Laura Patricia Viana Maia

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
HEPATITE C EM PACIENTES PORTADORES DE INSUFICIÊNCIA RENAL
CRÔNICA: PERFIL SOROLÓGICO E ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE
HUMORAL E CELULAR
LAURA PATRICIA VIANA MAIA
MANAUS
2007
LAURA PATRICIA VIANA MAIA
HEPATITE C EM PACIENTES PORTADORES DE INSUFICIÊNCIA RENAL
CRÔNICA: PERFIL SOROLÓGICO E ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE
HUMORAL E CELULAR
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós Graduação em Doenças
Tropicais
e
Infecciosas
da
Universidade do Estado do Amazonas,
em convênio com a Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas, para
obtenção do título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador (a): Profª Drª ADRIANA MALHEIRO
Co-orientador (a): Prof° Dr. WORNEI S. BRAGA
MANAUS
2007
FICHA CATALOGRÁFICA
Maia, Laura Patricia Viana
Hepatite C em pacientes portadores de insuficiência renal crônica: perfil
sorológico e aspectos da resposta imune humoral e celular/Laura Patricia
Viana Maia, Manaus-AM, Universidade do Estado do Amazonas,
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, 2007
85 p. ilus.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Universidade do Estado
do Amazonas. Programa de Pós-graduação em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientadora: Malheiro, Adriana
Co-orientador: Braga, Wornei Silva
1. HCV 2. Pacientes hemodialisados 3. Resposta imune
II
Dedico este trabalho aos meus
pais,
Francisco e Conceição,
que sempre dedicaram o seu
amor ao meu desenvolvimento.
Agradeço
por
terem
orientado
a ser
me
humilde,
a
respeitar o próximo e amar a
Deus. Por me ensinarem que
todo trabalho bem feito deve
ser
realizado
com
amor.
Dedico a vocês este trabalho e
todas
as
adquiridas.
outras
Á
conquistas
vocês
amor e gratidão.
o
meu
III
AGRADECIMENTOS
Aos meus irmãos Helena e Adriano, pelo carinho e amizade.
Obrigada por me amarem.
À minha família pelos momentos que eu não pude estar presente.
Obrigada pela compreensão.
Ao Angelito pelo amor e companheirismo durante este período da minha vida.
Obrigada por estar me fazendo feliz.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho e em especial:
À minha amiga e orientadora Adriana Malheiro, exemplo de responsabilidade,
dedicação e sabedoria, que possibilitou ampliar meu conhecimento cientifico e me
ensinou a ser dedicada e critica. Agradeço pela confiança depositada.
À amiga Kátia Torres que me acolheu na iniciação cientifica no HEMOAM,
mostrando novas possibilidades de crescimento acadêmico. Agradeço por esta
conquista.
À Márcia Poinho pelo convite a participar do grupo de pesquisa do HEMOAM. Muito
obrigada.
Ao Dr. Rolandro Vermehren, por ter permitido a realização deste trabalho na Clínica
Renal de Manaus. À toda a equipe da Clínica e especialmente a Selma por sua
atenção durante o desenvolvimento da pesquisa. Agradeço a colaboração e atenção
de todos.
Ao Dr. Edvaldo Silva e Drª Márcia Alexandre pelo auxilio na realização dos testes
laboratoriais. Muito Obrigada.
Às minhas amigas Dena, Tati, Rose, Cris e Débora pela grande força durante a
realização dos testes. Agradeço o carinho e atenção de vocês.
À Josi pela sua amizade e pelos momentos de descontração. Muito Obrigada.
Ao Felicien Vasquez e Edson Lira por terem ajudado na análise estatística dos
dados do trabalho. Muito obrigada.
IV
Ao grupo de pesquisa do HEMOAM, que torceram pela realização desse trabalho.
Muito Obrigada.
A equipe do Laboratório de Análises Clínicas do HEMOAM pela ajuda na realização
dos testes. Muito Obrigada.
Ao Laboratório de sorologia do HEMOAM pela realização dos testes sorológicos.
Muito Obrigada.
Aos amigos da turma de 2005 do mestrado (Débora, Jander, Kleber, Fabiane,
Rosilene, Suiane, Flávio, Marcelo e a Graça) pela força durante as disciplinas e pela
amizade adquirida. Muito Obrigada.
À coordenação da Pós-graduação pela oportunidade de participar deste curso.
À CAPES pela bolsa de mestrado.
Ao CNPq, FAPEAM, HEMOAM e SUFRAMA pelo auxilio financeiro para o
desenvolvimento deste trabalho.
V
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Dados demográficos de pacientes renais crônicos infectados com o
Vírus da hepatite C.............................................................................
Tabela 02 Análise do percentual em relação a DO/Cut off do teste ELISA de
pacientes reativos para o Vírus da hepatite C (HCV).........................
Tabela 03 Perfil de bandas de proteínas do teste complementar Imunoblot em
pacientes renais crônicos infectados com o Vírus da hepatite
C.........................................................................................................
Tabela 04 Níveis de alanina aminotransferase (ALT) em pacientes renais
crônicos...............................................................................................
Tabela 05 Freqüência de co-infecções virais (HCV, HBV, HIV e HTLV) em
pacientes renais crônicos...................................................................
Tabela 06 Perfil de sub-populações de leucócitos do sangue periférico de
pacientes renais crônicos...................................................................
Tabela 07 Perfil fenótipico de linfócitos do sangue periférico de pacientes
renais crônicos....................................................................................
Tabela 08 Análise estatística descritiva do percentual de sub-populações de
leucócitos ativados..............................................................................
24
26
27
28
29
32
34
36
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Figura 02
Figura 03
Figura 04
Figura 05
Figura 06
Figura 07
Figura 08
Figura 09
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos
percentuais de populações celulares por citometria de fluxo...................
Percentual de pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise
na Clínica Renal de Manaus....................................................................
Análise do percentual e distribuição por tempo de soroconversão de
pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise.......................
Comparação nos níveis de Alanina aminotransferase (ALT) nos
pacientes renais crônicos HCV negativo e HCV positivo........................
Percentual de leucócitos totais e sub-populações de células circulantes
no sangue periférico de pacientes renais crônicos em tratamento de
hemodiálise com sorologia negativa para o Vírus da hepatite C e com
sorologia positiva......................................................................................
Percentual de linfócitos LTCD3+/CD4+ (A) e LTCD3+/CD8+ (B) no
sangue periférico de pacientes renais crônicos em tratamento de
hemodiálise com sorologia negativa para o Vírus da hepatite C e com
sorologia positiva......................................................................................
Percentual da sub-população de leucócitos ativados- linfócitos CD69+
(A), monócitos CD69+ (B), neutrófilos CD69+ (C) e eosinófilos CD69+
(D) no sangue periférico de pacientes renais crônicos em tratamento
de hemodiálise com sorologia negativa para o Vírus da hepatite C e
com sorologia positiva..............................................................................
Correlação de Spearman entre as populações de linfócitos T CD4+ e
linfócitos T CD8+ no grupo HCV positivo em tratamento de
hemodiálise..............................................................................................
Correlação de Spearman entre as populações de linfócitos CD69+ e
linfócitos CD4+ do grupo HCV positivo em hemodiálise..........................
Correlação de Spearman entre as populações de linfócitos CD69+e
linfócitos CD8+ do grupo HCV positivo em hemodiálise...........................
Correlação de Spearman entre os níveis de alanina aminotransferase
e as populações de linfócitos T CD4+ no grupo HCV positivo em
tratamento de hemodiálise.......................................................................
Correlação de Spearman entre os níveis de alanina aminotransferase
e as populações de linfócitos T CD8+ no grupo HCV positivo em
tratamento de hemodiálise.......................................................................
21
23
25
28
31
34
36
37
38
39
40
41
VII
ABREVIATURAS
ALT
alanina aminotransferase
APCs
células apresentadoras de antígeno
AST
aspartato aminotransferase
BA
Bahia
CAPD
diálise peritoneal ambulatorial continua
CE
Ceará
CEP
Comitê de ética em pesquisa
Cut off
ponto de corte
DP
desvio padrão
DO
densidade óptica
E
região estrutural
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA
enzyme linked immuno assay
FITC
isotiocianato de fluoresceína
FL
histograma de fluorescência
FSC
ganho de tamanho
°C
graus Celsius
GO
Goias
HBV
Vírus da hepatite B
HCV
HCV
Vírus da hepatite C
+
hepatite C positiva
HCV -
hepatite C negativa
HD
hemodiálise
HEMOAM
Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
HTLV
Vírus T linfótrópicos humano
IL
interleucina
IFN
interferon
IgG
Imunoglobulina G
IRC
Insuficiência renal crônica
L
Litro
VIII
LB
linfócitos B
LDH
lactato desidrogenase
+
LTCD4
linfócitos T CD4+
LTh
linfócitos T helper
LTc
linfócitos T citotóxicos
M
Molar
MDH
malato desidrogenase
MHC
complexo maior de histocompatibilidade
MG
Minas Gerais
mL
mm
Mililitro
3
Milímetro cúbico
mmol
milimol
µl
microlitro
NADH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido
NAD
Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NK
natural killer
NKT
natural killer T
nm
nanômetro
NS
região não-estrutural
OMS
Organização Mundial de Saúde
ORF
Open reading frame
PPT
Tubo de Plasma preparado
PBS
solução fisiológica tamponada com fosfato
PE
ficoeritrina
PR
Paraná
RNA
ácido ribonucleico
RC
renais crônicos
RE
Recife
rpm
rotações por minuto
SP
São Paulo
SSC
ganho de granulosidade
TNF
fator de necrose tumoral
TRS
terapia renal substitutiva
UTR
Região não traduzida
IX
RESUMO
Os indivíduos submetidos a tratamento de hemodiálise são considerados de
alto risco para infecção pelo Vírus da hepatite C (HCV). O objetivo deste estudo foi
avaliar a prevalência de anticorpos anti-HCV, a presença de co-infecção, os níveis
de alanina aminotransferase (ALT) e o perfil da resposta imune celular em pacientes
renais crônicos em tratamento de hemodiálise na Clínica Renal de Manaus - AM.
Realizou-se testes sorológicos (ELISA e Immunoblot) e citometria de fluxo, utilizando
anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD69 para identificar as
subpopulações de linfócitos. Entre os 402 pacientes em tratamento de hemodiálise,
62 apresentaram resultados reativos para anti-HCV, demonstrando uma
soroprevalência de 15,2%. Nossos resultados mostraram que 78,2% (n=43) destes
pacientes soroconverteram durante o tratamento, com um tempo médio de
hemodiálise de 82 meses antes da soroconversão. Detectou-se co-infecção HCV e
HBV em 36,4% (n=20) dos pacientes, 1,8% (n=1) em relação aos demais vírus
avaliados (HBV+, HIV+ e HTLV+). Os valores de ALT foram similares para ambos os
grupos, pacientes HCV positivos (26,13±19,63%) e controles (24,11±23,93%). A
análise do perfil celular demonstrou uma diferença estatisticamente significante entre
as médias percentuais de linfócitos totais no grupo controle (18,58±6,18%) e HCV
(28,79±13,22%). A citometria demonstrou aumento significante de LTCD4+ em
pacientes HCV positivos (40,14±9,28%) em relação ao controle (34,37±10,43%).
Porém, não foi observada diferença significativa para LTCD8+ entre os dois grupos,
HCV positivos (25,91±9,33%) e controle (23,08±9,91%). As médias percentuais de
neutrófilos e eosinófilos ativados (CD69+) foram significativamente maiores nos
pacientes HCV positivos. Os resultados deste estudo demonstraram uma elevada
prevalência do anti-HCV em pacientes em tratamento de hemodiálise em ManausAM e que a infecção pelo HCV altera o perfil da resposta imune celular nestes
pacientes.
Palavras-chaves: Hepatite C, hemodialisados, resposta imune celular.
X
ABSTRACT
The individuals undergoing to hemodialysis treatment are considered to be at
the high risk of developing a hepatitis C virus (HCV) infection. The aim of this study
was to evaluate the anti-HCV antibodies prevalence, the co-infection presence, the
alanine aminotransferase (ALT) levels and the profile of the cellular immune
response in chronic renal patient undergoing hemodialysis treatment in the Clinica
Renal de Manaus - AM.
Serological assays (ELISA e Immunoblot) and flow
cytometry were done; monoclonal antibodies anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 and antiCD69 were used in cytometry to identify lymphocyte sub-populations. Among the 402
patients undergoing hemodialysis treatment 62 presented reactive results for antiHCV assays, demonstrating a seroprevalence of 15.17%. Our results showed that
78.18% (n=43) of these patient seroconverted during the treatment, with a average
time of hemodialysis of 82 months before the seroconversion. HCV and HBV coinfection were detected in 36.4% (n=20) of the patients and 1.8% in relation to the
other appraised viruses (HBV+, HIV+ and HTLV+). The ALT levels were similar to
both groups, HCV positive patients (26.13±19.63%) and control (24.11±23.93%). The
analysis of the cellular profile demonstrated a statistically significant difference
between the percentile average of total lymphocytes in the control (18.58±6.18%)
and HCV (28.79±13.22%) groups. The analysis for cytometry demonstrated
significant increase of LTCD4+ in HCV positive patients (40.14±9.28%) in relation to
control (34.37±10.43%). It was not observed any significant difference in LTCD8+
between the two groups, positive HCV (25.91±9.33%) and control (23.08±9.91%).
