Dissertação de Armando Toshikatsu Tomomitsu

i
COWPEA APHID-BORNE MOSAIC VIRUS E O SEU EFEITO
NO METABOLISMO SECUNDÁRIO DO MARACUJAZEIRO
(PASSIFLORA EDULIS fo. FLAVICARPA O.Deg.)
Armando Toshikatsu Tomomitsu
Dissertação
apresentada ao
Instituto
Biológico,
da
Agência
Paulista
de
Tecnologia
dos
Agronegócios,
para
obtenção do título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio.
Área de Concentração: Manejo integrado de
pragas e doenças em ambientes rurais e
urbanos.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eiras
São Paulo
2013
i
INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
COWPEA APHID-BORNE MOSAIC VIRUS E O SEU EFEITO
NO METABOLISMO SECUNDÁRIO DO MARACUJAZEIRO
(PASSIFLORA EDULIS fo. FLAVICARPA O.Deg.)
Armando Toshikatsu Tomomitsu
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico, da Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios, para
obtenção do título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio.
Área de Concentração: Manejo integrado
de pragas e doenças em ambientes rurais e
urbanos.
Orientador: Prof Dr Marcelo Eiras
Co-orientadora: Prof. Dra. Déborah
Yara Cursino dos Santos
São Paulo
2013
i
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Núcleo de Informação e Documentação – IB
Tomomitsu, Armando Toshikatsu.
Cowpea aphid-borne mosaic vírus e o seu efeito no metabolismo secundário do maracujazeiro (Passiflora edulis fo. flavicarpa
O.Deg.). /
Armando Toshikatsu Tomomitsu. -- São Paulo, 2013.
64 p.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação.
Área de concentração: Sanidade Animal, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio
Linha de pesquisa: Manejo integrado de pragas e doenças em ambientes rurais e urbanos.
Orientador: Marcelo Eiras.
Versão do título para o inglês: Cowpea aphid-borne mosaic vírus and its effect on secondary metabolismo of the passion
flower (Passiflora edulis fo. Flavicarpa O.Deg.).
1. Potyvirus 2. CABMV 3. Passifloraceae 4. Fenóis 5. Flavonóides
I. Tomomitsu, Armando Toshikatsu II. Eiras, Marcelo III. Instituto Biológico
(São Paulo). IV. Título
IB/Bibl./2013/015
i
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
Armando Toshikatsu Tomomitsu
Título: Cowpea aphid-borne mosaic virus e o seu efeito no metabolismo secundário
do maracujazeiro (Passiflora edulis fo. flavicarpa O.Deg.)
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eiras
Dissertação apresentada ao Instituto Biológico
da Agência Paulista de Tecnologia dos
Agronegócios para obtenção do título de Mestre
em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental
no Agronegócio.
Área de Concentração: Manejo integrado de
pragas e doenças em ambientes rurais e
urbanos.
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
Prof. (a) Dr.(a):
Instituição:
Assinatura:
Prof. (a) Dr.(a):
Instituição:
Assinatura:
Prof. (a) Dr.(a):
Instituição
:
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Dedico a todos que contribuíram e acreditaram na execução deste trabalho.
i
Agradecimentos
Especialmente ao professor, orientador, e amigo Dr. Marcelo Eiras, por me aceitar
como aluno, pelos conhecimentos compartilhados, dúvidas esclarecidas, paciência,
sugestões, correções e bons momentos de descontração. Agradeço-o principalmente pela
confiança e amizade que me manteve firme e confiante durande todo o período do
mestrado.
Á professora e co-orientadora, Dra. Déborah Yara Alves Cursino dos Santos, que me
abriu as portas da fitoquímica e permitiu que eu pudesse desenvolver este trabalho.
Agradeço muito a ela pela amizade, paciência e ensinamentos. Principalmente por todas as
contribuições neste trabalho.
Ao Instituto Biológico que sempre me recebeu de braços abertos, contribuiu para a
minha formação durante a graduação e durante mestrado.
Ao Programa de Pós-graduação do Instituto Biológico, e todos os docentes e
discentes.
Aos amigos pesquisadores do Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia, por
sempre estarem dispostos a esclarecer dúvidas, pelo incentivo a sempre buscar o melhor de
mim, pela amizade e descontração durante todo o mestrado.
Aos funcionários, amigos e professores do Laboratório de Fitoquímica do Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo, que me receberam, acolheram, dividiram
experiências, conhecimentos e alegrias.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pela bolsa de mestrado
concedida.
Finalmente agradeço a Deus pela graça da vida, à minha família e à minha querida
namorada, pelo amor e carinho sempre!
i
TOMOMITSU, A.T. COWPEA APHID-BORNE MOSAIC VIRUS E O SEU EFEITO NO
METABOLISMO SECUNDÁRIO DO MARACUJAZEIRO (PASSIFLORA EDULIS fo.
FLAVICARPA O.DEG.). São Paulo-SP. 2013. Dissertação (Mestrado em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio) – Instituto Biológico.
Resumo
O maracujá-amarelo (Passiflora edulis fo. flavicarpa O.Deg.) é conhecido na
medicina popular devido às suas propriedades farmacológicas, sendo muitas delas
determinadas por metabólitos secundários tais como flavonoides. O “endurecimento dos
frutos do maracujazeiro”, induzido pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), é a
virose mais importante que afeta esta cultura no Brasil, impedindo os frutos de serem
comercializados, gerando prejuízos econômicos. Portanto, devido aos poucos trabalhos
publicados e à falta de informação sobre a influência da infecção viral na produção de
metabólitos secundários, o presente projeto teve como objetivos: (ii) avaliar os efeitos e
variações na concentração de flavonoides em folhas de P. edulis fo. flavicarpa infectadas
experimentalmente com o CABMV; (i) identificar e quantificar os principais flavonoides de
folhas de P. edulis fo. flavicarpa. Avaliaram-se três tratamentos: C – plantas controle; L1 –
plantas inoculadas com solução de sulfito de sódio 0,5% e L2 – plantas inoculadas com o
CABMV + solução de sulfito de sódio 0,5%, em dois experimentos distintos. A extração
hidro-alcoólica foi utilizada para fenóis e flavonoides totais. Cromatografias em papel e em
camada delgada foram utilizadas para avaliar a classe de flavonoides em maracujazeiroamarelo, e a cromatografia líquida de alta eficiência analítica e preparativa utilizadas para o
isolamento de flavonoides. As estruturas químicas dos flavonoides foram propostas a partir
de reações de deslocamento com reagentes ionizantes e complexantes. Os fenóis e os
flavonoides totais foram quantificados com o reagente de Folin-Ciocalteau e cloreto de
alumínio, e lidos respectivamente em espectrofotômetro com λ=760 nm e 420 nm. Os
flavonoides identificados foram quantificados por meio de curva padrão em CLAE analítica
com detector em UV-visível (DAD – Diode array detector). Foram tentativamente
identificados três flavonas glicosiladas derivadas de apigenina (C-glicosídeo de apigenina,
apigenina 6-O-glicosilado e C-glicosídeo de apigenina 7-O-Me), e um quarto flavonoide que
não pôde ser identificado. Apesar de estatisticamente não ter havido diferenças, o teor de
fenóis foi maior em L2. Os quatro flavonoides foram identificados nos tratamentos em
quantidades diferentes, porém, sem diferença estatística. O CABMV não interferiu na
quantidade de flavonoides e, portanto, aparentemente não interferiu no metabolismo
secundário do maracujazeiro-amarelo com até 90 dias após a germinação.
Palavras chave: CABMV, Potyvirus, endurecimento dos frutos, fenóis, flavonoides,
Passifloraceae.
ii
TOMOMITSU, A.T. COWPEA APHID-BORNE MOSAIC VIRUS AND ITS EFFECT ON
SECONDARY METABOLISM OF THE PASSION-FLOWER (PASSIFLORA EDULIS fo.
FLAVICARPA O.DEG.). São Paulo-SP. 2013. Dissertação (Mestrado em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio) – Instituto Biológico.
Abstract
The yellow passion fruit (Passiflora edulis fo. flavicarpa O.Deg.) is known in folk
medicine due to its pharmacological properties, many of which are determined by secondary
metabolites such as flavonoids. The "Passion fruit woodiness disease" induced by Cowpea
aphid-borne mosaic virus (CABMV), is the most important virus disease that affects the crop
in Brazil, preventing the fruits being sold and generating economic losses. Therefore, due to
the few published studies and lack of information about the influence of viral infection in the
production of secondary metabolites, this work aimed to: (ii) evaluate the effects of variations
in the concentration of flavonoids in leaves of P. edulis fo. flavicarpa inoculated with CABMV,
(i) identify and quantify the main flavonoids in leaves of P. edulis fo. flavicarpa. Three
treatments were evaluated: C - control plants; L1 - plants inoculated with solution of sodium
sulfite 0.5%; and L2 - plants inoculated with CABMV + solution of sodium sulfite 0.5%, in two
different experiments. The hydro-alcoholic extractions were used for total phenols and
flavonoids. Paper chromatography and thin layer were used to assess the class of flavonoids
in passion fruit and analytical and preparative high performance liquid cromatography was
used for the isolation of flavonoids. The chemical structures of flavonoids were proposed
from shift reactions with complexing and ionizing reagents. Total flavonoid and phenols were
quantified by the Folin-Ciocalteau reagent and aluminum chloride, and respectively read on a
spectrophotometer at λ = 760 and 420 nm. The identified flavonoids were quantified using
the standard curve in analytical HPLC with UV-visible detector (DAD - Diode array detector).
We identified three glycosides flavones from apigenin (C-apigenin glycoside, apigenin 6-Oglycoside, and C-glycoside apigenin 7-O-Me) and a fourth flavonoid which could not be
identified. Although there were no statistically differences, the phenol content was higher in
L2. The four flavonoids were identified in treatments in different amounts, however with no
statistical difference. The CABMV did not interfere with the amount of flavonoids, and
therefore apparently did not affect the secondary metabolism of yellow passion fruit with up
to 90 days after germination.
Keywords: CABMV, Potyvirus, woodiness disease, phenols, flavonoids, Passifloraceae.
iii
Lista de figuras
Figura 1 – Estrutura molecular de um flavonoide (flavona) [modificado de Zeraik et al.
(2010)]......................................................................................................................................... 8
Figura 2 – Biossíntese de flavonoides a partir de fenilpropanoides e moléculas de acetil-CoA
[modificado de DAVIES; SCHWINN (2006)] .............................................................................. 9
Figura 3 – Estrutura química dos quatro principais flavonoides de Passiflora [modificado de
Zucolotto et al. (2011)].............................................................................................................. 11
Figura 4 - Representação esquemática do genoma de RNA de fita simples dos Potyvirus
indicando as diferentes proteínas (P1, HC-Pro, P3, CI, VPg, Pro, NIb, CP) que sofrem
processamento pós-traducional [adaptado de Shukla (2004) com inclusão da PIPO,
identificada por Chung et al. (2008)] ........................................................................................ 13
Figura 5 - Sintomas de mosaico, bolhas e distorção foliar induzidos pelo CABMV em
maracujazeiro-amarelo (A, B); e sintomas de anéis cloróticos induzidos pelo CABMV em
maracujazeiro-doce (C). (Fotos: Marcelo Eiras) ...................................................................... 14
Figura 6 - Delineamento experimental 1; Lotes de maracujazeiro “IAC-277”, C – plantas sem
tratamento; L1 – plantas fricionadas com solução sulfito de sódio 0,5%; L2 – plantas
inoculadas mecanicamente com CABMV em presença de solução sulfito de sódio 0,5%; R –
repetição (6 plantas) ................................................................................................................. 17
Figura 7 - Delineamento experimental 2; Lotes de maracujazeiro “IAC-277”, C – plantas sem
tratamento; L1 – plantas fricionadas com solução sulfito de sódio 0,5%; L2 – plantas
inoculadas mecanicamente com CABMV em presença de solução sulfito de sódio 0,5%; R –
repetição (4 plantas) ................................................................................................................. 17
Figura 8 – Extração de flavonoides totais; contorno vermelho – repetidos por 3 vezes;
contorno amarelo – repetido por 5 vezes ................................................................................ 20
Figura 9 – Curva-padrão de ácido p-cumárico ....................................................................... 26
Figura 10 – Curva-padrão de quercetina ................................................................................ 26
Figura 11 – Curva-padrão de vitexina ..................................................................................... 26
Figura 12 - Médias da concentração de fenóis e flavonoides totais nas folhas de Passiflora
edulis fo. flavicarpa (Experimento 1): C – Controle; L1 – solução de sulfito de sódio; L2 CABMV em presença de solução de sulfito de sódio .............................................................. 27
Figura 13 - Quantificação dos flavonoides identificados em Passiflora edulis fo. flavicarpa . 35
iv
Lista de tabelas
Tabela 1: Volume, massa e concentração de ácido p-cumárico usado no preparo da curvapadrão em espectrofotômetro. ................................................................................................. 20
Tabela 2: Volume, massa e concentração de quercetina usados no preparo da curva-padrão
em espectrofotômetro............................................................................................................... 21
Tabela 3: Volume, massa e concentrações de vitexina usados na preparação da curvapadrão em CLAE. ..................................................................................................................... 22
Tabela 4: Média (±DP) das diferenças entre alturas (cm) de cada tratamento. C – Controle;
L1 – solução de sulfito de sódio; L2 - CABMV em presença de solução de sulfito de sódio.
