Mycobacterium smegmatis recombinante - IPTSP
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA FÁBIO MUNIZ DE OLIVEIRA Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX induz resposta imune contra Mycobacterium tuberculosis em camundongos BALB/c. Goiânia 2014 TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Fábio Muniz de Oliveira E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Tese [ ] Não Vínculo empregatício do autor Agência de fomento: CNPq Sigla: País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX induz resposta imune contra Mycobacterium tuberculosis em camundongos BALB/c. Palavras-chave: Tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, proteína CMX e BCG. Título em outra língua: Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing CMX protein induces immune response against Mycobacterium tuberculosis in BALB/c mice. Palavras-chave em outra língua: Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, CMX protein and BCG. Área de concentração: Microbiologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 28/02/2014 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública Orientador: André Kipnis E-mail: [email protected] Co-orientador (a):* Ana Paula Junqueira-Kipnis E-mail: [email protected] *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________ Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a) 1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo. ii FÁBIO MUNIZ DE OLIVEIRA Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX induz resposta imune contra Mycobacterium tuberculosis em camundongos BALB/c. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientador: Prof. Dr. André Kipnis Co-orientador: Prof. Dra. Ana Junqueira-Kipnis Paula Goiânia 2014 iii Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP) GPT/BC/UFG O48m Oliveira, Fábio Muniz de. Mycobacterium smegmatis recombinante expressando a proteína CMX induz resposta contra Mycobacterium tuberculosis em camundongos BALB/c [manuscrito] / Fábio Muniz de Oliveira. - 2014. 92 f. : il., figs, tabs. Orientador: Prof. Dr. André Kipnis; Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Paula Junqueira-Kipnis; Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014. Bibliografia. Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas. Apêndices. 1. Tuberculose – Tratamento – História 2. Tuberculose – Vacinação 3. Tuberculose – Controle 4. Mycobacterium tuberculosis I. Título. CDU: 616.24-002.5 iv Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Aluno (a): Fábio Muniz De Oliveira Orientador (a): Prof. Dr. André Kipnis Co-orientador (a): Prof.ª Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis Membros: 1. 2. 3. Data: v Dedico este trabalho aos meus pais, os quais sempre me apoiaram em todos os momentos da minha vida. vi AGRADECIMENTOS Quero agradecer primeiramente a Deus, pois não cai se quer uma folha de uma árvore se Deus não permitir, e com a graça e a permissão Dele, consegui a oportunidade de fazer este mestrado. “Deus a ti dou louvores e cânticos, pois o Senhor foi fiel do início ao fim. Como diz na Sua palavra, Vereis a diferença entre o que serve e o que não ao Senhor dos Exércitos”. Quero agradecer aos meus pais e meus irmãos que sempre estiveram ao meu lado nesta jornada, dando apoio em todos os momentos difíceis e se alegrando comigo nos momentos de alegria. Sou grato a Deus por ter uma família abençoada, da qual tenho muito orgulho. Quero agradecer também a minha namorada Jacqueline Souza Amaral Melo e sua família a qual foi muito importante no desenvolvimento deste projeto, vários foram os momentos que precisei de ajuda, e em todos recebi o melhor desta linda família. Muito obrigado Jacque por tudo, pela compreensão e dedicação que teve comigo nesta jornada. Quero de coração agradecer aos meus Professores de graduação Milton Camplesi e Daniela Camplesi, os quais me orientaram a fazer o mestrado, dando conselhos e motivando a fazer a melhor escolha da minha vida. Quero agradecer ao meu orientador Prof. Dr. André Kipnis, que sempre foi um exemplo de pessoa e ética, que dedicou o seu melhor em me ensinar a ser um mestre. Sempre calmo no falar e educado nas palavras, me guiou pela mão neste mestrado, aprendi muito ao lado deste grande Mestre, que com grande sabedoria me orientou. O saber é algo que todos podem adquirir, mas transmiti-lo com clareza é algo que poucos conseguem, “todas as vezes que fui a sua sala tive a certeza que iria aprender algo novo, pois o senhor sempre me ensinou. O senhor é um exemplo de pessoa e de pesquisador para mim e para todos, é um privilegio tê-lo como orientador. Admiro o que o senhor é, pois és um grande pesquisador e orientador”. Quero agradecer a minha co-orientadora Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis, a qual considero orientadora, pois tive dois orientadores!! “Tive a graça de aprender da vii senhora as maiores lições que a pesquisa poderia ensinar, estar ao lado de uma grande pesquisadora é um privilegio, e eu tenho este privilégio. Obrigado por tudo, foi muito bom aprender com a senhora, te admiro muito!” Quero agradecer a todos os colegas do Laboratório de Bacteriologia Molecular, pelo companheirismo e apoio durante a realização deste trabalho, Luana, Suellen, Aline, Lorena, Renato, Rogério, Beatriz, André, Fabiana, Aureliano e Viviane. Em especial quero agradecer ao meu amigo Lázaro Moreira Marques Neto, o qual foi um grande companheiro, não só dentro, como fora do Laboratório, “obrigado pelos conselhos e por sempre estar disposto a me ajudar”. Quero agradecer a todos os colegas do Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas, Bruna, Adeliane, Danilo, Joseane, Abadio, Marcos, Duanne, Joyce, Bruno, Rafaela, por oferecerem atenção e serem sempre dedicados em ajudar e colaborar comigo no desenvolvimento deste trabalho. Em especial quero agradecer a Minha Colaboradora Monalisa Martins Trentini ou melhor MONA, pessoa que compartilhei muito momentos felizes e tristes, uma amiga para todos os momentos, a qual foi fundamental no desenvolvimento deste projeto. Quero agradecer ao pessoal do Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia – UFG, na pessoa da Professora Aline C. Batista, que contribuiu e muito na parte histopatológica deste trabalho. Quero agradecer aos membros da banca de Qualificação, os quais foram enfáticos e dedicados em contribuir para o crescimento deste trabalho, agradeço de coração, pois aprendi muito com seus ensinamentos. Em especial quero agradecer a duas professoras que me deram a honra de compor esta banca, Professora Maria Cláudia e Professora Juliana Lamaro, que contribuíram e muito não só neste momento, mas em toda a minha formação. Quero agradecer ao CNPq pelo apoio financeiro e ao IPTSP pela a oportunidade de estudo, e a todos os funcionários que sempre fizeram o seu melhor para manter o nível desta instituição. viii Quero agradecer a todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho, obrigado a todos. ix SUMÁRIO TABELAS, FIGURAS E ANEXOS SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT xii xiii xv xvi 1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1 1.1 Histórico ................................................................................................................................. 1 1.2 Epidemiologia ....................................................................................................................... 5 1.3 Etiologia .................................................................................................................................. 6 1.4 Imunopatologia .................................................................................................................... 7 1.5 Manifestação clínica e diagnóstico .............................................................................. 13 1.6 Medidas de controle: diagnóstico, tratamento e prevenção ............................... 15 1.7 Desenvolvimento de novas vacinas ............................................................................ 18 1.8 Antígenos imunodominantes de Mycobacterium tuberculosis abordados neste trabalho ............................................................................................................................... 19 1.9 Proteína CMX ...................................................................................................................... 21 1.10 Vetor de vacina ................................................................................................................ 21 2 JUSTIFICATIVA 23 3 OBJETIVOS 24 3.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 24 3.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 24 4 MÉTODOS 25 4.1 Fluxograma das etapas do desenvolvimento deste estudo. ................................ 25 4.2 Construção dos plasmídeos recombinantes. ........................................................... 26 4.3 Preparo de M. smegmatis eletrocompetente. .......................................................... 26 4.4 Eletroporação de M. smegmatis. ................................................................................... 27 4.5 Determinação da concentração da vacina recombinante mc2-­‐CMX. ................ 27 4.6 Obtenção e determinação da concentração da vacina BCG Moreau. ............... 28 4.7 Análise da expressão da proteína recombinante CMX em M. smegmatis mc2 155 por western blotting. .......................................................................................................... 28 4.8 Ensaio de estabilidade do plasmídeo in vitro. ......................................................... 29 4.9 Animais utilizados para realização do estudo e condições físicas de manutenção. .................................................................................................................................. 29 4.10 Avaliação da imunogenicidade e persistência da vacina mc2-­‐CMX. .............. 30 4.11 Estabilidade in vivo do mc2-­‐CMX. ............................................................................... 30 x 4.12 Preparo dos inóculos vacinais. ................................................................................... 31 4.13 Imunização. ....................................................................................................................... 31 4.14 Infecção intravenosa com Mtb. .................................................................................. 31 4.15 Obtenção do soro para realização de ELISA. ......................................................... 32 4.16 ELISA. .................................................................................................................................. 33 4.17 Obtenção das células do baço. .................................................................................... 33 4.18 Obtenção das células do pulmão. .............................................................................. 33 4.19 Avaliação da produção celular de citocinas do baço e pulmão. ...................... 34 4.20 Histopatológico. .............................................................................................................. 34 4.21 Determinação da carga bacilar no pulmão. ........................................................... 35 4.22 Análise Estatística. .......................................................................................................... 35 5 RESULTADOS 36 5.1 M. smegmatis recombinante pLA71-­‐CMX expressa proteína CMX. .................. 36 5.2 mc2-­‐CMX induz resposta imune humoral específica. ............................................ 37 5.3 mc2-­‐CMX persiste por até sete dias em camundongos BALB/c e este mantém a expressão da CMX in vivo. ...................................................................................................... 37 5.4 A imunização com mc2-­‐CMX em dois momentos induz melhor resposta imune humoral específica para CMX que a BCG. ............................................................... 39 5.5 A resposta imune celular frente a infecção com Mtb. ........................................... 39 5.6 Redução das lesões pulmonares induzidas pela infecção com Mycobacterium tuberculosis pelas vacinas mc2-­‐CMX e a BCG. ...................................................................... 41 5.7 Redução da carga bacilar no pulmão de camundongos imunizados com as vacinas mc2-­‐CMX e BCG. ............................................................................................................. 43 6 DISCUSSÃO 44 7 CONCLUSÕES 50 8 REFERÊNCIAS 51 9 ANEXOS 74 9.1 Parecer do comitê de ética em pesquisa. .................................................................. 74 9.2 Artigo: Prime-­‐Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. ................ 76 xi TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Tabela 1. Esquema básico de tratamento da tuberculose para adultos e adolescentes...................................................................................................................16 Tabela 2. Possíveis explicações que possam justificar a variabilidade na eficácia protetora da BCG contra a tuberculose pulmonar em adultos...............................17 Figura 1. O mapa representa uma estimativa do número casos novos de tuberculoses no mundo no ano de 2012 e também demonstra que a tuberculose é uma doença cosmopolita...............................................................................................5 Figura 2. Ativação da resposta antígeno-específica de células T contra Mtb. Figura adaptada de Cooper 2009.................................................................................9 Figura 3. Fluxograma das etapas realizadas no desenvolvimento e avaliação da vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c............................................................25 Figura 4. Esquema de avaliação da vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c..........................................................................................................................32 Figura 5. Expressão da proteína CMX no recombinante mc2-pLA71-CMX.........36 Figura 6. Resposta imune humoral específica induzida pela vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c.................................................................................................37 Figura 7. A persistência do mc2-CMX em camundongos BALB/c..........................38 Figura 8. Gel de agarose do PCR do gene da fusão CMX........................................38 Figura 9. Resposta imune humoral específica induzida pelas vacinas salina, BCG e mc2-CMX em esquema de prime-boost em camundongos BALB/c antes e após o desafio com Mtb...........................................................................................................39 Figura 10. Total de linfócitos T CD4 no pulmão e baço dos camundongos............40 Figura 11. Porcentagem de linfócitos T CD4 produtores de citocinas próinflamatórias no pulmão de camundongos................................................................41 Figura 12. A imunização com mc2-CMX induziu menor lesão pulmonar similar a de camundongos imunizados com a BCG..................................................................42 Figura 13. Comparação do score de lesão pulmonar entre os grupos de camundongos desafiados com M. tuberculosis...........................................................42 Figura 14. Resposta imune induzida pela a imunização com mc2-CMX é efetiva no controle da infecção por Mtb......................................................................................43 xii SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, do inglês: Acquired Immunodeficiency Syndrome APCs Célula Apresentadora de Antígenos, do inglês: Antigen Presenting Cells BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente BCG Bacillus Calmette-Guérin CD Marcador de Diferenciação, do inglês: Cluster of Diferentiation CFP Proteína de Filtrado de Cultura, do inglês: Culture Filtrate Antigen DAB Diaminobenzidina DCs Células Dendríticas DNA Ácido Desoxirribonucléico, do ingle: desoxyribonucleic acid DOT Tratamento Diretamente Observado DOTS Tratamento Diretamente Observado de Curta Duração, do infles: Direc ESAT-6 Antígeno Alvo de Secreção Primária do inglês: Early Secretory Antigenic Target FITC Isotiocianato de Fluoresceína FSC Dispersão frontal, do inglês: forward scatter GlcB Malato sintase G HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IFN-γ Interferon-gama IL Interleucina INH Isoniazida KDa Quilodalton LACEN-GO Laboratório Central de Goiás LAM Lipoarabinomanana MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade de Classe MPT-51 Proteína micobacterianas de 27kDa ou Ag85D MTB Mycobacterium tuberculosis NK Células Natural Killer NO Óxido Nítrico OADC Ácido Oléico, Albumina, Dextrose e Catalase OMS Organização Mundial da Saúde xiii OPD Substrato Ortofenilenodiamina, do inglês: Ortho-Phenylenediamine Dihydrochloride PAS Para-amino-ácido do ácido salicílico PBS Tampão Fosfato Salina, do inglês: Phosphate-buffered saline PCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês: