que GH e
IGF-I não são essenciais para o desenvolvimento ou função do sistema imunológico, já que
ratos deficientes em GH e IGF-I e crianças com deficiência de GH têm imunidade normal.
Para eles, o GH e o IGF-I são promotores do crescimento geral, com ações em vários órgãos,
sendo hormônios anabólicos e moduladores do estresse em muitas células, incluindo as
imunes.
Há evidências in vitro e em animais das ações dos hormônios pituitários no sistema
imunológico, mas há poucos e divergentes dados sobre essa interação nos seres humanos.
Estudos em crianças DGH não acharam diferenças no número de linfócitos B, de linfócitos T
helper e supressores/citotóxicos em relação a controles, na condição basal (191-194), mas o
número e a atividade das células NK foi diminuída (191, 192) ou semelhante (193) nas
crianças DGH comparadas aos controles. Adultos com DGH severo por pan-hipopituitarismo
apresentaram menor concentração, proporção e menor atividade de células NK, aumento no
número total e proporcional de células T helper CD4+ e similar concentração de células
39
CD8+, quando comparados aos controles normais, sendo levantado a possibilidade da menor
atividade das células NK ser compensada pela maior concentração de células T CD4 + (195).
Mukherjee e colaboradores (196) encontraram deficiência na resposta imune humoral
em adultos com hipopituitarismo, mesmo com reposição estável de GH e dos demais
hormônios, evidentes principalmente naqueles com menores níveis de IGF-I prévios ao
tratamento com GH e menores níveis de prolactina.
A mortalidade geral é aumentada no hipopituitarismo, estando as infecções entre as
principais causas de morte, no entanto, em levantamento realizado em 2013, mais da metade
destas mortes aconteceram por inadequado tratamento do hipocortisolismo durante um
quadro infeccioso (197). Um outro estudo encontrou também uma maior frequência de
doenças respiratórias como causa de mortalidade em pacientes com hipopituitarismo, mas
não foi encontrado uma associação destas mortes com a DGH (198). A morbidade por
infecções também foi aumentada na DGH (199), mas não há dados em pacientes adultos com
DIGH e que não tenham feito reposição de GH. Além disso, houve maior morbidade por
câncer, doenças endócrinas, circulatórias, pulmonar, urogenital, traumas, parecendo haver
relação com a doença pituitária geral (199), com seus vários déficits, particularidades das
reposições e tratamentos relacionados à doença de base como irradiação. No contexto clínico
geral, crianças com DGH têm imunidade normal e não há dados demonstrando maior taxa de
infecções na DIGH.
Em suma, há uma grande rede de comunicação entre o sistema imunológico e o
endócrino. Hormônios e citocinas compartilham mesmo sítio de ativação de receptores,
hormônios são secretados por células do sistema imunológico e estas apresentam os
respectivos receptores hormonais, e receptores de citocinas são encontrados na pituitária.
Alguns hormônios como o GH e a prolactina têm ações similares entre si e antagônicas a
outros, como o glicocorticóide. Esse sinergismo de ações pode fazer com que a deficiência
isolada de um hormônio seja compensada por esta rede imune-neuroendócrina, não levando a
alterações imunes relevantes, apesar do papel comprovado do sistema GH/IGFs no sistema
imunológico (152, 153). É possível que as pequenas concentrações locais destes peptídeos
sejam predominantes para manutenção das funções imunes, superando a atividade do GH
pituitário e do IGF-I circulante.
40
3
OBJETIVOS
Geral
Avaliar a frequência de infecções prévias e a resposta imune humoral e celular em
indivíduos adultos com DIGH.
Específicos
Comparar os indivíduos DIGH e controles genotipados sem esta mutação em relação
a:
a) Frequência das doenças: tuberculose, hepatite B, hepatite C, leishmaniose,
amigdalite de repetição, hanseníase, doença de Chagas, doenças diarreicas agudas,
pneumonias e de sorologias positivas para doença de Chagas, leishmaniose,
hepatite B, hepatite C, tétano, HIV;
b) Reatividade aos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia: PPD, candidina e
estreptoquinase;
c) Concentração sérica de imunoglobulinas: IgG total, IgA, IgM e IgE;
d) Resposta à vacinação para hepatite B, tétano toxóide e BCG.
41
4
METODOLOGIA
Indivíduos com DIGH não tratados e controles pareados por idade e sexo, residentes
na cidade de Itabaianinha, foram chamados para participar do estudo através de convites
durante reuniões na associação local dos anões de Itabaianinha ou por meio de ligações
telefônicas para os indivíduos que já haviam sido genotipados em estudos prévios. Toda a
parte experimental do estudo foi desenvolvida entre o ano de 2012 até meados de 2015. O
estudo foi realizado em duas etapas: na primeira, um estudo transversal, onde participaram
todas as pessoas convidadas, sendo o critério de inclusão para o grupo DIGH ter um genótipo
homozigoto para a mutação C.57 + 1G > A no GHRHR, enquanto os controles foram
indivíduos com estatura normal e genótipo normal para a mutação C.57 + 1G > A no
GHRHR. Não houve critério de exclusão nesta fase inicial do estudo e só compareceram
indivíduos adultos, com vinte anos de idade ou mais. A segunda etapa, um estudo de casos
com grupo controle, incluiu testes cutâneos de hipersensibilidade tardia (Derivado Proteico
Purificado (PPD), estreptoquinase e candidina), avaliação da resposta imunológica através da
quantificação dos níveis de imunoglobulinas (IgG total, IgA, IgM e IgE) e avaliação da
resposta às vacinações para a hepatite B, tétano toxóide e para o bacilo Calmette-Guérin
(BCG). Para esta parte, os critérios de inclusão foram idade entre 20 anos e 65 anos, e de
exclusão: infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), doenças clinicamente
evidentes como infecções agudas, malignidades, doenças autoimunes como artrite
reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, uso de medicações antialérgicas e glicocorticóides
ou condições como gravidez, que afetem a resposta imunológica. Foi obtido consentimento
por escrito de todos os indivíduos. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética da
Universidade Federal de Sergipe (CAAE: 01741012600000058).
Trinta e cinco indivíduos com DIGH e 31 controles foram avaliados na primeira parte
do protocolo. Esta etapa (objetivo a) consistiu da aplicação de um questionário clínico
(apêndice B) com a história pregressa e atual de doenças infecciosas (tuberculose, hanseníase,
amigdalite de repetição (mais de 5 episódios em 1 ano), diarréia com febre e vômitos antes
dos 5 anos, pneumonias, calazar, hepatite B, hepatite C, estreptococcia com febre reumática),
de vacinações para hepatite B, tétano toxóide, BCG e rotavírus, além de exame físico,
dosagem de exames hormonais (IGF-I e prolactina) e de sorologias para tétano, doença de
Chagas, HIV, leishmaniose, hepatite B e hepatite C. Dois controles não responderam ao
questionário, mas foram submetidos ao exame físico e a coleta sanguínea para dosagem das
sorologias e hormônios. O sangue para dosagem das sorologias e exames hormonais foi
42
coletado na cidade de Itabaianinha, pela manhã, após jejum noturno, seguindo-se a
centrifugação e transporte sob refrigeração ao laboratório do Hospital Universitário, e
estocagem em freezer a – 30 graus. A distância entre Itabaianinha e o laboratório é de
aproximadamente 121 quilômetros. Os exames foram realizados na semana seguinte à coleta.
As seguintes metodologias foram utilizadas:
a) Prolactina por Fluoroimunoensaio (Perkin Elmer Life and Analytical Science, Wallac Oy
Turku, Finland) com sensibilidade de 1,44 ng/ml.
b) IGF-I por ensaio imunométrico marcado com enzima quimioluminescente em fase sólida,
IMMULITE 2000 (Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd, Malvern, PA, USA),
com sensibilidade de 25 ng/ml.
c) Sorologia para Doença de Chagas anticorpos IgG por quimioluminescência por
micropartículas (CMIA): Chagas Architect Systems-Abbott (ARCHITECT-ABBOTT) e
confirmado quando positivo por imunofluorescência indireta: Imuno-COM CHAGAS
WAMA Diagnóstica, sendo considerado reagente valores ≥ 1/40.
d) Sorologia para Leishmania anticorpos IgG por imunofluorescência indireta (IFA)
(Leishmania IFA Vircell® fornecido pela Medivax), sendo considerado reagente valores ≥
1/40.
e) Sorologia
para
Hepatite
C:
Anti-HCV
(vírus
da
Hepatite
C)
por
Eletroquimioluminescência (ECLIA), ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics), sendo
considerado reagente a presença de anticorpos.
f) Sorologia para hepatite B: Anti-HBc (anticorpos contra antígenos do nucleocapsídeo
(core) do vírus da hepatite B), Anti-HBcTotal, Anti-HBcIgM e HBsAg (antígeno de
superfície do vírus da hepatite B) por ECLIA, ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics),
sendo reagente a presença de anticorpos, e Anti-HBs (anticorpos para hepatite B) também
pela mesma metodologia, com limite de detecção de 2 mUI/ml, sendo não reagente
dosagens até 10 mUI/ml.
g) Anticorpos HIV 1 e 2 por quimioluminescência (Abbott Laboratórios Diagnóstico), sendo
reagente a presença de anticorpos.
h) Sorologia para tétano por Radioimunoensaio ou ELISA (RIDASCREEN® Tetanus IgG
R-Biopharm), ambas as técnicas com limite de detecção de 0,1 UI/ml. Foi considerada
imunidade títulos maiores que 1 UI/ml para o Radioimunoensaio e maiores que 0,6 UI /ml
para o ELISA.
O fluxograma 1 delineia esta parte do experimento.
43
Fluxograma 1: Primeira etapa experimental para seleção dos indivíduos para comparação da
frequência de doenças infecciosas e de sorologias positivas para doença de Chagas,
leishmaniose, hepatite B, hepatite C, tétano e HIV, entre indivíduos DIGH e controles.
SELEÇÃO
Convite em reuniões na associação
dos anões de Itabaianinha ou contato
telefônico em banco de dados de
indivíduos previamente genotipados
Amostra selecionada por conveniência, Critério de
inclusão: genótipo homozigoto para mutação C.57
+ 1G > A ou homozigoto normal. Não houve
critérios de exclusão
66 indivíduos selecionados e explicado pesquisa
para consentimento
DIGH = 35 indivíduos
Homozigotos para a
mutação C.57 + 1G > A
Controle = 31 indivíduos
Homozigotos normais para a
mutação C.57 + 1G > A,
pareados para idade e sexo
Questionário clínico sobre as condições gerais de vida,
antecedentes de vacinações para o tétano, hepatite B, BCG,
pneumonia, rotavírus (conferências dos cartões de vacinas, se
possível) e sobre a história de doenças infecciosas e
tratamentos prévios já realizados, e exame físico.
Dosagem de prolactina e IGF-I e sorologia
para HIV, doença de Chagas, leishmania,
hepatite B, hepatite C e tétano
Na segunda etapa (objetivos b), um grupo de 25 DIGH e 25 controles foi convidado
para a avaliação da resposta imune celular in vivo através de testes cutâneos de
hipersensibilidade tardia. Dos 25 indivíduos com DIGH selecionados, 22 compareceram, mas
um deles não quis participar do exame após explicação de como seriam as aplicações e data
de retorno para leitura do teste. Já nos controles, 20 indivíduos compareceram para realização
44
dos testes cutâneos. Um indivíduo controle foi excluído da análise do teste com a candidina
por problemas técnicos no momento da aplicação deste antígeno. Posteriormente, os três
indivíduos DIGH, que não compareceram inicialmente para realização dos testes cutâneos,
realizaram o teste cutâneo com o PPD, além de oito indivíduos controles genotipados, que
não participaram da primeira parte do protocolo. O tempo entre a realização do teste com o
PPD entre o primeiro e o segundo grupo foi de cerca de 30 dias. Assim, 24 DIGH e 28
controles foram submetidos ao teste cutâneo de hipersensibilidade tardia com o PPD; 21
DIGH e 20 controles, com o antígeno estreptoquinase e 21 DIGH e 19 controles, com a
candidina.
O PPD utilizado foi procedente do Statens Serum Institut na Dinamarca: Tuberculina
PPD RT 23 SSI 2 U.T./ 0,1 ml, lote número 1624B, validade até 05-2016. Já os testes
intradérmicos com estreptococos e Cândida albicans foram adquiridos com a Immunotech,
Rio de Janeiro, Brasil, sendo manipulados em 14.04.14 e tendo validade até 14.10.15:
Streptococcus sp 100.000.000 BCT/ml (referência 14018/603) e Cândida albicans 1:100
(referência 14018/604).
