Mycobacterium smegmatis recombinante - IPTSP

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
FÁBIO MUNIZ DE OLIVEIRA
Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX
induz resposta imune contra Mycobacterium tuberculosis em
camundongos BALB/c.
Goiânia
2014
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA
DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a
disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem
ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões
assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção
científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
[ X ] Dissertação
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a):
Fábio Muniz de Oliveira
E-mail:
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[X]Sim
[ ] Tese
[ ] Não
Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento:
CNPq
Sigla:
País:
Brasil
UF:
GO
CNPJ:
Título:
Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX induz resposta imune contra
Mycobacterium tuberculosis em camundongos BALB/c.
Palavras-chave:
Tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, proteína CMX e BCG.
Título em outra língua:
Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing CMX protein induces
immune response against Mycobacterium tuberculosis in BALB/c mice.
Palavras-chave em outra língua:
Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis,
CMX protein and BCG.
Área de concentração:
Microbiologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
28/02/2014
Programa de Pós-Graduação:
Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador:
André Kipnis
E-mail:
[email protected]
Co-orientador (a):*
Ana Paula Junqueira-Kipnis
E-mail:
[email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento:
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] NÃO1
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________________________________ Data: ____ / ____ / _____
Assinatura do (a) autor (a)
1
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
ii
FÁBIO MUNIZ DE OLIVEIRA
Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX
induz resposta imune contra Mycobacterium tuberculosis em
camundongos BALB/c.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título
de Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Orientador: Prof. Dr. André Kipnis
Co-orientador: Prof. Dra. Ana
Junqueira-Kipnis
Paula
Goiânia
2014
iii
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)
GPT/BC/UFG
O48m
Oliveira, Fábio Muniz de.
Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a
proteína CMX induz resposta contra Mycobacterium
tuberculosis em camundongos BALB/c [manuscrito] / Fábio
Muniz de Oliveira. - 2014.
92 f. : il., figs, tabs.
Orientador: Prof. Dr. André Kipnis; Co-orientadora:
Profª. Drª. Ana Paula Junqueira-Kipnis;
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas.
Apêndices.
1. Tuberculose – Tratamento – História 2. Tuberculose –
Vacinação 3. Tuberculose – Controle 4. Mycobacterium
tuberculosis I. Título.
CDU: 616.24-002.5
iv
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Fábio Muniz De Oliveira
Orientador (a): Prof. Dr. André Kipnis
Co-orientador (a): Prof.ª Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
Membros:
1.
2.
3.
Data:
v
Dedico este trabalho aos meus pais, os
quais sempre me apoiaram em todos os
momentos da minha vida.
vi
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer primeiramente a Deus, pois não cai se quer uma folha de uma árvore se
Deus não permitir, e com a graça e a permissão Dele, consegui a oportunidade de fazer
este mestrado. “Deus a ti dou louvores e cânticos, pois o Senhor foi fiel do início ao
fim. Como diz na Sua palavra, Vereis a diferença entre o que serve e o que não ao
Senhor dos Exércitos”.
Quero agradecer aos meus pais e meus irmãos que sempre estiveram ao meu lado nesta
jornada, dando apoio em todos os momentos difíceis e se alegrando comigo nos
momentos de alegria. Sou grato a Deus por ter uma família abençoada, da qual tenho
muito orgulho.
Quero agradecer também a minha namorada Jacqueline Souza Amaral Melo e sua
família a qual foi muito importante no desenvolvimento deste projeto, vários foram os
momentos que precisei de ajuda, e em todos recebi o melhor desta linda família. Muito
obrigado Jacque por tudo, pela compreensão e dedicação que teve comigo nesta jornada.
Quero de coração agradecer aos meus Professores de graduação Milton Camplesi e
Daniela Camplesi, os quais me orientaram a fazer o mestrado, dando conselhos e
motivando a fazer a melhor escolha da minha vida.
Quero agradecer ao meu orientador Prof. Dr. André Kipnis, que sempre foi um exemplo
de pessoa e ética, que dedicou o seu melhor em me ensinar a ser um mestre. Sempre
calmo no falar e educado nas palavras, me guiou pela mão neste mestrado, aprendi
muito ao lado deste grande Mestre, que com grande sabedoria me orientou. O saber é
algo que todos podem adquirir, mas transmiti-lo com clareza é algo que poucos
conseguem, “todas as vezes que fui a sua sala tive a certeza que iria aprender algo novo,
pois o senhor sempre me ensinou. O senhor é um exemplo de pessoa e de pesquisador
para mim e para todos, é um privilegio tê-lo como orientador. Admiro o que o senhor é,
pois és um grande pesquisador e orientador”.
Quero agradecer a minha co-orientadora Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis, a qual
considero orientadora, pois tive dois orientadores!! “Tive a graça de aprender da
vii
senhora as maiores lições que a pesquisa poderia ensinar, estar ao lado de uma grande
pesquisadora é um privilegio, e eu tenho este privilégio. Obrigado por tudo, foi muito
bom aprender com a senhora, te admiro muito!”
Quero agradecer a todos os colegas do Laboratório de Bacteriologia Molecular, pelo
companheirismo e apoio durante a realização deste trabalho, Luana, Suellen, Aline,
Lorena, Renato, Rogério, Beatriz, André, Fabiana, Aureliano e Viviane. Em especial
quero agradecer ao meu amigo Lázaro Moreira Marques Neto, o qual foi um grande
companheiro, não só dentro, como fora do Laboratório, “obrigado pelos conselhos e por
sempre estar disposto a me ajudar”.
Quero agradecer a todos os colegas do Laboratório de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas, Bruna, Adeliane, Danilo, Joseane, Abadio, Marcos, Duanne, Joyce, Bruno,
Rafaela, por oferecerem atenção e serem sempre dedicados em ajudar e colaborar
comigo no desenvolvimento deste trabalho. Em especial quero agradecer a Minha
Colaboradora Monalisa Martins Trentini ou melhor MONA, pessoa que compartilhei
muito momentos felizes e tristes, uma amiga para todos os momentos, a qual foi
fundamental no desenvolvimento deste projeto.
Quero agradecer ao pessoal do Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de
Odontologia – UFG, na pessoa da Professora Aline C. Batista, que contribuiu e muito
na parte histopatológica deste trabalho.
Quero agradecer aos membros da banca de Qualificação, os quais foram enfáticos e
dedicados em contribuir para o crescimento deste trabalho, agradeço de coração, pois
aprendi muito com seus ensinamentos. Em especial quero agradecer a duas professoras
que me deram a honra de compor esta banca, Professora Maria Cláudia e Professora
Juliana Lamaro, que contribuíram e muito não só neste momento, mas em toda a minha
formação.
Quero agradecer ao CNPq pelo apoio financeiro e ao IPTSP pela a oportunidade de
estudo, e a todos os funcionários que sempre fizeram o seu melhor para manter o nível
desta instituição.
viii
Quero agradecer a todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para realização
deste trabalho, obrigado a todos.
ix
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT xii xiii xv xvi 1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1 1.1 Histórico ................................................................................................................................. 1 1.2 Epidemiologia ....................................................................................................................... 5 1.3 Etiologia .................................................................................................................................. 6 1.4 Imunopatologia .................................................................................................................... 7 1.5 Manifestação clínica e diagnóstico .............................................................................. 13 1.6 Medidas de controle: diagnóstico, tratamento e prevenção ............................... 15 1.7 Desenvolvimento de novas vacinas ............................................................................ 18 1.8 Antígenos imunodominantes de Mycobacterium tuberculosis abordados neste trabalho ............................................................................................................................... 19 1.9 Proteína CMX ...................................................................................................................... 21 1.10 Vetor de vacina ................................................................................................................ 21 2 JUSTIFICATIVA 23 3 OBJETIVOS 24 3.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 24 3.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 24 4 MÉTODOS 25 4.1 Fluxograma das etapas do desenvolvimento deste estudo. ................................ 25 4.2 Construção dos plasmídeos recombinantes. ........................................................... 26 4.3 Preparo de M. smegmatis eletrocompetente. .......................................................... 26 4.4 Eletroporação de M. smegmatis. ................................................................................... 27 4.5 Determinação da concentração da vacina recombinante mc2-­‐CMX. ................ 27 4.6 Obtenção e determinação da concentração da vacina BCG Moreau. ............... 28 4.7 Análise da expressão da proteína recombinante CMX em M. smegmatis mc2 155 por western blotting. .......................................................................................................... 28 4.8 Ensaio de estabilidade do plasmídeo in vitro. ......................................................... 29 4.9 Animais utilizados para realização do estudo e condições físicas de manutenção. .................................................................................................................................. 29 4.10 Avaliação da imunogenicidade e persistência da vacina mc2-­‐CMX. .............. 30 4.11 Estabilidade in vivo do mc2-­‐CMX. ............................................................................... 30 x
4.12 Preparo dos inóculos vacinais. ................................................................................... 31 4.13 Imunização. ....................................................................................................................... 31 4.14 Infecção intravenosa com Mtb. .................................................................................. 31 4.15 Obtenção do soro para realização de ELISA. ......................................................... 32 4.16 ELISA. .................................................................................................................................. 33 4.17 Obtenção das células do baço. .................................................................................... 33 4.18 Obtenção das células do pulmão. .............................................................................. 33 4.19 Avaliação da produção celular de citocinas do baço e pulmão. ...................... 34 4.20 Histopatológico. .............................................................................................................. 34 4.21 Determinação da carga bacilar no pulmão. ........................................................... 35 4.22 Análise Estatística. .......................................................................................................... 35 5 RESULTADOS 36 5.1 M. smegmatis recombinante pLA71-­‐CMX expressa proteína CMX. .................. 36 5.2 mc2-­‐CMX induz resposta imune humoral específica. ............................................ 37 5.3 mc2-­‐CMX persiste por até sete dias em camundongos BALB/c e este mantém a expressão da CMX in vivo. ...................................................................................................... 37 5.4 A imunização com mc2-­‐CMX em dois momentos induz melhor resposta imune humoral específica para CMX que a BCG. ............................................................... 39 5.5 A resposta imune celular frente a infecção com Mtb. ........................................... 39 5.6 Redução das lesões pulmonares induzidas pela infecção com Mycobacterium tuberculosis pelas vacinas mc2-­‐CMX e a BCG. ...................................................................... 41 5.7 Redução da carga bacilar no pulmão de camundongos imunizados com as vacinas mc2-­‐CMX e BCG. ............................................................................................................. 43 6 DISCUSSÃO 44 7 CONCLUSÕES 50 8 REFERÊNCIAS 51 9 ANEXOS 74 9.1 Parecer do comitê de ética em pesquisa. .................................................................. 74 9.2 Artigo: Prime-­‐Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. ................ 76 xi
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Tabela 1. Esquema básico de tratamento da tuberculose para adultos e
adolescentes...................................................................................................................16
Tabela 2. Possíveis explicações que possam justificar a variabilidade na eficácia
protetora da BCG contra a tuberculose pulmonar em adultos...............................17
Figura 1. O mapa representa uma estimativa do número casos novos de
tuberculoses no mundo no ano de 2012 e também demonstra que a tuberculose é
uma doença cosmopolita...............................................................................................5
Figura 2. Ativação da resposta antígeno-específica de células T contra Mtb.
Figura adaptada de Cooper 2009.................................................................................9
Figura 3. Fluxograma das etapas realizadas no desenvolvimento e avaliação da
vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c............................................................25
Figura 4. Esquema de avaliação da vacina mc2-CMX em camundongos
BALB/c..........................................................................................................................32
Figura 5. Expressão da proteína CMX no recombinante mc2-pLA71-CMX.........36
Figura 6. Resposta imune humoral específica induzida pela vacina mc2-CMX em
camundongos BALB/c.................................................................................................37
Figura 7. A persistência do mc2-CMX em camundongos BALB/c..........................38
Figura 8. Gel de agarose do PCR do gene da fusão CMX........................................38
Figura 9. Resposta imune humoral específica induzida pelas vacinas salina, BCG
e mc2-CMX em esquema de prime-boost em camundongos BALB/c antes e após o
desafio com Mtb...........................................................................................................39
Figura 10. Total de linfócitos T CD4 no pulmão e baço dos camundongos............40
Figura 11. Porcentagem de linfócitos T CD4 produtores de citocinas próinflamatórias no pulmão de camundongos................................................................41
Figura 12. A imunização com mc2-CMX induziu menor lesão pulmonar similar a
de camundongos imunizados com a BCG..................................................................42
Figura 13. Comparação do score de lesão pulmonar entre os grupos de
camundongos desafiados com M. tuberculosis...........................................................42
Figura 14. Resposta imune induzida pela a imunização com mc2-CMX é efetiva no
controle da infecção por Mtb......................................................................................43
xii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
AIDS
Síndrome
da
Imunodeficiência
Adquirida,
do
inglês:
Acquired
Immunodeficiency Syndrome
APCs
Célula Apresentadora de Antígenos, do inglês: Antigen Presenting Cells
BAAR
Bacilo Álcool Ácido Resistente
BCG
Bacillus Calmette-Guérin
CD
Marcador de Diferenciação, do inglês: Cluster of Diferentiation
CFP
Proteína de Filtrado de Cultura, do inglês: Culture Filtrate Antigen
DAB
Diaminobenzidina
DCs
Células Dendríticas
DNA
Ácido Desoxirribonucléico, do ingle: desoxyribonucleic acid
DOT
Tratamento Diretamente Observado
DOTS
Tratamento Diretamente Observado de Curta Duração, do infles: Direc
ESAT-6
Antígeno Alvo de Secreção Primária do inglês: Early Secretory
Antigenic Target
FITC
Isotiocianato de Fluoresceína
FSC
Dispersão frontal, do inglês: forward scatter
GlcB
Malato sintase G
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
IFN-γ
Interferon-gama
IL
Interleucina
INH
Isoniazida
KDa
Quilodalton
LACEN-GO Laboratório Central de Goiás
LAM
Lipoarabinomanana
MHC
Complexo Principal de Histocompatibilidade de Classe
MPT-51
Proteína micobacterianas de 27kDa ou Ag85D
MTB
Mycobacterium tuberculosis
NK
Células Natural Killer
NO
Óxido Nítrico
OADC
Ácido Oléico, Albumina, Dextrose e Catalase
OMS
Organização Mundial da Saúde
xiii
OPD
Substrato Ortofenilenodiamina, do inglês: Ortho-Phenylenediamine
Dihydrochloride
PAS
Para-amino-ácido do ácido salicílico
PBS
Tampão Fosfato Salina, do inglês: Phosphate-buffered saline
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês: Polymerase Chain Reaction.
PE
Ficoeritrina
PerCP
Proteína Peridinina de Clorofila
PI3P
Fosfatidilinositol 3-fostato
PNCT
Programa Nacional de Controle da Tuberculose
PPD
Derivado Protéico Purificado de Mycobacterium tuberculosis
RIOs
Reativos Intermediários de Oxigênio
RINs
Reativos Intermediários de Nitrogênio
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida com Duodecil Sulfato de Sódio
SM
Estreptomicina
SSC
Dispersao lateral, do inglês: side scatter
TB
Tuberculosis
TB-MDR
Tuberculose Multidroga-Resistente
Th
Linfócito T auxiliar do inglês: T Helper
TLR
Receptor Semelhante ao Toll, do inglês Toll-Like Receptor
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral-alfa, do inglês: Tumor Necrosis Fator
UNICEF
Fundo das Nações Unidas para a Infância, do inglês: United Nations
Children’s Fund
USA
Estados Unidos da América, do inglês: United States of America
xiv
RESUMO
Há séculos a tuberculose (TB), doença infectocontagiosa causada por
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), vem sendo um problema de saúde pública mundial.
Mesmo após o surgimento da vacina BCG em 1921, o controle da tuberculose continua
a passos lentos. Isso se deve à eficácia variável de 0 a 80% apresentada pela vacina na
proteção contra TB em indivíduos adultos. Deste modo, o desenvolvimento de uma
nova vacina contra a TB é necessário. Neste estudo, avaliou-se uma vacina
recombinante composta por Mycobacterium smegmatis expressando a proteína de fusão
CMX (mc2-CMX), formada por três antígenos do Mtb: Ag85C, MPT51 e HspX. M.
smegmatis mc2 155 foi transformado com pLA71-CMX por eletroporação, sendo a
expressão da proteína CMX confirmada por imunoblot. Camundongos BALB/c foram
distribuídos em quatro grupos: salina, infecção, BCG e mc2-CMX. Os grupos foram
imunizados com suas respectivas vacinas em dois momentos com intervalos de 15 dias,
e o sangue de todos os animais coletado quinze dias após a última imunização. Trinta
dias após a imunização, os animais foram desafiados com Mtb H37Rv (via endovenosa)
e trinta dias após o desafio, o sangue foi coletado para realização de ELISA. Setenta
dias após desafio, o pulmão e o baço de todos os camundongos foi coletado para
obtenção de células para realização de citometria, histopatológico e determinação da
carga bacilar. A imunização com o mc2-CMX induziu níveis maiores de anticorpos da
classe IgG1 (1,910±0,70) e IgG2a (0,139±0,020) anti-CMX quando comparado com o
grupo BCG (0,646±0,19 e 0,413±0,24, respectivamente, p<0,05). Estes resultados
demonstram a relevância do antígeno CMX na imunogenicidade da vacina
recombinante. Após setenta dias do desafio, a quantidade de células T CD4 produtoras
de citocinas do tipo Th1 foi analisada no pulmão. Foi observado um aumento
significativo na porcentagem de células T CD4 positivas para IFN-γ e TNF-α nos
camundongos imunizados com vacina mc2-CMX, quando comparado com o grupo
BCG. Camundongos desafiados com Mtb apresentaram porcentagens maiores de
células produtoras de IL-2, quando comparado com o grupo não desafiado. Todavia,
somente os camundongos imunizados com a vacina mc2-CMX apresentaram
porcentagens significativamente maiores em comparação ao grupo infecção. A resposta
imune observada foi efetiva no controle da infecção por Mtb, sendo isto confirmado
quando os pulmões dos camundongos foram analisados histologicamente e a carga
bacilar determinada. Os grupos vacinados com as vacinas mc2-CMX e BCG
apresentaram uma redução significativa da lesão pulmonar induzida pela infecção por
Mtb, e também da carga bacilar no pulmão, quando comparados com o grupo infecção.
