Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
DANIELA SUELI GUERREIRO RODRIGUES
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FILOGEOGRAFIA DE CEPAS DO
VÍRUS DA ENCEFALITE DE SAINT LOUIS ISOLADAS NO ESTADO
DO PARÁ, BRASIL.
BELÉM
2011
DANIELA SUELI GUERREIRO RODRIGUES
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FILOGEOGRAFIA DE CEPAS DO
VÍRUS DA ENCEFALITE DE SAINT LOUIS ISOLADAS NO ESTADO
DO PARÁ, BRASIL.
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade
Federal
do
Pará,
como
requisito parcial para a obtenção do grau
de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos
BELÉM
2011
DANIELA SUELI GUERREIRO RODRIGUES
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FILOGEOGRAFIA DE CEPAS DO
VÍRUS DA ENCEFALITE DE SAINT LOUIS ISOLADAS NO ESTADO
DO PARÁ, BRASIL.
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade
Federal
do
Pará,
como
requisito parcial para a obtenção do grau
de Bacharel em Biomedicina, aprovado
com conceito.
_________________________
Belém (PA), 30 de Novembro de 2011.
Banca Examinadora:
____________________________________
Dra. Lívia Carício Martins
____________________________________
Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes
____________________________________
Dra. Ana Cecília Ribeiro da Cruz
i
O Senhor é o meu pastor, nada me faltará. Deitar-me faz em verdes
pastos, guia-me mansamente a águas tranqüilas. Refrigera a minha
alma; guia-me pelas veredas da justiça, por amor do seu nome. Ainda
que eu andasse pelo vale da sombra da morte, não temeria mal algum,
porque Tu estás comigo; a tua vara e o teu cajado me consolam.
Preparas uma mesa perante a mim na presença dos meus inimigos,
unges a minha cabeça com óleo, o meu cálice transborda. Certamente
que a bondade e a misericórdia me seguirão todos os dias da minha
vida; e habitarei na casa do Senhor por longos dias.
Salmo 23
ii
DEDICATÓRIA
Dedico este Trabalho de Conclusão de Curso a minha mãe querida, fonte de
inspiração, que me ensinou a caminhar quando criança e segurou minhas mãos
nos primeiros passos da formação científica.
iii
AGRADECIMENTOS
- Agradeço a Deus por todas as lições que tem me proporcionado, por ter sido meu
porto seguro e meu esteio em todos os momentos de minha vida.
- Aos meus pais, Daniel e Sueli, pelo amor a mim dedicado e por procurarem me
proporcionar sempre a melhor educação, seja em casa, ou no trabalho.
- À minha irmã Danielen por sua amizade e companheirismo.
- À coordenação e aos professores da Faculdade Biomedicina/ICB/UFPA pelo apoio
e pelos ensinamentos ao longo destes quatro anos de aprendizado.
- Ao Instituto Evandro Chagas na pessoa da Diretora, Dra. Elizabeth Santos, pela
contribuição na minha formação acadêmica mediante os estágios disponibilizados.
- Ao PIBIC/IEC na pessoa da Coordenadora, Dra. Joana Mascarenhas, pela
liberação do trabalho de iniciação cientifica para ser utilizado como parte desde
Trabalho de Conclusão de Curso.
- Ao Dr. Márcio Nunes pela orientação no projeto por mim desenvolvido no
PIBIC/IEC.
- Ao Dr. Pedro Vasconcelos pela orientação no Trabalho de Conclusão de Curso,
pelo incentivo e por acreditar em meu potencial.
- Aos amigos da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro
Chagas que contribuíram direta ou indiretamente para a execução deste trabalho.
iv
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
1.1
ARBOVÍRUS ................................................................................................. 1
1.2
FLAVIVÍRUS ................................................................................................. 2
1.3
O VÍRUS DA ENCEFALITE SAINT LOUIS (VESL). ....................................... 3
1.3.1 Estrutura viral .......................................................................................... 4
1.3.2 Genoma viral ............................................................................................ 5
1.3.3 Proteínas virais ........................................................................................ 5
1.3.4 Ciclo de vida e replicação viral .............................................................. 7
1.3.5 Ciclo de transmissão .............................................................................. 9
1.3.6 Análise filogenética ............................................................................... 10
1.3.7 Filogeografia .......................................................................................... 11
2
JUSTIFICATIVA ................................................................................................ 14
3
OBJETIVOS....................................................................................................... 15
4
3.1
PRINCIPAL ................................................................................................. 15
3.2
SECUNDÁRIOS .......................................................................................... 15
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 16
4.1
AMOSTRA .................................................................................................. 16
4.2
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR ............................................................ 16
4.2.1 Estoque viral .......................................................................................... 16
4.2.2 Extração de RNA viral ........................................................................... 17
4.2.3 Amplificação do Genoma Viral ............................................................. 19
4.2.4 Purificação ............................................................................................. 21
4.2.5 Quantificação de cDNA ......................................................................... 22
v
4.2.6 Sequenciamento nucleotídico .............................................................. 22
4.2.6.1 Reação de sequenciamento .......................................................... 22
4.2.6.2 Precipitação do produto da reação de sequenciamento ............ 22
4.2.6.3 Sequenciamento automático......................................................... 23
4.2.7 Análise das sequências nucleotídicas ................................................ 24
4.2.8 Análise filogenética do gene E ............................................................. 24
4.2.9 Análise filogeográfica do VESL............................................................ 25
5
RESULTADOS .................................................................................................. 28
5.1
IDENTIFICAÇÃO DO GENE, SEQUENCIAMENTO NUCLEOTÍDICO E
ANÁLISE FILOGENÉTICA..................................................................................... 28
5.2
FILOGEOGRAFIA DO VESL NO ESTADO DO PARÁ ................................ 31
6
DISCUSSÃO ...................................................................................................... 36
7
CONCLUSÕES .................................................................................................. 38
REFERÊNCIA............................................................................................................39
ANEXO 1....................................................................................................................50
vi
Lista de Figuras
Figura 1: Esquema da estrutura dos flavivírus............................................................4
Figura 2: Apresentação esquemática do genoma e processamento da poliproteína
dos flavivírus.................................................................................................................6
Figura 3: Replicação e ciclo de vida dos flavivírus. (A) Adsorção do vírus e entrada
na célula por endocitose. (B) Fusão das membranas viral e celular na vesícula
endossomal, desmontagem do vírus e liberação do RNA viral para o citoplasma. (C)
Tradução e processamento do RNA viral. (D) Replicação do genoma viral. (E)
Brotamento da particular viral imatura na membrana do reticulo endoplasmático
(RE). (F) Maturação viral na rede trans-golgi (RTG), por meio da clivagem de prM
mediada por furinas. (G) Saída da particular viral madura do citoplasma celular. Os
números nos quadros coloridos referem-se ao pH nos respectivos compartimentos
celulares.......................................................................................................................8
Figura 4: Ciclo de transmissão do VESL.....................................................................9
Figura 5: Distribuição dos genótipos V e VIII e respectivos subgenótipos do SLEV na
Amazônia Brasileira....................................................................................................12
Figura 6: Esquema de extração de RNA pelo método do Trizol LS..........................18
Figura 7: Representação esquemática da RT-PCR..................................................20
Figura 8: Fragmentos de cDNA referentes ao Gene E do VESL, em gel de agarose
a 1,2%. PM- peso molecular; 1- fragmento com par de primers F880/B1629; 2fragmento com par de primers F1390/B2047; 3- fragmento com par de primers
F1990/B2586..............................................................................................................28
Figura 9: Análise filogenética, empregando método Bayesiano, com base no gene E
de 55 cepas do VESL, sendo 14 cepas desse estudo (amostras em vermelho). Os
valores Bayesianos aparecem próximos aos nós da árvore......................................30
Figura 10: Distribuição geográfica dos genótipos V e VIII referentes às 14 cepas do
VESL isolada de mosquitos do gênero Culex no Estado do Pará, 1964 a 2002.......31
Figura 11: Rota de dispersão do VESL da Mesorregião do Sudoeste Paraense para
a Mesorregião Metropolitana de Belém......................................................................32
Figura 12: Dispersão do VESL para as mesorregiões do Baixo Amazonas, Sudeste
e Nordeste Paraense, a partir da Região Metropolitana de Belém............................33
vii
Figura 13: Dispersão VESL para as Mesorregiões do Baixo Amazonas, e Sudeste
Paraense partindo do sudoeste paraense.................................................................34
Figura 14: Síntese da rota histórica do VESL entre as mesorregiões do estado do
Pará............................................................................................................................35
viii
RESUMO
Introdução: O Vírus da encefalite Saint Louis (VESL; Flavivirus, Flaviviridae),
amplamente distribuído nas Américas, pode causar desde síndromes febris até
menigoencefalite fatal. Na Amazônia Brasileira, este vírus tem sido isolado de várias
espécies de aves silvestres e mosquitos, principalmente, do gênero Culex. A
caracterização genética do VESL tem sido baseada no gene E (envelope).
Objetivos: Realizar a analise filogenética e filogeografica de cepas do VESL
isoladas no Pará a partir de mosquitos do gênero Culex. Material e Métodos:
Quatorze cepas do VESL, isoladas no período de 1964 a 2002, foram analisadas. O
RNA viral foi extraído pelo método do TRIZOL LS Reagente (Invitrogen, USA) a
partir do sobrenadante de culturas de células VERO infectadas com as referidas
cepas. O Gene E, amplificado por RT-PCR e purificado, seqüenciado e empregado
na análise filogenética e filogeográfica, optando-se pelo, o método Bayesiano, dentre
outros empregados, por apresentar melhor valor de suporte. Sequências do Gene E
do VESL disponíveis no GenBank foram empregadas para dar suporte às análises.
Resultados: Das 14 cepas de VESL, sete pertencem ao genótipo V (cinco VA e
duas VB) e 7 à nova linhagem VIII (três VIIIA e quatro VIIIB). Os genótipos V e VIII
foram detectados nos municípios de diferentes mesorregiões, incluídos no estudo:
Belém (subgenótipos VA, VB e VIIIB), Tucuruí (subgenótipos VA e VIIIA), Altamira
(subgenótipos VIIIA), Medicilândia (subgenótipos VA) e Faro (subgenótipos VA e
VIIIB). O VESL emergiu na Mesorregião do Sudoeste Paraense de onde se
dispersou para a região da capital do Estado, Mesorregião Metropolitana de Belém
(MMB), na década de 1960. Da MMB se dispersou para a Mesorregião do Baixo
Amazonas (MBA) e do Sudeste Paraense (MSEP), nas décadas de 1970-80. O
VESL foi reintroduzido na MBA e MSEP a partir do Sudoeste Paraense, na década
de 1990. Conclusão: As cepas do VESL estudadas pertencem ao genótipo V
(subgenótipo VA e VB) e ao genótipo VIII (subgenótipo VIIIA e VIIIB); e evidenciaram
a implicação dos mosquitos do gênero Culex na manutenção do genótipo V e VIII do
VESL no Estado do Pará. O VESL teve ampla dispersão entre as mesorregiões do
Estado do Pará, após emergir no Sudoeste Paraense e dispersar-se para a região
metropolitana de Belém, capital do Estado do Pará.
Palavras-chaves: Encefalite Saint Louis, Flavivirus, Arbovírus, Culex, gene E.
1
1
1.1
INTRODUÇÃO
ARBOVÍRUS
Os arbovírus, do inglês arthropod-borne virus, foram assim designados
por constituírem um grupo de vírus que é transmitido biologicamente por meio da
picada de um artrópode hematófago infectado para um vertebrado suscetível após
um período de incubação extrínseco. A manutenção destes vírus em ambiente
silvestre ocorre mediante um ciclo enzoótico que envolve artrópodes, geralmente
mosquitos, como vetores, e animais vertebrados, como hospedeiros virais (WHO,
1967). Entretanto, a infecção por arbovírus também pode ocorrer em humanos,
principalmente em pessoas que exercem atividades próximas a regiões onde
ocorrem os ciclos de manutenção desses vírus. Além disso, também tem sido
verificada a ocorrência de arboviroses em áreas urbanas no Brasil, sob a forma
endêmica e/ou epidêmica, como exemplo, Dengue e Oropouche (Travassos da
Rosa et al., 1997).
Encontram-se
registrados
cerca
de
537
arbovírus
no
Catálogo
Internacional dos Arbovírus (Karabatsos et al., 2002), dos quais 134 são
considerados causadores de doença humana (Gubler, 1998).
De acordo com suas características antigênicas os arbovírus estão
distribuídos em 63 grupos antigênicos. Por esta classificação, cada sorogrupo é
formado por dois ou mais vírus relacionados antigenicamente, de acordo com um ou
mais testes sorológicos (Casals, 1957).
