INTRODUÇÃO O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1

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INTRODUÇÃO
O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é o agente causal da
leucemia/linfoma de células T de adultos e da mielopatia associada ao HTLV1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) (Osame, M. et al., 1986). Cerca de 10 a
20 milhões de indivíduos em todo o mundo são infectados por este vírus e Salvador,
a capital do estado da Bahia tem a mais alta prevalência de infecção por HTLV-1 no
Brasil, com uma frequência de 1,83% na população geral (Galvão-Castro, B. et al.,
1997; Dourado et al., 2003).
A HAM/TSP é caracterizada clinicamente por paraparesia espástica, que é
progressiva e pode eventualmente evoluir para dependência de cadeira de rodas
(Osame, M. et al., 1986; Araujo, A. et al., 1993). Outras manifestações associadas a
infecção pelo HTLV-1 incluem Síndrome de Sjogren ou Síndrome Seca, polimiosite,
uveíte, manifestações urológicas e disfunção erétil (Eguchi, K. et al., 1992; Morgan,
O. S. et al., 1989; Mochizuky, M. et al., 1992; Castro, N. M. et al., 2007; Castro, N. et
al., 2013). Pacientes com HAM/TSP apresentam carga pro viral e produção de IFNy, uma importante citocina pro inflamatória do perfil Th1, mais elevados comparados
com indivíduos portadores do HTLV-1 (Yoshida, M. 2004; Santos, S. B. et al., 2004).
Em modelo experimental tem sido demonstrado que a infecção pelo S. mansoni ou a
injeção de ovos ou proteínas do parasita previne doenças inflamatórias associadas à
resposta Th1, a exemplo da diabete tipo 1, psoríase e colite ulcerativa (Cooke, A. et
al., 1999; Atochina, O. H. D. 2006). Nessa linha, nosso grupo tem demonstrado que
antígenos do Schistosoma mansoni são capazes de modular “in vitro” a resposta
imune inflamatória em indivíduos com Leishmaniose cutânea (Báfica, A. M. B. et al.,
2011).
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Atualmente muitos estudos mostram a importâncias das células TCD4 + na
homeostase da resposta imune de indivíduos saudáveis. Essas células participam
da manutenção da tolerância imunológica por suprimir a expansão e ativação de
linfócitos reativos que podem causar doenças autoimunes (Sakaguchi, S. et al.,
2001; Shevach, E. M. 2002). Elas podem expressar CD25 (o receptor da cadeia α de
IL-2) em sua superfície (CD4+CD25+) sendo que 1-2 % da população de células
CD4+CD25high exibe funções regulatórias em humanos (Baecher-Allan, C. et al.,
2001). As células T regulatórias não proliferam em resposta a estimulação antigênica
“in vitro” e podem potencialmente suprimir a proliferação de outras células TCD4 + e
TCD8+ induzidas por estimulação policlonal ou antígeno específicas (Sakaguchi, S.
et al., 2001; Shevach, E. M. 2002).
Algumas células T regulatórias expressam especificamente gene para Foxp3
(forkhead transcription factor) que é requerido para o seu desenvolvimento e função
(Hori, S. et al., 2003; Khattri, R. et al., 2003, Fontenot, J. D. et al., 2003). Tem sido
reportado também que a expressão do gene que transcreve o receptor GITR
(products of glucocorticoid-induced TNF receptor family-related) e CTLA-4 (cytotoxic
T lymphocyte-associated antigen 4) conferem atividade regulatória as células T
(Shimizu, J. et al., 2002; McHugh, R. S. et al., 2002; Read, S. et al., 2000; Salamon,
B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000).
Indivíduos com HAM/TSP apresentam algumas particularidades na resposta imune,
a exemplo da linfoproliferação espontânea de células TCD4+ “in vitro” e grande
produção de citocinas pro inflamatórias (Yamano, Y. et al., 2005), características
imunológicas estas semelhantes ao que ocorre com camundongos mutantes para
Foxp3 (Lyon, M. F. et al., 1990; Kanangat, S. et al., 1996; Clark, L. B. et al., 1999) e
camundongos deficientes em CTLA-4 (Tivol, E. A. et al., 1995; Waterhouse, P. et al.,
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1995). Adicionalmente, as células CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP
produzem elevadas concentrações de citocinas pro inflamatórias, a exemplo do
Interferon-gama (IFN-y) e interleucina 2 (IL-2) (Yamano, Y. et al., 2005).
A expressão de RNAm para Foxp3 nas células TCD4 +CD25+ de indivíduos com
HAM/TSP é menor do que em indivíduos saudáveis. Elas têm menores níveis de
expressão da proteína Foxp3 e de outros marcadores de células T regulatórias a
exemplo do CTLA-4 e GITR (Yamano, Y. et al. 2005).
Altos níveis de DNA pro viral ou RNAm para o gene Tax, do vírus, tem sido
detectado em pacientes com envolvimento neurológico quando comparado a
indivíduos portadores assintomáticos (Toulza, F. et al., 2008; Nagai, M. et al., 2001;
Takenouchi, N. et al., 2003). Em indivíduos infectados pelo HTLV-1 a expressão de
Foxp3 em células TCD4+ foi inversamente correlacionada com o DNA pro viral para
o gene Tax do HTLV-1. Esses resultados sugerem que a baixa expressão de Foxp3
pode contribuir para o desenvolvimento da doença inflamatória durante a infecção
pelo HTLV-1 (Oh, U. et al., 2006).
Muitos estudos tem avaliado o papel das células T CD4+ regulatórias nas doenças
infecciosas, mas, pouco se sabe a respeito do fenótipo e função das células T CD8 +
regulatórias nessas doenças. Em humanos (Suzuki, M. et al., 2008) e em modelo
animal, linfócitos regulatórios CD8+CD25+Foxp3+ naturais e induzidos já foram
descritos (Pomie, C. et al., 2008). Células naive TCD8+CD25- podem se diferenciar
em células T CD8+CD25+ regulatórias após o encontro com o antígeno (Mills, K. H.
et al., 2004). Por outro lado, células TCD8+ humanas ativadas pelo Mycobacterium
sp coexpressam os marcadores de células T regulatórias CD25 e Foxp3, suprimem
a resposta proliferativa antígeno-específico das células TCD4+ do tipo Th1 (Boer, M.
C. et al., 2013). Também em humanos infectados pelo Mycobacterium já foram
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encontradas células T regulatórias CD8 + nos linfonodos e no sangue. Estas células
foram isoladas das células mononucleares do sangue periférico (CMSP),
estimuladas com BCG e elas coexpressam marcadores clássicos como CD25 e
Foxp3, sendo capazes de inibir a capacidade efetora das células Th1 (Boer, M. C. et
al., 2013). Outro estudo mostrou que em macacos infectados pelo M. tuberculosis as
células T regulatórias CD8+CD25+Foxp3+ foram encontradas juntamente com as
células TCD4+ no sangue periférico e no pulmão (Chen, C. Y. et al., 2012). Células T
regulatórias CD4+ e CD8+ foram encontradas em lesões cutâneas de pacientes com
hanseníase Virchoviana e foram capazes de suprimir a resposta das células CD4+
do tipo Th1 (Ottenhoff, T. H. et al., 1986; Modlin, R. L. et al., 1986). Pouco se sabe
sobre o papel destas células na infecção pelo HTLV-1.
Revisão Bibliográfica
O vírus HTLV-1: caracterização e distribuição geográfica
O HTLV-I tem capacidade de infectar diversos tipos celulares incluindo linfócitos B,
fibroblastos, células dendríticas e monócitos (Matsuoka, M. 2005), mas, possui
tropismo especial pelas células T CD4+. É um retrovirus complexo pertencente ao
gênero Deltaretrovirus e à subfamília Orthoretrovirinae. Está constituído por um
envelope e um capsídeo, que contem no seu interior duas cópias de RNA de fita
simples associadas a uma molécula de tRNA e as enzimas virais (Cann, A. J. et al.,
1996). O genoma do HTLV-I, com 9,03Kb, possui os genes gag, pol, e env e a
região pX e, nos extremos, duas seqüências denominadas seqüências terminais
repetitivas (long terminal repeats - LTRs). Tais seqüências contêm os promotores
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virais e outros elementos regulatórios. A região pX, localizada na extremidade 3’,
contém os genes que codificam para as proteínas virais tax, rex, HBZ (HTLV-I bZIP
factor), p12, p13, p30 e p21 (Matsuoka, M. et al., 2007).
O HTLV-I integra o seu material genético no genoma da célula infectada para poder
expressar os genes virais. Como o seu material genético é RNA, este se transcreve
em DNA de fita dupla pela enzima transcriptase reversa viral no citoplasma da célula
infectada e posteriormente se transporta para o núcleo onde, após reorganização, se
integra no DNA genômico da célula hospedeira pela ação da integrase viral. O DNA
viral, uma vez integrado, chama-se DNA proviral. A capacidade infectiva das
partículas virais extracelulares do HTLV-I é baixa e a infecção de novo é pouco
efetiva. A propagação do vírus no individuo portador acontece de célula infectada
para célula não infectada através de sinapses virológicas (Banghan, C. H. 2003),
onde o RNA viral e outros componentes virais se transferem em forma de complexos
para a célula não infectada, sem a produção e liberação de partículas víricas
(Igakura, T. et al., 2003). No entanto, o mecanismo principal que o vírus usa para
aumentar a carga viral é a indução da proliferação clonal dos linfócitos T CD4+
infectados (Matsuoka, M. 2005).
O primeiro retrovírus humano, o vírus linfotrópico de células T humanas tipo I (HTLV1) foi identificado em 1980 (Gray, G. S. et al., 1990), mas, além deste vírus o HTLV
do tipo II foi descoberto em 1982 (Poiesz, B. J. et al., 1980) e dois novos tipos de
HTLV, 3 e 4, foram identificados em populações da África Central em 2005 (Calattini,
S. et al., 2005; Wolfe, N. et al., 2005). A prevalência varia de acordo com a região
geográfica, os padrões sócio-comportamentais e étnicos das populações e esta
infecção caracteriza-se, também, por ser mais frequente em mulheres e aumentar
com a idade (Proietti, F. A. et al., 2005).
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Este vírus se transmite por três vias: a) sexual, com maior eficiência de transmissão
de homem para mulher. Estima-se que essa eficiência seja de cerca de 60%, sendo
de 4% no sentido inverso; b) sanguínea, através de transfusão de sangue ou pelo
uso de agulhas e/ou seringas contaminadas e c) perinatal, da mãe par ao filho,
principalmente pelo aleitamento materno. Para que ocorra a infecção há a
necessidade da presença de células infectadas (Proietti, F. A. et al., 2005).
As principais áreas endêmicas da infecção compreendem África, América do Sul e
Central, Caribe, Japão, Melanésia e Oriente Médio. Na América do Sul e Central se
destacam Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia, Honduras, Panamá, Peru e
Venezuela (Proietti, F. A. et al., 2005). A província equatorial do Congo apresenta a
prevalência mais elevada desta infecção na África (Goubau, P. et al., 1990). Foram
detectadas infecções em tribos de pigmeus que vivem isolados em áreas remotas da
república Centro Africana, Camarões e nordeste do Congo (Salemi, M. et al., 1998).
Baseado na existência destas infecções na África Equatorial e em descendentes de
africanos no Caribe e na América Latina sugere-se que a África seria a fonte
primária deste vírus (Verger, P. 1968).
O vírus do HTLV-I foi detectado pela primeira vez no Brasil, em imigrantes japoneses
na cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul em 1986 (Kitagawa, T. et al.,
1986). Posteriormente foi constatado em outros grupos populacionais (CatalanSoares, B. C. et al., 2001). A maioria dos dados epidemiológicos da infecção no
Brasil refere-se à prevalência em populações específicas. Em doadores de sangue
observa-se um gradiente de indivíduos infectados, com taxas mais elevadas nas
regiões norte/nordeste e as mais baixas na região sul (Catalan-Sores, B. et al., 2005)
Figura 1. Salvador e São Luiz são as cidades que apresentam as maiores
prevalências em doadores de sangue no território nacional (Catalan-Soares, B. et al.,
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2005, Galvãoo-Castro, B. et al., 1997). Baseados nos dados de prevalência em
doadores de sangue estima-se que no Brasil existam 2,5 milhões de portadores de
HTLV-I (Carneiro-Proietti, A. B. et al., 2002; Carneiro-Proietti, A. B. et al., 2006) e
estima-se que 40 mil pessoas estejam infectadas em Salvador (Dourado, I. et al.,
2003). Tem sido, também, demonstrando a presença do HTLV-I em outras cidades
do estado da Bahia (Britto, A. P.C.R. et al., 1998; Magalhães, T. et al., 2008; Rego,
F. F. et al., 2008).
Figura 1- Distribuição geográfica do HTLV-1 no Brasil (Catalan-Soares et. al.,
2005)
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Manifestações clínicas
O HTLV-I tem sido considerado um vírus com pouca patogenicidade visto que é
descrito que menos de 5% dos infectados desenvolvem doenças graves associadas
a esta infecção, a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) (Hinuma, Y. et al.,
1981) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP)
(Manns, A. et al., 1999, Orland, J. R. et al., 2003).