Conclui-se que mc2-CMX tem um bom potencial para ser explorado como vacina contra
a TB.
xv
ABSTRACT
For hundreds years tuberculosis (TB), a contagious disease caused by Mycobacterium
tuberculosis (Mtb), has been a global public health problem. Even after the
development of the vaccine BCG, in 1921, tuberculosis control continues on slow pace.
This comes to be as a result of the variable efficacy (from 0 to 80%) presented by the
vaccine in the protection against TB in adults. Therefore, the development of a new
vaccine against TB is necessary. In this study, it was evaluated a recombinant vaccine
composed of Mycobacterium smegmatis expressing the CMX fusion protein (mc2CMX), formed from three antigen epitopes of Mtb: Ag85C, MPT51 and HspX. M.
smegmatis mc2 155 was transformed with pLA71-CMX by electroporation, and the
presence of the CMX protein was confirmed by imuno blotting. BALB/c mice were
distributed in four groups: saline, infection, BCG and mc2-CMX. The groups were
immunized with their respective vaccines in two moments with an interval of fifteen
days and the animal blood was collected fifteen days after the last immunization. Thirty
days after the last immunization, the animals were challenged with Mtb H37Rv
(intravenously) and thirty days after the challenge, the blood was collected to perform
ELISA test. Seventy days after the challenge, the lungs from all mice were collected to
obtain cells for flow-cytometry, histological analysis and also to determine the bacillary
burden. The immunization with mc2-CMX induced higher levels of antibodies of IgG1
(1,910±0,70) and IgG2a (0,139±0,020) class anti-CMX when compared with BCG
group (0,646±0,19 and 0,413±0,24; respectively, p<0,05). These results demonstrated
the relevance of CMX antigen in the immunogenicity of the recombinant vaccine.
Seventy days after the challenge, the amount of T CD4 cells in the lung producing Th1type cytokines was assessed. It was observed a significant increase in the percentage of
T CD4 cells positive for IFN-γ and TNF-α in the immunized mice with mc2-CMX
vaccine, when compared with the group immunized with BCG. Mice challenged with
Mtb presented significant higher percentage of IL-2 producer cells when compared with
the non-immunized group. However, only the mice immunized with the vaccine mc2CMX presented significant higher percentage when compared with the infection group.
The immune response induced by the vaccine was effective in the control of Mtb
infection, confirmed by the histological analysis and the bacillar burden determined.
The groups vaccinated with mc2-CMX and BCG presented a significant reduction of the
lung lesion induced by the Mtb infection, and also lung bacterial load, when compared
with the infection group. Thus, the recombinant vaccine mc2-CMX presents potential
characteristics to be used in the prevention of TB.
xvi
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Histórico
Conhecida na Grécia antiga como pthisis ou consumação, a tuberculose já era
problema de saúde pública. Hipócrates, por volta de 460 A.C., registrou que esta doença
atingia os maiores contingentes populacionais de seu tempo e era quase fatal, tempo em
que a maioria dos autores acreditava que a doença era hereditária. Já Aristóteles (384322 A.C.) a considerava contagiosa. Clarissimus Galen, médico de maior expressão
após Hipócrates, definiu pthisis como ulceração dos pulmões, peito ou garganta,
acrescida de tosse, febre baixa e perda de peso (PEASE, 1940).
A tuberculose foi conhecida também como ‘peste branca’ no início do século
XVII, devido à uma grande epidemia que persistiu por aproximadamente duzentos anos.
Durante este período surgiram pesquisadores como Laennec, lembrado por ter
inventado o estetoscópio, que elucidou a patogênese da tuberculose e estabeleceu as
formas da doença em pulmonar ou extrapulmonar. Já o militar Francês Jean-Antoine
Villemin demonstrou a infecção natural da tuberculose, quando inoculou uma pequena
quantidade de material tuberculoso em coelhos (DANIEL, 2006). Todavia, somente em
1830 que o termo tuberculose foi usado pela primeira vez por Shönlien, para definir a
doença (LIGON, 2002).
O grande marco histórico da tuberculose aconteceu em 24 de março de 1882,
quando o Dr. Hermann Heinrich Robert Koch em sua apresentação intitulada "Die
Aetiologie der Tuberculose" na audiência da Berlin Physiological Society (Sociedade de
Fisiologia em Berlin - Alemanha), demonstrou de forma categórica o agente etiológico
da doença, o Bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis), o que lhe rendeu o prêmio
Nobel de Medicina em 1905. Na mesma ocasião ele também apresentou critérios
adaptados de Jacob Henle para estabelecer a etiologia das doenças infecciosas,
publicados e conhecidos como ‘Postulados de Henle-Koch’ em 1890 (DANIEL,
2005b).
O tratamento da tuberculose inicialmente baseou-se na administração de arsênio
e ouro, mas, eram muitos os efeitos adversos (BENEDEK, 2004). Na metade do século
XIX os doentes começaram a se recolher em sanatórios, onde além de descansar,
recebiam cuidados médicos, dietas ricas em proteínas, e faziam exercícios monitorados
1
(DANIEL, 2006). Em 1895, a descoberta dos raios-X por Wilhelm Konrad Von
Röntgen significou um grande avanço no diagnóstico e acompanhamento da doença.
Em 1902, Albert Calmette e Camille Guérin obtiveram uma cultura da cepa de
Mycobaterium bovis virulenta, isolada por Edmond Nocard do leite de uma vaca com
mastite tuberculosa bovina, a “Lait Nocard” (BARRETO et al., 2006). Frustrados com a
formação de grumos no meio de cultura, eles adicionaram bile bovina ao meio, no
intuito de diminuir esta formação. Contudo, a adição desta substância não diminuiu a
formação de grumos na cultura, entretanto, ao avaliar a virulência da cepa em
porquinhos-da-índia foi observado um decréscimo da mesma. Após 200 passagens da
cepa em meios de cultura com bile bovina, e em seguida em animais de laboratório, foi
isolada uma nova cepa de M. bovis atenuada. E para avaliar esta como possível
candidata à vacina contra TB, a injetaram em uma vaca (DANIEL, 2005a). Com 231
subcultivos sucessivos do M. Bovis Lait Nocard em meios de cultura realizados a cada
três semanas, foi alcançada a total atenuação do mesmo (PEREIRA et al., 2007). O que
resultou na perda de aproximadamente 130 genes que estão agrupados principalmente
na região de diferença 1 (RD1), a principal responsável pela atenuação. Em 1921, após
13 anos de estudos, os pesquisadores Calmette e Guérin liofilizaram o BCG (Bacillus
Calmette-Guérin) que é o M. bovis atenuado, no Instituto Pasteur (BARRETO et al.,
2006).
Em colaboração com o Dr. Benjamin Weill-Hallé e Raymond Turpin no
Hospital Charité em Paris, em Julho de 1921, Calmette e Guérin, administraram 6 mg
de BCG por via oral a um bebê com 3 dias de vida, cuja a mãe havia morrido de
tuberculose pulmonar, um dia após o seu nascimento. O bebê ficou sob os cuidados da
avó que tinha baciloscopia positiva, e doses adicionais de BCG foram dadas ao bebê nos
dias 5 e 7 de vida. Seis meses depois, eles examinaram o bebê e o mesmo não
apresentava sinais de tuberculose, apesar da exposição constante (DANIEL, 2005a).
O primeiro estudo clínico realizado entre 1921 e 1927 na França e Bélgica,
confirmou que a BCG era altamente eficaz na proteção contra tuberculose em crianças.
Na França, a BCG era administrada por via oral no leite, porém, a administração da
vacina foi interrompida em 1930, em consequência do desastre de Lubeck, no qual 67
dos 249 bebês, que receberam a vacina, morreram devido à negligente contaminação da
vacina com uma cepa de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Após este incidente,
alguns países priorizaram a administração da BCG pela via intradérmica, sendo uma
medida necessária para segurança da vacinação em massa. Em 1950 a vacina BCG já
2
era recomendada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) (ANDERSEN et al.,
2005).
Em 1948, foi realizada uma notável campanha objetivando o controle da
tuberculose, com o patrocínio da UNICEF (Fundo das Nações Unidas para a Infância) e
da Cruz Vermelha Dinamarquesa. O programa era baseado no teste da tuberculina
seguida pela vacinação com BCG dos não reativos. Durante três anos, aproximadamente
30 milhões de pessoas fizeram o teste de tuberculina e 14 milhões de pessoas foram
vacinadas com BCG. O programa foi de fato, o primeiro programa de controle da
tuberculose organizado por uma agência da OMS (COMSTOCK, 1994).
Com a descoberta das sulfonamidas e penicilina na década de 30 do século XX,
a existência de uma terapia antimicrobiana eficaz tornou-se realidade. Iluminado pelas
observações que micróbios de solo pareciam ser capazes de prevenir o crescimento de
outras espécies “em seu território”, Selman Waksman, pesquisador em New Jersey,
identificou a estreptomicina (SM) em 1944. No mesmo período, Jorgen Lehman
trabalhando na Suécia, descrevia o para-amino-ácido do ácido salicílico (PAS).
Rapidamente cogitou-se o uso destes dois agentes que apresentavam claramente,
atividade contra o Mtb. Em estudos realizados na década 50 comparando os dois
agentes, observou-se que a combinação dos mesmos era mais eficaz no tratamento
contra tuberculose, prevenindo o aparecimento de resistência (BIGNALL, 1950;
ISEMAN, 2002; MURRAY, 2004). A isoniazida (INH), a primeira droga
micobactericida foi produzida em 1952 e as rifamicinas em 1957. Uma nova era para o
tratamento da tuberculose havia surgido (DANIEL, 2005b).
Novas drogas foram descobertas no decorrer do tempo permitindo que novos
esquemas terapêuticos fossem introduzidos, o uso destas drogas sugeriu que a
tuberculose seria um problema controlável, uma doença perto da eliminação (COSTA,
1988). Porém, com o aparecimento de resistência aos fármacos usados primariamente
no tratamento, esquemas terapêuticos compostos por mais de dois fármacos, como o de
1965 tiveram que ser implementados. Este consistia na administração combinada da
SM, INH e PAS, durante 12 meses, surgindo um novo regime de tratamento
(RUFFINO-NETTO, 2002).
O esquema de tratamento de menor duração (6 meses), utilizando a rifampicina
(RMP) no lugar da SM (RMP+INH+Pirazinamida (PZA)) foi introduzido em 1979
(RUFFINO-NETTO, 2002). Este era mais eficaz e menos tóxico que os anteriores,
sendo então implementado de forma pioneira em todo mundo (CAMPOS, 2007). Por
3
apresentar estas caraterísticas, o esquema terapêutico de curta duração tinha como
proposta, diminuir o abandono do tratamento. Todavia isto não foi observado na prática,
houve um aumento no número de abandono dando origem ao fenômeno da
multirresistência, no qual algumas cepas do bacilo conseguem neutralizar a ação de
algumas drogas usadas no tratamento. Com o advento da epidemia da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA), o números de casos de tuberculose voltaram a
aumentar a partir da década de 80 do século passado, iniciando assim a pesquisa por
programas de tratamento que pudessem auxiliar no controle da doença e evitar o
aparecimento de cepas resistentes aos fármacos (MURRAY, 2004; KWAN et al., 2011).
Nesse contexto foi preconizado o programa DOT – Tratamento Diretamente
Observado, que era um regime baseado em 68-78 encontros com o paciente durante os
seis meses de tratamento, que tinha como objetivo supervisionar a evolução do
prognóstico do paciente. Este foi implementado primariamente no Estados Unidos da
América (USA) na década de 90, levando a uma redução significativa no número de
casos de tuberculose, chegando aos 7,8% ao ano, entre 1995 e 2000. Em 1993 o
programa DOT foi modificado de acordo com recomendações da OMS para Tratamento
Diretamente Observado de Curta duração – DOTS, sendo uma estratégia de ação para o
controle da doença, com algumas recomendações que incluíam o comprometimento dos
governos, principalmente na garantia de suprimento dos medicamentos. O DOTS foi
implementado em vários países inclusive no Brasil em 1996 (SHRESTHAKUWAHARA R. et al.; ISEMAN, 2002; RUFFINO-NETTO, 2002).
Atualmente, a OMS recomenda como abordagem de cuidados e controle da
tuberculose, o programa Stop TB Strategy, que foi lançado em 2006 com objetivo de
reduzir pela metade o número de casos e mortes por tuberculose até 2015, com relação
aos índices de 1990, e eliminar a doença como um problema de saúde pública mundial
até 2050. O plano está dividido em seis itens: expandir a estratégia mundial DOTS com
qualidades; visar a co-infecção TB/HIV, tuberculose multidroga-resistente (TB MDR) e
as necessidades de populações pobres e vulneráveis; fortalecer o sistema de saúde
baseado na atenção primária; esclarecer as pessoas com a tuberculose e a sociedade civil
organizada; envolver todos os prestadores de serviços de saúde; e possibilitar e
promover pesquisas (WHO, 2012).
4
1.2 Epidemiologia
Segundo a OMS, a tuberculose é atualmente a segunda principal causa de morte
por doença infecciosa, ficando atrás somente da SIDA (WHO, 2013). De acordo com o
último relatório anual da tuberculose emitido pela OMS, o número de óbitos resultante
da infecção pelo Mycobacterium tuberculosis foi de 1,3 milhões, incluindo neste total
300 mil mortes de pacientes HIV positivo. A doença apresenta uma incidência média
mundial de 122 casos por 100.000 habitantes, com o registro de 8,6 milhões de casos
novos no ano 2012 (WHO, 2013). Isto demostra que a tuberculose ainda é um problema
de saúde pública que demanda atenção especial.
O Brasil também apresenta dados preocupantes, com uma incidência de 46 casos
por 100.000 habitantes sendo que, em 2012, foram notificados 71.230 casos novos e
4.900 óbitos, incluindo-o entre os 22 países responsáveis por 81% dos casos notificados
em todo mundo (WHO, 2013). Outro fator preocupante é o aumento nos números de
casos novos de TB MDR no Brasil, passando de 560 em 2011 para 850 em 2012
(WHO, 2012; 2013). No estado de Goiás, a incidência da tuberculose em 2011, foi de
13,6 por 100.000 habitantes, registrando 826 casos de tuberculose no estado (MS/SVS,
2012).
Figura 1. O mapa representa uma estimativa do número casos novos de tuberculoses no mundo no
ano de 2012. Adaptado de WHO, 2013.
5
1.3 Etiologia
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose é uma
bactéria aeróbica, intracelular facultativa que possui a forma de bastonetes retos e finos,
que pode sobreviver na ausência quase total de água durante semanas. Resistente ao
processo de descoloração pelo álcool-ácido, o bacilo é classificado como um bacilo
álcool-ácido resistente (BAAR) (ADEREM et al., 1999). Mtb apresenta crescimento
lento, se duplicando a cada 12-20h, em temperatura ideal de 34-38°C. Para o seu
crescimento in vitro é necessário realizar a cultura do bacilo em meio Löwestein-Jensen
ou em meio ágar como o 7H10/7H11 Middlebrook, e somente após 2-6 semanas de
cultivo, nas condições apropriadas, é possível visualizar as suas colônias, as quais são
secas e de superfície irregular, sendo inicialmente branco-cremosas tornando-se
posteriormente amareladas (CRUMP et al., 2003; ADLER et al., 2005; KONEMAN,
2008).
Mtb pertence a um complexo chamado Complexo Mycobacterium tuberculosis
que é constituído por outras seis espécies e subespécies que incluem M. africanum, M.
bovis, M. canetti, M. microti, M. pinnipedii e M. caprae sendo que, somente as duas
primeiras espécies citadas, juntamente com Mtb, causam tuberculose em humanos
(ROBERTS, 1991). Os constituintes desse complexo possuem características comuns,
como o período de crescimento lento e pouca variação genética, levando a hipótese de
que são patógenos que derivam de um ancestral comum (ERNST et al., 2007).
A parede celular do Mtb é complexa, pois é rica em glicolipídeos,
polissacarídeos, lipídeos e proteínas que estão envolvidas na ativação e na regulação da
resposta imune do hospedeiro (COLLINS et al., 2001). Esta é composta por uma
camada interna de peptidoglicano, sutilmente diferente das presentes nas demais
micobactérias.