Os
arbovírus
possuem
uma
classificação
taxonômica
bastante
diversificada, e são distribuídos em famílias de acordo com as suas características
físico-químicas. As principais famílias dos arbovírus são: Bunyaviridae, Flaviviridae,
Reoviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae. Porém, sabe-se que vários vírus dessas
famílias não são transmitidos por artrópodes e não são considerados como
arbovírus, além desses existem outros que ainda não foram classificados
taxonomicamente (Travassos da Rosa et al., 1997).
Diversos vírus da família Flaviviridae, gênero flavivirus constituem
importante causa de doença em humanos e animais, alguns dos quais se encontram
distribuídos mundialmente (Gubler et al. 2006). O Vírus da encefalite Saint Louis
(VESL) é um flavivírus encefalitogênico que se encontra amplamente distribuído nas
Américas (Gubler et al., 2006).
2
1.2
FLAVIVÍRUS
Os flavivírus compreendem cerca de 70 vírus, dos quais 53 são
considerados arbovírus, sendo que 27 são transmitidos por mosquitos, 12 são
transmitidos por carrapatos, e 14 são agentes zoonóticos com vetor desconhecido
(ICTV, 2005). Desse total, 40 vírus são conhecidos por causar doenças em
humanos, sendo 22 vírus transmitidos por mosquitos, 13 transmitidos por carrapatos
e cinco vírus classificados com agentes com vetor desconhecido (Gubler et al.,
2006).
Estruturalmente,
os
flavivírus
são
partículas
esféricas,
de
aproximadamente 50nm de diâmetro, constituídas por um núcleocapsídeo, de
simetria icosaédrica, com cerca de 30nm, envolto por um envelope lipídico (Murphy,
1980; Chambers & Monath, 2003). O genoma dos flavivírus corresponde a uma fita
simples de RNA de polaridade positiva com aproximadamente 11.000 nucleotídeos
(Rice et al., 1986).
Considerando as características clínicas, ecológicas, e também os vetores
e hospedeiros de cada flavivírus, foi possível agrupá-los em quatro grandes grupos
evolutivos: dois grupos de vírus transmitidos por mosquitos, um grupo de vírus
transmitido por carrapatos e outro grupo de vírus com vetores desconhecidos (Gould
et al., 2003). Atualmente, a análise parcial ou total do genoma de um número
crescente de flavivírus possibilitou a construção de árvores filogenéticas, que
confirmaram esses agrupamentos por meio de padrões característicos de
ramificação devido o relacionamento (proximidade) filogenético (Gould et al., 2003).
Desta maneira, os flavivírus transmitidos por mosquitos são divididos em
dois grandes grupos evolutivos (Gaunt et al., 2001; Kramer & Ebel., 2003; Sabin et
al., 1959), um é formado pelos flavivírus encefalitogênicos, os quais correspondem
ao grupo da encefalite japonesa, que inclui: o Vírus da encefalite Japonesa, o Vírus
do Nilo Ocidental, o Vírus da encefalite Murray Valley, o Vírus Rocio e o VESL; o
outro grupo evolutivo é formado por vírus viscerotrópicos que podem causar febre
hemorrágica, onde se incluem o Vírus da Febre Amarela e o Vírus Dengue (Gubler
et al., 2002).
De modo geral, os flavivírus transmitidos por mosquitos possuem dois
principais ciclos de manutenção, cada um correspondendo especificamente a um
dos grupos evolutivos. O ciclo de manutenção dos vírus encefalitogênicos ocorre
3
entre aves, como hospedeiros vertebrados naturais, e mosquitos do gênero Culex,
como vetores primários, enquanto a manutenção dos vírus viscerotrópicos ocorre em
um ciclo silvestre, entre primatas não humanos e mosquitos dos gêneros Aedes e
Haemagogus como vetores primários (Gubler et al., 2006).
1.3
O VÍRUS DA ENCEFALITE SAINT LOUIS (VESL).
O VESL pode causar infecção inaparente ou aparente em seres
humanos;
cujas
manifestações
clínicas
vão
desde
síndrome
febril
a
menigoencefalite fatal (Reisen, 2003; Travassos da Rosa et al., 1997, Vasconcelos
et al., 1998). A severidade das infecções também aumenta com a idade; sendo
assim, observa-se maior frequência de encefalite em idosos (Wooton, 2004). A taxa
de letalidade do VESL alcança aproximadamente 5% em pacientes com idade
abaixo de 49 anos, e 23% naqueles que possuem mais de 70 anos de idade (Day,
2001).
O VESL encontra-se amplamente distribuído nas Américas, sendo
detectado desde o Canadá até a Argentina, todavia as cepas isoladas nos Estados
Unidos (EUA) e Canadá aparentemente mostram-se mais virulentas, ou seja,
causariam mais encefalite em humanos, se comparadas com aquelas isoladas no
Caribe e nas Américas Central e do Sul (Gubler et al., 2006).
O isolamento protótipo do VESL foi obtido durante o surto de 1933 em St.
Louis, Missouri, EUA; desde então casos e surtos epidêmicos de encefalite têm sido
atribuídos ao VESL nesse país (Reisen, 2003).
No Brasil, a primeira evidência da circulação do VESL foi registrada em
1953, por meio da detecção de anticorpos neutralizantes anti-VESL em residentes
da região amazônica (Causey & Theiller 1958). Contudo, o primeiro isolamento do
VESL ocorreu em 1964, a partir de um lote de mosquitos Sabethes belisarioi,
capturados na rodovia Belém-Brasília (Causey et al., 1964).
Três cepas foram isoladas a partir de casos humanos no Brasil: duas de
pacientes com febre e icterícia no Pará (Pinheiro et al., 1981; Travassos da Rosa et
al., 1997, Vasconcelos et al., 1998) e uma de paciente com suspeita clínica de
dengue, em São Paulo (Rocco et al., 2005). Também em São Paulo, o VESL foi
detectado por técnicas moleculares em quatro pacientes com suspeita de dengue, e
em outros dois com suspeita de meningoencefalite viral durante uma epidemia de
4
dengue (Mondini et al., 2007a, Mondini et al., 2007b). Além disso, houve também o
isolamento do VESL nas regiões amazônica e sudeste do Brasil a partir de
artrópodes hematófagos e vertebrados silvestres (aves silvestres, roedores,
primatas, etc.) (Lopes et al., 1979; Travassos da Rosa et al., 1997; Vasconcelos et
al., 1998).
1.3.1 Estrutura viral
O VESL apresenta, aproximadamente, 50nm de diâmetro (Murphy, 1980)
e, assim como os demais flavivírus, é constituído por um núcleo icosaédrico
composto por cópias da proteína do capsídeo (C), que contém o genoma viral,
revestido por um envelope lipídico proveniente da membrana da célula hospedeira
(Murphy, 1980; Chambers e Monath, 2003).
Na superfície do envelope da partícula viral madura estão inseridas outras
duas proteínas codificadas pelo vírus: a proteína do envelope (E) e a proteína
precursora de membrana (prM), no vírus imaturo, ou a proteína de membrana (M) no
vírus maduro (Lindenbach & Rice, 2003) (Figura 1).
Fonte: ICTV, 2005.
Figura 1: Representação esquemática da partícula dos flavivírus. A) aspecto
intracelular (vírus imaturo);B) aspecto extracelular ( vírus maduro).
5
1.3.2 Genoma viral
O genoma do VESL é constituído de uma fita simples de ácido
ribonucléico (RNA), de polaridade positiva e com aproximadamente 11 kb de
comprimento (Chambers et al., 1990a). A região codificante (ORF) do RNA viral
consiste em uma cadeia longa de aproximadamente 10,800 nucleotídeos, a qual é
flanqueada pelas regiões não-codificadoras (NCR), uma pequena, 5’NCR, e outra
maior, 3’NCR (Chambers, 1990a, Lindenbach & Rice, 2003). A extremidade 5’ do
RNA dos flavivírus é modificada por meio da adição da 5’-7-metil-guanosina (Cap)
(Ferreira et al., 2008), além disso, a sua extremidade 3’ terminal não é poliadenilada
(Wengler et al., 1978).
A 5’NCR desempenha importante função na replicação viral, uma vez
que, nas fitas de RNA de polaridade negativa, esta representa uma região
complementar, que serve como sítio de início da síntese de RNA de polaridade
positiva, que atuará como material genômico das novas partículas virais (Cahour et
al., 1995).
O genoma dos flavivírus atua como RNAm para a tradução das proteínas
virais. A tradução da ORF do genoma do VESL, como dos demais flavivírus, codifica
uma poliproteína que origina três proteínas estruturais: C, prM/M e E; e sete
proteínas não estruturais (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. As
proteínas estruturais estão mais próximas da porção 5’ do genoma, enquanto que as
proteínas não estruturais localizam-se mais próximas à região 3’, na ordem: 5’-CPrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ (Chambers, 1990ª; Lindenbach &
Rice, 2003) (Figura 2).
1.3.3 Proteínas virais
Dentre as proteínas estruturais, a proteína E, com 53 kDa, atua como um
importante determinante antigênico da partícula viral, induzindo a produção de
anticorpos neutralizantes que são responsáveis pela resposta imune protetora
(Gubler, 2006). Além disso, a proteína E medeia os processos de adsorção e fusão
durante a entrada do vírus na célula hospedeira (Hearn, 1965; Russell et al., 1980;
Chambers e Monath, 2003; Lindenbach & Rice, 2003).
6
Fonte: Adaptado de ICTV, 2005.
Figura 2: Representação esquemática da organização genômica e processamento
da poliproteína dos flavivírus.
A proteína M, observada no vírus maduro, é produzida durante a
maturação da partícula viral nascente no interior das vias secretórias (Lindenbach &
Rice, 2003), por meio da clivagem de prM em pr e M por furinas no Complexo de
Golgi (Stadler et al., 1997). O segmento pr estabiliza a proteína E e impede que esta
sofra rearranjo para sua forma fusogênica em pH reduzido da via secretora inicial
(Guirakhoo et al., 1991, 1992).
A proteína C possui aproximadamente 11 kDa de comprimento (Boege et
al., 1983; Rice et al., 1985; Trent et al., 1977). A proteína C nascente (anchC)
contém uma região hidrofóbica de ancoragem que desempenha função de peptídeo
sinal na translocação de prM ao retículo endoplasmático. Esse domínio hidrofóbico é
clivado para a maturação da proteína C pela protease serina viral (Amberg et al.,
1994; Lobigs, 1993; Yamshchikov and Compans, 1994).
Dentre as proteínas não estruturais, a proteína NS1 desempenha
importante função na replicação do genoma viral, uma vez que contém os sítios
7
mais prováveis de replicação do RNA (Mackenzie et al., 1996); é translocada para o
retículo endoplasmático e separada da proteína E pela peptidase sinal do
hospedeiro (Chambers et al., 1990b; Falgout et al., 1989; Falgout and Markoff,
1995).
A função desempenhada pela forma extracelular de NS1 ainda não está
bem definida, contudo, sabe-se que durante a infecção, esta proteína induz uma
forte resposta humoral (Falgout et al., 1990; Jacobs et al., 1992; Lin et al.,1998; Qu
et al., 1993; Schlesinger et al., 1985, 1993; Timofeev et al., 1998), além disso, os
anticorpos contra a NS1 de superfície também podem induzir a lise das células
infectadas mediada por complemento (Henchal et al., 1988; Schlesinger et al., 1985,
1993).
A proteína NS2A está provavelmente envolvida na coordenação de
mudanças entre os processos de empacotamento e replicação do RNA (Khromykh
et al., 2001b). Ademais, NS3 e NS2B possuem atividade proteolítica e NS5 atua
como polimerase RNA dependente de RNA e também como metiltransferase
(Brinton, 2002). A proteína NS4A atua como replicase (Lindenbach and Rice, 1999)
e também está envolvia no processo de rearranjo da membrana (Roosendaal et al.,
2006.
1.3.4 Ciclo de vida e replicação viral
A adsorção e a entrada do vírus na célula hospedeira ocorrem por meio
de endocitose mediada por receptor celular. A acidificação da vesícula endossomal
desencadeia mudanças conformacionais no virion, bem como a fusão das
membranas virais com a celular e também na desmontagem da partícula (Allison et
al., 1995).
No citoplasma da célula hospedeira, o RNA viral tem várias funções,
como: RNAm para a tradução das proteínas virais; molde para a síntese de RNA; e
nova fita de RNA que será empacotada nas partículas virais nascentes (Lindenbach
et al.,2007).
Para que haja a replicação do genoma viral, inicialmente deve ocorrer a
tradução da poliproteína viral precursora completa, a qual é processada por
proteases virais e origina as proteínas estruturais e as não estruturais. As proteínas
8
não estruturais, então, associam-se ao RNAm viral para iniciar a transcrição de uma
fita de RNA complementar a partir do molde genômico viral (Ferreira et al., 2008).
A síntese do RNA viral ocorre nas membranas do retículo endoplasmático
perinuclear, sendo observada em três horas pós-infecção (Lindenbach & Rice,
1997), enquanto que, as partículas virais imaturas são formadas no lúmen do
retículo endoplasmático e, posteriormente, tornam-se maduras durante a clivagem
da prM na rede trans-Golgi (Stadler et al., 1997; Elshuber et al., 2003) (Figura 3).]