Além
das
apresentações
classicamente
descritas,
condições
inflamatórias
associadas ao HTLV-I são relatadas, como a síndrome de Sjogren (Eguchi, K. et al.,
1992), uveítes (Mochizuki, M. et al., 1992), polimiosite, artropatias (Morgan, O. S. et
al., 1989), disfunção erétil (Castro, N. et al., 2013), sintomas urinários (Castro, N. M.
et al., 2007) e alterações neurológicas que não preenchem os critérios para
HAM/TSP (Zunt, J. R. et al., 1999). Estudo realizado em portadores de HTLV-I
considerados assintomáticos identificou uma prevalência maior de parestesias,
sintomas urinários, artralgias, disfunção erétil, gengivite e periodontite quando
comparado com um grupo de indivíduos soronegativos (Caskey, M. F. et al., 2007).
A infecção por HTLV-I está associada com uma série de manifestações clínicas,
sugerindo que os portadores assintomáticos não correspondem a maioria dos
indivíduos infectados, como anteriormente pensado.
Estudos de coorte, entretanto, identificaram um risco para progressão para
HAM/TSP menor que 5%, com a
maioria dos pacientes
permanecendo
assintomáticos durante longo período de acompanhamento (Orland, J. R. 2003).
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Características da HAM/TSP
Inicialmente, a HAM/TSP foi descrita em 1985, na Martinica, Jamaica e Colômbia,
após a constatação da presença de anticorpos anti-HTLV-I no soro de mais de 60%
dos pacientes com paraparesia espástica tropical – TSP (Gessain, A. et al., 1985).
Em 1986, no Japão, foi descrita com a denominação de mielopatia associada ao
HTLV-I – HAM (1). Somente em 1988 foi reconhecida pela Organização Mundial de
Saúde (OMS) e denominada de HAM/TSP, por concluírem que se tratava de uma
mesma doença.
Ela apresenta-se como uma síndrome de desmielinização de início insidioso,
caracterizada por rigidez ou fraqueza progressiva dos membros inferiores,
espasticidade e hiperreflexia. Os indivíduos infectados podem apresentar dor
lombar, leves sintomas sensitivos (perda ou redução da sensibilidade superficial e/ou
profunda) e incontinência urinária. No processo de evolução da doença surge
obstipação intestinal, diminuição da libido e da potência sexual. O desenvolvimento
da HAM/TSP ocorre em cerca de 1 a 5% de indivíduos infectados pelo HTLV-I,
afetando freqüentemente mais as mulheres que os homens, na proporção 2,5:1 a
3:1. O período de latência para HAM/TSP é mais curto do que para ATLL. Acomete
indivíduos predominantemente na 4ª e 5ª décadas de vida e raramente antes dos 20
ou após os 70 anos. Cerca de 30% dos pacientes com HAM/TSP tornam-se
paraplégicos e confinados ao leito, cerca de dez anos após a instalação da doença
(Carneiro-Proietti, A. B. et al., 2002).
A HAM/TSP tem como característica marcante o comprometimento da medula
torácica inferior. Estudos histopatológicos evidenciam uma intensa infiltração
linfocitária, um processo de desmielinização, degeneração axonal e gliose. Tem sido
10
descrito um processo de degeneração da substância branca, caracterizada por
intenso exsudado, e pouco envolvimento da substância cinzenta. Associado a este
quadro observa-se um intenso processo inflamatório com predominância de células
mononucleares, principalmente linfócitos T CD4+ e CD8+. Nos casos mais
avançados ou de longa duração predominam o processo de degeneração sobre o
processo inflamatório com a substituição do padrão celular por um padrão mais
atrófico - atrofia medular de moderada à grave (Yoshioka, A. et al., 1993).
A HAM/TSP foi descrita como lentamente progressiva e é considerada uma doença
de baixa letalidade. Apesar de alguns aspectos da fisiopatologia do vírus ainda
serem desconhecidos, admitem-se três hipóteses para explicar o papel do HTLV-I no
desenvolvimento da HAM/TSP: a primeira hipótese aponta para um mecanismo de
citotoxicidade direta, onde células T CD8+ citotóxicas, específicas para antígenos do
HTLV-I, cruzariam a barreira hematoencefálica e destruiriam, por mecanismos
citotóxicos diretos ou via produção de citocinas, as células da glia infectadas pelo
HTLV-I (Ijichi, S. et al., 1995; Nakamura, S. et al., 1993; Furukawa, Y. et al., 2003); a
segunda hipótese, denominada de autoimune, aponta para um processo de
mimetismo molecular no qual a semelhança entre uma proteína neuronal
(ribonucleoproteina nuclear heterogênea, hnRNP-A1) do hospedeiro e a mais
importante proteína do vírus, o antígeno Tax, acarretaria um processo inflamatório
de auto-imunidade com lesão neuronal (Levin, M. C. et al., 2002), a terceira e última
hipótese, a mais aceita delas, também denominada de dano circundante ou
“bystander” envolveria os linfócitos T CD4+ infectados e os linfócitos T CD8+
específicos para a proteína viral Tax, que juntos atravessariam a barreira
hematoencefálica e produziriam grande quantidade de citocinas próinflamatórias
levando a um processo de intensa inflamação e destruição tecidual (Osame, M.
11
2002; Kubota, R. et al., 2003; Nagai, M. et al., 2003). Dando suporte a esta hipótese
estão os estudos que mostram que mediadores potencialmente inflamatórios
(citocinas, quimiocinas e
metaloproteinases),
quando produzidos em altas
concentrações em locais como o tecido nervoso, podem ser altamente tóxicos
(Biddison, W. W. et al., 1997)
Resposta Imune desencadeada pelo HTLV-1
A infecção pelo HTLV-1 envolve aspectos imunológicos ainda não completamente
elucidados, embora seja amplamente aceito que fatores imunológicos e virais
participam da imunopatogênese da infecção pelo HTLV-I, sendo os principais
estudos neste sentido aqueles relacionados com a HAM/TSP (Tanajura, D. et al.,
2009). O HTLV-I tem sido descrito como capaz de infectar, tanto in vitro como in
vivo, um grande número de tipos celulares. Todavia os linfócitos T CD4+, e numa
menor extensão os linfócitos T CD8+, são considerados como os principais alvos do
HTLV-I (Richardson, J. H. et al., 1990; Nagai, M. et al., 2001). Foi demonstrado que
células dendríticas (célula dentrítica plasmocitóide - pDC; mieloide - myDC e a
derivada de monócitos - MDDC) também são facilmente infectadas pelo HTLV-I e
capazes, in vitro, de eficientemente transmitir o vírus para as células T (Jones, K. S.
et al., 2008).
Ao infectar as células T CD4+, a proteína Tax do vírus induz ativação e proliferação
celular. As células T CD8+ específicas atuam sobre as células T CD4+ infectadas no
sentido de conter a infecção. Todavia o persistente estado de ativação das células T
CD4+ e T CD8+, associado a uma incapacidade de modulação da resposta imune,
leva ao desenvolvimento de uma resposta imune exagerada e ao dano tecidual
12
(Cartier, L. et al., 2005). Como esta ativação é persistente, os linfócitos T infectados
pelo vírus ficam hiperativados e proliferam intensamente,
fenômeno este
demonstrado, in vitro, pela linfoproliferação espontânea das células infectadas,
mesmo na ausência de estímulos exógenos (Prince, H. et al., 1990).
O envolvimento das células T CD4+ infectadas, como células produtoras de citocinas
do tipo 1, e participantes da imunopatogênese da HAM/TSP tem sido publicado em
estudos que mostram um aumento da produção de IFN-γ, Fator de necrose tumoral
(TNF), Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e
Interleucina 1 (IL-1) pelas células T CD4+ de pacientes com HAM/TSP (Nishiura, Y.
et al., 1996; Watanabe, H. et al., 1995). Isso sugere a presença de uma intensa e
exagerada resposta imune celular inflamatória nestes pacientes (Santos, S. B. et al.,
2004). Este e outros achados sugerem que células T com perfil Th1, mais do que
células Th2 (Linfócitos T auxiliares tipo 2), predominam na população de células T
CD4+ dos pacientes com HAM/TSP (Furukawa, Y. et al., 2003; Nishiura, Y. et al.,
1996).
Na infecção pelo HTLV-I a resposta desencadeada por células T CD8+ específicas
para o HTLV-I, é reconhecida como um evento importante no desenvolvimento da
HAM/TSP. Estas células estão cronicamente ativadas e a maioria reconhece a
proteína viral Tax (Hanon, E. et al., 2000; Tivol, E. A. 1995). A ativação dos linfócitos
T CD8+ específicos para Tax induz uma intensa produção de citocinas próinflamatórias e este fenômeno parece, também, estar diretamente envolvido no
desenvolvimento da HAM/TSP (Kubota, R. et al., 1998; Biddison, W. E. et al., 1997).
Linfócitos T CD4+ e CD8+ infectados pelo HTLV-I presentes no sangue periférico são
capazes de infiltrar a medula espinhal e produzir citocinas pró-inflamatórias como
IFN-γ, TNF-α e Interleucina 6 (IL-6), mediadores capazes de causar dano tecidual
13
como os observados na HAM/TSP (Kubota, R. et al., 1998; Osame, M. 2002). A
barreira hematoencefálica constitui a interface entre o sangue e o sistema nervoso
central (SNC). Na HAM/TSP a perda da integridade desta barreira é descrita em
estudos que evidenciam a infecção das células endoteliais pelo HTLV-I e a
passagem de linfócitos infectados através do endotélio cerebral (Afonso, P. V. et al.,
2008; Cavrois, M. et al., 2000).
Além das citocinas pró-inflamatórias, as quimiocinas, pequenas proteínas envolvidas
no tráfego normal dos leucócitos e no recrutamento de leucócitos para sítios de
lesão, têm sido reconhecidas por contribuir para a resposta inflamatória observada
na HAM/TSP (Narikawa, K. et al., 2005; Montanheiro, P. et al., 2007). Estudos
desenvolvidos pelo nosso grupo demonstraram que Chemokine C-X-C motif ligand 9
(CXCL-9) e Chemokine C-X-C motif ligand 10 (CXCL-10), quimiocinas reconhecidas
como importantes no recrutamento de células Th1, estavam aumentadas no soro de
pacientes com HAM/TSP, quando comparadas com os portadores assintomáticos do
HTLV-I ou controles saudáveis. Estes sugerem que a presença destas moléculas
pode levar a um aumento no recrutamento de fatores pró-inflamatórios para o tecido
medular, contribuindo para os danos observados no desenvolvimento da HAM/TSP
(Guerreiro, J. B. et al., 2006; Shevach, E. M. 2002).
Alternativamente, a patogênese da infecção pelo HTLV-I poderia estar também
relacionada a uma ativação de células T e B auto reativas e consequentemente
desenvolvimento de reações auto-imunes. Um dos aspectos importantes que deram
apoio ao papel de fenômenos auto-imunes na patogenia da infecção pelo HTLV-I foi
a elevada frequência de síndrome de Sjogren e de artrite reumatóide reportada em
pacientes infectados por este vírus (Tanajura, D. et al., 2009).
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Células T regulatórias
As células Treg são uma população de células T CD4+ CD25+, que têm uma função
inibitória sobre o sistema imune. Estas células parecem estar relacionadas ao
controle da resposta imune de uma forma mais ampla, modulando a “amplitude” da
resposta, tanto na fase de expansão quanto na de constrição (Sakaguchi, S. et al.
2001). A função inibitória das células Tregs sobre as células T pode ser tanto pela
secreção de citocinas imuno supressoras como IL-10 e TGF-, quanto pelo contato
célula a célula, via CTLA-4 ou TGF- de membrana (Nakamura, K. et al., 2001; Chen
et al. 2003).
As células T regulatórias são caracterizadas pela expressão constitutiva das
moléculas forkhead transcription factor (Foxp3), glucocorticoid-induced TNF receptor
family-related (GITR), cytotoxic T limphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) e altos
níveis de CD25 (revisto por Cruvinel, W. M. et al., 2008; Hori, S. et al., 2003; Khattri,
R. et al., 2003; Fontenot, J. D. et al., 2003; Shimisu, J. et al., 2002; McHugh, R. S. et
al., 2002; Read, S. et al., 2000; Salomon, B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000).