Ligados
covalentemente
ao
peptidoglicano,
estão
ramos
de
polissacarídeos, os arabinogalactanos, cuja porção final é esterificada com ácidos graxos
de alto peso molecular, os chamados ácidos micólicos. Além disso, há uma variedade de
lipídeos livres ligados à parte externa da parede celular e uma grande quantidade de
glicolipídeos ancorados na membrana plasmática. Intercaladas à rede existe uma
quantidade significativa de proteínas que podem ser permanentes ou se encontram em
processo de secreção (BRENNAN et al., 1995; DAFFE et al., 1998). A parede celular
dá a forma característica do bacilo conferindo proteção, principalmente da ação
6
mecânica de enzimas hidrolíticas e radicais tóxicos produzidos pelas células fagocíticas
(BRENNAN, 2003).
A infecção por Mtb ocorre preferencialmente pela via respiratória, quando um
indivíduo com doença ativa, portador de lesão pulmonar, pode, ao tossir ou ao falar,
eliminar uma carga bacilar, diluída num aerossol no ambiente. As partículas contendo
os bacilos (gotículas de Flügge), ao serem expostas ao vento e aos raios solares, são
ressecadas e passam a ter volume ainda menor (núcleos de Wells), com diâmetros de até
5 µm e com 1 a 2 bacilos em suspensão, passíveis de serem inalados e atingirem o
pulmão das pessoas daquele ambiente. Vários fatores ambientais reduzem as
probabilidades das partículas infectantes serem inaladas: as correntes de ar dispersando
as partículas no ambiente, a luz ultravioleta (sol) e a radiação gama destruindo os
bacilos. Mas se a inalação acontecer, esses indivíduos podem ser infectados podendo
desenvolver doença ativa (CAMPOS, 2006).
O estabelecimento da doença ativa depende de fatores associados ao bacilo,
como a virulência da cepa infectante, a quantidade de bacilos viáveis que atingem o
pulmão e a fatores do hospedeiro, como a capacidade de resposta imune e a sua
predisposição genética (COLLINS et al., 2001).
1.4 Imunopatologia
Ao chegar no interior do pulmão, os bacilos são fagocitados rapidamente pelas
células fagocíticas, particularmente macrófagos alveolares, células dendríticas (DCs)
locais, macrófagos intersticiais e, eventualmente, quando passarem para os bronquíolos
pulmonares, poderão ser fagocitados por células epiteliais (OTTENHOFF, 2012a). Ao
fagocitar Mtb, o macrófago gera uma vesícula endocítica que se funde com lisossomas
repletos de substâncias lesivas formando o fagolisossoma, visando a destruição do
bacilo. Dentro do fagolisossomo, o ambiente é hostil para Mtb, que sofre a ação do pH
ácido, de reativos intermediários de oxigênio (RIOs) e nitrogênio (RINs), de enzimas
serina esterases e de peptídeos tóxicos (KAUFMANN, 2001; 2002; ROHDE et al.,
2007). Aparentemente, os RINs são a arma mais potente do macrófago contra as
micobactérias virulentas (CHAN et al., 1992; CHAN et al., 1995; MACMICKING et
al., 1997).
No entanto o glicolipídeo Lipoarabinomanana (LAM), principal componente da
parede celular do bacilo, pode impedir a formação do fagolisossoma, inibindo a
fosforilização do fosfatidilinositol 3-fostato (PI3P) etapa importante na maturação do
7
fagossoma, que irá se fundir com o lisossoma. Com isso Mtb permanece dentro do
endossoma primário, o qual é um ambiente favorável para o seu crescimento
(DERETIC et al., 2006; SHALER et al., 2012).
Além de inibir a maturação do fagolisossomo, Mtb apresenta outras habilidades
que retardam o início da resposta imune adaptativa por até 2-3 semanas, tanto em
humanos como em camundongos (OTTENHOFF et al., 2012). Estudos nos quais foram
usados camundongos transgênicos que apresentavam na superfície das células T
receptores específicos para antígenos do Mtb, demostraram que a ativação da resposta
específica de células T contra bacilo, ocorria somente nos linfonodos drenantes do
pulmão. Adicionalmente, foi evidenciado que o transporte das células infectadas com
Mtb do parênquima pulmonar para os linfonodos era significativamente demorado,
ocorrendo somente após 1 a 2 semanas após a infecção (ULRICHS et al., 2006;
GALLEGOS et al., 2008; REILEY et al., 2008; WOLF et al., 2008) (figura 1). Estas
estratégias adaptativas do Mtb permitem o estabelecimento da infecção e o aumento da
população bacilar no local (OTTENHOFF et al., 2012; REECE et al., 2012).
Em adição às habilidades de inibir a maturação e fusão do fagossoma com o
lisossomo e retardar o início da resposta imune específica, Mtb é capaz também de
manipular e persistir no interior de células hospedeiras, particularmente em células
fagocíticas profissionais, utilizando outros mecanismos de evasão do sistema imune.
Entre outros mecanismos o bacilo possui a capacidade de inibir a autofagia; inibir a
apoptose celular e induzir a morte celular por necrose; inibir o processamento e a
apresentação de antígenos às células T impedindo seu reconhecimento; inibir a via de
sinalização mediada pelo receptor de interferon-gama (IFN-γ) que é uma das vias mais
importantes na defesa contra esse microrganismo, que regula vários mecanismos imunes
do hospedeiro; inibir a formação de reativos de oxigênio e nitrogênio que tem ação
microbicida e evasão do ambiente hostil do fagossoma para dentro do citoplasma, um
ambiente mais favorável (GUTIERREZ et al., 2004; DERETIC, 2006; ROHDE et al.,
2007; SAHIRATMADJA et al., 2007; VAN DER WEL et al., 2007). O conjunto de
estratégias de evasão do sistema imune do Mtb, possibilita a sua resistência e escape da
defesa do hospedeiro estabelecendo a infecção (OTTENHOFF, 2012a).
8
Figura 2. Ativação da resposta antígeno-específica de células T contra Mtb. Figura adaptada de
(COOPER, 2009). Ao entrar em contato com Mtb, células dendríticas migram para o linfonodo drenante
com objetivo de apresentar os antígenos do bacilo as células T virgens. Estas serão ativadas tornando-se
células T efetoras específicas contra o patógeno, no entanto este processo é retardado por mecanismos de
evasão do bacilo. Com isso, a geração de uma resposta imune celular específica contra o Mtb, demora de
18-20 dias após a infecção.
Após o estabelecimento da infecção, há um acúmulo de células no local da
infecção tais como neutrófilos, monócitos inflamatórios, macrófagos e células
dendríticas durante a fase inicial da resposta inata (ERNST, 2012). O resultado do
recrutamento de macrófagos e outras células e sua agregação e organização, representa
o passo inicial para a formação do granuloma (PHILIPS et al., 2012). Durante os
estágios iniciais da formação deste, uma fração dos macrófagos infectados afastam-se
do granuloma nascente. A morte destes, leva a liberação dos bacilos no espaço
extracelular, disseminando a infecção em outros locais do tecido pulmonar (DAVIS et
al., 2009).
Com o início efetivo da resposta imune adaptativa, células T específicas para
antígenos do Mtb infiltram também para dentro do granuloma, levando à formação e
reorganização deste, em que os bacilos juntamente com os macrófagos ficam
preferencialmente no centro e células T na periferia. Em contraste do que se acredita, os
granulomas são estruturas dinâmicas que podem aumentar rapidamente o influxo e
efluxo de células hospedeiras, como demonstrado em modelos peixe-zebra no qual foi
estudado este fenômeno (DAVIS et al., 2002; RAMAKRISHNAN, 2012). Egen et al.
(2008), demonstrou também o dinamismo do granuloma quando infectou camundongos
9
com BCG por via endovenosa, observando no fígado destes uma migração inicial de
células de Kupffer (macrófagos residentes do fígado) e macrófagos derivados de
monócitos após 2-3 semanas de infecção. Porém, ele observou que estas células
mieloides estavam relativamente estáticas, embora suas membranas pareciam estar em
constante fluxo.
Quando o controle da infecção e inflamação não é devidamente balanceado,
desenvolve-se assim necrose caseosa central no granuloma, o que facilita o crescimento
extracelular de um grande número de bacilos no local da infecção (DORHOI et al.,
2011). Logo que o granuloma necrosante começa a se liquefazer e produzir danos no
tecido pulmonar, um grande número de bacilos é liberado tornando-se passível de ser
transmitido por aerossol (OTTENHOFF, 2012a). Durante os primeiros cinco anos de
infecção o risco de transmissão é alto, diminuindo substancialmente depois deste
período (LAWN et al., 2011). Inicialmente, a probabilidade de desenvolvimento da
tuberculose, após a inalação do aerossol contendo o bacilo, é pequena, com uma
estimativa de risco de 5 a 10% de desenvolvimento da doença ativa (LAWN et al.,
2011).
O desenvolvimento de uma resposta imune contra Mtb é importante para o
controle da infecção, embora não esteja totalmente esclarecida, esta resposta envolve
diferente tipos celulares, variando da clássica resposta de células T à ação de
neutrófilos, células B, “natural killer” (NK), dentre outras (OTTENHOFF, 2012a).
A resposta imune mediada por células T tem um papel muito importante no
controle da infecção de Mtb. Os linfócitos T CD4, são células que reconhecem
peptídeos
processados
e
apresentados
por
via
Complexo
Principal
de
Histocompatibilidade de classe II (MHC II), de células apresentadoras, como as DC.
Inicialmente, ao migrar do pulmão infectado para o linfonodo, as DCs entram em
contato com células T virgens, as quais são ativadas primariamente, com apresentação
de peptídeos do Mtb via MHC II. Contudo, a total ativação e diferenciação destas
células é dependente de outros sinais, como o realizado por moléculas co-estimuladoras,
como CD80, CD86, CD40, CD27, e 4-1BB/CD137, e também pelo sinal executado pela
principal citocina produzida na infecção por Mtb, a Interleucina 12 (IL-12), ocorrendo
então a ativação e diferenciação do linfócito T CD4+ em linfócito T-helper tipo 1 (Th1
CD4+) (OTTENHOFF et al., 2012).
Os linfócitos T helper tipo 1 (Th1) produtores de IFN-γ, principal citocina
envolvida na ativação de macrófagos (BOEHM et al., 1997), são cruciais na proteção
10
contra a tuberculose. Isto é evidenciado com o aumento do risco de desenvolver a
doença ativa, em indivíduos com deficiência nas vias de sinalizações de IFN-γ e
Interleucina-12 (OTTENHOFF et al., 2005), e também a partir da associação entre a
depleção de células T CD4+ e elevada susceptibilidade à tuberculose em indivíduos
HIV positivos (LAWN et al., 2009). Camundongos CD4-/- e MHCII-/- são incapazes de
controlar o crescimento bacteriano e sucumbem à infecção significativamente mais cedo
do que camundongos selvagens homólogos (CARUSO et al., 1999). Apesar da
importância que as células T CD4 tem no controle da infecção do Mtb ser bastante
evidente, os mecanismos pelos quais elas mediam esta proteção ainda não estão bem
definidos (COOPER, 2009; COOPER et al., 2012).
As células Th1 CD4+ secretam também outras citocinas que são importantes na
imunidade protetora contra a infecção de micobactérias (KAUFMANN, 2011), tais
como o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) principal mediador da resposta
inflamatória aguda em infecções causadas por microrganismos intracelulares e
Interleucina-2 (IL-2) que induz a expansão de células T amplificando a resposta efetora
destas (WILLIAMS et al., 2006; SEDER et al., 2008).
Já está bem caracterizada a existência de vários subtipos de células T CD4+
efetoras, variando incialmente de células produtoras de IL-2, para células que secretam
IFN-γ, e até células multifuncionais capazes de produzir ao mesmo tempo IL-2, IFN-γ e
TNF-α, as quais são correlacionadas também com a proteção (DARRAH et al., 2007).
Juntamente com ativação das células Th1 CD4+, pode ocorrer também a
proeminente ativação de outro subtipo de linfócito Th, os Th17. Recentemente,
observou-se que este subtipo de células T produz IL-17A, IL-17F e TNF,
preferencialmente, mas também a IL-22 e em alguns casos IFN-γ. Os linfócitos Th17
são células pro-inflamatórias que estão envolvidas na resposta imune contra bactérias e
fungos extracelulares, particularmente na superfície das mucosas (OTTENHOFF,
2012a). Estudos indicam que as células Th17 são importantes na fase inicial da
infecção, surgindo no início da imunidade adaptativa, contribuindo na defesa do
hospedeiro ativando principalmente neutrófilos contra Mtb (KHADER et al., 2007;
COOPER, 2009).
Diferente das células Th1 e Th17, que apresentam um papel importante no
controle da infecção pelo Mtb, as células T helper CD4+ tipo 2 (Th2) produtoras de
Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-5 (IL-5) e Interleucina-13 (IL-13), não estão
correlacionadas com a proteção contra tuberculose, apesar delas estarem envolvidas na
11
regulação da imunidade humoral. A IL-4 por exemplo, secretada por células Th2,
desregula a defesa do hospedeiro na hanseníase e na TB, similar a coinfecções com
helminto em camundongos (SALGAME et al., 1991). Assim, o aumento desta
interleucina em indivíduos, está associado com o aumento de lesões no pulmão
(ORDWAY et al., 2004). Pessoas de países em desenvolvimento que estão mais
expostas ao Mtb, podem apresentar um aumento significativo de IL-4 o que
compromete a ação efetora de células Th1, dificultando o controle da infecção e
consequentemente favorecendo a transmissão de TB (TAN et al., 2012).
Embora o papel dos linfócitos T CD8+ na TB não esteja tão claro como os dos
linfócitos T CD4+, eles são geralmente reconhecidos por contribuírem na geração de
uma imunidade ideal e protetora capaz de conter a infecção por Mtb (OTTENHOFF,
2012b). Em camundongos, as células T CD8+ contribuem na proteção contra a rápida
progressão da infecção por Mtb; camundongos deficientes em células T CD8+
infectados com M. tuberculosis sucumbem mais cedo que camundongos selvagens,
contudo mais tardiamente que camundongos deficientes em células T CD4+ (MOGUES
et al., 2001).
As células T CD8+ são capazes de reconhecer antígenos em células não
fagocíticas através do MHC de classe I, como as células epiteliais que podem ser
infectadas pelo Mtb (HERNANDEZ-PANDO et al., 2000). Todas as células nucleadas
expressam moléculas de MHC de classe I, isto implica que as células T CD8+ podem
reconhecer uma grande variedade de células que possam estar infectadas por Mtb. Estas
apresentam mecanismos efetores únicos, como secreção de grânulos com moléculas
citotóxicas, tais como perforinas e granzimas, que podem matar as células infectadas e o
Mtb, dessa forma, as células T CD8 são importantes no desenvolvimento de uma
resposta imune protetora contra a tuberculose (OTTENHOFF, 2012a).
Os linfócitos B são capazes de reconhecer macromoléculas (incluindo proteínas,
polissacarídeos, lipídeos e ácidos nucleicos), bem como pequenos grupamentos
químicos e partes de macromoléculas. Estes, ao contrário dos linfócitos T, reconhecem
os antígenos em sua conformação natural, sem a necessidade de um processamento
prévio. Este reconhecimento se dá nos folículos linfóides do baço, linfonodos e tecidos
linfóides associados às mucosas (ABBAS, 2006).
A perfeita ativação das células B depende da cooperação das células T CD4+.
As células T CD4+ atuam na ativação das células B através da produção de IL-4 e IL-5,
bem como pela interação entre CD40 e CD40-ligante. Os linfócitos B ativados se
12
diferenciam em células produtoras de anticorpos. Estes podem estimular a proliferação,
a sobrevivência e diferenciação de células T (ABEBE et al., 2009).
Apesar da produção de anticorpos não ser considerada importante na proteção
contra o M. tuberculosis, a opsonização, um dos mecanismos efetores destes, tem se
mostrado importante durante a infecção por Mtb. Alguns estudos têm observado um
aumento na internalização e morte da micobactéria por neutrófilos e macrófagos na
presença de anticorpos específicos (BROWN et al., 2003; DE VALLIERE et al., 2005).
Outros demonstraram inclusive que, quando a micobactéria está revestida por
anticorpos específicos, o processamento e apresentação por DCs é mais efetivo,
induzindo uma resposta tanto de células T CD4+ como de CD8+ (TEITELBAUM et al.,
1998; PETHE et al., 2001; CHAMBERS et al., 2004).
1.5 Manifestação clínica e diagnóstico
A maioria dos indivíduos infectados (90%) desenvolve a forma latente e
assintomática da doença. Uma pequena porcentagem desses, (cerca de 10%) pode
apresentar reativação da infecção, geralmente como consequência de uma infecção
secundária, imunossupressão, tabagismo, desnutrição, consumo alcoólico, condições
sanitárias precárias ou elevado grau de exposição, podendo desenvolver a TB ativa que,
quando não tratada, mata em torno de 50% dos indivíduos doentes (PHILIPS et al.,
2012).
A principal manifestação clínica da doença é a forma pulmonar, cujos principais
sintomas são: tosse produtiva com mais de 15 dias, febre vespertina baixa, suor noturno,
dor no tórax e perda de peso. A suspeita clínica da TB começa com quadro clínico
constituído por febre baixa, geralmente vespertina, cansaço excessivo, sudorese noturna,
anorexia, perda de peso e indisposição. As outras manifestações clínicas da doença são
várias dependendo principalmente do órgão acometido pelo agente, incluindo a pleural,
ganglionar, óssea, meníngea, entre outras (CAMPOS, 2006).