Valores seguidos de mesma letra não apresentam diferenças significativas (α=5%). .......... 25
Tabela 5: Teor (μg/mg de folha seca) de fenóis e flavonoides totais nos extratos metanólicos
das folhas do maracujazeiro-amarelo do experimento 1. C – Controle; L1 – solução de sulfito
de sódio; L2 - CABMV em presença de solução de sulfito de sódio. Os valores
correspondem a média ± DP. Valores seguidos de mesma letra não apresentam diferenças
significativas (α=5%). Fenóis (p=0,4704). Flavonoides (p=0,3477). ....................................... 27
Tabela 6: Teor (μg/mg de folha seca) de cada flavonoide isolado (em padrões de vitexina),
nos extratos metanólicos das folhas do maracujazeiro do experimento 2. C – Controle; L1 –
solução de sulfito de sódio; L2 - CABMV em presença de solução de sulfito de sódio. Os
valores correspoondem a médias ± DP. Valores seguidos de mesma letra em colunas não
apresentam diferenças significativas (α=5%). ......................................................................... 35
v
Lista de abreviações: siglas e símbolos
Abs
AlCl3
BAW
C
CABMV
CCD
CLAE
cm
Da
DAD
DAG
DAI
DP
EFM
EPAW
eV
g
h
H3BO4
ha
HCl
HOAc
HPLC
K
L
M
mAU
MeOH
mg
min
mL
EM
N
NaOAc
NH3
NH4OH
nm
o
C
PVPP
r2
Rf
RT
UV
λ
μg
μL
absorbância
cloreto de alumínio
butanol: ácido acético: água
carbono
Cowpea aphid-borne mosaic virus
Cromatografia em Camada Delgada
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
centímetros
Dáltons
Diode Array Detector
dias após a germinação
dias após a inoculação
Desvio padrão
Endurecimento dos frutos do maracujazeiro
acetato de etila:piridina:ácido acético: água
elétron volt
grama
hora
ácido bórico
hectare
ácido clorídrico
ácido acético
High Precision Liquid Cromatography
kilo
litro
molar
abundância
metanol
miligrama
minuto
mililitro
Espectrometria de Massas
normalidade
acetato de sódio
amônia
hidróxido de amônio
nanômetro
graus Celsius
polivinilpolipirrolidona
fator de correlação
relação de frente
tempo de retenção
ultravioleta
comprimento de onda
micrograma
microlitro
i
Sumário
Lista de figuras ...................................................................................................................................... iii
Lista de tabelas...................................................................................................................................... iv
Lista de abreviações: siglas e símbolos................................................................................................... v
1.
Introdução ...................................................................................................................................... 1
2.
Revisão de literatura ..................................................................................................................... 3
3.
2.1
Classificação botânica ............................................................................................................. 3
2.2
Importância econômica .......................................................................................................... 4
2.3
Princípios farmacológicos, uso medicinal e metabólitos secundários .................................... 6
2.4
Flavonoides ............................................................................................................................ 7
2.5
Viroses do maracujazeiro ..................................................................................................... 12
Material e Métodos ...................................................................................................................... 16
3.1
Local de realização dos experimentos e material biológico.................................................. 16
3.2
Fonte do isolado viral ........................................................................................................... 16
3.3
Transmissão mecânica .......................................................................................................... 16
3.4
Delineamento experimental ................................................................................................. 16
3.5
Avaliação do crescimento ..................................................................................................... 18
3.6
PTA - ELISA (Plate Traped Antigen – Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ....................... 18
3.7
Substâncias fenólicas e flavonoides...................................................................................... 19
3.7.1
Extração ........................................................................................................................ 19
3.7.2
Quantificação de fenóis e flavonoides .......................................................................... 20
3.7.3
Cromatografias ............................................................................................................. 22
3.7.4
Reações de deslocamento ............................................................................................ 23
3.7.5
Hidrólise ácida .............................................................................................................. 24
3.8
4.
Análise estatística ................................................................................................................. 25
Resultados .................................................................................................................................... 25
4.1
Transmissão mecânica .......................................................................................................... 25
4.2
Avaliação do crescimento ..................................................................................................... 25
4.3
Quantificação de fenóis e flavonoides totais ........................................................................ 25
4.4
Flavonoides identificados ..................................................................................................... 27
4.4.1
Reações de deslocamento ............................................................................................ 28
4.4.2
Quantificação dos flavonoides isolados ........................................................................ 35
5.
Discussão ...................................................................................................................................... 36
6.
Conclusões ................................................................................................................................... 40
7.
Referências Bibliográficas............................................................................................................. 41
1
1. Introdução
O gênero Passiflora L. (Passifloraceae, tribo Passiflorieae) possui aproximadamente
520 espécies, distribuídas principalmente em regiões tropicais e subtropicais, sendo cerca
de 150 espécies do Brasil (CERVI, 2005). Das espécies já descritas, Passiflora edulis fo.
flavicarpa O.Deg. (maracujá-amarelo ou maracujá-azedo), P. edulis fo. edulis Sims
(maracujá-roxo), P. alata Curtis (maracujá-doce), P. ligularis Juss. e P. quadrangularis L. são
as mais difundidas e cultivadas comercialmente (MELETTI, 2011).
O mercado de frutas é um dos mais prósperos do território brasileiro, principalmente
devido às condições climáticas favoráveis, que aliadas às inovações tecnológicas, tornam o
maracujá-amarelo uma fonte de renda para o pequeno produtor durante o ano todo, com
mercado voltado para o consumo de fruto in natura e a produção de suco concentrado. O
Brasil é o maior produtor mundial de maracujá-amarelo, com aproximadamente 62.019 ha
de área cultivada (AGRIANUAL, 2013), sendo a região nordeste a maior produtora
(MELETTI, 2011). No entanto, esta cultura está sujeita a doenças de origem fúngica,
bacteriana, às causadas por fitoplasmas, nematoides e, principalmente, àquelas induzidas
por vírus (ANJOS et al., 2001, CHAGAS; COLARICCIO, 2006, FISCHER; REZENDE, 2008).
O “Endurecimento dos Frutos do Maracujazeiro” (EFM), principal doença que afeta
os cultivos de maracujá, no Brasil é atribuído ao Cowpea aphid-borne mosaic virus
(CABMV), que causa o endurecimento do pericarpo, impedindo os frutos de serem
comercializados e gerando queda na produção, perda da qualidade e prejuízos econômicos
(PERUCH et al., 2009). A elevada incidência dessa virose se dá pela não disponibilidade de
variedades comerciais resistentes, e ao fracasso de outras medidas de controle, o que
acarreta em perdas na produção e torna a cultura, originalmente considerada semiperene,
uma cultura anual. Essa mudança leva muitos produtores de maracujá a migrarem para
novas regiões ou abandonar o cultivo. A indisponibilidade de variedades de maracujazeiro
comerciais resistentes ao CABMV (MACIEL et al., 2009) também levanta a possibilidade de
desenvolvimento de outras táticas de manejo da cultura, principalmente levando-se em
conta um possível convívio com a doença no campo.
Além de serem consumidas in natura e utilizadas na produção de suco concentrado,
as espécies de maracujazeiro também são consideradas alimentos funcionais devido às
suas propriedades antioxidantes e medicinais, com uso no tratamento de ansiedade e
irritação (NODARI;GUERRA, 2000; DHAWAN et al., 2004). As espécies de maracujás
descritas nas farmacopeias internacionais são: maracujá-vermelho (P. incarnata L.),
maracujá-doce (P. alata) e maracujá-amarelo (P. edulis f. flavicarpa), sendo recomendada a
infusão de suas partes aéreas (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1977; PHARMACOPÉE
FRANÇAISE,
1980;
PHARMACOPOEIA
HELVETICA,
1987;
EUROPEAN
2
PHARMACOPOEIA, 1996; FARMACOPOEA UFFICIALE DELLA REPUBLICA ITALIANA,
1998; ANVISA, 2010).
No Brasil, apenas duas espécies de maracujás são de interesse comercial, P. edulis
utilizada na produção de suco, e P. alata para consumo in natura. Esta última também é
explorada comercialmente como ornamental e o extrato de suas folhas é utilizado na
formulação de alguns fitoterápicos (DOYAMA et al., 2005). Diversos experimentos in vivo
têm sido realizados a fim de atribuir as atividades farmacológicas a um único composto de
Passiflora sp., mas é provável que esses efeitos sejam resultados do sinergismo de alguns
flavonoides e alcaloides (POZZI, 2007).
A maioria dos fármacos denominados popularmente de “maracujinas”, com efeito
calmante, é produzida a partir de extratos foliares de Passiflora incarnata (maracujávermelho). Alguns desses medicamentos comerciais, como o Tensart® (Myralis Pharma), o
Floriny®, o Calman® (Ativus Farmacêutica) e o Calmiplan® (Bunker), trazem informações
referentes à sua composição, com destaque para a presença de flavonoides e alcaloides.
Os experimentos do presente projeto foram realizados com Passiflora edulis fo.
Flavicarpa O.Deg. (maracujá-amarelo), pois esta espécie é a mais difundida, cultivada e
comercializada no Brasil (ZERAIK et al., 2010) e no mundo (LI et al., 2011), não somente
devido à sua importância econômica no segmento da indústria alimentícia, como também
por ser a mais promissora para os interesses farmacológicos, uma vez que apresenta as
maiores concentrações e rendimento na extração de flavonoides (PARIS et al., 2002) e
alcaloides (LUTOMSKI; MALEK, 1976).
Os trabalhos científicos publicados que abordam o cultivo dessa planta frutífera
descrevem aspectos relacionados à fitotecnia e fitopatologia como a obtenção de novas
variedades, manejo de plantas daninhas, irrigação, epidemiologia, a influência dos fatores
abióticos no desenvolvimento, nutrição mineral, etc. A respeito dos metabólitos secundários,
os trabalhos são focados na identificação de novas moléculas e nas atividades
farmacológicas de seus flavonoides e alcaloides em mamíferos. Entretanto, não há
trabalhos científicos na literatura que abordem a influência da infecção viral sobre os
metabólitos secundários de Passiflora edulis fo. flavicarpa. É importante destacar que a
maioria das substâncias com atividades biológicas faz parte do metabolismo secundário das
plantas, o qual pode ser afetado quantitativa e/ou qualitativamente por fatores bióticos, como
infecções virais (HUDAIB et al., 2001).
De maneira geral há poucos trabalhos que abordam efeitos da infecção viral sobre o
metabolismo secundário das plantas hospedeiras. Kreft et al. (1999) relataram uma
diminuição do flavonoide rutina em batatas suscetíveis ao Potato virus Y NTN (PVYNTN,
Potyvirus), Hudaib et al. (2001) verificaram uma diminuição no rendimento do óleo volátil de
Salvea sclarea L. infectada com o Broad bean wilt virus (BBWV, Fabavirus), Bruni et al.
3
(2006) concluíram que a infecção pelo Alfalfa mosaic virus (AMV, Alfamovirus), subgrupos I
e II, diminui a produção de óleos voláteis em Lavandula spp.; Duarte et al. (2008)
constataram a diminuição de compostos fenólicos e alcaloides em folhas de Datura
stramonium L. inoculadas com o Potato virus X (PVX, Potexvirus). Ajmal et al. (2011)
relataram que variedades de algodão suscetíveis ao Cotton leaf curl virus (CLCuV,
Begomovirus) tiveram a quantidade de compostos fenólicos, carotenoides, clorofila a e b, e
clorofilas totais, reduzidas; Nagai et al. (2011) observaram a diminuição na produção de
metileugenol em manjericão naturalmente infectado, e Vega et al. (2011) verificaram, a partir
do transcriptoma de Vitis vinifera L. infectada com o Grapevine leaf-roll-associated virus 3
(GLRaV-3, Ampelovirus), uma redução da síntese de antocianinas. Lu et al. (2012) ao
estudarem o transcriptoma de tabaco infectado com o Cucumber mosaic virus (CMV,
Cucumovirus) sugeriram que alterações no metabolismo de pigmentos é responsável pelo
desenvolvimento dos sintomas.
O conhecimento da influência da infecção do CABMV sobre o metabolismo
secundário do maracujazeiro, caso seja positiva, poderá oferecer uma alternativa frente à
desvalorização dos frutos, com a possibilidade de comercialização das folhas de
maracujazeiro, mesmo que infectado por vírus, para a extração de moléculas bioativas para
a indústria farmacêutica. Apesar das metodologias para o controle de qualidade de drogas e
das preparações farmacêuticas existentes, tanto para a espécie oficial da Farmacopeia
Brasileira, como para as outras espécies nativas do Brasil (FÁVERO; PAVAN, 2002; POZZI,
2007), recomendarem o uso de plantas sadias, não existem estudos sobre qualidade de
fármacos versus infecção viral.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivos: (ii) avaliar os efeitos e variações
na concentração de flavonoides em folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa (maracujáamarelo) infectadas experimentalmente com o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV,
Potyvirus); (i) identificar e quantificar os principais flavonoides de folhas de Passiflora edulis
fo. flavicarpa.
2.
Revisão de literatura
2.1
Classificação botânica
O maracujazeiro (Passiflora spp.) é uma planta trepadeira, sublenhosa, que produz
frutos em bagas, e pertence à Malpighales, Passifloraceae, Passiflorae, (CUNHA et al.,
2004). As formas de passiflora descritas são todas sinônimas, o nome aceito segundo a
Lista do Brasil seria Passiflora edulis Sims. No presente trabalho será utilizada Passiflora
edulis fo. flavicarpa O.Deg. para designar o maracujazerio-amarelo. Passifloraceae abrange
cerca de 20 gêneros e 600 espécies distribuídas em regiões de clima quente, como nas
4
Américas e na Ásia (SOUZA; LORENZI, 2005), sendo Passiflora o gênero mais rico com
cerca de 520 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, das quais 150 são
nativas do Brasil (CERVI, 2005) e destas, 79 são da região Centro-Norte (RUGGIERO,
1987).