Fonte: Perera, 2008.
Figura 3: Replicação e ciclo de vida dos flavivírus. (A) Adsorção do vírus e entrada
na célula por endocitose. (B) Fusão das membranas viral e celular na vesícula
endossomal, desmontagem do vírus e liberação do RNA viral para o citoplasma. (C)
Tradução e processamento do RNA viral. (D) Replicação do genoma viral. (E)
Brotamento da particular viral imatura na membrana do reticulo endoplasmático
(RE). (F) Maturação viral na rede trans-golgi (RTG), por meio da clivagem de prM
mediada por furinas. (G) Saída da particular viral madura do citoplasma celular. Os
números nos quadros coloridos referem-se ao pH nos respectivos compartimentos
celulares.
9
1.3.5 Ciclo de transmissão
O VESL é mantido e amplificado em natureza por meio de um ciclo
enzoótico primário que envolve aves silvestres, principalmente columbiformes e
passeriformes, como hospedeiros vertebrados (Tsai, 1986) e mosquitos do gênero
Culex como vetores primários (Reisen, 1992); o homem e os mamíferos silvestres
não participam do ciclo biológico primário do VESL, podendo ser considerados
hospedeiros acidentais (Monath & Heinz 1996) (Figura 4).
Figura 4: Ciclo de transmissão do VESL.
Contudo, o ciclo de transmissão pode variar regionalmente, dependendo
da biologia das espécies de mosquitos, da virulência das cepas de VESL e da
suscetibilidade do hospedeiro vertebrado à infecção (Monath & Tsai 1987, Day 2001,
Reisen, 2003).
Em geral, nos EUA, o vírus é isolado de Culex pipiens, mas no estado da
Flórida, o vírus é mais frequentemente isolado de Culex nigripalpus (Day, 2001). Por
outro lado, na Amazônia Brasileira, o VESL tem sido principalmente isolado de
mosquitos do gênero Culex (Travassos da Rosa et al., 1997, Vasconcelos et al.,
10
1998), principalmente das espécies Culex declarator e Culex coronator. Ressalta-se
que no Brasil, isolamentos do VESL também têm sido obtidos a partir de outros
gêneros de mosquitos como Mansonia, Haemagogus, e Sabethes (Vasconcelos et
al., 1991; Dégallier et al., 1992).
Pode, ainda, ocorrer transmissão vertical do VESL pelo mecanismo de
transmissão transovariana, na qual o vírus é passado de uma geração de
hospedeiro artrópode infectado para a seguinte, por meio de ovos infectados
(Rosen, 1987).
1.3.6 Análise filogenética
Estudos anteriores, envolvendo a análise filogenética do gene de
envelope (E) (Kramer & Chandler, 2001) e da ORF (Baillie, 2008) de cepas do VESL
revelaram uma grande diversidade genética do VESL nas Américas.
A análise filogenética do gene E de 62 cepas do VESL isoladas ao longo
de sua área de distribuição geográfica demonstrou a existência de sete linhagens
(genótipos), nas quais os isolados foram agrupados predominantemente, mas não
estritamente, segundo a sua origem geográfica (Kramer & Chandler, 2001).
A linhagem I compreendeu isolamentos dos EUA ocidental e foi dividida
em 2 sub-grupos: IA e IB. A linhagem II reuniu o maior número de isolados e foi
dividida em 6 sub-grupos: sub-grupo IIA com isolamentos das Américas do Norte e
Central, do sul da Florida, EUA, Texas, e Brasil; sub-grupo IIB com isolamentos da
Flórida e Texas; IIC com cepas de várias origens geográficas dos EUA (Califórnia);
IID com cepas isoladas nos EUA (Florida), México e Panamá; e o sexto sub-grupo
IIF com isolamentos da Guatemala. A linhagem III consistiu-se de uma única cepa
da Argentina, isolada de mosquito. Enquanto que a linhagem IV conteve vários
isolamentos do Panamá, a partir de mosquitos. A linhagem V foi dividida em dois
sub-grupos: o VA com isolamentos do Brasil, Argentina, Peru e Trinidad; e o VB com
3 isolamentos do Brasil. A Linhagem VI constituiu-se em uma única cepa do
Panamá, isolada de galinha (Gallus g. domesticus) sentinela . A linhagem VII reuniu
cepas da Argentina, obtidas a partir de roedores. Esta análise indicou que
predomina um ciclo de manutenção local do VESL, mas ocasionalmente o VESL tem
sido transportado entre áreas dentro e fora dos EUA (Kramer & Chandler, 2001;
Reisen, 2003).
11
May e colaboradores (2008) sequenciaram o gene E de 25 isolados do
Texas, 1 da Jamaica, e 2 da California, e analisaram filogeneticamente esses
isolados em comparação as sequências de VESL já disponíveis no GenBank. Essa
análise filogenética, que incluiu 106 isolados do VESL, corroborou a classificação do
VESL em sete linhagens proposta por Kramer & Chandler (2001).
Posteriormente, o estudo de 30 cepas de VESL isoladas na Amazônia
brasileira, também baseado na análise filogenética do gene E, demonstrou a
existência de um novo genótipo, designado VIII, composto pelos sub-genótipos VIIIA
e VIIIB (Rodrigues et al., 2010b).
O genótipo II está praticamente restrito à América do Norte, enquanto que
os genótipos I e III a VIII estão mais distribuídos nas Américas Central e do Sul, no
Caribe, assim como nos EUA (Kramer & Chandler, 2001; Rodrigues et al., 2010b). O
genótipo II foi detectado no sudeste do país (São Paulo) do Brasil (Kramer &
Chandler, 2001). Os genótipos V e VIII são amplamente distribuídos na Amazônia
brasileira, especialmente no Estado do Pará (Rodrigues et al., 2010b) (Figura 5). Os
genótipos V e VIII são mais prevalentes no Brasil, sendo o genótipo VIII detectado
entre cepas do VESL isoladas nas décadas de 1960, 1970 e 1980 (Rodrigues et al.,
2010b).
1.3.7 Filogeografia
A análise filogeográfica é uma abordagem comum em ecologia molecular,
que conecta processos históricos da evolução com a distribuição espacial de um
grupo de organismos de uma mesma unidade taxonômica numa escala de tempo de
décadas (Knowles & Maddison, 2002; Lemey, 2009); a fim de rastrear sua possível
rota de dispersão por meio da utilização de métodos probabilísticos que avaliam as
informações moleculares que os processos epidemiológicos espaciais deixam no
genoma de cada organismo estudado (Faria et al, 2011).
A filogeografia teve início em 1987 com o estudo filogeográfico baseado
no DNA mitocondrial e foi anunciada como a ponte ligando os estudos dos
processos macro e microevolutivos (Avise, 1987; Bermingham & Moritz, 1998).
Desde então, diversos avanços nos métodos probabilísticos e nas ferramentas
estatísticas têm possibilitado a localização de traços evolutivos de diversos
organismo.
12
Fonte: Rodrigues et al., 2010b.
Figura 5 - Distribuição dos genótipos V e VIII e respectivos subgenótipos do SLEV
na Amazônia Brasileira
A emergência e a circulação de muitos microrganismos patógenos no
mundo acompanham o desenvolvimento das civilizações humanas e do comércio
global e a filogeografia desses agentes são impactadas pelas forças humamas,
evolutivas e ecológicas (Keim & Wagnner, 2009). Os vírus de RNA, como os
flavivirus, possuem taxa de mutação relativamente elevada (Twiddy et al., 2003;
Bryant et al, 2007; Rodrigues et al. 2010b). Nestes microrganismos a evolução está
ocorrendo simultaneamente com a dispersão geográfica (Faria et al., 2011), e a
análise filogeografica tem sido utilizada na determinação da paisagem histórica das
rotas de dispersão e emergência de flaviviroses de importância em saúde pública
mundial, como dengue e febre do Nilo (May et al., 2010; Rabaa et al., 2010).
O objetivo do estudo filogeográfico dos vírus é realizar a estimativa do
local ancestral em uma árvore filogenética condicionada aos locais de origem das
13
sequencias virais representadas nos braços da árvore. Partindo desta premissa,
uma gama de método têm sido desenvolvidos, os quais podem ser categorizados de
acordo com o critério que utilizam para escolher entre hipósteses alternativas
(Bloomquist et al., 2010; Faria et al., 2011).
As informações geradas pelos estudos filogeográficos são importantes
ferramentas epidemiologicas uma vez que, além da perspectiva histórica da
evolução viral, também têm como potencial prever a emergência de doenças
infecciosas por meio da identificação de reservatórios e áreas geográficas nas quais
a emergência e a dispersão de novas infecções são propensas a ocorrerem (Faria et
al., 2011), propiciando intervenções efetivas mediante a elaboração de estratégia de
prevenção contra epidemias (Wallace & Fitch, 2008; Lemey et al, 2009). Além disso,
a filogeografia possibilita a elucidação do impacto que o movimento de animais, ou,
ainda, a mobilidade humana podem causar na dispersão das doenças virais (Faria et
al., 2011).
14
2
JUSTIFICATIVA
O potencial encefalitogênico e de causar epidemias do VESL, além da
evidência da subdetecção de casos clínicos no Brasil fazem necessário um maior
conhecimento dos aspectos epidemiológicos do VESL em nosso país.
Estudos sobre arboviroses realizados, principalmente, nos Estados do
Pará e São Paulo contribuíram com achados sobre aspectos epidemiológicos do
VSLE. O acervo de cepas do VESL obtido nas últimas cinco décadas no Pará, pelo
Instituto Evandro Chagas, permite o desenvolvimento de investigações utilizando
ferramentas de biologia molecular e bioinformática que proporcionarão um
conhecimento sobre a epidemiologia molecular, revelando informações sobre
variabilidade genética, evolução e dispersão (filogeografia) do VESL. Essas
informações contribuirão no preenchimento de lacunas do conhecimento que
permitirão melhor entendimento do comportamento epidemiológico do VESL, como
vem ocorrêndo com outros flavivírus de inportância em saúde publica.
O maior conhecimento a cerca da filogeografia dos patógenos possibilta a
identificação de áreas geográficas nas quais a emergência e a dispersão desses
agentes são propensas a ocorrerem e, consequentemente, permite a elaboração de
medidas preventivas contra epidemias, o que é de extrema importância para a
vigilância epidemiológica.
As crescentes alterações ambientais e a ocupação de áreas desmatadas
pelo homem, devido a expansão populacional, propicia maior contato das
populações humanas com agentes e vetores de arboviroses, podendo dessa forma
favorecer a emergência e/ou reemergência de arbovírus, inclusive VESL.
15
3
3.1
OBJETIVOS
PRINCIPAL
- Realizar a caracterização molecular de isolados do Vírus da encefalite
de Saint Louis (VESL) obtidos no Estado do Pará pelo IEC.
3.2
SECUNDÁRIOS
- Seqüenciar completamente o gene do envelope de cepas do VESL
selecionadas para o estudo.
- Analisar filogeneticamente as cepas do VESL com base no gene do
envelope.
- Contribuir com a epidemiologia molecular do VESL por meio da geração
de novas informações sobre a dispersão do vírus.
16
4
4.1
MATERIAL E MÉTODOS
AMOSTRA
Foram analisadas 14 cepas do VESL isoladas no Estado do Pará, a partir
de mosquitos do gênero Culex, as quais foram obtidas no período de 1964 a 2002,
pertencentes a coleção viral da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do
Instituto Evandro Chagas (SAARB-IEC) (Quadro 1).
Quadro 1- Cepas do VESL selecionadas para sequenciamento nucleotídico do gene
E.
Cepa
do Ano
de Município de
VESL
isolamento origem
Fonte
Designação
Ar 74070
1964
Belém
Culex declarator BRA-64B
Ar 147139
1968
Belém
Culex coronatar
BRA-68B
Ar 190546
1970
Belém
Culex spissipes
BRA-70
Ar 263600
1974
Belém
Culex declarator BRA-74E
Ar 264588
1974
Belém
Culex declarator BRA-74F
Ar 264585
1974
Belém
Culex declarator BRA-74H
Ar 410054
1982
Tucuruí
Culex coronatar
BRA-82B
Ar 413721
1983
Altamira
Culex coronatar
BRA-83B
Ar 423357
1984
Altamira
Culex declarator BRA-84G
Ar 424447
1984
Faro
Culex species
BRA-84H
Ar 424449
1984
Faro
Culex species
BRA-84I
Ar 476060
1984
Tucuruí
Culex declarator BRA-84J
Ar 501019
1990
Tucuruí
Culex declarator BRA-90
Ar 658688
2002
Medicilândia Culex declarator BRA-02
Ar: artrópode; BRA: Brasil
As cepas virais foram isoladas por meio da inoculação intracerebral em
camundongos recém nascidos, e após uma passagem foram liofilizados e
armazenados a -70 °C.