As células T regulatórias (Treg) são divididas em dois grupos: células T regulatórias
que ocorrem naturalmente CD4+CD25+ (células Treg naturais) que normalmente se
desenvolvem no timo. Estão presentes no hospedeiro antes da exposição ao
patógeno e regula a reatividade de células T na periferia e são importantes para a
manutenção da tolerância imunológica e, células T regulatórias induzíveis ou
adaptativas, são ativadas nos tecidos linfóides periféricos, supostamente em
resposta ao estímulo antigênico e desempenham um papel importante na
modulação da resposta imune contra agentes infecciosos, como as células T CD4+
convencionais, após exposição de sinais como citocinas regulatórias, drogas
15
imunossupressoras, células apresentadoras de antígenos (APCs) ou condicionadas
por produtos microbianos (O’Garra, A. et al., 2004; Grassi, M. F. R. et al., 2009). A
população de células T regulatórias induzíveis inclui: células T regulatórias 1 (Tr1),
células T helper 3 (TH3) e células T regulatórias FOXP3 (forkhead Box P3)
convertidas (revisto por Belkaid, Y. 2007). Figura 2.
Figura 2- Tipos de células T regulatórias induzíveis. Adaptado de Noh & Lee,
2011.
As células Treg expressando CD25 (receptor de IL-2 cadeia α) constitui 1-2% da
população de CD4+ periférica em humanos, sendo que as CD4+CD25high são
aquelas que exibem funções regulatórias (Baecher-Allan, C. et al., 2001), enquanto
que as CD25Low representam células T ativadas (Baecher-Allan, C. et al., 2001;
Viglietta, M. et al., 2004; Lindley, S. et al., 2005).
As Treg não proliferam em resposta a estimulação antigênica in vitro e podem
suprimir a proliferação de outras células T induzida por estímulo especifico ou
policlonal (Sakaguchi, S. et al., 2001;Shevach, E. M. 2002).
16
Já foi mostrado que camundongos mutantes para Foxp3 e para CTLA-4 apresentam
disfunções de células TCD4+ e doenças autoimunes (Lyon, M. F. et al., 1990;
Kanangat, S. et al., 1996; Clark, L.B. et al., 1999; Tivol, E.A. et al., 1995;
Waterhouse, P. et al., 1995).
Os pacientes com HAM/TSP apresentam características imunológicas semelhantes
a aqueles encontrados em camundongos mutantes para Foxp3 e deficientes para
CTLA-4, incluindo linfoproliferação espontâneas de células TCD4 + e manifestações
clínicas associadas com doenças autoimunes, caracterizada por infiltrado linfocítico
em múltiplos órgãos e grande produção de citocinas proinflamatórias (Yamano, Y. et
al., 2005;). Nestes pacientes as células CD4+CD25+ são o principal reservatório de
HTLV-1, com mais de 90% desta população contendo DNA proviral do HTLV-1
(Yamano, Y. et al., 2005; Yamano, Y. et al., 2004).
A expressão de mRNA para Foxp3 nas células CD4 +CD25+ de pacientes com
HAM/TSP é menor do que em indivíduos saudáveis. É também menor a expressão
de GITR e CTLA-4 (Yamano, Y. et al., 2005). Uma menor expressão de Foxp3 em
células CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP sugere três possibilidades: O
HTLV-1 tem um efeito inibitório na expressão de Foxp3; a população das
CD4+CD25+ é diminuída em pacientes com HAM/TSP; e pacientes com HAM/TSP
tem geneticamente baixa expressão do gene Foxp3 (Yamano, Y. et al., 2005).
As células T regulatórias CD8+ são ainda pouco conhecidas. Entretanto as células
TCD8+CD25+ são descritas em humanos (Suzuki, M. et al., 2008), camundongos
(Pomie, C. et al., 2008), e pouco se sabe sobre o seu papel regulatório. As Células T
CD8+CD25- (naive) podem se diferenciar em T reg CD8 +CD25+ após o encontro com
antígeno (Mills, K. H. 2004).
17
Resposta Imune na infecção pelo Schistosoma
A infecção pelo Schistosoma spp ocorre através da penetração das cercarias pela
pele (ver ciclo do S. mansoni, Figura 3). Após este processo as cercarias perdem a
cauda e transformam-se em esquistossômulos que ganham a circulação e realizam
o ciclo pulmonar. Em seguida migram para o sistema porta, aonde chegam a fase
adulta. Estes parasitos vivem no sistema porto-mesentérico, põem os ovos nos
capilares intestinais e estes aparecem nas fezes após passar pelos tecidos da
mucosa intestinal, principalmente na região colônica. Os ovos ainda podem ganhar
a circulação porta-hepática e alcançarem os espaços porta, levando a formação de
granulomas, que são caracterizados pela reação inflamatória a antígenos do ovo,
seguida da produção de colágeno, podendo evoluir para um quadro de fibrose
periportal hepática (Wynn, T. A. et al., 1995).
Figura 3- Ciclo de vida do Schistossoma.
18
Durante a fase aguda a resposta imune desencadeada pelo parasita é do tipo Th1,
com produção das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ e TNF. Logo após a ovoposição
a resposta imune muda para o perfil Th2 com a produção de Interleucina 4 (IL-4),
interleucina 5 (IL-5), interleucina-13 (IL-13), com uma forte resposta Th2, mas, logo
em seguida ocorre uma baixa da resposta Th2 e um aumento da resposta
regulatória, com o aumento de células T regulatórias e produção das citocinas
regulatórias Fator de crescimento de transformação β (TGF-β) e Interleucina-10 (IL10) e se mantém assim durante toda a fase crônica (Dunne, D. W. et al., 2005).
Em modelo experimental a infecção pelo Schistosoma mansoni ou injeção de seus
produtos leva a uma diminuição na produção de IFN-γ, TNF e outras citocinas proinflamatórias, e aumento da produção de IL-10 e TGF-β, importantes citocinas
modulatórias (Dunne, D. W. et al., 2005). Esse perfil modulatório desencadeado por
helmitos vem despertando o interesse em estudos de modulação da resposta imune
em várias doenças de base imunológica, a exemplo do Diabetes tipo 1, Esclerose
Múltipla, Doença de Crohn e Asma brônquica (Elliott, et al. 2007).
HIPÓTESE
A hipótese do presente estudo é que antígenos do Schistosoma spp são capazes de
modular negativamente a resposta imune inflamatória em indivíduos infectados pelo
HTLV-1, através da expressão de células e citocinas regulatórias da resposta imune.
19
JUSTIFICATIVA
Antígenos de S. mansoni induzem a produção de IL-10 (Araujo, M. I. et al., 1996;
Correa-Oliveira, R. et al., 1998; Gazzinelli, G. et al., 1992; Williams, M. E. et al.,
1994) e existem evidências de que a IL-10 modula a resposta imune envolvida nas
doenças que cursam com a exacerbação da resposta imune do tipo Th1 (Elliott, D.
E. et al., 2003; La Flamme, A. C. et al., 2003; Sewell, D. et al., 2003), e do tipo Th2
(Araujo, M. I. et al., 2004; Royer, B. et al., 2001). Estes achados justificariam a busca
da identificação de antígenos de S. mansoni capazes de induzir a modulação das
respostas inflamatórias, na tentativa de futuro desenvolvimento de uma vacina capaz
de prevenir ou até mesmo atenuar as manifestações destas doenças.
A escolha dos antígenos recombinantes do S. mansoni Sm29, ShTSP2 e PIII para
serem utilizados neste estudo decorreu do fato de todos eles serem localizados na
membrana e/ou tegumento do verme adulto. Proteínas secretadas ou localizadas na
superfície de Schistosoma spp, que estão em íntimo contato com os tecidos do
hospedeiro
provavelmente
são
mais
eficazes
em
desencadear
processos
imunorregulatórios como mecanismo de escape do sistema imune.
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de antígenos recombinantes do Schistosoma spp. em modular
a resposta imune do tipo Th1/inflamatória in vitro, na infecção pelo HTLV-1.
20
Objetivos específicos
Em indivíduos infectados pelo HTLV- 1, assintomáticos e com HAM/TSP, avaliar:
1. A capacidade dos antígenos do Schistosoma spp. Sm29, shTSP2 e PIII
em
alterar a produção de IFN-γ, TNF e IL-10 e das quimiocinas CXCL9 e CXCL10 por
CMSP de pacientes com HTLV-1;
2. A capacidade destes antígenos em induzir um perfil regulatório nos linfócitos
TCD4+ e TCD8+ de pacientes infectados pelo HTLV-1, através da expressão das
moléculas modulatórias CD25, Foxp3 e CTLA-4 nessas células.
3. A frequência de células CD4+, CD8+, Monócitos e Linfócitos B expressando IL-10.
METODOLOGIA
População do estudo
Um total de 26 indivíduos infectados pelo HTLV-1 provenientes do Ambulatório
multidisciplinar de HTLV-1 do Serviço de Imunologia da Universidade Federal da
Bahia, localizado na cidade de Salvador, estado da Bahia no Brasil, com idade entre
10 a 60 anos, não infectados pelo S. mansoni e nenhum outro tipo de helminto, não
portadores de
doenças crônicas,
que
não
estejam em uso
de
drogas
imunossupressoras, do gênero masculino e mulheres não gestantes, foram incluídos
neste estudo.
Todos os pacientes doaram sangue para a separação das Células Mononucleares
do Sangue Periférico (CMSP) e estas foram cultivadas na presença e ausência dos
21
antígenos do Schistosoma spp. (rSm29, rShTSP2 e PIII). Após 72 horas de
incubação, a 37ºC e 5% CO2 foi recolhido o sobrenadante para a avaliação da
produção das citocinas IFN-γ, TNF e IL-10 e das quimiocinas CXCL9 e CXCL10,
através da técnica de ELISA Sanduiche. Após aproximadamente 20 horas, nas
mesmas condições acima, também foi avaliada a expressão de moléculas em
linfócitos TCD4+ e TCD8+ (CD25, Foxp3, CTLA-4) e a produção de IL-10 pelas
células TCD4+, TCD8+, Linfócitos B e monócitos, através da citometria de fluxo.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Maternidade Climério de Oliveira
da Universidade Federal da Bahia e o consentimento de participação do estudo foi
obtido de todos os pacientes.
22
23
Avaliação Laboratorial
Detecção da infecção pelo HTLV-1
Anticorpos anti HTLV-1 foram detectados utilizando a técnica de ELISA (Cambridge
Biotech Corp, Worcester, Mass., USA). Os resultados positivos foram confirmados
usando Western blot (HTLV blot 2.4, Genelabs, Science Park Drive, Singapore).
Antígenos de Schistosoma spp
Os antígenos usados neste estudo foram o rSm29, uma proteína recombinante do S.
mansoni, glicoproteína de membrana localizada no tegumento do verme adulto e no
estágio de esquistossômulo (Cardoso, F. C. et al., 2006), o rShTsp-2 uma proteína
recombinante (tetraspanina) do tegumento do S. haematobium (Rinaldi, G. et al.,
2011) e o PIII que é uma fração do antígenos solúvel do verme adulto do S. mansoni
(SWAP) obtido por cromatografia iônica (Hirsch, C. et al., 1996).
As proteínas recombinantes Sm29 e ShTsp-2 foram clonadas em Escherichia coli e
o nível de contaminação por lipopolissacarídeo foi avaliado através de um Kit
comercial (chromogenic LAL end-point assay kit - Cambrex, Charles City, Iowa,
USA) e foi <0,25 ng/ml. Para neutralizar o potencial efeito dos lipopolissacarídeos
encontrados em baixos níveis nos antígenos recombinantes de Schistosoma a
polimixina B foi adicionada as culturas de células a cada 12 horas, como
estabelecido previamente (Cardoso, L. S. et al., 2007).
24
Culturas de CMSP e dosagem de citocinas e quimiocinas
Os antígenos rSm29 (5 μg/ml), rShTSP2 (5 μg/ml) e PIII (10 μg/ml) foram
adicionados a culturas de CMSP (Células Mononucleares do Sangue Periférico) (3 x
106células/ml) de indivíduos infectados pelo HTLV-1, contendo RPMI 1640 (Gibco,
Grand Island, N.Y., USA)
mais 10% soro AB Rh+
Chemical Co., St. Louis, Mo., USA),
humano inativado (Sigma
antibióticos e glutamina. As células foram
incubadas a 37 °C em atmosfera de 5% CO2 em placas de 24 poços por 72 h. O
sobrenadante foi coletado para posterior dosagem de citocinas.
