vigilância sorológica para influenza aviária e

Vigilância sorológica para Influenza Aviária e Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas
DIVULGAÇÃO TÉCNICA
em material genético avícola brasileiro destinado à exportação no período de 2011 a 2012.
VIGILÂNCIA SOROLÓGICA PARA INFLUENZA AVIÁRIA E LARINGOTRAQUEÍTE
INFECCIOSA DAS GALINHAS EM MATERIAL GENÉTICO AVÍCOLA
BRASILEIRO DESTINADO À EXPORTAÇÃO NO PERÍODO DE 2011 A 2012
R.L. Luciano, A.L.S.P. Cardoso, E.N.C. Tessari,
G.F.Z. Stoppa, C.M.P. Villa, A.M.I. Kanashiro, A.G.M. Castro
Instituto Biológico, Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola, Rua Bezerra Paes,
2278, CEP 13.690-000, Descalvado, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMO
A avicultura industrial brasileira ocupa posição de destaque no cenário internacional. Atualmente,
somos o maior exportador mundial e o terceiro maior produtor de carne de frango. Nesse contexto, o
país também tem exportado material genético (matrizes, avós e bisavós) para diversos países, sendo
que é de extrema importância a garantia de que esse material cumpra as exigências sanitárias determinadas pelo Código Zoossanitário Internacional (CZI). Todo material exportado deve conter um
certificado veterinário internacional de acordo com os requisitos estabelecidos pelo país importador.
Uma das técnicas preconizadas pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o diagnóstico
de Influenza Aviária (IA) e Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas (LTI) é a prova de imunodifusão
em gel de ágar (IDGA). O Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola (CAPTAA), do Instituto Biológico (IB), localizado em Descalvado, SP, é um laboratório credenciado pelo
Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento, para realização do diagnóstico sorológico para
IA e LTI. No período de novembro de 2011 a dezembro de 2012, foram analisadas 21.364 amostras de
soros sanguíneos de galinhas, provenientes de matrizes, avós e bisavós destinadas à exportação, que
foram encaminhadas para o CAPTAA e submetidas ao diagnóstico sorológico de IA e LTI, através da
prova de IDGA. Não houve detecção de anticorpos para IA e LTI em nenhum dos lotes analisados, o
que contribuiu para atestar que o status sanitário dessas amostras destinadas à exportação, material
genético, foi considerado como livre de IA e LTI.
PALAVRAS-CHAVE: Diagnóstico sorológico, IDGA, Influenza Aviária, Laringotraqueíte Infecciosa
das Galinhas, aves, material genético.
ABSTRACT
SEROLOGICAL SURVEILLANCE FOR AVIAN INFLUENZA AND INFECTIOUS
LARYNGOTRACHEITIS IN GENETIC MATERIAL FROM BRAZILIAN POULTRY EXPORTS
DURING 2011-2012. Brazilian poultry industry ranks important position in the international scene.
Currently, the country kept its position as largest exporter and the third principal producer of poultry
meat. In respect this, Brazil has exported genetic material from poultry (breeders, grandparent
breeders and great grandparent breeders) to many countries, so that is extremely important to certify
that these material obey the sanitary requirements ordered by the International Zoo-sanitary Code
(IZC). All exporting products must having the international zoosanitary certificate (IZC) according
with the establishment of requirements by the importing country. One of techniques adopted by
World Organization for Animal Health (OIE) to diagnosis of avian influenza (AI) and infectious
laryngotracheitis (ILT) is agar gel immunodiffusion test (AGID). The Centro Avançado de Pesquisa
Tecnológica do Agronegócio Avícola (CAPTAA), Instituto Biológico (IB), located in Descalvado,
SP, Brazil is a laboratory accredited by the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply
(MAPA) to perform the serological diagnostic to AI and ILT. During November, 2011 to December
2012, 21.364 serum samples from breeders, grandparent breeders and great grandparent breeders
destined for exportation were forwarded to CAPTAA and submitted to the serological diagnosis
to AI and ILT by IDGA tests. There was no detection of antibodies to AI and ILT in any of the
flocks, which contributes to attest that the health status of these samples, intended to exporting of
Brazilian poultry genetic material was considerate free to AI and ILT.
KEY WORDS: Serological diagnosis, AGID, avian influenza, infectious laryngotracheitis, poultry,
genetic material.
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Segundo a OIE, a Influenza Aviária (IA) é uma
infecção em aves, causada por qualquer vírus
da influenza do tipo A ou por qualquer vírus de
influenza aviária que cause uma mortalidade de,
pelo menos, 75% de aves suscetíveis inoculadas.