Polymerase Chain Reaction. PE Ficoeritrina PerCP Proteína Peridinina de Clorofila PI3P Fosfatidilinositol 3-fostato PNCT Programa Nacional de Controle da Tuberculose PPD Derivado Protéico Purificado de Mycobacterium tuberculosis RIOs Reativos Intermediários de Oxigênio RINs Reativos Intermediários de Nitrogênio RPMI Roswell Park Memorial Institute SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com Duodecil Sulfato de Sódio SM Estreptomicina SSC Dispersao lateral, do inglês: side scatter TB Tuberculosis TB-MDR Tuberculose Multidroga-Resistente Th Linfócito T auxiliar do inglês: T Helper TLR Receptor Semelhante ao Toll, do inglês Toll-Like Receptor TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa, do inglês: Tumor Necrosis Fator UNICEF Fundo das Nações Unidas para a Infância, do inglês: United Nations Children’s Fund USA Estados Unidos da América, do inglês: United States of America xiv RESUMO Há séculos a tuberculose (TB), doença infectocontagiosa causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), vem sendo um problema de saúde pública mundial. Mesmo após o surgimento da vacina BCG em 1921, o controle da tuberculose continua a passos lentos. Isso se deve à eficácia variável de 0 a 80% apresentada pela vacina na proteção contra TB em indivíduos adultos. Deste modo, o desenvolvimento de uma nova vacina contra a TB é necessário. Neste estudo, avaliou-se uma vacina recombinante composta por Mycobacterium smegmatis expressando a proteína de fusão CMX (mc2-CMX), formada por três antígenos do Mtb: Ag85C, MPT51 e HspX. M. smegmatis mc2 155 foi transformado com pLA71-CMX por eletroporação, sendo a expressão da proteína CMX confirmada por imunoblot. Camundongos BALB/c foram distribuídos em quatro grupos: salina, infecção, BCG e mc2-CMX. Os grupos foram imunizados com suas respectivas vacinas em dois momentos com intervalos de 15 dias, e o sangue de todos os animais coletado quinze dias após a última imunização. Trinta dias após a imunização, os animais foram desafiados com Mtb H37Rv (via endovenosa) e trinta dias após o desafio, o sangue foi coletado para realização de ELISA. Setenta dias após desafio, o pulmão e o baço de todos os camundongos foi coletado para obtenção de células para realização de citometria, histopatológico e determinação da carga bacilar. A imunização com o mc2-CMX induziu níveis maiores de anticorpos da classe IgG1 (1,910±0,70) e IgG2a (0,139±0,020) anti-CMX quando comparado com o grupo BCG (0,646±0,19 e 0,413±0,24, respectivamente, p<0,05). Estes resultados demonstram a relevância do antígeno CMX na imunogenicidade da vacina recombinante. Após setenta dias do desafio, a quantidade de células T CD4 produtoras de citocinas do tipo Th1 foi analisada no pulmão. Foi observado um aumento significativo na porcentagem de células T CD4 positivas para IFN-γ e TNF-α nos camundongos imunizados com vacina mc2-CMX, quando comparado com o grupo BCG. Camundongos desafiados com Mtb apresentaram porcentagens maiores de células produtoras de IL-2, quando comparado com o grupo não desafiado. Todavia, somente os camundongos imunizados com a vacina mc2-CMX apresentaram porcentagens significativamente maiores em comparação ao grupo infecção. A resposta imune observada foi efetiva no controle da infecção por Mtb, sendo isto confirmado quando os pulmões dos camundongos foram analisados histologicamente e a carga bacilar determinada. Os grupos vacinados com as vacinas mc2-CMX e BCG apresentaram uma redução significativa da lesão pulmonar induzida pela infecção por Mtb, e também da carga bacilar no pulmão, quando comparados com o grupo infecção. Conclui-se que mc2-CMX tem um bom potencial para ser explorado como vacina contra a TB. xv ABSTRACT For hundreds years tuberculosis (TB), a contagious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), has been a global public health problem. Even after the development of the vaccine BCG, in 1921, tuberculosis control continues on slow pace. This comes to be as a result of the variable efficacy (from 0 to 80%) presented by the vaccine in the protection against TB in adults. Therefore, the development of a new vaccine against TB is necessary. In this study, it was evaluated a recombinant vaccine composed of Mycobacterium smegmatis expressing the CMX fusion protein (mc2CMX), formed from three antigen epitopes of Mtb: Ag85C, MPT51 and HspX. M. smegmatis mc2 155 was transformed with pLA71-CMX by electroporation, and the presence of the CMX protein was confirmed by imuno blotting. BALB/c mice were distributed in four groups: saline, infection, BCG and mc2-CMX. The groups were immunized with their respective vaccines in two moments with an interval of fifteen days and the animal blood was collected fifteen days after the last immunization. Thirty days after the last immunization, the animals were challenged with Mtb H37Rv (intravenously) and thirty days after the challenge, the blood was collected to perform ELISA test. Seventy days after the challenge, the lungs from all mice were collected to obtain cells for flow-cytometry, histological analysis and also to determine the bacillary burden. The immunization with mc2-CMX induced higher levels of antibodies of IgG1 (1,910±0,70) and IgG2a (0,139±0,020) class anti-CMX when compared with BCG group (0,646±0,19 and 0,413±0,24; respectively, p<0,05). These results demonstrated the relevance of CMX antigen in the immunogenicity of the recombinant vaccine. Seventy days after the challenge, the amount of T CD4 cells in the lung producing Th1type cytokines was assessed. It was observed a significant increase in the percentage of T CD4 cells positive for IFN-γ and TNF-α in the immunized mice with mc2-CMX vaccine, when compared with the group immunized with BCG. Mice challenged with Mtb presented significant higher percentage of IL-2 producer cells when compared with the non-immunized group. However, only the mice immunized with the vaccine mc2CMX presented significant higher percentage when compared with the infection group. The immune response induced by the vaccine was effective in the control of Mtb infection, confirmed by the histological analysis and the bacillar burden determined. The groups vaccinated with mc2-CMX and BCG presented a significant reduction of the lung lesion induced by the Mtb infection, and also lung bacterial load, when compared with the infection group. Thus, the recombinant vaccine mc2-CMX presents potential characteristics to be used in the prevention of TB. xvi 1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1.1 Histórico Conhecida na Grécia antiga como pthisis ou consumação, a tuberculose já era problema de saúde pública. Hipócrates, por volta de 460 A.C., registrou que esta doença atingia os maiores contingentes populacionais de seu tempo e era quase fatal, tempo em que a maioria dos autores acreditava que a doença era hereditária. Já Aristóteles (384322 A.C.) a considerava contagiosa. Clarissimus Galen, médico de maior expressão após Hipócrates, definiu pthisis como ulceração dos pulmões, peito ou garganta, acrescida de tosse, febre baixa e perda de peso (PEASE, 1940). A tuberculose foi conhecida também como ‘peste branca’ no início do século XVII, devido à uma grande epidemia que persistiu por aproximadamente duzentos anos. Durante este período surgiram pesquisadores como Laennec, lembrado por ter inventado o estetoscópio, que elucidou a patogênese da tuberculose e estabeleceu as formas da doença em pulmonar ou extrapulmonar. Já o militar Francês Jean-Antoine Villemin demonstrou a infecção natural da tuberculose, quando inoculou uma pequena quantidade de material tuberculoso em coelhos (DANIEL, 2006). Todavia, somente em 1830 que o termo tuberculose foi usado pela primeira vez por Shönlien, para definir a doença (LIGON, 2002). O grande marco histórico da tuberculose aconteceu em 24 de março de 1882, quando o Dr. Hermann Heinrich Robert Koch em sua apresentação intitulada "Die Aetiologie der Tuberculose" na audiência da Berlin Physiological Society (Sociedade de Fisiologia em Berlin - Alemanha), demonstrou de forma categórica o agente etiológico da doença, o Bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis), o que lhe rendeu o prêmio Nobel de Medicina em 1905. Na mesma ocasião ele também apresentou critérios adaptados de Jacob Henle para estabelecer a etiologia das doenças infecciosas, publicados e conhecidos como ‘Postulados de Henle-Koch’ em 1890 (DANIEL, 2005b). O tratamento da tuberculose inicialmente baseou-se na administração de arsênio e ouro, mas, eram muitos os efeitos adversos (BENEDEK, 2004). Na metade do século XIX os doentes começaram a se recolher em sanatórios, onde além de descansar, recebiam cuidados médicos, dietas ricas em proteínas, e faziam exercícios monitorados 1 (DANIEL, 2006). Em 1895, a descoberta dos raios-X por Wilhelm Konrad Von Röntgen significou um grande avanço no diagnóstico e acompanhamento da doença. Em 1902, Albert Calmette e Camille Guérin obtiveram uma cultura da cepa de Mycobaterium bovis virulenta, isolada por Edmond Nocard do leite de uma vaca com mastite tuberculosa bovina, a “Lait Nocard” (BARRETO et al., 2006). Frustrados com a formação de grumos no meio de cultura, eles adicionaram bile bovina ao meio, no intuito de diminuir esta formação. Contudo, a adição desta substância não diminuiu a formação de grumos na cultura, entretanto, ao avaliar a virulência da cepa em porquinhos-da-índia foi observado um decréscimo da mesma. Após 200 passagens da cepa em meios de cultura com bile bovina, e em seguida em animais de laboratório, foi isolada uma nova cepa de M. bovis atenuada. E para avaliar esta como possível candidata à vacina contra TB, a injetaram em uma vaca (DANIEL, 2005a). Com 231 subcultivos sucessivos do M. Bovis Lait Nocard em meios de cultura realizados a cada três semanas, foi alcançada a total atenuação do mesmo (PEREIRA et al., 2007). O que resultou na perda de aproximadamente 130 genes que estão agrupados principalmente na região de diferença 1 (RD1), a principal responsável pela atenuação. Em 1921, após 13 anos de estudos, os pesquisadores Calmette e Guérin liofilizaram o BCG (Bacillus Calmette-Guérin) que é o M. bovis atenuado, no Instituto Pasteur (BARRETO et al., 2006). Em colaboração com o Dr. Benjamin Weill-Hallé e Raymond Turpin no Hospital Charité em Paris, em Julho de 1921, Calmette e Guérin, administraram 6 mg de BCG por via oral a um bebê com 3 dias de vida, cuja a mãe havia morrido de tuberculose pulmonar, um dia após o seu nascimento. O bebê ficou sob os cuidados da avó que tinha baciloscopia positiva, e doses adicionais de BCG foram dadas ao bebê nos dias 5 e 7 de vida. Seis meses depois, eles examinaram o bebê e o mesmo não apresentava sinais de tuberculose, apesar da exposição constante (DANIEL, 2005a). O primeiro estudo clínico realizado entre 1921 e 1927 na França e Bélgica, confirmou que a BCG era altamente eficaz na proteção contra tuberculose em crianças. Na França, a BCG era administrada por via oral no leite, porém, a administração da vacina foi interrompida em 1930, em consequência do desastre de Lubeck, no qual 67 dos 249 bebês, que receberam a vacina, morreram devido à negligente contaminação da vacina com uma cepa de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Após este incidente, alguns países priorizaram a administração da BCG pela via intradérmica, sendo uma medida necessária para segurança da vacinação em massa. Em 1950 a vacina BCG já 2 era recomendada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) (ANDERSEN et al., 2005). Em 1948, foi realizada uma notável campanha objetivando o controle da tuberculose, com o patrocínio da UNICEF (Fundo das Nações Unidas para a Infância) e da Cruz Vermelha Dinamarquesa. O programa era baseado no teste da tuberculina seguida pela vacinação com BCG dos não reativos. Durante três anos, aproximadamente 30 milhões de pessoas fizeram o teste de tuberculina e 14 milhões de pessoas foram vacinadas com BCG. O programa foi de fato, o primeiro programa de controle da tuberculose organizado por uma agência da OMS (COMSTOCK, 1994). Com a descoberta das sulfonamidas e penicilina na década de 30 do século XX, a existência de uma terapia antimicrobiana eficaz tornou-se realidade. Iluminado pelas observações que micróbios de solo pareciam ser capazes de prevenir o crescimento de outras espécies “em seu território”, Selman Waksman, pesquisador em New Jersey, identificou a estreptomicina (SM) em 1944. No mesmo período, Jorgen Lehman trabalhando na Suécia, descrevia o para-amino-ácido do ácido salicílico (PAS). Rapidamente cogitou-se o uso destes dois agentes que apresentavam claramente, atividade contra o Mtb. Em estudos realizados na década 50 comparando os dois agentes, observou-se que a combinação dos mesmos era mais eficaz no tratamento contra tuberculose, prevenindo o aparecimento de resistência (BIGNALL, 1950; ISEMAN, 2002; MURRAY, 2004). A isoniazida (INH), a primeira droga micobactericida foi produzida em 1952 e as rifamicinas em 1957. Uma nova era para o tratamento da tuberculose havia surgido (DANIEL, 2005b). Novas drogas foram descobertas no decorrer do tempo permitindo que novos esquemas terapêuticos fossem introduzidos, o uso destas drogas sugeriu que a tuberculose seria um problema controlável, uma doença perto da eliminação (COSTA, 1988). Porém, com o aparecimento de resistência aos fármacos usados primariamente no tratamento, esquemas terapêuticos compostos por mais de dois fármacos, como o de 1965 tiveram que ser implementados. Este consistia na administração combinada da SM, INH e PAS, durante 12 meses, surgindo um novo regime de tratamento (RUFFINO-NETTO, 2002). O esquema de tratamento de menor duração (6 meses), utilizando a rifampicina (RMP) no lugar da SM (RMP+INH+Pirazinamida (PZA)) foi introduzido em 1979 (RUFFINO-NETTO, 2002). Este era mais eficaz e menos tóxico que os anteriores, sendo então implementado de forma pioneira em todo mundo (CAMPOS, 2007). Por 3 apresentar estas caraterísticas, o esquema terapêutico de curta duração tinha como proposta, diminuir o abandono do tratamento. Todavia isto não foi observado na prática, houve um aumento no número de abandono dando origem ao fenômeno da multirresistência, no qual algumas cepas do bacilo conseguem neutralizar a ação de algumas drogas usadas no tratamento. Com o advento da epidemia da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), o números de casos de tuberculose voltaram a aumentar a partir da década de 80 do século passado, iniciando assim a pesquisa por programas de tratamento que pudessem auxiliar no controle da doença e evitar o aparecimento de cepas resistentes aos fármacos (MURRAY, 2004; KWAN et al., 2011). Nesse contexto foi preconizado o programa DOT – Tratamento Diretamente Observado, que era um regime baseado em 68-78 encontros com o paciente durante os seis meses de tratamento, que tinha como objetivo supervisionar a evolução do prognóstico do paciente. Este foi implementado primariamente no Estados Unidos da América (USA) na década de 90, levando a uma redução significativa no número de casos de tuberculose, chegando aos 7,8% ao ano, entre 1995 e 2000. Em 1993 o programa DOT foi modificado de acordo com recomendações da OMS para Tratamento Diretamente Observado de Curta duração – DOTS, sendo uma estratégia de ação para o controle da doença, com algumas recomendações que incluíam o comprometimento dos governos, principalmente na garantia de suprimento dos medicamentos. O DOTS foi implementado em vários países inclusive no Brasil em 1996 (SHRESTHAKUWAHARA R. et al.; ISEMAN, 2002; RUFFINO-NETTO, 2002). Atualmente, a OMS recomenda como abordagem de cuidados e controle da tuberculose, o programa Stop TB Strategy, que foi lançado em 2006 com objetivo de reduzir pela metade o número de casos e mortes por tuberculose até 2015, com relação aos índices de 1990, e eliminar a doença como um problema de saúde pública mundial até 2050. O plano está dividido em seis itens: expandir a estratégia mundial DOTS com qualidades; visar a co-infecção TB/HIV, tuberculose multidroga-resistente (TB MDR) e as necessidades de populações pobres e vulneráveis; fortalecer o sistema de saúde baseado na atenção primária; esclarecer as pessoas com a tuberculose e a sociedade civil organizada; envolver todos os prestadores de serviços de saúde; e possibilitar e promover pesquisas (WHO, 2012). 4 1.2 Epidemiologia Segundo a OMS, a tuberculose é atualmente a segunda principal causa de morte por doença infecciosa, ficando atrás somente da SIDA (WHO, 2013). De acordo com o último relatório anual da tuberculose emitido pela OMS, o número de óbitos resultante da infecção pelo Mycobacterium tuberculosis foi de 1,3 milhões, incluindo neste total 300 mil mortes de pacientes HIV positivo. A doença apresenta uma incidência média mundial de 122 casos por 100.000 habitantes, com o registro de 8,6 milhões de casos novos no ano 2012 (WHO, 2013). Isto demostra que a tuberculose ainda é um problema de saúde pública que demanda atenção especial. O Brasil também apresenta dados preocupantes, com uma incidência de 46 casos por 100.000 habitantes sendo que, em 2012, foram notificados 71.230 casos novos e 4.900 óbitos, incluindo-o entre os 22 países responsáveis por 81% dos casos notificados em todo mundo (WHO, 2013). Outro fator preocupante é o aumento nos números de casos novos de TB MDR no Brasil, passando de 560 em 2011 para 850 em 2012 (WHO, 2012; 2013). No estado de Goiás, a incidência da tuberculose em 2011, foi de 13,6 por 100.000 habitantes, registrando 826 casos de tuberculose no estado (MS/SVS, 2012). Figura 1. O mapa representa uma estimativa do número casos novos de tuberculoses no mundo no ano de 2012. Adaptado de WHO, 2013. 