Por ser uma doença infecciosa, faz-se necessário a confirmação diagnóstica por
meio da identificação do Mtb em amostras da lesão. A realização da baciloscopia
associada aos sintomas clínicos são as principais metodologias usadas para o
diagnóstico da doença. No entanto, a baciloscopia que é baseada na pesquisa de bacilos
álcool ácido resistentes (técnica de coloração de Ziehl Neelsen), apresenta baixa
sensibilidade (34% a 60%), sendo necessário de 5.000 a 10.000 bacilos por mL para sua
13
identificação, o que inviabiliza o diagnóstico de indivíduos que apresentam baixa carga
bacilar (L.J. et al., 2009).
A prova laboratorial confirmatória da infecção é a cultura em meio de
Löwenstein-Jensen (LJ), que em casos pulmonares com baciloscopia negativa, a cultura
do escarro pode aumentar em até 30% o diagnóstico da doença. Assim, a cultura em
meio LJ é considerada como “padrão ouro” para o diagnóstico de tuberculose, porém
além de demorar pelo menos 3 semanas para ter um crescimento positivo, de acordo
com o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT), ela só deve ser
solicitada quando há falha no tratamento (MS/SVS, 2010).
Além dos métodos clássicos de diagnóstico da tuberculose novas técnicas foram
desenvolvidos utilizando biomarcadores genéticos e imunológicos, tais como Xpert
MTB/RIF e o IGRA (do inglês Interferon-gamma relase assay). O teste Xpert®
MTB/RIF é um teste de amplificação de ácidos nucléicos utilizado para detecção de M.
tuberculosis e para a triagem de cepas resistentes a fármacos. O teste consiste na
purificação, concentração e amplificação de ácidos nucléicos por reação em cadeia da
polimerase em tempo real e na identificação de seqüências de ácidos nucléicos no
genoma Mtb, especificamente do gene rpoβ. A diferença deste para os demais testes de
amplificação de ácidos nucléicos utilizados na detecção de TB é que a plataforma do
dispositivo de teste, o GeneXpert, integra e automatiza os três processos (preparação de
amostras, amplificação e detecção), necessários para a PCR em tempo real baseada em
testes moleculares. O teste Xpert® MTB/RIF é atualmente único, pois utiliza um
cartucho contendo todos os elementos necessários para a reação, incluindo reagentes
liofilizados, tampões líquidos e soluções de lavagem. O teste pode fornecer resultados
num laboratório local, em menos de 2 horas, sem necessitar de tratamento da amostra ou
de recursos humanos especializados em biologia molecular. Esse método detecta
simultaneamente Mtb e a resistência à rifampicina pela amplificação, por meio de PCR,
de cinco sondas sobrepostas que são complementares à região determinante da
resistência à rifampicina, composta por 81 pares de bases do gene rpoβ de M.
tuberculosis. Em seguida, esta região é examinada com o objetivo de identificar
mutações associadas à resistência à rifampicina. O processo de amplificação por PCR,
neste teste, é heminested e o alvo amplificado é detectado em tempo real por
fluorescência. Neste processo, dois conjuntos de primers são utilizados em duas reações
sucessivas. Na primeira PCR, um par de primers é usado para gerar produtos de DNA,
que podem conter produtos amplificados a partir de áreas não-alvo. Os produtos da
14
primeira PCR são, então, usados como modelo em uma segunda PCR, usando um
primer diferente, cujo sítio de ligação esteja localizado dentro do primeiro produto
amplificado, consequentemente, aumentando a especificidade da reação (VAN RIE et
al., 2010; NICOL et al., 2011; TOOSKY et al., 2014).
Já os testes baseados no IGRA quantificam a produção de IFN-γ por células T
sensibilizadas com antígenos do Mtb. Dois tipos de IGRA estão disponíveis
comercialmente: o QuantiFERON TB Gold, (Cellestis Ltd, Carnegie, Australia) e o TSPOT.TB (Oxford Immunotech, Abingdon,UK). Ambos utilizam os antígenos ESAT-6
e CFP-10 como estímulo para as células produzirem IFN-γ, mas as técnicas em que se
baseiam são diferentes, o ELISA e ELISpot, respectivamente. Uma nova versão do
QuantiFERON TB foi desenvolvida, e uma das melhorias técnicas foi a adição do
antígeno TB 7.7, também codificado pela região RD1 ausente no M. bovis BCG,
passando a se chamar então QuantiFERON-TB Gold IT, também disponível
comercialmente (PAI et al., 2004; SONG et al., 2013).
1.6 Medidas de controle: diagnóstico, tratamento e prevenção
A dificuldade de se controlar a tuberculose no Brasil, e em muitos países do
mundo, acontece por diversos fatores, que incluem o diagnóstico, tratamento e
prevenção. Como já exposto acima, a baixa sensibilidade dos métodos de diagnóstico
não permite a detecção de todos os casos esperados de TB e, consequentemente, permite
que indivíduos doentes não diagnosticados disseminem o bacilo.
A terapia para a tuberculose envolve o emprego de uma combinação de drogas
específicas, por um período longo para evitar o desenvolvimento de cepas resistente aos
fármacos empregados. Recentemente, foi adotado no Brasil, o esquema de tratamento
único para casos novos e recidivas, que envolve o uso de quatro fármacos: Rifampicina
(R), Isoniazida (H), Pirazinamida (Z) e Etambutol (E). Este esquema é dividido em duas
fases: a intensiva que consiste em dois meses de medicação com doses fixas RHZE; e a
de manutenção que é composta por RH por quatro meses (tabela 1.). Com um período
de seis meses de duração, o tratamento de curta duração, quando empregado
corretamente, leva à cura do indivíduo (MS/SVS, 2010).
Apesar de bastante eficiente, este esquema apresenta por sua vez problemas
como reações adversas aos fármacos e alívio dos sintomas da doença após a terceira
semana de tratamento, o que leva os pacientes que não foram orientados corretamente, a
abandonar o tratamento, permitindo que a doença reative com o agravante de os bacilos
15
infectantes daquele paciente terem grandes chances de desenvolver resistência a um ou
mais fármacos (CAMPOS, 2007).
Tabela 1. Esquema básico de tratamento da tuberculose para adultos e adolescentes.
Tabela adaptada do Informe Técnico de Tuberculose publicado em julho de 2010 pela Secretária de
Vigilância em Saúde/MS. R – Rifampicina; H – Isoniazida; Z – Pirazinamida; E – Etambutol.
A prevenção da tuberculose consiste em evitar o contato de indivíduos saudáveis
com pacientes com TB ativa, pois a transmissão do bacilo ocorre na maioria das vezes
pela via aérea. Calcula-se que em uma determinada comunidade, durante um ano, uma
única fonte de infecção poderá infectar, em média, de 10 a 15 pessoas que com ela
tenham tido contato (CAMPOS, 2006).
Hoje, a principal arma disponível para prevenção da TB é a vacina BCG, que foi
desenvolvida em 1921 por Calmette e Guérin. Esta é empregada mundialmente no
controle da tuberculose, sendo administradas anualmente 120 milhões de doses da
vacina. Cada dose contém de 200 mil a um milhão de bacilos (BCG) por dose vacinal
(0,1 mL), a qual é administrada por via intradérmica, no braço direito de recém-nascidos
que tenham peso igual ou superior a 2 kg. Estima-se atualmente que mais de 4 bilhões
de pessoas foram imunizadas com a mesma, atingindo em alguns países uma
abrangência de 90% da população. Com um perfil de segurança surpreendente, a vacina
BCG é eficaz na proteção contra as formas severas da tuberculose em crianças,
conferindo uma proteção de 52% a 100% na prevenção da meningite tuberculosa e de 2
a 80% na prevenção da tuberculose pulmonar (TIDJANI et al., 1986; ROMANUS,
1987; MS/SVS/PNCT, 2010; DALMIA et al., 2012; LUCA et al., 2013).
No entanto, diversos estudos de caso controle têm relatado uma eficácia variável
da vacina BCG na proteção contra tuberculose pulmonar, principalmente em indivíduos
adultos. Nestes estudos observou-se que a eficácia da vacina variava de 0 a 80% (FINE,
1995; KAUFMANN et al., 2010). Vários estudos foram realizados nas últimas décadas
com objetivo de entender os fatores que justificam esta variabilidade na eficácia
16
protetora da vacina BCG. Nestes estudos foram levantadas hipóteses descritas em uma
revisão, resumidas na tabela 2 (FINE, 1989; 2001; KAUFMANN, 2005; KAUFMANN
et al., 2010). Com esta variável eficácia protetora da BCG, tem-se observado em dados
epidemiológicos recentes que a tuberculose continua incidente mesmo em países em
que a abrangência vacinal da BCG é de até 90% da população, como é caso do Brasil.
Tabela 2. Possíveis explicações que possam justificar a variabilidade na eficácia protetora da
BCG contra a tuberculose pulmonar em adultos.
Possíveis explicações
Evidências
Exposição
Diversos dados epidemiológicos de animais indicaram que tal exposição
a
micobactérias
ambientais
pode tanto mascarar como até inibir a proteção induzida por BCG, seja
por induzir um nível de proteção até o qual a vacina pode melhorar
pouco ou até muito, ou talvez por induzir uma resposta imune contra a
própria vacina.
Variabilidade
das
cepas
vacinais
Estudos demonstraram que o cultivo in vitro das cepas vacinais nos
grandes centros produtores de vacina ao longo de décadas, levaram ao
desenvolvimento de uma grande variabilidade genética das cepas BCG
empregada hoje nos diferentes países, com propriedades antigênicas e
imunogênicas variadas e distintas da cepa original, desenvolvida por
Calmete e Guérin.
Variabilidade
genética
das
populações
Há evidências para influências genéticas no hospedeiro susceptível, mas
não há dados suficientes no controle genético da resposta à BCG em
humanos.
Ausência
de
antígenos
Alguns antígenos foram perdidos durante o processo de atenuação da
perdidos
cepa M. bovis que originou M. bovis BCG.
Resposta imune afetada pela
Em diversas teorias, helmintos induzem resposta Th2, mas nenhuma
infecção por helmintos
evidência relacionando proteção por BCG contra tuberculose.
Adaptado de Lambert et al. 2010
O controle da TB deve ser melhorado em diferentes frentes, tanto na melhoria
das técnicas de diagnóstico, nos programas de implementação dessas técnicas, melhoria
no atendimento aos doentes e seus contatos, quanto na melhoria da vacina para proteger
os indivíduos susceptíveis de todas as formas da doença durante toda a sua vida
(LAWN et al., 2011). Em relação à vacina, ainda há necessidade do desenvolvimento de
novas vacinas com maior capacidade de induzir uma imunidade protetora contra TB, em
adultos e jovens, e com maior segurança com relação à BCG (HESSELING et al., 2007;
OTTENHOFF et al., 2012; WHO, 2012).
17
1.7 Desenvolvimento de novas vacinas
Diversas são as estratégias de desenvolvimento de novas ou melhores formas de
induzir uma imunidade protetora contra a TB. Basicamente, estas se resumem em dois
tipos de abordagens: a primeira é conhecida como vacina primária e reforço, do inglês
“prime-boost” na qual a BCG é administrada em neonatos, prevenindo a TB juvenil. E
quando estes indivíduos atingem uma determinada faixa etária, eles recebem uma dose
“booster” de uma nova vacina, objetivando recuperar a resposta imunológica protetora
conferida inicialmente pela vacina BCG (WHO, 2012). Baseada nesta estratégia,
múltiplos trabalhos desenvolveram antígenos para serem avaliados como “booster”, os
quais têm apresentado bons resultados como o Mtb72F, que é uma proteína de fusão
recombinante baseada na fusão de duas serino proteases do Mtb, denominadas Mtb32A
e Mtb39A, codificadas pelas regiões gênicas Rv0125 e Rv1196, respectivamente
(SKEIKY et al., 1999).
Formulações vacinais da Mtb72F com os adjuvantes AS01 e AS02, mostraramse ser protetoras em modelos animais como camundongos, cobaias e coelhos desafiados
com Mtb (BRANDT et al., 2004; SKEIKY et al., 2004; TSENOVA et al., 2006).
Também observou-se que a vacinação de macacos com a Mtb72F/AS02 em esquema de
“prime-boost”, induzia uma maior sobrevivência e proteção após o desafio com Mtb,
em comparação aos controles (REED et al., 2009). Posteriormente, em estudos clínicos
de fase I/II, a Mtb72F/AS02 apresentou um perfil de segurança e imunogenicidade
promissor em indivíduos não infectados com Mtb e não vacinados com BCG. Nestes
estudos, observou-se que a vacinação com Mtb72F induzia uma alta resposta de células
T CD4+ polifuncionais (co-expressando CD40L, IL-2, TNF-α e IFN-γ), e de anticorpos
contra o Mtb72F (VON ESCHEN et al., 2009; LEROUX-ROELS et al., 2010).
A segunda estratégia é o desenvolvimento de vacinas que possam substituir a
BCG – como atenuação de M. tuberculosis ou uma nova BCG, através da adição e/ou
hiper-expressão de antígenos de Mtb imunodominantes (FINE, 2001). Esta tem
produzido também bons resultados, como a vacina VPM1002 que é uma cepa de BCG
Prague recombinante que expressa listeriolisina da Listeria monocytogenes e não
expressa a urease C, gene deletado, com finalidade de aumentar apresentação cruzada
de BCG para células T CD8 via MHC de classe I. Estudos vacinais demostraram que a
imunização de camundongos BALB/c com a VPM1002 induziu um perfil de resposta
imune do tipo Th1 e Th17 balanceada, a qual foi protetora, reduzindo de forma mais
18
eficiente a carga bacteriana no pulmão, em comparação ao grupo vacinado com a BCG
(DESEL et al., 2011). Com esses e outros resultados, a vacina VPM1002 evoluiu para
ensaios clínicos de fase IIa em crianças na África do Sul (MEYER et al., 2013).
1.8 Antígenos imunodominantes de Mycobacterium tuberculosis abordados neste
trabalho
O grupo de pesquisa liderados pela Prof. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis e Dr.
André Kipnis, vem desenvolvendo, há alguns anos, projetos que visam avaliar a
resposta imune de indivíduos com tuberculose ativa e/ou latente, frente a diferentes
antígenos de Mtb, que nos permite identificar candidatos (proteínas e/ou epítopos
proteicos) que possuirão melhores chances de adicionar propriedades imunogênicas
desejadas a vacina BCG.
Em condições de estresse, o Mtb produz e secreta uma série de proteínas que
estão relacionadas com seu metabolismo e sobrevivência. Uma vez sintetizadas e
secretadas tornam-se alvo da resposta imune do hospedeiro, tanto celular quanto
humoral (BOESEN et al., 1995; AREND et al., 2000). Algumas dessas proteínas já
foram isoladas e caracterizadas (NAGAI et al., 1991). A caracterização imunológica
dessas proteínas revelou que algumas delas são potencialmente imunogênicas in vivo,
em modelos humano e animal (DE ARAUJO-FILHO et al., 2008; CAVALCANTI et
al., 2009). Dentre as caracterizadas, as proteínas MPT-51, ESAT-6, GLcB, Groes,
Complexo Ag 85, HspX, CFP-10, dentre outras estão sendo largamente estudadas no
contexto da TB.
O Ag 85C (Rv0129c) faz parte de um complexo antigênico composto por dois
outros antígenos, Ag 85A (Rv3804c) e Ag 85B (Rv1886c), sendo codificados pelos
genes fbpC, fbpA e fbpB, respectivamente, apresentando peso molecular que varia entre
30 a 32-KDa (OHARA et al., 1997). Esta proteína possui atividade micolil transferase,
participando da síntese do ácido micólico que faz parte da constituição da parede celular
dos bacilos, contribuindo para manutenção de sua integridade e patogênese da
tuberculose (HARTH et al., 1996). Devido à sua característica imunodominante, e ser
secretado pelo Mtb no início da infecção em adultos, o Ag 85C vem sendo avaliado
como forte candidato a marcador de diagnóstico da tuberculose (SAMANICH et al.,
1998; SAMANICH et al., 2000; KASHYAP et al., 2010). A importância e relevância
destas proteínas se devem, provavelmente, ao seu papel na síntese da parede celular da
micobactéria. De modo igual, demonstrou-se que quando os monócitos humanos são
19
infectados por Mtb, estas micobactérias secretam proteínas do complexo Ag 85. Esta
propriedade poderia ser vantajosa para desenvolver uma vacina, visto que a liberação
destas proteínas é de suma importância para o processamento intracelular deste
patógeno via MHC de classe II (RE, 1994). A imunização de camundongos utilizando
plasmídeo para expressão de Ag 85 induziu resposta imune humoral e mediada por
células, conferindo proteção significante, quando desafiados com M. tuberculosis e
BCG (HUYGEN, 1998).
O MPT-51 (Rv3803c) também denominado como Ag 85 D, é uma proteína de
27-KDa codificada pela região gênica fbpC1 pelos genomas do Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium avium e Mycobacterium bovis
BCG (NAGAI et al., 1991; RINKE DE WIT et al., 1993). Apesar de possuir 40% de
homologia ao complexo Ag 85, este não possui atividade micolil transferase (RINKE
DE WIT et al., 1993; WILSON et al., 2004), caracterizando-o como uma nova família
não catalítica de α/β hidrolases que liga-se a fibronectina, cuja função fisiológica, em
analogia com a acetilcolina esterases não-catalíticas, podem ser baseadas em sua
capacidade de se conectar a ligantes extracelulares, tais como fibronectina e
potencialmente carboidratos (KITAURA et al., 2000). Este antígeno tem se mostrado
um bom marcador para diagnóstico de tuberculose principalmente em pacientes coinfectados com HIV (SINGH et al., 2005) cuja a imunodeficiência favorece uma rápida
disseminação do patógeno, tornando a detecção precoce essencial. Além disso, o MTP51 apresenta importância significativa como marcador de diagnóstico da TB como já
mostrado por nosso grupo de pesquisa (ARAUJO-FILHO et al., 2008).