4.2
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
4.2.1 Estoque viral
Para obtenção do estoque viral, as cepas liofilizadas do VESL foram
hidratadas com 0,5 mL de água destilada, sendo em seguida inoculadas em cultura
17
de células renais de macaco verde africano (VERO) em meio de cultura 199
contendo fungizona e penicilina.
Para a manutenção da linhagem celular foram utilizadas garrafas estéreis
de 50 cm3, nas quais foram adicionados 9 mL de meio de crescimento 199 com 5%
de soro bovino fetal (SBF) e 1 mL de suspensão celular. Cada garrafa contendo
meio de cultura e suspensão celular foi incubada a 37 °C por 3 a 4 dias, até a
formação completa da monocamada celular.
Uma vez completa a monocamada de células VERO, o meio de
crescimento contido nas garrafas foi trocado por meio de manutenção 199 com 2%
de SBF para a inoculação viral. Foram inoculados 250 µL de suspensão viral em
cada cultura celular. As culturas de células VERO infectadas foram incubadas a 37
°C até o aparecimento do efeito citopático, em média 7 dias. Durante o período de
incubação, as culturas infectadas foram observadas diariamente, quanto a seus
aspectos macroscópicos e microscópicos, e o sobrenadante foi colhido quando o
efeito citopático alcançava aproximadamente 75% da monocamada celular.
Posteriormente, as culturas infectadas foram aliquotadas em microtubos estéreis de
polipropileno de 1,5mL e armazenadas em freezers a temperatura de -70°C para
posterior extração do RNA viral.
4.2.2 Extração de RNA viral
O RNA do VESL foi extraído utilizando-se TRIzol LS Reagente
(Invitrogen, EUA), a partir do sobrenadante de células VERO infectadas com as
cepas do VESL, este método pode ser dividido em 5 etapas: homogeneização;
segregação de fases; precipitação do RNA; lavagem do RNA e dissolução do RNA
em água RNase-free (Figura 6).
18
Figura 6: Esquema de extração de RNA pelo método do Trizol LS reagente.
Na etapa de homogeneização ocorrem: lise celular, dissolução dos
componentes celulares e extração do RNA viral. Para isso, foram homogeneizados
750 µL de Trizol LS reagente em cada alíquota de 250 µL das culturas de células
infectadas, respeitando-se a proporção de 3: 1 sugerida no protocolo oferecido pelo
fabricante. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 5 minutos,
para a completa dissociação dos complexos protéicos.
Para se obter a segregação das fases aquosa e orgânica das soluções,
foram adicionados 200 µL de clorofórmio. Logo após a adição do clorofórmio, as
soluções foram homogeneizadas vigorosamente por 15 segundos, incubadas a
temperatura ambiente (15 a 30°C) por 10 minutos, e, então, centrifugadas a 12000xg
por 15 minutos sob refrigeração (2 a 8 °C). Após a centrifugação a mistura se separa
em uma fase de fenol-clorofórmio (vermelha), uma fase intermediária (branca), e
uma fase aquosa (incolor) que contém o RNA viral.
Para a etapa de precipitação do RNA, a fase aquosa de cada mistura foi
transferida para tubos limpos de polipropileno, e então acrescidos de 500 µL de
isopropanol com posterior incubação a temperatura ambiente por 10 minutos
seguida de centrifugação a 12000xg por 10 minutos sob refrigeração. Após a
centrifugação o RNA precipitado forma um pellet invisível aderido ao fundo do tubo.
19
Para lavagem do RNA, após desprezar o sobrenadante de isopropanol,
foi adicionado 1 mL de etanol 75% e em seguida as amostras foram
homogeneizadas em vortex e centrifugadas a 7500xg por 5 minutos sob
refrigeração.
Ao fim do procedimento, para a dissolução do RNA em água RNase-free,
o sobrenadante de etanol a 75% foi desprezado, e o pellet foi brevemente seco em
cabine de fluxo laminar. O RNA foi solubilizado em 20 µL de água RNase-free.
4.2.3 Amplificação do Genoma Viral
O gene E do VESL foi amplificado em reações de 50 µL, sendo 5 µL de
RNA extraído e 45 µL da mistura dos componentes para reação de amplificação
(MIX). As reações foram realizadas em termociclador (GeneAmp PCR Systems
9700, Applied Biosystems, EUA) pela técnica de RT-PCR segundo protocolo
descrito por Lanciotti e colaboradores (1992), utilizando 3 pares de oligonucleotídeos
específicos para a região do envelope descritos por Kramer & Chandler (2001)
(Quadro 2).
Quadro 2- Primers para amplificação do gene de envelope do VESL por RT-PCR.
Primer
Posição
no Sentido Sequência 5’-3’
Genoma
F880
880-901
(pb)
S
CGATTGGATGGAT
GCTAGGTAG
B1629
F1390
1608-1629
1390-1411
AS
S
GGTTCAAGTCGTG
F1990
2047-2064
1990-2014
AS
S
2586-2562
AS
RT/PCR
749
Sequenciamento
PCR
Sequenciamento
GTGCATGGTTCAA
RT/PCR
TCGCTCCCCCTGT
674
Sequenciamento
PCR
GCTTA
Sequenciamento
CTGCAAACCTCAT
RT/PCR
GGATTTGACACC
B2586
Envolvidas
AAACCAGTC
CGGACTCTAC
B2047
Produto Etapas
CAGTTGGAGTCAG
AGGGAAATACTT
Fonte: Kramer e Chandler, 2001.
572
Sequenciamento
PCR
Sequenciamento
20
Para cada par de primers foi preparada uma MIX contendo: H2O Rnase
free, tampão de PCR 1X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,3; KCL 75 mM), MgCl2 1,5, M,
dNTPS 200 µM, DTT 5 mM, primers senso e antisenso (50 pmol), enzima inibidora
de RNAse (RNAsin RNase inhibitor, Invitrogen, EUA), enzima transcriptase reversa
(Superscript ™ II Reverse Transcriptase, Invitrogen, EUA) e 1,125 U de enzima DNA
polimerase (Platinum Taq DNA polimerase, Invitrogen, EUA).
O RNA viral foi convertido em DNA complementar (cDNA) antes do
processo de amplificação enzimática por uma reação de transcrição reversa (RT),
utilizando-se a enzima transcriptase reversa e o primer consenso de cada fragmento
do RNA a ser amplificado a uma temperatura de 45ºC por 60 minutos. A
amplificação por polimerase subsequente foi realizada a partir do cDNA resultante
da transcrição reversa.
O cDNA foi amplificado em 40 ciclos com etapas de desnaturação (94 ° C,
30 s), anelamento dos primers (60 °C, 1 minuto) e extensão da cadeia de cDNA (68
°C, 3 minutos), em seguida a PCR foi finalizada a 72 ºC por 10 minutos (Figura 7).
Figura 7: Representação esquemática da RT-PCR.
21
4.2.4 Purificação
Os produtos da RT-PCR foram purificados empregando-se o kit PureLink
(Invitrogem, EUA), após eletroforese em gel de agarose 1,2% corado com
SyberSafe (0,5 µL/10 mL). O processo de purificação pode ser divido em quatro
etapas: solubilização dos fragmentos de gel de agarose contendo o cDNA; captura
do cDNA colunas de purificação, lavagem do cDNA retido na coluna; e dissolução do
cDNA agregado à sílica das colunas de purificação.
As bandas correspondentes aos fragmentos do gene E, visualizadas no
gel de agarose, foram recortadas e colocados em microtubos estéreis de
poliacrilamida de 1,5 mL, previamente pesados em balança de precisão. Os tubos
contendo os fragmentos de gel de agarose foram pesados novamente para se obter
a quantidade de gel com cDNA presente em cada tubo, mediante subtração dos
pesos do tubo com e sem o fragmento.
Para a solubilização do gel foram utilizado 3 volumes do tampão de
solubilização do kit para 1 volume do gel e as amostras foram incubadas em banho
Maria a 50º C por 15 minutos. As amostras solubilizadas foram transferidas para
colunas de purificação com membranas de sílica acopladas aos tubos coletores.
Após centrifugação a 14000rpm por 1 minuto o tampão foi filtrado para o tubo coletor
e o cDNA ficou ligado à sílica da coluna de purificação reteve o cDNA. O filtrado foi
descartado para iniciar a etapa subsequente.
Para lavagem do cDNA foi acrescentado 700 µl do tampão de lavagem do
kit para eliminar resquícios de agarose da coluna, e após centrifugação a 14000 rpm
por 1 minutos os filtrados foram descartados. Nova centrifugação a 14000 rpm por 3
minutos foi realizada para garantir a eliminação do tampão de lavagem e em seguida
as colunas foram transferidas para tubos tipo eppendorf de 1,5 mL, estéreis.
O cDNA foi recuperado do filtro de sílica pela adição de 50 µL de tampão
de eluição em cada coluna de purificação. Após incubação de 1 minuto em
temperatura ambiente, a coluna foi centrifugada a 14000 rpm por 1 minuto, e o
filtrado contendo o cDNA foi armazenado a -20º C para posterior quantificação e
sequenciamento nucleotídico.
22
4.2.5 Quantificação de cDNA
O cDNA obtido a partir das cepas do VESL em estudo foram
quantificadas, após quantificação, empregando-se o espectrofotômetro Nanodrop
2000 Thermo scientific.
4.2.6 Sequenciamento nucleotídico
Os produtos da RT-PCR, após purificação e quantificação, foram
seqüenciados em seqüenciador automático ABI 3130 (Applied Biosystems) usando o
kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied
Biosystems, EUA), empregando o método de terminação em cadeia de
dideoxinucleotideos marcados (Sanger et al. 1977). Os primers utilizados no
seguenciamento foram os mesmos da reação de RT-PCR, conforme descritos no
quadro 2.
4.2.6.1 Reação de sequenciamento
Cada reação de sequenciamento continha 8 µL de MIX Terminator Ready
Reaction (com os deoxinucleotídeos- dNTPs e dideoxinucleotídeos marcadosddNTPs), primer (3,2 pmol), 10ng cDNA viral e água RNase free quantidade
suficiente para 20 µL. As reações foram processadas em termociclador automático
(GeneAmp PCR Systems 9700, Applied Biosystems, EUA) programado para realizar
uma etapa inicial de desnaturação de 95 ºC por 3 minuto, seguida de 25 ciclos de 96
ºC por 30 segundos e 55 ºC por 15 segundos, e mais uma extensão final de 60 ºC
por 4 minutos. Após a termociclagem, o produto da reação de seqüenciamento deve
ser conservado a 4-8 ºC ou -20 ºC e protegido da luz, para evitar a degradação das
fluorescências, até o momento da precipitação.
4.2.6.2 Precipitação do produto da reação de sequenciamento
O processo de precipitação alcoólica dos produtos das reações de
seqüenciamento foi realizado em três etapas: precipitação do cDNA com
isopropanol, lavagem com etanol e reconstituição do precipitado com formamida.
Na placa de sequenciamento contendo 20 µL de reação adicionou-se
80µL de isopropanol a 80% em temperatura ambiente. A placa foi selada e
submetida a agitação por vortex por 10 segundos. Após a agitação, a placa foi
23
submetida a uma leve centrifugação a fim de concentrar novamente o liquido no
fundo dos poços da placa.
Após incubação por 15 minutos ao abrigo da luz e em temperatura
ambiente, a placa com as reações foi centrifugada em centrifuga para placas por 45
minutos por 4000 rpm, ao final da centrifugação os sobrenadantes de cada poço da
placa, isto é de cada reação, foram desprezados cuidadosamente por inversão da
placa sobre papel absorvente.
A lavagem do produto final foi feita por meio da adição de 100 µL de
etanol 70% nos poços contendo os precipitados das reações. Novamente a placa foi
centrifugada por 45 minutos a 4000 rpm e os sobrenadantes igualmente
desprezados cuidadosamente sobre o papel absorvente.
Para eliminar os resquícios de etanol, a placa foi invertida sobre papel
absorvente e submetida à breve e fraca centrifugação de 200 rpm por 10 segundos.
Os pellets das reações foram secos em termociclador (GeneAmp PCR Systems
9700, Applied Biosystems, EUA) a 95 ºC por 30 segundos. Em seguida, o cDNA viral
contido em cada poço da placa foi reconstituído com formamida HiDi (Applied
Biosystems, EUA) e a placa contendo as amostras foi imediatamente submetida ao
sequenciamento automático ou foram armazenada a -20ºC, envolta em papel
alumínio, até o momento do sequenciamento automático.
4.2.6.3 Sequenciamento automático
O cDNA reconstituído foi submetido à etapa de choque térmico
colocando-se a placa a 95 ºC por dois minutos. Imediatamente após o choque
térmico a placa foi iserida no sequenciador para processamento da eletroforese em
capilar de 50 cm.