No Brasil, as espécies de Passiflora são conhecidas como “maracujá”, palavra de
origem tupi (maraú-ya) que significa “fruto de sorver” ou “alimento em formato de cuia”
(TEIXEIRA, 1994; FONSECA, 2008). A utilização de Passiflora na medicina pela primeira
vez é atribuída ao pesquisador espanhol Monardus em 1569 no Peru, onde as belas flores
foram consideradas por ele como símbolo da Paixão de Cristo (TAYLOR, 1996). O nome
Passiflora provém do significado místico atribuído às características físicas de suas flores,
as quais foram interpretadas pelos escritores do século XVI como estigmas referentes à
Paixão de Jesus Cristo. Passiflora provém do latim passio e flos oris, equivalente à paixão e
à flor, respectivamente. Por essa razão é conhecida na Europa e América do Norte como
flor da paixão (BARROSO et al., 1978; FREITAS, 1985; ALONSO, 1998).
As
espécies
de
Passiflora
são
cultivadas
por
seus
frutos
comestíveis.
Comercialmente as mais difundidas são: Passiflora edulis Sims fo. flavicarpa O.Deg.
(maracujá-amarelo ou azedo), P. edulis fo. edulis Sims (maracujá-roxo), P. alata Curtis
(maracujá-doce), P. ligularis Juss. e P. quadrangularis L. (SÃO JOSÉ, 1994; SOUZA;
BRUCKNER, 1997; MELETTI, 1997).
2.2
Importância econômica
A fruticultura é um dos investimentos mais atrativos da agricultura brasileira, devido
às condições de clima favoráveis do país, que permite a produção de frutas durante o ano
inteiro e a geração de renda em áreas relativamente pequenas (NASCIMENTO, 2003).
Mudanças nos padrões de demanda da sociedade, acompanhadas por inovações
tecnológicas, têm permitido o crescimento do mercado de frutas e derivados, a taxas
superiores à dos demais produtos agrícolas (ANDRADE et al., 2010). Assim, a cultura do
maracujá tem ocupado uma posição de destaque na fruticultura brasileira, mesmo quando
comparado a outras frutas tropicais com maior tradição de consumo (MELETTI et al., 2010).
O maracujazeiro apresenta grande diversidade genética e funcional, além de ter
grande importância agrícola. O gênero Passiflora também tem suas aplicações na indústria
farmacêutica e cosmética, sendo que algumas espécies apresentam potencial ornamental,
como Passiflora caerulea L. e P. incarnata L. (PEIXOTO, 2005). Porém, o maracujáamarelo, P. edulis fo. flavicarpa, é a espécie comercialmente mais cultivada no Brasil.
Acredita-se que esta espécie tenha sido resultado do cruzamento entre P. edulis e uma
5
espécie mais próxima, possivelmente P. ligularis, ou uma mutação em P. edulis, ou ainda
seria uma forma mutante originária da Austrália (OLIVEIRA; FERREIRA, 1991).
A partir do final da década de 1960 ocorreu grande expansão da cultura do
maracujazeiro no Brasil. A produção de maracujá possui grande importância econômica e
social, sendo que o Brasil, atualmente, ocupa a primeira posição em termos de produção
mundial, com cultivos em quase todos os estados da federação (MELETTI et al., 2010;
AGRIANUAL, 2013). Apesar do investimento inicial elevado, o pequeno produtor encontra
na cultura do maracujá uma base de sustentação para a sua família e sua propriedade e
uma opção técnica economicamente viável, que o leva a contar o ano inteiro com uma
pequena produção. Foi assim que a cultura se desenvolveu, e, até hoje, a agricultura
familiar tem sido responsável pela expansão dos pomares comerciais (MELETTI, 2011).
Assim, a cultura do maracujá desempenha uma função social importante e garante um nível
de emprego razoável no campo e na indústria (SOUZA; MELETTI, 1997; MELETTI, 2011).
Em 1975, os estados da Bahia e Minas Gerais eram responsáveis por 55% da
produção nacional. Em 1993, os principais estados produtores eram: Pará, São Paulo,
Minas Gerais, Bahia, Rio de Janeiro e Sergipe, que representavam 97% de toda a produção
nacional (revisado por NASCIMENTO et al., 2006). Em 2003, os estados da Bahia, Espírito
Santo, São Paulo e Rio de Janeiro eram os principais produtores e representavam
aproximadamente 57% da produção nacional. Atualmente, o Brasil apresenta produção de
920 mil toneladas numa área aproximada de 62.019 ha (AGRIANUAL, 2013). As regiões
Nordeste, Sudeste e Norte são responsáveis por 94% da produção nacional, com
estimativas de 47.677, 7.130 e 4.213 hectares de área colhida, respectivamente, e o estado
da Bahia é o maior produtor nacional, seguido do Ceará, Espírito Santo, São Paulo, Rio de
Janeiro e Sergipe (IBGE, 2009; PERUCH et al., 2009; AGRIANUAL, 2013).
O maracujazeiro pode ser propagado por sementes ou vegetativamente, por enxertia
ou estaquia (GRATTAPAGLIA et al., 1991; SÃO JOSÉ et al., 1994). Na propagação por
sementes ocorre a polinização cruzada, ou seja, há o desenvolvimento de indivíduos
distintos com variabilidade genética, o que leva a formação de pomares heterogêneos. A
propagação vegetativa pode ser utilizada em programas de melhoramento genético e
permite a formação de pomares mais uniformes, já que seleciona e multiplica plantas com
alta produtividade (GRATTAPAGLIA et al., 1991; SOUZA; MELETTI, 1997).
Apesar da importância econômica e social para o país, o cultivo do maracujazeiro
ainda é prejudicado devido a problemas fitossanitários que resultam em rendimentos
limitados. O rendimento médio é de 22 a 28 t/ha (FNP, 2007), e pode atingir 50 t/ha, quando
os produtores lançam mão da utilização de sementes melhoradas, tecnologia de produção e
tratos culturais adequados (MELETTI; MAIA, 1999).
6
2.3
Princípios farmacológicos, uso medicinal e metabólitos secundários
Além de ser consumido in natura e de seus frutos serem utilizados na produção de
suco concentrado, o maracujá é conhecido na medicina popular devido às suas
propriedades farmacológicas e toxicológicas (depressiador do Sistema Nervoso Central):
antioxidantes, sedativas, anti-inflamatórias, antiespasmódicas, ansiolíticas, antitumorais e
antifúngicas (NODARI et al., 2000; DHAWAN et al., 2004; PATEL, 2009; ZERAIK et al.,
2010), propriedades estas atribuídas a compostos presentes nos frutos, cascas, sementes e
folhas (PIO CORRÊA, 1978; SACCO, 1980; PARIS et al., 2002; ZERAIK et al., 2010). Os
estudos referentes à composição química de diversas espécies de Passiflora evidenciam
alcaloides, flavonoides, saponinas, esteroides, lignanas, ácidos graxos, taninos, glicosídeos
cianogênicos (SEIGLER et al., 1982), maltol (AOYAGI et al., 1974), aminoácidos
(GAVASHELI et al., 1986), e glicosídeos fenólicos (CHASSANGNE et al., 1997).
Na revisão de Zeraik et al. (2010), os autores descrevem os principais estudos
farmacológicos e toxicológicos relacionados aos frutos, cascas e sementes das espécies de
Passiflora mais cultivadas no Brasil. A atividade antioxidante dos frutos é atribuída aos
polifenóis, principalmente aos flavonoides. As cascas do maracujá, antes consideradas
resíduo agroindustriais, agora são utilizadas na alimentação animal e humana, pois são
ricas em fibras solúveis, principalmente em pectina. Além disso, a farinha de cascas secas
de maracujá também é utilizada como redutora de glicemia. As sementes, por sua vez, são
boas fontes de ácidos graxos essenciais, utilizados nas indústrias alimentícias e cosméticas
[ex: ácido linoleico (ω-6) (55-66%), ácido oleico (18-20%) e ácido palmítico (10-14%)]. Já os
aspectos toxicológicos do maracujá são associados à presença de glicosídeos
cianogênicos, principalmente a prunasina, substâncias que produzem ácido cianídrico
(HCN) como produto da sua hidrólise. Os autores também descrevem as propriedades
alimentícias do suco do maracujá atribuídas a açúcares, fibras, ácidos orgânicos,
aminoácidos, carotenoides, vitaminas, substâncias voláteis, flavonoides e alcaloides. Em
outra revisão, Patel et al. (2009) listam os principais fitoconstituintes de Passiflora edulis e
os aspectos farmacológicos dessa espécie. A atividade anti-inflamatória foi atribuída à
fração aquosa e butanólica em modelos in vivo; a atividade anti-hipertensiva e antioxidante,
à fração metanólica, em que se concentram os polifenóis; a atividade antitumoral ao extrato
aquoso; e atividade antifúngica a peptídeos de carga positiva de baixo peso molecular.
Alguns autores investigaram o perfil de utilização de fitoterápicos pela população
brasileira e evidenciaram que Passiflora está entre os mais utilizados (RIBEIRO et al., 2005;
SILVA et al., 2006; MARLIÉRE et al., 2008). A presença desses compostos também pode
indicar o potencial do maracujá como um alimento funcional, já que podem prevenir curar
e/ou auxiliar na recuperação de determinadas doenças (CULHANE, 1995). Dentre os
7
diversos tipos de alimentos funcionais destacam-se aqueles que contêm substâncias
antioxidantes, tais como a vitamina-C, vitamina-E, carotenoides e flavonoides (HOLLMAN;
KATAN, 1999).
Folhas secas de maracujá-vermelho (P. incarnata), maracujá-doce (P. alata), e
maracujá-amarelo (P. edulis fo. flavicarpa) são descritas para uso medicinal; a primeira nas
Farmacopeias Europeia, Francesa, Italiana e Helvetica (PHARMACOPÉE FRANÇAISE,
1980; PHARMACOPOEIA HELVETICA, 1987; EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 1996;
FARMACOPOEA UFFICIALE DELLA REPUBLICA ITALIANA, 1998), e as duas últimas na
Brasileira (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1977; ANVISA, 2010). Como medicamento é
comercializado em extrato fluido de P. incarnata. Há relatos do uso de P. edulis em regiões
da América do Sul e Índia como sedativo, diurético, antihelmíntico e no tratamento da
hipertensão arterial (DHAWAN et al., 2004). Apesar do grande número de espécies
descritas, somente P. alata, P. edulis e P. incarnata foram investigadas com relação à sua
composição química e farmacológica, sendo identificados diferentes alcaloides, flavonoides
glicosilados, ácidos fenólicos e glicosídeos cianogênicos (ANTOGNONI et al., 2007; PATEL,
2009). Portanto, as propriedades farmacológicas e medicinais das espécies de Passiflora
são determinadas, principalmente, por diferentes metabólitos secundários.
2.4
Flavonoides
Dentre os metabólitos secundários presentes no maracujá, os flavonoides (Figura 1)
estão entre os compostos fenólicos mais importantes, diversificados (ZUANAZZI, 2001) e
utilizados no controle de qualidade de fitoterápicos (QUERCIA et al., 1978). Diversas
funções são atribuídas aos flavonoides nas plantas, tais como: proteção contra raios
ultravioletas (flavonas e flavonois), proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias,
atrativos de insetos polinizadores (antocianinas), ação antioxidante, controle de ação de
hormônios vegetais, atividade alelopática e inibidores de enzimas (ZUANAZZI, 2001). Em
mamíferos, os flavonoides apresentam vários efeitos biológicos e terapêuticos, incluindo
atividade antibacteriana, antiviral, anti-inflamatória, antialérgica e vasodilatadora (ZERAIK et
al., 2010). Além disso, estas substâncias inibem a peroxidação lipídica e reduzem o risco de
doenças cardiovasculares, efeitos estes relacionados à sua atividade antioxidante,
caracterizada pela capacidade de sequestrar radicais livres em organismos vivos
(HAVSTEEN, 1983; COOK & SAMMAN, 1996; HOLLMAN et al., 1996; HOLLMAN; KATAN,
1997; HOLLMAN; KATAN, 1999).
8
Figura 1 – Estrutura molecular de um flavonoide (flavona) [modificado de Zeraik et al. (2010)]
Quimicamente os flavonoides (Figura 1) são moléculas de quinze átomos de
carbono, C6-C3-C6, que contém dois anéis benzênicos (A e B) ligados por uma cadeia de
três átomos de carbono (2,3,4), e que pode formar ou não um terceiro anel heterocíclico
central C (MARKHAM, 1982). O anel A dos flavonoides é derivado de três unidades de
acetato condensadas, já o anel B e os três átomos de carbonos centrais são derivados do
ácido cinâmico. São produtos de biossíntese mista, das vias do ácido chiquímico e do
acetato-malonato (HAHLBROCK; GRISEBACH, 1975; WONG, 1976). O primeiro flavonoide
a ser produzido é uma chalcona, e a partir dela todos os demais flavonoides serão
produzidos (VICKERY; VICKERY, 1981).