No Código Sanitário para os Animais Terrestres da
OIE, as doenças causadas pelo vírus da Influenza
Aviária são de notificação obrigatória. A doença
se manifesta de três maneiras: forma severa, com
sinais clínicos generalizados (Influenza Aviária
de Alta Patogenicidade – IAAP); forma branda,
com sintomatologia respiratória (baixa patogenicidade – IABP) e sob a forma assintomática. A
estimativa do impacto da IAAP nos países afetados varia bastante, conforme a estrutura do setor
avícola, a rapidez no controle do surto e o método
utilizado para estimar os impactos. Desde que o
primeiro surto ocorreu no sudeste da Ásia, no
final de 2003, a Organização das Nações Unidas
para a Alimentação e Agricultura (FAO) e a OIE,
em colaboração com a Organização Mundial da
Saúde (OMS) têm coordenado a prevenção, o
controle e a erradicação internacional da doença,
inclusive fornecendo o suporte necessário aos
países em risco.
No Brasil, a doença é considerada exótica, com
vigilância sanitária e epidemiológica permanentes, além do monitoramento das aves migratórias
aquáticas. O Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), elaborou o Plano Operacional de Prevenção à Influenza Aviária, prevendo
ações para a proteção dos plantéis avícolas nacionais. Essas ações se devem ao fato de o Brasil ser o
terceiro maior plantel mundial de frangos e o maior
exportador avícola mundial. A Instrução Normativa
nº 32, de 13 de maio de 2002, estabelece as normas
técnicas de vigilância para a Doença de Newcastle
e a Influenza Aviária, definindo as provas laboratoriais que podem ser executadas no diagnóstico,
incluindo o IDGA. Essa técnica também é recomendada pela OIE como uma alternativa para o diagnóstico de IA em amostras destinadas ao comércio
internacional. O princípio é que todos os vírus de
influenza do tipo A possuem semelhanças entre os
antígenos do nucleocapsídeo e antígenos da matriz.
Com a utilização dessa técnica é possível detectar
anticorpos para os antígenos grupo específicos do
vírus influenza tipo A: ribonucleoproteína (RNP)
e matriz (M), permitindo a detecção de anticorpos
para todos os subtipos do vírus da Influenza A.
Assim sendo, essa prova é amplamente e rotineiramente empregada na detecção de anticorpos
específicos em aves (galinhas e perus), bem como
é um indicativo de quadros infecciosos causados
pelo agente etiológico.
A Laringotraqueíte Infecciosa das Aves
(LTI) é uma enfermidade respiratória altamente
contagiosa e aguda. O agente etiológico pertence à família Herpesviridae, gênero Itovirus e
espécie gallid herpesvirus 1. As manifestações
clínicas e patológicas podem variar de quadros severos (com aves mortas por asfixia), até
formas mais brandas, e as aves podem tornarse latentes e reexcretar o vírus tardiamente, sem
apresentar sintomatologia. Os prejuízos ocasionados incluem alta morbidade e mortalidade,
com queda na produção de ovos e diminuição no
desempenho de frangos de corte. Ocorrem mais
frequentemente em regiões com intensa produção
avícola. É uma enfermidade de notificação obrigatória à Organização Mundial de Saúde Animal
(OIE) e ao MAPA. O diagnóstico sorológico de LTI
inclui diversas provas utilizadas para a detecção
de anticorpos específicos para esse patógeno, tais
como virusneutralização, ELISA, imunofluorescência e IDGA.
A importância econômica e social da avicultura
brasileira coloca o setor em evidência no âmbito
nacional e internacional, visto que o Brasil é o maior
exportador mundial e o terceiro maior produtor de
carne de frango. Dentre os produtos exportados,
encontra-se o material genético avícola, composto
por matrizes, avós e bisavós que são comercializados para diversos países. O Código Zoossanitário
Internacional (CZI) estabelece os requisitos para a
exportação de produtos de origem animal, sendo
que uma das exigências sanitárias é a emissão de
um certificado veterinário internacional de acordo
com os requisitos estabelecidos pelos países importadores. Uma das técnicas recomendadas pela
Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para
o diagnóstico de Influenza Aviária (IA) e Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas (LTI) é a prova
de IDGA.
O Centro Avançado de Pesquisa do Agronegócio
Avícola – Instituto Biológico, localizado em Descalvado (SP) é um órgão vinculado à Secretaria de
Agricultura do Estado de São Paulo. Desde agosto
de 2011, o laboratório encontra-se credenciado pelo
MAPA, para realizar o diagnóstico sorológico oficial
de IA e LTI, através da prova de IDGA.