Níveis das cintocias IFN-γ, TNF, IL-10 e das quimiocinas CXCL-9, CXCL-10 foram
medidos pela técnica de ELISA sanduiche, usando Kit comercial (OptEIA; BD
Bioscience, San Jose, Calif., USA). Os resultados foram expressos em picogramas
por mililitros (pg/ml), com base na curva padrão.
Culturas de CMSP, avaliação das células T regulatórias e expressão de IL-10
nos linfócitos e monócitos
Os marcadores das células TCD4+ e TCD8+, CD25, Foxp3 e CTLA-4 e a expressão
de IL-10 nestas células e nos linfócitos B e monócitos, foram avaliados usando a
Citometria de Fluxo (FACS Canto II). Os antígenos rSm29 (0.5 ug/mL), rShTSP2
(0.5 ug/mL) e PIII (1 ug/mL) foram adicionados as culturas de CMSP (3 x 105
cells/mL) de indivíduos infectados pelo HTLV-1, com RPMI 1640 (Gibco, Grand
Island, NY, USA) mais 10% soro AB humano inativado Rh+ (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO), antibióticos e glutamina. As células foram incubadas a 37 oC em
atmosfera de 5% CO2 em places de 96 poços por 16 horas.
25
Para a marcação de superfície celular, 3 x10 5 células foram incubaddas com
anticorpos anti CD4+, CD8+, CD25+, CD14+ e CD19+ por 20 minutos a 4°C e, para a
marcação intracelular, foram usados anti CTLA-4. Foxp3, IL-10 de acordo com as
instruções do protocolo do kit (BD Pharmingen and eBioscience). Para distinguir
claramente as populações de células TCD4+, TCD8+, CD25+, CTLA-4+, Foxp3+ e
TCD4-, TCD8-, CD25-. CTLA-4-, Foxp3-, foi utilizado o isotipo controle de acordo com
as recomendações. As analises foram feitas usando FACS Canto II com o Software
Diva (BD Pharmingen), e o Flowjo (Treestar).
Os anticorpos usados foram obtidos da BD Pharmingen (mouse anti human CD4
(Clone RPA-T4), CD8 (RPA-T8), CD25 (M-A251), CD19 (555412), CD14 (555399),
IL-10 (559339) e da eBioscience anti-human CD152 (CTLA-4) (14D3), CD3
(UCHT1), Foxp3 (PCH101), HLA-DR (LN3).
Análise estatística
O teste não paramétrico de Wilcoxon signed-rank test foi utilizados para analisar o
efeito da adição de antígenos de Schistosoma spp. na produção de IFN-γ, TNF, IL10, CXCL-9, CXCL-10 e na expressão das moléculas: CD25, CTLA-4, Foxp3 nas
células TCD4+, TCD8+ e na produção de IL-10 pelos Linfócitos, B, CD4+, CD8+ e
monócitos. O teste exato de Fisher (Fisher exact test) foi usado para comparar
proporções. Um erro alfa (α) de 5% (p < 0,05) foi considerado como estatisticamente
significante. O software SPSS 9.0 (IBM Software, New York, N.Y., USA) foi utilizado
para a realização das análises estatísticas.
26
RESULTADOS
1- Estudo da modulação da resposta inflamatória do tipo Th1 na infecção
pelo HTLV-1
Dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 incluídos neste estudo dezessete eram
portadores assintomáticos do vírus (65%) enquanto que nove (35%) tinha a forma
HAM/TSP. A média de idade não diferiu entre os portadores do vírus e os com
HAM/TSP (47 ± 10 e 50 ± 6 anos, respectivamente; p>0,05). No grupo dos
indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do sexo
masculino (56% x 29%; p<0,05).
As concentrações de citocinas foram avaliadas no sobrenadante das culturas de
CMSP através de ELISA sanduíche. Observamos que os níveis de IFN-y foram
mais altos em culturas de CMSP não estimuladas (3.334 ± 3.822 pg/ml) quando
comparadas com culturas estimuladas com o antígeno rShTSP-2 (2.188 ± 2.560
pg/ml, 34% de redução; p = 0,004; Tabela I). Não foram observadas diferenças
estatisticamente significantes nos níveis médios de IFN-y entre culturas não
estimuladas e estimuladas com rSm29 ou PIII (Tabela I).
Em relação ao TNF, seus níveis também foram mais altos nas culturas não
estimuladas (436 ± 184 pg/ml) quando comparadas as culturas estimuladas: rSm29
(252 ± 163 pg/ml, 42% de redução; p = 0,018), rShTSP-2 (251 ± 130 pg/ml, 42% de
redução; p = 0,043) e PIII (190 ± 205 pg/ml, 56% de redução; p = 0,008; Tabela I).
Por outro lado, os níveis médios de IL-10 foram mais baixos em culturas não
estimuladas (123 ± 157 pg/ml), quando comparados com os níveis desta citocina em
27
culturas estimuladas com rSm29 (223 ± 391 pg/ml, 81% de aumento; p = 0,008) ou
com rShTSP-2 (556 ± 502 pg/ml, 352% de aumento; p = 0,0001; Tabela I).
Tabela I- Efeito da adição dos antígenos de Schistotoma spp sobre a produção
de IFN-y, TNF e IL-10 pelas CMSP de indivíduos infectados pelo HTLV-1
Redução de
IFN-γ
Redução de
TNF
sem
antigenos
rSm29
rShTSP-2
PIII
sem
antigenos
rSm29
rShTSP-2
PIII
Niveis de citocinas
(pg/ml)
média ± DP
3.334 ± 3.822
Redução/
Aumento
(%)
-
Valor de p*
2.802 ± 3.769
2.188 ± 2.560
2.812 ± 2.741
16
34
17
0,104
0,004
0,534
436 ± 184
-
-
252 ± 163
251 ± 130
190 ± 205
42
42
56
0,018
0,043
0,008
-
sem
123 ± 157
antigenos
Aumento de rSm29
223 ± 391
81
0,008
IL-10
rShTSP-2
556 ± 502
352
0,0001
PIII
125 ± 185
16
0,07
* Niveis de citocinas em culturas não estimuladas X culturas estimuladas com antigenos de
Schistosoma spp. Wilcoxon Signed-Rank Test.
A frequência de indivíduos que apresentaram uma redução significativa nos níveis
de IFN-y quando os antígenos rSm29, rShTSP-2 e PIII foram adicionados as culturas
foram 50%, 69% e 50%, respectivamente (Tabela II). A redução apresentada nos
níveis desta citocina foi de 59% quando as culturas foram estimuladas com rSm29;
47% de redução após estimulação com rShTSP-2 e 35% de redução na presença do
PIII (Tabela II). Já para TNF, esta frequência, quando os antígenos rSm29, rShTSP2 e PIII foram adicionados as culturas foram 41%, 29% e 53%, respectivamente
(Tabela II). A redução apresentada nos níveis desta citocina foi de 43% quando as
28
culturas foram estimuladas com Sm29; 45% de redução após estimulação com
rShTSP-2 e 45% de redução na presença do PIII (Tabela II).
A respeito da produção de IL-10, a frequência de indivíduos que apresentaram
significante aumento nos níveis desta citocina após estimulação com rSm29,
rShTSP-2 e PIII foi de 74%, 62% e 44%, respectivamente (Tabela II). E o aumento
nos níveis desta citocina foi de 327%, 573% e 35% em resposta ao rSm29, rShTSP2 e PIII, respectivamente (Tabela II).
Tabela II- Frequência de indivíduos que apresentaram mudanças nos niveis de
IFN-, TNF e IL-10 na presença dos antígenos do Schistosoma spp nas culturas
Redução de
IFN-γ
Antígenos
de
Schistosoma
spp
rSm29
rShTSP-2
Redução/Aumento dos níveis de Citocinas
Número de pacientes (%) / Percentagem de
redução/Aumento
13 (50 %) / 59%
18 (69 %) / 47%
PIII
13 (50 %) / 35%
Redução de
rSm29
07 (41 %) / 43%
TNF
rShTSP-2
PIII
5 (29 %) / 45%
9 (53 %) / 45%
Aumento de
IL-10
rSm29
rShTSP-2
PIII
4 (57 %) / 71%
3 (60 %) / 79%
4 (44 %) / 0%
A partir destes resultados foram comparadas as manifestações clínicas e os dados
laboratoriais dos indivíduos que apresentaram redução nos níveis de IFN-γ e TNF
com aqueles que não tiveram redução nos níveis destas citocinas na presença dos
antígenos de Schistosoma spp (Tabela III e Tabela IV, respectivamente).
A mediana da idade e a distribuição do gênero não diferiram entre os dois grupos
para nenhum dos antígenos testados (Tabela III e IV). Adicionalmente, a frequência
de pacientes com HAM/TSP entre os indivíduos que tiveram redução dos níveis de
29
IFN-y e TNF na presença de rSm29, rShTSP-2 e PIII foram similares a aqueles que
não apresentaram inibição na produção destas citocinas (Tabela III e Tabela IV).
Foi observado, entretanto, que os níveis basais de IFN-y e TNF foram menores no
grupo de indivíduos que tiveram uma diminuição nos níveis desta citocina na
presença de rSm29 nas culturas [mediana, (valores de IFN- y mínimo e máximo) =
469 pg/ml (63 – 3.277 pg/ml)], [mediana, (valores de TNF mínimo e máximo) = 190
pg/ml (190 (41 – 518 pg/ml)] quando comparados aos grupos de pacientes que não
tiveram redução na produção de citocinas [IFN- y 3.133 pg/ml (479 – 17.297 pg/ml);
p < 0,01 e TNF 1.677 pg/ml (280 – 2.082 pg/ml); p < 0,01; Tabelas III e IV
respectivamente]. Os níveis basais de IL-10 em indivíduos que mostraram
diminuição nos níveis de IFN-y e TNF quando os antígenos de Schistosoma foram
adicionados às culturas não diferiram significativamente daqueles que não tiveram
redução nos níveis de IFN-y e TNF pela presença dos antígenos (Tabela III e IV).
Também não foram encontradas diferenças na carga pro viral de HTLV-1 entre os
indivíduos que tiveram e não tiveram redução na produção de IFN-y e TNF (Tabela
III e IV).
30
Tabela III - Características dos indivíduos que apresentaram ou não inibição na
produção de IFN-y pela adição dos antígenos do Schistosoma spp nas
culturas.
Indivíduos que apresentaram
inibição da produção de IFN-γ
rSm29
(n=13/26)
Idade em anos
mediana( mínimo e
máximo)
Gênero masculino
n (%)
HAM/TSP
n (%)
rShTSP-2
(n=18/26)
PIII
(n=13/26)
Indivíduos que não apresentaram
inibição da produção de IFN-γ
rSm29
(n=13/26)
rShTSP-2
(n=8/26)
PIII
(n=13/26)
48
(23 - 58)
48
(23 - 58)
48
(23 - 58)
49
(23 - 59)
53
(35 - 59)
50
(43 - 59)
5 (38)
7 (39)
3 (23)
5 (38)
3 (38)
7 (54)
6 (46)
7 (39)
4 (31)
3 (23)
2 (25)
5 (39)
IFN-γ (pg/ml)
469
667
656
3.133
959
1.783
mediana (mínimo e
a
a
(63 - 3.277) (54 - 6.566) (41 - 7.898) (479 - 17.297) (348 – 9.991) (690 - 8.650)
máximo)
Aumento de IL-10
10 (77)
13 (72)
4 (31)
10 (77)
8 (100)
8 (62)
n (%)
Carga proviral
(Log do número
4,94
4,63
4,6
4,54
4,73
5,02
de cópias x
(4,33 – 5,84) (3,62 – 5,59) ( 3,62 – 5,84) (1,54 - 5,53) ( 1,54 – 5,53) (1,54 – 5,59)
6
10 células) média
(mínimo e máximo)
a
Indivíduos que apresentaram inibição na produção de IFN-γ após a adição de Sm29 nas culturas de
CMSP vs Indivíduos que não apresentaram inibição na produção de IFN-γ; p<0,01, Mann-Whitney
test.
31
Tabela IV- Características dos indivíduos que apresentaram ou não inibição na
produção de TNF pela adição dos antígenos do Schistosoma spp nas culturas.
