Rotina de Escaneamento do LSM 510 Meta

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina
REDE PREMiUM DE EQUIPAMENTOS MULTIUSUÁRIOS
COMPLEXO HC-FMUSP/LIMs
NÚCLEO DE MICROSCOPIA CONFOCAL
Roteiro operacional do LSM 510 Meta Laser Scanning
Elaborado por Ana Lúcia Garippo
Revisado por Luciana Pescatore Alves
2012
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
-2-
COMO USAR ESTE TUTORIAL
Este tutorial foi preparado para auxiliar na aquisição de imagens, permitindo fácil
acesso às ferramentas do Módulo de escanenamento à laser, LSM 510 Meta (Carl
Zeiss) e informações básicas sobre operação do equipamento.
De acordo com o material e qualidade da amostra ou as necessidades específicas
de cada usuário, novas rotinas serão implantadas e ampliadas para que possamos
adequar o sistema como um todo.
Por favor, note que este tutorial tem meramente a intenção de introduzir
rapidamente informações básicas sobre o programa LSM 510 Meta / Zeiss e não
apresenta todos os parâmetros do sistema. Informações complementares estão
disponíveis no Manual da Carl Zeiss.
FMUSP © 2012
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Av Dr Arnaldo 455
São Paulo - SP
Telefone: (11) 3061.7000
(11) 2661.5957
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www.premium.fm.usp.br
Editorado por Josué Moreira de Souza
SDC - Serviço de Documentação Científica FMUSP
Sumário
1.INTRODUÇÃO................................................................................................................... 1
1.1 Avisos prévios...........................................................................................................1
1.2 Introdução à Técnica Confocal ................................................................................ 2
1.3 Recursos do Módulo LSM 510 Meta .......................................................................3
2.MÉTODO - LSM 510 META..............................................................................................4
2.1 Acionar ou Instalar todos os Componentes e o Módulo...........................................4
3.O SISTEMA LSM 510 META ........................................................................................... 6
3.1 Acionar o LSM510 no Desktop: ..............................................................................6
3.2Aquisição das Imagens............................................................................................... 7
3.3 Acionar Lasers........................................................................................................ 10
4.GERAR NOVOS ARQUIVOS..........................................................................................11
5.MODOS DE CONFIGURAÇÃO DO ESCANEAMENTO..............................................12
5.1 Single Track ...........................................................................................................12
5.2 Multi Track ............................................................................................................ 13
5.3 Meta – ChS ............................................................................................................ 14
5.4 Dichroic Beam Splitter - Divisor de Feixe Dicroico.............................................. 15
6.SCAN CONTROL............................................................................................................. 16
6.1 MODE ....................................................................................................................16
6.2 Channels..................................................................................................................16
6.4 Gain, Offset e Amplifier Gain................................................................................ 18
6.5 Saturação do Sinal de acordo com a potência de Transmissão do Laser................19
7.BARRAS DE FERRAMENTAS ......................................................................................20
7.1 Escaneamento......................................................................................................... 20
7.2 Overlay ...................................................................................................................21
Ao final de cada edição de imagem inserir a barra de representação do tamanho real da
amostra (1)......................................................................................................... 21
7.3 Zoom por escaneamento ........................................................................................ 22
7.4 Excluir um Canal – Alterar cor...............................................................................23
7.5 Informações.............................................................................................................23
7.6 Visualizar impressão ..............................................................................................23
8.Z- STACK – 3D ................................................................................................................24
8.1 Z- Settings ..............................................................................................................25
Fatiamento da amostra (série Z).................................................................................... 25
8.2 Galeria – Barra de Ferramentas ............................................................................. 26
8.3 Projeções (3D) ....................................................................................................... 28
9.ARQUIVO JÁ EXISTENTE ............................................................................................ 30
9.1 REUSE - Acompanhar macros anteriores do projeto desejado.............................. 30
10.HISTOGRAMAS – CO-LOCALIZAÇÃO..................................................................... 32
10.1 Tabela de Correlação entre os Canais...................................................................32
10.2 Profile – Gráficos Bidimensionais........................................................................33
10.3 Representações Bidimensionais - 2.5 D................................................................33
11. GERAR ARQUIVOS E EXPORTAR IMAGENS.........................................................34
11.2.1FORM ................................................................................................................. 35
11.2.2 GALLERY ........................................................................................................35
11.2.3 TABLE...............................................................................................................35
11.4 Exportar Imagens..................................................................................................36
11.5 Exportar em Melhor Resolução............................................................................ 36
11.6 PEN-DRIVE......................................................................................................... 36
12. FINAL DO PROCEDIMENTO .....................................................................................37
12.1 Desligar os Lasers.................................................................................................37
12.2 Ajustes do Microscópio........................................................................................ 37
12.3 Após resfriar os Lasers - SAIR DO SISTEMA ................................................... 38
12.4 Aviso do Sistema.................................................................................................. 38
13. DESLIGAR OS COMPONENTES E O SISTEMA.......................................................39
13.1 Cobrir o microscópio............................................................................................ 39
14. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................40
Introdução
1.