Os testes foram realizados na cidade de Itabaianinha pela mesma técnica (ACSN). A
aplicação foi precedida de orientações sobre o teste, possíveis efeitos colaterais, cuidados
após a aplicação como não friccionar o local e marcado horário de retorno para a leitura
(200). Foi inoculado 0,1 ml dos antígenos tuberculina purificada (PPD) RT 23, do filtrado de
cultura Streptococcus sp e Cândida albicans, por via intradérmica, com 4 cm de distância um
do outro na face flexora do antebraço esquerdo, cerca de 4 cm abaixo da curvatura do
cotovelo, em local com pouco pêlos, sem cicatrizes ou lesões e distante de veias calibrosas. O
local em volta de cada aplicação foi circulado com caneta estereográfica para melhor
identificação e orientado reforçar o círculo, caso preciso. A leitura dos testes foi feita 48 h
após inoculação dos antígenos. O teste foi considerado positivo quando o diâmetro da
induração foi maior ou igual a 5 mm. Para leitura foi utilizada uma régua milimetrada
transparente de 10 cm.
O esquema representando o número final de participantes, que realizaram os testes
cutâneos de hipersensibilidade tardia em cada grupo, está apresentado no fluxograma 2.
45
Fluxograma 2: Número de indivíduos submetidos aos testes cutâneos de hipersensibilidade
tardia em cada grupo.
PPD
24 DIGH e 28 controles
0,1 ml de tuberculina
purificada
Estreptoquinase
21 DIGH e 20 controles
0,1 ml de filtrado de
Streptococcus sp
Candidina
21 DIGH e 19 controles
0,1 ml de filtrado de
Cândida albicans
Aplicação: intradérmica, na face flexora do antebraço esquerdo cerca de 4 cm abaixo
da curvatura do cotovelo, em local com pouco pêlos, sem cicatrizes ou lesões e
distante de veias calibrosas.
Cada antígeno foi inoculado com cerca de 4 cm de distância um do outro.
Leitura 48 horas após aplicação
Positivo induração ≥ 5 mm
Ainda nesta segunda etapa (objetivo c e d), convocamos quinze indivíduos DIGH e
quinze controles, cujo critério de inclusão foi, além da idade entre 20 e 65 anos, apresentar
sorologias negativas para tétano e/ou hepatite B. Foi procedida a coleta de sangue para a
dosagem das imunoglobulinas séricas IgG total, IgA, IgM e IgE, e a vacinação para tétano
e/ou hepatite B. Treze indivíduos DIGH e quinze controles compareceram no local para
coleta de imunoglobulinas e posterior vacinação. Dois indivíduos com DIGH não quiseram
fazer a coleta sanguínea, mas foram vacinados e um controle foi excluído da análise após
diagnóstico de um carcinoma do colo uterino, não finalizando a vacinação. Dois DIGH e um
outro controle também não completaram a vacinação: dois DIGH por efeitos colaterais no
local da vacina e o controle abandonou a vacinação. Assim, a análise da dosagem sérica das
imunoglobulinas foi feita em onze indivíduos DIGH e quatorze controles e a resposta à
vacinação foi analisada em onze indivíduos com DIGH e treze controles.
As imunoglobulinas séricas IgG total, IgM e IgA foram dosadas por imunoturbimetria
intensificada por polietileno glicol (PEG) – Siemens (Advia 2400), sendo os valores de
referência 700 a 1600 mg/dl (limite de detecção 140 mg/dl); 50 a 300 mg/dl (limite de
detecção 21 mg/dl) e 40 a 350 mg/dl (limite de detecção 33 mg/dl), respectivamente. A IgE
46
foi dosada pelo método imunológico não competitivo, com valor de referência inferior a 160
UI/ml.
As vacinas foram aplicadas na sala de vacinação, no posto de Saúde da cidade de
Itabaianinha, por enfermeira responsável pelo Programa de Vacinação, Ana Célia Simões do
Nascimento (ACSN), habilitada pelo Ministério da Saúde em Atualização de Administração
de PPD e Capacitação de Sala de Vacina. A conservação das vacinas e os procedimentos para
aplicação das mesmas estavam de acordo com as orientações do Manual de Normas e
Procedimentos para a Vacinação do Ministério da Saúde (201). A positividade sorológica foi
avaliada após 30 dias da última dose da vacina para hepatite B, e 150 dias da última dose do
tétano. A vacina adsorvida da hepatite B foi aplicada em 3 doses de 1 ml via intramuscular no
músculo deltoide, com 30 e 180 dias após a dose inicial, sendo produzida pelo Instituto
Butantan em São Paulo, Brasil e cada 1,0 ml contém 25 mcg da proteína de superfície do
vírus da hepatite B (recombinante). Já a vacina adsorvida difteria e tétano adulta,
TETADIF®, foi aplicada em 3 doses intramuscular de 0,5 ml (contendo pelo menos 40 UI/ml
do toxóide tetânico) após 30 e 60 dias da dose inicial (201) e foi produzida pela BB-NCIPD
na Sofia, Bulgária e distribuída pela InterVax, Toronto, Canadá.
O esquema da seleção dos indivíduos para coleta das imunoglobulinas séricas e
vacinação para hepatite B e tétano está apresentado no fluxograma 3.
47
Fluxograma 3: Seleção dos indivíduos para coleta das imunoglobulinas séricas e vacinação
para hepatite B e tétano.
SELEÇÃO
15 indivíduos DIGH e 15 controles com sorologia negativa para hepatite B e/ou tétano
e idade ≥ 20 e ≤ 65 anos
13 DIGH e 15 controles compareceram
2 DIGH não coletaram sangue para
dosar as imunoglobulinas
1 controle excluído por malignidade;
1 DIGH Anti-HBs + e 2 controles
anticorpos + para tétano não se
vacinaram respectivamente para
hepatite B e tétano
Coleta de sangue para dosagem
de imunoglobulinas séricas
(11 DIGH e 14 controles)
Vacinação
Hepatite B
12 DIGH e 14 controles
Tétano
13 DIGH e 12 controles
2 DIGH e 1 controle não
finalizaram a vacinação
- Anticorpos foram dosados:
- 30 dias após última dose do esquema 0, 30 e 180 dias da vacina adsorvida da
hepatite B, 1 ml cada aplicação
- 120 dias após última dose do esquema 0, 30 e 60 dias da vacina adsorvida difteria
e tétano adulto (dT), 0,5 ml cada aplicação
Hepatite B
10 DIGH e 13 controles
Anti-HBs ≥ 10 mIU/ml
(positividade sorológica)
Tétano
11 DIGH e 11 controles
Níveis de IgG para tétano > 0.6
IU / ml (positividade sorológica)
48
Quinze indivíduos DIGH e dez controles, que não foram reatores (induração menor
que 5 mm) ao teste com PPD, foram convocados para vacinação com BCG, lote 4021,
validade 31.10.16, fornecida pelo Ministério da Saúde, sendo aplicada via intradérmica, 0,1
ml da solução homogeneizada após diluição com cloreto de sódio, em braço direito, na altura
da inserção inferior do músculo deltóide. A aplicação foi feita pela mesma pessoa que
realizou o teste cutâneo. Após 60 dias da vacinação, um novo teste cutâneo com PPD foi feito
nestes indivíduos, seguindo o mesmo protocolo descrito acima.
O fluxograma 4 representa a vacinação com o BCG em não reatores ao PPD e a
leitura 48 h após aplicação de um novo teste com PPD.
Fluxograma 4: Número de indivíduos vacinados com o BCG e submetidos a novo PPD.
15 DIGH e 10 controles
não reatores ao PPD
Aplicação intradérmica: 0,1 ml da vacina BCG, em braço direito, na altura da inserção
inferior do músculo deltóide, e feito novo PPD após 60 dias da vacinação
Leitura 48 horas após aplicação do PPD
Positivo induração ≥ 5 mm
49
5
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores para variáveis contínuas foram expressos como média (desvio padrão). As
variáveis com distribuição não normal (IGF-I, prolactina, diâmetro da pápula da
estreptoquinase e PPD e IgA) foram expressas como mediana (distância interquartil). A
distância interquartil foi calculada entre os quartis 25 e 75. As porcentagens foram
comparadas com o teste exato de Fisher. Os dados com distribuição normal foram
comparados usando o teste t de Student e aqueles com distribuição não gaussiana foram
comparados com o teste U de Mann-Whitney. Análise univariada de variância foi utilizada
para avaliar a dimensão do efeito e o poder observado das variáveis com diferença
significante entre os 2 grupos. A análise estatística foi realizada usando o programa estatístico
da IBM® SPSS® Versão 20. Os valores de probabilidade < 0,05 foram considerados
estatisticamente significantes. Cada objetivo foi avaliado conforme descrito abaixo:
a) Objetivo a: Comparar a frequência de doenças infecciosas e dos resultados
sorológicos entre indivíduos DIGH e controles → Teste exato de Fisher
→ IGF-I e prolactina expressos em mediana (distância interquartil) e comparados
pelo teste U de Mann-Whitney.
Objetivo b: Comparar a reatividade aos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia:
PPD, candidina e estreptoquinase, entre os indivíduos DIGH e controles.
→ diâmetro da induração expresso em média (desvio padrão) e comparados pelo teste
t de Student, exceto o da estreptoquinase e PPD, que foram expressos em mediana
(distância interquartil) e comparados pelo teste U de Mann-Whitney.
→ frequência de positivos após os testes cutâneos: comparados pelo teste exato de
Fisher.
b) Objetivo c: Comparar os níveis de imunoglobulinas, IgG total, IgA, IgM e IgE, entre
os indivíduos DIGH e controles → Variáveis expressas média (desvio padrão) e
comparadas pelo teste t de Student, exceto IgA expressa em mediana (distância
interquartil) e comparada pelo teste U de Mann-Whitney.
c) Objetivo d: Comparar a resposta à vacinação para hepatite B, tétano toxóide e BCG
entre os indivíduos DIGH e controles
50
→ níveis de anticorpos expressos em média (desvio padrão) e comparados pelo teste t
de Student, exceto Anti-HBs pré vacinação expresso em mediana (distância
interquartil) e comparado pelo teste U de Mann-Whitney.
→ frequência de positivos após vacinação: comparados pelo teste exato de Fisher.
51
6
RESULTADOS
Comparação da frequência de doenças infecciosas e de sorologias positivas para doença
de Chagas, leishmaniose, hepatite B, hepatite C, tétano, HIV, entre indivíduos DIGH e
controles (Objetivo a).
Foram avaliados 66 indivíduos residentes no município de Itabaianinha há pelo menos
20 anos, genotipados previamente em outros estudos com este grupo populacional, já
havendo registros em arquivos do banco de dados do grupo de pesquisa iniciada em 1994. A
avaliação foi feita através de questionário clínico, exame físico, dosagens hormonais (IGF-I e
prolactina) e realização de exames sorológicos para doença de Chagas, leishmaniose, hepatite
B, hepatite C, tétano e HIV. Os 66 indivíduos avaliados foram divididos em 2 grupos: DIGH
35 indivíduos (53%), com genótipo apresentando a mutação C.57 + 1G > A nos 2 alelos no
gene do receptor do GHRH e controle, 31 (47%), homozigoto normal para ambos os alelos.
Dois indivíduos controles (3%) não responderam ao questionário clínico, por abandonar o
local antes de responder ao questionário, mas foram submetidos a coleta sanguínea e ao
exame físico.
A comparação dos dados antropométricos e resultados hormonais dos dois grupos são
apresentados na tabela 1.
52
Tabela 1: Comparação dos dados antropométricos (idade, sexo, EDP (escore de desvio
padrão) para peso, peso, EDP para altura, altura, EDP para índice de massa corpórea (IMC),
IMC e superfície corpórea (SC)) e hormonais (IGF-I e prolactina) entre os indivíduos com
deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.