A HspX (Rv2031c), é uma proteína de choque térmico, codificada pela região
gênica Acr, com peso molecular de 16-KDa, também conhecida como proteína αcristalina. Esta tem ação de chaperonina, o qual auxilia na conformação final das
proteínas (QAMRA et al., 2005). O gene Acr, o qual codifica a expressão da proteína
HspX, é altamente regulado quando o bacilo se encontra no interior dos macrófagos, os
quais induzem um ambiente intracelular com hipóxia e presença de doadores de NO,
condições estas que induzem a expressão de transcritos do gene HspX no estágio de
latência em infecções com o Mtb. Em infecções humanas, este antígeno é expresso na
fase latente da tuberculose, desencadeando resposta imune tanto humoral quanto celular
(RABAHI et al., 2007; SPRATT et al., 2010). Geluk et al. (2007) mostraram que a
vacinação com BCG não induz uma resposta de células T contra HspX como
apresentada em pacientes com TB, e ainda determinaram epítopos imunodominantes da
20
proteína HspX. Assim acredita-se que o BCG ou até mesmo outro vetor como M.
smegmatis mc2 155, expressando fragmentos de antígenos relacionados à latência do M.
tuberculosis (BOSHOFF et al., 2005; LEYTEN et al., 2006), como a proteína HspX,
pode ter potencial como vacinas contra a tuberculose latente.
1.9 Proteína CMX
Resultados da literatura, incluindo os do nosso grupo, permitiram formular uma
hipótese de que a construção de uma proteína de fusão recombinante, contendo epítopos
imunodominantes das proteínas Ag 85C, MPT-51 e HspX e a sua expressão em um
vetor, seria capaz de induzir uma resposta imune protetora contra TB. Diante disso
nosso grupo construiu a proteína CMX que contém epítopos dos antígenos Ag 85C,
MPT-51 e a proteína HspX inteira (DE SOUSA et al., 2012), baseando-se nas
publicações que determinaram os epítopos imunodominantes de cada uma destas
proteínas (D'SOUZA et al., 2003; SUZUKI et al., 2004; GELUK et al., 2007). Desta
forma, o gene artificial construído possui em sua extremidade amino terminal a porção
gênica correspondente aos aminoácidos 85 ao 149 da proteína Ag 85C (Ag85C85-149).
Após esta porção gênica, foi inserida uma sequência de cinco aminoácidos de glicina
para separa-la (sequência hinge) do epítopo da proteína MPT-51, correspondente aos
aminoácidos 91 ao 112 da proteína (MPT-5191-112), que também está separada da
proteína madura completa do HspX (sem peptídeo sinal) por uma sequência hinge
constituída de 5 resíduos de glicina (DE SOUSA et al., 2012).
A proteína CMX purificada obtida foi testada com o soro de uma pequena coorte
de pacientes e os resultados demonstraram que dosando os níveis de anticorpos da
classe IgM anti a proteína de fusão foi possível discriminar indivíduos com tuberculose
pulmonar ativa dos controles saudáveis (p<0.001). Estes resultados confirmaram que a
proteína CMX foi reconhecida pela resposta imune humoral de pacientes com TB,
portanto manteve conservado a estrutura terciária dos epítopos das proteínas de Mtb
originais (DE SOUSA et al., 2012).
1.10 Vetor de vacina
Mycobacterium
smegmatis,
um
membro
não
patogênico
do
gênero
Mycobacterium, de crescimento rápido e que pode ser transformado eficientemente com
21
vários genes in vitro, tem apresentado várias características importantes para uma
vacina contra tuberculose (ZHANG et al., 2010).
Ao contrário de outras cepas micobacterianas, tais como a BCG, que sobrevive
em células hospedeiras por meses inibindo a maturação do fagossoma, M. smegmatis é
rapidamente destruído por proteases fagossomais das células infectadas, fato que facilita
o processamento e apresentação pelas células apresentadoras de antígenos (APC). Este
também induz maior produção de citocinas pelos macrófagos do que espécies
patogênicas de micobactérias podendo ativar e induzir a maturação de células
dendríticas, pela regulação positiva do MHC de classe I e moléculas co-estimulatórias
(BELTAN et al., 2000; YADAV et al., 2004). M. smegmatis também pode acessar o
MHC classe I como caminho para a apresentação de antígenos de micobactérias de
forma mais eficiente do que a BCG (CAYABYAB et al., 2006; ZHAO et al., 2012).
A ausência de toxicidade em modelos imunodeprimidos, deficientes de células T
ou NK, é uma das características marcantes deste vetor, observada em estudos
realizados por Young et al. (2004), sugerindo que este vetor é um seguro veículo que
pode ser usado como vacina em indivíduos imunocomprometidos (YOUNG et al.,
2004; YANG et al., 2009). Conhecendo estas características, vários estudos têm sido
realizados utilizando este vetor para expressão de proteínas, como o estudo do Zhang et
al. (2010), no qual a vacinação com o M. smegmatis expressando uma proteína de fusão
ESAT6-CFP10, induziu uma imunidade humoral e celular significativamente melhor
que a vacinação com BCG em camundongos. Outro estudo, realizado por Yi et al.
(2007) observou que a imunização com M. smegmatis pZ607 recombinante
transportando IL-12/GLS em camundongos BALB/c, induziu uma eficiente resposta
imune protetora Th1 incluindo um alto nível de IFN-gama e IL-12 similar a cepa BCG.
Modelos de estudos indicam que o desenvolvimento de uma nova vacina que
apresente pelo menos 60% de eficácia na proteção contra tuberculose em adolescentes e
adultos, pode potencialmente evitar de 30 a 50 milhões de novos casos de tuberculose
no mundo, por um período 25 anos (WHO, 2013). Com isso o desenvolvimento de
novas vacinas contra a tuberculose é de extrema importância, pois esta conquista é um
passo importante para a erradicação da tuberculose no mundo.
22
2
JUSTIFICATIVA
A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada pela infecção com
Mycobacterium tuberculosis, e de acordo com a OMS, é a segunda principal causa de
morte por doença infecciosa, ficando atrás somente da SIDA. No ano 2012 foram
registrados 8,6 milhões de casos novos de tuberculose e mais de 1,3 milhões de mortes
decorrentes da infecção com o bacilo. Esses dados demonstram que mesmo com a
implementação de medidas preventivas, tais como a vacinação com a BCC, a
tuberculose continua sendo um problema de saúde pública mundial. A vacina BCG,
amplamente administrada em crianças no mundo, é a única vacina viável contra a
tuberculose, no entanto apresenta uma eficácia variável na proteção principalmente em
adolescentes e adultos. Com isso, países como o Brasil, que possuem 90% da população
imunizada com a BCG, apresentam números significativos de casos e mortes por ano
decorrentes da infecção com Mtb. Como esta é a única vacina existente para este fim, o
desenvolvimento de novas vacinas ou o melhoramento da BCG é de grande
importância. Modelos de estudos indicam que o desenvolvimento de uma nova vacina
que apresente pelo menos 60% de eficácia na proteção contra tuberculose em
adolescentes e adultos, pode potencialmente evitar de 30 a 50 milhões de casos novos
de tuberculose no mundo, por um período 25 anos. Diante disso, propomos a construção
de uma vacina recombinante M. smegmatis-mc2-CMX expressando a proteína
recombinante de fusão CMX produzida e estudada pelo nosso grupo nos últimos anos.
A proteína CMX é formada através da fusão de epítopos imunodominantes do Mtb
(Ag85C-MPT51-HspX) reconhecidamente capazes de produzir no hospedeiro uma
resposta imune. A análise da expressão da proteína CMX em M. smegmatis mc2 155
fornecerá dados importantes necessários para a construção da vacina BCG recombinante
pretendida, como por exemplo: se o gene da proteína CMX será transcrito pela célula
hospedeira; se o vetor é estável na célula hospedeira; se a proteína CMX está sendo
integralmente expressa; qual a cito-localização da proteína recombinante; entre outros.
Com a mesma importância será a análise da resposta imune induzida em camundongos
isogênicos vacinados com M. smegmatis expressando a proteína CMX, com a
possibilidade de esta ser uma nova vacina contra tuberculose.
23
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Construir e caracterizar uma vacina recombinante contra Mtb utilizando como
vetor vacinal M. smegmatis mc2 155, expressando a proteína recombinante de fusão
CMX composta por três subunidades de antígenos imunodominantes de Mycobacterium
tuberculosis.
3.2 Objetivos específicos
Ø Transformar o M. smegmatis mc2 155 com os vetores de expressão
pLA71-CMX, pLA73-CMX e pMIP12-CMX;
Ø Analisar a transcrição gênica (RNAm) das construções no vetor M.
smegmatis mc2 155 recombinante;
Ø Analisar a expressão e a imunoreatividade das proteínas de fusão CMX
recombinantes no M. smegmatis mc2 155;
Ø Avaliar a estabilidade dos plasmídeos em M. smegmatis mc2 155;
Ø Imunizar camundongos BALB/c e avaliar a resposta imune humoral dos
camundongos vacinados através do ensaio imunoenzimático ELISA;
Ø Avaliar resposta imune de camundongos BALB/c vacinados frente à
infecção por Mycobacterium tuberculosis H37Rv;
Ø Determinar a eficácia protetora da vacina mc2-CMX em camundongos
frente a infecção por Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
24
4
MÉTODOS
4.1 Fluxograma das etapas do desenvolvimento deste estudo.
O presente trabalho foi desenvolvido seguindo o fluxograma abaixo, o qual cita as
etapas realizadas neste estudo.
Figura 3. Fluxograma das etapas realizadas no desenvolvimento e avaliação da vacina mc2-CMX
em camundongos BALB/c.
25
4.2 Construção dos plasmídeos recombinantes.
A
partir
das
sequências
de
DNAs
correspondentes
aos
epítopos
imunodominantes dos Ag85C e MPT-51, e o gene inteiro do HspX, descritos em
estudos
anteriores
realizados
por
Sousa
et
al.
(2012),
foram
desenhados
oligonucleotídeos iniciadores, que permitiram a amplificação das regiões e ao mesmo
tempo a síntese de sítios para enzimas de restrição para posterior clonagem. O produto
desta amplificação foi clonada no vetor pGEM-T easy (Promega) através de um sistema
de ligação. Posteriormente, o vetor de clonagem pGEM-T easy contendo o gene de
fusão (CMX) foi digerido com as enzimas KpnI e NotI para eluição do gene CMX, para
posterior inserção deste nos plasmídeos pLA71 e pLA73 (JUNQUEIRA-KIPNIS et al.,
2013). O produto da eluição foi preparado para clonagem no plasmídeo pMIP12 e para
tanto, as enzimas usadas para digerir o plasmídeo pGEM-T easy/CMX foram BamHI e
KpnI. Os plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 (cedidos gentilmente pela Dra. Brigitte
Gicquel, Instituto Pasteur, França) são plasmídeos que possuem origem de replicação
para E. coli/micobactéria, tendo como marcador de seleção um gene de resistência à
Canamicina obtido do Tn903 (LIM et al., 1995). Após digestão, o gene CMX foi eluído
e inserido nos plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 previamente digeridos com as
mesmas enzimas. Posteriormente, os plasmídeos recombinantes pLA71-CMX, pLA73CMX e pMIP12-CMX, foram sequenciados para verificar a integridade das sequências
clonadas (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013).
4.3 Preparo de M. smegmatis eletrocompetente.
M. smegmatis mc2 155 (gentilmente cedidos pela Dra. Luciana Leite do Instituto
Butantan) foi cultivado em tubos contendo 5 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo
(Himedia®) com tween 80 a 0,05%, até atingir a fase exponencial (aproximadamente 3
dias). Foi usado 1 mL da cultura para inocular em 100 mL de meio Middlebrook 7H9
caldo com tween 80 a 0,05% em um erlenmeyer de 500 mL. Depois de três dias de
crescimento, as culturas foram centrifugadas a 6.000 rpm por 15 minutos a 10˚C e
lavadas com igual volume de solução gelada de glicerol 10%. Por último, as células
eletrocompetentes foram ressuspendidas em 3 mL de glicerol 10% gelado e alíquotas de
100 µL foram congeladas em criotubos a -80˚C.
26
4.4 Eletroporação de M. smegmatis.
Os plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 que correspondem aos plasmídeos
originais sem insertos gênicos, e plasmídeos recombinantes contendo a proteína de
fusão CMX (Ag85C, MPT-51 e HspX), pLA71-CMX, pLA73-CMX e pMIP12-CMX,
foram inseridos em M. smegmatis mc2 155 por eletroporação usando o eletroporador de
pulsação (Bio-Rad®) a 4°C. Cada sistema de transformação consistiu em 3 µL
(contendo 100 a 500 ɳg de DNA plasmidial) do plasmídeo em 100 µL de células
eletrocompetentes, com posterior incubação no gelo por 10 minutos. Logo após,
condições padrões de pulsação 2,5KV, 25µF e 1000Ω foram aplicadas numa cuveta de
2 mm (Bio-Rad®). Posteriormente, foi adicionado ao sistema 1 mL de meio SOB
(extrato de levedura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mM e KCL 2,5 mM) (HANAHAN,
1983), o qual juntamente com as células eletroporadas foi transferido para um tubo de
ensaio e incubado por 3 horas, sob agitação a 37°C.
Os transformantes foram selecionados a partir do plaqueamento e incubação dos
mesmos em meio Middlebrook 7H11 (Himedia®) com Canamicina (20 µg/mL) numa
estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após 3 dias de incubação, colônias
representativas de micobactérias recombinantes foram selecionadas e transferidas para
um tubo contendo 5 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo com tween 80 a 0,05% com
Canamicina (20 µg/mL), que foi incubado a 37°C sob agitação por três dias.
Posteriormente, 2 mL da cultura foram transferidos para um volume de 200 mL de meio
Middlebrook 7H9 caldo com tween 80 a 0,05% contendo Canamicina (20 µg/mL) e
incubados sob agitação a 37°C até atingir a fase exponencial (cerca de três dias). Ao
atingirem a fase exponencial de crescimento, as culturas foram transferidas para tubos
de fundo cônico de 50 mL, centrifugadas a 6.000 rpm por 15 minutos a 10˚C e depois
lavadas em igual volume de glicerol 10% por três vezes. Feito isso, o sedimento foi
ressuspendido em 5 mL de glicerol 10% e alíquotas de 100 µL foram congeladas a 80°C em criotubos.
4.5 Determinação da concentração da vacina recombinante mc2-CMX.
A determinação da concentração da vacina foi realizada através da contagem de
Unidades Formadoras de Colônias (UFC) em meio Middlebrook 7H11 ágar contendo
Canamicina (20 µg/mL). Portanto, algumas alíquotas da vacina mc2-CMX congeladas a
-80°C, foram selecionadas aleatoriamente e 50 µL destas foram diluídas seriadamente
27
10, 100, 1000 e 10000 vezes resultando nas diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4,
respectivamente. Foram plaqueados 50 µL de cada diluição em meio Middlebrook
7H11 com Canamicina (20 µg/mL) e posteriormente incubados por 3 dias a 37°C em
estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. O número de colônias que cresceu
nas placas foi usado para determinar a concentração do estoque da vacina mc2-CMX em
UFC/mL aplicando-se a seguinte fórmula: N x 20 x 1/FD, onde N corresponde ao
número de colônias crescidas na placa, 20 é o fator de correção do volume semeado e
1/FD é o inverso da diluição correspondente à placa onde se obteve colônias isoladas
(de 20 a 80) usadas na contagem.
4.6 Obtenção e determinação da concentração da vacina BCG Moreau.
A cepa BCG Moreau oriunda do Instituto Butantan, foi cultivada em meio
Middlebrook 7H9 suplementado com Ácido Oleico, Albumina, Dextrose e Catalase
(OADC) e tween 80 a 0,05%, sob agitação a 37ºC por 21 dias, quando então, foram
lavadas com igual volume de solução gelada de glicerol 10% e ressuspendidas em 3 mL
de glicerol 10% gelado. Alíquotas de 100 µL da vacina foram congeladas em criotubos
a -80ºC e após algumas semanas foram selecionadas aleatoriamente para determinação
do UFC. Estas foram diluídas seriadamente em 10, 100, 1000, 10000 vezes resultando
nas diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4, respectivamente, quando então foram plaqueados 50
µL de cada diluição em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC, com
posterior incubação de 21 dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de
CO2. Após 21 dias de incubação, o plaqueamento da diluição que resultou em colônias
isoladas (de 20 a 80) foi usado para determinar a concentração do estoque da vacina
BCG Moreau em UFC/mL.
4.7 Análise da expressão da proteína recombinante CMX em M. smegmatis mc2
155 por western blotting.
Culturas de M. smegmatis mc2 155 recombinante foram crescidas em meios
Middlebrook 7H9 contendo Canamicina (20 µg/mL) por três dias, quando então foram
centrifugadas. O sobrenadante foi descartado e então o sedimento foi ressuspendido em
tampão fosfato salina (PBS) e sonicado em 10 ciclos de 30 segundos de duração cada,
com intervalos de 30 segundos para ruptura das células. O lisado celular foi
centrifugado a 6.000 rpm 10ºC por 10 minutos e o sobrenadante (fração intracelular
28
solúvel) transferido para um novo tubo, no qual foi adicionado 0,5 µL de inibidores de
proteases (Ditiotreitol, Fluoreto fenilmetilsulfonil, Aproptin, Leupeptin e Pepstatin). O
sedimento do lisado foi ressuspendido em tampão PBS contendo os inibidores de
protease citados acima (fração intracelular insolúvel) (JUNQUEIRA-KIPNIS et al.,
2013).