Indivíduos que apresentaram
inibição da produção de TNF
Indivíduos que não apresentaram
inibição da produção de TNF
rSm29
rShTSP2
PIII
rSm29
rShTSP2
PIII
(n=7/17)
(n=5/17)
(n=9/17)
(n= 10/17)
(n=12/17)
(n=8/17)
51
55
52
50
43
51
(23-55)
(46 – 60)
(23 – 60)
(38 – 60)
(23 – 59)
(23 – 59)
Gênero masculino
n (%)
2 (29)
0 (0)
2 (22)
4 (40)
6 (50)
4 (50)
HAM/TSP
n (%)
2 (29)
2 (40)
4 (44)
6 (60)
6 (50)
4 (50)
190
399
1.035
1.677
493
493
(41 – 518)a
(299 – 518)
Idade em anos
mediana( mínimo
máximo)
TNF (pg/ml)
mediana (mínimo
máximo)
e
e
(41 – 2.082) (280 – 2.082) a (41 - 2.082) (41 - 1.271)
Aumento de IL-10
5 (71)
3 (60)
5 (56)
n (%)
Carga proviral
4,66
5,1
4,72
(Log do número
de cópias x
(4,43 - 5,53) (4,33 - 5,84) (1,54 – 5,84)
106 células) média
(mínimo e máximo)
7 (70)
9 (75)
7 (88)
5
4,84
4,97
(1,54 - 5,84)
(1,54 – 5,59) (4,6 – 5,59)
a
Indivíduos que apresentaram inibição na produção de TNF após a adição de Sm29 nas culturas de
CMSP vs Indivíduos que não apresentaram inibição na produção de TNF; p<0,01, Mann-Whitney
test.
Para analisar o balanço entre a resposta do tipo Th1 e as citocinas regulatórias, foi
avaliada a razão entre os níveis de IFN-y/IL-10 e TNF/IL-10 nas culturas não
estimuladas e estimuladas com os antígenos de Schistosoma spp. (Figura 4 e 5,
respectivamente). Foi observado que a razão entre os níveis de IFN-y/IL-10 no total
dos indivíduos infectados pelo HTLV-1, incluídos no estudo, foi maior nas culturas de
CMSP sem antígenos de Schistosoma (razão IFN-y/IL-10, média ± DP = 116 ±
207,1) que em culturas estimuladas com os antígenos rSm29 e rShTSP-2 (72.2 ±
207,7 e 14,3 ± 25,1, respectivamente; p<0,001. Figura 4A). Não foram observadas
diferenças estatisticamente significantes na razão dos níveis de IFN-y/IL-10 quando
32
o PIII foi adicionado às culturas (75,5 ± 121,9; Figura4A). Nos indivíduos portadores
de HTLV-1 observou-se também uma mais alta razão nos níveis de IFN-y/IL-10 em
culturas não estimuladas (79,8 ± 85,6), comparadas àquelas estimuladas com
rSm29 e rShTSP-2 (0,17 ± 0,49 e 15,1 ± 20,5, respectivamente; p<0,001. Figura 4B).
A adição de PIII às culturas não alterou a razão entre IFN-y/IL-10 (69,4 ± 96,7) em
relação as culturas não estimuladas. Entretanto, em indivíduos com HAM/TSP a
razão IFN-y/IL-10 foi mais baixa em culturas estimuladas com o rSm29 (0,44 ± 0,48)
do que em culturas sem antígenos (148,3 ± 311; p=0,01, Figura 4C). Não foram
encontradas diferenças significativas na razão dos níveis de IFN-y/IL-10 na presença
de rShTSP-2 (12,7 ± 32) e PIII (87,2 ± 158,1) quando comparado as culturas não
estimuladas (148,3 ± 311; p>0,05. Figura 4C).
Com relação à razão entre os níveis de TNF/ IL-10 no total dos indivíduos infectados
pelo HTLV-1, esta foi maior nas culturas de CMSP não estimuladas (razão TNF/IL10, média ± DP = 10 ± 11) que em culturas estimuladas com o antígeno rShTSP-2 (3
± 5; p<0,001. Figura 5A). Não foram observadas diferenças estatisticamente
significantes na razão dos níveis de TNF/IL-10 quando o Sm29 e PIII foram
adicionados às culturas (7 ± 9 e 8 ± 9; p>0,05, respectivamente, Figura 5A). Nos
indivíduos portadores de HTLV-1 foi observado também uma mais alta razão nos
níveis de TNF/IL-10 em culturas não estimuladas (11 ± 11), comparadas àquelas
estimuladas com rShTSP-2 (6 ± 8; p<0,001. Figura 5B). A adição de rSm29 e PIII as
culturas não alterou a razão entre TNF/IL-10 (6 ± 8 e 2 ± 2; p>0,05, respectivamente;
Figura 5B) em relação as culturas não estimuladas. O mesmo foi observado nos
indivíduos com HAM/TSP na razão TNF/IL-10, que também foi mais alta em culturas
de CMSP não estimuladas (13 ± 11) do que em culturas estimuladas com rShTSP-2
(3 ± 4; p=0,02, Figura 5C). Não foram encontradas diferenças significativas na razão
33
dos níveis de TNF/IL-10 na presença de Sm29 (9 ± 10) e PIII (13 ± 10) quando
comparado as culturas não estimuladas (p>0,05; Figura 5C).
A
B
Portadores
Total de indivíduos
C
HAM/TSP
Figura 4- Razão entre níveis de IFΝ-γ/IL-10 no sobrenadante das culturas de
CMSP sem estímulo (W/Ag) e culturas estimuladas com os antígenos do
Schistosoma spp. no total dos indivíduos (A), nos portadores (B) e nos
indivíduos com HAM/TSP (C). *p=0,0001, **p=0,02.
34
A
B
C
Figura 5- Razão entre níveis de TNF/IL-10 no sobrenadante das culturas de
CMSP sem estímulo (W/Ag) e culturas estimuladas com os antígenos do
Schistosoma spp. no total dos indivíduos avaliados (A), nos portadores do
HTLV-1 (B) e nos indivíduos com HAM/TSP (C). **p=0,02.
2- Avaliação da produção de quimiocinas no sobrenadante de cultura de
CMSP de pacientes infectados pelo HTLV-1, na presença dos antígenos
do Schistosoma spp.
Para a análise da expressão de CXCL9 e CXCL10 foram utilizados os
sobrenadantes de culturas de CMSP de 30 indivíduos com HTLV-1, sendo 23 (77%)
35
portadores do vírus e sete (23%) com a forma HAM/TSP. A média de idade não
diferiu significativamente entre os portadores do vírus e aqueles com HAM/TSP (45,3
± 10,6 e 52,3 ± 4,4 anos, respectivamente; p>0,05). No Grupo dos indivíduos com
HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do sexo masculino (71%)
em relação aos portadores do vírus (35%; p>0,05).
Foi observado uma diminuição na produção de CXCL9, no sobrenadante das CMSP,
após a adição dos antígenos rSm29 (18.167 ± 9.727 pg/ml, p=0,044) e rShTSP-2
(16.136 ± 9.233, p=0,031) em relação as células não estimuladas (19.745 ± 9.729),
no total dos indivíduos analisados (Figura 6A). A adição do PIII não alterou a
produção desta quimiocina (19.298 ± 10.048, p>0,05).
No grupo dos indivíduos
portadores do vírus a adição do rShTSP-2 resultou em diminuiu da produção desta
quimiocina (13.977 ± 8.857, p=0,026) (Figura 6B), o que não foi observado após a
adição do rSm29 (17.537 ± 10.520, p>0,05) e do PIII (18.177 ± 10.926, p>0,05) em
relação as células não estimuladas (18.121 ± 10.508).
No grupo dos indivíduos com HAM/TSP a adição do rSm29 diminuiu a produção de
CXCL9 (20.237 ± 6.023, p=0,028) no total dos indivíduos (Figura 6C), em relação as
células não estimuladas (25.078 ± 2.392), a adição dos antígenos rShTSP-2 (23.230
± 6.477, p>0,05) e PIII (22.982 ± 4.771, p>0,05) não alterou a produção desta
quimiocina.
36
A
*
**
B
***
C
****
Figura 6 - Produção de CXCL9 pelas CMSP de indivíduos com HTLV-1, antes e
após a adição de antígenos de Schistosoma spp, no total dos indivíduos
analisados (A), nos portadores do vírus (B) e naqueles com HAM/TSP (C).
*p=0,031, **p=0,044, ***p=0,026, ****p=0,028.
Com relação à produção de CXCL10 observou-se que não houve alteração nos
níveis desta quimiocina pela presença dos antígenos do Schistosoma spp. nas
culturas de células (rSm29 = 872 ± 650; rShTSP-2 = 760 ± 563; PIII = 815 ± 632;
p>0.05 respectivamente) em relação as células não estimuladas (733 ± 610), no total
dos indivíduos analisados (Figura 7A), no grupo dos portadores (rSm29 = 876 ± 658;
rShTSP-2 = 760 ± 569; PIII = 702 ± 640; p>0.05 respectivamente; sem estímulo =
689 ± 619) (Figura 7B) e no grupo com HAM/TSP (rSm29 = 890 ± 662; rShTSP-2 =
37
683 ± 543; PIII = 1.104 ± 501; p>0.05 respectivamente; sem estímulo = 824 ± 598)
(Figura 7C).
A
B
C
Figura 7 - Produção de CXCL10, pelas CMSP de indivíduos com HTLV-1, antes
e após a adição de antígenos de Schistosoma spp, no total dos indivíduos
analisados (A), nos portadores do vírus (B) e naqueles com HAM/TSP (C).
3- Células TCD4+ e TCD8+ regulatórias, na infecção pelo HTLV-1, em
resposta aos antígenos do Schistosoma spp.
38
Foram incluídos no estudo de expressão de células T regulatórias CD4+ e CD8+
dezoito pacientes com HTLV-1 sendo, onze portadores do vírus (61%) e sete (39%)
com a forma HAM/TSP. A média de idade não diferiu entre os portadores do vírus e
aqueles com HAM/TSP (44 ± 11 e 50 ± 7 anos, respectivamente; p>0,05). No grupo
dos indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do
sexo masculino (43% x 27%; p<0,05).
A estratégia para a avaliação da frequência da população de células TCD4+ e TCD8
expressando as moléculas CD25, é mostrado na figura 8.
Figura 8- Estratégia para seleção da população de linfócitos TCD3+TCD4+ e
TCD3+TCD8+ da expressando a molécula CD25.
Foi analisada a frequência de células TCD4+ expressando as moléculas CD25,
CTLA-4 e Foxp3, na presença e ausência dos antígenos do Schistosoma. Observouse uma diminuição da frequência de células CD4+CD25- após a adição do rSm29 às
39
culturas de CMSP dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 (91,7%) em relação as
células não estimuladas (93%; p=0,02) no total de indivíduos analisados, não
havendo diferenças após a adição do rShTSP-2 e PIII (92,8% e 93,3%,
respectivamente); Tabela V.
Tabela V- Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD4+CD25- de indivíduos infectados pelo HTLV-1
Células
TCD4+ CD25CD4+CD25-
CD4+CD25-CTLA4+
CD4+CD25-Foxp3+
ns= Não significativo
Indivíduos
HTLV-1
Total
com N
18
Portadores
11
HAM/TSP
07
Total
18
Portadores
11
HAM/TSP
07
Total
18
Portadores
11
HAM/TSP
07
Antígenos
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Média %
93,3
91,7
92,8
93,3
92,4
90,1
92,0
92,7
96,3
95,4
95,7
96,1
0,451
0,718
0,654
0,703
0,443
0,775
0,654
0,803
0,463
0,628
0,654
0,546
0,414
0,660
0,556
0,741
0,480
0,905
0,756
0,889
0,309
0,274
0,241
0,509
Valor de
p
0,020
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
0,001
0,018
0,022
0,006
0,05
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
40
Quando se dividiu os indivíduos em dois grupos (grupo de indivíduos portadores do
HTLV-1 e grupo de indivíduos com HAM/TSP), foi observado que no grupo de
indivíduos portadores do vírus a adição dos antígenos rSm29, rShTSP-2 e PIII às
culturas de células não alterou a frequência de células CD4 +CD25- (90,1%, 92% e
92,7, respectivamente), não diferindo em relação as culturas não estimuladas
(92,4%); Tabela V. O mesmo foi observado em relação a frequência de células
CD4+CD25- no grupo dos indivíduos com HAM/TSP nas culturas não estimuladas
(96,3%), em relação as culturas estimuladas com os antígenos de Schistosoma;
rSm29 (95,4%), rShTSP-2 (95,7%) e PIII (96,1%); Tabela V.
Analisando a frequência das células CD4+CD25-, expressando CTLA4+ foi verificado
que os três antígenos foram capazes de aumentar a frequência destas células
(rSm29= 0,718% - p=0,001; rShTSP-2 = 0,654% - p=0,018; PIII = 0,703% - p=0,022)
em relação as células não estimuladas (0,451%); Tabela V. No grupo dos indivíduos
portadores, o rSm29 (0,775% - p=0,006) e o rShTSP-2 (0,654% - p=0,05) quando
adicionados as culturas de células, aumentaram a frequência das mesmas em
relação as culturas não estimuladas (0,443%); Tabela V. A adição do PIII não alterou
a frequência destas células no grupo dos portadores do HTLV-1 (0,803%). No grupo
dos indivíduos com HAM/TSP não houve alteração na frequência de CD4+CD25CTLA4+ após a adição dos três antígenos analisados (rSm29 = 0,628%, rShTSP-2 =
0,654% e PIII = 0,546%; p<0,05, respectivamente) em relação as culturas não
estimuladas (0,463%); Tabela V.