N
Idade (anos)
Variação
Sexo
DIGH
35
Controles
31
P
45,8 (18)
47,6 (16,9)
0,686
23 a 89
25 a 83
18 H (51,4%) 17 H (54,8%)
25 (0)
128 (125)
25 to 37,2
43,3 to 270
6,4 (4,1)
10,9 (19)
Range
2,1 to 33,9
3,42 to 33,9
Peso (kg)
38,6 (8,2)
66,2 (11,1)
Variação
23,9 a 58,2
46,3 a 88,2
EDP Peso
-5,2 (3,0)
-0,1 (1,3)
Variação
- 11,2 a – 0,01
- 4,1 a 1,8
Altura (cm)
126,3 (10,3)
161,7 (9,9)
103 a 143
145 a 179,5
-6,96 (1,6)
-1,5 (1,1)
- 10,1 a – 3,5
- 3,5 a 0,5
IMC (kg/m²)
24,7 (7)
25,3 (3,9)
Variação
15 a 47,3
18,8 a 33,2
EDP IMC
0,02 (2,2)
-0,6 (1,2)
Variação
- 5,1 a 4,1
- 2,1 a 2,6
SC (m²)
1,1 (0,1)
1,7 (0,2)
Variação
0,8 a 1,4
1,4 a 2,0
IGF-I (ng/ml)
Range
Prolactin (ng/ml)
Variação
EDP Altura
Variação
0,809
< 0,0001
0,34
< 0,0001
< 0,0001
<0,0001
<0,0001
0,63
0,206
<0,0001
N = número de indivíduos em cada grupo; H = homem; kg (quilograma); cm (centímetros);
as variáveis são apresentadas como média (desvio padrão) e comparadas pelo teste t de
Student, exceto IGF-I e prolactina, expressos em mediana (distância interquartil) e
comparados pelo teste U de Mann-Whitney; a variável sexo foi comparada pelo teste exato de
Fisher; p < 0,05
Como esperado, a altura, o peso, a superfície corpórea e os níveis de IGF-I foram
menores no grupo DIGH.
A comparação das características gerais de habitação, do estado civil, da renda mensal
e do nível educacional de cada grupo está na tabela 2.
53
Tabela 2: Comparação das condições gerais de habitação, do estado civil, da renda mensal e
do nível educacional entre os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento
(DIGH) e controles.
DIGH
Controle
35
29
18 H (51,4%)
17 H (58,6%)
0,62
45,8 (18)
47,7 (17,1)
0,67
23 a 89
25 a 83
Solteiro
24 (68,6%)
5 (17,2%)
< 0,0001
Casado
10 (28,6%)
21 (72,4%)
0,0009
Divorciado
1 (2,9%)
3 (10,3%)
0,32
Luz elétrica
35 (100%)
29 (100%)
1,0
Água encanada
31 (88,6%)
24 (82,8%)
0,72
Esgoto sanitário
25 (71,4%)
17 (58,6%)
0,30
Fossa
8 (22,9%)
11 (37,9%)
0,27
Esgoto a céu aberto
2 (5,7%)
1 (3,4%)
1,0
Casa de taipa
2 (5,7%)
0
0,50
Casa rebocada com pintura
4 (11,4%)
1 (3,4%)
0,12
Casa rebocada sem pintura
29 (82,9%)
28 (96,6%)
0,37
< 1 SM
11(31,4%)
1 (3,4%)
0,008
1 a 3 SM
23 (65,7%)
26 (89,7%)
0,04
4 a 7 SM
1 (2,9%)
2 (6,9%)
0,59
Analfabeto
6 (17,1%)
5 (17,2%)
1,0
Fundamental completo
1 (2,9%)
3 (10,3%)
0,32
Fundamental incompleto
16 (45,7%)
15 (51,7%)
0,80
Médio completo
5 (14,3%)
2 (6,9%)
0,44
Médio incompleto
1 (2,9%)
2 (6,9%)
0,59
Superior completo
3 (8,6%)
2 (6,9%)
1,0
Superior incompleto
3 (8,6%)
0
0,25
N
Sexo
Idade (anos)
Variação (anos)
P
N = número de indivíduos em cada grupo; H = homem; SM = salário mínimo; a variável
idade é expressa em média (desvio padrão) e foi comparada pelo teste t de Student; as
variáveis qualitativas são apresentadas como número de indivíduos que responderam sim à
pergunta (porcentagem); sendo comparadas pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.
54
Os dados sócio-econômicos são semelhantes entre os dois grupos, com a ressalva do
maior número de solteiros e a menor renda familiar na DIGH.
Sessenta e quatro indivíduos foram questionados sobre os antecedentes de vacinações
para tuberculose (BCG), tétano, hepatite B, rotavírus e pneumococo. A tabela 3 mostra a
comparação do número de indivíduos entre os grupos DIGH e controles, que informaram já
ter recebido essas vacinas. Quando possível, foi feita a confirmação através dos dados do
cartão de vacinação.
Tabela 3: Comparação do relato de vacinações já recebidas entre os grupos com deficiência
isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.
Vacinações prévias
DIGH (35)
Controle (29)
P
BCG Sim
19 (54,3%)
17 (58,6%)
0,80
BCG Não
5 (14,3%)
6 (20,7%)
0,53
BCG NS
11(31,4%)
6 (20,7%)
0,40
Tétano Sim
25 (71,4%)
21(72,4%)
1,0
Tétano Não
0
3 (10,3%)
0,09
Tétano NS
10 (28,6%)
5 (17,2%)
0,12
Hepatite B Sim
6 (17,1%)
4 (13,8%)
1,0
Hepatite B Não
20 (57,1%)
16 (55,2%)
1,0
Hepatite B NS
9 (25,7%)
9 (31%)
0,78
Rotavírus Não
35 (100%)
29 (100%)
1,0
Pneumo Sim
0
1 (3,4%)
0,45
Pneumo Não
27 (77,1%)
21 (72,4%)
0,77
Pneumo NS
8 (22,9%)
7 (24,1%)
1,0
N = número de indivíduos em cada grupo; H = homem; NS = não sabe informar; as variáveis
qualitativas são apresentadas como número de indivíduos que responderam à pergunta
(porcentagem); sendo comparadas pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.
Esses dois grupos foram também comparados em relação a história de patologias
prévias apresentadas. Essa comparação é mostrada na tabela 4.
55
Tabela 4: Comparação do número de indivíduos com doenças infecciosas prévias entre
os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.
DIGH (35)
0
Controles (29)
1
P
0,453
Leishmaniose visceral
0
0
1,0
Hanseníase
2
1
1,0
Amigdalite de repetição
3
1
0,619
Gastroenterite na infância
1
2
0,586
Pneumonia
2
2
1,0
Hepatite B
0
0
1,0
Hepatite C
0
0
1,0
Tuberculose
0
0
1,0
Febre reumática
0
0
1,0
Doença de Chagas
Amigdalite de repetição: mais de 4 infecções em 1 ano; as variáveis qualitativas foram
comparadas pelo teste exato de Fisher; a idade é representada como média (desvio padrão)
e foi comparada pelo teste t de Student.
Os resultados dos exames sorológicos de cada grupo estão apresentados na tabela 5.
Tabela 5: Comparação do número de indivíduos com resultados sorológicos positivos
entre os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.
DIGH
35
Controles
31
P
Positividade para Chagas
1
2
0,597
Positividade para Leishmania
2
3
0,659
Positividade para Hepatite B
0
0
1,0
Positividade para Hepatite C
0
0
1,0
Positividade para HIV
0
0
1,0
Positividade para tétano
6
7
0,758
N
N = número de indivíduos em cada grupo; as variáveis qualitativas foram comparadas
pelo teste exato de Fisher.
.
Não houve diferença na história de doenças infecciosas, nos resultados sorológicos
para doença de Chagas, leishmaniose, HIV, hepatite B, hepatite C e tétano entre os grupos.
Dois DIGH e 3 controles tiveram sorologia positiva para leishmaniose e foram avaliados para
o diagnóstico de leishmaniose visceral através de Hemograma, dosagem de transaminases
56
(alanina transaminase e aspartato aminotransferase), proteínas totais e frações, coagulograma,
rK 39 (Kalazar Detect® Teste Rápido, fornecido pela Bios Internacional Inc., Seattle, WA) e
o teste cutâneo de Montenegro (teste utilizando antígenos da Leishmania amazonensis
produzido pela FIOCRUZ, Rio de Janeiro). Nenhum dos sujeitos apresentou esplenomegalia
nem alterações aos exames, não sendo diagnosticada leishmaniose visceral em nenhum deles.
Um DIGH e 2 Controles tinham sorologia positiva para doença de Chagas e foram
submetidos a exames complementares de eletrocardiograma e radiografia de tórax. Em 1
controle foi confirmado doença de Chagas com cardiomiopatia dilatada.
Comparação da reatividade aos testes cutâneos (Objetivo b) entre os indivíduos DIGH e
controles.
Cinquenta e dois indivíduos foram submetidos a testes cutâneos de hipersensibilidade
tardia: candidina, estreptoquinase e/ou PPD.
Todos os 52 adultos foram submetidos ao teste cutâneo com PPD, sendo 24 DIGH e
28 controles. A idade dos indivíduos com DIGH foi 41,7 (12,7) anos (mínimo de 25 e
máximo de 64 anos) e nos controles, 40,1 (11,7) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,64).
Na DIGH, 11 (45,8%) eram homens e nos controles, 9 (32,1%), p = 0,39. Não houve
diferença na frequência de positividade do PPD (DIGH 4 (16,7%) e Controles 10 (35,7%), p
= 0,21) nem no diâmetro da pápula (DIGH, 1,0 (2,75) mm e Controles, 2,0 (6,0) mm, p =
0,178). O diâmetro da pápula formada após a inoculação do antígeno variou de 0 a 9 mm na
DIGH e de 0 a 20 mm, nos controles. A figura 4 mostra a comparação entre a resposta média
e individual dos 2 grupos no teste cutâneo com o PPD.
57
Figura 4: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com o PPD nos indivíduos DIGH e
controles.
N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes
positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média do diâmetro da
induração. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da
induração está expresso em mediana (distância interquartil) e foi comparado pelo teste U de
Mann-Whitney. A frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher (p = 0,21).
Nos 41 indivíduos submetidos ao teste cutâneo com estreptoquinase, 21 eram DIGH e
20 controles. A idade dos indivíduos com DIGH foi 42,9 (13) anos, variando de 25 a 64 anos,
e nos controles, 44 (11,3) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,79). Na DIGH, 8 (38,1%)
eram homens e nos controles, 7 (35%), p = 1,0. Não houve diferença na frequência de
positividade: DIGH, 2 (9,5%) e controles, 5 (25%), p = 0,24. O diâmetro da pápula foi menor
na DIGH do que nos controles, 2,0 (2,5) mm e 3,5 (1,75) mm, respectivamente, p = 0,0151.
Na DIGH, a pápula formada variou de 0 a 11 mm e nos controles, 0 a 6 mm. Um dos
indivíduos não reativo do grupo DIGH apresentou tardiamente (10 dias após o teste) a
formação de uma pápula com pequena ulceração local. A figura 5 mostra a comparação entre
a resposta média e individual dos 2 grupos no teste cutâneo com a estreptoquinase.
58
Figura 5: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com a estreptoquinase nos indivíduos
DIGH e controles.
N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes
positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média do diâmetro da
induração. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da
induração está expresso em mediana (distância interquartil) e foi comparado pelo teste U de
Mann-Whitney, p < 0,05. A frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher
(p = 0,24).
Quarenta adultos foram submetidos ao teste cutâneo com candidina, sendo 21 DIGH e
19 controles. Na DIGH, a idade dos indivíduos foi 42,9 (13) anos, variando de 25 a 64 anos, e
nos controles, 44,3 (11,5) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,73). Na DIGH, 8 (38,1%)
eram homens e nos controles, 6 (31,6%) homens, p = 0,75. Não houve diferença na
freqüência de positividade da candidina (DIGH, 3 (14,3%) e Controles, 1 (5,3%), p = 0,64)
nem no diâmetro da pápula (DIGH, 2,1 (2,0) mm e Controles, 1,9 (1,5) mm, p = 1,0). Na
DIGH, a pápula formada variou de 0 a 7 mm e nos controles, 0 a 5 mm. A figura 6 mostra a
comparação entre a resposta média e individual dos 2 grupos no teste com a candidina.
59
Figura 6: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com a candidina nos indivíduos
DIGH e controles.
N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes
positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média do diâmetro da
induração. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da
induração está expresso em média (desvio padrão) e foi comparado pelo teste t de Student. A
frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher (p = 0,64).
Dos adultos submetidos a todos os três testes cutâneos, 21 eram DIGH e dezenove,
controles. A idade na DIGH foi 42,9 (13) anos, variando de 25 a 64 anos, e nos controles,
44,3 (11,2) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,73). Na DIGH, oito (38,1%) homens e nos
controles, seis (31,6%), p = 0,75. Dezesseis (76,2%) DIGH e 8 (42,1%) controles não foram
positivos em nenhum dos três testes cutâneos, p = 0,0515. Houve um maior número de
indivíduos positivos a pelo menos um teste cutâneo no grupo controle (DIGH, 3 (14,3%) e
Controles, 9 (47,4%), p = 0,038). A tabela 6 mostra individualmente o número de testes
cutâneos positivos e aqueles que apresentaram todos os três testes negativos.
60
Tabela 6: Resultados individuais do número de testes cutâneos positivos e dos que
apresentaram todos os 3 testes negativos.