As frações obtidas foram analisadas quanto à presença da proteína CMX através
da técnica de western blotting. Os extratos proteicos das duas frações descritas acima
foram aplicados em gel de poliacrilamida e duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).
Após separação eletroforética, os extratos proteicos foram eletrotransferidos para uma
membrana de nitrocelulose e incubados com uma diluição 1:10000 de anticorpos
policlonais, pré-adsorvidos com proteínas de E. coli, obtidos do soro de camundongos
BALB/c após três imunizações com a rCMX e adjuvante Freund’s completo.
Posteriormente, foi adicionado o anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com
avidina-peroxidase (Sigma-Aldrich®). A presença de proteínas CMX foi revelada pela
incubação com o substrato diaminobenzidina (DAB) (Roche, Germany®).
4.8 Ensaio de estabilidade do plasmídeo in vitro.
A estabilidade do plasmídeo no M. smegmatis mc2 155 recombinante foi
avaliada através de repetições de subcultivo e contínuo crescimento em meio
Middlebrook 7H9 sem o antibiótico Canamicina (20 µg/mL) por aproximadamente 50
gerações. Subsequentemente, as células foram plaqueadas em meio Middlebrook 7H11,
e 50 colônias foram selecionadas aleatoriamente e plaqueadas em dois meios
Middlebrook 7H11, um com Canamicina (20 µg/mL)
e outro sem Canamicina e
incubados por três dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. A
estabilidade do plasmídeo foi determinada pela porcentagem de colônias que após as
passagens sem a seleção de antibiótico permaneceram resistentes à Canamicina.
4.9 Animais utilizados para realização do estudo e condições físicas de
manutenção.
O estudo foi realizado em camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas,
provenientes do biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG,
mantidos em micro isoladores acoplados à rack ventilada contendo filtros HEPA para
entrada e saída de ar, com água e dieta ad libitum. A temperatura foi mantida entre 20 a
29
24ºC com umidade relativa do ar entre 40-70%, com ciclos de luz/escuridão de 12
horas. Os camundongos foram manejados de acordo com as normas da Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL/COBEA). O presente estudo
foi aprovado pelo Comitê de Ética da UFG sob N°: 229/11 (Anexo 1).
4.10 Avaliação da imunogenicidade e persistência da vacina mc2-CMX.
Quarenta e cinco camundongos BALB/c fêmeas com idade entre 6-8 semanas,
foram distribuídos em três grupos de quinze, os quais receberam as seguintes doses da
vacina mc2-CMX: 106, 107 e 108 UFC/animal, por via subcutânea. Os camundongos
permaneceram em observação durante 60 dias. Três camundongos de cada grupo foram
eutanasiados, nos dias 1, 7, 14, 30 e 60 após a imunização para coleta do baço, o qual
foi homogeneizado e plaqueado em meio Middlebrook 7H11 para determinar a
persistência da vacina mc2-CMX a partir da contagem de UFC. O sangue dos animais
eutanaziados foi coletado em três momentos, nos dias 14, 30 e 60 após a imunização
para determinar a imunogenicidade através do ELISA.
4.11 Estabilidade in vivo do mc2-CMX.
Para determinar a estabilidade do plasmídeo in vivo, camundongos imunizados
com 108 UFC de mc2-CMX foram eutanasiados para coleta do baço, o qual foi
posteriormente homogeneizado e plaqueado em meio Middlebrook 7H11 com
Canamicina. Após três dias de incubação a 37ºC, colônias crescidas na placa foram
analisadas através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), usando
iniciadores específicos para as sequências codificadoras da proteína CMX. Cinco
colônias foram selecionadas das placas aleatoriamente e transferidas para tubos
contendo 5 mL de 7H9, e incubadas por três dias a 37ºC. Após a incubação, 500 µL de
cada cultura foram transferidos para tubos eppendorfs de 1,5 mL e centrifugados por 10
minutos a 10.000 g na temperatura de 10ºC. Posteriormente, o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 100 µL de miliqH2O e fervido por 10 minutos.
Feito isso, a solução foi centrifugada por 5 minutos a 10.000 g na temperatura de 10ºC.
Assim, o sobrenadante foi transferido para outro tubo, e deste volume foi coletado 4 µL
para realização de PCR. O sistema de PCR foi preparado para um volume final de 30
µL em tubos de 0,2 mL no qual foram acrescentados 4 µL do sobrenadante, 6 µL
tampão Colorless GoTaqTM (Promega®), 0,47 µM de cada oligonucleotídeo iniciador
30
específico, 250 µM de cada dNTPs, e 1U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen®). O
DNA foi submetido à desnaturação a 94ºC por 4 minutos e em seguida a 35 ciclos de
92ºC por 45 segundos, 58ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto, com etapa de extensão
final a 72ºC por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a
1,5% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo, com um marcador de 100 pb
(Invitrogen®). O gel de agarose contendo os produtos da PCR foram visualizados e a
imagem digitalizada no aparelho Gel Doc System (Bio-Rad®) com o auxílio do software
Quantity One 4.6.7 (Bio-Rad®).
4.12 Preparo dos inóculos vacinais.
Alíquotas da vacina mc2-CMX (M. smegmatis mc2 155/pLA71-CMX) foram
retiradas do freezer -80ºC e a concentração foi ajustada com PBS tween 80 a 0,05%
para 1x108 UFC/mL. O mesmo processo foi realizado para o preparo do inóculo vacinal
de BCG Moreau, todavia, a concentração ajustada foi de 107 UFC/mL. Para os grupos
controles foram preparados PBS tween 80 a 0,05%.
4.13 Imunização.
Dezesseis camundongos BALB/c foram distribuídos em quatro grupos de
quatro camundongos: Salina; Salina+Mtb (infecção); BCG+Mtb e mc2-CMX+Mtb
(Figura 3). Os grupos de camundongos Salina; Salina+Mtb (infecção) e mc2-CMX+Mtb
receberam duas imunizações com intervalo de 15 dias entre elas. O grupo BCG+Mtb
recebeu uma única imunização. Em todas imunizações o inóculo vacinal foi plaqueado
para confirmar a concentração.
4.14 Infecção intravenosa com Mtb.
Trinta dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com
Mycobacterium tuberculosis H37Rv por via endovenosa. A cepa de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv fornecida pelo Laboratório Central de Goiás (LACEN-GO) foi
cultivada em meio 7H9 suplementado com OADC, contendo tween 80 a 0.05% até a
fase log de crescimento, e em seguida foram alíquotadas e mantidas no freezer -80ºC. O
estoque foi plaqueado e quantificado um mês após o congelamento. Diluições
centesimais do estoque foram plaqueadas em meio 7H11 suplementado com OADC e as
unidades formadoras de colônias foram contadas. No dia da infecção, o inóculo foi
31
diluído em PBS tween 80 a 0,05% na concentração de 108 UFC/mL, então foi
administrado 100 µL deste pela via intravenosa (via plexo retro-orbital), sendo
inoculado, portanto 107 UFC/animal. Com setenta dias de infecção, os camundongos
foram eutanasiados para análise da resposta imune celular induzida frente a infecção e
eficácia protetora das vacinas (Figura 3).
4.15 Obtenção do soro para realização de ELISA.
O sangue dos camundongos imunizados que receberam duas imunizações, foi
coletado 15 e 60 dias após a segunda imunização para obtenção do soro (Figura 3). Já o
grupo BCG+Mtb teve o sangue coletado nos dias 30 e 75 após imunização. O sangue
coletado foi incubado por uma hora a 37°C, centrifugado a 1.200 g a 4°C por 15
minutos para separação do soro, e posteriormente estocado a -20°C.
Figura 4. Esquema de avaliação da vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c. Camundongos
BALB/c foram distribuídos em quatro grupos: salina, salina+Mtb (infecção), mc2-CMX+Mtb, sendo estes
imunizados em dois momentos com intervalo de 15 dias, e o BCG+Mtb que recebeu somente uma
imunização. Nos dias 30 e 75, o sangue de todos os camundongos foi coletado para realização de ELISA,
e após 45 dias da primeira imunização camundongos dos grupos infecção, BCG e mc2-CMX foram
desafiados com 1x107CFU/animal de M. tuberculosis H37Rv por via intravenosa. Com 70 dias de
infecção, todos os camundongos foram eutanasiados para realização de citometria, CFU e
histopatológico.
32
4.16 ELISA.
Para determinação dos níveis séricos de anticorpos anti-CMX da classe IgG1 e
IgG2a, foi realizado um ELISA conforme otimizado por de Sousa et al. (2012). Placas
de poliestireno (Nunc®) de 96 poços foram inicialmente sensibilizadas com 10 µg/mL
de proteína CMX diluída em 0,05 M de tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,05 M
(pH 9,6) e incubadas a 4°C por 16 horas. Posteriormente, a placa foi lavada e incubada
por uma hora a 37°C com tampão carbonato de sódio (PBS) contendo 1% de gelatina. A
partir dessa etapa seguiu-se a adição dos soros, com posterior incubação de 1 hora a
37°C. Os anticorpos conjugados à biotina (anti-IgG1 e anti-mouse IgG2a;
Pharmingen®), diluídos a 1:5000, foram adicionados e as placas foram incubadas por 1
hora a 37°C. Foi adicionada a estreptoavidina peroxidase, diluída a 1:1000 e as placas
foram novamente incubadas por 1 hora a 37°C. A reação foi então revelada com o
substrato ortofenilenodiamina (OPD) e bloqueada adicionando-se ácido sulfúrico a 4N.
A leitura da absorbância foi realizada em comprimento de onde de 492 ηm em leitor de
ELISA (Multiskan Thermo Labsystems®). Entre cada uma das etapas, as placas foram
lavadas cinco vezes com PBS tween 20 0,05%.
4.17 Obtenção das células do baço.
Para obtenção das células, o baço dos camundongos foi coletado após setenta
dias de infecção, passado em filtro de 70 µm para células (BD Biosciences, Lincoln
Park, NJ) e posteriormente, as mesmas foram ressuspendidas em meio Roswell Park
Memorial Institute medium GIBCOTM (RPMI medium GIBCOTM). Os eritrócitos foram
lisados com solução de lise (0,15M NH4Cl, 10mMKHCO3), depois as células foram
lavadas e ressuspendidas em meio RPMI completo (cRPMI) suplementado com 10% de
soro bovino fetal, 0,15% de bicarbonato de sódio, 1% de L-glutamina (200 mM
SIGMA®) e 1% de aminoácidos não essenciais 100X (SIGMA®). Posteriormente, as
células foram contadas utilizando a câmara de Neubauer e ajustadas para concentração
de 1x106 células/mL.
4.18 Obtenção das células do pulmão.
Para obtenção das células, o lóbulo esquerdo pulmão dos camundongos foi
coletado após setenta dias de infecção e posteriormente, digerido como descrito por
Junqueira-Kipnis et al. (2003). O sistema sanguíneo do pulmão foi perfundido com 5
33
mL de solução gelada contendo PBS e 45 U/mL de heparina (Sigma-Aldrich). Após
coletado, o pulmão foi tratado com uma solução de DNAse IV (30 µg/mL; SigmaAldrich) e colagenase III (0,7 mg/mL; Sigma-Aldrich) por 1 hora a 37°C. Para a
obtenção das células, o homogenato foi passado em filtro de 70 µm para células. O
restante dos eritrócitos foram lisados com solução de lise, e então as células foram
lavadas e ressuspendidas em meio cRPMI. Posteriormente, as células foram contadas
utilizando a câmara de Neubauer e ajustadas para concentração de 1x106 células/mL.
4.19 Avaliação da produção celular de citocinas do baço e pulmão.
Para determinar a produção de citocinas pelas células do baço e pulmão, foram
distribuídos 200 µL de suspensão celular destes órgãos em placa de cultura celular de
96 orifícios (Cell Wells ). As células foram cultivadas sem estímulo (meio), em estufa
TM
de CO2 a 5% a 37°C por 4 horas. Após este período, foi acrescentado um inibidor de
transporte de proteínas, a monensina na concentração de 3 µM (eBioscience®), e então,
as culturas foram submetidas à nova incubação por 4 horas. Logo, as células foram
marcadas com anticorpos anti: PercP-CD4 (BD PharMingen®); PE-IL-2 (eBioscience®);
FITC-TNF-α (eBioscience®); APC-IFN-γ (eBioscience®) por 30 minutos, lavadas com
PBS contendo 0,1% de ácida sódica, fixada e permeabilizada com Perm Fix/ Perm
Wash (BD PharMingen®). Todas as análises foram realizadas com aquisição de 50.000
eventos no citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCalibur (Hospital Araújo Jorge
Goiânia/GO) e os dados foram analisados com o software FlowJo 8,7. Os linfócitos
foram selecionados baseado nas características de tamanho (FSC) e granulosidade
(SSC).
4.20 Histopatológico.
Para análise histopatológica do pulmão, o lóbulo pulmonar caudal direito de
cada camundongo foi coletado e fixado com formol a 10% tamponado, após setenta dias
de infecção intravenosa (Figura 3). Os espécimes foram processados em histotécnico
automático, incluídos em parafina e seccionados em micrótomo (Leica RM2165®).
Obteve-se de cada bloco, cortes consecutivos de 5µm, os quais foram colocados sobre
lâminas histológicas e corados pelo método de hematoxilina e eosina (HE) para análise
em microscopia de luz (Axio scope.A1 - Carl Zeiss), utilizando o programa AxioVision
4.7. Os eventos microscópicos avaliados nestes cortes histológicos foram: intensidade
34
de infiltrado inflamatório, presença ou não de macrófagos espumosos e área de necrose,
sendo esta análise realizada nas objetivas de 5x, 10x 40x e 100x. A determinação dos
escores de lesão foi adaptada do algoritmo desenvolvido pelo Dr. Randall Basaraba da
Colorado State University, descrito abaixo.
Foi considerado o valor de 0 aos cortes histológicos que não apresentaram lesão
e focos inflamatórios, sendo observado a conservação da arquitetura pulmonar. Para
cortes histológicos que apresentaram lesões com poucos focos inflamatórios,
mononuclear e macrófagos espumosos, o valor considerado foi entre 1-5, sendo 1, um
número mínimo de eventos por campo e 5 para um número 1 a 2 por campo. Presença
de lesões, focos inflamatórios, infiltrado mononuclear difuso e macrófagos espumosos,
o valor do score considerado foi entre 5-7, sendo o valor 5 para um número 3 a 5 de
eventos por campo e 7 para um número 6 a 8 por campo. Cortes histológicos que
apresentaram lesões, focos inflamatórios, infiltrado mononuclear difuso moderado,
macrófagos espumosos e presença de necrose, o valor do score considerado foi entre 710, sendo 7 quando o número de 8 a 10 focos inflamatórios por campo, com presença
de pouca necrose e 10 para cortes histológicos que apresentaram juntamente com os
focos, lesão acentuada e necrose, com perda total da arquitetura pulmonar. Todos os
procedimentos citados acima foram realizados no Laboratório de Patologia Bucal da
Faculdade de Odontologia – UFG.
4.21 Determinação da carga bacilar no pulmão.
Para avaliar a eficácia protetora das vacinas, após setenta dias de infecção,
camundongos desafiados com Mtb foram eutanasiados (Figura 3), para coleta dos lobos
pulmonares direito superior e mediano, os quais foram homogeneizados e plaqueados
em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC para determinação da carga
bacilar a partir da contagem de UFC, após 21 dias de incubação a 37ºC.
4.22 Análise Estatística.
Os resultados obtidos foram tabulados usando o Microsoft Office Excel 2011 e
Software Prism (versão 5.0c, GraphPad). A comparação entre os grupos foi dada pela
análise de variância (ANOVA) e teste t não pareado. Valores de p<0,05 foram
considerados estatisticamente significativos.
35
5 RESULTADOS
5.1 M. smegmatis recombinante pLA71-CMX expressa proteína CMX.
Para avaliar a expressão da proteína CMX nos recombinantes mc2-pLA71CMX,
mc2-pLA73-CMX
e
mc2-pMIP12-CMX,
alíquotas
foram
selecionadas
aleatoriamente no freezer -80°C e analisadas através da técnica de western blotting,
utilizando anticorpos policlonais específicos para a proteína CMX. Como controle,
alíquotas de M. smegmatis mc2 155 com pLA71 e selvagem, foram analisadas
juntamente. Como demonstrado na figura 4 A, somente a construção mc2-pLA71-CMX
apresentou a banda correspondente à proteína CMX (36KDa), sendo esta expressão
confirmada em uma réplica do mesmo experimento como demostrado na figura 4 B.
Diante desses resultados, escolhemos a mc2-pLA71-CMX como vacina, passando a ser
denominada de mc2-CMX.