The percentile averages of neutrophils and eosinophils activated (CD69+) were
significantly larger in the HCV positive patients. The study results demonstrated
increased prevalence of anti-HCV in patients undergoing hemodialysis in ManausAM and that the HCV infection modifies the profile of the cellular immune response in
these patients’ ones.
key-words: Hepatitis C, hemodialysis, cellular immune response
XI
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 01
1.1
Características do vírus da hepatite C (HCV)...................................... 01
1.2
Epidemiologia...................................................................................... 02
1.3
Formas de transmissão....................................................................... 03
1.4
Características clínicas da infecção e patologia................................. 04
1.5
Resposta imune ao vírus da hepatite C.............................................. 05
1.6
Resposta imune em pacientes renais crônicos................................... 09
2 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 12
3 OBJETIVOS.................................................................................................. 13
4 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................
4.1
Delineamento do estudo......................................................................
4.2
Pacientes/ Critérios de inclusão e exclusão........................................
4.3
Abordagem aos pacientes e coleta do material biológico...................
4.4
Diagnóstico laboratorial.......................................................................
4.4.1
Teste de triagem ELISA...................................................................
4.4.2
Teste complementar ........................................................................
4.4.3
Testes bioquímicos..........................................................................
4.4.3.1 Aspartato aminotransferase..........................................................
4.4.3.2 Alanina aminotransferase..............................................................
4.4.3.3 Bilirrubina.......................................................................................
4.4.4
Análise da expressão de moléculas de superfície através da
citometria de fluxo – FACS................ ………………………………..
4.5
Análise e interpretação dos dados......................................................
5 RESULTADOS..............................................................................................
5.1
Soroprevalência de HCV em pacientes em tratamento de
hemodiálise..........................................................................................
5.2
Análise de soroconversão para o HCV em pacientes renais crônicos
5.3
Relação densidade óptica e ponto de corte para reatividade ao HCV
pelo teste ELISA..................................................................................
5.4
Análise da distribuição das bandas de proteínas no Immunoblot.......
5.5
Análise bioquímica de alanina aminotransferase (ALT)......................
5.6
Percentual de pacientes HCV positivos co-infectados........................
5.7
Análise de populações e sub-populações de leucócitos em sangue
periférico..............................................................................................
5.8
Análise da população de linfócitos por citometria de fluxo..................
14
14
14
15
16
16
17
18
18
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19
20
22
23
23
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26
27
28
29
30
33
XII
5.9
Análise da sub-população de leucócitos por citometria de fluxo.........
5.10
Análise de correlação de Spearman....................................................
5.10.1 Correlação da população de linfócitos T CD4+ e CD8+....................
5.10.2 Correlação da população de linfócitos CD69+ com linfócitos T
CD4+ e CD8+....................................................................................
5.10.3 Correlação da ALT com linfócitos T CD4+ e CD8+...........................
35
37
37
6 DISCUSSÃO.................................................................................................
42
CONCLUSÕES................................................................................................
49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................
51
38
40
ANEXOS........................................................................................................... 59
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Características do vírus da hepatite C (HCV)
O Vírus da hepatite C (HCV) foi identificado por Choo e colaboradores em
1989, sendo inicialmente chamado de Vírus não A, não B. Devido a sua composição
estrutural foi classificado como pertencente à família Flaviviridae (CHOO et al, 1989)
e gênero Hepacivírus (SIMMONDS et al, 2005).
O HCV é um vírus de RNA de fita simples cujo genoma contém 9.400
nucleotídeos, possuindo apenas uma única fase de leitura (“open reading frame” ORF) que compreende quase todo o seu genoma e codifica uma poliproteína de
pouco mais de 3.000 aminoácidos, contendo uma região estrutural e uma não
estrutural (HOUGHTON et al, 1991). As proteínas não-estruturais NS2, NS3, NS4 e
NS5 representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral (SÁEZALQUEZAR et al, 2001). A região estrutural se localiza na porção aminoterminal da
proteína codificando a proteína C (core do nucleocapsídio viral – 19 kD) e as
glicoproteínas hipervariavíeis E1 (gp 33) e E2 (gp 72) constituintes do envelope
viral. A região do genoma que codifica a região estrutural (região 5’UTR do genoma)
e as 99 bases terminais da região 3’UTR , representa a seqüência mais altamente
conservada em relação a diferentes isolados virais, o que sugere cumprir com o
papel regulador durante a replicação viral (HOUGHTON et al, 1991; SIMMONDS et
al, 2005). No entanto, o Vírus da hepatite C apresenta uma característica importante
de variabilidade genética decorrente de mutações no genoma, causadas por erros
na etapa de replicação viral por ação da RNA polimerase (VAN DOORN, 1994).
Devido ao grande número de mutações no genoma, estudos filogenéticos
classificaram o HCV em diferentes tipos ou genótipos, além dos subtipos (CHAN et
al, 1992; SIMMONDS et al, 2005). O conhecimento da variabilidade genética
envolvida nas infecções é importante para compreender a evolução da doença,
conduzir tratamento antiviral, monitorar estudos epidemiológicos, além de ter
implicações importantes e decisivas no diagnóstico sorológico e molecular da
infecção (CARMO et al, 2002). As análises comparativas das seqüências
2
completamente ou parcialmente conhecidas dos isolados do HCV publicadas
indicam que existam pelo menos seis grupos distintos do vírus e mais de 50 subtipos
de HCV (PINHO et al, 2005; SIMMONDS et al, 2005).
Possivelmente, após a
análise completa de outras regiões do genoma dos isolados surgirão novos grupos e
subgrupos (SIMMONDS et al, 2005).
1.2 Epidemiologia
O Vírus da Hepatite C se distribui universalmente e a prevalência da infecção
na população varia de 0,3% a 14,5% (ALTER et al, 1989; GONÇALES, 1997).
Segundo estimativa da Organização Mundial de Saúde (OMS) a prevalência é 3%,
representando 180 milhões de pessoas infectadas pelo HCV no mundo (OMS 2007).
O HCV constitui um dos mais importantes problemas de saúde pública no mundo por
ser a maior causa de hepatite crônica e carcinoma hepatocelular (SANTANA et al,
2001; OMS, 2007). A infecção pelo HCV mantém alta incidência mundial, apesar da
significativa redução da transmissão por transfusão de sangue. No Estado do
Amazonas, dados de triagem sorológica da Fundação de Hematologia e
Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM) revelam que 0,6% dos doadores apresentam
soropositividade para anti-HCV (TORRES et al, 2001).
No Brasil, um estudo feito por Focaccia e colaboradores (2003) na cidade de
São Paulo demonstrou que a prevalência estimada era de 1,42%. Na população em
geral os dados ainda são muito inconclusivos, mas as estimativas atuais atingem
1,5% em média (FOCACCIA et al, 2003). Predominam no Brasil os genótipos 1, 2 e
3 (PINHO et al, 2005), sendo o genótipo 1b o de maior freqüência na população de
doadores de sangue, sendo também encontrados outros grupos os subtipos: 1a, 2a,
2b e 3a (BASSIT et al, 1999; OLIVEIRA et al, 1999). Recentemente foram
detectados o subtipo 4 (CARMO et al, 2002) e subtipo 5 (LEVI et al, 2002). Em
relação ao genótipo na Região Norte observa-se predomínio do genótipo 1 (74,1%),
seguido do genótipo 3 (24,7%) existindo também o genótipo 2 (1,2%) (PINHO et al,
2005).
3
Dados da literatura demonstram que em pacientes em tratamento por
hemodiálise ocorre uma grande incidência de soroconversão para anti-HCV. Na
Bélgica trabalhos relatam a positividade de 1,7% (JADOUL et al, 1993). Na
Alemanha observou-se que 6,1% dos pacientes apresentaram positividade para
anticorpos anti-HCV (HINRICHSEN et al, 2002). Na América do Norte estima-se que
a prevalência de anticorpos anti-HCV em pacientes tratados com hemodiálise varia
de 15 a 48% (PEREIRA; LEVEY, 1997). Em relação ao Brasil observamos que a
prevalência de anticorpos anti-HCV varia de um Estado para outro. Em Fortaleza –
CE, a prevalência média é de 52% (MEDEIROS et al, 2004), Salvador - BA 10,5%
(SILVA et al, 2006), Recife - RE 8,4% (ALBUQUERQUE et al, 2005), São Paulo –
SP 14,6% (MOREIRA et al, 2003), Curitiba - PR 39,2% (CARVALHO et al 1999),
Belo Horizonte - MG 20% (BUSEK et al, 2002) e Goiânia – GO 46,7% (CARNEIRO
et al, 2001). No entanto, não existem dados epidemiológicos relacionados ao Estado
do Amazonas nesta população.
1. 3 Formas de transmissão
A Hepatite C é considerada uma doença transmissível pelo sangue e seus
derivados, sendo o principal agente etiológico das hepatites pós-transfusionais no
Mundo (ALTER et al 1989; MINOLA et al, 2002). O risco de transmissão da hepatite
C transfusional diminuiu com a introdução de testes sorológicos de triagem em
bancos de sangue (TORRES et al, 2001). No entanto, outros fatores contribuem
para a transmissão do HCV transfusional. Na Itália, antes da introdução do teste de
detecção do anti-HCV entre os doadores de sangue mais de 10% dos transfundidos
nos anos 80 apresentaram evidências clínicas de hepatite pós-transfusional
(MINOLA et al, 2002).
Trabalhos têm demonstrado que algumas populações estão mais suscetíveis
à infecção pelo HCV. A presença de anti-HCV ocorre em 60 a 80% dos hemofílicos,
em 50 a 70% dos usuários de drogas endovenosas, em 21% dos pacientes
talassêmicos politransfundidos (CARMO et al, 2002; HAHN et al, 2001; JAISWAL et
al, 2001) e em 11 a 48% dos pacientes em tratamento prolongado de hemodiálise
4
(BUSEK et al, 2002), o que demonstra bem o potencial do sangue de transmitir a
hepatite C (YOSHIDA et al, 1992).
Quanto aos fatores de risco de contágio por hemodiálise o principal modo de
transmissão é por transfusões com sangue contaminado, mas a via nosocomial
(infecção adquirida em ambiente hospitalar) tem sido freqüentemente observada
(MEDEIROS et al, 2004). Oliveira e colaboradores (2001) e Silini e colaboradores
(2002) relatam que a transmissão nosocomial entre pacientes hemodialisados em
soroconversão pós-hemodiálise era freqüentemente causada pelo mesmo genótipo
viral. Estudos sugerem algumas causas de infecção como: a) segregação em sala
de diálise; b) frascos de heparina de uso coletivo; c) ausência de luvas na
manipulação de pacientes ou falta de troca de luvas entre a manipulação de cada
paciente; d) lavagem das mãos após troca das luvas entre pacientes; e) ausência de
limpeza e desinfecção de todos os instrumentos e superfícies ambientais
(MEDEIROS et al, 2004).
Outras formas de transmissão são através de seringas e agulhas
contaminadas (HAHN et al, 2001; OLIVEIRA et al, 1999), pelo transplante de órgãos
e tecidos (PEREIRA et al, 1991), por contato sexual (pouco freqüente) e por
transmissão vertical (transmissão da mãe para o filho durante a gestação, na hora
do parto ou durante o aleitamento) (GONÇALES et al, 2000).
1. 4 Características clínicas da infecção e patologia
A infecção aguda pelo HCV é normalmente assintomática e, por isso,
raramente reconhecida. O período de incubação varia de duas a 26 semanas, com a
média entre seis e 12 semanas (HELLER; REHERMANN, 2005) e a recuperação
completa é caracterizada pelo desaparecimento do RNA viral no sangue e pela
normalização dos níveis das enzimas hepáticas (DI BISCEGLIE, 1998). Apenas
cerca de 15% das infecções são autolimitada, a maioria evolui para uma infecção
persistente (HELLER; REHERMANN, 2005). Estima-se que a hepatite C seja a
5
causa mais comum de doença hepática, cirrose e câncer de fígado no mundo
(HAJJAR et al,1999).
Na infecção aguda, a icterícia ocorre em menos que 20% dos casos e parece
estar correlacionada com os níveis de RNA entre 105 a 107 cópias/mm3 de sangue
(ORLAND et al, 2001). Enquanto que a infecção crônica costuma apresentar-se de
forma oligossintomática, com manifestações clínicas inespecíficas como fadiga
muscular, artralgia, perda de peso, letargia, mialgias, febre baixa, náuseas, vômitos,
dor ou desconforto no quadrante superior do abdômen (CONTE, 2000). Um aspecto
clínico bastante característico do HCV é representado pelas elevações episódicas
nas transaminases séricas, com períodos interpostos de normalidade (ROSSINI et
al, 1995). Já foram descritas elevações transitórias nos níveis das transaminases em
11,9% dos pacientes com hepatite C, e essas elevações foram associadas com o
aumento da carga viral, na maioria dos casos, mas ocasionalmente houve
associação com alteração no genótipo viral, sugerindo re-infecção. Porém, nos
pacientes, considerados individualmente, o valor preditivo dessa associação foi
baixo, enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam graves alterações
histológicas (DI BISCEGLIE, 1998).
A persistência do vírus e as manifestações clínicas distintas estão
correlacionadas com as características imunológicas do hospedeiro e com a
evolução genética do vírus, isto é, com o tipo de variante viral responsável pela
infecção (ORLAND et al, 2001; BARRET et al, 2001).