DIGH
3
testes
+
2
testes
+
1
teste
+
1
2
3
testes
X
X
Controle
3
testes
+
2
testes
+
1
1
teste
+
X
2
3
testes
X
3
X
3
4
X
4
X
5
X
5
X
6
X
6
X
7
X
7
X
8
X
8
X
9
X
9
X
10
X
10
X
11
X
11
X
12
13
X
12
X
13
14
X
X
15
16
X
16
17
X
17
18
X
18
19
X
19
20
X
21
X
9,5%
0
3
16
14,3%
72,2%
X
X
X
2
X
14
15
Total
X
X
X
X
X
0
2
9
8
10,5% 47,4% 42,1%
A tabela 7 mostra a comparação entre os grupos do número de indivíduos que tiveram
os 3 testes negativos, um positivo, dois positivos, três positivos e o total de testes positivos de
cada grupo.
61
Tabela 7: Resultados do número de indivíduos com os 3 testes negativos, um positivo, dois
positivos, três positivos e o total de testes positivos em cada grupo.
DIGH
Controle
P
N
21
19
Sexo (M)
8 (38,1%)
6 (31,6%)
0,7475
Idade (anos)
42,9 (13)
44,3 (11,5)
0,73
Variação (anos)
25 a 64
20 a 61
Negativo nos 3 testes
16 (76,2%)
8 (42,1%)
0,0515
Positivo nos 3 testes
2 (9,5%)
0
0,4885
Positivo em 2 testes
0
2 (10,5%)
0,2192
Positivo em 1 teste
3 (14,3%)
9 (47,4%)
0,0378
Total de testes positivos
9 /63 (14,3%)
13/57 (22,8%)
0,3471
N = número de indivíduos em cada grupo; M = masculino; a variável idade é expressa em
média (desvio padrão) e foi comparada pelo teste t de Student; as variáveis qualitativas são
apresentadas como número de indivíduos (porcentagem), exceto total de testes positivos que
é o número de testes positivos/número total de testes; sendo comparadas pelo teste exato de
Fisher; p < 0,05.
Dos nove testes positivos no grupo DIGH, quatro (44,4%) foram positivos ao PPD,
três (33,3%), à candidina e dois (22,2%), à estreptoquinase. Nos controles, sete (53,8%) dos
13 testes positivos foram ao PPD, cinco (38,5%), à estreptoquinase e um (7,7%), à candidina.
Comparação das concentrações séricas de imunoglobulinas entre os indivíduos DIGH e
controles (Objetivo c).
Onze indivíduos DIGH e quatorze controles tiveram amostras sanguíneas coletadas
para a dosagem de imunoglobulinas.
A tabela 8 mostra os níveis séricos de imunoglobulinas. Os indivíduos com DIGH
apresentaram níveis de IgG menores do que os controles, mas dentro da variação normal para
metodologia do exame.
62
Tabela 8: Comparação dos resultados dos níveis séricos de imunoglobulinas dos indivíduos
DIGH e Controles.
DIGH
Controles
11
14
Sexo
7 H (63,6%)
6 H (42,9%)
0,43
Idade (anos)
41,1 (12,8)
45,6 (11,5)
0,37
25 a 58
28 a 61
277,1 (53)
199,1(122,7)
163,1 a 538,7
95,3 a 517
1049,9 (197,9)
1346,3 (401,9)
695 a 1355
471 a 1971,9
IgE (UI/ml)
743 (631,5)
439.9 (680,5)
Variação
31,7 a 2001
14 a 2001
IgM (mg/dl)
160,5 (61,3)
141,9 (40,8)
Variação
64,3 a 253,8
93,4 a 223
N
Variação
IgA (mg/dl)
Variação
IgG (mg/dl)
Variação
P
0,11
0,03
0,26
0,40
N = número de indivíduos; H = homens; IgA, IgG, IgE e IgM: imunoglobulinas A, G, E e M;
as variáveis são apresentadas como média (desvio padrão) e comparadas pelo teste t de
Student, exceto os valores de IgA que são expressos como mediana (distância interquartil) e
comparados pelo teste U de Mann-Whitney; a variável sexo foi comparada pelo teste exato de
Fisher; p < 0,05.
Comparação da resposta à vacinação para hepatite B, tétano toxóide e BCG entre os
indivíduos DIGH e controles (Objetivo d).
Dez DIGH e 13 controles completaram a vacinação para hepatite B e 11 DIGH e 11
controles, a vacinação para o tétano. Quatro indivíduos controles iniciaram a vacinação para
o tétano após confirmação pela história e cartão de vacinação de longo período sem reforço
desta vacina (mais de 20 anos).
A resposta a vacinação para hepatite B e tétano foi similar nos 2 grupos e está
representada na tabela 9.
63
Tabela 9: Comparação dos resultados da vacinação para hepatite B e tétano no grupo com
deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e nos Controles.
DIGH
Controle
Hepatite B
P
10
13
Sexo
7 H (70%)
6 H (46,2%)
0,4
Idade (anos)
42,3 (12,8)
47(10,8)
0,51
Variação
25 a 58
29 a 61
Anti-HBs pré (mUI/ml)
1,9 (0)
1,9 (0,81)
Variação
1,9 a 8,4
0,66 a 1,9
316,04(354,6)
278,7(361,2)
1,9 to 1001
1,9 to 1001
313,49(355,2)
251,93(343,2)
Variação
0 a 999,1
0 a 1000
Imunes
70% (7)
76,9% (10)
N
Anti-HBs pós (mUI/ml)
Variação
Diferença (mUI/ml)
0,054
0,81
0,71
1,0
Tétano
11
11
Sexo
7 H (63,6%)
5 H (45,5%)
0,67
Idade (anos)
41,1 (12,8)
49,4 (9,7)
0,10
25 a 58
32 a 61
Anticorpos pré (UI/ml)
0,15 (0,13)
0,15 (0,11)
Variação
0,09 a 0,42
0,01 a 0,34
Anticorpos pós (UI/ml)
2,33 (2,25)
1,75 (1,47)
0,09 a 5,1
0,46 a 4,97
2,12 (2,15)
1,76 (1,78)
Variação
0 a 5,01
0,21 a 4,87
Imunes
63,6% (7)
63,6% (7)
N
Variação
Variação
Diferença (UI/ml)
1,0
0,48
0,70
1,0
N = número de indivíduos; H = homens; Anticorpos pré = nível do anticorpo antes da vacina;
Anticorpos pós = nível do anticorpo após a vacina; Diferença = diferença do nível de
anticorpo pós-vacina menos o nível de anticorpo pré-vacina; imunes = número de indivíduos
que alcançaram níveis de anticorpos protetivos; a idade, o nível de anticorpos e a diferença
são expressos como média (desvio padrão) e comparados pelo teste t de Student; exceto o
Anti-HBs pré que é expresso como mediana (distância interquartil) e comparados pelo teste
U de Mann-Whitney; a porcentagem de imunes e a variável sexo foram comparadas pelo teste
exato de Fisher; p < 0,05.
64
Quinze DIGH não reatores ao PPD, 42,1 (13,2) anos, variando de 28 a 64 anos e 10
controles, 39,9 (9,8) anos, variando de 30 a 61 anos, foram vacinados com BCG (p = 0,64).
Na DIGH, 9 (60%) eram homens e nos controles, 5 (50%), p = 0,70. Não houve diferença na
frequência de positividade do PPD após a vacinação com BCG (DIGH, 9 (60%) e Controles,
6 (60%), p = 1,0), nem no diâmetro da pápula (DIGH, 8,1 (7,1) mm e Controle, 7,9 (6,0) mm,
p = 0,93). Na DIGH, a pápula formada variou de 0 a 21 mm e nos controles, 0 a 16 mm. A
figura 7 representa a comparação dos dois grupos no gráfico de pontos dos valores da
induração, após 60 dias da vacinação com o BCG.
Figura 7: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com o PPD, após 60 dias da vacina
BCG, em indivíduos que não foram reativos ao PPD inicial.
N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes
positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média. P corresponde a
diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da induração está expresso em
média (desvio padrão) e foi comparado pelo teste t de Student. A frequência de positivos foi
comparada pelo teste exato de Fisher (p = 1,0).
65
7
DISCUSSÃO
O mais importante achado deste trabalho é que indivíduos adultos com a mutação
C.57 + 1 G > A em homozigose nos dois alelos do GHRHR têm similar frequência de
infecções, painel sorológico e de imunoglobulinas, e resposta imune a vacinações, quando
comparados com controles locais pareados para idade e sexo. No entanto, adultos com DIGH
apresentam menores níveis séricos de IgG (ainda que na variação normal), menor diâmetro da
pápula após teste cutâneo com estreptoquinase e uma tendência a menor positividade nos
testes cutâneos. A importância deste trabalho advém da inexistência de dados publicados
sobre os aspectos imunológicos na DIGH congênita em adultos não previamente tratados.
Embora estudos in vivo e in vitro tenham mostrado que GH e IGF-I são importantes
para o desenvolvimento e função do sistema imune (6, 202, 203), não é claro se DGH por si,
cause déficits imunes. Um trabalho mostrou reduzida resposta imune (196), enquanto outros
reportaram resposta imune normal em indivíduos com DGH (153, 194, 204). Entretanto, a
DGH é frequente no pan-hipopituitarismo e é difícil diferenciar os efeitos da DGH na
resposta imune, daqueles efeitos de outros déficits pituitários e da reposição destes
hormônios. Menores níveis de anticorpos protetivos após vacina pneumocócica foram
encontrados em adultos com pan-hipopituitarismo severo, que vinham em reposição
hormonal, inclusive de GH, com níveis de IGF-I na variação normal para a idade, e dose de
GH estável por 6 meses antes do estudo. No entanto, esses indivíduos já tinham menores
níveis de anticorpos pneumocócicos antes da vacinação, quando comparados ao grupo
controle. Baixos níveis de IGF-I pré-tratamento e menores níveis de prolactina, ambos
relacionados a severidade do hipopituitarismo, foram associados a não resposta a vacina
pneumocócica (196). É possível que a menor resposta à vacina pneumocócica esteja
relacionada à deficiência de outros hormônios pituitários. Esta hipótese é apoiada pela
associação entre maiores níveis de prolactina e maior número de células B (196). Vários
estudos têm correlacionado os níveis de prolactina com a função das células B e a imunidade
(142, 196, 205, 206), e estudos encontraram número de linfócitos B na variação normal na
DGH (194, 204). Nossos indivíduos adultos com DIGH têm indetectáveis ou muito baixos
níveis de IGF-I (78), associado a muito baixos níveis de GH, mas detectáveis (207), e níveis
de prolactina normais (208). Devido a alta homologia entre os receptores do GH e da
prolactina (139), um cruzamento entre os dois ligantes e receptores é possível, como já
descrito previamente em neutrófilos humanos (140). Consequentemente, os níveis normais de
66
prolactina podem exercer um efeito compensatório na função imune de nossos indivíduos
com DIGH.
Deficiência imunológica primária é associada a deficiência de IGF-I em raras
condições (11, 13-18, 209). Deficiência imunológica é encontrada em mutações STAT5B (1215), que causam um severo nanismo devido à insensibilidade ao GH. Estes indivíduos
apresentam disfunção de células T regulatórias, déficit no número de células T e doenças
pulmonares (16), que não estão presentes na Síndrome de Laron (SL), o modelo clássico de
insensibilidade ao GH devido a mutações no GHR (210). A ausência de relevantes disfunções
imunes, em ambos os modelos de resistência ao GH (SL) e ao GHRH (DIGH de
Itabaianinha), implicam que um nível circulante de IGF-I normal não é necessário para a
função imune padrão.
Apesar dos menores níveis de IgG total, o grupo DIGH alcançou níveis de anticorpos
específicos para os antígenos da hepatite B e tétano que foram similares ao grupo controle. A
taxa de conversão com a vacinação para hepatite B foi acima de 70%, semelhante a alguns
estudos (211, 212), e menores do que outros em indivíduos não DGH (213-215). A vacina
produzida pelo Instituto Butantan na dose de 25 mcg foi testada em adultos de 31 a 40 anos e
mostrou equivalência à vacina de referência, com proteção em torno de 98,6% (216). Apesar
disso, 2,5 a 5% dos indivíduos saudáveis podem não responder a vacina para hepatite B (217)
e há diminuição da resposta à vacina em indivíduos mais velhos (218). A taxa de conversão
com a vacinação para o tétano foi similar nos 2 grupos. Um estudo prévio encontrou menores
níveis de anticorpos para o tétano no hipopituitarismo, mas a administração do tétano toxóide
foi analisada por dados de história e não foi controlada (196). A resposta semelhante à
vacinação para o tétano e hepatite B, entre DIGH e controles, prova que a DGH não leva a
uma menor resposta humoral a estas vacinas.