5 1.3 Etiologia Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose é uma bactéria aeróbica, intracelular facultativa que possui a forma de bastonetes retos e finos, que pode sobreviver na ausência quase total de água durante semanas. Resistente ao processo de descoloração pelo álcool-ácido, o bacilo é classificado como um bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) (ADEREM et al., 1999). Mtb apresenta crescimento lento, se duplicando a cada 12-20h, em temperatura ideal de 34-38°C. Para o seu crescimento in vitro é necessário realizar a cultura do bacilo em meio Löwestein-Jensen ou em meio ágar como o 7H10/7H11 Middlebrook, e somente após 2-6 semanas de cultivo, nas condições apropriadas, é possível visualizar as suas colônias, as quais são secas e de superfície irregular, sendo inicialmente branco-cremosas tornando-se posteriormente amareladas (CRUMP et al., 2003; ADLER et al., 2005; KONEMAN, 2008). Mtb pertence a um complexo chamado Complexo Mycobacterium tuberculosis que é constituído por outras seis espécies e subespécies que incluem M. africanum, M. bovis, M. canetti, M. microti, M. pinnipedii e M. caprae sendo que, somente as duas primeiras espécies citadas, juntamente com Mtb, causam tuberculose em humanos (ROBERTS, 1991). Os constituintes desse complexo possuem características comuns, como o período de crescimento lento e pouca variação genética, levando a hipótese de que são patógenos que derivam de um ancestral comum (ERNST et al., 2007). A parede celular do Mtb é complexa, pois é rica em glicolipídeos, polissacarídeos, lipídeos e proteínas que estão envolvidas na ativação e na regulação da resposta imune do hospedeiro (COLLINS et al., 2001). Esta é composta por uma camada interna de peptidoglicano, sutilmente diferente das presentes nas demais micobactérias. Ligados covalentemente ao peptidoglicano, estão ramos de polissacarídeos, os arabinogalactanos, cuja porção final é esterificada com ácidos graxos de alto peso molecular, os chamados ácidos micólicos. Além disso, há uma variedade de lipídeos livres ligados à parte externa da parede celular e uma grande quantidade de glicolipídeos ancorados na membrana plasmática. Intercaladas à rede existe uma quantidade significativa de proteínas que podem ser permanentes ou se encontram em processo de secreção (BRENNAN et al., 1995; DAFFE et al., 1998). A parede celular dá a forma característica do bacilo conferindo proteção, principalmente da ação 6 mecânica de enzimas hidrolíticas e radicais tóxicos produzidos pelas células fagocíticas (BRENNAN, 2003). A infecção por Mtb ocorre preferencialmente pela via respiratória, quando um indivíduo com doença ativa, portador de lesão pulmonar, pode, ao tossir ou ao falar, eliminar uma carga bacilar, diluída num aerossol no ambiente. As partículas contendo os bacilos (gotículas de Flügge), ao serem expostas ao vento e aos raios solares, são ressecadas e passam a ter volume ainda menor (núcleos de Wells), com diâmetros de até 5 µm e com 1 a 2 bacilos em suspensão, passíveis de serem inalados e atingirem o pulmão das pessoas daquele ambiente. Vários fatores ambientais reduzem as probabilidades das partículas infectantes serem inaladas: as correntes de ar dispersando as partículas no ambiente, a luz ultravioleta (sol) e a radiação gama destruindo os bacilos. Mas se a inalação acontecer, esses indivíduos podem ser infectados podendo desenvolver doença ativa (CAMPOS, 2006). O estabelecimento da doença ativa depende de fatores associados ao bacilo, como a virulência da cepa infectante, a quantidade de bacilos viáveis que atingem o pulmão e a fatores do hospedeiro, como a capacidade de resposta imune e a sua predisposição genética (COLLINS et al., 2001). 1.4 Imunopatologia Ao chegar no interior do pulmão, os bacilos são fagocitados rapidamente pelas células fagocíticas, particularmente macrófagos alveolares, células dendríticas (DCs) locais, macrófagos intersticiais e, eventualmente, quando passarem para os bronquíolos pulmonares, poderão ser fagocitados por células epiteliais (OTTENHOFF, 2012a). Ao fagocitar Mtb, o macrófago gera uma vesícula endocítica que se funde com lisossomas repletos de substâncias lesivas formando o fagolisossoma, visando a destruição do bacilo. Dentro do fagolisossomo, o ambiente é hostil para Mtb, que sofre a ação do pH ácido, de reativos intermediários de oxigênio (RIOs) e nitrogênio (RINs), de enzimas serina esterases e de peptídeos tóxicos (KAUFMANN, 2001; 2002; ROHDE et al., 2007). Aparentemente, os RINs são a arma mais potente do macrófago contra as micobactérias virulentas (CHAN et al., 1992; CHAN et al., 1995; MACMICKING et al., 1997). No entanto o glicolipídeo Lipoarabinomanana (LAM), principal componente da parede celular do bacilo, pode impedir a formação do fagolisossoma, inibindo a fosforilização do fosfatidilinositol 3-fostato (PI3P) etapa importante na maturação do 7 fagossoma, que irá se fundir com o lisossoma. Com isso Mtb permanece dentro do endossoma primário, o qual é um ambiente favorável para o seu crescimento (DERETIC et al., 2006; SHALER et al., 2012). Além de inibir a maturação do fagolisossomo, Mtb apresenta outras habilidades que retardam o início da resposta imune adaptativa por até 2-3 semanas, tanto em humanos como em camundongos (OTTENHOFF et al., 2012). Estudos nos quais foram usados camundongos transgênicos que apresentavam na superfície das células T receptores específicos para antígenos do Mtb, demostraram que a ativação da resposta específica de células T contra bacilo, ocorria somente nos linfonodos drenantes do pulmão. Adicionalmente, foi evidenciado que o transporte das células infectadas com Mtb do parênquima pulmonar para os linfonodos era significativamente demorado, ocorrendo somente após 1 a 2 semanas após a infecção (ULRICHS et al., 2006; GALLEGOS et al., 2008; REILEY et al., 2008; WOLF et al., 2008) (figura 1). Estas estratégias adaptativas do Mtb permitem o estabelecimento da infecção e o aumento da população bacilar no local (OTTENHOFF et al., 2012; REECE et al., 2012). Em adição às habilidades de inibir a maturação e fusão do fagossoma com o lisossomo e retardar o início da resposta imune específica, Mtb é capaz também de manipular e persistir no interior de células hospedeiras, particularmente em células fagocíticas profissionais, utilizando outros mecanismos de evasão do sistema imune. Entre outros mecanismos o bacilo possui a capacidade de inibir a autofagia; inibir a apoptose celular e induzir a morte celular por necrose; inibir o processamento e a apresentação de antígenos às células T impedindo seu reconhecimento; inibir a via de sinalização mediada pelo receptor de interferon-gama (IFN-γ) que é uma das vias mais importantes na defesa contra esse microrganismo, que regula vários mecanismos imunes do hospedeiro; inibir a formação de reativos de oxigênio e nitrogênio que tem ação microbicida e evasão do ambiente hostil do fagossoma para dentro do citoplasma, um ambiente mais favorável (GUTIERREZ et al., 2004; DERETIC, 2006; ROHDE et al., 2007; SAHIRATMADJA et al., 2007; VAN DER WEL et al., 2007). O conjunto de estratégias de evasão do sistema imune do Mtb, possibilita a sua resistência e escape da defesa do hospedeiro estabelecendo a infecção (OTTENHOFF, 2012a). 8 Figura 2. Ativação da resposta antígeno-específica de células T contra Mtb. Figura adaptada de (COOPER, 2009). Ao entrar em contato com Mtb, células dendríticas migram para o linfonodo drenante com objetivo de apresentar os antígenos do bacilo as células T virgens. Estas serão ativadas tornando-se células T efetoras específicas contra o patógeno, no entanto este processo é retardado por mecanismos de evasão do bacilo. Com isso, a geração de uma resposta imune celular específica contra o Mtb, demora de 18-20 dias após a infecção. Após o estabelecimento da infecção, há um acúmulo de células no local da infecção tais como neutrófilos, monócitos inflamatórios, macrófagos e células dendríticas durante a fase inicial da resposta inata (ERNST, 2012). O resultado do recrutamento de macrófagos e outras células e sua agregação e organização, representa o passo inicial para a formação do granuloma (PHILIPS et al., 2012). Durante os estágios iniciais da formação deste, uma fração dos macrófagos infectados afastam-se do granuloma nascente. A morte destes, leva a liberação dos bacilos no espaço extracelular, disseminando a infecção em outros locais do tecido pulmonar (DAVIS et al., 2009). Com o início efetivo da resposta imune adaptativa, células T específicas para antígenos do Mtb infiltram também para dentro do granuloma, levando à formação e reorganização deste, em que os bacilos juntamente com os macrófagos ficam preferencialmente no centro e células T na periferia. Em contraste do que se acredita, os granulomas são estruturas dinâmicas que podem aumentar rapidamente o influxo e efluxo de células hospedeiras, como demonstrado em modelos peixe-zebra no qual foi estudado este fenômeno (DAVIS et al., 2002; RAMAKRISHNAN, 2012). Egen et al. (2008), demonstrou também o dinamismo do granuloma quando infectou camundongos 9 com BCG por via endovenosa, observando no fígado destes uma migração inicial de células de Kupffer (macrófagos residentes do fígado) e macrófagos derivados de monócitos após 2-3 semanas de infecção. Porém, ele observou que estas células mieloides estavam relativamente estáticas, embora suas membranas pareciam estar em constante fluxo. Quando o controle da infecção e inflamação não é devidamente balanceado, desenvolve-se assim necrose caseosa central no granuloma, o que facilita o crescimento extracelular de um grande número de bacilos no local da infecção (DORHOI et al., 2011). Logo que o granuloma necrosante começa a se liquefazer e produzir danos no tecido pulmonar, um grande número de bacilos é liberado tornando-se passível de ser transmitido por aerossol (OTTENHOFF, 2012a). Durante os primeiros cinco anos de infecção o risco de transmissão é alto, diminuindo substancialmente depois deste período (LAWN et al., 2011). Inicialmente, a probabilidade de desenvolvimento da tuberculose, após a inalação do aerossol contendo o bacilo, é pequena, com uma estimativa de risco de 5 a 10% de desenvolvimento da doença ativa (LAWN et al., 2011). O desenvolvimento de uma resposta imune contra Mtb é importante para o controle da infecção, embora não esteja totalmente esclarecida, esta resposta envolve diferente tipos celulares, variando da clássica resposta de células T à ação de neutrófilos, células B, “natural killer” (NK), dentre outras (OTTENHOFF, 2012a). A resposta imune mediada por células T tem um papel muito importante no controle da infecção de Mtb. Os linfócitos T CD4, são células que reconhecem peptídeos processados e apresentados por via Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe II (MHC II), de células apresentadoras, como as DC. Inicialmente, ao migrar do pulmão infectado para o linfonodo, as DCs entram em contato com células T virgens, as quais são ativadas primariamente, com apresentação de peptídeos do Mtb via MHC II. Contudo, a total ativação e diferenciação destas células é dependente de outros sinais, como o realizado por moléculas co-estimuladoras, como CD80, CD86, CD40, CD27, e 4-1BB/CD137, e também pelo sinal executado pela principal citocina produzida na infecção por Mtb, a Interleucina 12 (IL-12), ocorrendo então a ativação e diferenciação do linfócito T CD4+ em linfócito T-helper tipo 1 (Th1 CD4+) (OTTENHOFF et al., 2012). Os linfócitos T helper tipo 1 (Th1) produtores de IFN-γ, principal citocina envolvida na ativação de macrófagos (BOEHM et al., 1997), são cruciais na proteção 10 contra a tuberculose. Isto é evidenciado com o aumento do risco de desenvolver a doença ativa, em indivíduos com deficiência nas vias de sinalizações de IFN-γ e Interleucina-12 (OTTENHOFF et al., 2005), e também a partir da associação entre a depleção de células T CD4+ e elevada susceptibilidade à tuberculose em indivíduos HIV positivos (LAWN et al., 2009). Camundongos CD4-/- e MHCII-/- são incapazes de controlar o crescimento bacteriano e sucumbem à infecção significativamente mais cedo do que camundongos selvagens homólogos (CARUSO et al., 1999). Apesar da importância que as células T CD4 tem no controle da infecção do Mtb ser bastante evidente, os mecanismos pelos quais elas mediam esta proteção ainda não estão bem definidos (COOPER, 2009; COOPER et al., 2012). As células Th1 CD4+ secretam também outras citocinas que são importantes na imunidade protetora contra a infecção de micobactérias (KAUFMANN, 2011), tais como o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) principal mediador da resposta inflamatória aguda em infecções causadas por microrganismos intracelulares e Interleucina-2 (IL-2) que induz a expansão de células T amplificando a resposta efetora destas (WILLIAMS et al., 2006; SEDER et al., 2008). Já está bem caracterizada a existência de vários subtipos de células T CD4+ efetoras, variando incialmente de células produtoras de IL-2, para células que secretam IFN-γ, e até células multifuncionais capazes de produzir ao mesmo tempo IL-2, IFN-γ e TNF-α, as quais são correlacionadas também com a proteção (DARRAH et al., 2007). Juntamente com ativação das células Th1 CD4+, pode ocorrer também a proeminente ativação de outro subtipo de linfócito Th, os Th17. Recentemente, observou-se que este subtipo de células T produz IL-17A, IL-17F e TNF, preferencialmente, mas também a IL-22 e em alguns casos IFN-γ. Os linfócitos Th17 são células pro-inflamatórias que estão envolvidas na resposta imune contra bactérias e fungos extracelulares, particularmente na superfície das mucosas (OTTENHOFF, 2012a). Estudos indicam que as células Th17 são importantes na fase inicial da infecção, surgindo no início da imunidade adaptativa, contribuindo na defesa do hospedeiro ativando principalmente neutrófilos contra Mtb (KHADER et al., 2007; COOPER, 2009). Diferente das células Th1 e Th17, que apresentam um papel importante no controle da infecção pelo Mtb, as células T helper CD4+ tipo 2 (Th2) produtoras de Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-5 (IL-5) e Interleucina-13 (IL-13), não estão correlacionadas com a proteção contra tuberculose, apesar delas estarem envolvidas na 11 regulação da imunidade humoral. A IL-4 por exemplo, secretada por células Th2, desregula a defesa do hospedeiro na hanseníase e na TB, similar a coinfecções com helminto em camundongos (SALGAME et al., 1991). Assim, o aumento desta interleucina em indivíduos, está associado com o aumento de lesões no pulmão (ORDWAY et al., 2004). Pessoas de países em desenvolvimento que estão mais expostas ao Mtb, podem apresentar um aumento significativo de IL-4 o que compromete a ação efetora de células Th1, dificultando o controle da infecção e consequentemente favorecendo a transmissão de TB (TAN et al., 2012). Embora o papel dos linfócitos T CD8+ na TB não esteja tão claro como os dos linfócitos T CD4+, eles são geralmente reconhecidos por contribuírem na geração de uma imunidade ideal e protetora capaz de conter a infecção por Mtb (OTTENHOFF, 2012b). Em camundongos, as células T CD8+ contribuem na proteção contra a rápida progressão da infecção por Mtb; camundongos deficientes em células T CD8+ infectados com M. tuberculosis sucumbem mais cedo que camundongos selvagens, contudo mais tardiamente que camundongos deficientes em células T CD4+ (MOGUES et al., 2001). As células T CD8+ são capazes de reconhecer antígenos em células não fagocíticas através do MHC de classe I, como as células epiteliais que podem ser infectadas pelo Mtb (HERNANDEZ-PANDO et al., 2000). Todas as células nucleadas expressam moléculas de MHC de classe I, isto implica que as células T CD8+ podem reconhecer uma grande variedade de células que possam estar infectadas por Mtb. Estas apresentam mecanismos efetores únicos, como secreção de grânulos com moléculas citotóxicas, tais como perforinas e granzimas, que podem matar as células infectadas e o Mtb, dessa forma, as células T CD8 são importantes no desenvolvimento de uma resposta imune protetora contra a tuberculose (OTTENHOFF, 2012a). Os linfócitos B são capazes de reconhecer macromoléculas (incluindo proteínas, polissacarídeos, lipídeos e ácidos nucleicos), bem como pequenos grupamentos químicos e partes de macromoléculas. Estes, ao contrário dos linfócitos T, reconhecem os antígenos em sua conformação natural, sem a necessidade de um processamento prévio. Este reconhecimento se dá nos folículos linfóides do baço, linfonodos e tecidos linfóides associados às mucosas (ABBAS, 2006). A perfeita ativação das células B depende da cooperação das células T CD4+. As células T CD4+ atuam na ativação das células B através da produção de IL-4 e IL-5, bem como pela interação entre CD40 e CD40-ligante. Os linfócitos B ativados se 12 diferenciam em células produtoras de anticorpos. Estes podem estimular a proliferação, a sobrevivência e diferenciação de células T (ABEBE et al., 2009). Apesar da produção de anticorpos não ser considerada importante na proteção contra o M. tuberculosis, a opsonização, um dos mecanismos efetores destes, tem se mostrado importante durante a infecção por Mtb. Alguns estudos têm observado um aumento na internalização e morte da micobactéria por neutrófilos e macrófagos na presença de anticorpos específicos (BROWN et al., 2003; DE VALLIERE et al., 2005). Outros demonstraram inclusive que, quando a micobactéria está revestida por anticorpos específicos, o processamento e apresentação por DCs é mais efetivo, induzindo uma resposta tanto de células T CD4+ como de CD8+ (TEITELBAUM et al., 1998; PETHE et al., 2001; CHAMBERS et al., 2004). 