Em relação a frequência das células CD4+CD25-, expressando Foxp3+, os três
antígenos analisados não foram capazes de causar alteração na frequência destas
células (rSm29 = 0,660%, rShTSP-2 = 0,556% e PIII = 0,741%, p<0,05
respectivamente) em relação as culturas não estimuladas (0,414%); Tabela V. O
41
mesmo foi observado para o grupo dos indivíduos portadores do vírus (rSm29 =
0,905%, rShTSP-2 = 0,756%, PIII = 0,889%; p<0,05 respectivamente; sem estímulo
= 0,480%) e para o grupo dos indivíduos com HAM/TSP (rSm29 = 0,274%, rShTSP2 = 0,241%, PIII = 0,509%, p<0,05 respectivamente; sem estímulo = 0,309%);
Tabela V.
Com relação a frequência de células CD4+CD25Low, não foi observada alteração na
frequência destas células após a adição dos antígenos de Schistosoma às culturaas
de células do total de indivíduos (rSm29 = 5,80%, rShTSP-2 = 5,89% e PIII = 5,21%,
p>0,05 respectivamente), nos indivíduos portadores (rSm29 = 4,79%, rShTSP-2 =
4,30% e PIII = 4,34%, p>0,05, respectivamente) e nos indivíduos com HAM/TSP
(rSm29 = 7,40%, rShTSP-2 = 8,38% e PIII = 6,59%, p>0,05, respectivamente) em
relação as células não estimuladas (5,01%, 4,28%, 6,16, respectivamente); Tabela
VI.
As células CD4+CD25Low expressando CTLA-4+ mostraram um aumento da sua
frequência após a adição dos antígenos rSm29 (5,59%, p= 0,006) e PIII (5,84%,
p=0,035) em relação as células não estimuladas (4,58%) no total de indivíduos
analisados. A adição do rShTSP-2 não resultou em diferenças (5,29%, p>0,05). Os
antígenos analisados não alteraram a frequência destas células nos indivíduos
portadores (rSm29 = 4,78%, rShTSP-2 = 4,59% e PIII = 4,93%, p>0,05
respectivamente, 3,84% sem antígenos). Nos indivíduos com HAM/TSP, o rSm29 e
o PIII foram capazes de aumentar a frequências das células CD4+CD25LowCTLA-4+
(4,92%, p=0,018; 7,18, p=0,018, respectivamente) em relação as células não
estimuladas (5,74%), sendo que o rShTSP-2 não levou a nenhuma diferença
(6,39%, p>0,05); Tabela VI.
42
Os antígenos rSm29, rShTSP-2 e PIII foram capazes de aumentar a frequência das
células CD4+CD25Low, expressando Foxp3+, no total de indivíduos (4,92%, p=0,05;
6,00%, p=0,003, 5,63%, p=0,006, respectivamente) e no grupo dos portadores de
HTLV-1 (6,50%, p=0,033; 7,08%, p=0,021; 6,48%, p=0,033, respectivamente) em
relação as células não estimuladas (3,09%, 3,48%, respectivamente). Já no grupo
dos indivíduos com HAM/TSP, somente o rShTSP-2 e o PIII foram capazes de
aumentar
a
frequência
destas
células
(4,31%,
p=0,018;
4,29,
p=0,021,
respectivamente). O rSm29 não foi capaz de alterar a frequência destas células
(2.43%, p>0.05), em relação as células não estimuladas (2,47%); Tabela VI.
43
Tabela VI - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD4+CD25Low de indivíduos infectados pelo HTLV-1.
Células T CD4+CD25Low
CD4+CD25Low-
Indivíduos
com HTLV-1
Total
Portadores
HAM/TSP
CD4+CD25Low CTLA-4+
Total
Portadores
HAM/TSP
CD4+CD25Low Foxp3+
Total
Portadores
HAM/TSP
N
Antígenos
18 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
11 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
07 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
18 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
11 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
07 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
18 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
11 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
07 Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Média
%
5,01
5,80
5,89
5,21
4,28
4,79
4,30
4,34
6,16
7,40
8,38
6,59
4,58
5,59
5,29
5,84
3,84
4,78
4,59
4,93
5,74
6,86
6,39
7,28
3,09
4,92
6,00
5,63
3,48
6,50
7,08
6,48
2,47
2,43
4,31
4,29
Valor de
p
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
0,006
ns
0,035
ns
ns
ns
0,018
ns
0,018
0,05
0,003
0,006
0,033
0,021
0,033
ns
0,018
0,021
ns=não significativo
No que diz respeito as células CD4+CD25High (Figura 9), os três antígenos
analisados foram eficientes para aumentar a frequência, tanto no total dos indivíduos
44
analisados (rSm29 = 0,712%, p=0,002; rShTSP-2 = 0,767%, p=0.00027; PIII =
0,883%, p=0,002; respectivamente), quanto no grupo dos portadores (rSm29 =
0,792%,
p=0,18;
rShTSP-2
=
0,884%,
p=0,004;
PIII
0,797%,
p=0,021;
respectivamente) e no grupo de HAM/TSP (rSm29 = 0,586, p=0,042; rShTSP-2 =
0,584%, p=0,017; PIII = 1,02%, p=0,043; respectivamente) em relação as células
não estimuladas (0,443%, 0,512%, 0,335: respectivamente); Figura 9.
A
*
**
*
C
B
***
****
***
*****
***
*****
Figura 9- Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD4+CD25High de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores (B)
e com HAM/TSP (C).*p=0,002, **p=0,00027, ***p=0,02, ****p=0,004, *****p=0,04.
45
Com relação as células CD4+CD25High expressando CTLA-4+ (Figura 10), o rSm29
aumentou sua frequência no total dos indivíduos analisados e no grupo com
HAM/TSP (25%, p=0,039; 30%, p=0,042, respectivamente), em relação as células
não estimuladas (21%; 24%) Já no grupo dos indivíduos portadores do vírus, a
presença do rSm29 não alterou esta população de células (22%, p>0,05 e sem
estímulo = 19%). A adição ds antígenos rShTSP-2 e PIII não resultou em alteração
da frequência das células CD4+CD25High quando adicionados as culturas, no total de
indivíduos (rShTSP-2 = 24; PIII = 27%; não estimuladas = 21%, p>0,05,
respectivamente), no grupo de portadores (rShTSP-2 = 20%; PIII = 24%; não
estimuladas = 19%; p>0,05, respectivamente) e de HAM/TSP (rShTSP-2 = 30%; PIII
= 33%; não estimuladas = 24%; p>0,05, respectivamente); Figura 10.
46
A
*
C
B
*
Figura 10 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD4+CD25HighCTLA4+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A),
portadores do HTLV-1 (B) e aqueles com HAM/TSP (C).*p=0,04.
A adição dos três antígenos utilizados neste estudo levou ao aumento da frequência
das células CD4+CD25High expressando Foxp3+ (Figura 11) no total de indivíduos
(rSm29 = 18%, p=0,004; rShTSP-2 = 24%, p=0,0004; PIII = 26%, p=0,012; sem
estímulo = 13%, respectivamente) e nos portadores (rSm29 = 23%, p=0,005;
rShTSP-2 = 30%, p=0,003; PIII = 29%, p=0,047; sem estímulo = 17%,
respectivamente). No grupo dos indivíduos com HAM/TSP, somente o rShTSP-2 foi
capaz de aumentar a frequência das células CD4 +CD25HighFoxp3+ (15%, p=0,046).
47
O rSm29 e o PIII não alteraram a frequência destas células (11%, 20%, p>0,05,
respectivamente); Figura 11.
A
*
**
***
C
B
****
*****
******
******
Figura 11 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD4+CD25High Foxp3+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A),
portadores
do
vírus
(B)
e
pacientes
com
HAM/TSP
(C).*p=0,004,**p=0,0004,***p=0,01, ****p=0,005,*****p=0,003, ******p=0,046.
Analisando o efeito da adição dos antígenos de Schistosoma sobre o perfil das
células TCD8+ (Tabela VII) foi observado que não houve alteração da frequência das
células CD8+CD25- no total de indivíduos (rSm29 = 95,7%; rShTSP-2 = 95,7%; PIII =
95.9%, p>0,05, em relação as células não estimuladas = 95.2%, respectivamente),
48
nos grupos dos portadores (rSm29 = 95%; rShTSP-2 = 95.2%; PIII = 95.2%, p>0,05,
em relação as células não estimuladas = 94.6%, respectivamente) e com HAM/TSP
(rSm29 = 96.7%; rShTSP-2 = 96.6; PIII = 97%, p>0,05, em relação as células não
estimuladas = 96,1%, respectivamente). Com relação às células CD8+CD25expressando Foxp3+ foi observado um aumento na sua frequência após a adição de
rSm29
e
rShTSP-2
nas
culturas
(3,27%,
p=
0,031;
2,77%,
p=
0,025,
respectivamente) em relação as células não estimuladas (0,819%), no total de
indivíduos, embora o PIII não tenha aumentado a frequência destas células (1,47%,
p>0,05). No grupo dos portadores do HTLV-1 (rSm29 = 3,41%; rShTSP-2 = 2,53%;
PIII = 1,57%, p>0,05 respectivamente; não estimuladas = 0,682%) e dos indivíduos
com HAM/TSP não houve alteração na frequência das células CD8+CD25-Foxp3+
quando os antígenos foram adicionados às cultura (rSm29 = 3,05%; rShTSP-2 =
2,61%; PIII = 1,31%, p>0,05 respectivamente; não estimuladas = 1,03%); Tabela VII.
49
Tabela VII - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD8+CD25- de indivíduos infectados pelo HTLV-1
Células T CD8+CD25CD8+CD25--
CD8+CD25-Foxp3+
Indivíduos
com HTLV1
Total
N
Antígenos
18
Portadores
11
HAM/TSP
07
Total
18
Portadores
11
HAM/TSP
07
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Média %
Valor de
p
95,2
95,7
95,7
95,9
94,6
95
95,2
95,2
96,1
96,7
96,6
97
0,819
3,27
2,57
1,47
0,682
3,41
2,53
1,57
1,03
3,05
2,61
1,31
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
0,031
0,025
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns=não significativo
As células CD8+CD25Low (Tabela VIII) não alteraram sua frequência quando os três
antígenos de Schistosoma foram adicionados as culturas tanto no total de indivíduos
analisados (rSm29 = 3,19%; rShTSP-2 = 3,31%; PIII = 3,22%, p>0,05
respectivamente), quanto nos grupos de portadores (rSm29 = 4,01%; rShTSP-2 =
3,66%; PIII = 3,93%, p>0,05 respectivamente) e com HAM/TSP (rSm29 = 2,01%;
rShTSP-2 = 2,77%; PIII = 2,20%, p>0,05 respectivamente) em relação as culturas
não
estimuladas (3,82%,
4,12%,
3,35%,
respectivamente).
Já
as células
CD8+CD25Low, expressando Foxp3+ (Tabela VIII), tiveram sua frequência aumentada na
50
presença de rSm29 no total dos indivíduos incluídos no estudo (15,6%, p=0,007; em
relação as células não estimuladas = 7,62%) e no grupo dos portadores (13,9%,
p=0,011, em relação as células não estimuladas 5,36), mas, não alterou no grupo
com HAM/TSP (18,1%, p>0,05; sem estímulo = 11,2%). O rShTSP-2 aumentou a
frequência no total de indivíduos (12,9%, p=0,004), mas não alterou nos grupos do
portadores (9,38%, p>0,05) e com HAM/TSP (18,4%, p>0,05). O antígeno PIII não
alterou a frequência destas células em nenhum dos grupos acima (14,4%, 13,8%,
15,4, respectivamente). Tabela VIII.