A chalcona é formada por ésteres de ácidos hidroxicinâmicos-Coenzima A,
normalmente 4-cumarolil-CoA, em três reações sequenciais envolvendo moléculas
extensoras de malonil-CoA provenientes da via do acetato-malonato. A molécula de malonilCoA provém de acetil-CoA, catalisada pela enzima acetil-CoA carboxilase (ACC). Por sua
vez a molécula de 4-cumarolil-CoA é produzida a partir do aminoácido fenilalanina, molécula
precursora da via metabólica dos fenilpropanoides. Esta sofre diversas conversões
enzimáticas catalizadas pelas enzimas fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato-4hidroxilase (C4H) e 4-cumarato-Coa-ligase (4CL). Finalmente, a primeira chalcona
(narigenina-chalcona) é produzida pela reação de três unidades de malonil-CoA com uma 4cumarolil-CoA, catalisadas pela chalcona sintase (CHS). Uma vez produzida, a narigeninachalcona será precursora de auronas, flavonas, flavanonas, dihidroxiflavonois, flavonois e
antocianinas. Inicialmente a narigenina chalcona é transformada em narigenina-flavanona
por meio da chalcona isomerase (CHI). A primeira flavona (apigenina) é formada por meio
da narigenina-flavanona, por meio da flavona sintase I e II (FNSI, FNSII). Dihidroxiflavonois
são sintetizados pela flavanona-3β-hidroxilase (F3H), este por sua vez, forma o primeiro
flavonol (campferol) pela flavonol-sintase (FLS) (Figura 2) (DAVIES; SCHWINN, 2006).
9
Figura 2 – Biossíntese de flavonoides a partir de fenilpropanoides e moléculas de acetil-CoA
[modificado de DAVIES; SCHWINN (2006)]
Flavonoides ligados a açúcares (glicosídeos) são mais estáveis e armazenados no
interior dos vacúolos da célula vegetal, sem interferir nos processos metabólicos. Os
monossacarídeos
comumente
encontrados
são:
D-glicose,
D-galactose,
D-ácido
10
glucurônico, D-xilose, L-ramnose, L-arabinose e D-apiose, podendo também ser
encontrados di- e trissacarídeos. Quanto ao padrão de glicosilação, os flavonoides podem
ser O-glicosilados ou C-glicosilados (VICKERY; VICKERY, 1981; MARKHAM, 1982). Ometilações tornam as hidroxilas dos flavonoides menos reativas, além de aumentarem a sua
lipossolubilidade. Agliconas O-metiladas são encontradas nas superfícies foliares, podendo
estar relacionadas a adaptações ao meio ambiente (WOLLENWEBER et al., 1987).
Flavonoides O-glicosilados são os mais abundantes, nos quais um ou mais açúcares
estão ligados a uma hidroxila do núcleo flavônico por uma ligação hemiacetálica, facilmente
destruída por hidrólise ácida. Apesar de qualquer hidroxila do núcleo flavônico poder ser
glicolisada, na verdade certas posições têm maior probabilidade de ligação do que as outras
(7-hidroxi em flavonas, isoflavonas e dihidroflavonas; 3- e 7- hidroxi nos flavonois e
dihidroflavonois; e 3- e 5- hidroxi nas antocianidinas) (MARKHAM, 1982).
Os flavonoides encontrados em Passiflora são principalmente do tipo C-glicosídeos,
nos quais os açúcares apresentam pouca diferenciação, sendo a glicose o principal, ligados
diretamente ao núcleo flavônico por uma ligação carbono-carbono, resistente à hidrólise,
apenas nas posições 6- e 8- do núcleo dos flavonoides (MARKHAM, 1982; JAY, 1996). Os
mesmos
possuem
atividade
biológica,
são
de
interesse
quimiotaxonômico,
e
frequentemente são utilizados como “marcadores” na análise de medicamentos fitoterápicos
derivados de maracujás (MARKHAM, 1982; PEREIRA; VILEGAS, 2000; ZERAIK et al.,
2010).
Dhawan et al. (2001) consideraram os flavonoides como o maior grupo de
constituintes já pesquisados em Passiflora, sendo derivados da luteolina e apigenina
(GEIGER; MARKLAN, 1986) (Figura 3). Ulubelen et al. (1982) trabalhando com três
espécies relataram os seguintes flavonoides: em P. pittieri Mast. Isovitexina, 2”xilosilvitexina, luteolina-7-O-glicosídeo, e uma mistura de vicenina-2, escaftosídeo e
isoescaftosídeo; em P. alata, 2”-xilosilvitexina, vitexina, isovitexina e orientina; e saponarina
em P. ambigua. Antognoni et al. (2007) descreveram derivados C-glicosilados de apigenina
(escaftosídeo, isoescaftosídeo, isovitexina e vitexina) e luteolina (isoorientina e orientina)
como os principais flavonoides detectados nessas espécies. Em P. incarnata, Rahman et al.
(1977) Proliac & Reynaud (1988), e Li et al. (1991), relataram a presença de C-glicosil
escaftosídeo, isoescaftosídeo, isovitexina-2’-O-glucopiranosídeo, orientina, isoorientina,
isoorientina-2’-O-glucopiranosídeo, suertisina, isoscopain-2”-O-glicosídeo, quercetina e
campferol. Mareck et al. (1991), Raffaelli et al. (1997), Abourashed et al. (2002), Muller et al.
(2005), Coleta et al. (2006), e Zucolotto et al. (2009), também descreveram flavonoides Cglicosilados em extratos de folhas de P. incarnata, P. edulis e P. alata, e Paris et al. (2002)
relataram que o extrato aquoso de folhas de P. edulis continha o dobro de flavonoides do
que em P. alata. Xu et al. (2013) detectaram em caules e folhas de P. edulis quatro novos
11
2,6-dideoxihexose-C-glicosil flavonas, incluindo luteolina-8-C-β-digitoxipiranosil-4’-O-β-Dglucopiranosídeo, apigenina-8-C-β-digitoxipiranosídeo, apigenina-8-C-β-boivinopiranosídeo
e luteolina-8-C-β-boivinopiranosídeo, junto com outros cinco compostos não identificados.
Oga et al. (1984) encontraram o flavonoide rutina em P. alata por meio de cromatografia em
camada delgada (CCD) e, Freitas (1985), utilizando o mesmo método, identificou em P.
incarnata, P. edulis, P. alata e P. quadrangularis quatro flavonoides principais: isoorientina,
orientina, isovitexina e vitexina.
Flavonoide
Orientina
Isoorientina
Isovitexina
Vitexina
Aglicona
Luteolina
Luteolina
Apigenina
Apigenina
R1
H
Glicose
Glicose
H
R2
Glicose
H
H
Glicose
R3
OH
OH
H
H
Figura 3 – Estrutura química dos quatro principais flavonoides de Passiflora [modificado de Zucolotto
et al. (2011)]
As atividades farmacológicas: ansiolíticas, anti-inflamatórias, antiespasmódicas,
antimicrobianas e antioxidantes, são atribuídas principalmente a vitexina e isovitexina
(MÜLLER et al., 2005).
Lutomski et al. (1975), após administrarem sucos de P. edulis fo. flavicarpa e P.
edulis fo. edulis a camundongos, observaram diminuição significativa da movimentação
espontânea e da irritabilidade, bem como aumento no tempo de busca a alimentos. Estes
efeitos foram atribuídos a pequenas quantidades de flavonoides e alcaloides harmânicos
presentes no suco de P. edulis. Barbosa et al. (2008) verificaram que o tratamento de ratos
com extratos aquosos de P. alata e P. edulis induziu efeitos ansiolíticos sem causar
influência na memória, como os induzidos pelo uso de diazepan. Esses autores ressaltaram
também que o teor de flavonoides do extrato aquoso de P. edulis é quase o dobro de P.
alata, sendo essa diferença uma forma de explicar o grau de efeito ansiolítico com doses
muito menores de extratos dessa primeira espécie.
12
2.5
Viroses do maracujazeiro
Apesar do destaque econômico, a produção de maracujá ainda é limitada devido à
presença constante de doenças nos pomares que causam perdas na produção e na
qualidade dos frutos. As doenças que acometem a cultura do maracujazeiro podem ser de
origem fúngica, bacteriana, causadas por fitoplasmas, nematoides e principalmente aquelas
induzidas por vírus (COLARICCIO et al., 1987, CHAGAS, 1991, CHAGAS; ANJOS et al.,
2001; COLARICCIO, 2006, FISHER; REZENDE, 2008). No Brasil, foram descritas várias
espécies de vírus infectando o maracujazeiro: Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus),
Passion fruit vein clearing virus (PVCV, Nucleorhabdovirus), Purple granadilla mosaic virus
(PGMV, vírus com partículas isométricas de posição taxonômica não determinada), Passion
fruit green spot virus (PFGSV, um possível Cytorhabdovirus), Passion fruit yellow mosaic
virus (PFYMV, Tymovirus), Grapevine virus A (GVA, Vitivirus), o “vírus do endurecimento
dos frutos do maracujazeiro” (Passion fruit woodiness virus, PWV ou Cowpea aphid-borne
mosaic virus, CABMV – Potyvirus) (CHAGAS, 1991; CHAGAS et al., 1992; BEZERRA et al.,
1995; ANJOS et al., 2001; CHAGAS; COLARICCIO, 2006; GALLETI et al., 2006;
NASCIMENTO et al., 2006; NICOLINI et al., 2012), Passionflower little leaf mosaic virus
(PLLMV) (NOVAES, 2002; NOVAES et al., 2003) e Passionfruit severe leaf distortion virus,
espécies novas de Begomovirus detectadas no Estado da Bahia (FERREIRA et al., 2010).
Recentemente, dois outros Begomovirus foram relatados em Passiflora spp., nos estados de
Minas Gerais, Pará e Rio de Janeiro: o Sida mottle virus (SiMoV) e o Sida micrantha mosaic
virus (SimMV) (ALVES et al., 2011).
O “endurecimento dos frutos do maracujazeiro” (EFM) foi, inicialmente, relatado
na Austrália (COBB, 1901; NOBLE, 1928), nas Américas (CHAGAS, 1991) e posteriormente
na África (MCKERN et al., 1994), sendo, atualmente, considerada uma das doenças mais
importantes da cultura do maracujá no mundo. Inicialmente, a caracterização biológica e
sorológica dos isolados virais associados ao EFM indicava que os isolados pertenciam à
espécie Passion fruit woodiness virus (PWV). Posteriormente, análises moleculares
revelaram que outras espécies de Potyvirus também estariam associadas à doença: o
Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), presente na África e predominante no Brasil,
além do East Asian Passiflora virus (EAPV), restrito ao Japão (SITHOLE NIANG et al., 1996;
NASCIMENTO et al., 2004; 2006; IMAI et al., 2006; NICOLINI et al., 2012).
No Brasil, a partir da década de 1970, foram detectadas quedas de produção no
estado da Bahia devido à presença do VEFM em cultivos de maracujá destinados à indústria
de suco (YAMASHIRO; CHAGAS, 1979; CHAGAS et al., 1981). Posteriormente, o VEFM foi
diagnosticado nos principais estados produtores de maracujá, entre eles Alagoas, Ceará,
Goiás, Minas Gerais, Pará, Pernambuco, Rio de Janeiro, Santa Catarina, São Paulo e
13
Sergipe (LIMA et al., 1985; CHAGAS, 1991; SÃO JOSÉ et al., 1994; INOUE et al., 1995;
TRINDADE et al., 1999; COLARICCIO et al., 2008). Entretanto, os isolados virais
associados ao EFM, inicialmente identificados por meio de métodos biológicos e sorológicos
como PWV, a partir de análises moleculares, foram identificados como CABMV
(NASCIMENTO et al., 2006).
Os vírus associados ao EFM (PWV, CABMV e EAPV) pertencem à família
Potyviridae, gênero Potyvirus, esta com mais de 100 espécies descritas e infectam um
amplo número de angiospermas de diferentes regiões climáticas, causando grandes perdas
para diversas culturas (GREBER, 1973; BOCK, CONTI, 1974; SHUKLA et al., 1994;
MLOTSHWA et al., 2002; BERGER et al., 2005; TAYLOR; IMAI et al., 2006; GIBBS;
OHSHIMA, 2010; ICTV, 2011; NICOLINI et al., 2012).
A família Potyviridae é uma das mais importantes economicamente entre as famílias
de fitovírus, abrangendo cerca de 16% das espécies descritas. Atualmente está subdividida
em oito gêneros (Brambyvirus, Bymovirus, Ipomovirus, Macluravirus, Poacevirus, Potyvirus,
Rymovirus e Tritivirus), de acordo com as características taxonômicas, agente vetor e
organização genômica (ADAMS et al., 2012). Os vírus pertencentes a essa família são
cosmopolitas, com mais de 2.000 espécies de plantas hospedeiras e induzem a formação
de inclusões cilíndricas citoplasmáticas denominadas “cata-ventos”, também utilizada na
identificação de Potyviridae (FENNER, 1976). Além de atingirem altas concentrações nas
hospedeiras, esses vírus infectam principalmente células de tecidos parenquimáticos, o que
faz com que sejam facilmente transmitidos mecanicamente por meio de inoculação
mecânica de extrato vegetal infectado e de preparações virais purificadas ou concentradas
(SHUKLA, 2004; BERGER et al., 2005).
Os Potyvirus possuem partículas alongadas e flexuosas de 680-900 nm de
comprimento e 11-13 nm de diâmetro. O genoma é constituído de uma única molécula de
RNA de fita simples de sentido positivo [(+)ssRNA], com aproximadamente 10.000
nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura (Open Reading Frame, ORF) que codifica
uma poliproteína de aproximadamente 345 kDa, a qual é clivada, dando origem às proteínas
virais (P1, HC-Pro, P3, PIPO, CI, 6K2, VPg, Pro, NIb e CP) (Figura 4). São envoltos por um
capsídeo formado por cerca de 2.000 cópias da proteína capsidial (CP) com massa
molecular de aproximadamente 34 kDa.