INTRODUÇÃO
1.1
Avisos prévios
-1-
O equipamento será liberado para uso somente aos usuários treinados e
habilitados.
O uso inadequado deste equipamento poderá gerar sérios riscos aos
usuários, podendo ocasionar a exposição da retina e pele ao laser; o usuário corre
o risco de prender os dedos na base motorizada ou se queimar em superfícies
quentes. Os danos por uso inadequado não serão cobertos pela empresa Carl
Zeiss.
É VEDADO quaisquer alterações nas configurações realizadas sem
autorização dos responsáveis e além das necessárias e citadas neste tutorial.
Todo e qualquer dano ou prejuízo, periférico ou não, no microscópio, e seus
complementos, computador, adicionais do computador, módulos de escaneamento,
racks dos lasers, chiller e noBreak será de responsabilidade do usuário.
Em caso de alguma dúvida técnica ou algum problema operacional não
citado neste manual, entre em contato IMEDIATAMENTE com o responsável
técnico ou um dos coordenadores do Núcleo de Microscopia Confocal.
Este equipamento está instalado no 9 o. Andar do Bloco II do INCOR. Não
temos gerador neste andar. O equipamento conta com o recurso de um pequeno
nobreak. Assim, em caso de queda de energia é fundamental desligar corretamente
todos os componentes e sair do sistema imediatamente.
Em eventual aviso de queda de energia ou fatores climáticos adversos
(relâmpagos, raios e trovões), não ligue, ou então desligue o equipamento o
mais rápido possível !
A temperatura da sala deverá estar em torno de 21°C a 23°C. Em dias
quentes o Spliter deverá estar em menor temperatura. O laser UV exige maior
refrigeração; todos os lasers acionados, assim como muitas pessoas na sala
elevará a temperatura. Em caso de alta temperatura o rendimento do equipamento
cai, ou mesmo se desconecta sozinho, podendo causar danos ao equipamento.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
1.2
Introdução à Técnica Confocal
A microscopia confocal é uma técnica de imagem ótica superior a
microscopia ótica convencional porque possibilita controle da profundidade de
campo, eliminação de informações fora de foco da imagem comprometendo sua
qualidade e mais ainda possibilita coletar secções óticas de espécimes espessos
que podem ser reconstruídos tridimensionalmente. Tais qualidades proporcionam
uma melhora substancial da aquisição de imagens que antes eram obtidas por
microscopia de fluorescência ótica convencional. A realização de estudos por
microscopia confocal possibilitou a localização sub-celular de organelas e
proteínas específicas que são imprescindíveis para compreensão de fenômenos
complexos envolvidos, por exemplo, na compreensão de eventos de etapas
específicas da embriogênese e desenvolvimento; melhor entendimento da gênese
de neoplasias e processos de mestastização; ou ainda o destino de células tronco
transplantadas para reparação de órgãos adultos.