1. 5 Resposta imune ao vírus da hepatite C
Segundo a revisão de Neumann-Haefelin e colaboradores (2005) a resposta
imune do hospedeiro é constituída pela imunidade inata através das barreiras físicas
(ex. pele), componentes celulares (ex. granulócitos) e componentes solúveis (ex.
fatores do complemento) e pela imunidade adaptativa composta da imunidade
humoral (anticorpos) e a imunidade celular (linfócitos T CD4+ e CD8+).
6
O papel da imunidade inata na hepatite C, com o envolvimento de
polimorfonucleares, células Natural Killer (NK), Natural Killer T (NKT) e das
linhagens fagocíticas, ainda não está totalmente elucidado, embora as células NK e
NKT pareçam ter função significativa na resposta imune em relação aos patógenos
hepatotrópicos, tais como o Vírus da hepatite C (FREEMANN et al, 2001). As
Células NK constituem a primeira linha de defesa contra patógenos e usualmente
tornam-se ativados na fase inicial da infecção viral. O fígado é particularmente rico
em células NK, que são ativados por vírus hepatotrópicos, como o HCV. A ativação
das células NK exerce um papel essencial no recrutamento de células T HCVespecíficas e eliminação de hepatócitos infectados diretamente por citólise ou
indiretamente pela secreção de citocinas, que induzem um estado antiviral nas
células do hospedeiro. Assim, elas seriam importantes para limitar a replicação viral
naquele órgão, ainda que também pudessem contribuir para o dano tecidual
hepático durante a resposta imunológica (AHMAD et al, 2004).
A hepatite C caracteriza-se por uma importante resposta adaptativa através
da imunidade humoral e celular (THIMME et al, 2002). A resposta imune humoral é
fundamental na neutralização de partículas virais livres e para impedir a entrada do
vírus nas células do hospedeiro (FUKUDA e NAKANO, 2003). Por outro lado, apesar
da existência de anticorpos neutralizantes, como aqueles contra a região E2 HVR, a
resposta humoral é muito ineficiente, talvez pela rápida seleção de variantes de
escape (CHANG et al, 2003) ou porque estes anticorpos falhem em induzir
“clearance” viral (NELSON et al, 2001). No entanto, a resposta imune celular (LT
CD4+) é crítica para a geração e manutenção de um estado antiviral, tanto pela
secreção de citocinas estimulatórias de linfócitos B, ativação de Linfócitos T CD8+
específicos como pela geração de uma memória imune celular (SHEDLOCK et al,
2003).
Assim, os linfócitos T helper são fundamentais na coordenação da imunidade
celular contra patógenos intracelulares. Essas células reconhecem os peptídeos
virais antigênicos ligados às moléculas de histocompatibilidade (MHC) de classe II
na membrana das células apresentadoras de antígenos. Os linfócitos T helper 1
favorecem
a
ativação
de
linfócitos
T
citotóxicos
CD8+
específicos
7
(PAPATHEODORIDIS et al, 1999) responsáveis pela eliminação das células
infectadas por vírus (LASARTE et al, 1998), enquanto linfócitos T helper 2 induzem a
proliferação de linfócitos B específicos e a produção de anticorpos anti-HCV
(PAPATHEODORIDIS et al, 1999). Os linfócitos T helper, produzem citocinas que
podem inibir a replicação viral. As respostas dos Linfócitos T helper aos diferentes
antígenos virais, incluindo o do core, estão associadas a uma evolução benigna da
infecção pelo Vírus da hepatite C (LASARTE et al, 1998).
Os linfócitos T CD8+ são fundamentais na evolução da infecção aguda pelo
HCV. Durante os primeiros seis meses da infecção, a citotoxicidade direta mediada
por linfócitos T CD8+ contra múltiplos epítopos de diferentes regiões estruturais ou
não-estruturais do HCV pode favorecer um caráter autolimitante da infecção pelo
HCV (GRÜNER, 2000).
Estudos sugerem que a resposta Th1 por linfócitos T CD4+ contra a fração
NS3 do vírus e possivelmente a outras proteínas não estruturais do HCV (NS4 e
NS5) contribuem para o sucesso do "clearance" viral. No entanto a resposta de
células mononucleares contra o core do vírus é mais comum em pacientes que
evoluem para a forma crônica da hepatite C (DIEPOLDER et al, 1995). Acredita-se
que o “clearance” viral está associado a uma forte resposta intra-hepática
multiespecífica de linfócitos T CD8+ contra o vírus, enquanto que a persistência viral
tem sido associada a uma fraca e limitada resposta destes linfócitos (THIMME et al,
2002; COX et al, 2005).
Apesar da resposta imune celular parecer ser eficiente no “clearance” viral
ainda não se conseguiu estabelecer qual a amplitude e o mecanismo da resposta
inicial do sistema imune frente ao reconhecimento do antígeno HCV, que faz com
que o curso da infecção siga em direção a cronicidade e não a cura (COX et al,
2005). A patogenia da hepatite C parece estar relacionada à intensidade da resposta
dos linfócitos T na fase inicial da infecção, a qual pode ser crítica na evolução da
doença (PAPATHEODORIDIS et al, 1999). É importante salientar que a reatividade
imunológica celular do hospedeiro, incluindo tanto os linfócitos T helper (CD4+)
quanto os linfócitos T citotóxicos (CD8+), encontra-se ativada em pacientes
8
infectados pelo vírus da hepatite C (NAVEAU et al, 1999). Durante a infecção pelo
HCV, citocinas são produzidas tanto no fígado como na circulação sanguínea,
assumindo papel importante no controle da replicação viral e contribuindo para o
dano tecidual através da amplificação de uma resposta imune inespecífica (NELSON
et al, 2001).
As citocinas são muito importantes na resposta imune contra as infecções,
como o Fator de necrose tumoral - alfa (TNF-α) e Interferon – gama (IFN-γ). Essas
citocinas possuem particular importância, pois elas participam desde a ativação
celular até o rolamento celular para o local da infecção viral. O IFN-γ tem um efeito
antiviral semelhante ao TNF-α, que contribui mediando a inflamação e reações
citotóxicas na infecção viral, porém o IFN-γ é liberado somente de células T
ativadas. As citocinas contribuem muito para a patogênese da infecção das
hepatites, pois estão envolvidas diretamente no curso da infecção (ESQUIVEL et al,
2002). Pacientes com infecção aguda e crônica apresentam níveis plasmáticos de
TNF-α elevados quando comparados com indivíduos não infectados. Níveis séricos
de TNF-α elevados previamente ao tratamento parecem estar associados com
resistência tratamento com INF-α (ESQUIVEL et al, 2002).
A produção de níveis inadequados de algumas citocinas parece contribuir
para a persistência do vírus e, também, influenciar a resposta à terapia antiviral na
infecção pelo HCV. Por exemplo, a quantidade de interleucina-10 (IL-10) produzida
pode potencialmente influenciar a evolução da doença, uma vez que a IL-10 parece
ser capaz de controlar a resposta imune antiviral do indivíduo (DE WAAL MALEFYT,
1998), sendo que seu declínio precoce pode favorecer uma mudança da resposta
imune tipo Th2 para Th1, levando a uma resposta terapêutica sustentada (TORRE et
al, 2004) . Segundo Torre e colaboradores (2004) os níveis séricos de IL-10 e de
outras citocinas do tipo 2 (IL-4, IL-5 e IL-13) encontram-se bastante elevados em
pacientes com infecção crônica pelo HCV não tratados quando comparados com
indivíduos sadios, sugerindo que o desvio do perfil imunológico para um padrão do
tipo 2 poderia comprometer a resposta imune do hospedeiro, resultando na infecção
crônica pelo HCV. Níveis séricos elevados de IL-10 também parecem estar
associados com persistência da viremia e resistência à terapia antiviral com INF-α .
9
1. 6 Resposta imune em pacientes renais crônicos
Okuda e Yokosuka (2004) publicaram um estudo tipo coorte com 189
pacientes com anti-HCV positivo e em tratamento de hemodiálise, acompanhados
por mais de quatro anos, e concluíram que a infecção pelo HCV neste grupo de
pacientes possui uma história natural diferente do paciente não-renal, com uma
atividade menos intensa de doença, assim como uma menor progressão para a
cirrose, provavelmente devido à anormalidades na resposta imunológica destes
pacientes.
Em um estudo clássico da resposta imune celular e humoral, Giacchino e
colaboradores (1982), demonstraram que a imunidade celular estava muito
comprometida em pacientes com insuficiência renal crônica (IRC) inicial ou em
hemodiálise, e menor comprometimento da imunidade humoral, com contagem de
linfócitos B e dosagens de imunoglobulinas normais, e somente uma redução de
uma proteína do complemento (C3). Pacientes com IRC possuem uma
imunodeficiência caracterizada por complicações mais freqüentes às infecções e
baixas respostas às vacinações. Esta imunodeficiência é influenciada tanto pela
uremia como pela terapia renal substitutiva (TRS) (KAUL et al, 2000).
Barros e Romão (1996) sugeriram que o comprometimento geral da
imunidade poderia ser atribuído à uremia, à associação de múltiplas doenças
crônicas e, ainda, aos fatores relacionados a TRS, como a modalidade e tempo de
diálise. Na uremia, a alteração da homeostase pode estar diretamente relacionada
à regulação anormal da apoptose, um processo crucial para manter as funções
biológicas. Pacientes em hemodiálise (HD) apresentam alteração na apoptose se
comparados àqueles em diálise peritoneal e a controles sadios. Esse fato também
pode estar envolvido na disfunção imune em pacientes sob HD (D’INTNINI et al,
2003). Outros fatores que podem contribuir para diminuir a resposta imune são a
anemia e a desnutrição, que o tratamento em diálise acentua (BARROS; ROMÃO,
1996).
10
A interferência da biocompatibilidade das membranas dialisadoras nos níveis
séricos de citocinas, durante o procedimento da hemodiálise, é assunto
controverso. Acredita-se que essas membranas levem à ativação da imunidade
humoral, do sistema complemento, causando liberação de C3a e C5a, de
neutrófilos (GIACCHINO et al, 1982) e levando os monócitos a gerarem citocinas
como IL-1, IL-6 e TNF alfa (PASTAN e BAILEY, 1998). As moléculas médias do
soro urêmico são retidas nas membranas, o que pode, teoricamente, contribuir para
diminuir a função dos linfócitos T e, conseqüentemente, inibir a estimulação de
linfócitos pelos mitógenos, a proliferação de fibroblastos e a atividade fagocítica dos
leucócitos.
Várias
hipóteses
tentam
explicar
essas
alterações;
contudo,
permanecem as controvérsias. Tem-se notado, por exemplo, que a HD não parece
contribuir para essas alterações; o que se observa, na prática, nesses pacientes, é
a progressiva diminuição da imunidade, que tem relação direta com o tempo de HD
(GIACCHINO et al, 1982).
Nos pacientes com IRC em programa de diálise, as múltiplas transfusões
sangüíneas e a reposição de ferro durante o uso da eritropoietina levam ao
acúmulo de ferro e a hemossiderose hepática, podendo agravar as lesões
causadas pelo vírus C (BARROS; ROMÃO, 1996).
A resposta proliferativa das células mononucleares periféricas tende a ser
deprimida nos pacientes urêmicos em relação aos controles não urêmicos, a
despeito das controvérsias a esse respeito. Estudos in vitro demonstram que a
produção do IFN gama pelos linfócitos, necessário para a ativação de macrófagos,
linfócitos B e linfócitos T citotóxicos, é reduzida em pacientes urêmicos (YOUSEFI
et al, 1987), mas não nos pacientes em hemodiálise (DAICHOU et al, 1999).
Também se observa diminuição na produção de Interleucina-2 (IL-2) e,
conseqüentemente,
há
comprometimento
da
resposta
proliferativa
e
da
diferenciação linfocítica dos linfócitos B. Acredita-se que a HD possa remover
moléculas e, entre estas, a IL-2. A redução da IL-2 na uremia tem sido um fator
fundamental para explicar a imunodeficiência que ocorre em pacientes urêmicos
(WALDHERR et al, 1992). Todavia, a função dos macrófagos parece estar
preservada em urêmicos (YOUSEFI et al, 1987) e aumentada nos pacientes
11
hemodialisados (DAICHOU, et al, 1999). No entanto muitos estudos ainda precisam
ser feitos para relacionar a infecção pelo HCV com a imunidade.
12
2 JUSTIFICATIVA
A população de indivíduos submetidos ao tratamento de hemodiálise é
considerada de alto risco para infecção pelo HCV, devido a exposição constante à
transfusões sanguíneas e a materiais possivelmente contaminados, como relatado
na introdução do trabalho.
Observa-se que indivíduos que iniciaram protocolos de tratamento por
hemodiálise com sorologia negativa para marcadores para o HCV, após várias
sessões, soroconvertem e passam a apresentar anticorpos anti-HCV nos testes de
triagem. Este fato pode ser relacionado com a transmissão nosocomial, através da
utilização de máquinas de diálise única para todos os pacientes, frascos de heparina
de uso coletivo, ausência de luvas na manipulação de pacientes ou falta de troca de
luvas entre a manipulação de cada paciente e ausência de limpeza e desinfecção de
todos os instrumentos e superfícies ambientais.