Figura 4 - Representação esquemática do genoma de RNA de fita simples dos Potyvirus indicando
as diferentes proteínas (P1, HC-Pro, P3, CI, VPg, Pro, NIb, CP) que sofrem processamento póstraducional [adaptado de Shukla (2004) com inclusão da PIPO, identificada por Chung et al. (2008)]
14
As proteínas virais possuem funções distintas. A proteína P1 está envolvida no
movimento célula a célula, a HC-Pro é responsável pela transmissão por afídeos e pelo
movimento de célula a célula, a proteína 3 (P3) não tem função conhecida, a CI, 6K2 e a
VPg estão associadas a replicação do genoma, a NIb é a RNA polimerase dependente de
RNA e a CP é a capa proteica responsavél pela encapsidação do genoma, transmissão por
afídeos e movimento de célula a célula (SHUKLA, 2004).
CABMV, EAPV e PWV apresentam comportamento biológico similar, e infectam
espécies de Passifloraceae, Fabaceae, Amaranthaceae, Solanaceae e Cucurbitaceae
(TAYLOR; GREBER, 1973; BOCK; CONTI, 1974; NASCIMENTO et al., 2006). Esses vírus
induzem, em maracujazeiros, sintomas de mosaico, bolhas e distorção foliar (Figura 5), além
de deformação, redução do tamanho e endurecimento dos frutos. Também podem infectar
amendoim (Arachis hypogaea L.), crotalaria (Crotalaria juncea L.), soja (Glycine max (L.)
Merr.) e diferentes cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e feijão-caupi (Vigna
unguiculata (L.) Walp.).
Figura 5 - Sintomas de mosaico, bolhas e distorção foliar induzidos pelo CABMV em maracujazeiroamarelo (A, B); e sintomas de anéis cloróticos induzidos pelo CABMV em maracujazeiro-doce (C).
(Fotos: Marcelo Eiras)
Na natureza, a transmissão dos Potyvirus (genêro mais numeroso) bem como do
CABMV, EAPV e PWV, é realizada por afídeos (pulgões) de maneira não persistente, ou
seja, tanto a aquisição como a inoculação das partículas virais pelo inseto ocorrem em
questão de segundos, durante as picadas de prova (YUKI et al., 2006), sendo a
disseminação realizada por várias espécies de afídeos, principalmente as do gênero Aphis
(NOVAES, 2002). Dentre as espécies de afídeos que transmitem e disseminam o VEFM
foram relatadas: Myzus persicae Sulzer, Aphis gossypii Glover, A. fabae Scopoli, A.
craccivora Bock., Toxoptera citricidus Kilkaldy, Uroleucon ambrosiae Thomas, U. sonchi L. e
Myzus nicotianae Blackman (COSTA et al., 1995; INOUE et al., 1995). Os afídeos
permanecem no campo durante o ano todo, colonizando plantas silvestres, que contribuem
para a permanência das fontes de inóculo do vírus nas culturas. Das espécies de afídeos
descritas nenhuma coloniza plantas de maracujá, entretanto, na ausência de um hospedeiro
15
específico, A. gossypii e Toxoptera aurantii (Boyer de Fonscolombe) podem colonizar o
maracujazeiro (SOUSA-SILVA; ILHARCO, 1995; DI PIERO et al., 2006).
A principal estratégia de controle de vírus de plantas é o uso de variedades
resistentes (MELLO, 2009). Porém, a não disponibilidade de variedades de maracujazeiro
comerciais resistentes ao CABMV levanta a possibilidade de desenvolvimento de outras
táticas de manejo da cultura, principalmente levando-se em conta a possibilidade de
convívio com a doença no campo (CERQUEIRA-SILVA et al., 2008; MACIEL et al., 2009).
16
3.
Material e Métodos
3.1
Local de realização dos experimentos e material biológico
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia
(LFF) do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal (CPDSV), do Instituto
Biológico (IB) e também no Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Botânica da
Universidade de São Paulo (USP), com a coorientação da Professora Dra. Déborah Yara
Alves Cursino dos Santos.
Foram utilizadas plantas da espécie Passiflora edulis fo. flavicarpa O.Deg. (maracujáamarelo), variedade IAC-277 (sementes gentilmente cedidas pela Dra. Laura M. M. Meletti,
Pesquisadora Científica do IAC), provenientes de semeadura em terra esterilizada e
mantidas em casa de vegetação com irrigação diária e proteção com telado antiafídeos. As
semeaduras foram realizadas diretamente em sacos plásticos pretos de polietileno com
dimensões de 17 cm x 24 cm.
3.2
Fonte do isolado viral
A fonte de vírus consistiu de um isolado do Cowpea aphid-borne mosaic virus
(CABMV), de P. edulis fo. flavicarpa (maracujá-amarelo) proveniente de Monte Alegre do
Sul, SP, identificado e caracterizado por Silva et al. (2012).
3.3
Transmissão mecânica
A transmissão mecânica do CABMV foi realizada com extrato vegetal obtido a partir
de folhas de maracujazeiro infectadas, trituradas em almofariz e pistilo de porcelana
previamente esterilizados e gelados, em presença de solução de sulfito de sódio 0,5%, pH
6,0, na proporção de 1:5 (g:mL) (GIBBS; HARRISON, 1976). A inoculação mecânica foi
realizada friccionando-se o extrato vegetal com o pistilo sobre a epiderme adaxial da folha
do terceiro nó acima das cotiledonares, previamente polvilhada com um abrasivo (carbureto
de silício, 400 MESH). Ao término das inoculações, as folhas foram lavadas com água e as
plantas mantidas em casa de vegetação para a posterior avaliação de sintomas.
3.4
Delineamento experimental
O experimento 1 foi realizado a partir de 54 plantas maracujá-amarelo com 90 dias
após a germinação (DAG), sorteadas e agrupadas em três lotes: C, L1 e L2 (Figura 6), de
18 plantas cada. Cada lote foi dividido em três repetições (R1, R2 e R3) (N=3), contendo 6
plantas/repetição, para análise de flavonoides.
17
Figura 6 - Delineamento experimental 1; Lotes de maracujazeiro “IAC-277”, C – plantas sem
tratamento; L1 – plantas fricionadas com solução sulfito de sódio 0,5%; L2 – plantas inoculadas
mecanicamente com CABMV em presença de solução sulfito de sódio 0,5%; R – repetição (6 plantas)
O experimento 2 foi realizado a partir de 72 plantas de maracujá-amarelo com 60
DAG, sorteadas e agrupadas em três lotes: C, L1 e L2 (Figura 7) de 24 plantas cada. Cada
lote foi dividido em seis repetições (R1, R2, R3, R4, R5 e R6)(N=6), contendo 4
plantas/repetição, para análise de flavonoides.
Figura 7 - Delineamento experimental 2; Lotes de maracujazeiro “IAC-277”, C – plantas sem
tratamento; L1 – plantas fricionadas com solução sulfito de sódio 0,5%; L2 – plantas inoculadas
mecanicamente com CABMV em presença de solução sulfito de sódio 0,5%; R – repetição (4 plantas)
As plantas de L1 foram friccionadas com solução de sulfito de sódio 0,5%, pH 6,0
com auxílio de pistilo, na folha do terceiro nó acima das cotiledonares. As plantas de L2
foram inoculadas mecanicamente com o CABMV na folha do terceiro nó acima das
cotiledonares. Trinta dias após a inoculação (DAI), as folhas acima do 3º nó foram coletadas
e secas em estufa, para a realização das extrações e das análises dos flavonoides. Em
cada tratamento, as repetições foram formadas por folhas de seis plantas no experimento 1
e, folhas de quatro plantas no experimento 2.
O controle consistiu de folhas de P. edulis fo. flavicarpa sadias, sem qualquer
tratamento.
Os experimentos 1 e 2 não são equiparáveis, devido a diferença de idade das
18
plantas inoculadas e a época em que cada um foi conduzido. Os dois experimentos tiveram
finalidades diferentes: os resultados do experimento 1 foram utilizados para avaliar o
desenvolvimento de P. edulis fo. flavicarpa frente ao CABMV e para a quantificação do teor
de fenóis e flavonoides totais por meio de espectrofotometria; o experimento 2 foi conduzido
na tentativa de identificar os flavonoides isolados, nos tratamentos por meio de UV em
CLAE analítica.
3.5
Avaliação do crescimento
Em literatura a influência dos fitovírus sobre o crescimento das plantas é bem
conhecida (GIBBS; HARRIS 1976; WALLER, 2002; AGRIOS, 2005; HULL, 2009). Para
avaliar o efeito do CABMV no desenvolvimento de Pasiflora edulis fo. flavicarpa foram
utilizadas somente as plantas do experimento 1. Para isso, mediu-se a altura (cm) de todas
as plantas do solo até o ápice caulinar. As alturas foram medidas em dois momentos: antes
das inoculações (Ai) e antes da coleta das folhas (Af). O crescimento das plantas em cada
tratamento foi comparado por meio de médias (M) da diferença (D) entre as duas medições
de altura (Af e Ai) de todas as plantas/repetição/tratamento:
Dn = Af – Ai
Onde: n = (cada planta em cada tratamento do experimento 1)
M = Σ(D1+...+D18)/18 (em cada tratamento do experimento 1)
A avaliação do crescimento das plantas do Experimento 1, foi feita através de um
teste de médias (Teste de Tukey com α = 5%).
3.6
PTA - ELISA (Plate Traped Antigen – Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)
A infecção do CABMV nas folhas coletadas de Passiflora edulis fo. flavicarpa foi
confirmada por meio de PTA-ELISA de acordo com Converse & Martin (1991), com
antissoro policlonal específico contra o CABMV. As leituras de absorbância (A 405 nm) foram
feitas em Microplate reader 3550-UV (Bio-Rad), após aplicação do substrato (pnitrofenilfosfato). Foram consideradas positivas as leituras três vezes superiores à média
dos controles negativos. Utilizaram-se folhas sintomáticas de P. edulis f. flavicarpa,
experimentalmente infectadas, trituradas em solução sulfito de sódio 0,5% na proporção de
1g:5mL. Em orifícios de uma placa de poliestireno foram adicionados 50 L do extrato,
sendo a placa mantida em estufa a 37ºC. Após 2h de incubação, a placa foi lavada três
vezes com PBS-T (tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0 + 0,8% NaCl + 0,02% KCl + 0,05%
19
Tween - 20). Aos orifícios da placa, 50 L de solução 2% de leite desnatado em PBSTPo
(PBS-T + 2% polivinilpirrolidona) foram acrescentados. Após incubação por 1h a 37ºC, a
placa foi lavada, como descrito anteriormente, e aos orificíos, foram adicionados 50 L de
antissoro contra CABMV, diluído em PBSTPo (1:30000) + 1% e leite desnatado. Repetiu-se
novamente o procedimento de incubação por 2h seguido de lavagem e, em seguida,
adicionou-se o conjugado (‘anti-rabbit IgG alkaline phosphatase’) diluído a 1:5000 em
PBSTPo. Após o procedimento de incubação e lavagem, adicionaram-se, em cada orifício,
50 L de substrato da enzima fosfatase alcalina (p-nitrofenil fosfato), a 1mg/mL em tampão
substrato (9,7% dietanolamina + 0,01% MgCl2 em H2O destilada). A placa foi levada à
incubação a 37ºC até que houvesse o aparecimento de coloração amarela, indicativa da
reação antígeno-anticorpo, seguido de leitura da absorbância, em espectrofotômetro, a 405
nm. Para o controle positivo, utilizou-se o vírus correspondente ao antissoro utilizado
(CABMV), e para o controle negativo, extrato de folhas de P. edulis f. flavicarpa sadio.
3.7
Substâncias fenólicas e flavonoides
3.7.1 Extração
A extração de flavonoides totais (Figura 8) foi realizada a partir de 2,0 g de folhas
secas de cada repetição/tratamento do experimento 1, trituradas em almofariz com
nitrogênio líquido. Esse material foi submetido à extração com MeOH 80% a quente sob
refluxo por 1 hora e depois filtrado, procedimento esse que foi repetido por três vezes. Os
filtrados foram agrupados e concentrados em rotaevaporador sob pressão reduzida,
transferidos para tubos de vidro e mantidos em banho-maria até que estivessem
completamente secos. O resíduo seco foi ressuspendido em 2,0 mL de tolueno, deixado em
banho-maria a 40ºC por 5 minutos, por cinco vezes. As frações toluênicas foram
descartadas. Após total secura do tolueno, o mesmo procedimento foi realizado com 2,0 mL
de MeOH 100%, e os extratos metanólicos foram agrupados em nova cápsula de porcelana
com massa conhecida, obtendo-se assim a fração metanólica de cada repetição/tratamento
[modificado de FURLAN et al. (2010)].
20
Trituração em
almofariz com
nitrogênio líquido
2,0 g de folhas secas
repetição/tratamento
Filtração
Concentração em
Rotaevaporador
sob pressão
reduzida por 1 h
Extrato seco
Purificação com
tolueno; Extração
com MeOH 100%;
Extração a quente
com MeOH 80%,
sob refluxo por 1h
Banho maria
Figura 8 – Extração de flavonoides totais; contorno vermelho – repetidos por 3 vezes; contorno
amarelo – repetido por 5 vezes
3.7.2 Quantificação de fenóis e flavonoides
Para calcular a concentração de fenóis totais em P. edulis fo. flavicarpa do
experimento 1, utilizou-se curva-padrão, construída a partir de diluições da solução estoque
de ácido p-cumárico 350 μg/mL em MeOH(Sol. A). A curva-padrão foi preparada de acordo
com as alíquotas da Tabela 1:
Tabela 1: Volume, massa e concentração de ácido p-cumárico usado no preparo da curvapadrão em espectrofotômetro.