O módulo Confocal Zeiss LSM 510 Meta/UV dispõe de uma ampla faixa de
lasers, incluindo Argônio (458, 477, 488 e 514 nm), Hélio-Neônio (543 nm), HélioNeônio (633 nm) e o módulo UV possibilita o uso de um laser Enterprise (351 e
364 nm), um módulo eletrônico e software de controle para o LSM. Cada canal
pode ser regulado independentemente, e a coleta simultânea e seqüencial das
imagens pode ser obtida com a utilização do software possibilitando a
sobreposição de imagens, ou ainda a formação de imagens em 3D.
-3-
Introdução
1.3
Recursos do Módulo LSM 510 Meta
1.1. Escaneamento à laser com leitura precisa do plano focal individual de
interesse,
1.2. Múltiplas aquisições de fluorescências: vários fluorocromos que
marcam diferentes estruturas celulares, componentes da matriz
extracelular ou ainda materiais sintéticos e estruturas particuladas;
1.3. Localização, coexistência, compartimentalização e co-localização de
mais de uma proteína em uma mesma amostra e sua análise gráfica;
1.4. Análise de amostras tridimensionais, tais como: células tronco,
embriões, biofilmes, colônias celulares, esferas, etc...
1.5. Representação tridimensional de amostras (x-y-z).
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
2.
MÉTODO - LSM 510 META
2.1
Acionar ou Instalar todos os Componentes e o Módulo
2.1.1 Ligar as chaves do SISTEMA (1) e dos LASERs (2)
1
2
Acionar o Controle Remoto, nesta ordem:
3
(3) SISTEMA e
(4) COMPONENTES
4
-5-
Método - LSM 510 Meta
2.1.2 Ligar todos os componentes: o Microscópio e o rack do
Laser UV (1 e 2).
Acionar interruptor e chave.
1
Quando houver falhas no escaneamento do UV,
ou luzes intermitentes no rack do laser UV,
CHAME O TÉCNICO responsável pelo Núcleo,
para que o mesmo verifique o volume de água no
reservatório localizado dentro do chiller.
2
.
2.1 3 Ligue a HBO (Localizar e identificar os marcadores)
1. Antes de iniciar a aquisição de imagens: Ligue a HBO para que se
estabilize a temperatura. O intervalo para re-ligagem desta lâmpada é de
30 minutos, para total resfriamento. O desrespeito a este intervalo pode
ocasionar estouro na lente por aquecimento.
2. Ao final do uso, anote o horário de desligamento da HBO assim como o
valor do contador da HBO para que o próximo usuário saiba o horário
que foi desligado e para possibilitar o controle de troca da mesma.
3. Durante a troca de lâmpada, evite tocar no bulbo da lâmpada ou na
superfície quente.
4. A lâmpada de mercúrio HBO tem duração média entre 200 e 300 h
(Osram: HBO 100W/2 and HBO 103W/2; Ushio: USH-102D).
5. Antes de trocar a lâmpada, desconecte da energia e espere por 15
minutes para o resfriamento total.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
3.
O SISTEMA LSM 510 META
3.1
Acionar o LSM510 no Desktop:
2.
SCAN NEW IMAGE e
3.
START EXPERT MODE
O sistema varrerá todos os
componentes.
3.1.2 A barra de tarefas se abrirá
VIS – Ocular aberta
LSM - Schutter fechado para escanemento do laser.
OBS – há risco de lesão na retina e pele; mantenha-se distante do objeto em
leitura, quando em LSM.
-7-
O Sistema LSM 510 Meta
3.1.3 Posicionar a amostra no suporte
1. Antes de posicionara a amostra no
2.
3.
4.
5.
suporte, verifique se todas as lâminas
estão secas externamente e vedadas com
esmalte nas extremidades da lamínula,
pois ao observar ao microscópio as
objetivas são de imersão, formam vácuo,
podendo ocasionar desprendimento e
perda da amostra.
