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Universidade Federal de Santa Catarina Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética Laboratório de Imunologia Aplicada à Aquicultura Immunogenetics of Marine Invertebrates: RNAi approaches in Aquaculture Prof. Dr. Rafael D Rosa E-mail: [email protected] Site: www.liaaq.ccb.ufsc.br Dra. Profa. Margherita Anna Barracco Idealizadora do LIAA (aposentada) Fundação do LIAA em 1992 (23 anos) Dra. Profa. Luciane Maria Perazzolo 2006-presente Dr. Prof. Rafael Diego da Rosa 2013-presente Linhas de Pesquisa: 1. Interação microrganismo-hospedeiro em invertebrados Defesas antimicrobianas e antivirais; Proteínas e peptídeos antimicrobianos; Envolvimento da microbiota nos mecanismos de defesa. 2. Imunogenética de organismos marinhos Bases moleculares da resistência a doenças; Assinaturas moleculares de expressão gênica; Genômica e transcriptômica de organismos marinhos. 3. Biotecnologia aplicada às Ciências do Mar Terapias gênicas por RNAi; Identificação de moléculas bioativas isoladas a partir de invertebrados marinhos; Identificação de marcadores hemato-imunológicos; Desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas para a Aquicultura. RNA de interferência RNAi RNAi: Conceito Mecanismo celular de silenciamento gênico pós-transcricional RNAi: Conceito RNAs regulatórios que INTERFEREM na transcrição e traduação. RNA dupla fita (dsRNA) RNAi: Conceito EXÓGENO ENDÓGENO RNAi: Conceito PTGS (Post-Transcriptional Gene Silencing) - Repressão da tradução no citosol TGS (Transcriptional Gene Silencing) - Repressão da tradução no núcleo RNAi: Histórico Fenômeno descrito pela primeira vez em plantas (petúnias) no início da década de 1990. Plantas transgênicas, superexpressando genes para produção de pigmentos, apresentavam flores brancas devido à inibição da síntese do pigmento por silenciamento do transgene e do gene endógeno (COSSUPRESSÃO). RNAi: Histórico 1990 1992 COSSUPRESSÃO 1998 2000 Andrew Fire e Craig Mello Nobel Price Caenorhabditis elegans QUELLING Neurospora crassa 2006 Tomas Tuschl RNAi: Histórico RNAi: Função Proteção Degradação de ácidos nucleicos exógenos no citoplasma Proteção antiviral RNAi: Função Regulação Regulação da expressão gênica Controle gênico pós-transcricional RNAi MECANISMO RNAi: Mecanismo RNAi: Mecanismo exógeno RNAs de longa dupla fita long-dsRNA (100-800 pb) hairpin RNA (hpRNA) Produzido durante a replicação de vírus (DNA ou RNA) Invertebrados: SID-1 (transportador de dsRNA) Vertebrados: reconhecido por TLR3 (expressão de interferon) RNAi: Mecanismo endógeno micro-RNA (miRNA) Regula a expressão gênica modulando a disponibilidade dos mRNA a serem traduzidos em proteínas (silenciamento póstranscricional). Controle de genes endógenos (silenciamento transcricional no núcleo – formação de heterocromatina). RNAi: Mecanismo Dicer 3’ 5’ 5’ 3’ dsRNA RISC siRNA RISC 5’ 5’ 3’ 3’ mRNA RNAi: Mecanismo Silenciamento via RNAi: vertebrados × invertebrados SID-1 mRNA degradation TLR3 INTERFERON-I Vertebrados núcleo Invertebrados Silenciamento via RNAi: vertebrados × invertebrados Silenciamento via RNAi: vertebrados RNAi APLICAÇÃO Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA Silenciamento pós-transcricional Via dsRNA: invertebrados Via siRNA: vertebrados Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA Silenciamento via dsRNA Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA Silenciamento via dsRNA Aplicações RNAi: silenciamento via dsRNA Silenciamento via dsRNA Aplicações RNAi: silenciamento via siRNA Silenciamento via siRNA Aplicações RNAi: silenciamento via siRNA Silenciamento via siRNA Aplicações RNAi: confirmação do silenciamento RT-PCR ou RT-qPCR Aplicações RNAi: confirmação do silenciamento Western blot ou ELISA Aplicações RNAi 1. Genômica funcional 2. Indução de defesa antiviral Aplicações RNAi: Genômica funcional Entender a função de um gene Aplicações RNAi: Genômica funcional Entender a função de um gene Aplicações RNAi: Genômica funcional Entender a função de um gene APLICAÇÃO Indução de defesas antivirais Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Ativação de respostas antivirais Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Ativação de respostas antivirais APLICAÇÃO Vírus WSSV Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Cristhiane Guertler Vírus WSSV Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral 92% Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral APLICAÇÃO Vírus IMNV Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Emily B Justino Vírus IMNV Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Ativação de respostas antivirais 90% 83% Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Ativação de respostas antivirais 46 genes: 7 candidatos Aplicações RNAi: indução de defesa antiviral Ativação de respostas antivirais Diferenças observadas apenas em 48 h pós-desafio viral APLICAÇÃO Experimentos com PEIXES Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Aplicações RNAi: experimentos com peixes Universidade Federal de Santa Catarina Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética Laboratório de Imunologia Aplicada à Aquicultura Muchas gracias Muchas gracias Prof. Dr. Rafael D Rosa E-mail: [email protected] Site: www.liaaq.ccb.ufsc.br