Sol.A (μL)
MeOH (μL)
p-cumárico (μg)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
200
195
190
185
180
175
170
165
160
155
150
0
1,75
3,5
5,25
7
8,75
10,5
12,25
14
15,75
17,5
p-cumárico (μg/μL)
0
0,00875
0,01750
0,02625
0,03500
0,04375
0,05250
0,06125
0,07000
0,07875
0,08750
Para cada 200 μL de cada ponto adicionaram-se 3,8 mL de água destilada, 250 μL
do reagente de Folin-Ciocalteau e 750 μL de solução saturada de carbonato de sódio. Após
21
duas horas, cada uma das soluções foi lida em espectrofotômetro UV-visível (UV-1650 PCShimadzu) a 760 nm. Um gráfico de regressão linear foi construído usando os valores de
massa de ácido p-cumárico. Da mesma forma, para cada repetição/tratamento uma alíquota
de 200 μL de extrato metanólico foi utilizada para a dosagem. A esse extrato foi adicionado,
3,8 mL de água destilada, 250 μL do reagente de Folin-Ciocalteau e 750 μL de solução
saturada de carbonato de sódio e lidos em espectrofotômetro a 760 nm após duas horas.
Os teores de fenóis totais foram expressos em μg/mg de folha seca.
Os flavonoides totais do experimento 1 foram quantificados com base em curvapadrão feita a apartir de solução estoque de quercetina 50 μg/mL em MeOH (Sol.Q), com
alíquotas seguindo a Tabela 2.
Tabela 2: Volume, massa e concentração de quercetina usados no preparo da curva-padrão
em espectrofotômetro.
Sol.Q (μL)
MeOH (μL)
quercetina (μg)
quercetina (μg/μL)
0
25
50
75
100
125
150
175
200
250
300
500
475
450
425
400
375
350
325
300
250
200
0
1,25
2,5
3,75
5,0
6,25
7,5
8,75
10
12,5
15
0
0,0025
0,0050
0,0075
0,0100
0,0125
0,0150
0,0175
0,0200
0,0250
0,0300
A cada 0,5 mL de cada diluição da solução de quercetina adicionou-se 0,5 mL de
solução de cloreto de alumínio (AlCl3) e as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro
(UV-1650 PC- Shimadzu) a 420 nm, após 15 min. Com os valores de absorbância e massa
de quercetina, foi construído um gráfico de regressão linear. Para as amostras de todas as
repetições/tratamento, a 0,5 mL do extrato metanólico foi adicionado 0,5 mL de solução de
AlCl3, e a mistura lida em espectrofotômetro após 15 min.
Os flavonoides identificados no experimento 2 foram quantificados por curva-padrão
de vitexina feita a partir de solução estoque contendo 2 μg/μL em MeOH grau HPLC (Sol.V),
de acordo com a Tabela 3.
22
Tabela 3: Volume, massa e concentrações de vitexina usados na preparação da curva-
padrão em CLAE.
MeOH grau
HPLC (μL)
98,75
97,5
92
90,5
87,5
60
75
72,5
67,5
62,5
60
50
40
32,5
25
Sol.V (μL)
1,25
2,5
8
9,5
12,5
20
25
27,5
32,5
37,5
40
50
60
67,5
75
vitexina (μg)
vitexina (μg/μL)
2,5
6,25
16
19
25
40
50
55
65
75
80
100
120
135
150
0,025
0,0625
0,16
0,19
0,25
0,40
0,50
0,55
0,65
0,75
0,80
1
1,2
1,35
1,50
vitexina injetada em
CLAE (μg/μL)
0,0005
0,001
0,0032
0,0038
0,005
0,008
0,01
0,011
0,013
0,015
0,016
0,002
0,024
0,027
0,03
A curva-padrão de vitexina foi construída em cromatógrafo líquido de alta eficiência
(CLAE) descrito no item 3.7.3.C.
3.7.3 Cromatografias
A) Papel
As frações toluênicas e metanólicas foram avaliadas quanto à qualidade de
flavonoides presentes. Para isso desenvolveram-se duas cromatografias descendentes em
papel 3MM
(46
x
57
cm):
cromatografia
bi-dimensional em
BAW
(butanol:ác.
acético:água)(6:2:1) e HOAc 15%, para a fração toluênica; e unidimensional em HOAc 15%,
para a fração metanólica. Ao término das cromatografias os papéis foram analisados sob luz
UV, com e sem vapores de amônia (NH3).
B) Coluna
Para o isolamento e identificação de flavonoides, a partir da extração de 20 g de
folhas secas de P. edulis fo. flavicarpa, desenvolveu-se uma cromatografia em coluna da
fração metanólica, com PVPP (polivinilpolipirrolidona) como fase estacionária, e MeOH 80%
e 100% como fases móveis. O desenvolvimento da cromatografia foi acompanhado com
auxílio de luz UV.
23
C) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Para a construção da curva-padrão de vitexina (Tabela 3), alíquotas de 2 μL de cada
ponto, foram injetadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) analítico modelo
Agilent 1260, com detector DAD (Diode array detector), coluna Zorbax C18 de fase reversa
(250 mm x 4,6 mm, 0,5 μm) e com cromatogramas processados em λ = 352 nm. A fase
móvel foi composta por gradiente de ácido acético 1% (A) e acetonitrila (B), com a seguinte
programação: 12% de B (0-5 min), até 20% de B (5-8 min); isocrático até 20 min, e
aumentando até 80% de B (20-25 minutos) [modificado de MOTTA et al. (2009)]. O fluxo da
fase móvel foi constante a 0,4 mL/min, e a temperatura da coluna ajustada a 40 °C.
As mesmas condições utilizadas na construção da curva-padrão foram utilizadas
para avaliar o perfil cromatográfico dos flavonoides de P. edulis fo. flavicarpa, exceto pelo
volume de injeção e método diferentes. Alíquotas de 5 μL dos extratos metanólicos de todas
as repetições/tratamento/experimento foram analisados com base em Motta et al. (2009),
com a seguinte programação: 12% de B (0-5 min), até 20% de B (5-8 min); isocrático até 28
min, e aumentando até 50% de B (28-38 minutos), 65% de B (38-48 minutos) e 65-100%
(48-50 minutos), isocrático por 5 minutos e decrescendo até 12% (55-60 minutos). Amostras
autênticas (padrões) de alguns flavonoides descritos em P. edulis fo. flavicarpa foram
analisadas nas mesmas condições, a fim de auxiliar na identificação das substâncias por
meio da comparação dos tempos de retenção (RT).
Na tentativa de isolar e identificar flavonoides de P. edulis fo. flavicarpa, os mesmos
foram coletados em CLAE preparativo. Os flavonoides coletados tiveram seus espectros
associados aos mesmos espectros obtidos em CLAE analítico. Alíquotas de 120 μL foram
injetadas em CLAE modelo Agilent 1200, com detector DAD (Diode array detector), coluna
XDB-C18 (250 mm x 9,4 mm x 5 um), e com cromatogamas processados em λ = 352 nm. A
fase móvel empregada foi composta por gradiente de água (A) e acetonitrila (B) com a
seguinte programação: 20% de B (0-20 min); 50% de B (20-22 min); 100% de B (22-27 min)
e 20% de B (27-29 min). O fluxo da fase móvel foi constante a 0,4 mL/min, e a temperatura
da coluna ajustada a 40 °C.
3.7.4 Reações de deslocamento
Na tentativa de elucidar a estrutura dos flavonoides isolados em CLAE preparativa,
os mesmos foram submetidos a reações de deslocamento com acréscimo de reagentes
complexantes e ionizantes e leituras de absorbância em espectrofotômetro (UV-1650 PCShimadzu) entre λ = 240 a 600 nm. O método utilizado foi o proposto por Markham (1982).
24
Inicialmente, cada um dos flavonoides isolados, foi diluído em MeOH 100% e imediatamente
foram realizadas as leituras. A essa mesma mistura adicionaram-se 2 gotas de KOH, 2M, e
após 5 min, foi feita nova leitura. Em uma nova alíquota da solução metanólica do
flavonoide, adicionaram-se 2 gotas de solução saturada de AlCl3 e foi feita mais uma leitura.
A essa mesma mistura acrescentaram-se 2 gotas de HCl, 0,5M, sendo imediatamente lida.
Finalmente a uma terceira alíquota da solução metanólica do flavonoide, adicionou-se
NaOAc, e após 5 min, foi feita a leitura. A essa nova mistura acrescentou-se H3BO4, e em
seguida foram feitas as leituras. Todos os dados foram registrados em forma de gráficos e
interpretados.
3.7.5 Hidrólise ácida
A fim de identificar possíveis açúcares ligados aos flavonoides isolados, uma alíquota
de cada flavonoide foi transferida para tubo de ensaio, seca e acrescida de 4 mL de solução
HCl 1N. Esses tubos foram tampados e transferidos a um banho seco a 95ºC por 1 h. Após
esfriarem em temperatura ambiente, foram adicionados 2 mL de acetato de etila em cada
tubo, a mistura foi agitada e, após separação das fases, as frações de acetato de etila e de
HCl 1N, foram coletadas separadamente e secas. As duas frações foram desenvolvidas em
CCD (cromatografia em camada delgada ascendente de celulose). As frações de acetato de
etila (contendo as agliconas) foram ressuspendidas em MeOH, e a CCD foi desenvolvida em
CAW (clorofórmio:ác. acético:água)(30:15:2) ao lado de amostras autênticas (padrões) de
apigenina, luteolina, quercetina, orientina e rutina. Ao término, essa CCD foi seca e
analisada sob luz UV, com e sem vapores de NH3. Uma nova CCD em ácido acético 15% foi
desenvolvida com alíquotas dos flavonoides originais e suas respectivas frações em acetato
de etila. Ao final, a CCD foi seca em temperatura ambiente e analisada sob luz UV, com e
sem vapores de NH3. Os valores de Rf foram calculados da seguinte forma:
Rf = Df/LF
Df = distância percorrida pelos flavonoides na cromatografia
LF = linha de frente percorrida pela fase móvel na cromatografia
As frações em HCl 1N (contendo os açúcares) foram ressuspendidas em água
destilada. A CCD para a análise de açúcares (fração aquosa) foi desenvolvida em EPAW
(acetato de etila:piridina:ác.acético:água)(36:36:7:21) ao lado de amostras autênticas
(padrões) de galactose, glicose, ramnose, arabinose, xilose e ácido glucurônico. Ao final, a
CCD foi seca, nebulizada com fosfato de anilina (anilina, acetona; 2:3) e revelada em estufa
a 100ºC.
25
3.8
Análise estatística
Os resultados dos experimentos foram avaliados estatisticamente utilizando-se a
Análise de Variância (ANOVA) do Programa R, com o teste de Tukey (α = 5%) do pacote
Laercio (LAERCIO, 2010), para avaliar as médias de alturas, médias da concentração de
fenóis, flavonoides totais e de flavonoides isolados.
4. Resultados
4.1
Transmissão mecânica
A variedade IAC-277 de Passiflora edulis fo. flavicarpa (maracujá-amarelo) mostrouse suscetível ao isolado de CABMV de Monte Alegre do Sul, previamente caracterizado
biológica e molecularmente por Silva et al. (2012). Foi observado sintomas de mosaico,
bolhas e distorção foliar, evidenciados no tratamento L2 (CABMV + sulfito de sódio 0,5%) a
partir do 30º DAI. O PTA-ELISA confirmou que as plantas sintomáticas estavam infectadas
pelo CABMV, e as assintomáticas, por sua vez, mantiveram-se sadias, ou seja, as plantas
dos tratamentos C (controle) e L1 (sulfito) estavam livres do vírus.
4.2
Avaliação do crescimento
Foi avaliado o crescimento somente das plantas do experimento 1. Todas as plantas
se desenvolveram, no entanto a média das alturas de L2 foi menor do que de L1 e C, que
não diferiram entre si (Tabela 4).
Tabela 4: Média (±DP) das diferenças entre alturas (cm) de cada tratamento. C – Controle; L1 –
solução de sulfito de sódio; L2 - CABMV em presença de solução de sulfito de sódio. Valores
seguidos de mesma letra não apresentam diferenças significativas (α=5%).
Tratamento
Médias
a
C
25,833 ± 17,5744
L1
24,056a ± 15,2937
L2
5,3333b ± 6,167
4.3
Quantificação de fenóis e flavonoides totais
As curvas padrões de ácido p-cumárico, quercetina e vitexina tiveram as seguintes
equações e valores de r2 (fator de correlação) (Figuras 9 a 11):
Absorbância (760 nm)
26
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
y = 0,0238x + 0,014
R² = 0,9924
0
5
10
15
20
ácido p-cumárico (μg)
Figura 9 – Curva-padrão de ácido p-cumárico
0,14
y = 0,0088x - 0,0004
R² = 0,9905
Absorbância (420 nm)
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
5
10
15
20
Quercetina (μg)
mAU
Figura 10 – Curva-padrão de quercetina
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
y = 14284x + 20,221
R² = 0,9989
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
μg de Vitexina
Figura 11 – Curva-padrão de vitexina
0,03
0,035
27
A partir das equações da reta de ácido p-cumárico e quercetina (Figuras 9 e 10),
fenóis e flavonoides totais dos extratos metanólicos, obtidos de folhas secas dos
tratamentos do experimento 1 foram quantificados em μg/mg de folha seca. Os teores de
fenóis e flavonoides totais não diferiram estatisticamente entre os tratamentos C, L1 e L2
(Tabela 5, Figura 12).
Tabela 5: Teor (μg/mg de folha seca) de fenóis e flavonoides totais nos extratos metanólicos das
folhas do maracujazeiro-amarelo do experimento 1. C – Controle; L1 – solução de sulfito de sódio; L2
- CABMV em presença de solução de sulfito de sódio. Os valores correspondem a média ± DP.
Valores seguidos de mesma letra não apresentam diferenças significativas (α=5%). Fenóis
(p=0,4704). Flavonoides (p=0,3477).