Dados da literatura demonstram que a prevalência de soroconversão para
HCV em pacientes em hemodiálise pode chegar a 90% como relata Okuda e
Yokosuka (2004) no Japão e, no Brasil, estudos mostram um percentual de 52%
como o de Medeiros (2004) em Fortaleza. No entanto, a prevalência de
soroconversão para anti-HCV em pacientes em tratamento por hemodiálise da
cidade de Manaus não é conhecida, desta forma é de fundamental importância à
pesquisa destes dados nesta população, uma vez que conhecido o número, se alto,
pode-se propor uma melhoria no serviço de hemodiálise.
Em adição, propomos avaliar a resposta imune em indivíduos infectados com
o Vírus da hepatite C (HCV), que apresenta mutações durante a replicação viral,
dificultando o seu reconhecimento pelo sistema imunológico e dificultando a
elaboração de protocolos terapêuticos eficientes e a produção de vacinas para o
controle da infecção. Desta forma o entendimento dos processos imunes envolvidos
na resposta contra o HCV é parte importante na análise do diagnóstico clínico e
laboratorial da infecção.
13
3 OBJETIVOS
3.1 Geral:
Estimar a soroprevalência e o perfil da resposta imune celular contra o Vírus
da hepatite C, associado ou não a prevalência de co-infecção com outras doenças
de transmissão parenteral em pacientes com insuficiência renal crônica.
3.2 Específicos:
1. Estimar a soroprevalência de anticorpos anti-HCV em pacientes renais
crônicos.
2. Estimar a freqüência de soroconversão para o HCV durante o tratamento de
hemodiálise e relacionar com o tempo de eventos de hemodiálise.
3. Estudar o padrão sorológico do teste ELISA (relação DO/Cut off) para o HCV.
4. Estudar o padrão de bandas encontradas nos testes complementares
Imunoblot para o HCV.
5. Analisar os níveis de Alanina aminotransferase (ALT) e Bilirrubinas (BD/BT).
6. Estudar a freqüência de co-infecção de HCV com outras doenças de
transmissão parenteral (HIV, HBV e HTLV) na população de hemodialisados.
7. Analisar o perfil da resposta imunológica celular, através de marcadores de
superfície celular para linfócitos T CD4+ e CD8+ e avaliar as populações de
leucócitos ativados através do marcador CD69+.
14
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo observacional descritivo de casos.
4.2 Pacientes/ Critérios de inclusão e exclusão
Em Manaus existem dois serviços de hemodiálise, o Centro de doenças
Renais com 132 pacientes/mês e a Clínica Renal de Manaus com 400
pacientes/mês. O presente estudo foi realizado na Clínica Renal de Manaus, pois é o
serviço mais antigo e com maior número de pacientes cadastrados. O projeto de
pesquisa foi apresentado ao Comitê de Ética em Pesquisa - CEP da Fundação de
Hematologia e Hemoterapia do Amazonas - HEMOAM em 09 de agosto de 2005 e
aprovado em 28 de novembro de 2005, com o parecer 19-05 (em anexo).
Para o estudo de soroprevalência para HCV foram incluídos todos os
pacientes maiores de 18 anos que estavam em tratamento de hemodiálise. Os
pacientes HCV positivos foram convidados a participarem da pesquisa e submetidos
a novos testes de diagnósticos para análise do perfil sorológico, bioquímico e celular.
Pacientes HCV positivos co-infectados com outras doenças de transmissão
parenteral (HIV, HBV, HTLV, Doença de Chagas e sífilis) também foram incluídos na
pesquisa. Os pacientes menores de dezoito anos e mulheres gestantes foram
excluídos do estudo.
Para efeito de comparação da análise da resposta imune celular foram
incluídos 55 pacientes em hemodiálise, maiores de dezoito anos e que não
apresentavam nenhuma infecção no momento da coleta. A seleção dos pacientes foi
realizada por conveniência e o número de participantes foi determinado de acordo
com o número de pacientes soropositivos para HCV.
15
4.3 Abordagem dos pacientes e coleta do material biológico
Durante a consulta médica os pacientes HCV positivos receberam
esclarecimentos dos objetivos do estudo pela pesquisadora, a participação na
pesquisa não foi remunerada e os pacientes foram orientados em relação à
possibilidade de desistência, com garantia de continuidade da assistência médica,
caso desejassem, em qualquer etapa da pesquisa. Os pacientes que concordaram
em participar da mesma foram convidados a assinar um termo de consentimento
livre e esclarecido (Anexo 6.1), e foi aplicado um questionário (Anexo 6.2) para
investigação dos dados demográficos e epidemiológicos.
As informações clínicas e laboratoriais foram coletadas através do sistema
informatizado Dialsist da Clínica Renal de Manaus do início do tratamento de
hemodiálise até julho de 2006 e compiladas na ficha de acompanhamento dos
pacientes conforme anexo 6.2. Em seguida, foi coletada através de punção venosa,
amostra de 20 mL de sangue periférico, distribuído em três tubos: 10 mL no tubo
sem anticoagulante, 5 mL no tubo PPT e 5 mL no tubo com EDTA para
processamento e análise dos testes previstos neste estudo e armazenamento para
estudos posteriores. A coleta foi realizada por pessoas da equipe da Clínica Renal e
acompanhada pela pesquisadora.
As amostras coletadas foram identificadas com as iniciais do nome do
paciente e o número de identificação; e levadas ao HEMOAM, onde feito cadastro,
como de rotina do serviço do laboratório, no sistema de banco de dados (X-Clinic) de
pacientes do HEMOAM, e foram enviadas ao laboratório para processamento. O
tubo sem anticoagulante foi centrifugado para obtenção de soro. O soro foi separado
em três tubos de hemólise devidamente identificados com nome e data de
nascimento do paciente e data da rotina do laboratório.
Um tubo de hemólise foi para o laboratório de sorologia para realização dos
testes (ELISA e Imunoblot), foram armazenadas duas alíquotas de 180 µl em placas
de soroteca, por um período de 1 (um) ano para fins de contraprova (como de rotina
do laboratório); o segundo foi armazenado para a dosagem de citocinas e o terceiro
16
foi enviada para o laboratório de Bioquímica onde foram realizados os testes das
transaminases e das bilirrubinas. Após realização dos testes as amostras restantes
foram desprezadas.
O tubo de PPT contendo 5 mL de sangue e duas alíquotas de sangue total
em EDTA foram armazenados a -70°C para estudo posterior de genotipagem. Uma
alíquota contendo 3 mL de sangue total em EDTA foi utilizado para a análise celular
por citometria de fluxo.
O grupo controle, constituído por soronegativos para HCV ou outras
infecções, e em tratamento de hemodiálise foram abordados durante a sessão de
hemodiálise onde receberam esclarecimentos dos objetivos do estudo pela
pesquisadora e foram convidados a assinar o termo de consentimento livre e
esclarecido (Anexo 6.3). Foram coletados 5 mL de sangue em tubo com EDTA para
a realização dos testes de citometria de fluxo e 5 mL em tubo de hemólise foi
armazenado para estudos posteriores.
4.4 Diagnóstico Laboratorial
Os testes de triagem para detecção de anticorpos anti-HCV foram realizados
pela Clínica Renal através de teste ELISA por micropartículas 3a geração (Axysm –
Abbott) e no laboratório de sorologia da Fundação HEMOAM através de teste ELISA
em microplacas de 3a geração (Murex anti HCV–Versão 4.0/Abbott). Os testes
complementares para detecção de anticorpos anti-HCV foram realizados no
HEMOAM pela técnica de Immunoblot (CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA).
4.4.1 Teste de triagem - ELISA
O teste ELISA em microplaca se baseia na detecção de anticorpos anti-HCV
utilizando-se microplacas revestidas com antígenos altamente purificados que
contêm seqüências das regiões do Core, NS3, NS4 e NS5 do HCV.
17
O teste é realizado em equipamento automatizado (Genesis -Tecan/Abbott) e
feito de rotina no laboratório de sorologia do HEMOAM, de acordo com as
especificações do fabricante e baseia-se no adicionamento de 180 µL de diluente da
amostra (tampão contendo proteínas de origem bovina e suína, contendo Bronidox
® a 0,05% e azida sódica a 0,1% como conservante), em seguida 20 µL de amostra
e controles, a placa é coberta com tampa e incubada por 1 hora a 37°C, ao término
deste período lava-se a placa utilizando cinco ciclos de lavagem usando solução de
lavagem (solução de lavagem glicina/borato 20 vezes concentrada e como
conservante Bronidox ® a 0,2%) diluída – 1:20. Após a lavagem adiciona-se 100 µL
do conjugado (anticorpo monoclonal de camundongo contra IgG humana liofilizado,
marcado com peroxidase de rábano em uma base de proteína bovina) em cada
poço, cobre-se as cavidades com a tampa e incuba-se por mais 30 minutos a 37°C,
ao final do período lava-se novamente as placas, adiciona-se 100 µL da solução de
substrato (citrato trissódico, peróxido de hidrogênio, 3,3' ,5,5' - tetrametilbenzidina TMB- e estabilizantes) para o desenvolvimento da cor, cobriu-se com a tampa e
incubou-se por mais 30 minutos a 37°C. Em seguida adiciona-se 50 µL de solução
de parada de reação (ácido sulfúrico 0,5M), realizando a leitura em seguida em
espectrofotômetro a 450 nm . O ensaio foi realizado em equipamento automatizado
(Genesis - Tecan/Abbott), de acordo com as especificações do fabricante. Os
resultados obtidos foram compilados em ficha de acompanhamento do paciente
padronizada para este estudo (anexo 6.2).
4.4.2 Teste Complementar/confirmatório
O teste complementar Immunoblot foi realizado nas amostras de pacientes
reativos nos teste ELISA, este se baseia na detecção de anticorpos anti-HCV contra
antígenos recombinantes representativos do Core e das regiões NS3, NS4 e NS5 do
HCV.
O teste é realizado em equipamento automatizado (Profblot – Tecan/Abbott) e
feito de rotina no laboratório de sorologia do HEMOAM, de acordo com as
especificações do fabricante. Tiras individuais de Immunoblot são transferidas para
18
tubos de análise, adicionando 1 mL de diluente de amostra (solução fisiológica
tamponada com fosfato [PBS] com estabilizadores de proteína bovina e
detergentes), adiciona-se 20 µl da amostra, coloca-se a tampa e inverte para
misturar, coloca-se os tubos no oscilador, oscila a 16-20 ciclos/minuto por 4 horas à
temperatura ambiente (15 a 30°C). Após completar o tempo, aspira todo o liquido e
acrescenta-se mais 1 mL do diluente da amostra e coloca-se para oscilar por mais
30 minutos a temperatura ambiente e aspira o liquido novamente. Adiciona-se 1 mL
de tampão de lavagem (solução detergente com tampão de fosfato contendo timerol
como conservante) e despreza-se o liquido e as tiras no recipiente de lavagem
contendo 10 mL de tampão de lavagem mexendo as tiras no recipiente de lavagem,
adiciona-se mais 30 mL de tampão de lavagem e decanta o tampão, ficando as tiras
retidas no recipiente de lavagem (repete-se este procedimento de lavagem duas
vezes). Adiciona-se 1 mL de conjugado por tira em cada recipiente de lavagem, girase o recipiente de lavagem num agitador rotativo a 110±5 rpm por 10 minutos à
temperatura ambiente. Após completar a incubação do conjugado, o mesmo é
decantado e lava-se as tiras com 30 mL de tampão de lavagem (processo repetido
por duas vezes), decantando o tampão. Adiciona-se 1 mL de substrato de trabalho,
girando o recipiente de lavagem num agitador rotativo a 110±5 rpm por 20 minutos à
temperatura ambiente. O substrato é decantado e lava-se as tiras, adicionando-se
60 mL de água destilada. Decanta-se a água e repete este passo duas vezes.
Usando pinças retira-se as tiras e transfere-se para papel absorvente para eliminar o
excesso de água, deixando as tiras secar por 30 minutos no escuro a temperatura
ambiente. Fazendo a interpretação das tiras antes de 3 horas após o termino do
teste. Os resultados obtidos foram compilados em ficha de acompanhamento do
paciente padronizada para este estudo (anexo 6.2).
4.4.3 Testes bioquímicos
4.4.3.1 Aspartato aminotransferase (AST)
A análise baseou-se em reações enzimáticas onde a AST catalisa a
transferência do grupo amina do ácido aspártico para o cetoglutarato com formação
19
de glutamato e oxalacetato. O oxalacetato é reduzido a malato por ação da malato
desidrogenase (MDH), enquanto a coenzima NADH é oxidada a NAD. O reagente de
uso é colocado em contato com a amostra e incubado por 1 minuto. A redução da
absorbância em 340 ou 365 nm, conseqüente à oxidação da NADH, foi monitorada
fotometricamente, sendo diretamente proporcional à atividade da AST na amostra.
Os ensaios foram realizados com kit da ABBOT Clinical chemistry em equipamento
automatizado (Alcyon 300 – Abbott).Os resultados obtidos foram compilados em
ficha de acompanhamento do paciente padronizada para este estudo (anexo 6.2).
