(Microsoft PowerPoint - Semin\341rio RNAi

Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética
Laboratório de Imunologia Aplicada à Aquicultura
Immunogenetics of Marine Invertebrates:
RNAi approaches in Aquaculture
Prof. Dr. Rafael D Rosa
E-mail: [email protected]
Site: www.liaaq.ccb.ufsc.br
Dra. Profa. Margherita Anna Barracco
Idealizadora do LIAA (aposentada)
Fundação do LIAA em 1992 (23 anos)
Dra. Profa. Luciane Maria Perazzolo
2006-presente
Dr. Prof. Rafael Diego da Rosa
2013-presente
Linhas de Pesquisa:
1. Interação microrganismo-hospedeiro em invertebrados
Defesas antimicrobianas e antivirais;
Proteínas e peptídeos antimicrobianos;
Envolvimento da microbiota nos mecanismos de defesa.
2. Imunogenética de organismos marinhos
Bases moleculares da resistência a doenças;
Assinaturas moleculares de expressão gênica;
Genômica e transcriptômica de organismos marinhos.
3. Biotecnologia aplicada às Ciências do Mar
Terapias gênicas por RNAi;
Identificação de moléculas bioativas isoladas a partir de invertebrados marinhos;
Identificação de marcadores hemato-imunológicos;
Desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas para a Aquicultura.
RNA de interferência
RNAi
RNAi: Conceito
Mecanismo celular de
silenciamento gênico pós-transcricional
RNAi: Conceito
RNAs regulatórios que INTERFEREM na
transcrição e traduação.
RNA dupla fita (dsRNA)
RNAi: Conceito
EXÓGENO
ENDÓGENO
RNAi: Conceito
PTGS (Post-Transcriptional Gene Silencing)
- Repressão da tradução no citosol
TGS (Transcriptional Gene Silencing)
- Repressão da tradução no núcleo
RNAi: Histórico
Fenômeno descrito pela primeira vez em plantas (petúnias)
no início da década de 1990. Plantas transgênicas,
superexpressando genes para produção de pigmentos,
apresentavam flores brancas devido à inibição da síntese do
pigmento por silenciamento do transgene e do gene
endógeno (COSSUPRESSÃO).
RNAi: Histórico
1990
1992
COSSUPRESSÃO
1998
2000
Andrew Fire e Craig Mello
Nobel Price
Caenorhabditis elegans
QUELLING
Neurospora crassa
2006
Tomas Tuschl
RNAi: Histórico
RNAi: Função
Proteção
Degradação de ácidos nucleicos exógenos no citoplasma
Proteção antiviral
RNAi: Função
Regulação
Regulação da expressão gênica
Controle gênico pós-transcricional
RNAi
MECANISMO
RNAi: Mecanismo
RNAi: Mecanismo exógeno
RNAs de longa dupla fita
long-dsRNA (100-800 pb)
hairpin RNA (hpRNA)
Produzido durante a replicação de vírus (DNA ou RNA)
Invertebrados: SID-1 (transportador de dsRNA)
Vertebrados: reconhecido por TLR3 (expressão de interferon)
RNAi: Mecanismo endógeno
micro-RNA (miRNA)
Regula a expressão gênica modulando a disponibilidade dos
mRNA a serem traduzidos em proteínas (silenciamento póstranscricional).
Controle de genes endógenos (silenciamento transcricional no
núcleo – formação de heterocromatina).
RNAi: Mecanismo
Dicer
3’
5’
5’
3’
dsRNA
RISC
siRNA
RISC
5’
5’
3’
3’
mRNA
RNAi: Mecanismo
Silenciamento via RNAi: vertebrados × invertebrados
SID-1
mRNA
degradation
TLR3
INTERFERON-I
Vertebrados
núcleo
Invertebrados
Silenciamento via RNAi: vertebrados × invertebrados
Silenciamento via RNAi: vertebrados
RNAi
APLICAÇÃO
Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA
Silenciamento pós-transcricional
Via dsRNA: invertebrados
Via siRNA: vertebrados
Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA
Silenciamento via dsRNA
Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA
Silenciamento via dsRNA
Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA
Silenciamento via dsRNA
Aplicações RNAi: silenciamento via siRNA
Silenciamento via siRNA
Aplicações RNAi: silenciamento via siRNA
Silenciamento via siRNA
Aplicações RNAi: confirmação do silenciamento
RT-PCR ou RT-qPCR
Aplicações RNAi: confirmação do silenciamento
Western blot ou ELISA
Aplicações RNAi
1. Genômica funcional
2. Indução de defesa antiviral
Aplicações RNAi: Genômica funcional
Entender a função de um gene
Aplicações RNAi: Genômica funcional
Entender a função de um gene
Aplicações RNAi: Genômica funcional
Entender a função de um gene
APLICAÇÃO
Indução de defesas antivirais
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Ativação de respostas antivirais
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Ativação de respostas antivirais
APLICAÇÃO
Vírus WSSV
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Cristhiane Guertler
Vírus WSSV
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
92%
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
APLICAÇÃO
Vírus IMNV
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Emily B Justino
Vírus IMNV
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Ativação de respostas antivirais
90%
83%
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Ativação de respostas antivirais
46 genes:
7 candidatos
Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral
Ativação de respostas antivirais
Diferenças observadas apenas em
48 h pós-desafio viral
APLICAÇÃO
Experimentos com PEIXES
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Aplicações RNAi: experimentos com peixes
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética
Laboratório de Imunologia Aplicada à Aquicultura
Muchas gracias
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Prof. Dr. Rafael D Rosa
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Site: www.liaaq.ccb.ufsc.br