1.5 Manifestação clínica e diagnóstico A maioria dos indivíduos infectados (90%) desenvolve a forma latente e assintomática da doença. Uma pequena porcentagem desses, (cerca de 10%) pode apresentar reativação da infecção, geralmente como consequência de uma infecção secundária, imunossupressão, tabagismo, desnutrição, consumo alcoólico, condições sanitárias precárias ou elevado grau de exposição, podendo desenvolver a TB ativa que, quando não tratada, mata em torno de 50% dos indivíduos doentes (PHILIPS et al., 2012). A principal manifestação clínica da doença é a forma pulmonar, cujos principais sintomas são: tosse produtiva com mais de 15 dias, febre vespertina baixa, suor noturno, dor no tórax e perda de peso. A suspeita clínica da TB começa com quadro clínico constituído por febre baixa, geralmente vespertina, cansaço excessivo, sudorese noturna, anorexia, perda de peso e indisposição. As outras manifestações clínicas da doença são várias dependendo principalmente do órgão acometido pelo agente, incluindo a pleural, ganglionar, óssea, meníngea, entre outras (CAMPOS, 2006). Por ser uma doença infecciosa, faz-se necessário a confirmação diagnóstica por meio da identificação do Mtb em amostras da lesão. A realização da baciloscopia associada aos sintomas clínicos são as principais metodologias usadas para o diagnóstico da doença. No entanto, a baciloscopia que é baseada na pesquisa de bacilos álcool ácido resistentes (técnica de coloração de Ziehl Neelsen), apresenta baixa sensibilidade (34% a 60%), sendo necessário de 5.000 a 10.000 bacilos por mL para sua 13 identificação, o que inviabiliza o diagnóstico de indivíduos que apresentam baixa carga bacilar (L.J. et al., 2009). A prova laboratorial confirmatória da infecção é a cultura em meio de Löwenstein-Jensen (LJ), que em casos pulmonares com baciloscopia negativa, a cultura do escarro pode aumentar em até 30% o diagnóstico da doença. Assim, a cultura em meio LJ é considerada como “padrão ouro” para o diagnóstico de tuberculose, porém além de demorar pelo menos 3 semanas para ter um crescimento positivo, de acordo com o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT), ela só deve ser solicitada quando há falha no tratamento (MS/SVS, 2010). Além dos métodos clássicos de diagnóstico da tuberculose novas técnicas foram desenvolvidos utilizando biomarcadores genéticos e imunológicos, tais como Xpert MTB/RIF e o IGRA (do inglês Interferon-gamma relase assay). O teste Xpert® MTB/RIF é um teste de amplificação de ácidos nucléicos utilizado para detecção de M. tuberculosis e para a triagem de cepas resistentes a fármacos. O teste consiste na purificação, concentração e amplificação de ácidos nucléicos por reação em cadeia da polimerase em tempo real e na identificação de seqüências de ácidos nucléicos no genoma Mtb, especificamente do gene rpoβ. A diferença deste para os demais testes de amplificação de ácidos nucléicos utilizados na detecção de TB é que a plataforma do dispositivo de teste, o GeneXpert, integra e automatiza os três processos (preparação de amostras, amplificação e detecção), necessários para a PCR em tempo real baseada em testes moleculares. O teste Xpert® MTB/RIF é atualmente único, pois utiliza um cartucho contendo todos os elementos necessários para a reação, incluindo reagentes liofilizados, tampões líquidos e soluções de lavagem. O teste pode fornecer resultados num laboratório local, em menos de 2 horas, sem necessitar de tratamento da amostra ou de recursos humanos especializados em biologia molecular. Esse método detecta simultaneamente Mtb e a resistência à rifampicina pela amplificação, por meio de PCR, de cinco sondas sobrepostas que são complementares à região determinante da resistência à rifampicina, composta por 81 pares de bases do gene rpoβ de M. tuberculosis. Em seguida, esta região é examinada com o objetivo de identificar mutações associadas à resistência à rifampicina. O processo de amplificação por PCR, neste teste, é heminested e o alvo amplificado é detectado em tempo real por fluorescência. Neste processo, dois conjuntos de primers são utilizados em duas reações sucessivas. Na primeira PCR, um par de primers é usado para gerar produtos de DNA, que podem conter produtos amplificados a partir de áreas não-alvo. Os produtos da 14 primeira PCR são, então, usados como modelo em uma segunda PCR, usando um primer diferente, cujo sítio de ligação esteja localizado dentro do primeiro produto amplificado, consequentemente, aumentando a especificidade da reação (VAN RIE et al., 2010; NICOL et al., 2011; TOOSKY et al., 2014). Já os testes baseados no IGRA quantificam a produção de IFN-γ por células T sensibilizadas com antígenos do Mtb. Dois tipos de IGRA estão disponíveis comercialmente: o QuantiFERON TB Gold, (Cellestis Ltd, Carnegie, Australia) e o TSPOT.TB (Oxford Immunotech, Abingdon,UK). Ambos utilizam os antígenos ESAT-6 e CFP-10 como estímulo para as células produzirem IFN-γ, mas as técnicas em que se baseiam são diferentes, o ELISA e ELISpot, respectivamente. Uma nova versão do QuantiFERON TB foi desenvolvida, e uma das melhorias técnicas foi a adição do antígeno TB 7.7, também codificado pela região RD1 ausente no M. bovis BCG, passando a se chamar então QuantiFERON-TB Gold IT, também disponível comercialmente (PAI et al., 2004; SONG et al., 2013). 1.6 Medidas de controle: diagnóstico, tratamento e prevenção A dificuldade de se controlar a tuberculose no Brasil, e em muitos países do mundo, acontece por diversos fatores, que incluem o diagnóstico, tratamento e prevenção. Como já exposto acima, a baixa sensibilidade dos métodos de diagnóstico não permite a detecção de todos os casos esperados de TB e, consequentemente, permite que indivíduos doentes não diagnosticados disseminem o bacilo. A terapia para a tuberculose envolve o emprego de uma combinação de drogas específicas, por um período longo para evitar o desenvolvimento de cepas resistente aos fármacos empregados. Recentemente, foi adotado no Brasil, o esquema de tratamento único para casos novos e recidivas, que envolve o uso de quatro fármacos: Rifampicina (R), Isoniazida (H), Pirazinamida (Z) e Etambutol (E). Este esquema é dividido em duas fases: a intensiva que consiste em dois meses de medicação com doses fixas RHZE; e a de manutenção que é composta por RH por quatro meses (tabela 1.). Com um período de seis meses de duração, o tratamento de curta duração, quando empregado corretamente, leva à cura do indivíduo (MS/SVS, 2010). Apesar de bastante eficiente, este esquema apresenta por sua vez problemas como reações adversas aos fármacos e alívio dos sintomas da doença após a terceira semana de tratamento, o que leva os pacientes que não foram orientados corretamente, a abandonar o tratamento, permitindo que a doença reative com o agravante de os bacilos 15 infectantes daquele paciente terem grandes chances de desenvolver resistência a um ou mais fármacos (CAMPOS, 2007). Tabela 1. Esquema básico de tratamento da tuberculose para adultos e adolescentes. Tabela adaptada do Informe Técnico de Tuberculose publicado em julho de 2010 pela Secretária de Vigilância em Saúde/MS. R – Rifampicina; H – Isoniazida; Z – Pirazinamida; E – Etambutol. A prevenção da tuberculose consiste em evitar o contato de indivíduos saudáveis com pacientes com TB ativa, pois a transmissão do bacilo ocorre na maioria das vezes pela via aérea. Calcula-se que em uma determinada comunidade, durante um ano, uma única fonte de infecção poderá infectar, em média, de 10 a 15 pessoas que com ela tenham tido contato (CAMPOS, 2006). Hoje, a principal arma disponível para prevenção da TB é a vacina BCG, que foi desenvolvida em 1921 por Calmette e Guérin. Esta é empregada mundialmente no controle da tuberculose, sendo administradas anualmente 120 milhões de doses da vacina. Cada dose contém de 200 mil a um milhão de bacilos (BCG) por dose vacinal (0,1 mL), a qual é administrada por via intradérmica, no braço direito de recém-nascidos que tenham peso igual ou superior a 2 kg. Estima-se atualmente que mais de 4 bilhões de pessoas foram imunizadas com a mesma, atingindo em alguns países uma abrangência de 90% da população. Com um perfil de segurança surpreendente, a vacina BCG é eficaz na proteção contra as formas severas da tuberculose em crianças, conferindo uma proteção de 52% a 100% na prevenção da meningite tuberculosa e de 2 a 80% na prevenção da tuberculose pulmonar (TIDJANI et al., 1986; ROMANUS, 1987; MS/SVS/PNCT, 2010; DALMIA et al., 2012; LUCA et al., 2013). No entanto, diversos estudos de caso controle têm relatado uma eficácia variável da vacina BCG na proteção contra tuberculose pulmonar, principalmente em indivíduos adultos. Nestes estudos observou-se que a eficácia da vacina variava de 0 a 80% (FINE, 1995; KAUFMANN et al., 2010). Vários estudos foram realizados nas últimas décadas com objetivo de entender os fatores que justificam esta variabilidade na eficácia 16 protetora da vacina BCG. Nestes estudos foram levantadas hipóteses descritas em uma revisão, resumidas na tabela 2 (FINE, 1989; 2001; KAUFMANN, 2005; KAUFMANN et al., 2010). Com esta variável eficácia protetora da BCG, tem-se observado em dados epidemiológicos recentes que a tuberculose continua incidente mesmo em países em que a abrangência vacinal da BCG é de até 90% da população, como é caso do Brasil. Tabela 2. Possíveis explicações que possam justificar a variabilidade na eficácia protetora da BCG contra a tuberculose pulmonar em adultos. Possíveis explicações Evidências Exposição Diversos dados epidemiológicos de animais indicaram que tal exposição a micobactérias ambientais pode tanto mascarar como até inibir a proteção induzida por BCG, seja por induzir um nível de proteção até o qual a vacina pode melhorar pouco ou até muito, ou talvez por induzir uma resposta imune contra a própria vacina. Variabilidade das cepas vacinais Estudos demonstraram que o cultivo in vitro das cepas vacinais nos grandes centros produtores de vacina ao longo de décadas, levaram ao desenvolvimento de uma grande variabilidade genética das cepas BCG empregada hoje nos diferentes países, com propriedades antigênicas e imunogênicas variadas e distintas da cepa original, desenvolvida por Calmete e Guérin. Variabilidade genética das populações Há evidências para influências genéticas no hospedeiro susceptível, mas não há dados suficientes no controle genético da resposta à BCG em humanos. Ausência de antígenos Alguns antígenos foram perdidos durante o processo de atenuação da perdidos cepa M. bovis que originou M. bovis BCG. Resposta imune afetada pela Em diversas teorias, helmintos induzem resposta Th2, mas nenhuma infecção por helmintos evidência relacionando proteção por BCG contra tuberculose. Adaptado de Lambert et al. 2010 O controle da TB deve ser melhorado em diferentes frentes, tanto na melhoria das técnicas de diagnóstico, nos programas de implementação dessas técnicas, melhoria no atendimento aos doentes e seus contatos, quanto na melhoria da vacina para proteger os indivíduos susceptíveis de todas as formas da doença durante toda a sua vida (LAWN et al., 2011). Em relação à vacina, ainda há necessidade do desenvolvimento de novas vacinas com maior capacidade de induzir uma imunidade protetora contra TB, em adultos e jovens, e com maior segurança com relação à BCG (HESSELING et al., 2007; OTTENHOFF et al., 2012; WHO, 2012). 17 1.7 Desenvolvimento de novas vacinas Diversas são as estratégias de desenvolvimento de novas ou melhores formas de induzir uma imunidade protetora contra a TB. Basicamente, estas se resumem em dois tipos de abordagens: a primeira é conhecida como vacina primária e reforço, do inglês “prime-boost” na qual a BCG é administrada em neonatos, prevenindo a TB juvenil. E quando estes indivíduos atingem uma determinada faixa etária, eles recebem uma dose “booster” de uma nova vacina, objetivando recuperar a resposta imunológica protetora conferida inicialmente pela vacina BCG (WHO, 2012). Baseada nesta estratégia, múltiplos trabalhos desenvolveram antígenos para serem avaliados como “booster”, os quais têm apresentado bons resultados como o Mtb72F, que é uma proteína de fusão recombinante baseada na fusão de duas serino proteases do Mtb, denominadas Mtb32A e Mtb39A, codificadas pelas regiões gênicas Rv0125 e Rv1196, respectivamente (SKEIKY et al., 1999). Formulações vacinais da Mtb72F com os adjuvantes AS01 e AS02, mostraramse ser protetoras em modelos animais como camundongos, cobaias e coelhos desafiados com Mtb (BRANDT et al., 2004; SKEIKY et al., 2004; TSENOVA et al., 2006). Também observou-se que a vacinação de macacos com a Mtb72F/AS02 em esquema de “prime-boost”, induzia uma maior sobrevivência e proteção após o desafio com Mtb, em comparação aos controles (REED et al., 2009). Posteriormente, em estudos clínicos de fase I/II, a Mtb72F/AS02 apresentou um perfil de segurança e imunogenicidade promissor em indivíduos não infectados com Mtb e não vacinados com BCG. Nestes estudos, observou-se que a vacinação com Mtb72F induzia uma alta resposta de células T CD4+ polifuncionais (co-expressando CD40L, IL-2, TNF-α e IFN-γ), e de anticorpos contra o Mtb72F (VON ESCHEN et al., 2009; LEROUX-ROELS et al., 2010). A segunda estratégia é o desenvolvimento de vacinas que possam substituir a BCG – como atenuação de M. tuberculosis ou uma nova BCG, através da adição e/ou hiper-expressão de antígenos de Mtb imunodominantes (FINE, 2001). Esta tem produzido também bons resultados, como a vacina VPM1002 que é uma cepa de BCG Prague recombinante que expressa listeriolisina da Listeria monocytogenes e não expressa a urease C, gene deletado, com finalidade de aumentar apresentação cruzada de BCG para células T CD8 via MHC de classe I. Estudos vacinais demostraram que a imunização de camundongos BALB/c com a VPM1002 induziu um perfil de resposta imune do tipo Th1 e Th17 balanceada, a qual foi protetora, reduzindo de forma mais 18 eficiente a carga bacteriana no pulmão, em comparação ao grupo vacinado com a BCG (DESEL et al., 2011). Com esses e outros resultados, a vacina VPM1002 evoluiu para ensaios clínicos de fase IIa em crianças na África do Sul (MEYER et al., 2013). 1.8 Antígenos imunodominantes de Mycobacterium tuberculosis abordados neste trabalho O grupo de pesquisa liderados pela Prof. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis e Dr. André Kipnis, vem desenvolvendo, há alguns anos, projetos que visam avaliar a resposta imune de indivíduos com tuberculose ativa e/ou latente, frente a diferentes antígenos de Mtb, que nos permite identificar candidatos (proteínas e/ou epítopos proteicos) que possuirão melhores chances de adicionar propriedades imunogênicas desejadas a vacina BCG. Em condições de estresse, o Mtb produz e secreta uma série de proteínas que estão relacionadas com seu metabolismo e sobrevivência. Uma vez sintetizadas e secretadas tornam-se alvo da resposta imune do hospedeiro, tanto celular quanto humoral (BOESEN et al., 1995; AREND et al., 2000). Algumas dessas proteínas já foram isoladas e caracterizadas (NAGAI et al., 1991). A caracterização imunológica dessas proteínas revelou que algumas delas são potencialmente imunogênicas in vivo, em modelos humano e animal (DE ARAUJO-FILHO et al., 2008; CAVALCANTI et al., 2009). Dentre as caracterizadas, as proteínas MPT-51, ESAT-6, GLcB, Groes, Complexo Ag 85, HspX, CFP-10, dentre outras estão sendo largamente estudadas no contexto da TB. O Ag 85C (Rv0129c) faz parte de um complexo antigênico composto por dois outros antígenos, Ag 85A (Rv3804c) e Ag 85B (Rv1886c), sendo codificados pelos genes fbpC, fbpA e fbpB, respectivamente, apresentando peso molecular que varia entre 30 a 32-KDa (OHARA et al., 1997). Esta proteína possui atividade micolil transferase, participando da síntese do ácido micólico que faz parte da constituição da parede celular dos bacilos, contribuindo para manutenção de sua integridade e patogênese da tuberculose (HARTH et al., 1996). Devido à sua característica imunodominante, e ser secretado pelo Mtb no início da infecção em adultos, o Ag 85C vem sendo avaliado como forte candidato a marcador de diagnóstico da tuberculose (SAMANICH et al., 1998; SAMANICH et al., 2000; KASHYAP et al., 2010). A importância e relevância destas proteínas se devem, provavelmente, ao seu papel na síntese da parede celular da micobactéria. De modo igual, demonstrou-se que quando os monócitos humanos são 19 infectados por Mtb, estas micobactérias secretam proteínas do complexo Ag 85. Esta propriedade poderia ser vantajosa para desenvolver uma vacina, visto que a liberação destas proteínas é de suma importância para o processamento intracelular deste patógeno via MHC de classe II (RE, 1994). A imunização de camundongos utilizando plasmídeo para expressão de Ag 85 induziu resposta imune humoral e mediada por células, conferindo proteção significante, quando desafiados com M. tuberculosis e BCG (HUYGEN, 1998). O MPT-51 (Rv3803c) também denominado como Ag 85 D, é uma proteína de 27-KDa codificada pela região gênica fbpC1 pelos genomas do Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium avium e Mycobacterium bovis BCG (NAGAI et al., 1991; RINKE DE WIT et al., 1993). Apesar de possuir 40% de homologia ao complexo Ag 85, este não possui atividade micolil transferase (RINKE DE WIT et al., 1993; WILSON et al., 2004), caracterizando-o como uma nova família não catalítica de α/β hidrolases que liga-se a fibronectina, cuja função fisiológica, em analogia com a acetilcolina esterases não-catalíticas, podem ser baseadas em sua capacidade de se conectar a ligantes extracelulares, tais como fibronectina e potencialmente carboidratos (KITAURA et al., 2000). Este antígeno tem se mostrado um bom marcador para diagnóstico de tuberculose principalmente em pacientes coinfectados com HIV (SINGH et al., 2005) cuja a imunodeficiência favorece uma rápida disseminação do patógeno, tornando a detecção precoce essencial. Além disso, o MTP51 apresenta importância significativa como marcador de diagnóstico da TB como já mostrado por nosso grupo de pesquisa (ARAUJO-FILHO et al., 2008). A HspX (Rv2031c), é uma proteína de choque térmico, codificada pela região gênica Acr, com peso molecular de 16-KDa, também conhecida como proteína αcristalina. Esta tem ação de chaperonina, o qual auxilia na conformação final das proteínas (QAMRA et al., 2005). O gene Acr, o qual codifica a expressão da proteína HspX, é altamente regulado quando o bacilo se encontra no interior dos macrófagos, os quais induzem um ambiente intracelular com hipóxia e presença de doadores de NO, condições estas que induzem a expressão de transcritos do gene HspX no estágio de latência em infecções com o Mtb. Em infecções humanas, este antígeno é expresso na fase latente da tuberculose, desencadeando resposta imune tanto humoral quanto celular (RABAHI et al., 2007; SPRATT et al., 2010). Geluk et al. (2007) mostraram que a vacinação com BCG não induz uma resposta de células T contra HspX como apresentada em pacientes com TB, e ainda determinaram epítopos imunodominantes da 20 proteína HspX. Assim acredita-se que o BCG ou até mesmo outro vetor como M. smegmatis mc2 155, expressando fragmentos de antígenos relacionados à latência do M. tuberculosis (BOSHOFF et al., 2005; LEYTEN et al., 2006), como a proteína HspX, pode ter potencial como vacinas contra a tuberculose latente. 1.9 Proteína CMX Resultados da literatura, incluindo os do nosso grupo, permitiram formular uma hipótese de que a construção de uma proteína de fusão recombinante, contendo epítopos imunodominantes das proteínas Ag 85C, MPT-51 e HspX e a sua expressão em um vetor, seria capaz de induzir uma resposta imune protetora contra TB. Diante disso nosso grupo construiu a proteína CMX que contém epítopos dos antígenos Ag 85C, MPT-51 e a proteína HspX inteira (DE SOUSA et al., 2012), baseando-se nas publicações que determinaram os epítopos imunodominantes de cada uma destas proteínas (D'SOUZA et al., 2003; SUZUKI et al., 2004; GELUK et al., 2007). Desta forma, o gene artificial construído possui em sua extremidade amino terminal a porção gênica correspondente aos aminoácidos 85 ao 149 da proteína Ag 85C (Ag85C85-149). Após esta porção gênica, foi inserida uma sequência de cinco aminoácidos de glicina para separa-la (sequência hinge) do epítopo da proteína MPT-51, correspondente aos aminoácidos 91 ao 112 da proteína (MPT-5191-112), que também está separada da proteína madura completa do HspX (sem peptídeo sinal) por uma sequência hinge constituída de 5 resíduos de glicina (DE SOUSA et al., 2012). A proteína CMX purificada obtida foi testada com o soro de uma pequena coorte de pacientes e os resultados demonstraram que dosando os níveis de anticorpos da classe IgM anti a proteína de fusão foi possível discriminar indivíduos com tuberculose pulmonar ativa dos controles saudáveis (p<0.001). Estes resultados confirmaram que a proteína CMX foi reconhecida pela resposta imune humoral de pacientes com TB, portanto manteve conservado a estrutura terciária dos epítopos das proteínas de Mtb originais (DE SOUSA et al., 2012). 1.10 Vetor de vacina Mycobacterium smegmatis, um membro não patogênico do gênero Mycobacterium, de crescimento rápido e que pode ser transformado eficientemente com 21 vários genes in vitro, tem apresentado várias características importantes para uma vacina contra tuberculose (ZHANG et al., 2010). Ao contrário de outras cepas micobacterianas, tais como a BCG, que sobrevive em células hospedeiras por meses inibindo a maturação do fagossoma, M. smegmatis é rapidamente destruído por proteases fagossomais das células infectadas, fato que facilita o processamento e apresentação pelas células apresentadoras de antígenos (APC). Este também induz maior produção de citocinas pelos macrófagos do que espécies patogênicas de micobactérias podendo ativar e induzir a maturação de células dendríticas, pela regulação positiva do MHC de classe I e moléculas co-estimulatórias (BELTAN et al., 2000; YADAV et al., 2004). M. smegmatis também pode acessar o MHC classe I como caminho para a apresentação de antígenos de micobactérias de forma mais eficiente do que a BCG (CAYABYAB et al., 2006; ZHAO et al., 2012). A ausência de toxicidade em modelos imunodeprimidos, deficientes de células T ou NK, é uma das características marcantes deste vetor, observada em estudos realizados por Young et al. (2004), sugerindo que este vetor é um seguro veículo que pode ser usado como vacina em indivíduos imunocomprometidos (YOUNG et al., 2004; YANG et al., 2009). Conhecendo estas características, vários estudos têm sido realizados utilizando este vetor para expressão de proteínas, como o estudo do Zhang et al. (2010), no qual a vacinação com o M. smegmatis expressando uma proteína de fusão ESAT6-CFP10, induziu uma imunidade humoral e celular significativamente melhor que a vacinação com BCG em camundongos. Outro estudo, realizado por Yi et al. (2007) observou que a imunização com M. smegmatis pZ607 recombinante transportando IL-12/GLS em camundongos BALB/c, induziu uma eficiente resposta imune protetora Th1 incluindo um alto nível de IFN-gama e IL-12 similar a cepa BCG. Modelos de estudos indicam que o desenvolvimento de uma nova vacina que apresente pelo menos 60% de eficácia na proteção contra tuberculose em adolescentes e adultos, pode potencialmente evitar de 30 a 50 milhões de novos casos de tuberculose no mundo, por um período 25 anos (WHO, 2013). Com isso o desenvolvimento de novas vacinas contra a tuberculose é de extrema importância, pois esta conquista é um passo importante para a erradicação da tuberculose no mundo. 22 2 JUSTIFICATIVA A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada pela infecção com Mycobacterium tuberculosis, e de acordo com a OMS, é a segunda principal causa de morte por doença infecciosa, ficando atrás somente da SIDA. No ano 2012 foram registrados 8,6 milhões de casos novos de tuberculose e mais de 1,3 milhões de mortes decorrentes da infecção com o bacilo. Esses dados demonstram que mesmo com a implementação de medidas preventivas, tais como a vacinação com a BCC, a tuberculose continua sendo um problema de saúde pública mundial. A vacina BCG, amplamente administrada em crianças no mundo, é a única vacina viável contra a tuberculose, no entanto apresenta uma eficácia variável na proteção principalmente em adolescentes e adultos. Com isso, países como o Brasil, que possuem 90% da população imunizada com a BCG, apresentam números significativos de casos e mortes por ano decorrentes da infecção com Mtb. Como esta é a única vacina existente para este fim, o desenvolvimento de novas vacinas ou o melhoramento da BCG é de grande importância. Modelos de estudos indicam que o desenvolvimento de uma nova vacina que apresente pelo menos 60% de eficácia na proteção contra tuberculose em adolescentes e adultos, pode potencialmente evitar de 30 a 50 milhões de casos novos de tuberculose no mundo, por um período 25 anos. Diante disso, propomos a construção de uma vacina recombinante M. smegmatis-mc2-CMX expressando a proteína recombinante de fusão CMX produzida e estudada pelo nosso grupo nos últimos anos. A proteína CMX é formada através da fusão de epítopos imunodominantes do Mtb (Ag85C-MPT51-HspX) reconhecidamente capazes de produzir no hospedeiro uma resposta imune. A análise da expressão da proteína CMX em M. smegmatis mc2 155 fornecerá dados importantes necessários para a construção da vacina BCG recombinante pretendida, como por exemplo: se o gene da proteína CMX será transcrito pela célula hospedeira; se o vetor é estável na célula hospedeira; se a proteína CMX está sendo integralmente expressa; qual a cito-localização da proteína recombinante; entre outros. Com a mesma importância será a análise da resposta imune induzida em camundongos isogênicos vacinados com M. smegmatis expressando a proteína CMX, com a possibilidade de esta ser uma nova vacina contra tuberculose. 23 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Construir e caracterizar uma vacina recombinante contra Mtb utilizando como vetor vacinal M. smegmatis mc2 155, expressando a proteína recombinante de fusão CMX composta por três subunidades de antígenos imunodominantes de Mycobacterium tuberculosis. 3.2 Objetivos específicos Ø Transformar o M. smegmatis mc2 155 com os vetores de expressão pLA71-CMX, pLA73-CMX e pMIP12-CMX; Ø Analisar a transcrição gênica (RNAm) das construções no vetor M. smegmatis mc2 155 recombinante; Ø Analisar a expressão e a imunoreatividade das proteínas de fusão CMX recombinantes no M. smegmatis mc2 155; Ø Avaliar a estabilidade dos plasmídeos em M. smegmatis mc2 155; Ø Imunizar camundongos BALB/c e avaliar a resposta imune humoral dos camundongos vacinados através do ensaio imunoenzimático ELISA; Ø Avaliar resposta imune de camundongos BALB/c vacinados frente à infecção por Mycobacterium tuberculosis H37Rv; Ø Determinar a eficácia protetora da vacina mc2-CMX em camundongos frente a infecção por Mycobacterium tuberculosis H37Rv. 24 4 MÉTODOS 4.1 Fluxograma das etapas do desenvolvimento deste estudo. O presente trabalho foi desenvolvido seguindo o fluxograma abaixo, o qual cita as etapas realizadas neste estudo. Figura 3. Fluxograma das etapas realizadas no desenvolvimento e avaliação da vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c. 25 4.2 Construção dos plasmídeos recombinantes. A partir das sequências de DNAs correspondentes aos epítopos imunodominantes dos Ag85C e MPT-51, e o gene inteiro do HspX, descritos em estudos anteriores realizados por Sousa et al. (2012), foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores, que permitiram a amplificação das regiões e ao mesmo tempo a síntese de sítios para enzimas de restrição para posterior clonagem. O produto desta amplificação foi clonada no vetor pGEM-T easy (Promega) através de um sistema de ligação. Posteriormente, o vetor de clonagem pGEM-T easy contendo o gene de fusão (CMX) foi digerido com as enzimas KpnI e NotI para eluição do gene CMX, para posterior inserção deste nos plasmídeos pLA71 e pLA73 (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013). O produto da eluição foi preparado para clonagem no plasmídeo pMIP12 e para tanto, as enzimas usadas para digerir o plasmídeo pGEM-T easy/CMX foram BamHI e KpnI. Os plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 (cedidos gentilmente pela Dra. Brigitte Gicquel, Instituto Pasteur, França) são plasmídeos que possuem origem de replicação para E. coli/micobactéria, tendo como marcador de seleção um gene de resistência à Canamicina obtido do Tn903 (LIM et al., 1995). Após digestão, o gene CMX foi eluído e inserido nos plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 previamente digeridos com as mesmas enzimas. Posteriormente, os plasmídeos recombinantes pLA71-CMX, pLA73CMX e pMIP12-CMX, foram sequenciados para verificar a integridade das sequências clonadas (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013). 4.3 Preparo de M. smegmatis eletrocompetente. M. smegmatis mc2 155 (gentilmente cedidos pela Dra. Luciana Leite do Instituto Butantan) foi cultivado em tubos contendo 5 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo (Himedia®) com tween 80 a 0,05%, até atingir a fase exponencial (aproximadamente 3 dias). Foi usado 1 mL da cultura para inocular em 100 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo com tween 80 a 0,05% em um erlenmeyer de 500 mL. Depois de três dias de crescimento, as culturas foram centrifugadas a 6.000 rpm por 15 minutos a 10˚C e lavadas com igual volume de solução gelada de glicerol 10%. Por último, as células eletrocompetentes foram ressuspendidas em 3 mL de glicerol 10% gelado e alíquotas de 100 µL foram congeladas em criotubos a -80˚C. 26 4.4 Eletroporação de M. smegmatis. Os plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12 que correspondem aos plasmídeos originais sem insertos gênicos, e plasmídeos recombinantes contendo a proteína de fusão CMX (Ag85C, MPT-51 e HspX), pLA71-CMX, pLA73-CMX e pMIP12-CMX, foram inseridos em M. smegmatis mc2 155 por eletroporação usando o eletroporador de pulsação (Bio-Rad®) a 4°C. Cada sistema de transformação consistiu em 3 µL (contendo 100 a 500 ɳg de DNA plasmidial) do plasmídeo em 100 µL de células eletrocompetentes, com posterior incubação no gelo por 10 minutos. Logo após, condições padrões de pulsação 2,5KV, 25µF e 1000Ω foram aplicadas numa cuveta de 2 mm (Bio-Rad®). Posteriormente, foi adicionado ao sistema 1 mL de meio SOB (extrato de levedura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mM e KCL 2,5 mM) (HANAHAN, 1983), o qual juntamente com as células eletroporadas foi transferido para um tubo de ensaio e incubado por 3 horas, sob agitação a 37°C. Os transformantes foram selecionados a partir do plaqueamento e incubação dos mesmos em meio Middlebrook 7H11 (Himedia®) com Canamicina (20 µg/mL) numa estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após 3 dias de incubação, colônias representativas de micobactérias recombinantes foram selecionadas e transferidas para um tubo contendo 5 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo com tween 80 a 0,05% com Canamicina (20 µg/mL), que foi incubado a 37°C sob agitação por três dias. Posteriormente, 2 mL da cultura foram transferidos para um volume de 200 mL de meio Middlebrook 7H9 caldo com tween 80 a 0,05% contendo Canamicina (20 µg/mL) e incubados sob agitação a 37°C até atingir a fase exponencial (cerca de três dias). Ao atingirem a fase exponencial de crescimento, as culturas foram transferidas para tubos de fundo cônico de 50 mL, centrifugadas a 6.000 rpm por 15 minutos a 10˚C e depois lavadas em igual volume de glicerol 10% por três vezes. Feito isso, o sedimento foi ressuspendido em 5 mL de glicerol 10% e alíquotas de 100 µL foram congeladas a 80°C em criotubos. 4.5 Determinação da concentração da vacina recombinante mc2-CMX. A determinação da concentração da vacina foi realizada através da contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) em meio Middlebrook 7H11 ágar contendo Canamicina (20 µg/mL). Portanto, algumas alíquotas da vacina mc2-CMX congeladas a -80°C, foram selecionadas aleatoriamente e 50 µL destas foram diluídas seriadamente 27 10, 100, 1000 e 10000 vezes resultando nas diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4, respectivamente. Foram plaqueados 50 µL de cada diluição em meio Middlebrook 7H11 com Canamicina (20 µg/mL) e posteriormente incubados por 3 dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. O número de colônias que cresceu nas placas foi usado para determinar a concentração do estoque da vacina mc2-CMX em UFC/mL aplicando-se a seguinte fórmula: N x 20 x 1/FD, onde N corresponde ao número de colônias crescidas na placa, 20 é o fator de correção do volume semeado e 1/FD é o inverso da diluição correspondente à placa onde se obteve colônias isoladas (de 20 a 80) usadas na contagem. 