4.4.3.2 Alanina aminotransferase (ALT)
A análise baseou-se em reações enzimáticas, a ALT catalisa a transferência
do grupo amina da alanina para o cetoglutarato com formação de glutamato e
piruvato. O piruvato é reduzido à lactato por ação da lactato desidrogenase (LDH),
enquanto a coenzima NADH é oxidada à NAD. O reagente de uso é colocado em
contato com a amostra e incubado por 1 minuto. A redução da absorbância em 340
ou 365 nm, conseqüente à oxidação da NADH, foi monitorada fotometricamente,
sendo diretamente proporcional à atividade da ALT na amostra. Os ensaios foram
realizados com kit da ABBOT Clinical chemistry em equipamento automatizado
(Alcyon 300 – Abbott). Os resultados obtidos foram compilados em ficha de
acompanhamento do paciente padronizada para este estudo (anexo 6.2).
4.4.3.3 Bilirrubina
Bilirrubina direta - O método usado para testar a bilirrubina está baseada na
reação entre a bilirrubina e as soluções ácidas de sulfanílico diazotizadas. Em
soluções aquosas, somente a bilirrubina direta reage desta maneira. A bilirrubina
conjugada reage com o ácido sulfanílico diazotizado para produzir um ácido
azobilirrubina cuja absorbância é proporcional à concentração da bilirrubina direta na
amostra e pode ser medida a 550 nm.
●
Bilirrubina total - A forma não conjugada está firmemente limitada à albumina,
este complexo bilirrubina-albumina não é solúvel em água e portanto exige um
20
acelerador, ou um agente solvente, para remover a bilirrubina da albumina para que
reaja com o ácido sulfanílico diazotizado.
O método da bilirrubina total usa o
surfactante como um solubilizante. O nitrito de sódio é adicionado ao ácido
sulfanílico para formar o ácido sulfanilico diazotizado. A bilirrubina reage com o
ácido sulfanílico diazotizado para produzir a azobilirrubina, cuja absorbância é
proporcional à concentração da bilirrubina na amostra, e pode ser medida 550 nm. A
bilirrubina total usa um método de surfactante. Os ensaios foram realizados com o kit
Labtest (constituído por reagente acelerador – cafeína 130mmol/L, benzoato de
sódio 260 mmol/L, acetato de sódio 460mmol/L e surfactante – ácido sulfanílico 5,75
mmol/L e diazo reagente – 1 gota de nitrito de sódio 72,5 mmol/L e 1,5 mL do ácido
sulfanílico) em equipamento automatizado (Alcyon 300 – Abbott). Os resultados
obtidos foram compilados em ficha de acompanhamento do paciente padronizada
para este estudo (anexo 6.2).
4.4.4 Análise da expressão de moléculas de superfície através da citometria de
fluxo.
Amostra de 50 µL de sangue venoso coletada com EDTA foram incubadas
com anticorpos monoclonais por 20 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da
luz. Os marcadores de superfície celulares avaliados: anti-CD8 (code MHCD0801,
lote 08090506, marca CALTAG) e anti-CD69 (code MHCD6901, lote 04120906,
marca CALTAG) marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) , anti-CD4
(code MHCD0404, lote 23031206, marca CALTAG) marcados com ficoeritrina (PE)
e anti-CD3 (code MHCD0306, lote 60010708, marca CALTAG) marcado com
terceira cor, foram colocados no fundo dos tubos. Após a marcação dos glóbulos
brancos, as hemácias presentes foram lisadas com 2 mL de Solução de lise. Em
seguida lavadas com 2mL de PBS (solução fisiológica tamponada com fosfato) e
centrifugadas por 7 minutos, a 1300 rotações por minuto. Posteriormente desprezouse o sobrenadante por inversão e adicionou-se 300 µL de PBS a 1% de formaldeído.
A leitura foi realizada no laboratório de Citometria de Fluxo do HEMOAM, no
citômetro de fluxo FACScalibur com sistema de detecção de quatro cores (Becton
Dickinson).
21
A identificação das populações celulares de interesse foi realizada utilizandose o programa Cell-Quest. Primeiro identificou-se a população de linfócitos,
neutrófilos, monócitos e eosinófilos, utilizando gráficos “dot plot” onde a população
de interesse ocupa uma região característica após ajustes de ganhos de seu
tamanho (FSC) e granulosidade (SSC), (FIG. 1A). Após a seleção da região de
interesse, analisou-se a intensidade de fluorescência apresentada pelas células
marcadas nesta região, através de histograma de fluorescência 1 (FL1) versus
fluorescência 2 (FL2) (FIG. 1B). Após a definição das regiões, o percentual de
células positivas foi determinado utilizando-se de um histograma simples de análise
da região. Os resultados obtidos foram anexados na ficha de acompanhamento do
paciente padronizada para este estudo (anexo 6.2).
(A)
(B)
R2
Figura 01: Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
de populações celulares por citometria de fluxo. (A) Gráficos Dot plot FSC x SSC são
utilizados para seleção da população linfocitária – R2. (B) Histograma; FL1 x FL2 são
utilizados para avaliar parâmetros de interesse em populações celulares específicas.
22
4.5 Análises e interpretação dos dados
As ferramentas estatísticas utilizadas neste estudo foram do tipo descritiva e
inferêncial. Os resultados obtidos estão representados em tabelas e gráficos de
distribuição de freqüência, e para as análises inferênciais utilizamos o teste t de
student (dados paramétricos) ou Man-Whitney (não-paramétricos) para se fazer as
devidas comparações entre médias das variáveis estudadas, empregou-se intervalo
de confiança de 95% nos testes estatísticos. Foi também utilizada a correlação de
Pearson, para verificar a relação entre as duas variáveis quantitativas. Os dados
foram armazenados e analisados através do programa Epiinfo (Versão 3.3.2, 2005).
23
5 RESULTADOS
5.1 Soroprevalência de HCV em pacientes em tratamento de hemodiálise.
O estudo de soroprevalência em pacientes hemodialisados ocorreu na Clínica
Renal de Manaus no período de março de 2006 a janeiro de 2007. Como mostra a
figura 02, havia 402 pacientes em tratamento de hemodiálise destes 62
apresentaram reatividade nos testes sorológicos para HCV, demonstrando uma
soroprevalência de 15,17% (FIGURA 02). A tabela 01 mostra a distribuição por sexo
em relação a média de idade dos 55 pacientes HCV positivos que aceitaram
participar do estudo, observamos que 54,5% (n=30) eram homens com idade média
de 50,13±14,90 (anos) e 45,5% (n=25) eram mulheres com idade média
48,16±17,50; não mostrando diferença estatística significante.
Pacientes renais crônicos em
tratamento de hemodiálise (%)
84,83%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
15,17%
30%
20%
10%
0%
HCV negativos
HCV positivos
Figura 02: Percentual de pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise na Clínica
Renal de Manaus. Pacientes renais não reativos para o Vírus da hepatite C (HCV) [
84.83% (n=340) e reativos para HCV
[
]
] 15,17% (n=62). Para a análise da
reatividade para HCV foram utilizados os testes ELISA e Immunoblot.
24
Tabela 01 - Dados demográficos de pacientes renais crônicos infectados com o Vírus
da hepatite C.
Sexo
Número
%
Idade média±DP
Mediana
Masculino
30
54,5
50,13±14,90*
48
Feminino
25
45,5
48,16±17,50*
47
Teste T de student ; p=0,6533
5.2 Análise de soroconversão para HCV em pacientes renais crônicos.
Após o estudo da soroprevalência analisamos o percentual de soroconversão
para o HCV durante o tratamento de hemodiálise. A figura 03 (A) mostra que dos 62
pacientes renais crônicos HCV positivos, 21,82% (n=12) iniciaram o tratamento de
hemodiálise com reatividade ao HCV e 78,18% (n=43) soroconverteram durante o
tratamento. O número de pacientes que soroconverteram foi distribuído em
intervalos a cada 2 anos. Observamos que 9,30% (n=4) dos pacientes
soroconverteram com um período inferior a 2 anos de tratamento, 13,95% (n=6) dos
pacientes entre 2 e 4 anos, 18,60% (n=8) entre 4 e 6 anos, 16,28% (n=7) de 6 e 8
anos, 25,58% (n=11) entre 8 e 10 anos, 11,64% (n=5) entre 10 e 12 anos e 4,65%
(n=2) com mais de 12 anos de tratamento (FIGURA 03 B).
25
(A)
78,18%
Soropositividade anti-HCV em
pacientes renais crônicos em
tratamento de hemodiálise (%)
80%
70%
60%
50%
40%
21,82%
30%
20%
10%
0%
HCV positivo
HCV negativo
Sorologia inicial
(B)
30%
Pacientes que soroconverteram (%)
25,58%
25%
18,60%
20%
16,28%
13,95%
15%
11,64%
9,30%
10%
4,65%
5%
0%
<2
2a4
4a6
6a8
8 a 10
10 a 12
12 a 14
Tempo de hemodiálise até a soroconversão (anos)
Figura 03: Análise do percentual e distribuição por tempo de soroconversão de pacientes
renais crônicos em tratamento de hemodiálise. (A) Percentual de pacientes HCV positivos
21,82% (n=12) e HCV negativos 78,18% (n=43) antes de iniciarem o tratamento de
hemodiálise. (B) Percentual de pacientes que soroconverteram para HCV ao longo do
período (anos) de tratamento de hemodiálise. O percentual de pacientes foi distribuído em
intervalos a cada 2 anos.
26
5.3 Relação densidade óptica e ponto de corte para reatividade ao HCV pelo
teste ELISA.
As amostras foram testadas pelo método ELISA obtendo os valores da
densidade óptica (DO) e ponto de corte (Cut off). A análise demonstrou que 1,89%
(n=1) dos pacientes tiveram relação DO/Cut off no teste ELISA para HCV menor
que 3. Enquanto que 3,78% (n=2) entre 3 e 5 e 94,33% (n=50) dos pacientes
apresentaram valores superior a 5 como podemos observar na tabela 2.
Tabela 02: Análise do percentual em relação a DO/Cut off do teste ELISA de pacientes
reativos para o Vírus da hepatite C (HCV). Observou-se que 94,33% dos pacientes
encontram-se com relação DO/cut off >5,0 (n=50 pacientes), 3,78% (n=2) entre 3 e 5 e
apenas 1,89% (n=1) inferior a 3.
Relação DO/Cut off do Teste ELISA
Pacientes RC HCV
reativos (%)
<3
3a5
>5
1,89
3,78
94,33
27
5.4 Análise da distribuição das bandas de proteínas no Immunoblot.
Como de rotina do laboratório de sorologia, as amostras reativas e
indeterminadas foram submetidas ao teste complementar Immunoblot. Todas as
amostras submetidas ao teste confirmaram ser reativas para o HCV. Através da
tabela 03 pode-se observar a distribuição das bandas de proteínas presentes no
teste, a banda c100 esteve presente em 81% dos soros dos pacientes, c33c em
100%, c22(p) em 88,68% e 56,60% apresentaram a banda NS5.
Tabela 03: Perfil de bandas de proteínas do teste complementar Imunoblot em pacientes
renais crônicos infectados com o Vírus da hepatite C. Em 100% dos pacientes observou-se
à proteína c33c, 88,68% observou-se a proteína c22(p), seguida da c100 com 81% e NS5
com 56,60%.
Bandas de proteínas do teste complementar Immunoblot
Pacientes
HCV+ (%)
c100 (NS4)
c33c (NS3)
c22(p) (core)
NS5
81
100
88,68
56,60
28
5.5 Análise bioquímica de alanina aminotranferase (ALT).
Para análise bioquímica dos níveis de alanina aminotransferase (ALT) foi feita
uma comparação entre os pacientes renais crônicos HCV negativos (n=53), que
foram selecionados aleatoriamente, e HCV positivos (n=51) em tratamento de
hemodiálise. Como mostra a figura 4 e tabela 4, não foi observada diferença
estatística significativa entre os grupos. O método estatístico utilizado foi o teste T de
student.
Níveis de alanina
minotransferase (U/I)
140
120
100
80
60
40
20
0
HCV negativos
HCV positivos
Figura 04: Comparação nos níveis de Alanina aminotransferase (ALT) nos pacientes renais
crônicos HCV negativo (n= 53 pacientes) e HCV positivo (n=51 pacientes). Não se observou
diferença estatística significante entre os dois grupos (p=0,639). Método estatístico utilizado
– teste T de student.
Tabela 04: Níveis de alanina aminotransferase (ALT) em pacientes renais crônicos.
GRUPO
VARIÁVEL
ALT
HCV negativo
Média
DP
24,11
23,93
* Teste estatístico T student
HCV positivo
Valor p*
Mediana
Média
DP
Mediana
17,00
26,13
19,63
19,00
0,6390
29
5.6 Percentual de pacientes HCV positivos co-infectados.
Dentre os pacientes HCV positivos estudados (n=55), 60% (n=33) eram
infectados somente com HCV, o restante 40% apresentaram-se HCV positivo com
co-infecção para outras patologias como demonstrado na tabela 05 - 36,36% (n=20)
apresentaram-se HCV+/HBV+, 1,82% (n=1) HCV+/HBV+/HIV+ e 1,82% (n=1) foram
positivos para HCV/HBV e HTLV.
Tabela 05: Freqüência de co-infecções virais (HCV, HBV, HIV e HTLV) em pacientes renais
crônicos.
Infecção presente nos pacientes
Pacientes
RC (%)
HCV
HCV + HBV
HCV + HBV + HIV
HCV + HBV +HTLV
60
36,36
1,82
1,82
30
5. 7 Análise de populações e sub-populações de leucócitos em sangue
periférico.