Os dideoxinucleotídeos na técnica de Sanger (1977) são análogos aos
dNTPs normais, entretanto não possuem um grupamento hidroxila no carbono 3’ e
2’, o que os impede de fazer uma nova ligação com outra base nitrogenada. Assim,
qualquer ddNTP incorporado à cadeia de DNA crescente finaliza a síntese da
mesma.
A terminação da cadeia ocorre de forma aleatória em qualquer base e em
qualquer fita de DNA crescente. Cada fragmentado de DNA marcado foi detectado
pelo equipamento devido a emissão de fluorescência em diferentes comprimentos
de onda, e interpretados pelo sistema computacional segundo códigos de cores
24
(azul, vermelho, verde e amarelo). As bases são identificadas uma vez que se
conhece o código de cores para cada base adicionada.
4.2.7 Análise das sequências nucleotídicas
As sequências nucleotídicas obtidas neste estudo para o gene E das
cepas do VESL foram identificadas pelo programa BLAST (Basic Local Aligning
Search Toll) disponível no portal do National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (www.nchi.nhi.org).
A qualidade das sequências foi avaliadas pelo pacote de programas
DNAstar lasergene® (DNAstar, Mega Align, Seqman, Genequest, Protean) e essas
foram utilizadas para a caracterização genética no que tange à determinação da
cadeia de leitura do gene E, mediante comparação com sequências homólogas de
outras cepas do VESL pertencentes aos diversos genótipos, disponíveis no
GenBank (HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov).
4.2.8 Análise filogenética do gene E
Para a análise filogenética foram selecionadas 41 sequências referentes
ao gene E do VESL disponíveis no GenBank (Anexo 1), além das14 cepas
selecionadas para este estudo. Foram construídas árvores empregando os métodos
de agrupamento de vizinhos (AV) (Saitou & Nei, 1987), máxima parcimônia (MP)
(Swofford, 1999) e máxima verossimilhança (MV) (Goldman et al., 2000),
implementados nos programas computacionais PAUP 4.0 (Swofford, 1999) e Mega
4.0 (Kumar et al., 2008). O método Bayesiano (Huelsenbeck & Ronquist, 2001)
também foi utilizado.
A determinação do melhor modelo de substituição nucleotídica a ser
utilizado para as seqüências, segundo o critério de informação Akaike (CIA), foi
realizada com o auxilio do programa Modeltest versão 3.6 (Posada & Crandall,
1998). Para a análise pelo método de AV, a matriz de distância foi calculada a partir
das sequências alinhadas usando a fórmula de dois parâmetros de Kimura (Kimura,
1980). Em relação à análise pelo método de MP, os valores de 4:1 foram estipulados
para avaliação da razão transição/ transversão. O teste de bootstrap foi aplicado
conjuntamente aos métodos de AV, MP fixando 1000 réplicas para gerar maior
confiabilidade aos valores dos grupamentos (Felsenstein, 1985).
25
A análise Bayesiana empregando a cadeia de Markov Monte Carlo
(MCMC) foi realizada pelo programa MrBayes3.0b4, programado para gerar dois
milhões de árvores, fixando uma amostragem consensual a cada 1000 árvores
geradas. Os valores de probabilidade posteriores foram estimados a partir dos
dados obtidos para 50% das árvores consenso geradas (Huelsenbeck & Ronquist,
2001). O Programa TRACER versão 1.4 (www.evolve.zoo.ox.ac.uk) foi usado para
verificar se as análises feitas pelo MrBayes alcançaram a convergência apropriada.
O enraizamento da árvore filogenética foi feito incluindo a sequência homóloga
(gene E) do VNO, um flavivírus geneticamente relacionado ao VESL.
4.2.9 Análise filogeográfica do VESL
Para as inferências moleculares em termos cronológicos, foram utilizadas
as 32 sequências do gene E, disponíveis no GenBank, de cepas do VESL isoladas
de diferentes hospedeiros, períodos e localidades do Pará (Quadro 3).
As filogenias de Máxima Verossimilhança foram construídas com o
programa PhyML ( Guindon et al., 2003) implementado no Seaview ( Gouy et al.,
2010) incorporando o modelo geral de substituição nucleotídica de tempo reversível
otimizado pela variação da taxa dos sítios (GTR+4). A melhor árvore foi
selecionada empregando-se os algoritmos Subtree Pruning and Regrafting (SPR) e
Nearest Neighbor Interchanges (NNI), e foi utilizada como ponto de partida para as
análises subseqüentes.
Os parâmetros de um modelo probabilístico completo, incluindo a
evolução cronológica das sequências e a dispersão espacial-temporal, foram
estimadas utilizando a inferência estatística Bayesiana implementada no pacote de
programas BEAST (Benson et al.; 2006; Edwards et al., 2011; Lemey et al., 2009). O
método Bayesiano coalescente skyline (Drummond et al, 2005) foi utilizado para
modelar as flutuações de tamanho populacional ao longo do tempo. Similarmente às
filogenias de Máxima Verossimilhança, a inferência filogenética Bayesiana foi
realizada com o modelo Geral de Tempo Reversível com 4-categorias de distribuição
gamma (GTR+4) para contabilizar as variações de taxas entre sítios.
Para reconstruir a dispersão espacial-temporal foi utilizado um modelo de
probabilidade assimétrica de difusão viral implementado no pacote BEAST ( Benson
et al.; 2006; Edwards et al., 2011; Lemey et al., 2009). Esta abordagem permitiu
26
estimar a localização espacial do ancestral na história filogenética, considerando a
incerteza da filogenia e do processo de difusão.
Uma cadeia de 50 milhões de réplicas foi usada com amostragens
fixadas a cada 1000 árvores geradas. A análise filogenética foi calculada utilizando a
biblioteca BEAGLE (Suchard et al., 2009) a fim de aumentar a velocidade
computacional. Após remover 10% do burn-in, as corridas foram combinadas com
LogCombiner (Raambaut et al., 2007).
As árvores Maximum clade credibility (MCC) foram resumidas com o
TreeAnnotator e visualizadas com o FigTree (Raambaut et al., 2007). O aplicativo
SPREAD (spatial phylogenetic reconstruction of evolutionary dynamics) foi utilizado
para visualizar e converter as estimativas espaciais e de tempos estimados de
divergência anotadas nas árvores MCC para um arquivo keyhole markup language
(KML) para visualização do processo de dispersão no programa virtual
Cartographica (http://www.macgis.com/). Todos os parâmetros evolutivos foram
relatados como médias posteriores juntamente com os intervalos Bayesianos
correspondentes de 95% de credibilidade (95% BCI).
27
Quadro 3: Lista de cepas do VESL utilizadas na análise filogeográfica empregando o
método do relógio molecular relaxado.
Ano
Procedência
Denominação
Genótipo
GenBank
Latitude
Longitude
1960
Ipixuna, Pará, Brasil
BRA-60
VB
AF205485
-2,943
-47,216
1964
Belém, Pará, Brasil
BRA-64A
VIIIA
GU808537
-1,455
-48,502
1964
Belém, Pará, Brasil
BRA-64B
VB
GU808540
-1,455
-48,502
1964
Belém, Pará, Brasil
BRA-64
VA
EU906880
-1,455
-48,502
1968
Belém, Pará, Brasil
BRA-68B
VB
GU808541
-1,455
-48,502
1969
Belém, Pará, Brasil
BRA-69
VA
EU906881
-1,455
-48,502
1971
Belém, Pará, Brasil
BRA-71A
VB
AF205484
-1,455
-48,502
1971
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-71B
VIIIB
GU808542
-4,269
-55,989
1973
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-72
VB
AF205483
-4,269
-55,989
1973
Santarém, Pará, Brasil
BRA-73A
VA
AF205478
-2,439
-54,698
1973
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73B
VA
AF205482
-4,269
-55,989
1973
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73C
VA
AF205480
-4,269
-55,989
1973
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73D
VA
EF158067
-4,269
-55,989
1973
Belém, Pará, Brasil
BRA-73E
VB
GU808549
-1,455
-48,502
1973
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73F
VIIIB
GU808552
-4,269
-55,989
1974
Altamira, Pará, Brasil
BRA-74C
VA
GU808545
-3,196
-52,202
1974
Belém, Pará, Brasil
BRA-74D
VB
GU808547
-1,455
-48,502
1974
Belém, Pará, Brasil
BRA-74F
VA
GU808553
-1,455
-48,502
1974
Belém, Pará, Brasil
BRA-74G
VA
GU808555
-1,455
-48,502
1977
Oriximiná, Pará, Brasil
BRA-77
VIIIA
GU808533
-1,760
-55,862
1978
Belém, Pará, Brasil
BRA-78
VB
GU808534
-1,455
-48,502
1982
Oriximiná, Pará, Brasil
BRA-82
VA
GU808535
-1,760
-55,862
1984
Marabá, Pará, Brasil
BRA-84A
VB
GU808539
-5,371
-49,117
1984
Tucurui, Pará, Brasil
BRA-84C
VIIIB
GU808546
-3,769
-49,674
1984
Belém, Pará, Brasil
BRA-84D
VIIIA
GU808548
-1,455
-48,502
1984
Belém, Pará, Brasil
BRA-84E
VIIIA
GU808551
-1,455
-48,502
1984 Monte Alegre, Pará, Brasil
BRA-84F
VIIIA
GU808554
-1,998
-54,082
1984
Altamira, Pará, Brasil
BRA-84G
VIIIA
GU808556
-3,196
-52,202
1984
Faro, Pará, Brasil
BRA-84I
VA
GU808558
-2,169
-56,472
1984
Tucurui, Pará, Brasil
BRA-84J
VA
GU808559
-3,769
-49,674
1984
Tucurui, Pará, Brasil
BRA-90
VA
GU808531
-3,769
-49,674
1984
Medicilândia, Pará, Brasil
BRA-02
VA
GU808532
-3,448
-52,889
Be: Belém; Ar: Artrópode; BRA: Brasil.
28
5
5.1
RESULTADOS
IDENTIFICAÇÃO
DO
GENE,
SEQUENCIAMENTO
NUCLEOTÍDICO
E
ANÁLISE FILOGENÉTICA
As culturas de células VERO infectadas com as cepas do VESL (n=14)
incluídas no estudo apresentaram efeito citopático na monocamada da cultura de
células VERO entre o 5° e o 10° dia após a inoculação. O RT-PCR, empregando os
3 pares de primers específicos, detectou RNA do VESL nos sobrenadantes das
culturas de células VERO infectadas (Figura 8).
PM
1
2
3
Figura 8: Fragmentos de cDNA referentes ao Gene E do VESL, amostra
BeAr264588, em gel de agarose a 1,2%. PM- peso molecular; 1- fragmento com par
de primers F880/B1629; 2- fragmento com par de primers F1390/B2047; 3fragmento com par de primers F1990/B2586.
O sequenciamento do produto de RT-PCR das 14 cepas do VESL gerou
sequências nucleotídicas que foram identificadas como sequências completas do
gene E. O percentual de homologia entre as sequências do gene E das cepas do
VESL estudadas variou de 92,9% a 99,9% e de 93% a 100 % para nucleotídeos e
aminoácidos, respectivamente.
A árvore filogenética gerada pelo método Bayesiano apresentou melhor
valor de suporte (Figura 9) que as outras metodologias e foi utilizada para a
caracterização genética das amostras. Das 14 cepas de VESL isoladas de
29
mosquitos do gênero Culex, sete foram classificadas no genótipo V, sendo que cinco
pertencem ao subgenótipo VA (BRA-74F, BRA-84i, BRA-84J, BRA-90 e BRA-02) e
duas ao subgenótipo VB (BRA-64B E BRA-68B); as outras sete cepas se agruparam
na linhagem VIII, com três cepas classificadas no subgenótipo VIIIA (BRA-82B,
BRA-83B e BRA-84G) e quatro no VIIIB (BRA-70, BRA74H, BRA74E e BRA-84H).
Os Genótipos V e VIII do VESL foram detectados em mosquitos do
gênero Culex procedentes dos municípios de Belém, Faro, Tucurui, Medicilândia e
Altamira; os quais pertencem a diferentes mesorregiões do Estado do Pará (Figura
10). Genótipo V: Mesorregião Metropolitana de Belém (Belém), Mesorregião do
Baixo Amazonas (Faro), Messorregião do Sudeste Paraense (Tucuruí) e
Mesorregião do Sudoeste Paraense (Medicilândia); Genótipo VIII: Mesorregião
Metropolitana de Belém (Belém), Mesorregião do Baixo Amazonas (Faro),
Messorregião do Sudeste Paraense (Tucuruí) e Mesorregião do Sudoeste paraense
(Altamira).