Tratamento
Fenóis
μg/mg
C
L1
L2
25,233 ± 8,708
a
26,328 ± 5,572
a
33,413 ± 7,223
a
Flavonoides
μg/mg
b
1,320 ± 0,382
b
1,332 ± 0,170
b
0,992 ± 0,169
Figura 12 - Médias da concentração de fenóis e flavonoides totais nas folhas de Passiflora edulis fo.
flavicarpa (Experimento 1): C – Controle; L1 – solução de sulfito de sódio; L2 - CABMV em presença
de solução de sulfito de sódio
4.4
Flavonoides identificados
Em cromatograma obtido por CLAE analítica do extrato metanólico de P. edulis fo.
flavicarpa foi possível identificar picos de flavonoides e as amostras autênticas (padrões).
No entanto nenhuma das amostras autênticas de: homoorientina, orientina, vitexina,
luteolina e apigenina foram identificadas através dos tempos de retenção (RT).
Quatro flavonoides foram coletados em CLAE preparativo e suas estruturas
sugeridas por: Rf, reação de deslocamento e hidrólise ácida.
28
4.4.1 Reações de deslocamento
Com as reações de deslocamento somadas às informações das reações de hidrólise
e de Rf, as seguintes estruturas dos flavonoides foram tentativamente propostas:
C – glicosídeo de apigenina
––– MeOH – 274 nm/330 nm
MeOH/MeOH+KOH
MeOH+AlCl3/MeOH+AlCl3+HCl
––– MeOH +KOH – 278 nm/ombro 336
nm/394 nm
––– MeOH+AlCl3 – 274 nm/304 nm/338 nm
––– MeOH+AlCl3+HCl – 276 nm/302 nm/340
nm
––– MeOH+NaOAc – 274 nm/330 nm
––– MeOH+NaOAc+H3BO4 – 274 nm/330 nm
UV – púrpura
UV+NH3 – amarelo
Rf-BAW – 0,423
Rf-AcOH 15% – 0,423
TR – 15,056 min
Hidrólise: não
MeOH+NaOAc/MeOH+NaOAc+H3BO4
29
Derivado de apigenina com 6-O-
––– MeOH – 274 nm/322 nm
MeOH/MeOH+KOH
MeOH+AlCl3/MeOH+AlCl3+HCl
––– MeOH +KOH - degradou
––– MeOH+AlCl3 – 280 nm/304 nm/340 nm
––– MeOH+AlCl3+HCl – 280 nm/304 nm/336
nm
––– MeOH+NaOAc – 276 nm
––– MeOH+NaOAc+H3BO4 – 274 nm/320 nm
UV – purpura
UV+NH3 – púrpura
Rf-BAW – 0,153
Rf-AcOH 15% – não calculado
TR – 19,356 min
Hidrólise: não
MeOH+NaOAc/MeOH+NaOAc+H3BO4
30
C-glicosideo de Apigenina-7-O-Me
––– MeOH – 270 nm/334 nm
MeOH/MeOH+KOH
MeOH+AlCl3/MeoH+AlCl3+HCl
––– MeOH +KOH – 338 nm
––– MeOH+AlCl3 – 280 nm/302 nm/348 nm
––– MeOH+AlCl3+HCl – 280 nm/300 nm/346 nm
––– MeOH+NaOAc – 270 nm/332 nm
––– MeOH+NaOAc+H3BO4 – 270 nm/332 nm
UV – purpura
UV+NH3 – amarelo
Rf-BAW – 0,461
Rf-AcOH 15% – não calculado
TR – 19,951 min
Hidrólise: não
MeOH+NaOAc/MeOH+NaOAc+H3BO4
31
Flavonoide não identificado
MeOH/MeOH+KOH
––– MeOH – 274 nm/320 nm
MeOH+AlCl3/MeOH+AlCl3+HCl
––– MeOH +KOH – 278 nm/364 nm
––– MeOH+AlCl3 – 280 nm/302 nm/332 nm
––– MeOH+AlCl3+HCl – 282 nm/302 nm/336 nm
––– MeOH+NaOAc – 274 nm/316 nm
––– MeOH+NaOAc+H3BO4 – 274 nm/318 nm
UV – amarelo
MeOH+NaOAc/MeOH+NaOAc+H3BO4
UV+NH3 – amarelo
Rf-BAW – não calculado
Rf-ácido acético – 0,661
TR – 15,979 min
Hidrólise: não
O método de extração para flavonoides proposto por Furlan et al. (2010) foi
adequado para P. edulis fo. flavicarpa, já que foi possível detectar flavonoides em todos os
extratos metanólicos. As extrações descritas para flavonoides utilizam solventes polares,
como etanol, metanol, butanol e água (MARKHAN, 1982). As hidroxilas presentes na
molécula dão o caráter menos polar, e os açúcares ligados tornam os flavonoides mais
polares. Portanto, misturas de água com um dos solventes citados são usadas para a
extração
de
glicosídeos.
Flavonoides
de
Passiflora
são
descritos
como
sendo
predominanemente flavonas C-glicosiladas, contendo pelo menos um açúcar ligado no
carbono 6- ou 8- (MARKHAM, 1982; JAY, 1996).
Para propor as estruturas químicas dos quatro flavonoides isolados, bem como as
posições das hidroxilas, foram utilizados reagentes de deslocamento descritos por Markhan
32
(1982). Os deslocamentos baseiam-se em desvios batocrômicos, ou seja, na mudança de
absorção em comprimentos de onda maiores, ou também chamados de desvio à direita,
com ou sem aumento na absorção, e retorno hipsocrômicos também chamados de desvios
à esquerda. Para isso, reagentes ionizantes (KOH e NaOAc) e complexantes (AlCl 3/HCl e
NaOAc/H3BO4) são utilizados para causar mudança do perfil espectrométrico dos
flavonoides. Flavonas são descritas por possuírem a posição 3- livre diferente dos flavonóis
que possuem na mesma posição uma hidroxila (3-OH) (HARBORNE, 1973; MARKHAN,
1982). Esta única hidroxila na posição 3- muda o perfil de absorção (aumenta a absorção da
Banda I), sendo possível distinguir flavonas de flavonóis. As hidroxilações dos anéis A e B
alteram respectivamente a Banda II (240-280 nm) e a Banda I (300-380 nm) (MABRY et al.,
1970).
Com o espectro em MeOH, foi possível identificar três flavonas, devido à absorção
da Banda I entre 310-350 nm (MARKHAN, 1982). Provavelmente essas flavonas são
derivadas de apigenina, já que não houve desvio batocrômico da Banda I e nem aumento da
intesidade no espectro de AlCl3, e também não houve retorno hipsocrômico da Banda I ao
adicionar HCl. Se essas flavonas fossem derivadas de luteolina (com hidroxilas em 3’-OH e
4’-OH), haveria desvio batocrômico da Banda I e II no espectro com AlCl 3 com aumento da
intensidade, e haveria retorno hipsocrômico somente da Banda I no espectro de AlCl 3/HCl.
Ulubelen et al. (1982), Geiger & Marklan (1986), Dhawan et al. (2001) e Antognoni et al.
(2007), encontraram em espécies de Passiflora os flavonoides vitexina e isovitexina,
derivados de apigenina.
O quarto flavonoide não pode ser classificado em flavona ou flavonol, mesmo que o
desvio batocrômico da banda I de 320 nm para 364 nm no especto em KOH possa indicar 3OH (MABRY et al., 1970).
A adição de KOH, uma base forte, ioniza todas as hidroxilas (-OH) do núcleo
flavônico. O surgimento de uma terceira banda entre 320-335 nm revela uma hidroxila na
extremidade 7-OH. A degradação com o tempo é um indício de haver grupos álcalisensíveis, geralmente 3,4’-OH, -diOH no anel A, ou três -OH adjacentes no anel B. O desvio
batocrômico estável entre 45–65 nm, sem aumento na intensidade, da Banda I com KOH
revela hidroxila livre em 4-’ (MABRY et al., 1970; MARKHAN, 1982). Houve desvio
batocrômico nos espectros dos quatro flavonoides isolados, e a terceira Banda surgiu no
espectro de três deles. No espectro do flavonoide não identificado, a terceira Banda não
surgiu, o que pode indicar um possível 7-O-.
A adição de AlCl3 fornece íons Al3+ , que forma um complexo entre os grupo hidroxila
de 5- e cetônico de 4-, e entre as hidroxilas de 3’- e 4’-. Um desvio batocrômico com AlCl3
representa a soma dos dois complexos, ou seja provoca desvios das Banda II e I, enquanto
o espectro AlCl3/HCl representa somente o complexo hidroxi-cetônico (5- e 4-) que não é
33
desfeito com o HCl (MABRY et al., 1970; MARKHAN, 1982; HARBORNE, 1973). O espectro
em AlCl3 dos quatro flavonoides teve um desvio batocrômico nas Bandas II e I, e retorno
hipsocrômico das duas Bandas ao adicionar HCl. Sugere-se que os quatro flavonoides
tenham 5-OH, 4-O, no entanto não foi possível afirmar que as extremidade 3’ sejam
hidroxiladas.
Os flavonoides propostos como C-glicosídeo de apigenina e derivado de apigenina6-O-, e o flavonoide não identificado devem possuir a extremidade 7-OH livre revelada no
espectro de NaOAc. Esta é uma base fraca, e portanto ioniza somente as hidroxilas mais
ácidas (7-OH) e provoca um desvio batocrômico de aproximadamente 5-20 nm da Banda II
(MABRY et al., 1970; MARKHAN, 1982; HARBORNE, 1973). No espectro do derivado de
apigenina-6-O- em NaOAc, esse desvio foi quase imperceptível, devido a uma possível
substituição (6-O-) que diminui acidez em 7-OH (MABRY et al., 1970). O outro C-glicosídeo
de apigenina deve ter a extremidade 7- substituída, provavelmente com um grupo metil, já
que não houve desvio batocrômico da Banda II. Se houvesse 6-OH e/ou 8-OH, a adição de
H3BO4 na solução em NaOAc formaria complexos entre 6- e 7- e/ou 7- e 8- e haveria um
desvio batocrômico da Banda II (MABRY et al., 1970).
A hidrólise ácida foi utilizada para tentar separar a aglicona de possíveis açúcares.
Em cromatogradia em camada delgada (CCD) nenhuma das agliconas usadas como padrão
e nenhum padrão de açúcar foram identificados.
A partir dos resultados de hidrólise e valores de Rf, dois dos quatro flavonoides
isolados foram propostos como C-glicosídeo de apigenina e C-glicosídeo de apigenina-7-OMe. Flavonoides C-glicosilados são resistentes a hidrólise ácida e, portanto permanecem
solúveis em acetato de etila (HARBORNE, 1973; MARKHAM, 1982) o que foi confirmado em
desenvolvimento de CCD dos flavonoides isolados com os possíveis produtos de hidrólise.
Se houvesse flavonoides C-diglicosilados ligados em um único carbono, o açúcar mais
externo sofreria hidrólise, enquanto o adjacente ao carbono do núcleo flavonico
permaneceria e não seria revelado na fração aquosa. Mesmo que não foi detectado nenhum
açúcar na fração aquosa, os flavonoides isolados ainda poderiam ser C-diglicosídeos com
açúcares ligados em carbonos diferentes (6- ou 8-) e não seriam também hidrolisados com
HCl. Como os valores de Rf em BAW foram intermediários, foi possível sugerir que os
flavonoides C-glicosilados tinham um único açúcar em 6- ou em 8-, o que os torna mais
polares e, portanto, mais solúveis em água e ácido acético e menos solúveis em butanol. As
informações dos outros dois flavonoides não foram suficientes para diferenciar O- de Cglicosídeos, embora um deles seja proposto como um derivado de apigenina-6-O- e,
possivelmente, haja um açúcar em 8-. Porém, não foi possível comparar os valores de Rf
em ácido acético desses flavonoides.
34
A posição e o tipo de açúcar dos C-glicosideos não puderam ser determinados, para
isso são utizadas técnicas como a espectrometria de massas e ressonância magnética, no
entanto sugere-se que os açúcares esteja ligados em 6- ou 8-. Markhan (1982) e Jay (1996)
descreveram, em Passiflora, flavonoides C-glicosilados apenas nas posições 6- e 8-, sendo
a glicose o açúcar predominante. Flavonoides O-glicosilados foram descritos em outras
espécies de Passiflora, como luteolina-7-O-glicosídeo em P. pittieri Mast. (ULUBELEN et al.,
1982), isovitexina-2’-O-glucopiranosídeo, isoorientina-2’-O-glucopiranosídeo e isoscopain-2”O-glicosídeo, em P. incarnata (PROLIAC et al., 1988; LI et al., 1991; RAFFAELLI et al.,
1997; ABOURASHED et al., 2002; MULLER et al., 2005).
Talvez o volume dos flavonoides isolados tenha sido insuficiente para tornar os
produtos de hidrólise visíveis em CCD. Por outro lado, é mais uma evidência de que os
flavonoides isolados de Passiflora edulis fo. flavicarpa sejam C-glicosilados.
35
4.4.2 Quantificação dos flavonoides isolados
Cada flavonoide isolado em CLAE preparativa, foi identificado e quantificado nos
extratos metanólicos, obtidos de folhas secas dos tratamentos do experimento 2 por meio de
curva-padrão de vitexina (Figura 11), e expressos em μg/mg de folha seca.
Os teores dos flavonoides tentativamente identificados como: C-glicosideo de
apigenina, glicosídeo de apigenina 6-O- e o flavonoide não identificado, diferiram
estatisticamente entre tratamentos do experimento 2, e os maiores valores detectados no
tratamento L1. No entanto o teor do flavonoide tentativamente identificado como Cglicosídeo de apigenina 7-O-Me não diferiu estatisticamente entre os tratamentos (Tabela 6,
Figura 13).