Tabela VIII - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD8+CD25Low, de indivíduos infectados pelo HTLV-1
Células T CD8+CD25Low Indivíduos N
com HTLV1
+
Low
CD8 CD25
Total
18
CD8+CD25Low Foxp3+
ns=não significativo
Portadores
11
HAM/TSP
07
Total
18
Portadores
11
HAM/TSP
07
Antígenos
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Sem antígenos
rSm29
rShTsp2
PIII
Média %
3,82
3,19
3,31
3,22
4,12
4,01
3,66
3,93
3,35
2,01
2,77
2,20
7,62
15,6
12,9
14,4
5,36
13,9
9,38
13,8
11,2
18,1
18,4
15,4
Valor
de p
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
0,007
0,004
ns
0,011
ns
ns
ns
ns
ns
51
Para a população de células CD8+CD25High (Figura 12), os antígenos rSm29 e
rShTSP-2 foram eficientes em aumentar a sua frequência (0,655%, p= 0,031;
0,759%, p=0,018, respectivamente), em relação as células não estimuladas
(0,505%) no total dos indivíduos analisados, mas, estes antígenos não alteraram a
frequência destas células nos indivíduos portadores do HTLV-1 (0,777%, 0,834%,
p>0,05 respectivamente e sem estímulo = 0,640%) e nos indivíduos com HAM/TSP
(0,482%, 0,643%, p>0,05, respectivamente e sem estímulo = 0,293%). A presença
do PIII não levou a alteração da frequência destas células, em nenhum dos grupos
analisados (total de indivíduos 0,686%, p>0,05, portadores 0,800%, p>0,05 e com
HAM/TSP 0,524%, p>0,05); Figura 12.
A
*
**
B
C
***
52
Figura 12 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD8+CD25High de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores (B)
e pacientes com HAM/TSP (C).*p=0,018, **p=0,031, ***p=0,043.
No que se refere as células CD8+CD25High expressando Foxp3+ (Figura 13), foi
observado que os três antígenos foram eficientes em aumentar a frequência destas
células, no total de indivíduos analisados (rSm29 = 31%, p=0,011; rShTSP-2 = 32%,
p=0,026; PIII = 33%, p=0,026) em relação as células não estimuladas (21%).
Entretanto, nos indivíduos portadores, somente o rSm29 foi capaz de aumentar a
frequência destas células (30%, p=0,046, sem estímulo = 21%). Os outros antígenos
não mostraram diferença em relação as culturas não estimuladas (rShTSP-2 = 31%;
PIII = 35%, p>0,05, respectivamente). Nos indivíduos com HAM/TSP, somente o PIII
foi capaz de aumentar a frequências das células CD8 +CD25HighFoxp3+ (31%,
p=0,043 em relação as células não estimuladas 22%). Os outros antígenos não
induziram diferença (rSm29 = 31; rShTSP-2 34%, p=0,05 respectivamente); Figura
13.
53
A
*
*
**
C
B
***
****
Figura 13 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de
células CD8+CD25HighFoxp3+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A),
portadores (B) e pacientes com HAM/TSP (C). *p=0,026, **p=0,011, ***p=0,046,
****p=0,043.
4- Produção de IL-10 por CMSP em indivíduos infectados pelo HTLV-1 na
presença de antígenos do Schistosoma spp.
Foi analisada a fonte produtora de IL-10 nos pacientes com HTLV-1 em 12
indivíduos, sendo oito (67%) portadores do vírus e quatro (33%) com a forma
HAM/TSP. A média de idade diferiu significativamente entre os portadores do vírus e
aqueles com HAM/TSP (45 ± 8,6 e 56 ± 3,1 anos, respectivamente; p=0,017). No
54
Grupo dos indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos
do sexo masculino (75%) em relação aos portadores do vírus (25%), p<0,05.
A frequência de células expressando IL-1 foi avaliada e observou-se uma maior
frequência de monócitos expressando IL-10 (20,7 ± 24,9), quando comparados aos
Linfócitos TCD4+ (5,4 ± 6,5), TCD8+ (9,5 ± 19,4) e B (6,7 ± 11,8), no total dos
indivíduos, p<0.05 (Figura 14A). Analisando os indivíduos portadores (Figura 14B),
foi observada, também, uma maior frequência de monócitos expressando IL-10 (21,7
± 24,7) em relação as TCD4+ (6,3 ± 7,5), TCD8+ (4,9 ± 8,6), p<0.05, entretanto, não
foi observada diferença em relação aos linfócitos B (8,1 ± 14,1; p>0.05).
No grupo dos indivíduos com HAM/TSP não foi observada alterações de frequência
celular expressando IL-10 (Figura 14C) (monócitos = 19 ± 25,1; CD4+ = 3,6 ± 3;
CD8+ = 18,8 ± 29,2; linfócitos B = 4,1 ± 3, p>0.05), apesar de se observar uma
tendência para uma maior frequência das células CD8+ e monócitos expressando IL10.
55
*
*
**
***
****
Figura 14 - Frequência de células CD4+, CD8+, Monócitos e Linfócitos B
expressando IL-10, de indivíduos infectados pelo HTLV- 1, no total dos
indivíduos analisados (A), nos portadores do vírus (B) e nos pacientes com
HAM/TSP (C).*p=0,019, **p=0,05, ***p=0,036, ****p=0,012.
Ao analisar se os antígenos de Schistosoma spp são capazes de aumentar a
frequência de células expressando IL-10 foi observado que, nas células TCD4 + os
antígenos rSm29 e rShTSP-2 aumentaram a frequência destas células expressando
IL-10 (Figura 15A) (7,3%, p=0.034; 7,5%, p=0.023; respectivamente), em relação as
56
células sem estímulo (5,4%), no total dos indivíduos analisados, sendo que a adição
do PIII não mostrou diferença (6,5%). No grupo dos indivíduos portadores do vírus, o
rSm29 aumentou a frequência das células TCD4 + expressando IL-10 (8,9%; p=0,05)
em relação as células não estimuladas (6,3%) (Figura 15B). Já os antígenos
rShTSP-2 e PIII não mostraram diferença (8,3%; 7,8%, respectivamente, p>0,05).
No grupo da HAM/TSP os três antígenos analisados não alteraram a frequência de
TCD4+, expressando IL-10, (Figura 15C) (4,2%; 6%; 4%; respectivamente, p>0,05)
em relação às células não estimuladas (3,6%).
*
**
***
Figura 15 - Frequência de células CD4+ expressando IL-10, nos indivíduos
infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma spp.
No total dos indivíduos (A), no grupo dos portadores (B) e naqueles com
HAM/TSP (C). *p=0,023, **p= 0,034, ***p=0,05.
Avaliando a adição dos antígenos sobre a frequência das células TCD8+
expressando IL-10 foi observado que o rShTSP-2 e PIII foram eficiente em aumentar
essa frequência (Figura 16A) (13,1%, p=0,034; 10,9%, p=0,034, respectivamente),
em relação as células não estimuladas (9,5%), no total dos indivíduos analisados. A
adição do rSm29 não mostrou diferença em relação as células não estimuladas
(13,9, p>0,05). No grupo dos indivíduos portadores (Figura 16B) a adição do PIII
57
aumentou a frequência das células TCD8+ expressando IL-10 (6,9%, p=0,017), em
relação as células não estimuladas (4,9%). O rSm29 e o rShTSP-2 não alteraram a
frequência destas células (10,9%; 9,1%; respectivamente, p>0.05). No grupo dos
indivíduos com HAM/TSP (Figura 16C) nenhum dos três antígenos aumentou a
frequência destas células (rSm29 = 19,9%; rShTSP-2 = 21%; PIII = 18,9%; p>0,05
respectivamente) em relação as células não estimuladas (18,8%).
*
*
**
Figura 16 - Frequência de células CD8+ expressando IL-10, nos indivíduos
infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma
spp, no total dos indivíduos analisados (A), no grupo dos portadores do vírus
(B) e naqueles com HAM/TSP (C). *p=0,034, **p=0,017.
Os antígenos analisados não alteraram a frequência dos linfócitos B expressando IL10 (rSm29 = 6%; rShTSP-2 = 10%; PIII = 5%; respectivamente, p>0,05) em relação
as células não estimuladas (7%), no total dos indivíduos analisados; (Figura 17A) . O
mesmo foi observado no grupo dos indivíduos portadores (Figura 17B) (rSm29 =
5,3%; rShTSP-2 = 10,8%; PIII = 4,9%; respectivamente, p>0,05; sem estímulo =
8,05%) e no grupo com HAM/TSP (Figura 17C) (rSm29 = 7,4%; rShTSP-2 = 7,6%;
PIII = 4,3%; respectivamente, p>0,05; sem estímulo = 4,1%).
58
B
Figura 17- Frequência de Linfócitos B expressando IL-10, nos indivíduos
infectados pelo HTLV- 1. Antes e após a adição dos antígenos do Schistosoma
spp, no total dos indivíduos analisados (A), no grupo dos portadores do vírus
(B) e no grupo com HAM/TSP (C).
A adição do rSm29 aumentou a frequência de monócitos expressando IL-10 (Figura
18A) (20,1%, p=0,05) em relação as células não estimuladas (19,8%), no total dos
indivíduos analisados. O rShTSP-2 e o PIII não alterou a frequência destas células
(25,2%, 22,2%; respectivamente, p>0,05). No grupo dos indivíduos portadores
(Figura 18B) os três antígenos não foram capazes de aumentar essa frequência
(25,5%; 24,8%, 25,2%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não
estimuladas (21,7%). No grupo dos indivíduos com HAM/TSP (Figura 18C) os
antígenos não aumentaram a frequência destas células (rSm29 = 30,8%; 30,03%;
20%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não estimuladas (18,9%).
59
*
Figura 18- Frequência de Monócitos expressando IL-10, nos indivíduos
infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma
spp, no total dos indivíduos (A), nos portadores do vírus (B) e no grupo com
HAM/TSP (C). *p=0,05.
60
DISCUSSÃO
Neste estudo nós avaliamos se antígenos do Schistosoma spp são capazes de
alterar in vitro a produção de citocinas e o perfil nas células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de indivíduos infectados pelo HTLV-1.
A forte resposta imune que ocorre na infecção pelo HTLV-1 explica o fato de alguns
indivíduos infectados desenvolvem sérias complicações, enquanto aqueles que
permanecem assintomáticos durante boa parte de suas vidas e, a produção de
citocinas nestes indivíduos é variável. Estudos tem mostrado que indivíduos
infectados pelo HTLV-1 têm altos níveis de produção das citocinas IFN-γ e TNF,
mesmo sem adição de estímulo In vitro às culturas de CMSP, quando comparadas
às culturas de células de doadores de sangue soro negativos para HTLV-1 (Santos,
S. B. et al., 2004; Carvalho, E. M. et al., 2001).
Concentrações elevadas de citocinas pró-inflamatórias, ou que induzem a
proliferação de linfócitos, a exemplo da IL-2, TNF, IFN-γ, e IL-15, entre outras e,
expressão do receptor de IL-2, têm sido relatadas tanto em pacientes com
HAM/TSP, quanto em indivíduos assintomáticos (Azimi, M. et al., 1999; Carvalho, E.
M. et al., 2001; Nishiura, Y. et al., 1996). Existem, entretanto, evidências de que uma
resposta imune exagerada participa da imunopatogênese da HAM/TSP, com a
documentação de que em relação aos portadores da infecção, pacientes com
HAM/TSP produzem níveis mais elevados de TNF e IFN-γ, além de IL-6 e IL-2
detectadas no soro e no líquor (Nagai, M. et al., 2001; Lima, M. A. et al., 2005; Ohbo,
K. et al., 1991; Andrada-Serpa, M. J. et al., 1996; Nishimoto, N. et al., 1990). Eles
também apresentam um maior número de células T CD4 + e T CD8+ expressando
estas citocinas (Lima, M. A. et al., 2005). Adicionalmente existe uma diminuição da
61
capacidade regulatória da resposta imune exacerbada, por IL-10 e TGF-β nestes
pacientes (Lima, M. A. et al., 2005).
Ainda não existem tratamentos satisfatórios ou uma forma de prevenir o
desenvolvimento da doença nos indivíduos infectados pelo HTLV-1 e a resposta
imune exacerbada é à base desta patologia (Castro, N. M. et al., 2006). Estratégias
capazes de reduzir a resposta imune inflamatória do tipo Th1 se fazem necessárias.
Um estudo prévio conduzido pelo Serviço de Imunologia da Universidade Federal da
Bahia mostrou que em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e coinfectados com S.
mansoni os níveis de IFN-y no sobrenadante de culturas de CMSP não estimuladas
foram mais baixos do que em indivíduos com HTLV-1 não co-infectados (Porto, A. F.
et al., 2005).
Foi também demonstrado previamente, que os antígenos do Schistosoma mansoni,
Sm29 e PIII são capazes de induzir a produção de IL-10 pelas CMSP de indivíduos
infectados pelo S. mansoni (Cardoso, L. S. et al., 2006; Cardoso, L. S. et al., 2011) e
que eles suprimem a resposta inflamatória do tipo Th2 em um modelo experimental
de asma alérgica (Cardoso, L. S. et al., 2010).
Os antígenos Sm29, ShTSP-2 e PIII foram testados neste estudo para verificar a
capacidade de induzir a produção de IL-10 e suprimir a resposta do tipo Th1 in vitro
pelas CMSP de indivíduos infectados pelo HTLV-1.