Figura 5. Expressão da proteína CMX no recombinante mc2-pLA71-CMX. (A) e (B) Avaliação da
expressão da proteína CMX nos recombinantes através da técnica de western blotting utilizando
anticorpos policlonais anti-CMX. Canaleta M, marcador BlueStepTM Broad Range Protein (Amresco). (A)
Canaleta 1: proteína recombinante CMX purificada. Canaleta 2: poço vazio. Canaleta 3: M. smegmatis
mc2 155 com plasmídeo pLA71-vazio. Canaleta 4, 5: M. smegmatis pMIP12-CMX sedimento e
sobrenadante, respectivamente. Canaleta 6, 7: M. smegmatis pLA71-CMX sedimento e sobrenadante,
respectivamente. Canaleta 8, 9: M. smegmatis pLA73-CMX sedimento e sobrenadante, respectivamente.
(B) Canaleta M, marcador BlueStepTM Broad Range Protein (Amresco). Canaleta 1: proteína
recombinante CMX purificada. Canaleta 2, 3: M. smegmatis pLA71-CMX sedimento e sobrenadante,
respectivamente. Canaleta 4: M. smegmatis mc2 155 com plasmídeo pLA71-vazio. Canaleta 5: M.
smegmatis mc2 155 Selvagem.
36
5.2 mc2-CMX induz resposta imune humoral específica.
Para definir a melhor dose vacinal da vacina mc2-CMX a ser administrada,
grupos de camundongos foram imunizados com uma dose única de mc2-CMX em
diferentes concentrações, 106, 107 e 108, e posteriormente, a resposta imune humoral
específica foi avaliada através da técnica de ELISA nos dias 14, 30 e 60 após
imunização. Como demonstrado na Figura 5 A e B, todas as doses vacinais foram
capazes de induzir níveis séricos de anticorpos anti-CMX, tanto classe IgG1 quanto
IgG2a. Diante desse resultados decidimos usar a dose intermediaria 107 para imunização
em dois momentos com intervalo 15 dias, pois apesar da dose 108 ter apresentado uma
maior resposta humoral, observamos a formação de uma pequena lesão no local da
imunização (dados não mostrados), fator não observado na dose 107.
Figura 6. Resposta imune humoral específica induzida pela vacina mc2-CMX em camundongos
BALB/c. (A) e (B) Três grupos de camundongos foram imunizados com uma dose única da vacina mc2CMX em diferentes concentrações 106, 107 e 108, sendo os níveis séricos de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a
(B) anti-CMX dosados em diferentes pontos pela técnica de ELISA.
5.3 mc2-CMX persiste por até sete dias em camundongos BALB/c e este mantém a
expressão da CMX in vivo.
Para determinar a persistência do mc2-CMX in vivo, grupos de camundongos
BALB/c foram imunizados com uma dose única da vacina em diferentes concentrações,
106, 107 e 108, por via subcutânea. O baço foi coletado nos dias 1, 7, 14, 30 e 60 para
determinar as UFCs. Como observado na figura 6, somente na dose 108 houve
persistência do mc2-CMX por até sete dias após a imunização.
37
109
108
106CFU/camundongo
107CFU/camundongo
108CFU/camundongo
CFU/baço
107
106
105
104
103
102
101
Dia 0
Dia 1
Dia 7
Dia 14
Dia 30
2
Figura 7. A persistência do mc -CMX em camundongos BALB/c. Camundongos BALB/c foram
imunizados com uma única dose da vacina em diferentes concentrações, 106, 107 e 108, por via
subcutânea. O baço foi coletado nos dias 1, 7, 14, 30 e 60 para determinar as UFC.
Para avaliar se durante este período de persistência o mc2-CMX manteve o
plasmídeo in vivo na ausência de pressão seletiva (Canamicina), colônias recuperadas
do baço de camundongos foram analisadas através da técnica de PCR usando
iniciadores específicos para as sequências codificadoras da proteína CMX. Como
demonstrado na figura 7, todas as colônias recuperadas apresentaram PCR positiva com
uma banda de tamanho correspondente ao da sequência codificadora da proteína CMX.
A partir destes resultados, notamos que a vacina não apresentou mudança na
persistência com adição da CMX, e este manteve o plasmídeo em ambiente sem pressão
seletiva in vivo.
Figura 8. Gel de agarose do PCR do gene da fusão CMX. Para avaliar se o mc2-CMX manteve o
plasmídeo in vivo, colônias recuperadas do baço de camundongos imunizados foram analisadas através da
técnica de PCR usando iniciadores específicos para as sequências codificadoras da proteína CMX. Todas
as colônias analisadas apresentavam o gene da fusão CMX. Canaleta M, marcador de DNA Axygen
100pb (Biosciences®). Canaletas 1- 5: colônias de bactérias recuperadas e testadas pela PCR. Canaleta 6:
controle negativo do PCR.
38
5.4 A imunização com mc2-CMX em dois momentos induz melhor resposta imune
humoral específica para CMX que a BCG.
Para analisar a capacidade imunogênica da vacina mc2-CMX, camundongos
BALB/c foram imunizados em dois momentos com intervalo de 15 dias. Como
controles foram utilizados camundongos imunizados com salina ou BCG Moreau. Após
15 dias da ultima imunização o sangue de todos os camundongos foi coletado para
realização de ELISA. Como evidenciado na figura 8 (A e B) camundongos imunizados
com a vacina mc2-CMX em dois momentos, apresentaram maiores níveis de anticorpos
anti-CMX, tanto da classe IgG1 quanto IgG2a, quando comparado com os grupos
controles. Trinta dias após a ultima imunização, os camundongos foram desafiados com
Mtb, e depois de trinta dias de infecção o sangue de todos os animais foi coletado
novamente e os níveis de anticorpos anti-CMX determinados. Como evidenciado na
figura 8 (A e B) os níveis de anticorpos tanto da classe IgG1 quanto IgG2a foram
significativamente maiores nos camundongos imunizados com vacina mc2-CMX que
nos animais do grupo salina e BCG após desafio com Mtb (Figura 8 A e B). Estes
resultados mostram que a vacina mc2-CMX induziu uma resposta imune humoral
específica e esta se manteve após o desafio, sendo mais imunogênica que a BCG.
A
**
3
**
B
1.0
2
IgG2a (492 ηm)
IgG1 (492 ηm)
**
*
1
0
***
0.5
0.0
Não-desafiado
Salina
Desafiado
BCG
mc2-CMX
Não-desafiado
Salina
Desafiado
BCG
mc2-CMX
Figura 9. Resposta imune humoral específica induzida pelas vacinas salina, BCG e mc2-CMX em
camundongos BALB/c antes e após o desafio com Mtb. (A) Níveis séricos de anticorpos da classe
IgG1 anti-CMX antes e após o desafio com Mtb. (B) Níveis séricos de anticorpos da classe IgG2a antiCMX antes e após o desafio com Mtb. Camundongos foram distribuídos em três grupos: salina, BCG e
mc2-CMX, os quais receberam em dois momentos as seguintes vacinas, salina, 106 UFC de BCG Moreau
e 107 UFC de mc2-CMX, respectivamente. *P< 0,05, **P<0,01 ***P<0,001 indica a significante
diferença entre os grupos.
5.5 A resposta imune celular frente a infecção com Mtb.
Setenta dias após desafio com Mtb H37Rv, pulmão e o baço dos camundongos
foram coletados para obtenção de células e avaliação da resposta imune celular induzida
frente a infecção. Como observado na figura 9 A, a infecção por Mtb por si só foi capaz
39
de induzir uma maior migração de linfócitos T CD4 para o pulmão, tanto nos
camundongos imunizados quanto no grupo infecção (Salina+Mtb) quando comparados
grupo não desafiado. Contudo, não houve diferença significativa entre os grupos
desafiados. O mesmo foi observado no baço, aonde houve proliferação linfocítica
significativa em todos os grupos desafiados com Mtb, em comparação ao grupo não
desafiado (Figura 9 B).
A
B
10
Total de Linfócitos TCD4+ (x108)
Total de Linfócitos TCD4+ (x108)
1.5
*
*
1.0
***
0.5
0.0
**
8
6
**
***
4
2
0
Salina
Salina+Mtb
Pulmão
BCG+Mtb
mc2-CMX+Mtb
Salina
Salina+Mtb
BCG+Mtb
mc2-CMX+Mtb
Baço
Figura 10. Total de linfócitos T CD4 no pulmão e baço dos camundongos. Camundongos foram
imunizados e após trinta dias da última imunização, foram desafiados com Mtb. Setenta dias depois do
desafio, pulmão e baço foram coletados para realização da citometria de fluxo. As células foram
cultivadas ex vivo sem estímulo, por 4 h a 37°C. Na (A) quantidade de linfócitos T CD4 totais no pulmão
e na (B) baço. *P< 0,05, **P<0,01 ***P<0,001 indica a significante diferença entre os grupos.
A produção de citocinas efetoras pelos linfócitos T CD4 é um fator importante no
controle da infecção pelo Mtb, principalmente quando estas são características de uma
resposta do tipo Th1 como IFN-γ, TNF-α e IL-2. Deste modo, avaliamos o perfil de
citocinas produzidas pelas células T CD4 obtidas do pulmão de camundongos
imunizados com suas respectivas vacinas, desafiados com Mtb, tendo como controle um
grupo de camundongos imunizados com salina sem desafio. Como observado na figura
10 A, camundongos imunizados com vacina mc2-CMX apresentaram uma porcentagem
significativamente maior de células produtoras de IFN-γ, quando comparado com os
grupos imunizados com Salina e BCG Moreau, todavia não houve diferença
significativa quando comparado o grupo BCG+Mtb com o grupo infecção
(Salina+Mtb). A porcentagem de células produtoras de TNF-α foi também
significativamente maior no grupo imunizado com vacina mc2-CMX quando comparada
com o grupo BCG, (Figura 10 B), porém este aumento não foi significativo quando
comparado o grupo mc2-CMX+Mtb com os grupos que receberam salina (Salina e
Salina+Mtb). Como mostrado na figura 10 C, camundongos desafiados com o Mtb,
apresentaram porcentagens significativas de células produtoras de IL-2, quando
comparado com o grupo não desafiado. Todavia somente os camundongos imunizados
40
com a vacina mc2-CMX apresentaram porcentagens significativas, quando comparadas
com o grupo infecção (Salina+Mtb).
A
B
1.5
25
*
% células TCD4+/TNF-α+
% células TCD4+/IFN-γ+
20
*
15
*
**
**
*
10
*
1.0
*
0.5
5
0
Salina
Salina+Mtb
BCG+Mtb
0.0
mc2-CMX+Mtb
Salina
Salina+Mtb
BCG+Mtb
mc2-CMX+Mtb
C
15
% células TCD4+/IL-2+
**
*
**
10
*
5
0
Salina
Salina+Mtb
BCG+Mtb
mc2-CMX+Mtb
Figura 11. Porcentagem de linfócitos T CD4 produtores de citocinas pró-inflamatórias no pulmão
de camundongos. Camundongos foram imunizados e após trinta dias da última imunização, foram
desafiados com Mtb. Setenta dias depois do desafio, o pulmão foi coletado para realização da citometria
de fluxo. As células foram cultivadas ex vivo sem estímulo, por 4 h a 37°C. (A) produção de IFN-γ por
células T CD4, (B) produção de TNF-α por células T CD4 e (C) produção de IL-2 por células T CD4.
Comparação entre os grupos pelo teste t, *P< 0,05, **P<0,01 indica a significante diferença entre os
grupos.
5.6 Redução das lesões pulmonares induzidas pela infecção com Mycobacterium
tuberculosis pelas vacinas mc2-CMX e a BCG.
Após setenta dias de infecção foi avaliado a eficácia da resposta imune
específica induzida pelas vacinas no controle da infecção. O pulmão de todos os
camundongos foram coletados e as lesões induzidas pelo desafio foram determinadas.
No grupo infecção (Salina+Mtb), o desafio intravenoso com Mtb induziu inflamação
pulmonar grave e difusa, acompanhada de grandes aglomerados inflamatórios de
linfócitos (seta preta) e macrófagos espumosos (seta verde) (Figura 11 B). Quando
observado os pulmões dos camundongos imunizados com as vacinas BCG Moreau e
mc2-CMX, estes apresentaram uma significante redução da lesão pulmonar, com poucos
focos inflamatórios (seta preta), em comparação ao grupo infecção (Figura 11 C e D).
Ao determinar o escore de lesão (figura 12) foi observado um número
significativamente maior de lesões no grupo infeção em comparação aos grupos
imunizados com as vacinas BCG e mc2-CMX, mas ao comparar esses dois últimos
grupos não houve diferença . A resposta induzida pelas vacinas BCG Moreau e mc241
CMX foi capaz de conservar a arquitetura pulmonar (seta azul), sendo estas efetivas no
controle da infecção.
Figura 12. A imunização com mc2-CMX induziu menor lesão pulmonar similar a de camundongos
imunizados com a BCG. Análise histopatológica do pulmão de camundongos BALB/c após setenta dias
de infecção por Mtb H37Rv, na objetiva de 10x. (A) Camundongo Salina não infectado. (B) Camundongo
infectado (Salina+Mtb) com uma significante inflamação pulmonar grave e difusa, acompanhada de
grandes aglomerados inflamatórios de linfócitos (seta preta) e macrófagos espumosos (seta verde). (C)
Camundongo imunizado com BCG e infectado apresentando uma significante redução da lesão pulmonar
com poucos focos inflamatórios (seta preta), em comparação ao grupo infecção (Salina+Mtb). (D)
Camundongo imunizado com mc2-CMX e infectado apresentando uma redução da lesão pulmonar similar
ao camundongo imunizado com BCG.
Figura 13. Comparação do score de lesão pulmonar entre os grupos de camundongos desafiados
com M. tuberculosis. Após setenta dias de infecção o pulmão de todos os camundongos foi coletado para
realização da análise histológica determinando os score de lesão com base no número de focos
inflamatórios, lesões, macrófagos espumosos, células inflamatórias e presença de necrose. ***P<0,001
indica diferença significante entre os grupos.
42
5.7 Redução da carga bacilar no pulmão de camundongos imunizados com as
vacinas mc2-CMX e BCG.
Após setenta dias de infecção camundongos desafiados com Mtb foram
eutanasiados para coleta dos lobos pulmonares direitos superior e mediano, os quais
foram homogeneizados e plaqueados em meio Middlebrook 7H11 suplementado com
OADC, para determinação da carga bacilar a partir da contagem de UFC. Como
observado na figura 13, camundongos imunizados com vacinas BCG e mc2-CMX,
apresentaram uma significante redução da carga bacilar no pulmão, quando comparado
com o grupo infecção (Salina+Mtb). A resposta induzida pelas vacinas BCG e mc2CMX foi efetiva no controle da infeção por Mtb, sendo essa protetora.
Figura 14. Resposta imune induzida pela a imunização com mc2-CMX é efetiva no controle da
infecção por Mtb. Com setenta dias de infecção os camundongos desafiados com Mtb foram
eutanasiados para coleta dos lobos pulmonares direitos superior e mediano, os quais foram
homogeneizados e plaqueados em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC para determinação
da carga bacilar, a partir da contagem de UFC. Comparação entre os grupos pelo teste t, *P< 0,05, indica
a significante diferença entre os grupos.
43
6 DISCUSSÃO
Há séculos a tuberculose vem sendo um problema de saúde pública mundial.
Mesmo após o surgimento da vacina BCG, em 1921, o controle da tuberculose continua
a passos lentos. Diante deste cenário, medidas que possam auxiliar no controle desta
doença são necessárias, tais como o desenvolvimento de novas vacinas, que possam
substituir ou melhorar a resposta imune induzida pela vacina BCG (CHECKLEY et al.,
2011). Neste estudo desenvolvemos a vacina recombinante mc2-CMX, a partir da
transformação da cepa M. smegmatis mc2 155 com o plasmídeo contendo a sequência
codificadora da proteína de fusão CMX (Ag85C-MPT51-HspX) (DE SOUSA et al.,
2012). A vacinação de camundongos BALB/c com mc2-CMX foi capaz de induzir a
produção de anticorpos específicos para a proteína CMX. Além disso, esses
camundongos, quando infectados por Mtb, apresentaram significativa redução da lesão
pulmonar e carga bacilar, similar aos camundongos imunizados com a BCG Moreau.
Como já descrito na literatura, a proteína CMX é imunogênica em camundongos
e antigênica em humanos, características que a qualifica como um bom antígeno para o
desenvolvimento de uma nova vacina contra tuberculose (DE SOUSA et al., 2012). No
entanto, para induzir uma resposta a um determinado patógeno é necessário apresentar
este antígeno às células do sistema imune, e a melhor forma de o apresentar é utilizando
um vetor que possua características constitucionais similares ao patógeno. O M.
smegmatis tem características únicas que permitem a boa apresentação de antígenos
recombinantes à células apresentadoras de antígenos, tais como a não inibição da
maturação do fagossoma. Em nossos estudos, a transformação de Mycobacterium
smegmatis mc2 155 com o plasmídeo pLA71-CMX gerou a vacina recombinante mc2CMX, o qual expressou eficientemente a proteína CMX. Camundongos BALB/c
imunizados com a vacina mc2-CMX apresentaram resposta imune humoral específica
para CMX similar a resultados obtidos por de Sousa et. al., (2012), com a proteína de
fusão, mostrando que o mc2-CMX foi um bom vetor vacinal, mantendo a
imunogenicidade do antígeno recombinante (figuras 4 e 5). Vários outros estudos
realizados com o vetor M. smegmatis têm demonstrado a habilidade deste vetor em
expressar proteínas recombinantes e induzir resposta imune específica como observado
por exemplo no estudo realizado por Zhang et al., (2010). Neste estudo, observou-se
que a vacinação de camundongos com o M. smegmatis expressando uma proteína de
44
fusão ESAT6-CFP10, induziu uma melhor imunidade humoral e celular que a
vacinação com BCG. Em outro estudo, realizado por Yi et al., (2007), notou-se que a
imunização de camundongos BALB/c com M. smegmatis pZ607 recombinante,
transportando IL-12/GLS, induziu uma eficiente resposta imune protetora Th1 com alta
produção de IFN-γ e IL-12, similar à vacinação com BCG. Estes resultados em conjunto
com os obtidos neste trabalho, demostram que o vetor M. smegmatis é um ótimo
carreador de proteínas capaz de induzir em camundongos resposta imune específica
para estas proteínas.