Tabela 6: Teor (μg/mg de folha seca) de cada flavonoide isolado (em padrões de vitexina), nos
extratos metanólicos das folhas do maracujazeiro do experimento 2. C – Controle; L1 – solução de
sulfito de sódio; L2 - CABMV em presença de solução de sulfito de sódio. Os valores correspoondem
a médias ± DP. Valores seguidos de mesma letra em colunas não apresentam diferenças
significativas (α=5%).
Tratamento
C-Glicosídeo
de Apigenina
Glicosídeo de
Apigenina 6-O-
C
L1
L2
3,450±0,448
a
45,343±7,62
b
28,063±12,69
c
2,892±1,319
a
11,072±4,119
b
3,892±0,314
b
C-Glicosídeo
de apigenina
7-O-Me
a
9,267±8,661
a
2,399±1,849
a
12,319±7,96
Flavonoide
não
identificado
b
1,380±0,877
a
28,347±2,443
b
2,387±0,734
Figura 13 - Quantificação dos flavonoides identificados em Passiflora edulis fo. flavicarpa
36
5. Discussão
Os sintomas induzidos por vírus são reflexos de alterações morfológicas (histológicas) e
fisiológicas (DINER, 1963; GIBBS; HARRIS 1976; WALLER, 2002). Os vírus diferem de
outros fitopatógenos, pois a doença não é causada pela translocação de toxinas originadas
no local de infecção. A infecção viral interfere no metabolismo da célula hospedeira,
causando diminuição da fotossíntese, aumento da taxa de respiração, aumento na atividade
de fenoloxidases e frequentemente um aumento anormal de metabólitos (WALLER, 2002).
Uma vez que os vírus não possuem metabolismo próprio, toda a informação contida em seu
genoma pode atuar como fator de patogenicidade, que regula a infecção e a transmissão
(DINER, 1963).
A diferença de alturas entre os três tratamentos pode ser explicada. As plantas que
sofreram injúrias mecânicas + vírus (L2) se desenvolveram menos do que as de C (controle)
e L1 (sulfito de sódio 0,5%). Isso pode ser explicado, já que a inoculação mecânica destrói
algumas células da epiderme adaxial das folhas, diminui a superfície fotossintética e,
portanto, reduz a fotossíntese. No entanto, as plantas de L2, além de clorose (degradação
de clorofila), exibiram nanismo. Agrios (2005) descreveu que alguns vírus, fitoplasmas e
nematoides podem induzir sintomas como clorose e nanismo, e estes patógenos alteram
significativamente a fotossíntese e o desenvolvimento das plantas hospedeiras. Sintoma de
clorose reflete a degradação de clorofilas e outros pigmentos presentes nos cloroplastos. O
sintoma de nanismo pode ser explicado por alterações nos balanços hormonais, redução da
concentração de derivados de carbono ou alteração na sua translocação (HULL, 2009).
Diener (1963), Berger et al. (2007), e Hull (2009) concordam que a redução da fotossintese
é acompanhada pelo aumento da taxa respiratória, mas os autores divergem se há aumento
ou redução de fotoassimilados nos tecidos infectados. Estes sintomas representam a soma
de alterações estruturais que estão associadas com a redução do crescimento e
desenvolvimento da planta, além de alterações fisiológicas da célula (MAULE et al., 2002).
No presente trabalho não foi realizado um estudo de ultra-estrutural do CABMV em P. edulis
fo. flavicarpa, no entanto estudos anteriores (BASHIR, 2002) citam inclusões citoplasmáticas
e alterações nos cloroplastos, associados a regiões de replicação, que explicaria a redução
da fotossíntese. Alterações fisiológicas induzidas pelo CABMV foram avaliadas por meio de
análises de metabólitos secundários. Para isso foram estudados fenóis totais e flavonoides
totais de P. edulis fo. flavicarpa.
A influência de vírus sobre o teor de compostos fenólicos é pouco conhecida,
principalmente em hospedeiras que reagem com sintomas sistêmicos. Em hospedeiras com
sintomas locais há aumento de compostos fenólicos (DINER, 1963; WALLER, 2002), que
impermeabilizam as células ao redor da infecção viral, para isolar e restringir a infecção, a
37
esta reação dá-se o nome de reação de hipersensibilidade (GIBBS, 1976; MAULE et al.,
2002). O CABMV em P. edulis fo. flavicarpa induz sintomas sistêmicos, longe da folha
inoculada (SILVA et al., 2012). No presente trabalho a dosagem de fenóis foi feita a partir de
folhas sintomáticas sistêmicas infectadas com o CABMV, a cima da inoculada. Apesar dos
teores de fenóis totais não terem sido estatisticamente diferentes, houve um pequeno
aumento no teor de fenóis do tratamento L2, assim como os resultados de Duarte (1997)
que verificou uma diminuição de fenóis em folhas de Datura stramonium inoculadas com o
PVX (Potato virus X) com aumento nas folhas acima; e ao contrário de Ajmal et al. (2011)
que verificaram uma diminuição no teor de fenóis em algodão experimentalmente infectados
com o CLCuV. O teor dessas substâncias parece depender de uma série de fatores, como
sistema vírus x hospedeira, concentração viral e estado nutricional da planta.
O aumento de compostos fenólicos está associado ao aumento de fenoloxidases,
este processo é muito conhecido em infecções fúngicas (VIDHYASEKARAN, 2004;
AGRIOS, 2005). A esses composto formado de novo após o contato com o pátogeno dá se
o nome de fitoalexinas (DIXON; PAIVA, 1995; MALECK; LAWTON, 1998; SUDHA;
RAVISHANKAR, 2002). Dixon & Paiva (1995) em sua revisão, relataram que estresses
bióticos e abióticos podem induzir a síntese de fitoalexinas provenientes da via dos
fenilpropanoides, muitas possuem atividade antimicrobiótica sintetizadas em resposta a
patógenos. De acordo com esses autores, as fitoalexinas podem ser; pterocarpanos,
isoflavonas,
isoflavonoides
prenilados,
stilbenos,
psoralenos,
cumarinas,
3-
deoxiantocianidinas, flavonóis e auronas.
Tendo em vista o maior teor de fenóis totais em L2, pode-se considerar que a
diferença entre fenóis totais de L2 e de C, possam atuar como fitoalexinas. Os compostos
fenólicos em plantas abragem um grande número de substâncias que possuem em comum
um ou mais anéis aromáticos, aos quais se ligam um ou mais grupos hidroxílicos (VICKERY
& VICKERY, 1981), como ácidos fenólicos, fenilpropanoides, flavonoides, taninos, lignina
etc. Em estudos envolvendo defesa da planta a lignina é aumentada durante a infecção, em
resposta a lesões e injúrias, bloqueando e impedindo o crescimento e a entrada de
patógenos (GOULD, 1983). As infecções fúngicas são muito estudadas para a quantificação
de fenóis totais, e a lignina normalmente é o composto majoritário (AGRIOS, 2005), que
limita o crescimento micelial enrijecendo a parede celular. Essa deposição induzida limita o
crescimento celular e o desenvolvimento da planta (NOBEL, 2009). Os poucos trabalhos de
vírus e metabólitos secundários não descrevem a influência deste patógeno sobre a lignina,
mas descrevem a influência sobre antocianina (VEGA et al., 2011) e outros pigmentos (LU
et al., 2012). Todos estes metabólitos secundários são compostos fenólicos, e assim como
os que compõem os flavonoides, também derivam da via do ácido chiquímico.
38
Fenilpropanoides também são precursores de flavonoides. A desaminação da
fenilalanina pela PAL, seguida de outras reações catalisadas pela cinamato-4-hidroxilase
(C4H) e 4-cumarato-CoA-ligase (4CL), origina o fenilpropanoide 4-cumaroil-CoA, que junto
com três moléculas de malonil-Coa provenientes da via do Acetato-Malonato formam a
chalcona (VICKERY; VICKERY, 1981; MARKHAN, 1982). Qualquer alteração nas enzimas
ou em seus substratos prejudicará a síntese de chalcona e portanto a síntese dos demais
flavonoides. Na revisão descrita por Dixon & Paiva (1995), plantas de tabaco que tiveram a
enzima fenilalanina amônia-liase (PAL) suprimida, ainda manifestavam a reação de
hipersensibilidade e redução de compostos fenólicos frente à infecção pelo Tobacco mosaic
virus (TMV, Tobamovirus). Nesse contexto parece que a infecção viral altera a síntese de
compostos fenólicos, sem interferir na via dos fenilpropanoides.
Com relação aos flavonoides, poucos trabalhos demonstram a influência de vírus no
teor desses metabólitos. Ao contrário dos teores de fenóis totais, a infecção pelo CABMV,
bem como somente a injúria mecânica nas folhas não induziu alteração no teor de
flavonoides totais em plantas de maracujá-amarelo. Kreft et al. (1999) relataram uma
diminuição do flavonoide rutina em Solanum tuberosum L. suscetíveis ao Potato virus YNTN
(PVYNTN, Potyvirus). Por outro lado, Vega et al. (2011) verificaram um aumento inicial de
flavonóis em frutos de Vitis vinifera L. var. Cabernet Sauvignon infectados com Grapevine
leaf-roll-associated virus-3 (GLRaV-3, Ampelovirus), seguido de diminuição ao longo do
amadurecimento dos frutos. Apesar desses trabalhos também relatarem diferenças
quantitativas, não condizem com os resultados obtidos no presente trabalho, onde os
maiores aumentos de três dos quatro flavonoides tentativamente identificados foram
observados somente em L1, talvez se deva ao fato da rutina e de flavonóis diferirem de
flavonas e possuírem funções distintas. Outra possível explicação é a de que somente a
injúria mecânica é suficiente para alterar o metabolismo secundário de P. edulis f. flavicarpa.
Aparentemente a variação de flavonoides induzida por vírus depende da planta, da idade, e
do vírus.
Derivados de flavonas C-glicosiladas já foram descritas como comuns em espécies
de maracujá (Dhawan et al. 2004, Zeraik et al. 2010, Zucolotto et al. 2011). As análises dos
extratos do maracujá-amarelo IAC-277 sugerem a presença de três derivados de apigenina
sendo dois C-glicosilados. Através da comparação com amostras autênticas, sabemos que
não se tratam de vitexina e/ou isovitexina. Apesar de não ter havido quantidade suficiente de
material que possibilitasse a identificação destes compostos, o C-glicosideo de apigenina 7O-Me, não se asemelha a nenhuma flavona descrita em P. edulis f. flavicarpa.
A quantificação de flavonoides por meio da técnica em espectrofotômetro difere da
técnica de detecção em CLAE, pois detecta a absorção dos complexos formados com AlCl3.
É considerada uma técnica pouco precisa, e subquantifica os valores reais de flavonoides
39
(WOISKY; SALATINO, 1998; GUEDES et al., 2009). O mesmo pode-se dizer da
quantificação de fenóis totais com o reagente de Folin-Ciocalteau. Assim é possível justificar
os maiores valores de flavonoides isolados quantificados por CLAE, do que os de
flavonoides totais quantificados por espectrofotometria.
Mesmo que dois experimentos não possam ser equiparáveis estatisticamente, alguns
compostos fenólicos (ex: 4-cumaroil-CoA e malonil CoA) são precursores de flavonoides, e
poderia haver uma correlação positiva entre os teores desses compostos, o que não foi
observado entre os tratamentos do experimento 1. Apesar disso, Croteau et al. (2000)
afirmou que compostos fenólicos, como flavonoides, poderiam aumentar em infecções por
patógenos, e desempenhariam função de defesa.
Os desvios padrões muito altos entre os tratamentos (C, L1 e L2) talvez possa ser
explicado pela elevada variabilidade genética de P. edulis fo. flavicarpa (IAC-277) que ainda
persiste, mesmo tratando-se de uma variedade pré-selecionada, e poderia explicar os
resultados estatísticos não significativos para o teor de fenóis e flavonoides totais.
Os fenóis e flavonoides de P. edulis fo. flavicarpa foram extraídos de plantas com até
90 dias após a germinação (DAG). Nesse estádio fenológico, o teste estatístico somente
revelou diferenças de flavonoides quantificados individualmentes entre os três tratamentos.
Por se tratar de plantas jovens, sem flores e frutos, esses resultados não refletem a
realidade do produtor que mantém plantas adultas para a comercialização dos frutos.
Portanto, até esse estádio, fenóis e flavonoides de importância econômica, ainda poderiam
ser extraídos e comercializados a partir de folhas de maracujazeiro-amarelo mesmo
infectadas com o CABMV.
40
6. Conclusões
Quatro flavonoides de folhas de Passiflora edulis fo. flavicarpa (variedade IAC-277)
foram tentativamente identificados, sendo três deles sugeridos como: C-glicosídeo de
apigenina, glicosídeo de apigenina 6-O-, glicosídeo de apigenina 7-O-Me e um flavonoide
não identificado.
A injúria mecânica é suficiente para aumentar a síntese de três dos quatro flavonoides
tentativamente identificados.
Houve aumento sistêmico de compostos fenólicos de P. edulis fo. flavicarpa infectados
com o CABMV (tratamento L2).
Com até 90 dias após a germinação e 30 dias após a inoculação, o CABMV não induziu
alterações quantitativas e nem qualitativas de fenóis, mas alterou a quantidade de um único
flavonoide isolado em folhas de P. edulis fo. flavicarpa.
O CABMV não alterou o metabolismo secundário de P. edulis fo. flavicarpa com até 90
dias após a germinação.
41
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