30
BRA-82B
BRA-83B
BRA-84B
BRA-64A
BRA-84G
BRA-77
85%
BRA-84D
91%
BRA-84F
BRA-84E
91%
BRA-71B
96%
97%
BRA-73F
BRA-74A
90%
BRA-84C
BRA-83
91%
89%
BRA-70
87%
BRA-74H
90%
BRA-74E
BRA-84H
95% BRA-82
91%
BRA-73D
86%
BRA-88
93% 87% BRA-02
CA- 01B
89%
91%
TX- 02B
92%
85%
BRA-73A
BRA-84I
90%
ARG- 78
90%
BRA-84J
91%
BRA-73B
83% BRA-73C
89%
90%
BRA-90
BRA-74F
91%
BRA-74C
BRA-74G
83% BRA-68B
91%
BRA-74B
88%
BRA- 72
92%
94%
BRA-73E
80%
97%
BRA-74D
83%
BRA-64B
96%
BRA-84A
81%
91%
BRA-78
BRA-71A
82%
BRA- 60
PAN- 83
80%
CA- 70
87%
CO- 72
78%
BRA-68A
TX-01L
79%
78%
BRA-04
ARG-05A
92%
PAN-73B
92% PAN-77A
ARG- 66
ARG- 67
79%
91%
81%
94%
93%
100%
VIII A
VIII
VIII B
VA
V
VB
VI
IA
IB
II A
II B
VNO
Figura 9 - Árvore filogenética, empregando método Bayesiano, de 55 cepas do
VESL ( gene E), sendo 14 cepas deste estudo (amostras em vermelho). Os valores
Bayesianos aparecem próximos aos nós da árvore.
Nota: Os isolados foram nomeados de acordo com a localização e ano de isolamento: ARG
(Argentina), BRA (Brasil), CA (Califórnia), CO (Colorado), PAN (Panamá) e TX (Texas).
I
II
III
IV
VII
31
Figura 10 – Distribuição geográfica dos genótipos V e VIII referentes às 14 cepas do
VESL isoladas de mosquitos do gênero Culex no Estado do Pará, 1964 a 2002.
5.2
FILOGEOGRAFIA DO VESL NO ESTADO DO PARÁ
A análise filogeográfica mostrou que o VESL emergiu na Mesorregião do
Sudoeste Paraense de onde se dispersou para a região metropolitana de Belém, na
capital do Estado, ao norte, na década de 1960 (Figura 11 A e B). Posteriormente, a
partir da Mesorregião Metropolitana de Belém o VESL introduziu-se em três
mesorregiões, nas décadas de 1970-80; dispersou-se para a Mesorregião do Baixo
Amazonas, obedecendo a um fluxo gênico no sentido leste-oeste, e também se
dispersou ao leste do Estado para municípios da mesorregião do Nordeste Paraense
e do Sudeste Paraense (Figura 12 A e B).
Em seguida, ocorreu uma nova introdução do VESL na Mesorregião do
Baixo Amazonas, a oeste do Estado, e também na Mesorregião do Sudeste
Paraense, partindo do Sudoeste Paraense (Figura 13 A e B).
32
A figura 14 mostra uma síntese da rota histórica do VESL entre as
mesorregiões do Estado do Pará dentro do período estudado, conforme a escala de
cores para o período referente as décadas 1960-2000.
Figura 11: Rota de dispersão do VESL da Mesorregião do Sudoeste Paraense para
a Mesorregião Metropolitana de Belém.
33
Figura 12: Dispersão do VESL para as mesorregiões do Baixo Amazonas, Sudeste e
Nordeste Paraense, a partir da Região Metropolitana de Belém.
34
Figura 13: Dispersão VESL para as Mesorregiões do Baixo Amazonas, e Sudeste
Paraense partindo do Sudoeste Paraense.
35
Figura 14: Síntese da rota histórica do VESL entre as mesorregiões do Estado do
Pará.
36
6
DISCUSSÃO
Desde a primeira evidência sorológicada da presença do VESL em
populações humanas da Amazônia em 1953 (Causey & Theiller 1958) e o primeiro
isolamento a partir de lote de mosquitos Sabethes belisarioi, capturados na rodovia
Belém-Brasília em 1960 (Causey et al., 1964); o VESL tem sido frequentemente
detectado seja por achados sorológicos, isolamentos virais ou detecção de genoma
a partir do homem, artrópodes hematófagos e vertebrados silvestres (Travassos da
Rosa et al., 1979; Pinheiro et al., 1981; Travassos da Rosa et al.,1997; Vasconcelos
et al., 1979; Vasconcelos et al., 1998, Rodrigues et al., 2010a).
A detecção do genótipo V (subgenótipo VA e VB) e do genótipo VIII
(subgenótipo VIIIA e VIIIB) do VESL em mosquitos do gênero Culex capturados nas
décadas de 1960 a 2000 está de acordo com a descrição desses genótipos já
detectados no Estado do Pará (Kramer & Chandler, 2001, May et al., 2008,
Ottendorfer et al., 2009, Rodrigues et al., 2010b).
A diversidade de subgenótipos do VESL detectada em isolados de
mosquitos Culex evidencia a co-circulação das duas linhagens, assim como, a
importância dos mosquitos Culex no ciclo de manutenção do VESL no Estado do
Pará, como já sugerido na literatura (Travassos da Rosa et al., 1997, Vasconcelos et
al., 1998). Além disso, a detecção desses subgenótipos em aves silvestres
capturadas no mesmo período (Rodrigues et al., 2010b), as quais correspondem ao
hospedeiro primário do ciclo de manutenção do VESL (Gubler et al., 2006), reforçam
essa evidência.
A ampla distribuição do genótipo V e do genótipo VIII do VESL, no Pará,
está, provavelmente, associada com a infecção de mosquitos do gênero Culex,
especialmente Culex declarator, visto que as sublinhagens VA, VB, VIIIA e VIIIB
foram detectadas em lotes de mosquitos Culex procedentes de municípios de quatro
mesorregiões do Estado do Pará, essa distribuição das linhagens pelas
mesorregiões do Estado está de acordo com a análise de cepas procedentes
vertebrados silvestres (Rodrigues et al., 2010b).
A filogeografia das cepas do VESL isoladas no Estado do Pará, cepas
seqüenciadas nesse estudo e outras com sequências disponíveis no GenBank,
permitiu traçar a rota histórica de dispersão do VESL com base nas características
filogenéticas e datas de isolamento das cepas analisadas. Desta forma, a rota
37
estimada reflete os movimentos decorrentes de empreendimentos executados em
nome do desenvolvimento da região, visto que a filogeografia dos patógenos sofre
influência da mobilidade humana e de forças ecológicas, entre outros fatores (Keim
& Wagnner, 2009).
Considerando os dados de 32 cepas do VESL isoladas no Pará, a análise
filogeografica sugere que o VESL emergiu no Sudoeste Paraense de onde se
dispersou para a região metropolitana de Belém, Baixo Amazonas e Sudeste
Paraense. A dispersão do VESL foi, posteriormente, ampliada para várias
mesorregiões do Estado a partir de Belém, capital do Estado do Pará. Nas
Mesorregiões do Baixo Amazonas e do Sudeste Paraense, o VESL foi introduzido a
partir de Belém e, cerca de duas décadas depois, foi reintroduzido a partir do
Sudoeste Paraense.
A exploração das riquezas naturais em nome do desenvolvimento
regional resultou no desmatamento de grandes extensões de terra na Amazônia. No
Estado do Pará, em particular nas últimas cinco décadas, têm ocorrido construções
de estradas e hidrelétricas, aberturas de novas fronteiras agrícolas, surtos de
mineração, crescimento dos serviços, motivando a mobilidade humana e alterações
ecológicas. Nesse contexto, ocorreram as investigações científicas de campo que
proporcionaram os isolamentos de inúmeras cepas do VESL pelo Instituto Evandro
Chagas (IEC), mostrando que a alteração do ecossistema Amazônico resulta na
emergência de arboviroses, como previamente descrito (Travassos da Rosa et al.,
1980; Vasconcelos et al., 2011). A inserção de dados moleculares e filogeográficos
desses agentes reforçam a hipótese acima referida.
Finalmente, a rota histórica de dispersão do VESL, aqui contada pela
análise de parte do acervo de cepas do VESL disponível no IEC, representa um
estudo piloto que deve ser ampliado para um estudo incluindo uma amostra mais
representativa de isolados e com base na sequência completa do genoma das
cepas do VESL, a serem selecionadas para o referido estudo.
.
38
7
CONCLUSÕES
- As cepas do VESL isoladas dos mosquitos do gênero Culex,
caracterizadas
filogeneticamente
nesse
estudo,
pertencem
ao
genótipo
V
(subgenótipo VA e VB) e ao genótipo VIII (subgenótipo VIIIA e VIIIB).
- Os genótipos V e VIII do VESL tiveram sua ampla distribuição no estado
do Pará associada com infecção de mosquitos do gênero Culex, especialmente
Culex declarator, no período estudado;
- As cepas do VESL isoladas de mosquito Culex evidenciam que os
genótipos V e VIII co-circularam no estado do Pará, no período de 1964 a 2002;
- O VESL emergiu no sudoeste paraense de onde se dispersou para
Belém, Baixo Amazonas e do Sudeste Paraense.
- A dispersão do VESL foi ampliada para várias mesorregiões do Estado a
partir de Belém, capital do Estado do Pará.
- Nas Mesorregiões do Baixo Amazonas e do Sudeste Paraense, o VESL
foi introduzido a partir de Belém e, cerca de duas décadas depois, foi reintroduzido a
partir do sudoeste paraense.
39
REFERÊNCIA
ALLISON, S.L. SCHALICH J, STIASNY K, MANDL CW, KUNZ C, & HEINZ FX.
Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelop proteins
induced by an acidic pH. J.virol.69.695-700. 1995.
AMBERG, S. M., NESTOROWICZ, A., MCCOURT, D. W., & RICE, C. M. NS2B-3
proteinase-mediated processing in the yellow fever virus structural region: In vitro
and in vivo studies. J. Virol. 68:3794–3802. 1994.
AVISE, J.C., BALL, J.A.R.M., BERMINGHAM, E., LAMB, T., NEIGEL, J.E., REEB,
C.A., & SAUNDER, N.C. Intraspecific phylogeography: The Mitochondrial DNA
Bridge Between Population Genetics and Systematics. Annual Reviews
Ecology Syste, 18:489-522.1987.
BAILLIE, G.J., KOLOKOTRONIS, S-O., WALTARI, E., MAFFEI, J.G., KRAMER,
L.D., PERKINS, S.L. Phylogenetic and evolutionary analyses of St. Louis
encephalitis virus genomes. Mol Phylogenet Evol 47, 717-728. 2008.
BENSON, D. A., KARSCH-MIZRACHI I., LIPMAN D. J., OSTELL J., & WHEELER D.
L. GenBank. Nucleic Acids Res 34:D16-20. 2006.
BERMINGHAM, E., & MORITZ, C. Comparatative phylogeography: concecpt and
applications. Molecular Ecology, 7: 367-369. 1998.
BLOOMQUIST, E.W., LEMEY, P., SUCHARD, M.A. Three roads diverged? Routes
to phylogeographic inference. Trends Ecol Evol.;25(11):626-32. 2010.
BOEGE, U., HEINZ, F. X., WENGLER, G., & KUNZ, C. Amino acid compositions and
amino-terminal sequences of the structural proteins of a flavivírus, European tickborne encephalitis virus. Virology 126:651–657. 1983.
BRINTON M.A., The molecular biology of West Nile virus: a new invader of the
western hemisphere, Annu. Rev. Microbiol; 56: 371–402. 2002.
BRYANT J.E., HOLMES E.C., BARRETT A.D.T. Out of Africa: A Molecular
Perspective on the Introduction of Yellow Fever Virus into the Americas. Plos
Pathog. 3(5):e75.
40
CAHOUR, A., PLETNEV, A., VAZEILLE-FALCOZ, M., ROSEN, L., & LAI, C.-J.
Growth restricted dengue virus mutants containing deletions in the 50 noncoding
region of the RNA genome. Virology 207:66–76. 1995.
CASALS, J. The arthropod-borne group of animal viruses. Transactions of the New
York Academy of Sciences, v19, p.219-235, 1957.
CAUSEY, O.R.; SHOPE, R.E. & THEILER, M. - Isolation of St. Louis encephalitis
virus from arthropods in Pará, Brazil. Amer. J. trop. Med. Hyg., 13: 449, 1964.
CAUSEY, O.R., & THEILLER M. Virus antibody survey on sera of residents of the
Amazon Valley in Brazil. Am J Trop Med Hyg 7: 36-41. 1958.
CHAMBERS, T.J., HAHN, C.S., GALLER, R., RICE, & C.M. Flavivírus genome
organization, expression and replication. Annual Reviews Microbiology, 44:
649-688, 1990a.
CHAMBERS, T. J., MCCOURT, D.W., & RICE, C. M. Production of yellow fever virus
proteins in infected cells: Identification of discrete polyprotein species and
analysis of cleavage kinetics using region-specific polyclonal antisera. Virology
177:159–174. 1990b.
CHAMBER, T.J., & MONATH, T.P. The Flaviviruses: Structure, Replication, and
Evolution. Ed. Elsevier academic press. v29, 388p. 2003.