Nossos dados imunológicos ajustam-se com os achados de longevidade normal que
foram publicados previamente nestes indivíduos com DIGH (21). Naquele estudo, cinco
mortes foram registradas entre 4 e 20 anos, uma devido a provável causa infecciosa e as
restantes foram atribuídas a doenças diarreicas por relatos verbais dos familiares (21). No
grupo equatoriano com SL, 22 crianças morreram em uma idade precoce, aparentemente de
infecções e/ou hipoglicemia (219). Entre as quatro conhecidas mortes do grupo de Israel com
SL, uma foi devido a encefalite (210). Os indivíduos com DIGH e com resistência ao GH
parecem vulneráveis a doenças infecciosas na infância (21, 219, 220). Nós não pudemos
investigar a função imunológica das crianças com DIGH neste estudo, porque muitas delas
estão no momento em reposição com GH. É possível que os menores níveis de IgG (ainda
67
que na variação normal para o adulto) possam ser insuficientes na infância, quando os níveis
de imunoglobulinas começam a se elevar progressivamente a partir dos 6 meses de vida,
alcançando níveis adultos apenas no fim da adolescência (221). Como nossos indivíduos
DIGH têm puberdade atrasada (222), pode ser que haja um atraso em alcançar um nível
adulto seguro de imunoglobulinas, e isso contribua para uma maior susceptibilidade a
infecções bacterianas ou virais antes da idade adulta.
O GH parece influenciar o tamanho do baço. Foi já previamente reportado que estes
indivíduos adultos com DIGH têm um menor volume do baço, mesmo quando corrigido pela
superfície corpórea (130). O baço tem funções imunes inatas e adaptativas: modula migração
e proliferação celular; ativa a resposta de células T citotóxicas macrófago-dependente;
remove células apoptóticas; aumenta o contato entre os linfócitos T antígeno-específico e as
APCs e contém células B específicas, que capturam antígenos na corrente sanguínea via
receptores de complemento (223). Pelo avaliado neste trabalho, o menor tamanho do baço
não parece afetar a produção de imunoglobulinas. No entanto, não é possível afastar que os
menores níveis de IgG e o menor volume do baço possam contribuir para um prognóstico
desfavorável durante infecções agudas e severas, já que a remoção do patógeno pode estar
prejudicada, tendo em vista que o ritmo de remoção do microorganismo pode estar reduzido
pelo possível menor fluxo sanguíneo no baço, que é proporcional ao tamanho do mesmo
(223).
Menores níveis de anticorpos IgM e células B de memória foram encontrados em
pacientes esplenectomizados por doença autoimune em uma idade mais avançada (média de
35,6 anos) do que em controles e esplenectomizados na infância (média de 5,4 anos), sendo
sugerido que a resposta normal à vacinação nos esplenectomizados na infância poderia ser
pelo fato de haver uma maior plasticidade do sistema imunológico mais jovem, que foi capaz
de compensar os menores níveis de anticorpos e células B de memória através da produção
destas células em outros sítios extra-esplênico (224). Os indivíduos com DIGH do presente
estudo têm apenas baço reduzido, mas é possível que a produção de células B de memória e
de anticorpos em outros sítios possam também estar compensando uma menor produção
destes componentes do sistema imunológico devido ao menor baço, como também, que a
nível celular possam ser necessárias menores concentrações de GH/IGF-I do que para o
crescimento longitudinal, e que outros fatores locais e/ou uma produção parácrina e autócrina
do GH (195) e IGF-I possam estar mantendo o equilíbrio da resposta celular e humoral (5).
A relação IGF total/IGFBP-3 é uma medida da biodisponibilidade dos IGFs e pode
também ter um papel positivo na função das células imunes. Os indivíduos com DIGH têm
68
níveis muito baixos do IGF-I e IGFBP-3 no soro, com uma redução na proporção IGFI/IGFBP-3 e um nível proporcionalmente maior do IGF-II, levando a um aumento na relação
molar IGF-II/IGFBP-3, tal que a razão molar do IGF total (IGF-I + IGF-II) /IGFBP-3 é
elevada (78). Esse aumento da razão molar do IGF total/IGFBP-3 pode ser um outro
mecanismo compensatório, além da produção autócrina e parácrina do GH e do IGF-I, que
pode atuar na manutenção do equilíbrio da imunidade celular e humoral, independentemente
dos níveis circulantes de GH e IGF-I necessários para o crescimento longitudinal (7-10).
A resposta imune celular destes indivíduos DIGH foi também similar a dos controles
quando avaliados através de testes cutâneos para estreptoquinase, candidina, PPD e na
imunização com BCG, mas os controles foram mais prováveis a responder positivamente a
pelo menos um teste cutâneo. O diâmetro da pápula no teste cutâneo em resposta ao antígeno
estreptoquinase foi menor na DIGH, mas a freqüência de testes cutâneos positivos não foi
diferente entre DIGH e controles, como previamente reportado em crianças com DGH
adquirida (194). Houve muitos indivíduos que não apresentaram induração positiva após a
administração dos 3 antígenos comuns à maioria da população. Os trabalhos que avaliam
anergia utilizam um perfil de pelo menos cinco antígenos (47, 49, 52) e o antígeno da
tuberculina é o regularmente padronizado por sua potência (225). Problemas referentes a
dificuldades técnicas na aplicação dos antígenos, na leitura e no condicionamento adequado
da vacina BCG e do PPD (52) foram minimizados através da aplicação dos antígenos por
pessoa experiente, e foram afastadas condições clínicas que pudessem levar a anergia, como
HIV, imunodeficiências, terapia imunossupressora, alcoolismo, entre outras (52).
Não encontramos estudos prévios com vacinação com BCG e avaliação da resposta ao
PPD em pacientes com hipopituitarismo ou DIGH, para comparar nossos dados. Cerca de
42% dos indivíduos de cada grupo não sabiam ou diziam que não tinham recebido
previamente BCG. Não houve um controle no estudo sobre a presença de cicatriz de BCG,
para tentar confirmar vacinação prévia. Apesar da sensibilidade positiva a tuberculina ser
usada como um indicador de sucesso da vacinação com o BCG, a reatividade tuberculínica
pós-vacinal declina ao longo dos anos (226, 227) e a proteção da BCG não está relacionada
com o tamanho da induração (228). O impacto da vacinação sobre o resultado do PPD é
fortemente afetado pela idade na vacinação. O efeito da vacina BCG recebida na infância no
PPD é mínimo após 10 anos ou mais da vacinação, e o BCG, quando dado em mais idade,
produz com mais frequência reações, que habitualmente são maiores e mais persistentes
(229). Não há evidência de benefício da revacinação (230), não sendo recomendada pela
Organização Mundial de Saúde. Possíveis interferentes na efetividade do BCG são
69
micobactérias ambientais não patogênicas, que podem agir como vacinas naturais, mas isto é
mais relevante em países com muito baixa incidência de tuberculose (229), além de
infestações crônicas por helmintos, que por induzir predominantemente uma resposta do tipo
Th2, podem alterar a resposta imune celular, reduzindo a eficácia da BCG, mas que pode ser
melhorada com o tratamento anti-helmíntico (231). No presente estudo, não foi feito exame
parasitológico, embora em geral não seja comum parasitoses na idade adulta.
Apesar do número de indivíduos que não apresentaram reação a nenhum dos
antígenos inoculados, após a vacinação com BCG e um novo PPD, houve um aumento na
positividade de ambos os grupos. Vale ressaltar que a resposta aos testes cutâneos foi
semelhante entre os grupos e não há relato de infecções causadas por patógenos intracelulares
no grupo com DIGH, a não ser dois casos de hanseníase que foram tratados e um familiar
controle, de um desses dois casos, que apresentou também a doença. A ausência de relato de
qualquer caso de tuberculose no grupo com DIGH, em mais de 20 anos de atividades clínica
e de pesquisa nesta comunidade, está de acordo com uma resposta celular normal nestes
indivíduos.
Os dados sócio-econômicos são semelhantes entre os dois grupos, com a ressalva do
maior número de solteiros e menor renda familiar na DIGH. Embora este último achado
pudesse ter um efeito favorecendo mais infecções no grupo DIGH (o que não ocorreu), a
significância biológica deste dado é questionável. Não há indivíduos com DIGH, em estado
de desnutrição ou escassez alimentar. Ao contrário, eles ingerem mais calorias e mais
proteínas do que os controles (232).
No último censo do IBGE em 2010, a população de Sergipe era de 2.068.017 pessoas
e a estimada em 2015 era de 2.219.574 de habitantes. Já Itabaianinha tinha 38.910 habitantes
e a população estimada em 2015 era de 41.404 habitantes (233). A freqüência de notificação
das doenças pesquisadas neste estudo foi pequena. Segundo dados do SINAN (Sistema
Nacional de Agravos de Notificação), em Itabaianinha, a incidência de tuberculose entre
2010 e 2015, considerando-se todas as formas da doença, ficou em uma média de 10,86
casos/100.000 habitantes/ano, e em 2015, foram notificados 4 casos novos de tuberculose,
com uma incidência de 9,66 casos/100.000 habitantes. Já em Sergipe, a média da incidência
de tuberculose, entre 2010 e 2015, foi em torno de 27 casos/100.000 habitantes/ano, e em
2015, foram notificados 636 casos novos de tuberculose, com uma incidência de 28,18
casos/100.000 habitantes. Com relação à frequência de notificação das outras doenças
pesquisadas, em Itabaianinha, entre 2010 e 2015, foi notificado apenas um caso de
leishmaniose visceral (em 2013) e nenhum caso de leishmaniose tegumentar entre 2010 e
70
2011; seis casos de hepatite por vírus B, sendo nenhum caso em 2015 e dois casos de hepatite
por vírus C, ambos em 2011. Já em Sergipe, a freqüência de notificação foi de 361 casos de
leishmaniose visceral; 975 casos de hepatite B, sendo 52 em 2015 e 412 casos de hepatite por
vírus C, sendo 33 em 2015. Em Sergipe, o coeficiente de detecção de casos novos de
hanseníase é considerado alto e, em 2014, foi de 18,74 por 100.000 habitantes (234). Em
2015, houve três notificações de casos novos de hanseníase em Itabaianinha e um total de 230
em Sergipe.
O grupo de indivíduos de Itabaianinha tem DIGH congênita e vitalícia. É possível que
tenham algum mecanismo compensatório não presente na DGH adquirida e de início na idade
adulta. Portanto, os resultados deste estudo podem não necessariamente ser aplicados aos
indivíduos nos quais a DGH foi adquirida e que possuam outras deficiências hormonais.
Uma possível limitação deste estudo é o relativo pequeno tamanho da amostra. Não
encontramos literatura semelhante em humanos sobre as consequências imunes da DIGH
para auxiliar em encontrar um poder de cálculo confiável. Acreditamos que o número inicial
de indivíduos adultos com DIGH e controles que responderam ao questionário clínico foi
adequado considerando a raridade da DIGH (1 em 3.480 a 1 em 10.000 nascidos vivos) (235)
e a dificuldade de identificar adultos não tratados. Este é de longe o maior grupo no mundo
de indivíduos adultos com DIGH congênita, não tratados. A vasta maioria dos casos com
DIGH não são tão severos como os nossos e são tratados com terapia de reposição com GH.
Devido a estes fatores, um estudo semelhante a este não pode ser facilmente realizado em
qualquer outro lugar, nem mesmo em Itabaianinha, por causa do tratamento atual com GH
nas crianças do nosso grupo. Infelizmente, mas compreensivelmente, o número de indivíduos
após a primeira etapa deste estudo foi reduzido em função dos critérios de idade e resultados
sorológicos, e isto pode ter diminuído nosso poder de detectar diferenças sutis entre os
grupos.
Assim, indivíduos adultos, não tratados, com DIGH vitalícia, não exibiram uma maior
frequência de infecções ou uma significante alteração na resposta imune humoral. No
entanto, indivíduos com DIGH apresentaram menores níveis de IgG total, menor diâmetro da
pápula após teste cutâneo com estreptoquinase, e uma tendência (embora não significante) a
uma menor resposta celular com maior frequência de todos os três testes cutâneos negativos,
já os controles apresentaram uma maior frequência de um teste cutâneo positivo. Estas
diferenças parecem não ter relevância clínica no cotidiano, mas podem contribuir para
resultados desfavoráveis em situações de infecções mais severas.