Princípios da técnica de IDGA
A prova de IDGA é uma reação de soroprecipitação entre o antígeno e o anticorpo, correspondente
em meio gelificado, onde ambos os reagentes se
difundem um contra o outro, encontrando-se na
área de reação. A difusão do antígeno e do soro a
ser testado ocorre em uma placa de Petri contendo
ágar gel. A reação que indica que os anticorpos
entraram em contato com o antígeno é uma precipitação do complexo antígeno-anticorpo, com
a formação de uma linha de precipitação. O an-
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Vigilância sorológica para Influenza Aviária e Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas
em material genético avícola brasileiro destinado à exportação no período de 2011 a 2012.
tígeno é colocado em um reservatório perfurado
no ágar e os soros a serem testados são colocados
em reservatórios perfurados no gel, próximos aos
orifícios com os antígenos. A placa é incubada a
22 ± 2 ºC, por 24 horas. Durante esse período, os
anticorpos e os antígenos se difundem pelo ágar
gel. Quando entram em contato, o complexo
produzido se precipita, formando uma linha,
que indica a presença de anticorpos no soroteste.
A velocidade de difusão de uma substância é
regida pelas leis de difusão, além do tamanho do
poro de gel, da temperatura, da concentração do
ágar e sua pureza; a velocidade de difusão de um
antígeno depende especialmente de duas variáveis,
que são: concentração e tamanho da molécula. Há
também alguma influência da forma ou configuração
molecular.
No período de novembro de 2011 a dezembro
de 2012, foram encaminhadas para o CAPTAA
21.364 amostras de soros sanguíneos, provenientes
de matrizes, avós e bisavós destinadas à exportação. Esse material foi submetido ao diagnóstico
sorológico de IA e LTI, através da prova de IDGA,
sendo coletado de aves com idades entre 16 e
95 semanas, provenientes de 586 núcleos, loca-
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lizados em 4 estados brasileiros. As Tabelas 1 e
2 mostram o agrupamento dessas amostras, por
tipo de exploração, unidade da federação, idade,
número de núcleos amostrados e quantidade de
soros analisados.
Procedimentos da prova de IDGA
O ágar gel (pH entre 7,2 ± 0,2) foi distribuído
em placas de Petri (90 x 15 mm), até que estivesse
completamente polimerizado. As placas de Petri
foram marcadas com o molde (perfurador) para
demarcação das cavidades onde foram distribuídos
os soros-testes, os controles e os antígenos para a
realização da prova.
IDGA para IA
Foram adicionados 50 µL de cada amostra de
soro a ser testada, nas posições 1, 3 e 5 (Fig. 1); 50 µL
do soro controle positivo, nas posições 2, 4 e 6. Por
último, foram acrescentados 50 µL do antígeno na
posição 7. Em cada grupo de placas testadas foram
acrescentados, na última roseta, os soros controles
(positivo fraco, positivo forte e negativo), nas posições 1, 3 e 5.
Tabela 1 – Amostras de soro de galinha, provenientes de material genético destinado à exportação, submetidas ao
diagnóstico sorológico de IA e LTI, através da prova de IDGA, no período de novembro de 2011 a dezembro de 2012,
CAPTAA, Instituto Biológico, Descalvado, SP.
Exploração
Bisavós
Avós
Matrizes
Total
Núcleos n° (%)
115 (19,62)
350 (59,73)
121 (20,65)
586 (100)
Amostras IDGA IA n° (%)
4.412 (20,65)
13.382 (62,64)
3.570 (16,71)
21.364 (100)
Amostras IDGA LTI n° (%)
4.371 (23,95)
10.310 (56,49)
3.570 (19,56)
18.251 (100)
Tabela 2 – Estratificação por unidades da federação (UF) das amostras submetidas ao diagnóstico sorológico de IA e
LTI, através da prova de IDGA, para exportação de material genético, no período de novembro de 2011 a dezembro de
2012, CAPTAA, Instituto Biológico, Descalvado, SP.
Exploração
UF
Núcleos n°
(%)
Amostras IDGA
IA n° (%)
95 (16,21)
3.812 (17,84)
20 (3,41)
600 (2,81)
285 (48,63)
11.432 (53,51)
Avós
17 (2,90)
510 (2,39%)
48 (8,19)
1.440 (6,74)
64 (10,92)
1.920 (8,99)
3 (0,51)
30 (0,14)
Matrizes
6 (1,02)
180 (0,84)
48 (8,19)
1.440 (6,74)
Total
586 (100)
21.364 (100)
a
expressa a variação entre a idade mínima e a idade máxima dos núcleos avaliados
Bisavós
São Paulo
Minas Gerais
São Paulo
Minas Gerais
Mato Grosso do Sul
São Paulo
Minas Gerais
Mato Grosso do Sul
Rio Grande do Sul
Idade
(semanas)a
26 – 67
24 – 60
17 – 95
26 – 65
25 – 67
16 – 73
27 – 52
25 – 64
25 – 69
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Amostras IDGA
LTI n° (%)
3.771 (20,66)
600 (3,29)
8.360 (45,81)
510 (2,79)
1.440 (7,89)
1.860 (10,19)
90 (0,49)
180 (0,99)
1.440 (7,89)
18.251 (100)
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R.L. Luciano et al.