Na figura 05 mostramos a análise do perfil celular (populações e subpopulações de leucócitos) através do hemograma obtido por método automatizado
(PENTRA). Foi feita análise de 54 pacientes renais crônicos em tratamento de
hemodiálise com sorologia negativa para o Vírus da hepatite C e 51 pacientes com
sorologia positiva para o HCV, amostra de um paciente HCV negativo e 4 pacientes
HCV positivos tiveram de ser excluídas por problemas durante o processamento.
Comparando o número de leucócitos totais entre os grupos de pacientes,
observamos uma diferença estatisticamente significante, os pacientes HCV positivos
apresentaram menor número de leucócitos que os HCV negativos (FIG 5 A). Ao
compararmos o percentual de linfócitos observamos um maior percentual nos
pacientes HCV positivos em relação aos HCV negativos, sendo esta diferença
estatisticamente significante (p<0,001) (FIG 5 B). As médias percentuais de
monócitos (FIG 5 C) e eosinófilos (FIG 5 D) não demonstraram diferença estatística
significante quando analisado comparativamente entre os grupos. A figura 5 E
apresenta o percentual de neutrófilos no sangue periférico, quando comparamos os
dois grupos pelo teste de Mann-Whitney obtivemos um percentual mais baixo de
neutrófilos nos pacientes renais crônicos HCV positivo, demonstrando uma diferença
estatística significante. As medianas estão representadas como linhas horizontais
nos gráficos e a análise estatística descritiva está na tabela 06.
31
Leucócitos totais
[10³/mm³]
(A)
*
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
HCV negativos
*
(B)
HCV positivos
(C)
20
Monócitos (%)
60
Linfócitos (%)
50
40
30
20
15
10
5
10
0
HCV negativos
(D)
(E)
Neutrófilos (%)
Eosinófilos (%)
30
20
10
0
0
HCV positivos
HCV negativos
HCV positivos
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HCV negativos
HCV positivos
*
HCV negativos
HCV positivos
Figura 05: Percentual de leucócitos totais e sub-populações de células circulantes no
sangue periférico de pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise com sorologia
negativa para o Vírus da hepatite C - HCV negativos - (n=54 pacientes) e com sorologia
positiva – HCV positivo – (n=51 pacientes). A população total de leucócitos e as subpopulações celulares (linfócitos, monócitos, eosinófilos e neutrófilos) foram avaliados
através do hemograma obtido por método automatizado (PENTRA). (*) Diferença estatística
significante.
32
Tabela 06: Perfil de sub-populações de leucócitos do sangue periférico de pacientes renais
crônicos.
GRUPO
VARIÁVEIS
1
Leucócitos
DP
Média
DP
Mediana
Valor p
6,0
5,00
1,26
5,10
0,0002*
Linfócitos
18,58
6,18
18,9
28,79
13,22
28,3
<0,001*
Monócitos
8,93
3,07
8,20
8,01
3,25
7,70
0,1412
Eosinófilos
6,32
4,51
5,30
6,50
6,93
3,80
0,2231
65,82
9,72
66,15
50,33
13,70
49,50
<0,001*
2
1
Neutrófilos
Teste estatístico Mann-Whitney
Teste estatístico T student
* Diferença estatística significante
2
Mediana
1,68
1
1
Média
HCV positivo
6,16
totais
1
HCV negativo
33
5.8 Análise da população de linfócitos por citometria de fluxo.
Na figura 6 demonstramos a análise da freqüência de populações de
linfócitos TCD3+/CD4+ (FIG 6 A) e LTCD3+/CD8+ (FIG 6 B) no sangue periférico de
pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise com sorologia negativa
para o Vírus da hepatite C (n=54 pacientes) e com sorologia positiva (n=51
pacientes). As populações celulares foram identificadas utilizando-se anticorpos
monoclonais anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 marcados com fluorocromos distintos
(terceira cor, PE e FITC, respectivamente). A Figura 6 A mostra que os pacientes
HCV positivos apresentaram um percentual de linfócitos T CD4+ maior que os
pacientes HCV negativos, a média destas células foi de 40,14±9,28% e
34,37±10,43%, respectivamente. Quando comparamos os dois grupos pelo teste T
de student encontramos uma diferença estatística significante, para que possamos
rejeitar a hipótese nula de que os grupos são iguais. Ao analisarmos através do teste
T de student as médias percentuais de linfócitos T CD8+ nos grupos RC HCV
negativos (23,08±9,91) e RC HCV positivos (25,91±9,33), observamos que não
houve diferença estatística significante entre os grupos (FIG 6 B). As medianas
estão mostradas como barras horizontais nos gráficos e a análise estatística
descritiva está representada na tabela 07.
34
*
(B)
70
60
50
40
30
20
10
0
60
LTCD3+/CD8+ (%)
LTCD3+/CD4+ (%)
(A)
HCV negativos
50
40
30
20
10
0
HCV positivos
HCV negativos
HCV positivos
Figura 06: Percentual de linfócitos LTCD3+/CD4+ (A) e LTCD3+/CD8+ (B) no sangue
periférico de pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise com sorologia
negativa para o Vírus da hepatite C - HCV negativos - (n=54 pacientes) e com sorologia
positiva – HCV positivo – (n=51 pacientes). As populações celulares foram identificadas
utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 marcados com
fluorocromos distintos (terceira cor, PE, FITC, respectivamente). (*) Diferença estatística
significante.
Tabela 07: Perfil fenótipico de linfócitos do sangue periférico de pacientes renais crônicos.
GRUPO
VARIÁVEIS
HCV negativo
Média
Mediana
Média
DP
Mediana
+
+
34,37
10,43
35,73
40,14
9,28
39,16
0,0036*
+
+
23,08
9,91
20,86
25,91
9,33
23,31
0,1364
LTCD3 /CD4
LTCD3 /CD8
1
DP
Valor p1
HCV positivo
Teste estatístico T student
* Diferença estatística significante.
35
5.9 Análise da sub-população de leucócitos por citometria de fluxo.
Na figura 07 demonstramos a análise da sub-população de leucócitos no
sangue periférico de pacientes renais HCV positivos. Foram feitas análises de 54
pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise com sorologia negativa
para o Vírus da hepatite C e 51 pacientes com sorologia positiva para o HCV. As
populações celulares foram identificadas utilizando-se anticorpo monoclonal antiCD69, marcado com FITC. As médias percentuais de linfócitos CD69+ (FIG 7 A) e
monócitos CD69+ (FIG 7 B) não demonstraram diferença estatística significante. A
figura 6C apresenta o percentual de neutrófilos CD69+, ao compararmos os grupos
pelo teste de Mann-Whitney obtivemos um percentual mais alto de neutrófilos
ativados nos pacientes renais crônicos HCV positivo, demonstrando uma diferença
estatística significante (p<0,001), comparando o percentual de eosinófilos CD69+
através do teste T de student observamos um maior percentual de eosinófilos
ativados nos pacientes HCV positivos em relação aos HCV negativos, sendo esta
diferença estatisticamente significante (p=0,0088) (FIG 7 D). As medianas estão
representadas como linhas horizontais nos gráficos e a análise estatística descritiva
está na tabela 08.
36
Neutrófilos CD69 + (%)
Monócitos CD69 + (%)
20
15
10
5
0
(C)
(B)
25
HCV negativos
(D)
*
12
10
8
6
4
2
0
HCV negativos
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
HCV positivos
Eosinófilos CD69 + (%)
Linfócitos CD69+ (%)
(A)
HCV positivos
*
15
10
5
0
HCV positivos
HCV negativos
HCV negativos
HCV positivos
Figura 07: Percentual da sub-população de leucócitos ativados - linfócitos CD69+ (A),
monócitos CD69+ (B), neutrófilos CD69+ (C) e eosinófilos CD69+ (D) no sangue periférico de
pacientes renais crônicos em tratamento de hemodiálise com sorologia negativa para o
Vírus da hepatite C - HCV negativos - (n=54 pacientes) e com sorologia positiva – HCV
positivo – (n=51 pacientes). As sub-populações de leucócitos foram identificadas utilizandose anticorpo monoclonal anti-CD69 marcado com fluorocromo (FITC). (*) Diferença
estatística significante.
Tabela 08: Análise estatística descritiva do percentual de sub-populações de leucócitos
ativados .
GRUPO
VARIÁVEIS
RC HCV negativo
Média
DP
5,34
3,00
4,59
5,38
2,70
4,82
0,9336
1
Monócitos CD69+
2,88
1,15
2,86
2,81
1,92
2,60
0,1661
1
+
Neutrófilos CD69
0,93
0,39
0,89
2,87
2,19
2,33
<0,001*
Eosinófilos CD69+
1,45
1,34
1,12
2,33
2,70
1,56
0,0088*
1
Linfócitos CD69
1
Teste estatístico Mann-Whitney
Teste estatístico T student
* Diferença estatística significante
2
Média
DP
Valor p
+
2
Mediana
RC HCV positivo
Mediana
37
5.10 Análise da correlação
5.10.1 Correlação da população de linfócitos T CD4+ com linfócitos T CD8+
Ao correlacionarmos a população de linfócitos T CD3+/CD4+ (eixo horizontal
da figura) com a população de linfócitos T CD3+/CD8+ (eixo vertical) utilizando a
correlação de Spearman observamos ausência de correlação no grupo HCV positivo
em tratamento de hemodiálise (r=-0,060 e p=0,6735) (Figura 08).
70
LTCD3+ /CD8+ (%)
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
+
60
80
+
LTCD3 /CD4 (%)
Figura 08: Correlação de Spearman entre as populações de linfócitos T CD4+ e linfócitos T
CD8+ no grupo HCV positivo em tratamento de hemodiálise. Números de pares XY = 51, r= 0,060 e p=0,6735, não há correlação entre as populações.
38
5.10.2 Correlação da população de linfócitos CD69+ com :
•
Linfócitos T CD4+
Ao realizarmos a correlação de Spearman entre as populações de linfócitos
CD69+, isto é, uma população ativada, e linfócitos T CD4+,
não observamos
correlação no grupo HCV positivo em hemodiálise (r=-0,2406 e p=0,0889), porem
observamos que quanto maior a população de linfócitos T CD4+ menor a de
linfócitos CD69+ (figura 09).
16
14
Linf CD69+ (%)
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
LTCD3+/CD4+ (%)
Figura 09: Correlação de Spearman entre as populações de linfócitos CD69+ e linfócitos
CD4+ do grupo HCV positivo em hemodiálise. Números de pares XY = 51, r=-0,2406 e
p=0,0889.
39
•
Linfócitos T CD8+
Ainda no estudo da população de linfócitos CD69+ (eixo vertical), mas agora
com uma população de linfócitos T CD8+(eixo horizontal), pela correlação de
Spearman, não observamos correlação entre as populações ao estudarmos o grupo
de pacientes hemodialisados infectados pelo HCV (r=0,0133 e p=0,9259).
16
14
Linf CD69+ (%)
12
10
8
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
LTCD3+/CD8+ (%)
Figura 10: Correlação de Spearman entre as populações de linfócitos CD69+ e linfócitos
CD8+ do grupo HCV positivo em hemodiálise. Números de pares XY = 51, r=0,0133 e
p=0,9259.
40
5.10.3 Correlação da alanina aminotransferase com :
•
Linfócitos T CD4+
Através correlação de Spearman correlacionarmos os níveis de alanina
aminotransferase (ALT) (eixo vertical) com a população de linfócitos T CD4+ (eixo
horizontal da figura) do grupo HCV positivo em hemodiálise, não encontramos
correlação entre os níveis de ALT e os LTCD4+ (r=-0,0154 e p=0,9142) (figura 11).
140
120
ALT (U/I)
100
80
60
40
20
0
0
20
40
+
60
80
+
LTCD3 /CD4 (%)
Figura 11: Correlação de Spearman entre os níveis de alanina aminotransferase e as
populações de linfócitos T CD4+ no grupo HCV positivo em tratamento de hemodiálise.
Números de pares XY = 51, r=-0,0154 e p=0,9142, não houve correlação entre as
populações.
41
•
Linfócitos T CD8+
Ainda no estudo dos níveis de ALT (eixo vertical) mas agora com uma
população de linfócitos T CD8+ (eixo horizontal), pela correlação de Spearman, não
observamos correlação entre os níveis de ALT e a população de linfócitos T CD8+
ao estudarmos o grupo de pacientes hemodialisados infectados pelo HCV (r=0,0905
e p=0,5275) (FigurA 12).
140
120
ALT (U/I)
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
LTCD3+/CD8+ (%)
Figura 12: Correlação de Spearman entre os níveis de alanina aminotransferase e as
populações de linfócitos T CD8+ no grupo HCV positivo em tratamento de hemodiálise.
Números de pares XY = 51, r=0,0905 e p=0,5275, não há correlação entre as populações.
42
6 DISCUSSÃO
Nos últimos anos a estimativa de infecção pelo HCV foi de 180 milhões de
pessoas infectadas em todo o Mundo, se tornando um grande problema de saúde
pública.
Os pacientes em tratamento de hemodiálise são considerados de alto risco
para a infecção pelo HCV. A prevalência desta infecção varia de região para região
em todo o Mundo, de 71% (DEVESA et al, 1997) a 3% (OLUT et al, 2005).