4.6 Obtenção e determinação da concentração da vacina BCG Moreau. A cepa BCG Moreau oriunda do Instituto Butantan, foi cultivada em meio Middlebrook 7H9 suplementado com Ácido Oleico, Albumina, Dextrose e Catalase (OADC) e tween 80 a 0,05%, sob agitação a 37ºC por 21 dias, quando então, foram lavadas com igual volume de solução gelada de glicerol 10% e ressuspendidas em 3 mL de glicerol 10% gelado. Alíquotas de 100 µL da vacina foram congeladas em criotubos a -80ºC e após algumas semanas foram selecionadas aleatoriamente para determinação do UFC. Estas foram diluídas seriadamente em 10, 100, 1000, 10000 vezes resultando nas diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4, respectivamente, quando então foram plaqueados 50 µL de cada diluição em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC, com posterior incubação de 21 dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após 21 dias de incubação, o plaqueamento da diluição que resultou em colônias isoladas (de 20 a 80) foi usado para determinar a concentração do estoque da vacina BCG Moreau em UFC/mL. 4.7 Análise da expressão da proteína recombinante CMX em M. smegmatis mc2 155 por western blotting. Culturas de M. smegmatis mc2 155 recombinante foram crescidas em meios Middlebrook 7H9 contendo Canamicina (20 µg/mL) por três dias, quando então foram centrifugadas. O sobrenadante foi descartado e então o sedimento foi ressuspendido em tampão fosfato salina (PBS) e sonicado em 10 ciclos de 30 segundos de duração cada, com intervalos de 30 segundos para ruptura das células. O lisado celular foi centrifugado a 6.000 rpm 10ºC por 10 minutos e o sobrenadante (fração intracelular 28 solúvel) transferido para um novo tubo, no qual foi adicionado 0,5 µL de inibidores de proteases (Ditiotreitol, Fluoreto fenilmetilsulfonil, Aproptin, Leupeptin e Pepstatin). O sedimento do lisado foi ressuspendido em tampão PBS contendo os inibidores de protease citados acima (fração intracelular insolúvel) (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013). As frações obtidas foram analisadas quanto à presença da proteína CMX através da técnica de western blotting. Os extratos proteicos das duas frações descritas acima foram aplicados em gel de poliacrilamida e duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Após separação eletroforética, os extratos proteicos foram eletrotransferidos para uma membrana de nitrocelulose e incubados com uma diluição 1:10000 de anticorpos policlonais, pré-adsorvidos com proteínas de E. coli, obtidos do soro de camundongos BALB/c após três imunizações com a rCMX e adjuvante Freund’s completo. Posteriormente, foi adicionado o anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com avidina-peroxidase (Sigma-Aldrich®). A presença de proteínas CMX foi revelada pela incubação com o substrato diaminobenzidina (DAB) (Roche, Germany®). 4.8 Ensaio de estabilidade do plasmídeo in vitro. A estabilidade do plasmídeo no M. smegmatis mc2 155 recombinante foi avaliada através de repetições de subcultivo e contínuo crescimento em meio Middlebrook 7H9 sem o antibiótico Canamicina (20 µg/mL) por aproximadamente 50 gerações. Subsequentemente, as células foram plaqueadas em meio Middlebrook 7H11, e 50 colônias foram selecionadas aleatoriamente e plaqueadas em dois meios Middlebrook 7H11, um com Canamicina (20 µg/mL) e outro sem Canamicina e incubados por três dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. A estabilidade do plasmídeo foi determinada pela porcentagem de colônias que após as passagens sem a seleção de antibiótico permaneceram resistentes à Canamicina. 4.9 Animais utilizados para realização do estudo e condições físicas de manutenção. O estudo foi realizado em camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas, provenientes do biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG, mantidos em micro isoladores acoplados à rack ventilada contendo filtros HEPA para entrada e saída de ar, com água e dieta ad libitum. A temperatura foi mantida entre 20 a 29 24ºC com umidade relativa do ar entre 40-70%, com ciclos de luz/escuridão de 12 horas. Os camundongos foram manejados de acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL/COBEA). O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da UFG sob N°: 229/11 (Anexo 1). 4.10 Avaliação da imunogenicidade e persistência da vacina mc2-CMX. Quarenta e cinco camundongos BALB/c fêmeas com idade entre 6-8 semanas, foram distribuídos em três grupos de quinze, os quais receberam as seguintes doses da vacina mc2-CMX: 106, 107 e 108 UFC/animal, por via subcutânea. Os camundongos permaneceram em observação durante 60 dias. Três camundongos de cada grupo foram eutanasiados, nos dias 1, 7, 14, 30 e 60 após a imunização para coleta do baço, o qual foi homogeneizado e plaqueado em meio Middlebrook 7H11 para determinar a persistência da vacina mc2-CMX a partir da contagem de UFC. O sangue dos animais eutanaziados foi coletado em três momentos, nos dias 14, 30 e 60 após a imunização para determinar a imunogenicidade através do ELISA. 4.11 Estabilidade in vivo do mc2-CMX. Para determinar a estabilidade do plasmídeo in vivo, camundongos imunizados com 108 UFC de mc2-CMX foram eutanasiados para coleta do baço, o qual foi posteriormente homogeneizado e plaqueado em meio Middlebrook 7H11 com Canamicina. Após três dias de incubação a 37ºC, colônias crescidas na placa foram analisadas através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), usando iniciadores específicos para as sequências codificadoras da proteína CMX. Cinco colônias foram selecionadas das placas aleatoriamente e transferidas para tubos contendo 5 mL de 7H9, e incubadas por três dias a 37ºC. Após a incubação, 500 µL de cada cultura foram transferidos para tubos eppendorfs de 1,5 mL e centrifugados por 10 minutos a 10.000 g na temperatura de 10ºC. Posteriormente, o sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido em 100 µL de miliqH2O e fervido por 10 minutos. Feito isso, a solução foi centrifugada por 5 minutos a 10.000 g na temperatura de 10ºC. Assim, o sobrenadante foi transferido para outro tubo, e deste volume foi coletado 4 µL para realização de PCR. O sistema de PCR foi preparado para um volume final de 30 µL em tubos de 0,2 mL no qual foram acrescentados 4 µL do sobrenadante, 6 µL tampão Colorless GoTaqTM (Promega®), 0,47 µM de cada oligonucleotídeo iniciador 30 específico, 250 µM de cada dNTPs, e 1U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen®). O DNA foi submetido à desnaturação a 94ºC por 4 minutos e em seguida a 35 ciclos de 92ºC por 45 segundos, 58ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto, com etapa de extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo, com um marcador de 100 pb (Invitrogen®). O gel de agarose contendo os produtos da PCR foram visualizados e a imagem digitalizada no aparelho Gel Doc System (Bio-Rad®) com o auxílio do software Quantity One 4.6.7 (Bio-Rad®). 4.12 Preparo dos inóculos vacinais. Alíquotas da vacina mc2-CMX (M. smegmatis mc2 155/pLA71-CMX) foram retiradas do freezer -80ºC e a concentração foi ajustada com PBS tween 80 a 0,05% para 1x108 UFC/mL. O mesmo processo foi realizado para o preparo do inóculo vacinal de BCG Moreau, todavia, a concentração ajustada foi de 107 UFC/mL. Para os grupos controles foram preparados PBS tween 80 a 0,05%. 4.13 Imunização. Dezesseis camundongos BALB/c foram distribuídos em quatro grupos de quatro camundongos: Salina; Salina+Mtb (infecção); BCG+Mtb e mc2-CMX+Mtb (Figura 3). Os grupos de camundongos Salina; Salina+Mtb (infecção) e mc2-CMX+Mtb receberam duas imunizações com intervalo de 15 dias entre elas. O grupo BCG+Mtb recebeu uma única imunização. Em todas imunizações o inóculo vacinal foi plaqueado para confirmar a concentração. 4.14 Infecção intravenosa com Mtb. Trinta dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv por via endovenosa. A cepa de Mycobacterium tuberculosis H37Rv fornecida pelo Laboratório Central de Goiás (LACEN-GO) foi cultivada em meio 7H9 suplementado com OADC, contendo tween 80 a 0.05% até a fase log de crescimento, e em seguida foram alíquotadas e mantidas no freezer -80ºC. O estoque foi plaqueado e quantificado um mês após o congelamento. Diluições centesimais do estoque foram plaqueadas em meio 7H11 suplementado com OADC e as unidades formadoras de colônias foram contadas. No dia da infecção, o inóculo foi 31 diluído em PBS tween 80 a 0,05% na concentração de 108 UFC/mL, então foi administrado 100 µL deste pela via intravenosa (via plexo retro-orbital), sendo inoculado, portanto 107 UFC/animal. Com setenta dias de infecção, os camundongos foram eutanasiados para análise da resposta imune celular induzida frente a infecção e eficácia protetora das vacinas (Figura 3). 4.15 Obtenção do soro para realização de ELISA. O sangue dos camundongos imunizados que receberam duas imunizações, foi coletado 15 e 60 dias após a segunda imunização para obtenção do soro (Figura 3). Já o grupo BCG+Mtb teve o sangue coletado nos dias 30 e 75 após imunização. O sangue coletado foi incubado por uma hora a 37°C, centrifugado a 1.200 g a 4°C por 15 minutos para separação do soro, e posteriormente estocado a -20°C. Figura 4. Esquema de avaliação da vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c. Camundongos BALB/c foram distribuídos em quatro grupos: salina, salina+Mtb (infecção), mc2-CMX+Mtb, sendo estes imunizados em dois momentos com intervalo de 15 dias, e o BCG+Mtb que recebeu somente uma imunização. Nos dias 30 e 75, o sangue de todos os camundongos foi coletado para realização de ELISA, e após 45 dias da primeira imunização camundongos dos grupos infecção, BCG e mc2-CMX foram desafiados com 1x107CFU/animal de M. tuberculosis H37Rv por via intravenosa. Com 70 dias de infecção, todos os camundongos foram eutanasiados para realização de citometria, CFU e histopatológico. 32 4.16 ELISA. Para determinação dos níveis séricos de anticorpos anti-CMX da classe IgG1 e IgG2a, foi realizado um ELISA conforme otimizado por de Sousa et al. (2012). Placas de poliestireno (Nunc®) de 96 poços foram inicialmente sensibilizadas com 10 µg/mL de proteína CMX diluída em 0,05 M de tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,05 M (pH 9,6) e incubadas a 4°C por 16 horas. Posteriormente, a placa foi lavada e incubada por uma hora a 37°C com tampão carbonato de sódio (PBS) contendo 1% de gelatina. A partir dessa etapa seguiu-se a adição dos soros, com posterior incubação de 1 hora a 37°C. Os anticorpos conjugados à biotina (anti-IgG1 e anti-mouse IgG2a; Pharmingen®), diluídos a 1:5000, foram adicionados e as placas foram incubadas por 1 hora a 37°C. Foi adicionada a estreptoavidina peroxidase, diluída a 1:1000 e as placas foram novamente incubadas por 1 hora a 37°C. A reação foi então revelada com o substrato ortofenilenodiamina (OPD) e bloqueada adicionando-se ácido sulfúrico a 4N. A leitura da absorbância foi realizada em comprimento de onde de 492 ηm em leitor de ELISA (Multiskan Thermo Labsystems®). Entre cada uma das etapas, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS tween 20 0,05%. 4.17 Obtenção das células do baço. Para obtenção das células, o baço dos camundongos foi coletado após setenta dias de infecção, passado em filtro de 70 µm para células (BD Biosciences, Lincoln Park, NJ) e posteriormente, as mesmas foram ressuspendidas em meio Roswell Park Memorial Institute medium GIBCOTM (RPMI medium GIBCOTM). Os eritrócitos foram lisados com solução de lise (0,15M NH4Cl, 10mMKHCO3), depois as células foram lavadas e ressuspendidas em meio RPMI completo (cRPMI) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 0,15% de bicarbonato de sódio, 1% de L-glutamina (200 mM SIGMA®) e 1% de aminoácidos não essenciais 100X (SIGMA®). Posteriormente, as células foram contadas utilizando a câmara de Neubauer e ajustadas para concentração de 1x106 células/mL. 4.18 Obtenção das células do pulmão. Para obtenção das células, o lóbulo esquerdo pulmão dos camundongos foi coletado após setenta dias de infecção e posteriormente, digerido como descrito por Junqueira-Kipnis et al. (2003). O sistema sanguíneo do pulmão foi perfundido com 5 33 mL de solução gelada contendo PBS e 45 U/mL de heparina (Sigma-Aldrich). Após coletado, o pulmão foi tratado com uma solução de DNAse IV (30 µg/mL; SigmaAldrich) e colagenase III (0,7 mg/mL; Sigma-Aldrich) por 1 hora a 37°C. Para a obtenção das células, o homogenato foi passado em filtro de 70 µm para células. O restante dos eritrócitos foram lisados com solução de lise, e então as células foram lavadas e ressuspendidas em meio cRPMI. Posteriormente, as células foram contadas utilizando a câmara de Neubauer e ajustadas para concentração de 1x106 células/mL. 4.19 Avaliação da produção celular de citocinas do baço e pulmão. Para determinar a produção de citocinas pelas células do baço e pulmão, foram distribuídos 200 µL de suspensão celular destes órgãos em placa de cultura celular de 96 orifícios (Cell Wells ). As células foram cultivadas sem estímulo (meio), em estufa TM de CO2 a 5% a 37°C por 4 horas. Após este período, foi acrescentado um inibidor de transporte de proteínas, a monensina na concentração de 3 µM (eBioscience®), e então, as culturas foram submetidas à nova incubação por 4 horas. Logo, as células foram marcadas com anticorpos anti: PercP-CD4 (BD PharMingen®); PE-IL-2 (eBioscience®); FITC-TNF-α (eBioscience®); APC-IFN-γ (eBioscience®) por 30 minutos, lavadas com PBS contendo 0,1% de ácida sódica, fixada e permeabilizada com Perm Fix/ Perm Wash (BD PharMingen®). Todas as análises foram realizadas com aquisição de 50.000 eventos no citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCalibur (Hospital Araújo Jorge Goiânia/GO) e os dados foram analisados com o software FlowJo 8,7. Os linfócitos foram selecionados baseado nas características de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC). 4.20 Histopatológico. Para análise histopatológica do pulmão, o lóbulo pulmonar caudal direito de cada camundongo foi coletado e fixado com formol a 10% tamponado, após setenta dias de infecção intravenosa (Figura 3). Os espécimes foram processados em histotécnico automático, incluídos em parafina e seccionados em micrótomo (Leica RM2165®). Obteve-se de cada bloco, cortes consecutivos de 5µm, os quais foram colocados sobre lâminas histológicas e corados pelo método de hematoxilina e eosina (HE) para análise em microscopia de luz (Axio scope.A1 - Carl Zeiss), utilizando o programa AxioVision 4.7. Os eventos microscópicos avaliados nestes cortes histológicos foram: intensidade 34 de infiltrado inflamatório, presença ou não de macrófagos espumosos e área de necrose, sendo esta análise realizada nas objetivas de 5x, 10x 40x e 100x. A determinação dos escores de lesão foi adaptada do algoritmo desenvolvido pelo Dr. Randall Basaraba da Colorado State University, descrito abaixo. Foi considerado o valor de 0 aos cortes histológicos que não apresentaram lesão e focos inflamatórios, sendo observado a conservação da arquitetura pulmonar. Para cortes histológicos que apresentaram lesões com poucos focos inflamatórios, mononuclear e macrófagos espumosos, o valor considerado foi entre 1-5, sendo 1, um número mínimo de eventos por campo e 5 para um número 1 a 2 por campo. Presença de lesões, focos inflamatórios, infiltrado mononuclear difuso e macrófagos espumosos, o valor do score considerado foi entre 5-7, sendo o valor 5 para um número 3 a 5 de eventos por campo e 7 para um número 6 a 8 por campo. Cortes histológicos que apresentaram lesões, focos inflamatórios, infiltrado mononuclear difuso moderado, macrófagos espumosos e presença de necrose, o valor do score considerado foi entre 710, sendo 7 quando o número de 8 a 10 focos inflamatórios por campo, com presença de pouca necrose e 10 para cortes histológicos que apresentaram juntamente com os focos, lesão acentuada e necrose, com perda total da arquitetura pulmonar. Todos os procedimentos citados acima foram realizados no Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia – UFG. 4.21 Determinação da carga bacilar no pulmão. Para avaliar a eficácia protetora das vacinas, após setenta dias de infecção, camundongos desafiados com Mtb foram eutanasiados (Figura 3), para coleta dos lobos pulmonares direito superior e mediano, os quais foram homogeneizados e plaqueados em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC para determinação da carga bacilar a partir da contagem de UFC, após 21 dias de incubação a 37ºC. 4.22 Análise Estatística. Os resultados obtidos foram tabulados usando o Microsoft Office Excel 2011 e Software Prism (versão 5.0c, GraphPad). A comparação entre os grupos foi dada pela análise de variância (ANOVA) e teste t não pareado. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. 