71
8
CONCLUSÕES
a) A frequência de história de doenças infecciosas e de sorologia positiva para doença de
Chagas, leishmaniose, hepatite B, hepatite C, HIV e tétano é semelhante àquela dos
controles normais da mesma região.
b) Os níveis de IgG foram menores no grupo DIGH do que nos controles, embora dentro
da variação normal do método. Os níveis das demais imunoglobulinas IgA, IgM e IgE
foram semelhantes nos DIGH e controles.
c) A freqüência de positividade aos testes cutâneos PPD, estreptoquinase e candidina foi
igual entre DIGH e controles, apesar do diâmetro da pápula 48 h após o teste cutâneo
com estreptoquinase ser menor no grupo DIGH e de os controles apresentarem uma
maior frequência de pelo menos um teste cutâneo positivo.
d) A imunização com as vacinas do vírus da hepatite B, com o tétano toxóide e com a
BCG induzem respostas semelhantes em pacientes com DIGH e controles.
72
9
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como um todo, a avaliação da resposta imunológica dos indivíduos adultos com
DIGH vitalícia não revelou uma maior frequência de infecções ou uma significante alteração
na resposta imune humoral ou mediada por células, apesar dos menores níveis de IgG total e
da menor positividade a pelo menos um dos testes cutâneos na DIGH. Os níveis normais de
prolactina podem compensar os baixíssimos níveis de GH, já que estes dois hormônios têm
grande semelhança nos seus receptores, podendo compartilhar funções. Adicionalmente, a
maior razão molar IGF total (IGF-I + IGF-II)/IGFBP-3 pode levar a uma maior
biodisponibilidade dos IGFs e isto pode também ter um papel positivo na função das células
da resposta imune. Além disso, a secreção autócrina-parácrina do GH nas células do sistema
imunológico, independente da regulação pituitária, pode ser suficiente para modular a
resposta imune destes indivíduos com DIGH vitalícia, considerando a importância do sistema
imunológico para a sobrevivência do homem. No entanto, considerando os achados de
menores níveis de IgG e o menor volume do baço em adultos com DIGH vitalícia, e tendo em
vista a importância de ambos para neutralização de patógenos invasores, principalmente em
crianças, onde os níveis de imunoglobulinas ainda estão em ascensão, é possível que em
situações de infecções mais agudas e graves, estes indivíduos tenham uma maior dificuldade
de controlar as infecções, com consequente aumento da mortalidade.
73
10 PERSPECTIVAS
a) Avaliar a resposta imunológica a outros agentes (exemplo, pneumococo 23 e
rotavírus).
b) Avaliar a produção de citocinas pelas células estimuladas in vitro com antígenos e
tratadas com GH e IGF-I.
c) Acompanhar os níveis de imunoglobulinas nos recém-nascidos com DIGH, para
verificar seus níveis de IgG, IgM, IgA, IgE e suas respostas às vacinas do calendário
habitual.
d) Acompanhar a frequência de infecções nos recém-nascidos até a adolescência, faixa
etária onde ocorreu uma maior frequência de morte em estudo anterior do nosso
grupo.
74
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89
APÊNDICE A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PESQUISA: Avaliação da prevalência de infecções e da resposta imune em indivíduos com
deficiência de GH/IFG-1
Concordo em participar da pesquisa acima, que tem como objetivo estudar a capacidade
do organismo de pessoas com deficiência de hormônio de crescimento reagir à infecção e se
esta reação é diferente de outros familiares ou conhecidos próximos que não tenham a
deficiência. Para isto será realizado inicialmente um questionário onde perguntaremos sobre a
ocorrência de infecções anteriores, quais vacinas já foram tomadas e alguns dados sobre
condições de vida. Além disso, será realizada uma coleta sanguínea de cerca de 10 ml para
verificar se há anticorpos de defesa no sangue contra algumas doenças infecciosas (Hepatite
C, Calazar, HIV e Doença de Chagas) e contra antígenos de vacinas que são dadas nos
Programas do Governo como Tuberculose, Tétano, Calazar e Hepatite B. Será feito também
um teste na pele para verificar se as pessoas reagem bem à aplicação de algumas vacinas
como a do microorganismo toxóide tetânico, BCG, estreptoquinase e candidina, produzindo
mecanismos de defesa normal. Para isto aplicaremos uma quantidade mínima da vacina no
subcutâneo (logo embaixo da pele, na camada de gordura) com uma agulha bem pequena e
fina (mesma agulha para aplicar insulina) e 2 dias após esta aplicação verificaremos se o
organismo reage. A reação normal ocorre quando é formado um edema na pele de mais de
0,5 cm, sendo assim esse edema poderá ocorrer, podendo ser maior ou menor em algumas
pessoas, mas depois desaparecerá e faremos também uma nova coleta de sangue para dosar
os anticorpos (células de defesa) que serão formados no sangue para proteção contra o
microorganismo da vacina. Em seguida, um número menor de pessoas que não tenham
resposta à vacinação da Hepatite B e Tétano, poderá ser novamente vacinado, desta vez com
aplicação no músculo da vacina e faremos a coleta de sangue 3 meses após a aplicação da
vacina para verificarmos se anticorpos no sangue foram produzidos para proteção contra esse
microorganismo da vacina. Com esse sangue também faremos estudos nas células de defesa,
verificando o comportamento das células à infecção como por exemplo à infecção do Calazar
(Leishmania).
Estou ciente de que os dados do meu questionário e dos meus exames serão utilizados
para a pesquisa. Ponho-me à disposição para fornecer outras informações, caso necessário, da
minha história ou do meu exame. Estou também ciente de que posso abandonar a pesquisa
em qualquer estágio sem comprometimento algum. Os dados da Pesquisa ficarão sob a
responsabilidade da médica Viviane Correia Campos Almeida, devendo ser publicado em
revista científica da área médica. O nome e endereço dos participantes serão mantidos em
sigilo.
Aracaju, ______de ___________________de _________.
______________________________________________
Nome do responsável
_____________________________________________
Nome da Pesquisadora
90
APÊNDICE B
QUESTIONARIO
1. Número:_____(Nome:______________________________________)
2. Grupo: (1) DGH (Homozigoto) (2) Heterozigoto (3) Homozigoto normal
3. Idade:_________(Data de nascimento ____/____/___)
4.Sexo: (1) M (2) F
5. Estado civil: (1) S (2) C (3) D (4) V
6. Local de residência:__________________________________________________
7. Naturalidade:__________________
8. Dados sócio-econômico-cultural:
8.1. Endereço:__________________________________________________________
8.2. Telefone:___________ 8.3 Água encanada: (1) Sim (2) Não (3) Sim, mas falta com
freqüência
8.4: Luz elétrica: (1) Sim (2) Não
8.5. Renda familiar: (1) < 1 SM (2) 1 a 3 SM (3) 4 a 7 SM (4) > 7 SM
8.6. Esgotamento sanitário: (1) Esgoto (2) Fossa (3) esgoto a céu aberto
8.7. Tipo de casa: (1) Taipa (2) Reboco sem pintura (3) Reboco com pintura
8.8 . ( ) Número de pessoas na casa
8.9. ( ) Número de cômodos na casa
8.10. Escolaridade: (1) Analfabeto (2) Fundamental completo (8 série) (3) Fundamental
incompleto (< 8 série) (4) Médio completo (3 anos) (5) Médio incompleto (6) Superior
completo (7) Superior incompleto (8) Outro: ____________
9. Antecedentes de Vacinação: (1 ) BCG (2) Tétano (3) Rotavírus (2006) (4) Hepatite B
(5) Pneumo 23
10. Antececentes Patológicos: (1) Tuberculose (2) Chagas (3) Hepatites vírus B ou C
(4) Calazar (5) Hanseníase (6) Pneumonia
(7) Diarréia com febre e vômitos (antes dos
5 anos) (8) Infecções de orofaringe de repetição (9) Estreptococcia com febre reumática e
lesão cardíaca
11. Antecedentes Tratamento:
(1) Tuberculose (uso de rifampicina, etambutol, isoniazida e/oupirazinamida, por no mínimo
6 meses)
(1) Sim (2) Não (3) NS
(2) Hanseníase (tratamento longo, uso de rifampicina, dapsona ou clofazimina)
(1) Sim
(2) Não (3) NS
(3) Uso de Interferon
(1) Sim (2) Não (3) NS
(4) Pneumonia
(1) Sim (2) Não (3) NS
(5) Fez profilaxia mensal com Benzetacil (1) Sim (2) Não (3) NS
(6) Calazar
(1) Sim (2) Não (3) NS
12. Antecedentes Familiares:
( ) Número de óbitos por diarréia, febre, vômitos e desidratação na infância
(1) Sim (2) Não (3) NS
( ) Número de óbitos por outras causas (1) Sim (2) Não (3) NS
(idade)_______________________________________
13. Resultados Sorológicos positivos:
(1) Chagas (2) Leishmaniose (3) Tétano (4) HIV (5) Hepatite B (6) Hepatite C (7)
Pneumo 23
14. Resultados sorológicos positivos na reimunização: (1) Tétano (2) Hepatite B (3)
Pneumococo
91
15.Exame físico:
Peso: ________ Altura:_______ SC:____________
Inspeção (pele e fâneros):_________________________________________________
ACV: ________________________________________________________________
Ausculta respiratória:_____________________________________________________
Exame neurológico (sensibilidade, força):_____________________________________
16. Exames laboratoriais adicionais (pacientes com Doença e quadro clínico específico):
R-X tórax______________________________________________________________
ECG__________________________________________________________________
EED (R-X esôfago-estômago-duodeno com contraste)___________________________
ECO__________________________________________________________________
US Abdômen (medir baço e corrigir SC)______________________________________
______________________________________________________________________
Enema_________________________________________________________________
Hemograma____________________________________________________________
Coagulograma __________________________________________________________
TGO________ TGP________ gamaGT _________ albumina________
92
ANEXO
93
Infectious diseases and immunological responses in adult subjects with
lifetime untreated, congenital GH deficiency
Viviane C. Campos¹, Mônica R. Barrios², Roberto Salvatori³, Roque Pacheco de Almeida²,
Enaldo V. de Melo¹, Ana C. S. Nascimento¹, Amélia Ribeiro de Jesus², and Manuel H.
Aguiar-Oliveira¹
1 - Federal University of Sergipe, Division of Endocrinology, 49060–100, Aracaju – SE,
Brazil.
2 - Federal University of Sergipe, Division of Immunology and Molecular Biology
Laboratory, 49060–100, Aracaju - SE, Brazil.
3- Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, The Johns Hopkins University
School of Medicine Baltimore, Maryland 21287 USA.
Corresponding author:
Roberto Salvatori, MD,
Division of Endocrinology,
Johns Hopkins University School of Medicine,
1830 East Monument street suite #333,
Baltimore, MD 21287
E-mail: [email protected]
Tel (410) 955-3921; Fax (410) 367-2042
Abbreviated title: Infection and immunology in GH deficiency
94
Abstract
Purpose: GH is important for the development and function of the immune system, but there
is controversy on whether GH deficiency (GHD) is associated to immune disorders. A model
of isolated GHD (IGHD) may clarify if the lack of GH is associated with increased
susceptibility to infections, or with an altered responsiveness of the immune system.
Methods: We have studied the frequency of infectious diseases and the immune function in
adults with congenital, untreated IGHD. In a cross-sectional study, 35 adults with IGHD due
to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene and 31 controls were submitted to a
clinical questionnaire, physical examination and serology for tripanosomiasis, leishmaniasis,
HIV, tetanus, hepatitis B and C, and serum total IgG, IgM, IgE and IgA measurement. The
immune response was evaluated in a subset of these subjects by skin tests and response to
vaccination for hepatitis B, tetanus, and bacillus Calmette-Guérin.
Results: There was no difference between the groups in history of infectious diseases and
baseline serology. IGHD subjects had lower total IgG, but within normal range. There was no
difference in the response to any of the vaccinations, or in the positivity to PPD, streptokinase
or candidin.
Conclusions: Adult untreated IGHD does not cause an increased frequency of infectious
diseases, and does not alter serologic tests, but is associated with lower total IgG levels,
without detectable clinical impact.
Key Words: cellular and humoral immune response; isolated GH deficiency; vaccines and
skin tests; infectious diseases.
95
Introduction
GH and its principal mediator IGF-I have synergistic effects on somatic growth and
complex effects on various body functions, including the immune response, which is essential
for survival by defending against dangerous pathogens and cancer cells [1]. There is a
complex interaction between the two types of immune response, the humoral and the cellmediated, related respectively to the function of B and T cells. Both cells interact with antigen
presenting cells and become activated, proliferate and migrate to the site of inflammation. B
cells produce antibodies that target extracellular pathogens. T cell populations include CD8+
cytotoxic T cells that lyse infected cells, and CD4+ T helper cells that secrete a wide range of
cytokines and activate other components of the immune response [2].