No presente estudo a soroprevalência encontrada na Clínica Renal de
Manaus foi de 15,17%. Esses dados estão de acordo com os encontrados por
Moreira e colaboradores (2003) em um estudo realizado em São Paulo (14,6%). No
entanto a prevalência encontrada em nosso trabalho pode ser considerada baixa
quando comparada aos relatados em outras regiões do Brasil, como por exemplo,
em Fortaleza - CE de 52% (Medeiros et al, 2004), Curitiba - PR 39,2% (Carvalho et
al, 1999), Goiânia - GO 46,7% (Carneiro et al, 2001), Belo Horizonte - MG 20%
(Busek et al, 2002) e Porto Alegre - RS 29,1% (Gomes et al, 2006) e alta quando
comparada a estudos realizados, por Albuquerque e colaboradores (2005)
demonstrando uma prevalência de 8,4% em Recife, 10,5% em Salvador-BA por
Silva e colaboradores (2006) e na cidade de Araguaína-TO onde Souza e
colaboradores (2003) demonstraram uma prevalência de 13%. Isto demonstra que o
HCV é um problema significante nas unidades de diálises em todo o Brasil.
Os dados da literatura sobre soroconversão em pacientes em tratamento de
hemodiálise são escassos. Em nosso estudo encontramos que 78,18% dos
pacientes HCV positivos em hemodiálise soroconverteram após o inicio do
tratamento. Quando analisamos o tempo de soroconversão observamos que a
maioria ocorre após 5 anos de tratamento. Estes dados corroboram os
demonstrados por Gomes e colaboradores (2006) no estudo realizado em Porto
Alegre-RS e Olut e colaboradores (2005) em Izmir-Turquia. Desta forma podemos
sugerir que o tempo de exposição ao tratamento hemodialítico contribui para
transmissão do HCV na população de pacientes hemodialisados.
Segundo
43
Medeiros e colaboradores (2004) uma das causas de soroconversão seriam as
freqüentes transfusões sanguíneas a que estes pacientes são submetidos. No
entanto, esta não parece ser uma via constante de infecção, uma vez que existe
grande controle na qualidade de sangue em unidades transfusionais. A introdução
de triagem para o anti-HCV nos bancos de sangue, instituída pelo Ministério da
Saúde, pela Portaria n° 1376 de 19 de novembro de 1993, trouxe perspectivas no
sentido de se reduzir a transmissão do HCV por transfusão através de um melhor
controle dos doadores de sangue. Conforme os dados da literatura, a prevalência
em doadores de sangue, segundo Torres e colaboradores (2001) é de 0,6% em
Manaus. Sendo também a transfusão restringida ao mínimo com o uso da
eritropoetina recombinante como terapia substitutiva em pacientes em hemodiálise
(MEDEIROS et al, 2004).
O diagnóstico da infecção por HCV é baseado em duas categorias de testes
laboratoriais, testes sorológicos que detectam anticorpos específicos para o HCV
através do ensaio ELISA, e aqueles que podem detectar, quantificar ou caracterizar
os componentes de partículas virais do HCV através do imunoblot ou pela presença
de RNA viral (LAPERCHE et al, 2005).
O teste ELISA se baseia na relação de densidade ótica (DO) e o ponto de
corte (cut off) que determina se o paciente é soropositivo. A análise da DO/Cut off
em nosso estudo mostrou que 94,33% dos pacientes HCV positivos em hemodiálise
apresentaram valores superiores a 5, demonstrando uma alta reatividade para o
HCV e sugerindo a presença de grande quantidade de anticorpos contra este
antígeno nestes soros. A avaliação da presença de anticorpos contra as frações das
proteínas do HCV, através do imunoblot (CHIRON RIBA 3.0 HCV), também foi de
interesse neste estudo. Nossos resultados demonstraram 81% de positividade para
a fração c-100 (NS4), 100% para c33c (NS3), 88,68% para c22(p) (core). No
entanto, obtivemos uma baixa reatividade para a fração NS5 (56,60%). Os valores
determinados neste trabalho foram semelhantes aos encontrados por Santana e
colaboradores (2001) em Salvador-BA relatando reatividade de 79,8%, 100%, 80,9%
e 52,1% para as frações c100, c33, c22 e NS5, respectivamente.
44
A baixa freqüência de positividade para a fração NS5, foi também observada
em estudo realizado em Taiwan em 1993 por Huang e colaboradores, detectando
anticorpo para esta região em apenas 40% dos indivíduos positivos. Sendo assim,
sugerimos que a menor positividade do anticorpo contra a fração NS5, encontrada
na população estudada pode estar vinculada a alterações na resposta imune.
Segundo relatos de Santana e colaboradores (2001) isto ocorre por deficiência
imunológica ou mesmo à heterogeneidade genotípica do vírus.
Dados da literatura demonstram que uma das formas de avaliar a evolução da
hepatite C, em pacientes infectados pelo vírus, seria através da análise bioquímica
das aminotransferases, como a alanina aminotransferase (ALT) (OLUT et al 2005;
GOUVEIA et al, 2004), o que nos levou a analisar as possíveis alterações desta
enzima. Como parâmetro de análise comparamos o perfil bioquímico de ALT de
pacientes infectados com HCV em hemodiálise com pacientes em hemodiálise não
infectados.
Como podemos
observar
na
figura
04
não
houve
diferença
estatisticamente significativa entre os níveis de ALT entre os dois grupos. Apesar de
alguns
trabalhos
sugerirem
a
utilização
da
dosagem
de
ALT
para
o
acompanhamento da evolução clínica da doença, este fato se mantém controverso
entre os pacientes renais crônicos. Alguns autores relatam que níveis alterados de
ALT são pouco encontrados nos pacientes HCV positivos em hemodiálise (Gouveia
et al, 2004), sugerindo que a ALT não seja preditora de lesão hepatocelular nestes
pacientes. Em outro estudo realizado por Cotler e colaboradores (2002), revisto por
Gouveia e colaboradores 2004, foram observados níveis inferiores de ALT, assim
como menor atividade inflamatória e menor proporção à cirrose, nos pacientes HCV
positivos em hemodiálise quando comparados com indivíduos com infecção pelo
HCV, com função renal normal. Dados encontrados por Dussol e colaboradores
(1993) revisto por Santana e colaboradores (2001) demonstraram a ausência de
associação entre elevação de ALT e viremia pelo HCV em pacientes renais crônicos.
Os autores concluíram que a infecção crônica pelo HCV é clinicamente latente e
lesões hepáticas ocorrem sem qualquer elevação de ALT. O motivo da baixa
atividade enzimática não está esclarecido (SANTANA et al, 2001). Entre as teorias
propostas estão: inibição enzimática das aminotransferases por toxinas urêmicas,
deficiência de piridoxina (cofator da aminotransferase), perda das enzimas na
45
diálise, interferência de outras substâncias dialisáveis na dosagem da atividade
enzimática das transaminases e consumo pelo lactato de fatores necessários para
dosagem da atividade das transaminases (SANTANA et al, 2001). Outro dado
importante encontrado na literatura se refere a episódios esporádicos de aumento
nos níveis de ALT, predominando os valores normais (OLUT et al, 2005; GOUVEIA
et al, 2004). O que nos leva a pensar que seria necessário um acompanhamento
dos níveis desta enzima por um período maior de tempo. Embora a elevação de ALT
possa estar associada com infecção pelo HCV, os níveis de aminotransferases
parecem ser mais baixos nos pacientes em hemodiálise do que na população em
geral. Portanto, em nosso estudo realizamos uma análise pontual. Desta forma
podemos sugerir que a taxa de ALT não deve ser utilizada na triagem ou diagnóstico
da infecção, como marcador para avaliar a evolução clínica da hepatite C nos
pacientes com IRC em hemodiálise pela sua baixa sensibilidade. Também avaliamos
os níveis de aspartato aminotransferase e das bilirrubinas (direta, indireta e total),
mas esta análise não demonstrou alteração nos níveis bioquímicos (dados não
mostrados).
Outro objetivo avaliado em nosso estudo foi à presença de co-infecção nos
pacientes HCV positivos com outras doenças de transmissão parenteral (HBV, HIV e
HTLV). Nossos dados mostraram que 60% eram infectados somente com HCV,
36,36% eram HCV+/HBV+, 1,82% HCV+/HBV+/HIV+ e 1,82% foram positivos para
HCV/HBV e HTLV. Comparando os nossos dados de co-infecção HCV+/HBV+ com
os encontrados na literatura observamos que não se trata de um evento raro, e
segundo Souza e colaboradores (2003) valor entre 5% e 62,7% tem sido observado
em outras clínicas de hemodiálise. Segundo Devesa e colaboradores (1997), o HBV
reduz a reatividade do anticorpo para c33 e c100 do HCV, sugerindo que o HBV
aumenta a imunossupressão.
Em nossas análises encontramos entre os co-
infectados um paciente com marcadores para HCV/HBV e HIV, o qual era
homossexual e tinha realizado transplante renal, semelhante ao encontrado por
Vardinon e colaboradores (1999) que relatou a presença de um paciente HIV
positivo em hemodiálise que tinha historia de transplante renal. Pacientes que
apresentam marcadores para HIV são transferidos de tratamento e passam a
realizar diálise peritoneal ambulatorial contínua (CAPD).
Segundo a Resolução
46
n°154 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, determina que os pacientes
hemodialisados devem ser triados a cada três meses para anti-HCV e anti-HBC total
e uma vez ao ano para HIV, para prevenir a transmissão nosocomial.
Ao consultar a literatura observamos que a co-infecção com HIV e Vírus da
hepatite C está associada com perda da resposta imune eficiente, progressão mais
rápida da hepatite C, aumento nos níveis de RNA viral, diminuição da atividade de
linfócitos T CD8+ HCV específico e diminuição na contagem de linfócitos T CD4+
(NETSKI et al, 2007). Outro relato importante da literatura mostra que pacientes coinfectados com HCV e HIV tem risco maior de progredir para doença hepática
crônica (cirrosse ou carcinoma) que os infectados somente por HCV (MENDESCORRÊA et al, 2001).
O resultado da infecção viral é determinado pela interação entre o vírus e a
resposta imune do hospedeiro, sendo que esta representa um importante papel no
controle viral assim como na patogênese da doença. À medida que a infecção viral
progride, essas respostas imunes específicas são ativadas, com o aparecimento de
linfócitos T helper (LTh CD4+),
anticorpos secretados por linfócitos B (LB) e a
expansão de clones de linfócitos T citotóxicos (LTc CD8+) (KAPLAN et al, 2007).
Linfócitos TCD4+ reconhecem antígenos apresentados através de moléculas
MHC classe II presentes nas APCs e células TCD8+ em MHC classe I (NEUMANNHAEFELIN et al, 2005). Subseqüentemente, linfócitos TCD4+ desempenham
múltiplas funções efetoras, incluindo ativação direta de macrófagos e linfócitos B
antígenos específicos, assim como ativação de linfócitos TCD8+ dependente de
citocinas (NEUMANN-HAEFELIN et al, 2005) e estas células têm efeito direto na
eliminação de células infectadas através de mecanismos citolíticos e não citolíticos
(KAPLAN et al, 2007).
Para determinarmos o perfil da resposta imune celular em pacientes renais
crônicos infectados pelo Vírus da hepatite C, analisamos o percentual de leucócitos
totais e suas sub-populações. Nossos dados demonstraram aumento significativo do
número de linfócitos (28,79±13.22) e redução de neutrófilos (50.33±13.70), quando
47
comparado aos pacientes controles. No entanto, não observamos alterações
significativas em relação às demais sub-populações de leucócitos (monócitos e
eosinófilos).
Através da análise por citometria de fluxo, fenotipamos as sub-populações de
linfócitos T, através de marcadores específicos para as moléculas CD4/CD8 e CD3.
Comparado ao grupo de pacientes controles (HCV negativos) observamos aumento
significativo no percentual de linfócitos T CD3+/CD4+ em sangue periférico. Os
valores por nós encontrados em relação a estas células (40.14±9.28) em pacientes
HCV positivos foram semelhantes aos relatados na literatura. Tran e colaboradores
(1997) encontraram 48,3±6,8 de LT CD3+/CD4+, em pacientes com hepatite C
crônica. Porém, estes autores não estudaram pacientes HCV positivos em
tratamento de hemodiálise, o que difere parcialmente do nosso estudo. O aumento
no número destas células nesta população de pacientes é um fato interessante, uma
vez que uma forte resposta por células Th1 CD4+ específica está associada com
“clearance” viral e resolução da doença (ROSEN et al, 2002).
Quando avaliamos o percentual de LT CD3+/CD8+, observamos que não
houve diferença estatística significante entre os grupos. Ao realizarmos a correlação
de Spearman entre as populações de linfócitos T CD4+ com linfócitos T CD8+ não
observamos correlações destas populações celulares no grupo HCV positivo em
hemodiálise. Dados da literatura relatam que pacientes em hemodiálise com uso de
eritropoetina aumenta a intensidade de apoptose nos linfócitos T CD8+, mas
dificilmente exerce algum efeito prejudicial em linfócitos T CD4+ (TRZONKONWSKI
et al, 2005).