DAY, J.F. Predicting St. Louis encephalitis virus epidemics: Lessons from recent, and
not so recent, outbreaks. Ann Rev Entomol 46: 111-138. 2001.
DÉGALLIER N., TRAVASSOS DA ROSA A.P.A., SILVA J.M.C., RODRIGUES S.G.,
VASCONCELOS P.F.C., TRAVASSOS DA ROSA J.F.S. As aves como
hospedeiras de arbovírus na Amazônia brasileira. Boletim do Museu Paraense
Emílio Goeldi 8:69-111, 1992.
DRUMMOND, A. J., RAMBAUT A., SHAPIRO B., & PYBUS O. G. Bayesian
coalescent inference of past population dynamics from molecular sequences.
Mol Biol Evol 22:1185-92. 2005.
EDWARDS, C. J., SUCHARD M. A., LEMEY P., WELCH J. J., BARNES I., FULTON
T. L., BARNETT R., O'CONNELL T. C., COXON P., MONAGHAN N.,
VALDIOSERA C. E., LORENZEN E. D., WILLERSLEV E., BARYSHNIKOV G. F.,
RAMBAUT A., THOMAS M. G.,. BRADLEY D. G, & SHAPIRO B. Ancient
41
hybridization and an Irish origin for the modern polar bear matriline. Curr Biol
21:1251-8. 2011.
ELSHUBER S., ALLISON S.L., HEINZ F.X., & MANDL C.W. Cleavage of protein prM
is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virus. J Gen.
Virol. 84, 183-191. 2003.
FALGOUT, B., BRAY, M., SCHLESINGER, J. J., & LAI, C. J. Immunization of mice
with recombinant vaccinia virus expressing authentic dengue virus nonstructural
protein NS1 protects against lethal dengue virus encephalitis. J. Virol.
64(9):4356–4363. 1990.
FALGOUT, B., CHANOCK, R., & LAI, C.-J. Proper processing of dengue virus
nonstructural glycoprotein NS1 requires the N-terminal hydrophobic signal
sequence and the downstream nonstructural protein NS2a. J. Virol. 63(5):1852–
1860. 1989.
FALGOUT, B., & MARKOFF, L. Evidence that flavivírus NS1-NS2A cleavage is
mediated by a membrane-bound host protease in the endoplasmic reticulum. J.
Virol. 69(11):7232–7243. 1995.
FARIA, N.R., SUCHARD, M.A., RAMBAUT, A., & LEMEY, P. Toward a quantitative
understanding of viral phylogeography. Current opinion in Virology, 1:1-7.
2011.
FELSENSTEIN, J. Confidence limitson phylogenies: an approach using the
bootstrap. Evolution; 39:783-791. 1985.
FERREIRA, F.F., COSTA, L.J., CAVALEIRO, N.P., CÂMARA, F.P., & MIRANDA,
M.M.F.S. Propriedades Gerais dos Vírus, estratégias de replicação dos Vírus e
Arquitetura dos Vírus. In: Introdução à VIROLOGIA HUMANA. Guanabara
koogan. Segunda edição. p. 1-41. 2008
GAUNT, M., SALL, A., DE LAMBALLERIE, X., FALCONAR, A.K., DZHIVANIAN, T.I.,
& GOULD, E.A. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their
epidemiology, disease association and biogeography. J Gen Virol; 82:1867–
1876. 2001.
GOLDMAN, N., ANDERSON, J. P., & RODRIGO, A. G. Likelihood-Based test of
Topologies in Phylogenetics. Systematic Biology, 49(4): 652-670. 2000.
42
GOULD, E.A., LAMBALLERIE X., ZANOTTO P.M., & HOLMES EC. Origins,
Evolution, and Vetor/Host Coadaptations within the Genus Flavivirus. In:
Maramorosch K, Murphy FA, Shatkin AJ (editors). Advances in Virus
Research. Elsevier: San Diego, v. 59, p. 278-314. 2003.
GOUY, M., S. GUINDON, & O. GASCUEL. SeaView version 4: A multiplatform
graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building.
Mol Biol Evol 27:221-4. 2010.
GUBLER, D. J. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev.
Jul;11(3):480-96 1998.
GUBLER, D.J. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social
and economic problem in the 21st century. Trends Microbiol;10:100–103. 2002.
GUBLER, D.J., KUNO, G., & MARKOFF, L. Flaviviruses. In: Knipe DM & Peter MH
(editors). Field’s Virology. USA: Quebecor Versailles. p. 1153-1252. 2006.
GUINDON, S., & GASCUEL ,O. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate
large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol 52:696-704. 2003.
GUIRAKHOO, F., BOLIN, R. A., & ROEHRIG, J. T. The Murray Valley encephalitis
virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the
expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. Virology
191(2):921–931. 1992.
GUIRAKHOO, F., HEINZ, F. X., MANDL, C. W., HOLZMANN, H., & KUNZ, C. Fusion
activity of flaviviruses: Comparison of mature and immature (prM-containing)
tickborne encephalitis virions. J. GEN. VIROL. 72(PT 6):1323–1329. 1991.
HEARN, H.J., SOPER, W.T., & MILLER, W.S. Loss in virulence of yellow fever virus
serially passed in HeLa cells. Proc Soc Exp Biol Med; 119: 319–322. 1965.
HENCHAL, E. A., HENCHAL, L. S., & SCHLESINGER, J. J. Synergistic interactions
of anti-NS1 monoclonal antibodies protect passively immunized mice from lethal
challenge with dengue 2 virus. J. Gen. Virol. 69(Pt 8):2101–2107. 1988.
HUELSENBECK, J.P., RONQUIST, F., MRBAYES: Bayesian inference of phylogeny
and its impact on evolutionary biology. Science 14(294):2310-4, 2001.
43
ICTV. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. In: Fauquet
CM, Mayo MA, Maniloff J, et al. eds. San Diego: Elsevier Academic Press;982–
988. 2005.
JACOBS, S. C., STEPHENSON, J. R., & WILKINSON, G.W. High-level expression of
the tick-borne encephalitis virus NS1 protein by using an adenovirus-based
vector: Protection elicited in a murine model. J. Virol. 66(4):2086–2095. 1992.
KARABATSOS, N. Annual Report on the Catalogue of Arthropod-Borne and
Selected Vertebrate Viruses of the World. San Antonio, USA: the American
Committee on Arthrod Borne Viruses. Issue nº 108, 2002. 30p.
KEIM, P.S., & WAGNER, D.M. Humans and evolutionary and ecological forces
shaped the phylogeography of recently emerged diseases. Nat Rev Microbiol;
7(11):813-21. 2009.
KHROMYKH, A. A., VARNAVSKI, A. N., SEDLAK, P. L., & WESTAWAY, E. G.
Coupling between replication and packaging of flavivirus RNA: Evidence
derived from the use of DNA-based full-length cDNA clones of Kunjin virus. J.
Virol. 75(10):4633–4640. 2001.
KIMURA M. A single method for estimating evolutionary rate of base substitutions
through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol, 16: 111-120.
1980.
KNOWLES,
L.,
&
MADDISON,
W.
Statistical
phylogeography.
Molecular
Ecology.11: 2623–2635. 2002.
KRAMER LD & CHANDLER LJ. Phylogenetic analisis of the envelope gene of St.
Louis encephalitis virus. Arch Virol 2001; 46:2341-2355.ephalitis in Tropical
América. In Monath TP (Editor). St. Louis Encephalitis. Washington: Am. Publ.
Hlth. Assoc; p. 451-471. 1980.
KRAMER, L.D., & EBEL, G.D. Dynamics of flavivirus infection in mosquitoes. Adv
Virus Res; 60:187–232. 2003.
KUMAR S, TAMURA K, & NEI M. Molecular evolutionary genetic analysis. The
Pennsylvania State University, V 4.0.Philadelphia, 2008.
LANCIOTTI, R.S., CALISHER, C.H., GUBLER, D.J., CHANG, G.J., & VORNDAM,
A.V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using
44
reverse
transcriptase-polymerase
chain
reaction.
Journal
of
Clinical
Microbiology.3:545-51. 1992.
LEMEY, P., RAMBAUT, A., DRUMMOND, A.J., & SUCHARD, M.A. Bayesian
Phylogeography Finds Its Roots. PLoS Comput Biol.5(9):e1000520. 2009.
LIN, Y. L., CHEN, L. K., LIAO, C. L., YEH, C. T., MA, S. H., CHEN, J. L., HUANG, Y.
L., CHEN, S. S., & CHIANG, H. Y. DNA immunization with Japanese encephalitis
virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice. J. Virol.
72(1):191–200. 1998.
LINDENBACH, B.D., & RICE, C.M. Trans-Complementation of yellow fever virus NS1
reveals a role in early RNA replication. Journal of Virology, 71(12): 9608-9617.
1997.
LINDENBACH, B. D., AND RICE, C. M. Genetic interaction of flavivirus nonstructural
proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. J. Virol.
73(6):4611–4621. 1999.
LINDENBACH B.D.; RICE, C.M. Molecular biology of flaviviruses. Advance of Virus
Research, 59: 23-61. 2003.
LINDENBACH, D.B.; THIEL; H-J.; RICE, C.M. Flaviviridae: The viruses and their
Replication In: Fields Virology. Knipe, D.M. & Howley, P.M. (eds), Philadelphia,
USA, Wolters Kluwer Health. p.1101-1152. 2007.
LOBIGS, M. Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer
secretion requires the function of the viral proteinase NS3. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:6218–6222. 1993.
LOPES, O.S., SACHETTA, L.A., COIMBRA, T.L., PEREIRA, L.E. Isolation of St.
Louis encephalitis virus in south Brazil. Am J Trop Med Hyg 28: 583-585. 1979.
MACKENZIE, J. M., JONES, M. K., & YOUNG, P. R. Immunolocalization of the
dengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA
replication. Virology 220:232–240. 1996.
MAY, F.J., LI, L., ZHANG, S., GUZMAN, H., BEASLEY, D.W., TESH, R.B., HIGGS,
S., RAJ, P., BUENO, R. JR., RANDLE, Y., CHANDLER, L., BARRETT, A.D.
Genetic variation of St. Louis encephalitis virus. J Gen Virol 89: 1901-10, 2008.
45
MAY, F.J., DAVIS, C.T., TESH, R.B., & BARRETT, A.D. Phylogeography of West
Nile virus: from the cradle of evolution in Africa to Eurasia, Australia, and the
Americas. J Virol; 85(6):2964-74. 2010.
MONATH, T.P., HEINZ, F.X. Flaviviruses. In BN Fields, DM Knipe, PM Howley
(eds.), Fields Virology, 3rd ed., Lippincott, Raven Publishers, Philadelphia, New
York, p. 961-1034. 1996.
MONATH, T.P., TSAY, T.F. St. Louis encephalitis: Lessons from the last decade. Am
J Trop Med Hyg 37: 40s-59s. 1987.
MONDINI, A., BRONZONI, R., CARDEAL, I., SANTOS, T., LÁZARO, E., NUNES,
S.H., MOREIRA, C.C., RAHAL, P., MAIA, I.L., FRANCO, C., GÓNGORA, D.V.,
GÓNGORA-RUBIO, F., CABRERA, E.M., FIGUEIREDO, L.T., DA FONSECA,
F.G.,
BRONZONI, R.V.,
CHIARAVALLOTI-NETO,
F.,
NOGUEIRA,
M.L.
Simultaneous infection by DENV-3 and SLEV in Brazil. J Clin Virol; 40(1):84-86.
2007b.
MONDINI A., CARDEAL, I.L., LÁZARO, E., NUNES, S.H., MOREIRA, C.C., RAHAL,
P., FIGUEIREDO, L. Saint Louis Encephalitis Virus, Brazil. Emerg Infect Dis;
13(1):176-8. 2007a.
MURPHY, F. A. Togavirus morphology and morphogenesis. In ‘‘The Togaviruses:
Biology, Structure, Replication’’ (R. W. Schlesinger, ed.), pp. 241–316.
Academic Press, New York. 1980.
PERERA, R., KHALIQ M, KUHN RJ. Closing the door on flaviviruses: Entry as a
target for antiviral drug design, Antiviral Res, doi:10.1016/j.antiviral.2008.05.004.
2008.
PINHEIRO, F.P., LEDUC, J.W., TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A., & LEITE, O.F.
Isolation from St. Louis encephalitis virus from a patient in Belém, Brazil. Am J
Trop Med Hyg; 30:145-148. 1981.
POSADA, D., CRANDALL, K.A. Modeltest: testing the model of DNA substitution.
Bioinformatics. 14(9):817-8, 1998.
QU, X., CHEN, W., MAGUIRE, T., & AUSTIN, F. Immunoreactivity and protective
effects in mice of a recombinant dengue 2 Tonga virus NS1 protein produced in a
baculovirus expression system. J. Gen. Virol. 74(Pt 1):89–97. 1993.