Nós observamos que a adição do rShTSP-2 nas culturas de células resultou na
redução dos níveis de IFN-y e TNF. Os três antígenos utilizados, foram capazes de
diminuir a produção destas citocinas em uma significativa proporção de indivíduos
avaliados. Além disso, o modulação negativa da produção de IFN-y por Sm29 e
ShTSP-2 foi seguida por um aumento da produção de IL-10 na maioria dos
indivíduos e, este aumento na produção de IL-10 alcançou mais de 300%. A redução
62
da produção de IFN-y pelo uso do rSm29 e do PIII nas culturas de CMSP e o
aumento dos níveis de IL-10 pelo uso de rSm29 também foi vista em pacientes com
Leishmaniose cutânea, uma doença cuja patologia também está associada com uma
forte resposta imune do tipo Th1 (Báfica, A. M. B. et al., 2011).
Avaliando possíveis características dos indivíduos associadas com a habilidade
destes antígenos em modular negativamente a produção de IFN-y, nós observamos
que indivíduos que apresentaram inibição na produção destas citocinas pela
presença de rSm29 nas culturas foram aqueles que tiveram menores níveis basais
de IFN-y, quando comparados à aqueles que não apresentaram inibição na
produção de IFN-y. Inesperadamente, não observamos nenhuma outra diferença
clínica, imunológica ou de carga viral entre os grupos de indivíduos que tiveram
redução nos níveis de IFN-y e aqueles que não tiveram.
Em pacientes com
Leishmaniose cutânea (Báfica, A. M. B. et al., 2011), a adição de rSm29 e PIII as
culturas de células estimuladas com o antígeno solúvel de Leishmania (SLA)
resultou em uma redução da produção de IFN-y e TNF independentemente das
concentrações basais desta citocina e da apresentação clínica dos pacientes..
A relação entre a infecção pelo HTLV-1 e S. mansoni não está bem estudada e
existem dados controversos. Por exemplo, a frequência de infecção pelo S. mansoni
em indivíduos com HTLV-1 de um banco de doadores de sangue é maior que em
indivíduos negativos do mesmo banco de sangue. Entretanto, a frequência de
indivíduos com HAM/TSP, nesta mesma casuística, foi menor em indivíduos
infectados pelo S. mansoni, comparados com aqueles não infectados (Porto, A. F. et
al., 2005).
Nós mostramos que os antígenos rSm29 e rShTSP-2 usados neste estudo foram
capazes de induzir in vitro a produção de IL-10 e este resultado está de acordo com
63
outros estudos, mostrando que o antígeno rSm29 induziu maior produção de IL-10
pelas CMSP de indivíduos infectados com S. mansoni do que nos indivíduos não
infectados (Cardoso, L. S. et al., 2006).
A IL-10 tem um importante papel na manutenção do estado de portador nos
indivíduos infectados pelo HTLV-1, balanceando a produção de IFN-γ, uma
importante citocina pro-inflamatória (Britto-Melo, G. E. P. et al., 2007). Recentemente
foi descrito uma incapacidade de IL-10 recombinante humana em modular
negativamente a produção de IFN-γ in vitro em indivíduos com HAM/TSP (Santos, S.
B. et al., 2006). A baixa razão entre IFN-γ/IL-10 por alguns antígenos de
Schistosoma spp neste estudo sustenta a hipótese de que estes antígenos podem
ser utilizados para prevenir patologias em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (Lima,
L. M. et al., 2013).
As quimiocinas também participam do processo inflamatório na infecção pelo HTLV1. Já foi demonstrado, por exemplo, que a quimiocina CXCL9, juntamente com a
CXCL10, reconhecida como importante no recrutamento de células Th1, estavam
aumentadas no soro de pacientes com HAM/TSP, quando comparado com os
portadores assintomáticos do HTLV-I ou com controles saudáveis. O dado sugere
que a presença destas moléculas pode levar a um aumento no recrutamento de
moléculas pró-inflamatórias para o tecido medular, contribuindo para o dano
associado ao desenvolvimento da HAM/TSP (Guerreiro, J. B. et al., 2006; Shevach,
E. M. 2002). Neste estudo observamos que a adição dos antígenos rSm29 e
rShTSP-2 as culturas de células resultou em diminuição da produção de CXCL-9 no
sobrenadantes das CMSP, em relação as células não estimuladas, nos indivíduos
com HTLV-1, tanto no total dos indivíduos analisados, quanto nos portadores e nos
indivíduos com HAM/TSP.
64
Estes resultados mostram que os antígenos de Schistosoma spp usados neste
estudo são capazes de modular negativamente a resposta imune exacerbada do tipo
Th1 in vitro em uma alta porcentagem de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Esta
modulação negativa pode ser explicada pelo aumento da produção de IL-10.
Existe ainda a possibilidade de existir outros mecanismos induzidos pelos antígenos
de Schistosoma spp que podem estar envolvidas na modulação negativa da
resposta imune do tipo Th1 na infecção pelo HTLV-1. Estudos mostram, em um
modelo de asma induzida pela ovoalbumina, que antígenos de S. mansoni induzem
a expansão da população de células regulatórias T CD4+CD25+Foxp3+ (Pacífico, L.
G. et al., 2009; Porto, A. F. et al., 2005).
Em outra etapa deste estudo avaliamos a capacidade dos antígenos de
Schistosoma spp em aumentar a frequência das células TCD4 + e TCD8+ com perfil
modulatório.
As células TCD4+ participam da manutenção da tolerância imunológica por suprimir
a expansão e ativação de linfócitos reativos que podem causar doenças autoimunes
(Sakaguchi, S. et al., 2001; Shevach, E. M. 2002). As Células TCD4+ com perfil
regulatório incluem aquelas que expressam a molécula CTLA-4 (cytotoxic T
limphocyte-associated antigen 4) (Shimizu, J. et al., 2002; McRugh, R. S. et al.,
2002; Read, S. et al., 2000; Salomon, B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000). As
células que expressam esta molécula podem ter um papel modulatório nas doenças
inflamatórias, a exemplo da infecção pelo HTLV-1.
O Foxp3 (forkhead transcription factor) também é requerido para o desenvolvimento
e função das células T regulatórias (Hori, S. et al., 2003; Khattri, R. et al., 2003;
Fontenot, J. D. et al., 2003). O aumento da expressão desta molécula em células
com perfil modulatório poderá diminuir a linfoproliferação espontânea de células
65
TCD4 e manifestações clínicas associadas com doenças autoimunes, caracterizada
por infiltrado linfocítico em múltiplos órgãos e grande produção de citocinas
proinflamatórias observadas em indivíduos com HAM/TSP (Yamano, Y. et al., 2005).
Já se sabe que pacientes com HAM/TSP apresentam características imunológicas
semelhantes a camundongos mutantes para Foxp3 e deficientes para CTLA-4,
incluindo linfoproliferação espontâneas de células TCD4 + e manifestações clínicas
associadas com doenças autoimunes, caracterizada por infiltrado linfocítico em
múltiplos órgãos e grande produção de citocinas proinflamatórias (Yamano, Y. et al.,
2005).
Os três antígenos analisados aumentaram a população destas células expressando
CTLA-4 no total dos indivíduos do estudo, o rSm29 e o rShTSP-2 nos portadores.
A expressão da molécula CD25 nas células T podem conferir diferentes
propriedades a estas células, dependendo da intensidade da expressão. As células
expressando CD25 constituem 1-2% da população de CD4+ periférica. As
CD4+CD25Low representam células T ativadas (Beacher-Allan, C. et al., 2001;
Viglietta, V. et al., 2004; Lindley, S. et al., 2005). Os antígenos rSm29 e PIII foram
eficientes no presente estudo, em aumentar a população destas células
expressando CTLA-4, o que dá a elas características modulatórias. Os antígenos
utilizados neste estudo também foram capazes de aumentar a população das
células CD4+CD25Low expressando Foxp3 no total de indivíduos, nos portadores e, o
rShTSP-2 e o PIII aumentaram a frequência destas células nos indivíduos com
HAM/TSP.
Todos os antígenos analisados foram capazes de aumentar a frequência das células
CD4+CD25high
,
que são as que classicamente exibem
funções regulatórias
(Baecher-Allan, C. et al., 2001), em todos os indivíduos analisados, inclusive nos
66
pacientes com HAM/TSP. Também foram capazes de aumentar a frequência destas
células T regulatórias expressando CTLA-4 e Foxp3. Tem sido demonstrado que em
pacientes com HAM/TSP expressão menores quantidades de mRNA para Foxp3 e
CTLA-4 nas células CD4+CD25+, quando comparado com indivíduos saudáveis
(Yamano, Y. et al., 2005). Nossos resultados mostram que os antígenos do
Schistosoma spp. podem aumentar a expressão destas moléculas nas células de
pacientes com HTLV-1. O fato da menor expressão de Foxp3 em células
CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP sugere que o HTLV-1 possa ter um efeito
inibitório na expressão de Foxp3, que a população das CD4 +CD25+ possa ser
diminuída em pacientes com HAM/TSP, ou alternativamente que pacientes com
HAM/TSP possam ter geneticamente baixa expressão do gene Foxp3 (Yamano, Y.
et al., 2005).
Em relação às células T CD8+CD25-, os antígenos analisados também foram
capazes de aumentar a frequência destas células expressando Foxp3+, no total dos
indivíduos analisados.
Avaliamos também neste estudo o perfil das células TCD8 + frente aos antígenos do
Schistosoma spp. Houve um aumento da frequência das células TCD8+ regulatórias
(TCD8+CD25High) na presença dos antígenos no total dos indivíduos e nos indivíduos
com HAM/TSP. Adicionalmente, a frequência de células regulatórias expressando
Foxp3 (CD8+CD25HighFoxp3+) aumentou em todos os indivíduos analisados.
Já havíamos demonstrado que antígenos do Schistosoma spp. são capazes de levar
a diminuição da produção de IFN-y in vitro e ao aumento de IL-10 pelas CMSP
(Lima, L. M. et al., 2013) e, observamos também que as células T com perfil
modulatório (TCD4+ e TCD8+) parecem estar associadas a este processo.
67
Alguns estudos tem demonstrado que antígenos de helmintos induzem a produção
de IL-10 por macrófagos em modelo de asma e colite aguda. A depleção destas
células reverte este efeito, mostrando que os macrófagos, além das células Treg são
as principais responsáveis pela produção de IL-10 após tratamento com antígenos
parasitários (Schnoeller, C. et al., 2008).
A fonte produtora de IL-10 foi também avaliada no presente estudo, uma vez que
esta é uma importante citocina modulatória e que é altamente produzida pela adição
dos antígenos do Schistosoma spp. avaliados neste estudo (Lima, L. M. et al., 2013).
Foi observado que os monócitos são a principal fonte produtora de IL-10 nos
indivíduos infectados pelo HTLV-1, seguido pelas células TCD4+, TCD8+ e linfócitos
B. Esse estudo mostrou, também, que nos indivíduos com HAM/TSP existe uma
tendência para que os monócitos, juntamente com as células CD8+ sejam as
principais fontes produtoras de IL-10.
Tem sido demonstrado que a produção de IL-10 é maior em indivíduos com HTLV-1
em relação aos indivíduos não infectados (Carvalho, E. M. et al., 2001) e que essa
produção é maior nos indivíduos portadores em relação aos indivíduos com
HAM/TSP (Santos, S. B. et al., 2004). A adição de IL-10 em estudos in vitro resultou
na diminuição da produção de IFN-y pelas CMSP de indivíduos portadores do vírus
(Santos, S. B. et al., 2006). Essas são evidências de que a IL-10 é uma citocida
chave no controle do processo inflamatório induzido pelo HTLV-1.
Existe também a documentação de mais alta frequência de células TCD8+
expressando IL-10 nos portadores do HTLV-1 coinfectados com helmintos, em
relação aos não coinfectados (Porto, A. F. et al., 2005). Os antígenos do
Schistosoma spp utilizados no presente estudo foram também eficientes em
68
aumentar a produção de IL-10 pelas células CD4+, CD8+ e monócitos, nos indivíduos
com HTLV-1.
69
CONCLUSÃO
Os antígenos do Schistosoma spp utilizados neste estudo foram capazes de modular
negativamente a resposta imune exacerbada do tipo Th1 in vitro em uma alta
porcentagem de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Esta modulação foi coincidente
com o aumento da produção de IL-10, citocina esta produzida principalmente pelas
células Treg e monócitos. Estes achados podem contribuir para o desenvolvimento
de novas estratégias para a prevenção do processo inflamatório induzido pela
infecção pelo HTLV-1 e a cosequente progressão para as formas mais graves da
doença, a exemplo da HAM/TSP.
70
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