Um mecanismo pelo qual pode-se avaliar a resposta imune ativada é através
do marcador de ativação CD69, uma molécula transmembrana tipo II, pertencente a
família das lecitinas
e dependentes de cálcio (TRAN et al, 1997). Quando
analisamos a expressão desta proteína nas diferentes populações de leucócitos,
observamos que não houve relevância estatística entre linfócitos e monócitos dos
pacientes renais crônicos HCV negativos em relação aos HCV positivos. Apesar de
ser uma forma subjetiva de análise da resposta imune especifica, podemos inferir
48
que parece não haver ativação celular desencadeada pela infecção do HCV. Este
dado nos surpreendeu uma vez que como citado anteriormente, observamos um
aumento na população de LTCD4+ em renais crônicos infectados pelo vírus, e que
trabalhos da literatura relatam que o procedimento de hemodiálise por si só e o uso
de diferentes tipos de membranas de diálise seriam responsáveis pela ativação
celular e aumento da produção de citocinas em renais crônicos (HORL, 2002). Ao
avaliarmos estatisticamente este marcador de superfície entre os linfócitos,
verificamos que não houve correlação em relação ao LTCD4+ e ao LTCD8+.
Por outro lado, ao analisarmos a expressão de CD69 na superfície de
neutrófilos e eosinófilos, observamos aumento significativo da expressão desta
molécula nestas populações celulares. Este fato nos leva a pensar que a infecção
pelo HCV associado ao procedimento de diálise seriam os responsáveis por esta
ativação. No entanto, nossos dados em relação a este marcador são inconclusivos e
novos estudos, como análise da produção de citocinas e outros deverão ser feitos
para melhor compreensão deste fenômeno.
Desta forma podemos concluir que o entendimento da resposta imune,
associada a maior compreensão dos determinantes do “clearance” viral e dos
elementos necessários para o desenvolvimento de imunidade, assim como o maior
entendimento dessas correlações imunológicas poderá favorecer a busca de novas
estratégias imunoterapêuticas eficaz contra o Vírus da hepatite C.
49
CONCLUSÕES
A partir dos dados obtidos no presente trabalho podemos concluir que:
1. Os resultados deste estudo demonstraram uma elevada prevalência do anti-HCV
em pacientes em tratamento de hemodiálise em Manaus-AM. Estes resultados
devem ser analisados e interpretados cuidadosamente, já que essa infecção viral
pode alterar o prognóstico desses pacientes a longo prazo.
2. A associação entre a positividade do anti-HCV e duração de hemodiálise, sugere
que o tratamento de hemodiálise prolongado, envolvendo procedimentos
hospitalares, pode contribuir para maior disseminação da infecção.
3. A relação DO/Cut off demonstrou que 94,33% dos pacientes apresentaram
valores superior a 5 demonstrando uma alta concentração de anticorpos
presentes no soro.
4. A menor positividade do anticorpo contra a fração NS5, encontrada na população
estudada pode estar associada a uma fraca resposta imunológica. Sendo
necessário mais estudos sobre esta fração e sua relação com o perfil da resposta
imune.
5. Os níveis de alanina aminotransferase não demonstraram ser um bom marcador
para análise do curso da infecção nos pacientes renais crônicos infectados com
HCV, devido apresentar elevações esporádicas no decorrer do tempo, sendo a
infecção latente nestes pacientes.
6. Os pacientes hemodialisados apresentaram uma alta prevalência de co-infecção,
demonstrando a necessidade de uma rigorosa triagem sorológica e cuidados no
manuseio para prevenir a transmissão nosocomial nesta população.
7. Os pacientes renais crônicos HCV positivos apresentaram aumento significativo
de linfócitos totais e linfócitos T CD3+/CD4+ e um pequeno aumento (não
50
significativo) de linfócitos T CD3+/CD8+ em relação aos pacientes renais crônicos
não infectados.
8. Não observamos diferença na população de linfócitos ativados (CD69+) entre os
grupos estudados, porém neutrófilos e eosinófilos estavam aumentados nos
pacientes hemodialisados HCV positivos.
9. Desta forma concluímos que pacientes em tratamento de hemodiálise são de alto
risco para infecção pelo Vírus da hepatite C e que a infecção, as suas vias de
transmissão e o perfil da resposta imune permanecem obscuras, necessitando de
muitos estudos.
51
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ANEXOS
6.1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do estudo: Soroprevalência de anticorpos contra o vírus da Hepatite C (HCV)
em pacientes em tratamento de hemodiálise.
Justificativa/objetivos: Conhecer o número de casos de pessoas que passam a
apresentar resultado positivo nos testes para hepatite C durante o tratamento de
hemodiálise através da análise laboratorial de amostras dos participantes.
Procedimentos: Para este estudo será coletada amostra de 20ml de sangue. Serão
feitos testes para verificar a presença do vírus, a confirmação do diagnóstico e o
acompanhamento laboratorial da infecção. Todos os testes serão realizados no
HEMOAM em Manaus.
Riscos e desconfortos: Não existem riscos associados à sua participação neste
estudo. O único desconforto é a picada da agulha para a coleta de amostra de
sangue.
Benefícios: A sua participação neste estudo não implica em nenhum benefício
direto e imediato para o senhor(a). O estudo, contudo, proporcionará maiores
esclarecimentos sobre a prevenção e infecção pelo vírus da hepatite C.
Acompanhamento assistencial: Sendo o senhor(a) participante deste estudo terá,
sempre que necessário, esclarecimentos de dúvidas, acompanhamento clínico e
laboratorial no que diz respeito à doença em estudo, podendo entrar em contato com
Drª Adriana Malheiro e Laura Maia (HEMOAM Tel: 3655-0111) e o Dr. Wornei S.
Braga (FMTAM). Sempre que necessário será prestada orientação médica
adequada ou encaminhamentos necessários, feitos pela equipe médica do
HEMOAM.
Voluntariedade: A sua participação neste estudo é voluntária. O senhor(a) pode
retirar sua participação a qualquer momento, o senhor(a) não terá qualquer tipo de
prejuízo para o seu atendimento dentro da Instituição onde faz o tratamento.
Confidencialidade, privacidade e anonimato: Os dados referentes à sua
participação neste estudo permanecerão confidenciais, não sendo divulgados de
forma a declarar a sua identidade.
Uso de material biológico coletado do participante/ metodologia: O sangue
coletado (20ml) será utilizado para o que se propõe neste estudo e será armazenado
para estudos posteriores. Neste caso, podendo ser realizados estudos dos tipos de
vírus HCV presente no sangue.
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO
Após ter recebido informações claras, eu concordo com minha participação no
estudo.
O Sr.(a) autoriza que o seu sangue seja guardado para pesquisas futuras para o
estudo dos tipos de vírus? ( ) sim ou ( ) não
_____________________________
Assinatura do participante
Impressão dactiloscópica
______________________________
Assinatura do pesquisador
Manaus, ___/___/____
6.2 QUESTIONÁRIO / DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS
Título do projeto: Soroprevalência de anticorpos contra o Vírus da Hepatite C
(HCV) em pacientes em tratamento de hemodiálise.
PARTE I: ENTREVISTA COM O PACIENTE
Dados pessoais/ demográficos:
N° Ident.:
N° Ident. na clínica renal :
Nome:_________________________________________________________________
Data de nascimento: ___/___/____
Sexo: F
M
Estado civil:
Casado Solteiro outros____________________________________
Profissão: __________________________ ℡:___________________
Local do tratamento de hemodiálise: Clínica Renal outro: __________________
Dados complementares do caso antes do tratamento de hemodiálise:
Tem vacinação contra:
Hepatite A
Hepatite B
Paciente tem história anterior:
icterícia alcoolismo
O paciente foi submetido ou exposto a:
transfusão de sangue/derivados
parto normal
Quando:__________________
acunputura
drogas injetáveis
tatuagem
transplante
piercing
3 ou mais parceiros sexuais
tratamento dentário
medicamentos injetáveis
tratamento cirúrgico
Contato com paciente de Hepatite B ou C, ou com portador dos VHB ou VHC:
sexual
domiciliar (não sexual)
ocupacional
PARTE II: DADOS OBTIDOS A PARTIR DA FICHA MÉDICA DO PACIENTE
Dados clínicos:
Doença de base: ________________________________________________________
______________________________________________________________________
Data do início do tratamento por hemodiálise:___/__/____Freqüência/semana:_______
Sala e turno de diálise:____________________________________________________
Sintomatologia associada ao HCV
Icterícia
Dor abdominal
Hepatopatia diagnosticada
Hepatocarcinoma
Hepatomegalia
outros _____________________
Está em tratamento para HCV? Não Sim
Qual?________________________________
Co-infecção:
HIV
data do diagnostico:___/____/____
HBV
data do diagnostico:___/____/____
Sífilis
data do diagnostico:___/____/____
Doença de chagas data do diagnostico:___/____/____
HTLV
data do diagnostico:___/____/____
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Testes laboratoriais para HCV:
Sorologia antes da hemodiálise: Negativa
positiva
Marcadores anti-HCV
Marca:____________________________________
Data do teste : ___/___/____
Local da realização do teste: Clínica Renal
Outro_______________
Do:_________ Cut off:______________
Observações:___________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Sorologia durante a hemodiálise :
Primeira sorologia reativa para HCV:
anti-HCV Marca:____________________________________
Data do teste:___/___/____
Local da realização do teste: Clínica Renal
Outro______________
Do:_________ Cut off:______________
Acompanhamento laboratorial na Clínica Renal:
Testes sorológicos
anti-HCV Marca:____________________________________
Data do teste:___/___/____
Local da realização do teste: Clínica Renal
Outro______________
Do:_________ Cut off:______________
anti-HCV Marca:____________________________________
Data do teste:___/___/____
Outro______________
Local da realização do teste: Clínica Renal
Do:_________ Cut off:______________
anti-HCV Marca:____________________________________
Data do teste:___/___/____
Outro______________
Local da realização do teste: Clínica Renal
Do:_________ Cut off:______________
Outros testes para HCV?
Não Sim
HCV RNA
Data:___/___/____
Resultado: Negativo Positivo
Local da realização do teste:_______________________________
Genotipagem:
Data:___/___/____
Resultado:_________________________________________
Observações:___________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
PARTE III: Acompanhamento laboratorial no HEMOAM
Registro LAP:___________________
Testes sorológicos ELISA
Marca:______________________________
DATA
TESTE
DO
CUT OFF
RESULTADO
Teste complementar Imunoblot
Marca:________________________________
DATA
c100
BANDAS
c22(p)
c33c
NS5
hSOD
Observaçãoes:__________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Testes bioquímicos
Aspartato aminotransferase:_______________________
Data do teste:___/___/____ Concentração:______________
Alanina aminotransferase:_______________________
Data do teste:___/___/____ Concentração:______________
Bilirrubina direta:_______________________
Data do teste:___/___/____ Concentração:______________
Bilirrubina total:_______________________
Data do teste:___/___/____ Concentração:______________
Testes de análise da resposta imunológica
Resultado do teste de citocinas
Citocina
Data do teste
IL-10
IL-4
IL-12
INF-γ
DO
Concentração
OBS
O resultado do teste de citometria de fluxo será anexado a esta ficha de
acompanhamento clínico e laboratorial
_______________________________________
pesquisador responsável
6.3 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do estudo: Soroprevalência de anticorpos contra o vírus da Hepatite C (HCV)
em pacientes em tratamento de hemodiálise.
O estudo visa conhecer como é a defesa dos pacientes renais crônicos em
tratamento de hemodiálise contra o vírus da hepatite C, para se obter este
conhecimento é necessário a comparação com pacientes em tratamento de
hemodiálise que não estejam infectados com o vírus da hepatite C.
Para este estudo será coletada amostra de 10mL de sangue. Serão feitos testes
para avaliar a defesa do organismo contra o vírus da hepatite C. Todos os testes
serão realizados no HEMOAM em Manaus.
Não existem riscos associados à sua participação neste estudo. O único desconforto
é a picada da agulha para a coleta de amostra de sangue.
A sua participação neste estudo não implica em nenhum benefício direto e imediato
para o senhor(a). O estudo, contudo, proporcionará maiores esclarecimentos sobre a
prevenção e infecção pelo vírus da hepatite C.
Sendo o senhor(a) participante deste estudo terá, sempre que necessário,
esclarecimentos de dúvidas, podendo entrar em contato com Drª Adriana Malheiro e
Laura Maia (HEMOAM Tel: 3655-0111).
A sua participação neste estudo é voluntária. O senhor(a) pode retirar sua
participação a qualquer momento, o senhor(a) não terá qualquer tipo de prejuízo
para o seu atendimento dentro da Instituição.
Os dados referentes à sua participação neste estudo permanecerão confidenciais,
não sendo divulgados de forma a declarar a sua identidade.
O sangue coletado (10mL) será utilizado apenas para o que se propõe neste estudo.
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO
Após ter recebido informações claras, eu concordo com minha participação no
estudo.
_____________________________
Assinatura do participante
__________________________________
Assinatura do pesquisador ou colaborador
Impressão dactiloscópica
Manaus, ____/____/______
FORMULÁRIO DE GUARDA DE MATERIAL BIOLÓGICO HUMANO PARA
PESQUISA
Manaus, 18 de agosto de 2007.
NOTA DE ESCLARECIMENTO
Eu,
LAURA
PATRICIA
VIANA
MAIA,
pesquisadora
responsável
pelo
desenvolvimento desta dissertação inicialmente intitulado Soroprevalência de
anticorpos contra o vírus da hepatite C em pacientes em tratamento de
hemodiálise, venho esclarecer que o titulo do trabalho foi modificado para Hepatite
C em pacientes portadores de insuficiência renal crônica: perfil sorológico e
aspectos da resposta imune humoral e celular por sugestão da banca de defesa
com justificativa de que o titulo inicial não abrangia todos os dados apresentados no
estudo.
Laura P V Maia
Pesquisadora responsável
Adriana Malheiro
Orientadora