The knowledge of the interaction between the pituitary gland and the immune system
dates back almost 90 years, when hypophysectomized rats were found to have atrophy of the
thymus [3]. GH, IGF-I, ghrelin and their receptors were demonstrated in various immune cells
in rodents and humans[4-10], suggesting autocrine and paracrine production of these and
other peptides like IGF binding proteins, IGF-II and its receptor[11].It is possible that the
local effects of these peptides surpasses the activity of pituitary GH and circulating IGF-I on
the immune system [4-8]. Indeed, immune function is more relevant to survival capacity than
body size, which reflects the effect of pituitary GH and circulating IGF-I.
Several pieces of indirect evidence tie the GH-IGF-I axis to the immune system. The
generation of IGF-I requires the binding of GH to growth hormone receptor (GHR), a class I
cytokine receptor that triggers phosphorylation of Janus Kinase 2 (JAK2), and activation of
the signal transducer and activator of transcriptional gene-5b (STAT5b) [12-15]. Prolactin,
interferon gamma, and various interleukins (IL) also bind to cytokine receptors and activate
the STAT family [15]. The binding of IL-2 to its receptor and the activation of STAT5b lead
to activation of T lymphocytes and inhibition of their apoptosis (protecting against
96
infections), and to the development and proliferation of regulatory T cells (protecting against
autoimmunity) [13]. Immunological disorders are well described in some GH/IGF-I axis
defects, like homozygous mutations in STAT5b [12-15] and hypogammaglobinemia
associated to X-linked isolated GH deficiency (GHD) [16, 17]. Interestingly, GH releasing
hormone (GHRH) gene knock out GHD mice are less likely to develop experimental
autoimmune encephalitis, suggesting pivotal role of GH in regulation of immune system [18].
GHD is often acquired, in setting of hypopituitarism, and associated to other pituitary
deficits requiring replacement therapies. Both the other deficits and the replacement therapies
may confound the consequences of GHD on the immune response. Patients with isolated
GHD (IGHD) would allow clarifying whether lack of GH results into an altered
responsiveness of the immune system, and increased susceptibility to infections. We have
described (in Itabaianinha County, in Northeast Brazil) a group of individuals with severe
IGHD caused by a null homozygous mutation in the GHRH receptor gene (GHRHR) [19].
Despite an apparent increase in childhood deaths, there is no significant difference in life span
between these IGHD subjects and normal statured siblings or the general population when
subjects reach age 20 years [20]. Given the normal longevity, we hypothesized that their
immunity in adulthood is not relevantly impaired. The objective of this study was to compare
the frequencies of infectious diseases, and to perform a comprehensive immune assessment in
GH-naïve adult subjects from this IGHD cohort.
97
Subjects and Methods
Subjects
In a cross-sectional study, adult GH-naïve IGHD and age- and sex-matched controls
were recruited by advertising in the local Dwarfs Association building and by word of mouth
among the inhabitants of Itabaianinha County. Inclusion criteria for IGHD was genotypeproven homozygosity for the C.57 + 1G > A GHRHR mutation, whereas controls were normal
statured individuals proven to be homozygous for the wild-type GHRHR allele. A two-step
protocol was performed. The first step included a clinical questionnaire (supplemental file),
physical examination and serology. The only exclusion criterion for this first step was age <
20 years. The second step included the evaluation of immune response through
immunoglobulins measurements, skin tests reactivity, and response to vaccinations. For this
step, the exclusion criteria were age < 20 and > 65 years; diagnosis of Human
Immunodeficiency Virus (HIV) infection or acute diseases; history of malignancies;
autoimmune diseases; glucocorticoid and anti-allergic medications use; or current pregnancy.
Thirty-five IGHD subjects and 32 controls volunteered. One control was excluded due to
history of cervical cancer. Both groups live in the same area and have similar educational
level, monthly family income, and general living conditions.
The Institutional Review Board of Federal University of Sergipe approved the
protocol, and all subjects provided written informed consent.
Study protocol
Clinical questionnaire and physical examination
The same physician (V.C.C) administered a questionnaire to all subjects to evaluate
past and current history of infectious diseases and vaccination for hepatitis B, tetanus toxoid,
bacillus Calmette-Guérin (BCG) and rotavirus, and performed a complete physical
98
examination. All the clinical information were confirmed by the file records of the database of
research group started in 1994.
Hormone assays
Prolactin, was measured by fluoroimmunoassay (Perkin Elmer Life and Analytical
Science, Wallac Oy Turku, Finland) with sensitivity of 1.44 ng/ml. IGF-I was measured by a
solid-phase, enzyme labeled chemiluminescent immunometric assay IMMULITE 2000
(Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd, Malvern, PA, USA), with sensitivity of 25
ng/ml.
Serology
Serological screening for tripanosomiasis was performed by immunoassay
chemiluminescent
microparticle
(ARCHITECT-ABBOTT)
and
by
indirect
immunofluorescence (WAMA Diagnostics). Serology for leishmaniasis was performed by
indirect immunofluorescence (Leishmania IFA Vircell® provided by MEDIVAX). Serology
for HIV by chemiluminescence (Abbott Diagnostic Laboratories, Santa Clara, California,
USA); hepatitis B and C by electrochemiluminescence (ELECSYS 2010, Roche Diagnostics);
tetanus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA RIDASCREEN® Tetanus IgG RBiopharm). Subjects with positive leishmaniasis serology enrolled in a protocol to rule out
visceral leishmaniasis, including measurement of blood cell count, transaminases, total
protein and fractions, coagulation, rK39 (Kalazar Detect® Rapid Test: In Bios International
Inc., Seattle, WA) and Montenegro skin test (test uses antigens of Leishmania amazonensis
produced by FIOCRUZ, Rio de Janeiro). Subjects with positive results for tripanosomiasis
enrolled in a protocol to rule out tripanosomiasis disease including, electrocardiogram,
transthoracic echocardiogram and chest radiograph.
Evaluation of immunoglobulin panel
Serum total IgG (reference value 700 to 1600 mg/dl), IgM (reference value 50 to 300
99
mg/dl) and IgA (reference value 40 to 350 mg/dl) were measured by immunoturbidimetric
assay. IgE (reference value lower than 160 IU/ml) was measured by non-competitive
immunoassay method.
Evaluation of hypersensitivity skin test reactivity
Three skin tests of delayed hypersensitivity were performed: Protein Purified Derived
(PPD), Candidin, and Streptokinase. PPD was obtained from the Staten’s Serum Institute of
Denmark, PPD RT 23 SSI 2 UT / 0.1 mL, lot number 1624B; Candidin and Streptokinase
were obtained from the Immunotech, Rio de Janeiro, Brazil. Candidin was extracted from
Candida albicans 1:100 (reference 14018/604) and Streptokinase from Streptococcus sp
100.000.000 BCT/ml (reference 14018/603). The three antigens were administered
intradermallly in the amount of 0.1 ml on the flexor side of the left forearm, starting 4 cm
from of the elbow, according to standard techniques by the same nurse. The tests were
considered positive when the diameter of indurations was ≥ 5mm [21, 22]. We analyzed
positive or negative reaction and induration size, separately, as histological findings can be
found with indurations smaller than 5 mm [21, 23].
Evaluation of response to vaccines
Thirteen IGHD individuals and thirteen controls who had negative serology for tetanus
and/or hepatitis B vaccines volunteered for this study. Two IGHD subjects dropped out after
first dose of vaccination for tetanus toxoid and hepatitis B because of side effects at the
injection site. One IGHD was already Anti-HBs positive, and he was immunized only against
tetanus toxoid. Two controls had positive serology for tetanus and they were immunized only
against hepatitis B. Therefore, 10 IGHD and 13 control subjects completed hepatitis B, and 11
IGHD and 11 controls tetanus vaccination.
The schedule for hepatitis B vaccination consisted of three 1 ml intramuscular doses
(baseline,30, and 180 days later) of the adsorbed hepatitis B vaccine (recombinant) developed
100
at the Butantan Institute in São Paulo, Brazil. The schedule for tetanus vaccination
(TETADIF, vaccine adsorbed diphtheria and tetanus adult, BB-NCIPD Sofia, Bulgaria)
consisted of three 0.5 ml intramuscular doses (baseline, 30, and 60 days later). The respective
levels of antibodies were measured 30 days after the end of the schedule for hepatitis B and
150 days after the end of tetanus vaccination. Seroconversion were considered when AntiHBs titer ≥ 10 mIU/ml for hepatitis B and IgG levels for tetanus toxoid greater than 0.6 IU /
ml.
Fifteen IGHD and 10 controls, all non-reactive to PPD, were vaccinated with BCG
(0.1 ml) and a new PPD test was performed 60 days after vaccination. A diameter of
induration ≥ 5 mm was considered positive. For the entire experimental protocol, it was
needed 18 months for an individual has completed all the steps.
Statistical analysis
Values for continuous variables were expressed as mean (standard deviation).
Variables with non-normal distribution (IGF-I and prolactin levels, IgA and papule diameter
streptokinase and PPD) were expressed as median (interquartile range). Percentages were
compared with the Fisher's exact test. Data with normal distribution were compared using the
Student t test, and those with non-Gaussian distribution were compared by Mann-Whitney U
test. Univariate analysis of variance was used to assess the dimension of the effect and
observed power of the variables with significant difference between the two groups. Statistical
analysis was performed using the statistical software IBM®SPSS® Version 20. Probability
values < 0.05 were considered statistically significant.
101
Results
Table 1 shows the anthropometric data, previous pathologies, and results of hormonal
and serological tests of the two groups. As expected, height and weight were lower in the
IGHD group. IGF-I was below the limit of sensibility of the method in all but 4 of the IGHD
individuals. There was no difference in history of infectious diseases, or positive serology for
tripanosomiasis, leishmaniasis, HIV, hepatitis B and C, and tetanus between the groups. Two
IGHD and three controls had positive serology for leishmaniasis, but visceral leishmaniasis
was ruled out in all five subjects. One IGHD and two controls had positive serology for
tripanosomiasis, and one control was found to have tripanosomiasis with dilated
cardiomyopathy.
Table 2 shows the immunoglobulins levels. IGHD subjects had lower IgG levels, but
within the normal range.
Twenty-four IGHD, 41.7 (12.7) yrs. (range 25 to 64), 11 males, and 28 controls, 40.1
(11.7) yrs. (range 20 to 61), nine males, were submitted to PPD skin test. Twenty-one IGHD,
42.9 (13) yrs. (range 25 to 64), 8 males, and 20 controls, 44 (11.3) yrs. (range 20 to 61), seven
males, were submitted to streptokinase test. Twenty-one IGHD, 42.9 (13) yrs. (range 25 to
64), 8 males, and 19 controls, 44.3 (11.5) yrs. (range 20 to 61), six males, were submitted to
candidin test.
There was no difference in the frequency of positivity to PPD [IGHD 4 (16.7%) vs.
controls 10 (35.7%), p = 0.21], nor in the papule diameter [IGHD, 1.0 (2.75) mm vs. controls
2.0 (6.0) mm, p = 0.178].
There was no difference in the frequency of positivity to streptokinase [IGHD 2
(9.5%) vs. controls 5 (25%), p = 0.24], although the papule diameter was smaller in IGHD
than controls [2.0 (2.5) mm vs. 3.5 (1.75) mm, respectively, p = 0.0151].
There was no difference in the frequency of positivity to candidin [IGHD 3 (14.3%)
102
vs. controls 1 (5.3%), p = 0.61], nor in the papule diameter [IGHD 2.1 (2.0) mm vs. controls
1.9 (1.5) mm, p = 1.0]. Figure 1 shows the individual and mean response of the two groups to
the skin tests. Even excluding indurations < 5 mm, and analyzing the small number of
subjects with indurations ≥ 5 mm, there was no difference between groups (IGDH vs.
Control: PPD, p = 0.31; streptokinase, p= 0.13; and candidin p= 0.56).
Table 3 shows the comparison of the number of subjects who had all the three negative
tests, one positive, two positive, three positive tests and the total number of positive tests.
IGHD subjects showed a tendency to reduced cellular response with non-significant higher
frequency of all the three negative skin tests (p = 0.052), while the controls have a high
frequency of one positive skin test (p = 0.04).
Table 4 shows the response to hepatitis B and tetanus vaccination, which was similar
in both groups.
Fifteen IGHD individuals, 42.1 (13.2) yrs. (range 28 to 64), 9 males, and 10 controls,
39.9 (9.8) yrs. (range 30 to 61), five males, were vaccinated with BCG. There was no
difference in the frequency of positivity of PPD after BCG vaccination [IGHD vs. controls, 9
(60%) vs. 6 (60%), p = 1.0], nor in the papule diameter [IGHD vs controls, 8.1 (7.1) mm vs
7.9 (6) mm, p = 0.933]. Figure 2 shows a dot plot of the values of induration after 60 days of
vaccination.