Acione VIS na barra de tarefas:
Delicadamente, mova o estágio mecânica
conduzindo a placa do microscópio à direita
do condensador.
Encaixe a lâmina no suporte.
Delicadamente, volte a placa do microscópio
à posição, na direção do condensador.
6. Ajuste a objetiva, suba o carrossel foco
focalize a área de interesse.
3.2
Aquisição das Imagens
3.2.1 ANTES de escanear qualquer experimento, FAÇA uma
avaliação qualitativa da amostra e os ajustes dos Controles
Branco e Negativo.
Qualquer experimento que der seguimento à análise sem controles está fora dos
critérios de avaliação. Os dados gerados são superficiais, fora dos critérios
técnicos e sem valor científico.
3.2.1.1.
O Controle Branco (somente o marcador nuclear Dapi,
Hoechst
ou
PI)
autofluorescência
nos
da
auxiliará
a
amostra.
identificar
Zeramos
toda
a
esta
autofluorescência através da excitação máxima de laser, sem
que haja auto-marcação.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
3.2.1.2.
O Controle Negativo (SEM os anticorpos primários, mas
COM todos os secundários) tem a finalidade de identificar
qualquer marcação inespecífica devido às ligações cruzadas
entre anticorpos (espécies de origem), ou reatividade entre
amostras
e
anticorpos.
Partindo
dos
parâmetros
do
BRANCO, zeramos novamente e à partir deste teto as
amostras serão analisadas.
(1) O quadro 1 demonstra o escaneamento do controle negativo, os parâmetros
calibrados para ele serão adotados no experimento do dia para cada usuário.
(2) Ao mudar de objetiva os controles deverão ser escaneados e ajustados
novamente (mesmo quando não há mudança de amostra)
(3) Quando houver mudança de amostra, tecido para cultura celular, células em
2D para 3D, parafinados para congelados, mudanças de tecidos (coração,
pulmão, fígado, ósseo, etc...): TODOS DEVERÃO TER SEU CONTROLE
NEGATIVO INDIVIDUALMENTE.
3.2.2 CONTAMINAÇÕES
Devem ser verificados pelo marcador de DNA; DAPI, Hoechst, Iodeto de
Propideo, entre outros. Qualquer agente contaminante interferirá na avaliação
científica do experimento. Exceto se o alvo for o agente contaminante!
O Sistema LSM 510 Meta
-9-
Por exemplo: Células oncogências são extremamente resistentes às terapêuticas
testadas, contudo quando há contaminação, comportam-se de modo diverso.
A presença de agentes contaminantes na amostra evidencia a necessidade
urgente de cuidados na sala de cultura ou no preparo de reagentes.
Causas possíveis de contaminação:
-
excesso de passagens de suas células;
meio contaminado;
descuido ao usar o fluxo e no manuseio da amostra;
reagentes utilizados na fixação e fluorescência contaminados;
reaproveitamento de materiais e sobra de reagentes.
Dica: Um dia antes de iniciar as imunomarcações verifique se todos os reagentes que
necessitará estarão à disposição, novos e filtrados. Lembre-se: o ensaio é demorado para
que se perca tudo por descuido no preparo das amostras.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
3.3
Acionar Lasers
(1) UV (350nm – azul) e Argon (488nm - verde) : Standby, e quando
PRONTO acionar ON
(2) HeNe 543 e HeNe 633 Acionar ON
É PROIBIDO alterar o OUTPUT (%) de qualquer Laser, somente o Eng. da Zeiss
esta autorizado a fazer tais alterações.
- 11 -
Gerar Novos Arquivos
4.
GERAR NOVOS ARQUIVOS
(1) Entre no DRIVE D
Abra uma nova pasta – Novo Usuário
Ou na Mesma Pasta – Datas diferentes
(2) IMAGENS
Ex. PASTA em (D) Laboratório de
Biologia Vascular: Alunos, Jorge, Data,
nome da imagem – OK!