35 5 RESULTADOS 5.1 M. smegmatis recombinante pLA71-CMX expressa proteína CMX. Para avaliar a expressão da proteína CMX nos recombinantes mc2-pLA71CMX, mc2-pLA73-CMX e mc2-pMIP12-CMX, alíquotas foram selecionadas aleatoriamente no freezer -80°C e analisadas através da técnica de western blotting, utilizando anticorpos policlonais específicos para a proteína CMX. Como controle, alíquotas de M. smegmatis mc2 155 com pLA71 e selvagem, foram analisadas juntamente. Como demonstrado na figura 4 A, somente a construção mc2-pLA71-CMX apresentou a banda correspondente à proteína CMX (36KDa), sendo esta expressão confirmada em uma réplica do mesmo experimento como demostrado na figura 4 B. Diante desses resultados, escolhemos a mc2-pLA71-CMX como vacina, passando a ser denominada de mc2-CMX. Figura 5. Expressão da proteína CMX no recombinante mc2-pLA71-CMX. (A) e (B) Avaliação da expressão da proteína CMX nos recombinantes através da técnica de western blotting utilizando anticorpos policlonais anti-CMX. Canaleta M, marcador BlueStepTM Broad Range Protein (Amresco). (A) Canaleta 1: proteína recombinante CMX purificada. Canaleta 2: poço vazio. Canaleta 3: M. smegmatis mc2 155 com plasmídeo pLA71-vazio. Canaleta 4, 5: M. smegmatis pMIP12-CMX sedimento e sobrenadante, respectivamente. Canaleta 6, 7: M. smegmatis pLA71-CMX sedimento e sobrenadante, respectivamente. Canaleta 8, 9: M. smegmatis pLA73-CMX sedimento e sobrenadante, respectivamente. (B) Canaleta M, marcador BlueStepTM Broad Range Protein (Amresco). Canaleta 1: proteína recombinante CMX purificada. Canaleta 2, 3: M. smegmatis pLA71-CMX sedimento e sobrenadante, respectivamente. Canaleta 4: M. smegmatis mc2 155 com plasmídeo pLA71-vazio. Canaleta 5: M. smegmatis mc2 155 Selvagem. 36 5.2 mc2-CMX induz resposta imune humoral específica. Para definir a melhor dose vacinal da vacina mc2-CMX a ser administrada, grupos de camundongos foram imunizados com uma dose única de mc2-CMX em diferentes concentrações, 106, 107 e 108, e posteriormente, a resposta imune humoral específica foi avaliada através da técnica de ELISA nos dias 14, 30 e 60 após imunização. Como demonstrado na Figura 5 A e B, todas as doses vacinais foram capazes de induzir níveis séricos de anticorpos anti-CMX, tanto classe IgG1 quanto IgG2a. Diante desse resultados decidimos usar a dose intermediaria 107 para imunização em dois momentos com intervalo 15 dias, pois apesar da dose 108 ter apresentado uma maior resposta humoral, observamos a formação de uma pequena lesão no local da imunização (dados não mostrados), fator não observado na dose 107. Figura 6. Resposta imune humoral específica induzida pela vacina mc2-CMX em camundongos BALB/c. (A) e (B) Três grupos de camundongos foram imunizados com uma dose única da vacina mc2CMX em diferentes concentrações 106, 107 e 108, sendo os níveis séricos de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a (B) anti-CMX dosados em diferentes pontos pela técnica de ELISA. 5.3 mc2-CMX persiste por até sete dias em camundongos BALB/c e este mantém a expressão da CMX in vivo. Para determinar a persistência do mc2-CMX in vivo, grupos de camundongos BALB/c foram imunizados com uma dose única da vacina em diferentes concentrações, 106, 107 e 108, por via subcutânea. O baço foi coletado nos dias 1, 7, 14, 30 e 60 para determinar as UFCs. Como observado na figura 6, somente na dose 108 houve persistência do mc2-CMX por até sete dias após a imunização. 37 109 108 106CFU/camundongo 107CFU/camundongo 108CFU/camundongo CFU/baço 107 106 105 104 103 102 101 Dia 0 Dia 1 Dia 7 Dia 14 Dia 30 2 Figura 7. A persistência do mc -CMX em camundongos BALB/c. Camundongos BALB/c foram imunizados com uma única dose da vacina em diferentes concentrações, 106, 107 e 108, por via subcutânea. O baço foi coletado nos dias 1, 7, 14, 30 e 60 para determinar as UFC. Para avaliar se durante este período de persistência o mc2-CMX manteve o plasmídeo in vivo na ausência de pressão seletiva (Canamicina), colônias recuperadas do baço de camundongos foram analisadas através da técnica de PCR usando iniciadores específicos para as sequências codificadoras da proteína CMX. Como demonstrado na figura 7, todas as colônias recuperadas apresentaram PCR positiva com uma banda de tamanho correspondente ao da sequência codificadora da proteína CMX. A partir destes resultados, notamos que a vacina não apresentou mudança na persistência com adição da CMX, e este manteve o plasmídeo em ambiente sem pressão seletiva in vivo. Figura 8. Gel de agarose do PCR do gene da fusão CMX. Para avaliar se o mc2-CMX manteve o plasmídeo in vivo, colônias recuperadas do baço de camundongos imunizados foram analisadas através da técnica de PCR usando iniciadores específicos para as sequências codificadoras da proteína CMX. Todas as colônias analisadas apresentavam o gene da fusão CMX. Canaleta M, marcador de DNA Axygen 100pb (Biosciences®). Canaletas 1- 5: colônias de bactérias recuperadas e testadas pela PCR. Canaleta 6: controle negativo do PCR. 38 5.4 A imunização com mc2-CMX em dois momentos induz melhor resposta imune humoral específica para CMX que a BCG. Para analisar a capacidade imunogênica da vacina mc2-CMX, camundongos BALB/c foram imunizados em dois momentos com intervalo de 15 dias. Como controles foram utilizados camundongos imunizados com salina ou BCG Moreau. Após 15 dias da ultima imunização o sangue de todos os camundongos foi coletado para realização de ELISA. Como evidenciado na figura 8 (A e B) camundongos imunizados com a vacina mc2-CMX em dois momentos, apresentaram maiores níveis de anticorpos anti-CMX, tanto da classe IgG1 quanto IgG2a, quando comparado com os grupos controles. Trinta dias após a ultima imunização, os camundongos foram desafiados com Mtb, e depois de trinta dias de infecção o sangue de todos os animais foi coletado novamente e os níveis de anticorpos anti-CMX determinados. Como evidenciado na figura 8 (A e B) os níveis de anticorpos tanto da classe IgG1 quanto IgG2a foram significativamente maiores nos camundongos imunizados com vacina mc2-CMX que nos animais do grupo salina e BCG após desafio com Mtb (Figura 8 A e B). Estes resultados mostram que a vacina mc2-CMX induziu uma resposta imune humoral específica e esta se manteve após o desafio, sendo mais imunogênica que a BCG. A ** 3 ** B 1.0 2 IgG2a (492 ηm) IgG1 (492 ηm) ** * 1 0 *** 0.5 0.0 Não-desafiado Salina Desafiado BCG mc2-CMX Não-desafiado Salina Desafiado BCG mc2-CMX Figura 9. Resposta imune humoral específica induzida pelas vacinas salina, BCG e mc2-CMX em camundongos BALB/c antes e após o desafio com Mtb. (A) Níveis séricos de anticorpos da classe IgG1 anti-CMX antes e após o desafio com Mtb. (B) Níveis séricos de anticorpos da classe IgG2a antiCMX antes e após o desafio com Mtb. Camundongos foram distribuídos em três grupos: salina, BCG e mc2-CMX, os quais receberam em dois momentos as seguintes vacinas, salina, 106 UFC de BCG Moreau e 107 UFC de mc2-CMX, respectivamente. *P< 0,05, **P<0,01 ***P<0,001 indica a significante diferença entre os grupos. 5.5 A resposta imune celular frente a infecção com Mtb. Setenta dias após desafio com Mtb H37Rv, pulmão e o baço dos camundongos foram coletados para obtenção de células e avaliação da resposta imune celular induzida frente a infecção. Como observado na figura 9 A, a infecção por Mtb por si só foi capaz 39 de induzir uma maior migração de linfócitos T CD4 para o pulmão, tanto nos camundongos imunizados quanto no grupo infecção (Salina+Mtb) quando comparados grupo não desafiado. Contudo, não houve diferença significativa entre os grupos desafiados. O mesmo foi observado no baço, aonde houve proliferação linfocítica significativa em todos os grupos desafiados com Mtb, em comparação ao grupo não desafiado (Figura 9 B). A B 10 Total de Linfócitos TCD4+ (x108) Total de Linfócitos TCD4+ (x108) 1.5 * * 1.0 *** 0.5 0.0 ** 8 6 ** *** 4 2 0 Salina Salina+Mtb Pulmão BCG+Mtb mc2-CMX+Mtb Salina Salina+Mtb BCG+Mtb mc2-CMX+Mtb Baço Figura 10. Total de linfócitos T CD4 no pulmão e baço dos camundongos. Camundongos foram imunizados e após trinta dias da última imunização, foram desafiados com Mtb. Setenta dias depois do desafio, pulmão e baço foram coletados para realização da citometria de fluxo. As células foram cultivadas ex vivo sem estímulo, por 4 h a 37°C. Na (A) quantidade de linfócitos T CD4 totais no pulmão e na (B) baço. *P< 0,05, **P<0,01 ***P<0,001 indica a significante diferença entre os grupos. A produção de citocinas efetoras pelos linfócitos T CD4 é um fator importante no controle da infecção pelo Mtb, principalmente quando estas são características de uma resposta do tipo Th1 como IFN-γ, TNF-α e IL-2. Deste modo, avaliamos o perfil de citocinas produzidas pelas células T CD4 obtidas do pulmão de camundongos imunizados com suas respectivas vacinas, desafiados com Mtb, tendo como controle um grupo de camundongos imunizados com salina sem desafio. Como observado na figura 10 A, camundongos imunizados com vacina mc2-CMX apresentaram uma porcentagem significativamente maior de células produtoras de IFN-γ, quando comparado com os grupos imunizados com Salina e BCG Moreau, todavia não houve diferença significativa quando comparado o grupo BCG+Mtb com o grupo infecção (Salina+Mtb). A porcentagem de células produtoras de TNF-α foi também significativamente maior no grupo imunizado com vacina mc2-CMX quando comparada com o grupo BCG, (Figura 10 B), porém este aumento não foi significativo quando comparado o grupo mc2-CMX+Mtb com os grupos que receberam salina (Salina e Salina+Mtb). Como mostrado na figura 10 C, camundongos desafiados com o Mtb, apresentaram porcentagens significativas de células produtoras de IL-2, quando comparado com o grupo não desafiado. Todavia somente os camundongos imunizados 40 com a vacina mc2-CMX apresentaram porcentagens significativas, quando comparadas com o grupo infecção (Salina+Mtb). A B 1.5 25 * % células TCD4+/TNF-α+ % células TCD4+/IFN-γ+ 20 * 15 * ** ** * 10 * 1.0 * 0.5 5 0 Salina Salina+Mtb BCG+Mtb 0.0 mc2-CMX+Mtb Salina Salina+Mtb BCG+Mtb mc2-CMX+Mtb C 15 % células TCD4+/IL-2+ ** * ** 10 * 5 0 Salina Salina+Mtb BCG+Mtb mc2-CMX+Mtb Figura 11. Porcentagem de linfócitos T CD4 produtores de citocinas pró-inflamatórias no pulmão de camundongos. Camundongos foram imunizados e após trinta dias da última imunização, foram desafiados com Mtb. Setenta dias depois do desafio, o pulmão foi coletado para realização da citometria de fluxo. As células foram cultivadas ex vivo sem estímulo, por 4 h a 37°C. (A) produção de IFN-γ por células T CD4, (B) produção de TNF-α por células T CD4 e (C) produção de IL-2 por células T CD4. Comparação entre os grupos pelo teste t, *P< 0,05, **P<0,01 indica a significante diferença entre os grupos. 5.6 Redução das lesões pulmonares induzidas pela infecção com Mycobacterium tuberculosis pelas vacinas mc2-CMX e a BCG. Após setenta dias de infecção foi avaliado a eficácia da resposta imune específica induzida pelas vacinas no controle da infecção. O pulmão de todos os camundongos foram coletados e as lesões induzidas pelo desafio foram determinadas. No grupo infecção (Salina+Mtb), o desafio intravenoso com Mtb induziu inflamação pulmonar grave e difusa, acompanhada de grandes aglomerados inflamatórios de linfócitos (seta preta) e macrófagos espumosos (seta verde) (Figura 11 B). Quando observado os pulmões dos camundongos imunizados com as vacinas BCG Moreau e mc2-CMX, estes apresentaram uma significante redução da lesão pulmonar, com poucos focos inflamatórios (seta preta), em comparação ao grupo infecção (Figura 11 C e D). Ao determinar o escore de lesão (figura 12) foi observado um número significativamente maior de lesões no grupo infeção em comparação aos grupos imunizados com as vacinas BCG e mc2-CMX, mas ao comparar esses dois últimos grupos não houve diferença . A resposta induzida pelas vacinas BCG Moreau e mc241 CMX foi capaz de conservar a arquitetura pulmonar (seta azul), sendo estas efetivas no controle da infecção. Figura 12. A imunização com mc2-CMX induziu menor lesão pulmonar similar a de camundongos imunizados com a BCG. Análise histopatológica do pulmão de camundongos BALB/c após setenta dias de infecção por Mtb H37Rv, na objetiva de 10x. (A) Camundongo Salina não infectado. (B) Camundongo infectado (Salina+Mtb) com uma significante inflamação pulmonar grave e difusa, acompanhada de grandes aglomerados inflamatórios de linfócitos (seta preta) e macrófagos espumosos (seta verde). (C) Camundongo imunizado com BCG e infectado apresentando uma significante redução da lesão pulmonar com poucos focos inflamatórios (seta preta), em comparação ao grupo infecção (Salina+Mtb). (D) Camundongo imunizado com mc2-CMX e infectado apresentando uma redução da lesão pulmonar similar ao camundongo imunizado com BCG. Figura 13. Comparação do score de lesão pulmonar entre os grupos de camundongos desafiados com M. tuberculosis. Após setenta dias de infecção o pulmão de todos os camundongos foi coletado para realização da análise histológica determinando os score de lesão com base no número de focos inflamatórios, lesões, macrófagos espumosos, células inflamatórias e presença de necrose. ***P<0,001 indica diferença significante entre os grupos. 42 5.7 Redução da carga bacilar no pulmão de camundongos imunizados com as vacinas mc2-CMX e BCG. Após setenta dias de infecção camundongos desafiados com Mtb foram eutanasiados para coleta dos lobos pulmonares direitos superior e mediano, os quais foram homogeneizados e plaqueados em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC, para determinação da carga bacilar a partir da contagem de UFC. Como observado na figura 13, camundongos imunizados com vacinas BCG e mc2-CMX, apresentaram uma significante redução da carga bacilar no pulmão, quando comparado com o grupo infecção (Salina+Mtb). A resposta induzida pelas vacinas BCG e mc2CMX foi efetiva no controle da infeção por Mtb, sendo essa protetora. Figura 14. Resposta imune induzida pela a imunização com mc2-CMX é efetiva no controle da infecção por Mtb. Com setenta dias de infecção os camundongos desafiados com Mtb foram eutanasiados para coleta dos lobos pulmonares direitos superior e mediano, os quais foram homogeneizados e plaqueados em meio Middlebrook 7H11 suplementado com OADC para determinação da carga bacilar, a partir da contagem de UFC. Comparação entre os grupos pelo teste t, *P< 0,05, indica a significante diferença entre os grupos. 43 6 DISCUSSÃO Há séculos a tuberculose vem sendo um problema de saúde pública mundial. Mesmo após o surgimento da vacina BCG, em 1921, o controle da tuberculose continua a passos lentos. Diante deste cenário, medidas que possam auxiliar no controle desta doença são necessárias, tais como o desenvolvimento de novas vacinas, que possam substituir ou melhorar a resposta imune induzida pela vacina BCG (CHECKLEY et al., 2011). Neste estudo desenvolvemos a vacina recombinante mc2-CMX, a partir da transformação da cepa M. smegmatis mc2 155 com o plasmídeo contendo a sequência codificadora da proteína de fusão CMX (Ag85C-MPT51-HspX) (DE SOUSA et al., 2012). A vacinação de camundongos BALB/c com mc2-CMX foi capaz de induzir a produção de anticorpos específicos para a proteína CMX. Além disso, esses camundongos, quando infectados por Mtb, apresentaram significativa redução da lesão pulmonar e carga bacilar, similar aos camundongos imunizados com a BCG Moreau. Como já descrito na literatura, a proteína CMX é imunogênica em camundongos e antigênica em humanos, características que a qualifica como um bom antígeno para o desenvolvimento de uma nova vacina contra tuberculose (DE SOUSA et al., 2012). No entanto, para induzir uma resposta a um determinado patógeno é necessário apresentar este antígeno às células do sistema imune, e a melhor forma de o apresentar é utilizando um vetor que possua características constitucionais similares ao patógeno. O M. smegmatis tem características únicas que permitem a boa apresentação de antígenos recombinantes à células apresentadoras de antígenos, tais como a não inibição da maturação do fagossoma. Em nossos estudos, a transformação de Mycobacterium smegmatis mc2 155 com o plasmídeo pLA71-CMX gerou a vacina recombinante mc2CMX, o qual expressou eficientemente a proteína CMX. Camundongos BALB/c imunizados com a vacina mc2-CMX apresentaram resposta imune humoral específica para CMX similar a resultados obtidos por de Sousa et. al., (2012), com a proteína de fusão, mostrando que o mc2-CMX foi um bom vetor vacinal, mantendo a imunogenicidade do antígeno recombinante (figuras 4 e 5). Vários outros estudos realizados com o vetor M. smegmatis têm demonstrado a habilidade deste vetor em expressar proteínas recombinantes e induzir resposta imune específica como observado por exemplo no estudo realizado por Zhang et al., (2010). Neste estudo, observou-se que a vacinação de camundongos com o M. smegmatis expressando uma proteína de 44 fusão ESAT6-CFP10, induziu uma melhor imunidade humoral e celular que a vacinação com BCG. Em outro estudo, realizado por Yi et al., (2007), notou-se que a imunização de camundongos BALB/c com M. smegmatis pZ607 recombinante, transportando IL-12/GLS, induziu uma eficiente resposta imune protetora Th1 com alta produção de IFN-γ e IL-12, similar à vacinação com BCG. Estes resultados em conjunto com os obtidos neste trabalho, demostram que o vetor M. smegmatis é um ótimo carreador de proteínas capaz de induzir em camundongos resposta imune específica para estas proteínas. A determinação de um protocolo de imunização é importante para avaliação de uma vacina. Em nossos estudos observamos que a imunização com uma única dose de mc2-CMX não induziu significante resposta imune humoral, mesmo na dose 108 UFC/animal (Figura 5), a qual induziu lesão no local da imunização (dados não mostrados). Quando imunizamos os camundongos com 107 UFC/animal em dois momentos, com intervalo de 15 dias, observamos um aumento significativo da resposta induzida. Dessa maneira, este protocolo foi o escolhido para avaliação da vacina mc2CMX (figura 8). Zhao et al. (2012), obtiveram resultados similares quando imunizaram camundongos BALB/c com M. smegmatis recombinante expressando a proteína de fusão HBHA-hIL12, observando que a imunização com uma única dose do recombinante não era suficiente para induzir resposta imune protetora desejada em camundongos, sugerindo a imunização em dois momentos com intervalos de duas semanas como esquema de imunização ideal. Possivelmente, a necessidade de uma dose reforço, pode estar relacionada à persistência de M. smegmatis mc2 155 in vivo. Em nosso estudo observamos que a persistência do mc2-CMX em camundongos BALB/c imunizados com uma única dose 108, foi de sete dias (Figura 6), sendo então necessário um reforço para recuperar as células do sistema imune induzidas inicialmente. Pelosi et al., (2012), observaram in vitro que após 48hs de infecção por M. smegmatis em macrófagos J774A, a infecção era resolvida, mostrando o que já estava postulado na literatura: a suscetibilidade de M. smegmatis aos mecanismos microbicidas dos macrófagos, fator que favorece à apresentação de antígenos beneficiando a indução de uma resposta Th1. Todavia, com esse rápido processamento e apresentação de M. smegmatis, diminui a persistência do antígeno dentro da APC dificultando a geração de uma resposta imune de memória, sendo necessário uma dose reforço para recuperar as células ativadas incialmente (KUEHNEL et al., 2001; ANES et al., 2006). 