Avaliação do Nível de Expressão Gênica da Malato Desidrogenase

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Avaliação do Nível de Expressão Gênica da Malato
Desidrogenase -2 na Regeneração Hepática de Ratos
Brito, D de; Guimarães Filho, A; Pinto, TMF; Matos, MNC; Cunha, RMS; Cavada, BS
Palavras-chave: malato desidrogenase (MDH), regeneração, cDNA, qRT-PCR
Hepatectomia parcial à 70%(PHx) é um modelo experimental freqüentemente utilizado para o estudo da
regeneração hepática. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos na regeneração hepática associados
a danos ao fígado ainda não estão totalmente esclarecidos. Elucidar essas questões, muitas vezes exige a
determinação dos níveis de expressão de genes que podem ser avaliados através da técnica qRT-PCR. A malato
desidrogenase (MDH) é uma enzima do ciclo de Krebs que catalisa a conversão do malato em oxaloacetato e que
participa da lançadeira malato/aspartato fundamental na redução do NAD e portanto fornecedora de elétrons
para cadeia respiratória. A análise de sua expressão gênica reflete o metabolismo celular bem como a ativação
dessas vias metabólicas. Dessa forma, objetivou-se no presente estudo avaliar o nível de expressão gênica da MDH2
em ratos submetidos a PHx. Foram utilizados ratos wistar masculinos, pesando 250-350 g com 10-14 semanas de
idade. Os animais foram divididos em subgrupos de seis, sendo um submetido a laparotomia enquanto outro a
PHx. Todos receberam alimentação ad libitum, e foram sacrificados nos dias 3, 7 e 14 após cirurgia para obtenção
das amostras de fígado. Para a extração do RNA total foi utilizado o reagente TRIzol® seguindo as especificações
do fabricante, a síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada a partir de RNA total com primer oligo
(dT) (0.5µg/µl) e enzima M-MLV RT seguindo especificações do fabricante. Através de espectrofotometria e
eletroforese em gel de agarose 0.8% corado com Brometo de Etídio foi possível a quantificação e a mensuração
da qualidade da extração do RNA total e cDNA. A reação de qRT-PCR foi realizada utilizando equipamento
Realplex4 da Eppendorf e corante SYBR Green (Applied Biosystems). Usou-se como molde 10ng de cDNA a uma
temperatura de 55 °C de anelamento dos primers específicos para o gene da MDH2. Utilizou-se, ainda o gene
gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como gene referência, Os Ct´s foram normalizados e a expressão
relativa dada pelo método 2-ΔΔCt. A eletroforese em gel de agarose 0.8% permitiu verificar a integridade das
amostras de RNA total, avaliadas pelas bandas estruturais do RNA ribossômico (28S e 18S) e a quantificação
em espectrofotômetro permitiu verificar boa qualidade e concentração ideal para trabalho, as relações entre as
absorbâncias A 260 nm e 280 nm demonstraram boa qualidade na extração do RNA total e cDNA. A expressão
relativa do MDH2 em animais PHx após 3, 7 e 14 dias foi respectivamente: uma redução de 42% na expressão
em 3 dias; aumento de 289% no sétimo dia e uma redução de expressão de 10% em 14 dias (todos em relação ao
grupo laparotomia). Assim, uma maior expressão relativa do gene estudado foi evidenciada após sete dias da PHx.
Apoio: CNPq e Funcap