Fig. 1 - Identificação das cavidades na roseta para distribuição das amostras e dos controles na prova de IDGA
para IA.
IDGA para LTI
Os soros sanguíneos foram inativados a 56 ºC, por
45 minutos. Foram adicionados 25 µL de cada amostra
de soro a ser testada, nas posições de 1 a 17 (Fig. 2);
25 µL do soro controle positivo, na posição “AC”.
Por último, foram acrescentados 25 µL do antígeno
na posição central de cada roseta. Também foram
incluídos os soros controles negativo e positivo em
cada grupo de placas analisadas.
Interpretação dos resultados
As placas foram transferidas para um recipiente
com algodão umedecido, sendo posteriormente
fechadas e incubadas por 24 horas, à temperatura
ambiente (22 ± 2 ºC).
Após esse período, foram examinadas em uma
sala escura, com uma fonte de luz, registrando-se o
resultado no formulário específico.
As amostras foram consideradas positivas, quando houve formação de uma linha contínua (linha de
identidade) similar entre a linha formada entre as
cavidades do controle positivo e o antígeno. Amostras inconclusivas ou suspeitas foram retestadas em
triplicata.
O lote com maior idade (95 semanas) correspondeu a uma propriedade de avós, proveniente do
Fig. 3 – Leitura dos soros controles utilizados na prova de
IDGA para IA, CAPTAA, Instituto Biológico, Descalvado,
SP. Legenda: WP – soro controle fraco positivo; SP – soro
controle forte positivo; NEG – soro controle negativo;
Ag – antígeno (IA); AC – soro controle positivo (IA).
Fig. 2 - Identificação das cavidades nas rosetas para distribuição das amostras e dos controles na prova de IDGA
para ILT.
Estado de São Paulo, enquanto que o núcleo com
menor idade foi de matrizes (16 semanas), localizado
no mesmo Estado. O maior número de núcleos amostrados (48,63%) foi proveniente de granjas de avós, em
São Paulo, sendo que nessas propriedades também
foi realizado o maior número de testes de IDGA
para IA (53,51%) e LTI (45,81%), respectivamente.
Em contrapartida, o menor número de núcleos em
que houve coleta de amostras foi encontrado em
propriedades compostas de matrizes, localizadas em
Minas Gerais, correspondendo a 0,51% do total de
lotes analisados, com a realização de apenas 0,14%
do total de IDGA para IA e 0,49% de IDGA para LTI.
As Figuras 3, 4 e 5 ilustram os resultados das leituras realizadas nas placas de IDGA. Em nenhuma
das amostras analisadas houve detecção de anticorpos
contra IA e LTI, o que comprova a ausência de resposta
sorológica à circulação do vírus de IA e LTI nos lotes
avaliados. Tal fato pode ser explicado pela ausência
de contato prévio com os vírus avaliados. Isso corrobora com o fato de que IA nunca foi reportado no
país, que é considerado livre dessa enfermidade. No
caso de LTI, pode-se concluir que o material avícola
analisado também é livre dessa doença. Os dados
encontrados neste estudo contribuem para assegurar
que o material genético avícola analisado possui um
elevado padrão sanitário, atestando sua qualidade e
possibilidade de entrada nos países importadores.
Fig. 4 – Leitura de soros negativos para a prova de IDGA
IA, CAPTAA, Instituto Biológico, Descalvado, SP. Legenda:
1, 3 e 5 – amostras de soros; Ag – antígeno (IA); AC
– soro controle positivo (IA).
Biológico, São Paulo, v.76, n.1, p.13-17, jan./jun., 2014
Vigilância sorológica para Influenza Aviária e Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas
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Fig. 5 – Leitura de soros negativos para a prova de IDGA
LTI, CAPTAA, Instituto Biológico, Descalvado, SP. Legenda: 13, 14, 15, 16 e 17 – amostras de soros; Ag – antígeno
LTI; AC – soro controle positivo LTI.
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Recebido em 23/5/14
Aceito em 5/6/14
Biológico, São Paulo, v.76, n.1, p.13-17, jan./jun., 2014
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