46
RABAA, M.A., TY HANG, V.T., WILLS, B., FARRAR, J., SIMMONS, C.P., &
HOLMES, E.C. Phylogeography of recently emerged DENV-2 in southern Viet
Nam. PLoS Negl Trop Dis;4(7):e766. 2010.
RAMBAUT,
A.,
DRUMMOND,
A.
Molecular
evolution,
phylogenetics
and
epidemiology - http://tree.bio.ed.ac.uk/software/.2007.
REISEN, W.K., ME YER, R.P., MILBY, M.M., PRESSER, S.B., EMMONS, R.W.,
HARDY, J.L., REEVES, W.C. Ecological observations on the 1989 outbreak of
St. Louis encephalitis virus in the southern San Joaquin Valley of California. J
Med Entomol 29: 472–482. 1992.
REISEN, W.K. Epidemiology of St. Louis Encephalitis Virus. In: Maramorosch K,
Murphy FA & Shatkin AJ (Editors). Advances in Virus Research. San Diego:
Elsevier; v. 61, p. 139-183. 2003.
RICE, C. M., LENCHES, E. M., EDDY, S. R., SHIN, S. J., SHEETS, R. L., &
STRAUSS, J. H. Nucleotide sequence of yellow fever virus: Implications for
flavivirus gene expression and evolution. Science 229:726–733. 1985.
RICE, C., STRAUSS, E.G., STRAUSS, J.H. Structure of the flavivirus genome. In:
Schlesinger S, Schlesinger MJ (ed.), The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum
Press: New York, p. 279-326. 1986.
ROCCO, I.M., SANTOS, C.L.S., BISORDI I., PETRELLA, S.M.C.N., PEREIRA, L.E.,
SOUZA, R.P., COINBRA, L.M., BESSA, T.A.F., OSHIRO, F.M., LIMA, L.B.Q.,
CERRONI, M.P., MARTI, A.T., BARBOSA, V.M., KATZ G, SUZUKI A. St. Louis
encephalitis: first virus isolation from a human in São Paulo State, Brazil. Rev
Inst Med Trop Sao Paulo; 47:281-285. 2005.
RODRIGUES SG, NUNES MR, CASSEB SM, PRAZERES AS, RODRIGUES DS,
SILVA MO, CRUZ AC, TAVARES-NETO JC, VASCONCELOS PF. Molecular
epidemiology of Saint Louis encephalitis virus in the Brazilian Amazon: genetic
divergence and dispersal. J Gen Virol;(Pt 10):2420-7. 2010a.
RODRIGUES, S.G., NUNES, M.R.T., CASSEB, S.M.M., PRAZERES, A.S.C.,
RODRIGUES, D.S.G., SILVA, M.O., CRUZ, A.C.R., TAVARES-NETO, J.C., &
VASCONCELOS, P.F.C. Molecular epidemiology of Saint Louis encephalitis
47
virus in the Brazilian Amazon: genetic divergence and dispersal. Jornal of
General Virology; 91: 2420-2427. 2010b.
ROOSENDAAL, J.; WESTAWAY, E.G.; KHROMYKH, A.; MACKENZIE, J.M.
Regulated cleavages at the West Nile virus NS4A-2K-NS4B junctions play a
major role in rearranging cytoplasmic membranes and Golgi trafficking of the
NS4A protein. Journal of Virology, 80(9): 4623-4632, 2006.
ROSEN L. Sur le mechanism de la transmission verticale du virus de la dengue chez
les moustiques. C R Acad Sci Paris; 304:347–350. 1987.
RUSSEL PK, BRANDT WE, DALRYMPLE JM. Chemical and antigenic structure of
flaviviruses. In: Schlesinger RW (ed.), The Togaviruses: biology, structure,
replication. Academic Press: New York, p. 503-29. 1980.
SABIN A. Survey of knowledge and problems in field of arthropod-borne virus
infections. Arch Gesamte Virusforsch; 9:1–10. 1959.
SAITOU N & NEI M. The neighbor-joining method: a new method for reconstruction
phylogenetic trees. Mol Biol Evol; 4:406-425. 1987.
SANGER F, NICKLEN S, COULSON AR. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences; 74(12):54635467. 1977.
SCHLESINGER, J. J., BRANDRISS, M. W., & WALSH, E. E. Protection against 17D
yellow fever encephalitis in mice by passive transfer of monoclonal antibodies to
the nonstructural glycoprotein gp48 and by active immunization with gp48. J.
Immunol. 135(4):2805–2809. 1985.
SCHLESINGER, J. J., FOLTZER, M., & CHAPMAN, S. The Fc portion of antibody to
yellow fever virus NS1 is a determinant of protection against YF encephalitis in
mice. Virology 192(1):132–141. 1993.
STADLER, K., ALLISON, S. L., SCHALICH, J., & HEINZ, F. X. Proteolytic activation
of tick-borne encephalitis virus by furin. J. Virol. 71:8475–8481. 1997.
SUCHARD, M. A., & RAMBAUT, A. Many-core algorithms for statistical
phylogenetics. Bioinformatics 25:1370-6. 2009.
48
SWOFFORD, D.L. PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and other
methods). Sinauer Assciates, Sunderland;4. 1999.
TIMOFEEV, A. V., OZHERELKOV, S. V., PRONIN, A. V., DEEVA, A. V.,
KARGANOVA, G. G., ELBERT, L. B., & STEPHENSON, J. R. Immunological
basis for protection in a murine model of tick-borne encephalitis by a recombinant
adenovirus carrying the gene encoding the NS1 non-structural protein. J. Gen.
Virol. 79(Pt 4):689–695. 1998.
TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S., FREITAS, E.N., TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.,
PINHEIRO, F.P. Epidemiologia do vírus da Encefalite de São Luís na Amazônia.
Revista da FSESP. XXV ( 2):73-80. 1980.
TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A., TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S., PINHEIRO, F.P.,
& VASCONCELOS, P.F.C. Arboviroses. In: Leão RNQ (editor). Doenças
Infecciosas e Parasitárias. Enfoque Amazônico. Belém: Editora CEJUP; p.
208-225. 1997.
TRENT, D. W. Antigenic characterization of flavivirus structural proteins separated by
isoelectric focusing. J. Virol. 22(3):608–618. 1977.
TSAI, T.F., CANFIELD, M.A., REED, C.M., FLANNERY, V.L., SULLI VAN, K.H., REE
VE, G.R., BAILE Y RE, POLAND JD. Epidemiological aspects of a St. Louis
encephalitis outbreak in Harris County,T exas. J Infect Dis 157: 351–356. 1986.
1988.
TWIDDY S.S., HOLMES E.C, RAMBAUT A. Inferring the Rate and Time-Scale of
Dengue Virus Evolution. Mol. Biol. Evol. 20(1): 122-129. 2003.
VASCONCELOS, P.F.C., TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S., TRAVASSOS DA ROSA,
A.P.A., DÉGALLIER, N, PINHEIRO, F.P., SÁ FILHO, G.C. Epidemiologia das
encefalites por Arbovírus na Amazônia Brasileira. Rev. Inst. Med. Trop. São
Paulo. 33:465-76, 1991.
VASCONCELOS, P.F.C,. TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A., PINHEIRO, F.P.,
SHOPE,
R.E.,
TRAVASSOS
DA
ROSA,
J.F.S.,
RODRIGUES,
S.G.,
DÉGALLIER, N., & TRAVASSOS DA ROSA, E.S. Arboviruses Pathogenic for
man in Brazil. In: Travassos da Rosa APA, Vasconcelos PFC & Travassos da
49
Rosa JFS. (Editors). An overview of arbovirology in Brazil and neighbouring
countries. Belém: Editora CEJUP; p. 72-99. 1998.
VASCONCELOS, P.F.C,. TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A., RODRIGUES, S.G.,
DÉGALLIER, N., & TRAVASSOS DA ROSA, J.F.C. Inadequate management of
natural ecosystem in the Brazilian Amazon Region results in the emergence and
reemergence of arboviruses. Cad. Saúde publ. 17: 155-164, 2001.
WALLACE, R.G., & FITCH, W.M. Influenza A H5N1 immigration is filtered out at
some international borders. PLoS ONE 3: e1697. 2008.
WENGLER, G., WENGLER, G., & GROSS, H. J. Studies on virus-specific nucleic
acids synthesized in vertebrate and mosquito cells infected with flaviviruses.
Virology 89:423–437. 1978.
WHO (World Health Organization). Arboviruses and human disease. Report of a
WHO Scientific Group. World Health Organization.Technical Report, 369: 184, 1967.
WOOTON SH., KAPLAN SH., & PERROTTA DM. St. Louis encephalitis in early
infancy. Pediatr Infect Dis; 23:951–954. 2004.
YAMSHCHIKOV, V. F., & COMPANS, R. W. Processing of the intracellular form of
the west Nile virus capsid protein by the viral NS2B-NS3 protease: An in vitro
study. J. Virol. 68(9):5765–5771. 1994.
50
Anexo 1: Cepas do VESL disponíveis no GenBank e incluídas na análise filogenética
do gene E.
Ano
Cepa
Procedência
Denominação Genótipo Código no GenBank
1960
BeAr23379
Ipixuna do Pará, Pará, Brasil
BRA-60
VB
AF205485
1964
BeAn69768
Belém, Pará, Brasil
BRA-64A
VIIIA
GU808537
1971
BeH203235
Belém, Pará, Brasil
BRA-71A
VB
AF205484
1971
BeAn212371
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-71B
VIIIB
GU808542
1973
BeAn246262
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-72
VB
AF205483
1973
BeAr242587
Santarém, Pará, Brasil
BRA-73A
VA
AF205478
1973
BeAn246407
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73B
VA
AF205482
1973
BeAn248398
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73C
VA
AF205480
1973
BeAn247377
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73D
VA
EF158067
1973
BeAn235722
Belém, Pará, Brasil
BRA-73E
VB
GU808549
1973
BeAn248376
Itaituba, Pará, Brasil
BRA-73F
VIIIB
GU808552
1974
BeAn261207
Aripuanã, Mato Grosso, Brasil
BRA-74A
VIIIB
GU808538
1974
BeAn258717
Belém, Pará, Brasil
BRA-74B
VA
GU808543
1974
BeAn259507
Altamira, Pará, Brasil
BRA-74C
VA
GU808545
1974
BeAn259290
Belém, Pará, Brasil
BRA-74D
VB
GU808547
1974
BeAr264594
Belém, Pará, Brasil
BRA-74G
VA
GU808555
1977
BeAr338371
Oriximiná, Pará, Brasil
BRA-77
VIIIA
GU808533
1978
BeH355964
Belém, Pará, Brasil
BRA-78
VB
GU808534
1982
BeAn401517
Oriximiná, Pará, Brasil
BRA-82
VA
GU808535
1983
BeAr415520
Altamira, Pará, Brasil
BRA-83
VIIIB
GU808530
1984
BeAn423728
Marabá, Pará, Brasil
BRA-84A
VB
GU808539
1984
BeAn421388
Tucurui, Pará, Brasil
BRA-84B
VIIIA
GU808544
1984
BeAn421297
Tucurui, Pará, Brasil
BRA-84C
VIIIB
GU808546
1984
BeAn423429
Belém, Pará, Brasil
BRA-84D
VIIIA
GU808548
1984
BeAn423442
Belém, Pará, Brasil
BRA-84E
VIIIA
GU808551
1984
BeAr423512
Monte Alegre, Pará, Brasil
BRA-84F
VIIIA
GU808554
1988
BeAr485655
Jamari, MT, Brasil
BRA-88
VA
GU808536
1966
CorAn9124
Cordoba, Argentina
ARG 66
VII
AF205473
1967
CorAn9275
Cordoba, Argentina
ARG 67
VII
AF205474
1968
SpAn9398
São Paulo, Brasil
BRA 68A
IIA
AF205472
1970
E22924
Kern Country, EUA
CA 70
IA
AF205453
1972
72V4749
Washington, EUA
CO 72
IB
AF205497
Continua
51
Anexo 1: Cepas do VESL disponíveis no GenBank e Incluídas na análise filogenética
do gene E (continuação).
Ano
Cepa
Procedência
Denominação Genótipo Código no GenBank
1973
PanAn90274
Panamá
PAN 73B
IV
AF205476
1977
GML902981
Panamá
PAN 77A
IV
AF205489
1978
78V6507
Santa Fé, Argentina
ARG 78
VA
AF205481
1983
GML903797
Panamá
PAN 83
VI
AF205487
2001
COAV353
Coachella Valley, EUA
CA 01B
VA
AY135512
2001
01V2906
Harris Country, EUA
TX 01L
IIB
EU306897
2002
TDH3178
El Paso, EUA
TX 02B
VA
EU306899
2004
SPH253157
São Paulo,Brasil
BRA 04
III
DQ022950
2005
CbaAr4006
Cordoba, Argentina
ARG 05A
III
DQ385450