Potencial genotóxico do cultivo de células tronco mesenquimais

Potencial genotóxico do cultivo de células tronco mesenquimais
provenientes da medula óssea de equinos.
Natalia Sato Minami, Rogério Martins Amorim, Juliana Ferreira da Silva, Danielle Jaqueta Barberini,
Luciano Barbosa, Ligia Souza Lima Silveira da Mota. Campus Botucatu, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Medicina Veterinária, [email protected], bolsista PIBIC.
Palavras Chave: terapia celular, teste do cometa.
Introdução
A perspectiva do uso de Células Tronco
Mesenquimais
(CTM)
no
tratamento
de
enfermidades
ortopédicas,
neurológicas,
inflamatórias, dentre outras, tem gerado uma
1
explosão de pesquisas nessa área . O potencial
terapêutico das CTM reside na sua capacidade em
regenerar tecidos, tanto pela substituição das
células lesadas, quanto pelos efeitos parácrinos
imunomoduladores e antiinflamatórios, associados à
estimulação da angiogênese, inibição da formação
1,2
cicatricial e da apoptose . No entanto, dados sobre
o potencial genotóxico induzido pelo processo de
isolamento e cultivo das CTM em equinos são
escassos na literatura.
Considerando que CTM com o DNA danificado
pode dar origem a uma mutação deletéria e sofrer
3
precocemente
apoptose
ou
necrose
comprometendo a eficácia da terapia celular, este
trabalho teve como objetivo verificar o potencial
genotóxico dos procedimentos empregados in vitro,
para o isolamento e cultivo das CTM provenientes
da medula óssea de equinos, por meio do Teste do
Cometa.
Material e Métodos
Foram utilizados como doadores de medula
óssea três equinos adultos, sem raça definida de
ambos os sexos e clinicamente saudáveis. A
punção da medula óssea, o isolamento e o cultivo
das CTM foram realizados conforme a metodologia
descrita por Maia et al., 2013. O Teste do Cometa
foi realizado em três momentos, sendo o cultivo
primário, passagem 1 e passagem 2, de acordo com
RIBEIRO, 2003. As imagens das lâminas de
agarose, submetidas à eletroforese e coradas com
brometo de etídio, contendo as CTM foram
capturadas
imagens
em
microscópio
de
fluorescência de 50 cometas, para avaliar a
intensidade da cauda (tail intensity), expressa pelo
percentual de DNA na cauda, por meio do programa
“Comet assay”. Para a análise estatística foi
empregada a análise de variância de dois fatores e
o teste de Tukey para a comparação de médias ao
4
nível de 5% de significância .
Resultados e Discussão
Os resultados obtidos para a medida da
intensidade da cauda do cometa estão resumidos
na Tabela 1.
XXIV Congresso de Iniciação Científica
Figura 1. Imagem de um cometa de célula tronco
mesenquimal de medula óssea de equino, com DNA
danificado (cauda do cometa).
Tabela 1. Médias da intensidade (%) da cauda do
cometa durante o cultivo primário, passagem 1 e
passagem 2 de células tronco mesenquimais da
medula óssea de três equinos.
ANIMAL
1
2
3
CULTIVO
PRIMÁRIO
a
4,501
3,809a
a
3,314
PASSAGEM
1
a
4,924
0,855b
a
2,012
PASSAGEM
2
a
2,588
ab
1,313
b
5,888
*Médias seguidas de letras iguais não diferem estatisticamente
em cada momento (p<0,05).
Por meio dos resultados apresentados na
Tabela 1, podemos observar que o cultivo de CTM
do animal 3 apresentou na passagem 2, aumento
significativo no percentual de DNA na cauda
(intensidade da cauda), indicando efeito genotóxico.
As CTM de medula óssea de equinos em cultivo
entram em senescência mais cedo do que as CTM
5
de tecido adiposo e de cordão umbilical .
A perda da integridade do DNA durante os
procedimentos de passagens das CTM em cultivo
pode deflagrar precocemente a senescência dessas
células, comprometendo o estabelecimento de
bancos de CTM e a eficácia da terapia celular.
Conclusões
As sucessivas passagens para manutenção
e expansão dos cultivos de CTM de medula óssea
de equinos podem causar efeitos genotóxicos. Mais
estudos devem ser realizados com um número
maior de animais para confirmação e validação
desses resultados.
Agradecimentos
Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim.
1
BORJESSON, D. L.; PERONI, J. F. The regenerative medicine laboratory:
facilitating stem cell therapy for equine disease. Clinic Lab Med. v. 31, p. 109123, 2010.
2
FRISBIE, D. D.; SMITH, R. K. W. Clinical update on the use of mesenchymal
stem cells in equine orthopaedics. Equine Veterinary Journal. v. 42, p. 86-89,
2009.
3
RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. Mutagênese
Ambiental. Rio Grande do Sul: Editora da ULBRA, 2003. p. 173-200
4
DAWSON, B. ; TRAPP, R.G. Bioestatística Básica e Clínica, 3ª. Ed., Ed.
McGraw-Hill Interamericana, 2003. 348p.
5
VIDAL, M. A. et al. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated
from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem Cells
and Development, v. 21, n.2, p. 273-283, 2012.