45 Apesar de ser determinante no controle de infecções, como por Leishmania major (WOELBING et al., 2006), o papel dos anticorpos na resposta imune contra tuberculose, não está claro. Todavia, estudos têm mostrado a importância das células B na geração de uma resposta imune protetora contra a infecção por Mtb (MAGLIONE et al., 2007; MAGLIONE et al., 2009). Torrado et al., (2013), observaram que camundongos deficientes na maturação de anticorpos são mais susceptíveis à infecção por Mtb, porém não determinaram o papel do anticorpos, pois ao injetar soro de camundongo normal não houve controle da infecção. Todavia, foi observada uma alta produção de IL-10 pelos camundongos deficientes, o que resultou numa maior susceptibilidade à infecção. Isso mostra que a indução de uma resposta humoral é importante no desenvolvimento de uma resposta imune protetora, pois esta pode não ser efetiva no controle da infecção, mas sim na modulação da resposta a ser desenvolvida, auxiliando na proliferação, diferenciação e sobrevivência de células T e até modulando a ativação dos macrófagos (ABEBE et al., 2009; TORRADO et al., 2013). Em nossos estudos a vacina mc2-CMX foi capaz de induzir níveis significativos de anticorpos da classe IgG1 e IgG2a, específicos para a proteína CMX (figura 8). O mesmo foi observado por de Sousa et al., 2012, ao imunizar camundongos BALB/c com a proteína CMX. Além disso, observamos que mesmo contendo os antígenos presentes na proteína CMX, a vacina BCG não induziu níveis significativos de anticorpos contra ela. Possivelmente, a baixa resposta observada nos camundongos imunizados com a BCG é devido à menor expressão da HspX pela bactéria, pois vários estudos têm mostrado, tanto em humanos quanto em camundongos, que a BCG não induz uma resposta imune específica contra a proteína (GELUK et al., 2007; SHI et al., 2010; SPRATT et al., 2010). Foi demonstrado também por de Sousa et al., (2012), que grande parte da resposta imune humoral induzida pela CMX, em camundongos, era específica para o antígeno HspX. As células T CD4 possuem um papel muito importante na controle da infecção por Mtb, pois estas secretam citocinas do tipo Th1, como IFN-γ e TNF-α, ativadoras de macrófagos (COOPER, 2009; BOLD et al., 2012). Diante disso, a migração destas células para o local da infecção, principalmente para o pulmão, é importante no desenvolvimento de uma resposta imune protetora, pois a secreção de citocinas como IFN-γ, pode induzir em macrófagos ações microbicidas como a produção dos reativos intermediários do oxigênio e nitrogênio e também, induzir a autofagia (FLYNN et al., 1993; SAUNDERS et al., 2002; GUTIERREZ et al., 2004; OTTENHOFF et al., 2012; 46 PHILIPS et al., 2012; SHALER et al., 2012). Outro mecanismo de proteção exercido pelas células T CD4 é auxiliar no desenvolvimento do granuloma, através da produção de TNF-α (KINDLER et al., 1989; FLYNN et al., 1995; RAMAKRISHNAN, 2012). Neste estudo foi observada uma migração de linfócitos T CD4 para o pulmão em todos os grupos desafiados com Mtb, mostrando que a infecção por si só foi capaz de induzir a migração destas células (Figura 9). Todavia, quando avaliamos o perfil de citocinas Th1 produzidas por estas células no pulmão, observamos que a produção de IFN-γ e TNF-α, foi maior no grupo de camundongos imunizados com a vacina mc2CMX, sendo significativa quando comparada ao grupo imunizado com a BCG (Figura 10 A e B). Resultados similares foram obtidos no estudo realizado por Zhang et al., 2010, cuja produção de IFN-γ pelas células T CD4 foi maior no grupo de camundongos que foram imunizados com o M. smegmatis expressando a proteína de fusão ESAT6CFP10 em comparação ao grupo BCG. A resposta imune que se tem por objetivo a ser induzida por uma vacina, a qual possa substituir ou melhorar a BCG, não é uma resposta imune melhor que a BCG, mas sim balanceada, cujos mecanismos de defesa do hospedeiro sejam otimizados e as lesões inflamatórias reduzidas, resultando no controle da infecção e manutenção da arquitetura do órgão infectado (OTTENHOFF, 2012a). Diversos estudos têm demonstrado que a proteção induzida pela vacina BCG não é totalmente dependente de IFN-γ, pois ao infectar camundongos vacinados com BCG deficientes de IFN-γ, estes apresentaram um maior controle da infecção do que camundongos depletados de células T CD4, mostrando que o controle da infecção por Mtb pode ser realizado por outros mecanismos dos linfócitos T CD4 não dependentes de IFN-γ, ou por outras células como as NK (COWLEY et al., 2003; MITTRUCKER et al., 2007; ABEBE, 2012). Em nossos estudos observamos este fenômeno, pois mesmo não induzindo uma produção significativa de citocinas como IFN-γ em comparação ao grupo infecção (Figura 10 A), camundongos imunizados com a vacina BCG apresentaram uma significante redução da lesão pulmonar, similar aos camundongos imunizados com a vacina mc2-CMX (Figura 11 C e D), os quais apresentaram porcentagens significativas de produção de citocinas do tipo Th1 (Figura 10 A e B). O mesmo foi observado ao avaliarmos a carga bacilar, pois camundongos imunizados com BCG apresentaram uma significante redução da carga bacilar em comparação ao grupo infecção, similar ao grupo imunizado com a com a vacina mc2-CMX (Figura 13). 47 Possivelmente, a resposta imune induzida pela nossa vacina é dependente de IFN-γ, diferente da vacina BCG. A produção de IFN-γ pelas células T CD4 é essencial no controle da infecção por Mtb, todavia esta produção não deve ser o único marcador de proteção a ser determinado numa vacina candidata contra a tuberculose (ABEBE, 2012). Ao observarmos os pulmões dos camundongos do grupo infecção, os quais apresentaram porcentagens significativas de citocinas Th1, observamos acentuada lesão tecidual acompanhada de aglomerados inflamatórios linfocíticos e macrofágicos, mostrando que não houve um controle da infecção (Figura 11 B e 12). Isto se confirmou ao determinamos carga bacilar no pulmão destes camundongos (figura 13), o quais apresentaram uma maior carga bacilar em comparação aos grupos vacinados. Provavelmente este fenômeno observado está relacionado ao fato de que uma resposta imune protetora não se resume à produção de citocinas Th1, mas sim ao balanceamento da resposta imune como um todo (WALZL et al., 2011). Torrado et al., 2013 observaram e demonstraram em seus estudos, a necessidade de uma resposta imune balanceada para controle da infecção por Mtb. Em seus estudos, camundongos deficientes na maturação de anticorpos apresentaram uma maior suscetibilidade ao Mtb em relação aos camundongos controles, embora estes apresentassem porcentagens similares de produção de citocinas Th1 e ativação de macrófagos. Interessantemente, ao avaliar o perfil de citocinas Th2 como a IL-10, observou-se uma maior porcentagem destas citocinas em relação aos controles. E ao determinar o perfil de ativação microbicida dos macrófagos, notou-se uma produção reduzida de iNOS nestes camundongos, sendo este o possível motivo de maior suscetibilidade. Possivelmente em nossos estudos, os camundongos do grupo infecção juntamente com a elevada reposta Th1 este apresentaram também uma resposta mais Th2, com maior produção de IL-10, que pode ter regulado negativamente a resposta Th1, resultando na redução da produção de iNOS pelos macrófagos, o que culminou em uma maior suscetibilidade a infecção e o não controle da mesma observado. O esquema de imunização primer-boost é uma alternativa na adição de propriedades imunogênicas a vacina BCG. A vacina mc2-CMX mostrou neste trabalho, sua capacidade de induzir em camundongos BALB/c uma resposta imune diferenciada e efetiva no controle da infecção, que poderia aumentar o efeito protetor da BCG se administrada em esquema de primer-boost. A vacina mc2-CMX apresenta 48 características significantes que a qualificam como uma boa candidata à vacina contra a tuberculose. 49 7 CONCLUSÕES A transformação do M. smegmatis mc2-155 com os plasmídeos pLA71/CMX, pLA73/CMX e pMIP12/CMX foram bem sucedidas. Somente o recombinante obtido com a transformação com o plasmídeo pLA71/CMX expressou a proteína CMX. O plasmídeo pLA71/CMX foi mantido pelo M. smegmatis in vitro e in vivo sem a pressão seletiva do antibiótico. A vacina mc2–CMX foi recuperada de camundongos em até 8 dias. A vacina mc2–CMX recuperada dos animais permaneceu com o plasmídio pLA71/CMX. A vacina mc2-CMX induziu uma resposta imune humoral específica para a proteína CMX em camundongos BALB/c, antes e após o desafio com Mtb. A imunização de camundongos BALB/c com a vacina mc2-CMX foi capaz de induzir em camundongos BALB/c uma significante resposta imune celular, a qual foi efetiva na redução da lesão pulmonar induzida pelo desafio com Mtb similar à vacina BCG. A resposta imune induzida pela vacinação com a mc2-CMX foi efetiva no controle da infecção, reduzindo de forma significativa a carga bacilar no pulmão quando comparado com o grupo infecção, portanto está resposta é protetora. A vacina mc2-CMX apresenta características significantes que a qualificam como uma boa candidata à vacina contra a tuberculose, sendo necessários ainda, estudos mais aprofundados, tais como a avaliação desta vacina em esquemas vacinais como primer-boost e também o entendimento dos mecanismos imunes pelos quais ela induz esta resposta observada. 50 8 REFERÊNCIAS ABBAS, A. K., LICHTMAN, A. H. . Imunologia Celular e Molecular. Elsevier, v. 5 ed., 2006. ABEBE, F. Is interferon-gamma the right marker for bacille Calmette-Guerin-induced immune protection? The missing link in our understanding of tuberculosis immunology. Clin Exp Immunol, v. 169, n. 3, p. 213-9, Sep, 2012. ABEBE, F.; BJUNE, G. The protective role of antibody responses during Mycobacterium tuberculosis infection. Clin Exp Immunol, v. 157, n. 2, p. 235-43, Aug, 2009. ADEREM, A.; UNDERHILL, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol, v. 17, p. 593-623, 1999. 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Prime–Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis Ana Paula Junqueira-Kipnis1*, Fábio Muniz de Oliveira1, Monalisa Martins Trentini1, Sangeeta Tiwari2, Bing Chen2 , Danilo Pires Resende1 , Bruna D. S. Silva1 , Mei Chen 2, Lydia Tesfa2,3, William R. Jacobs Jr 2 , André Kipnis1 1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil, 2 Microbiology and Immunology, Molecular Genetics, Albert Einstein College of Medicine, New York, New York, United States of America, 3 Flow Cytometry Core Facility, Albert Einstein College of Medicine, New York, New York, United States of America Abstract The development of a new vaccine as a substitute for Bacillus Calmette–Guerin or to improve its efficacy is one of the many World Health Organization goals to control tuberculosis. Mycobacterial vectors have been used successfully in the development of vaccines against tuberculosis. To enhance the potential utility of Mycobacterium smegmatis as a vaccine, it was transformed with a recombinant plasmid containing the partial sequences of the genes Ag85c, MPT51, and HspX (CMX) from M. tuberculosis. The newly generated recombinant strain mc2-CMX was tested in a murine model of infection. The recombinant vaccine induced specific IgG1 or IgG2a responses to CMX. CD4+ and CD8+ T cells from the lungs and spleen responded ex vivo to CMX, producing IFN-c, IL17, TNF-a, and IL2. The vaccine thus induced a significant immune response in mice. Mice vaccinated with mc2-CMX and challenged with M. tuberculosis showed better protection than mice immunized with wild-type M. smegmatis or BCG. To increase the safety and immunogenicity of the CMX antigens, we used a recombinant strain of M. smegmatis, IKE (immune killing evasion), to express CMX. The recombinant vaccine IKE-CMX induced a better protective response than mc2-CMX. The data presented here suggest that the expression of CMX antigens improves the immune response and the protection induced in mice when M. smegmatis is used as vaccine against tuberculosis. Citation: Junqueira-Kipnis AP, de Oliveira FM, Trentini MM, Tiwari S, Chen B, et al. (2013) Prime–Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. PLoS ONE 8(11): e78639. doi:10.1371/journal.pone.0078639 Editor: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, India Received August 5, 2013; Accepted September 21, 2013; Published November 8, 2013 Copyright: ! 2013 Junqueira-Kipnis et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work was funded by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientı́fico e Tecnológico (CNPq, grants numbers: 301976/2011-2, 472906/2011-9, 301198/2009-8, 472909/2011-8); Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás: FAPEG-PRONEX. APJK was awarded with a Science without borders senior training fellowship from CNPq. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interest exist. * E-mail: [email protected] To select molecules or agents that can be tested as TB vaccines, it is important to understand the immune response induced during TB infection. TB has several clinical forms, and approximately one third of the world population is infected with M. tuberculosis (Mtb), comprising a massive population of individuals with latent disease. It has been shown by our group and others that the immune response of individuals infected with Mtb specifically recognizes a set of proteins, including HspX, produced by Mtb bacilli under stress conditions that mimic in vivo circumstances [4– 7]. Patients that present with active pulmonary TB, for instance, preferentially recognize and respond to other Mtb antigens, i.e., the GLc-B, MPT51, Ag85 complex [8–12]. Some responses in patients with extrapulmonary forms of TB are the same as those seen with the active pulmonary TB form [12,13]. These features support the hypothesis that a good candidate vaccine should induce immune responses to antigens common to more than one form of TB and should include more than one protein in a single formulation. Antigens recognized by both the humoral and cellular immune responses might also improve the protection profile of a vaccine [14,15]. Introduction Tuberculosis (TB) was the eighth most frequent cause of death worldwide in 2008 according to a World Health Organization (WHO) report, although since the Millennium Development Goals and Stop TB Strategy were established by WHO, more than 51 million people have been successfully treated and cured of TB [1]. Although these data are encouraging, the incidence of the disease is persistently high in several countries, explaining the continual spread of TB. Early diagnostic and prophylactic strategies are still required to control TB. Bacillus Calmette–Guerin (BCG), the currently available vaccine for TB, although safe, does not protect against TB in adults [2]. To date, several TB vaccines have been tested in preclinical and clinical trials and in 2012, a review article described 12 promising vaccines. Those vaccines differ in their vaccination schemes and their use as primary vaccines or boosters for the BCG vaccine. The only vaccine being tested in a phase 3 trial to date is an attenuated Mycobacterium indicus pranii, to be used in immunotherapy [3]. PLOS ONE | www.plosone.org 1 November 2013 | Volume 8 | Issue 11 | e78639 76