A determinação de um protocolo de imunização é importante para avaliação de
uma vacina. Em nossos estudos observamos que a imunização com uma única dose de
mc2-CMX não induziu significante resposta imune humoral, mesmo na dose 108
UFC/animal (Figura 5), a qual induziu lesão no local da imunização (dados não
mostrados). Quando imunizamos os camundongos com 107 UFC/animal em dois
momentos, com intervalo de 15 dias, observamos um aumento significativo da resposta
induzida. Dessa maneira, este protocolo foi o escolhido para avaliação da vacina mc2CMX (figura 8). Zhao et al. (2012), obtiveram resultados similares quando imunizaram
camundongos BALB/c com M. smegmatis recombinante expressando a proteína de
fusão HBHA-hIL12, observando que a imunização com uma única dose do
recombinante não era suficiente para induzir resposta imune protetora desejada em
camundongos, sugerindo a imunização em dois momentos com intervalos de duas
semanas como esquema de imunização ideal. Possivelmente, a necessidade de uma dose
reforço, pode estar relacionada à persistência de M. smegmatis mc2 155 in vivo. Em
nosso estudo observamos que a persistência do mc2-CMX em camundongos BALB/c
imunizados com uma única dose 108, foi de sete dias (Figura 6), sendo então necessário
um reforço para recuperar as células do sistema imune induzidas inicialmente. Pelosi et
al., (2012), observaram in vitro que após 48hs de infecção por M. smegmatis em
macrófagos J774A, a infecção era resolvida, mostrando o que já estava postulado na
literatura: a suscetibilidade de M. smegmatis aos mecanismos microbicidas dos
macrófagos, fator que favorece à apresentação de antígenos beneficiando a indução de
uma resposta Th1. Todavia, com esse rápido processamento e apresentação de M.
smegmatis, diminui a persistência do antígeno dentro da APC dificultando a geração de
uma resposta imune de memória, sendo necessário uma dose reforço para recuperar as
células ativadas incialmente (KUEHNEL et al., 2001; ANES et al., 2006).
45
Apesar de ser determinante no controle de infecções, como por Leishmania
major (WOELBING et al., 2006), o papel dos anticorpos na resposta imune contra
tuberculose, não está claro. Todavia, estudos têm mostrado a importância das células B
na geração de uma resposta imune protetora contra a infecção por Mtb (MAGLIONE et
al., 2007; MAGLIONE et al., 2009). Torrado et al., (2013), observaram que
camundongos deficientes na maturação de anticorpos são mais susceptíveis à infecção
por Mtb, porém não determinaram o papel do anticorpos, pois ao injetar soro de
camundongo normal não houve controle da infecção. Todavia, foi observada uma alta
produção de IL-10 pelos camundongos deficientes, o que resultou numa maior
susceptibilidade à infecção. Isso mostra que a indução de uma resposta humoral é
importante no desenvolvimento de uma resposta imune protetora, pois esta pode não ser
efetiva no controle da infecção, mas sim na modulação da resposta a ser desenvolvida,
auxiliando na proliferação, diferenciação e sobrevivência de células T e até modulando
a ativação dos macrófagos (ABEBE et al., 2009; TORRADO et al., 2013).
Em nossos estudos a vacina mc2-CMX foi capaz de induzir níveis significativos
de anticorpos da classe IgG1 e IgG2a, específicos para a proteína CMX (figura 8). O
mesmo foi observado por de Sousa et al., 2012, ao imunizar camundongos BALB/c com
a proteína CMX. Além disso, observamos que mesmo contendo os antígenos presentes
na proteína CMX, a vacina BCG não induziu níveis significativos de anticorpos contra
ela. Possivelmente, a baixa resposta observada nos camundongos imunizados com a
BCG é devido à menor expressão da HspX pela bactéria, pois vários estudos têm
mostrado, tanto em humanos quanto em camundongos, que a BCG não induz uma
resposta imune específica contra a proteína (GELUK et al., 2007; SHI et al., 2010;
SPRATT et al., 2010). Foi demonstrado também por de Sousa et al., (2012), que grande
parte da resposta imune humoral induzida pela CMX, em camundongos, era específica
para o antígeno HspX.
As células T CD4 possuem um papel muito importante na controle da infecção
por Mtb, pois estas secretam citocinas do tipo Th1, como IFN-γ e TNF-α, ativadoras de
macrófagos (COOPER, 2009; BOLD et al., 2012). Diante disso, a migração destas
células para o local da infecção, principalmente para o pulmão, é importante no
desenvolvimento de uma resposta imune protetora, pois a secreção de citocinas como
IFN-γ, pode induzir em macrófagos ações microbicidas como a produção dos reativos
intermediários do oxigênio e nitrogênio e também, induzir a autofagia (FLYNN et al.,
1993; SAUNDERS et al., 2002; GUTIERREZ et al., 2004; OTTENHOFF et al., 2012;
46
PHILIPS et al., 2012; SHALER et al., 2012). Outro mecanismo de proteção exercido
pelas células T CD4 é auxiliar no desenvolvimento do granuloma, através da produção
de TNF-α (KINDLER et al., 1989; FLYNN et al., 1995; RAMAKRISHNAN, 2012).
Neste estudo foi observada uma migração de linfócitos T CD4 para o pulmão em
todos os grupos desafiados com Mtb, mostrando que a infecção por si só foi capaz de
induzir a migração destas células (Figura 9). Todavia, quando avaliamos o perfil de
citocinas Th1 produzidas por estas células no pulmão, observamos que a produção de
IFN-γ e TNF-α, foi maior no grupo de camundongos imunizados com a vacina mc2CMX, sendo significativa quando comparada ao grupo imunizado com a BCG (Figura
10 A e B). Resultados similares foram obtidos no estudo realizado por Zhang et al.,
2010, cuja produção de IFN-γ pelas células T CD4 foi maior no grupo de camundongos
que foram imunizados com o M. smegmatis expressando a proteína de fusão ESAT6CFP10 em comparação ao grupo BCG.
A resposta imune que se tem por objetivo a ser induzida por uma vacina, a qual
possa substituir ou melhorar a BCG, não é uma resposta imune melhor que a BCG, mas
sim balanceada, cujos mecanismos de defesa do hospedeiro sejam otimizados e as
lesões inflamatórias reduzidas, resultando no controle da infecção e manutenção da
arquitetura do órgão infectado (OTTENHOFF, 2012a).
Diversos estudos têm demonstrado que a proteção induzida pela vacina BCG
não é totalmente dependente de IFN-γ, pois ao infectar camundongos vacinados com
BCG deficientes de IFN-γ, estes apresentaram um maior controle da infecção do que
camundongos depletados de células T CD4, mostrando que o controle da infecção por
Mtb pode ser realizado por outros mecanismos dos linfócitos T CD4 não dependentes
de IFN-γ, ou por outras células como as NK (COWLEY et al., 2003; MITTRUCKER et
al., 2007; ABEBE, 2012). Em nossos estudos observamos este fenômeno, pois mesmo
não induzindo uma produção significativa de citocinas como IFN-γ em comparação ao
grupo infecção (Figura 10 A), camundongos imunizados com a vacina BCG
apresentaram uma significante redução da lesão pulmonar, similar aos camundongos
imunizados com a vacina mc2-CMX (Figura 11 C e D), os quais apresentaram
porcentagens significativas de produção de citocinas do tipo Th1 (Figura 10 A e B). O
mesmo foi observado ao avaliarmos a carga bacilar, pois camundongos imunizados com
BCG apresentaram uma significante redução da carga bacilar em comparação ao grupo
infecção, similar ao grupo imunizado com a com a vacina mc2-CMX (Figura 13).
47
Possivelmente, a resposta imune induzida pela nossa vacina é dependente de IFN-γ,
diferente da vacina BCG. A produção de IFN-γ pelas células T CD4 é essencial no
controle da infecção por Mtb, todavia esta produção não deve ser o único marcador de
proteção a ser determinado numa vacina candidata contra a tuberculose (ABEBE,
2012).
Ao observarmos os pulmões dos camundongos do grupo infecção, os quais
apresentaram porcentagens significativas de citocinas Th1, observamos acentuada lesão
tecidual acompanhada de aglomerados inflamatórios linfocíticos e macrofágicos,
mostrando que não houve um controle da infecção (Figura 11 B e 12). Isto se confirmou
ao determinamos carga bacilar no pulmão destes camundongos (figura 13), o quais
apresentaram uma maior carga bacilar em comparação aos grupos vacinados.
Provavelmente este fenômeno observado está relacionado ao fato de que uma resposta
imune protetora não se resume à produção de citocinas Th1, mas sim ao balanceamento
da resposta imune como um todo (WALZL et al., 2011). Torrado et al., 2013
observaram e demonstraram em seus estudos, a necessidade de uma resposta imune
balanceada para controle da infecção por Mtb. Em seus estudos, camundongos
deficientes na maturação de anticorpos apresentaram uma maior suscetibilidade ao Mtb
em relação aos camundongos controles, embora estes apresentassem porcentagens
similares de produção de citocinas Th1 e ativação de macrófagos. Interessantemente, ao
avaliar o perfil de citocinas Th2 como a IL-10, observou-se uma maior porcentagem
destas citocinas em relação aos controles. E ao determinar o perfil de ativação
microbicida dos macrófagos, notou-se uma produção reduzida de iNOS nestes
camundongos, sendo este o possível motivo de maior suscetibilidade. Possivelmente em
nossos estudos, os camundongos do grupo infecção juntamente com a elevada reposta
Th1 este apresentaram também uma resposta mais Th2, com maior produção de IL-10,
que pode ter regulado negativamente a resposta Th1, resultando na redução da produção
de iNOS pelos macrófagos, o que culminou em uma maior suscetibilidade a infecção e
o não controle da mesma observado.
O esquema de imunização primer-boost é uma alternativa na adição de
propriedades imunogênicas a vacina BCG. A vacina mc2-CMX mostrou neste trabalho,
sua capacidade de induzir em camundongos BALB/c uma resposta imune diferenciada e
efetiva no controle da infecção, que poderia aumentar o efeito protetor da BCG se
administrada em esquema de primer-boost. A vacina mc2-CMX apresenta
48
características significantes que a qualificam como uma boa candidata à vacina contra a
tuberculose.
49
7 CONCLUSÕES
A transformação do M. smegmatis mc2-155 com os plasmídeos pLA71/CMX,
pLA73/CMX e pMIP12/CMX foram bem sucedidas.
Somente o recombinante obtido com a transformação com o plasmídeo
pLA71/CMX expressou a proteína CMX.
O plasmídeo pLA71/CMX foi mantido pelo M. smegmatis in vitro e in vivo sem
a pressão seletiva do antibiótico.
A vacina mc2–CMX foi recuperada de camundongos em até 8 dias.
A vacina mc2–CMX recuperada dos animais permaneceu com o plasmídio
pLA71/CMX.
A vacina mc2-CMX induziu uma resposta imune humoral específica para a
proteína CMX em camundongos BALB/c, antes e após o desafio com Mtb.
A imunização de camundongos BALB/c com a vacina mc2-CMX foi capaz de
induzir em camundongos BALB/c uma significante resposta imune celular, a qual foi
efetiva na redução da lesão pulmonar induzida pelo desafio com Mtb similar à vacina
BCG.
A resposta imune induzida pela vacinação com a mc2-CMX foi efetiva no
controle da infecção, reduzindo de forma significativa a carga bacilar no pulmão quando
comparado com o grupo infecção, portanto está resposta é protetora.
A vacina mc2-CMX apresenta características significantes que a qualificam
como uma boa candidata à vacina contra a tuberculose, sendo necessários ainda, estudos
mais aprofundados, tais como a avaliação desta vacina em esquemas vacinais como
primer-boost e também o entendimento dos mecanismos imunes pelos quais ela induz
esta resposta observada.
50
8 REFERÊNCIAS
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Mycobacterium tuberculosis infection. Clin Exp Immunol, v. 157, n. 2, p. 235-43,
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73
9 ANEXOS
9.1 Parecer do comitê de ética em pesquisa.
74
75
9.2 Artigo: Prime-Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine
Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.
Prime–Boost with Mycobacterium smegmatis
Recombinant Vaccine Improves Protection in Mice
Infected with Mycobacterium tuberculosis
Ana Paula Junqueira-Kipnis1*, Fábio Muniz de Oliveira1, Monalisa Martins Trentini1, Sangeeta Tiwari2,
Bing Chen2 , Danilo Pires Resende1 , Bruna D. S. Silva1 , Mei Chen 2, Lydia Tesfa2,3, William R. Jacobs Jr 2 ,
André Kipnis1
1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil, 2 Microbiology and Immunology, Molecular Genetics, Albert
Einstein College of Medicine, New York, New York, United States of America, 3 Flow Cytometry Core Facility, Albert Einstein College of Medicine, New York, New York,
United States of America
Abstract
The development of a new vaccine as a substitute for Bacillus Calmette–Guerin or to improve its efficacy is one of the many
World Health Organization goals to control tuberculosis. Mycobacterial vectors have been used successfully in the
development of vaccines against tuberculosis. To enhance the potential utility of Mycobacterium smegmatis as a vaccine, it
was transformed with a recombinant plasmid containing the partial sequences of the genes Ag85c, MPT51, and HspX (CMX)
from M. tuberculosis. The newly generated recombinant strain mc2-CMX was tested in a murine model of infection. The
recombinant vaccine induced specific IgG1 or IgG2a responses to CMX. CD4+ and CD8+ T cells from the lungs and spleen
responded ex vivo to CMX, producing IFN-c, IL17, TNF-a, and IL2. The vaccine thus induced a significant immune response in
mice. Mice vaccinated with mc2-CMX and challenged with M. tuberculosis showed better protection than mice immunized
with wild-type M. smegmatis or BCG. To increase the safety and immunogenicity of the CMX antigens, we used a
recombinant strain of M. smegmatis, IKE (immune killing evasion), to express CMX. The recombinant vaccine IKE-CMX
induced a better protective response than mc2-CMX. The data presented here suggest that the expression of CMX antigens
improves the immune response and the protection induced in mice when M. smegmatis is used as vaccine against
tuberculosis.
Citation: Junqueira-Kipnis AP, de Oliveira FM, Trentini MM, Tiwari S, Chen B, et al. (2013) Prime–Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine
Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. PLoS ONE 8(11): e78639. doi:10.1371/journal.pone.0078639
Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, India
Received August 5, 2013; Accepted September 21, 2013; Published November 8, 2013
Copyright: ! 2013 Junqueira-Kipnis et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was funded by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientı́fico e Tecnológico (CNPq, grants numbers: 301976/2011-2, 472906/2011-9,
301198/2009-8, 472909/2011-8); Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás: FAPEG-PRONEX. APJK was awarded with a Science without borders senior
training fellowship from CNPq. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interest exist.
* E-mail: [email protected]
To select molecules or agents that can be tested as TB vaccines,
it is important to understand the immune response induced during
TB infection. TB has several clinical forms, and approximately
one third of the world population is infected with M. tuberculosis
(Mtb), comprising a massive population of individuals with latent
disease. It has been shown by our group and others that the
immune response of individuals infected with Mtb specifically
recognizes a set of proteins, including HspX, produced by Mtb
bacilli under stress conditions that mimic in vivo circumstances [4–
7]. Patients that present with active pulmonary TB, for instance,
preferentially recognize and respond to other Mtb antigens, i.e.,
the GLc-B, MPT51, Ag85 complex [8–12]. Some responses in
patients with extrapulmonary forms of TB are the same as those
seen with the active pulmonary TB form [12,13]. These features
support the hypothesis that a good candidate vaccine should
induce immune responses to antigens common to more than one
form of TB and should include more than one protein in a single
formulation. Antigens recognized by both the humoral and
cellular immune responses might also improve the protection
profile of a vaccine [14,15].
Introduction
Tuberculosis (TB) was the eighth most frequent cause of death
worldwide in 2008 according to a World Health Organization
(WHO) report, although since the Millennium Development Goals
and Stop TB Strategy were established by WHO, more than 51
million people have been successfully treated and cured of TB [1].
Although these data are encouraging, the incidence of the disease
is persistently high in several countries, explaining the continual
spread of TB.
Early diagnostic and prophylactic strategies are still required to
control TB. Bacillus Calmette–Guerin (BCG), the currently
available vaccine for TB, although safe, does not protect against
TB in adults [2]. To date, several TB vaccines have been tested in
preclinical and clinical trials and in 2012, a review article
described 12 promising vaccines. Those vaccines differ in their
vaccination schemes and their use as primary vaccines or boosters
for the BCG vaccine. The only vaccine being tested in a phase 3
trial to date is an attenuated Mycobacterium indicus pranii, to be used
in immunotherapy [3].
PLOS ONE | www.plosone.org
1
November 2013 | Volume 8 | Issue 11 | e78639
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