103
Discussion
The most important finding of this work is that adult IGHD individuals with a null
homozygous (C.57 + 1G > A) GHRHR mutation have similar frequency of infections,
serological and immunoglobulins panel, and immune response to vaccinations, when
compared with age and gender matched local controls. Nevertheless, IGHD subjects have
lower serum IgG levels (still in normal range), smaller papule diameter after streptokinase test
and a tendency to lower positivity in skin tests.
Although studies in vivo and in vitro have shown that GH and IGF-I are important for
the development and function of the immune system [6, 24, 25], it is not clear if GHD per se
causes immune deficits. One paper showed reduced [26], while others reported normal
immune response in GHD subjects [25, 26]. However, GHD is often found in the setting of
pan-hypopituitarism, and it is difficult to separate the effects of GHD from the effects of other
pituitary deficits and replacements. For instance, lower levels of protective antibodies postpneumococcal vaccine were found in treated severely panhypopituitary adults. Low levels of
IGF-I and lower prolactin levels, both related to the severity of hypopituitarism, were
associated with non-response to pneumococcal vaccination [26]. It is possible that lower
response to pneumococcal vaccine was related to deficiency of other pituitary hormones. This
is supported by the association between higher levels of prolactin and greater number of B
cells [26]. Various studies have correlated the levels of prolactin and B cell function and
immunity [26, 29, 30], and studies found the number of B-lymphocytes to be in the normal
range in GHD [27, 31].Our adult IGHD subjects have undetectable or very low IGF-I levels
[32], associated to very low GH but detectable GH levels [33], and normal prolactin levels
[34]. Due to the high homology between GH and prolactin receptors [35], a cross talking
between the two ligands and receptors is possible, as previously shown in human neutrophils
104
[36]. Consequently, the normal prolactin levels may exert a compensatory effect on the
immune function of our IGHD subjects.
Primary immune deficiency is associated to IGF-I deficiency in some rare conditions
[11-17, 37]. Immune deficiency was reported in STAT5B mutations [12-15], which cause
severe dwarfism due to GH insensitivity. These individuals present dysfunction of
T
regulatory cells, T cell number deficit, and pulmonary disease [15], which are not present in
the classical model of GH insensitivity due to mutations in the GH receptor, the Laron
syndrome (LS) [38]. The lack of relevant immune disorders in both GH (LS) and our GHRH
resistance models imply that a normal IGF-I circulating level is not required for adequate
immunity.
Despite lower total IgG levels, the IGHD group reached levels of specific antibodies to
the antigens of hepatitis B and tetanus that were similar to the control group. The conversion
rate of tetanus and hepatitis B vaccination was similar in the two groups. The % of conversion
of hepatitis B vaccination in IGHD subjects was above 70%, similar to some previous studies
[39, 40], and lower than others done in non-GH deficient individuals [41-43]. A previous
study had found lower levels of antibody to tetanus toxoid in hypopituitarism, but tetanus
toxoid administration was historical and not controlled [26]. The similar response to tetanus
and hepatitis B vaccination between IGHD and controls proves that GHD does not lead to a
lower humoral response to these vaccines.
Our immune data fit with the finding of normal longevity we reported previously in
these IGHD subjects [20]. In that study, five deaths were registered between 4 and 20 years,
one due to infectious cause and the remainders were attributed to diarrheic diseases by verbal
reports [20]. In the Ecuadorian LS cohort, 22 children died at an early age, apparently from
infections and/or hypoglycemia [44]. Among the four known deaths of the Israeli LS cohort,
one was due to encephalitis [38]. Therefore, both IGHD and GH resistant patients seem
105
vulnerable to infectious diseases in childhood [20, 44, 45]. We could not investigate the
immunological status of IGHD children in this study because most IGHD children are
presently on GH replacement. It is possible that the lower IgG levels (still in normal
adulthood range) could be insufficient in childhood, as the immunoglobulin levels raises
progressively after the first month of life, reaching the adult levels at the end of adolescence
[46]. As our IGHD individuals have delayed puberty [47], it is also possible that they may
have a delay in reaching a safe immunoglobulin adulthood profile, and be more susceptible to
bacterial infections or viral antigens before adulthood.
We had previously reported that these adult IGHD subjects have a small spleen
volume, even when corrected by body surface [48]. Accordingly, GH replacement in GH
deficient mice increases spleen size [49]. The spleen has innate and adaptive immune
functions: it modulates migration and proliferation of lymphoid cells and macrophagedependent activation of cytotoxic T cell responses; removes apoptotic cells; increases contact
between antigen specific T lymphocytes and antigen presenting cells and contains specific B
cells, which capture antigens carried in the blood via complement receptors [50]. While the
smaller spleen size does not seem to affect the day-to-day immunoglobulin production, we
cannot exclude that during acute and severe infections, the lower levels of IgG and the smaller
volume of the spleen could contribute to an unfavorable outcome, as pathogen clearance rate
can be improved by increasing the blood flow in the spleen, which is proportional to its size
[50].
The cellular immune response of the IGHD subjects is also similar to controls, when
assessed by skin tests for streptokinase, candidin and PPD, but controls subjects were more
likely to be positive to at least one test. The skin test papule diameter in response to
streptokinase antigen was smaller in IGHD, but the frequency of positive skin tests were not
different between IGHD and controls, as previously reported in children with acquired GHD
106
[31]. After BCG immunization, there was an increase in positivity of both groups. We could
not find any previous study on BCG vaccination and response to PPD in patients with GHD.
The normal response we found fits with the observation that there has been no report of any
cases of tuberculosis in the IGHD cohort in more than 20 years of clinical and research
activities in the community.
It is important to note that the Itabaianinha cohort subjects have lifetime, congenital
IGHD. They may therefore have some compensatory mechanism not found in acquired or
adulthood onset GHD. Furthermore, the vast majority of GHD cases are not as severe as ours.
Therefore, the results of this study may not necessarily apply to subjects in whom GHD is
acquired.
One possible limitation of the study is the relatively small sample size. There is no
good literature on immune consequences of IGHD to help a reliable power calculation. We
believe that the initial number of IGHD and control adult subjects enrolled in the clinical
questionnaire was respectable considering the rarity of IGHD (1 in 3,480 to 1 in 10,000 live
births) [51] and the rarity of identifying untreated adults. This is by far the largest cohort in
the world of adult individuals with lifetime untreated IGHD. Due to these factors, a study like
this could not be easily performed anywhere else, and due to GH treatment occurring now in
children from our cohort, never again even in Itabaianinha. Unfortunately, but
understandably, the number of individuals in the following steps was each time reduced in
function of the age criteria and immune status, and this may have reduced our ability of
detecting more subtle differences between the two groups.
In conclusion, adult subjects with lifetime, untreated IGHD do not exhibit increased
frequency of infections or a significant alteration in humoral immune response. However,
IGHD subjects present reduction of total IgG levels, smaller papule diameter after
streptokinase test, and a non-significant tendency to reduced cellular response with higher
107
frequency of all the three negative skin tests. Accordingly, the controls have a higher
frequency of one positive skin test. These differences seem without clinical relevance in daily
conditions, but may contribute to an unfavorable outcome in situations of more severe
infections.
108
Funding:
This work was supported by Foundation Research and Technological Innovation of Sergipe FAPITEC/SE/ FUNTEC/ CNPq Nº 12/ 2009 (to A.R.J).
Acknowledgments:
The authors thank the Associação do Crescimento Físico e Humano de Itabaianinha, for
assistance.
Conflict of interest:
R.S. serves in the advisory board of Novo Nordisk and Pfizer.
Ethical approval:
All procedures performed in studies involving human participants were in accordance with
the ethical standards of the institutional and national research committee and with the 1964
Helsinki declaration and its later amendments or comparable ethical standards.
109
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Figures legends
Figure 1: Response to intradermal skin test in isolated GH deficiency (IGHD) and controls:
A) Protein Purified Derived (PPD); B) streptokinase and C) candidin; n = number of
individuals in each group. The dotted line indicates the threshold of positivity (induration 5
mm or more). The horizontal bar represent the mean.
Figure 2: PPD response after 60 days of BCG vaccine in subjects who were non-reactive to
the initial PPD; n = number of individuals in each group; dots above the dashed line indicate
positives tests (induration ≥ 5 mm). p indicates the difference of the diameter of induration
between the groups
118
Table 1: Anthropometric, hormonal, serologic data and previous infectious diseases in
isolated GH deficiency (IGHD) and controls.
Age (years)
IGHD (35)
45.8 (18)
Controls (31)
47.6 (16.9)
P
0.686
Range
23 to 89
25 to 83
Men
18 (51.4%)
17 (54.8%)
0.81
Height meter
126.3 (10.3)
161.7 (9.9)
< 0.0001
Range
103 to 143
145 to 179.5
Weight Kg
38.6 (8.2)
66.2 (11.1)
Range
23.9 to 58.2
46.3 to 88.2
BMI
24.7 (7)
25.3 (3.9)
Range
15 to 47.3
18.8 to 33.2
Body Surface (m²)
1.1 (0.1)
1.7 (0.2)
Range
0.8 to 1.4
1.4 to 2.0
IGF-I ng/ml
25 (0)
128 (125)
Range
25 to 37.2
43.3 to 270
Prolactin ng/ml
6.4 (4.1)
10.9 (19)
Range
2.1 to 33.9
3.42 to 33.9
Positivity for Chagas
1
2
0.597
Chagas disease
0
1
0.469
Positivity for leishmania
2
3
0.659
Leishmaniasis disease
0
0
1.0
Hanseniasis
2
1
1.0
Recurrent tonsillitis
3
1
0.619
Child Gastroenteritis
1
2
0.586
Pneumonia
2
2
1.0
HIV positive
0
0
1.0
Hepatitis B and C
0
0
1.0
Tuberculosis
0
0
1.0
Rheumatic fever
0
0
1.0
Positivity for Tetanus
6
7
0.758
< 0.0001
0.206
< 0.0001
< 0.0001
0.34
Data are in mean (standard deviation), except for IGF-I and prolactin in median (interquartile
range)
119
Table 2: Comparison of the results of the immunoglobulin levels in isolated GH deficiency
(IGHD) and controls
IGHD
Controls
11
14
Men
7 (63.6 %)
6 (42.9 %)
0.43
Age (years)
41.1 (12.8)
45.6(11.5)
0.37
25-58
28-61
277.1 (53)
199.1 (122.7)
163.1-538.7
95.3-517
1049.9 (197.9)
1346.3 (401.9)
695-1355
471-1971.9
IgE (UI/ml)
743 (631.5)
439.9 (680.5)
Range
31.7-2001
14-2001
IgM (mg/dl)
160.5 (61.3)
141.9 (40.8)
Range
64.3-253.8
93.4-223
N
Range
IgA (mg/dl)
Range
IgG (mg/dl)
Range
P
0.11
0.03
0.26
0.40
N = number of individuals; IgA, IgG, IgE and IgM: immunoglobulins A, G, E and M; data
presented as mean (standard deviation), except the IgA values that are expressed as median
(interquartile distance).
Table 3: Comparison of the number of subjects who had all the three negative skin tests, one
positive, two positive, three positive tests and the total of positive tests between the groups.
IGHD
Controls
p
Number of subjects
21
19
Men
8 (38.1%)
6 (31.6%)
0.75
Age (years)
42.9 (13)
44.3 (11.5)
0.73
Range (years)
25-64
20-61
Negative in 3 tests
16 (76.2%)
8 (42.1%)
0.052
Positive in 3 tests
2 (9.5%)
0
0.49
Positive in 2 tests
0
2 (10.5%)
0.22
Positive in 1 test
3 (14.3%)
9 (47.4%)
0.04
Overall positive tests
9 /63 (14.3%)
13/57 (22.8%)
0.35
120
Table 4: Comparison of the results of the vaccination for hepatitis B and tetanus in isolated
GH deficiency (IGHD) and controls:
IGHD
Controls
p
Hepatitis B
N
Men
Age (years)
Range
Antibodies
(mUI/ml)
10
13
7 (70 %)
6 (46.2 %)
0.4
42.3 (12.8)
47 (10.8)
0.51
25-58
29-61
316.04 (354.6)
278.7 (361.2)
1.9-1001
1.9-1001
7 (70%)
10 (76.9%)
0.81
Range
Immune
1.0
Tetanus
11
11
Men
7 (63.6 %)
5 (45.5%)
0.67
Age (years)
41.1 (12.8)
49.4 (9.7)
0.10
25-58
32-61
2.33 (2.25)
1.75 (1.47)
0.09-5.1
0.46-4.97
7 (63.6%)
7 (63.6%)
N
Range
Antibodies (UI/ml)
Range
Immune
0.48
1.0
N = number of individuals; immunes = number of individuals who have achieved levels of
protective antibodies; data expressed as mean (standard deviation).
121
FIGURE 1
122
FIGURE 2