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
5.
MODOS DE CONFIGURAÇÃO DO ESCANEAMENTO
Modos para configuração dos fotomultiplicadores e trajeto dos lasers,
intensidade de transmissão do laser.
5.1
Single Track
Escaneamento único, simultâneo, de 1 ou mais canais, menor tempo e
menor definição entre os marcadores
- Se desejar, selecione configurações já salvas no programa.
Modos de configuração do escaneamento
5.2
- 13 -
Multi Track
Escaneamento individual para cada canal. O tempo para escaneamento
neste modulo é maior, porem as imagens geradas possuem maior definição.
O Multi Track e o Meta-ChS são os mais indicados para escaneamento de
mais de um canal.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
5.3
Meta – ChS
O
sistema
Meta
oferece
a
possibilidade de avaliarmos vários
marcadores (8) com estreitamento do
espectro das leituras.
Entretanto, o Meta funcionará muito
bem quando a expressão do marcador
for alta/forte, pois nas marcações
fracas precisamos de espectros
maiores.
È importante lembrar que apesar do
grande número de possibilidades,
precisamos de marcadores oriundos
de diferentes espécies (mouse, rat,
rabbit, goat, etc...). Para que não haja
interpretações
equivocas
de
colocalizações.
- 15 -
Modos de configuração do escaneamento
5.4
Dichroic Beam Splitter - Divisor de Feixe Dicroico
O conjunto de Bem Splitter ficam dentro do Rack
de lasers e portanto não está acessível.
Devemos aciona-los na plataforma de trabalho
CONFIG.
Selecionar o filtro adequado para
cada laser no roteiro de detecção:
HFT – HauptFarbTeiler
Deixa
passar
a
emissão
fluorescente através da amostra.
NFT - NebenFarbTeiler
Seleciona a faixa de excitação
desejada.
Deixa
passar
os
comprimentos acima do espectro
de interesse mas barra tudo que
estiver
abaixo do espectro
escolhido.
Mirror – Barra 100% da luz
Plate –100% da luz é transmitida.
LP – Long Pass
Transmite o comprimento de onda
aberto, sem limite acima da faixa
escolhida.
BP – Band Pass
Limita o comprimento de onda.
Contraste - Luz transmitida, geralmente usa-se a cor
branca. É necessário acionar um laser.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
6.
SCAN CONTROL
6.1
MODE
Velocidade de escaneamento
- Optar entre 6 e 7 (Scan Speed) para obter
imagens sem ‘’ruído’’.
Numero de Pixel e Média de Escanemento por
Linha
- Optar entre 2 e 4 – Quanto maior, mais lento
será o processo e a imagem será de melhor
qualidade. Entretanto, nos casos onde há baixa
expressão da proteína, o processo consumirá os
fluoróforos.
6.2
Channels
Selecione um dos canais e verifique a
intensidade da expressão baseando-se
nos controles negativos. Se necessário
reduza o percentual de excitação e
ganho. Os parâmetros definidos nesta
etapa deverão ser mantidos até o final
do experimento deste dia.
Scan Control
- 17 -
6.3 Pinhole
6.3.1 Airy Unit
A abertura ideal do pinhole é de 1,0 Airy unit.
Preste atenção com a mudança de objetiva ou de canais esta unidade
também variará.
Ajuste-a os parâmetros (Optical slice) iguais para todos os canais. Inicie
pelos canais de maior comprimento de onda.
O pinhole ganhará pequenas diferenças de ajuste, mas adequadas às
objetivas e ao Optical Slice.
Ajustes fundamentais para a avaliação da co-localização.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
6.4
Gain, Offset e Amplifier Gain
Detector Gain – Determina a sensibilidade
máxima de detecção. Quanto maior o
ganho, maior o ruído.
Amplifier Offset – Determina o limite de
intensidade mínima. Quanto maior o offset
menor a expressão.
Amplifier Gain – determina a amplificação
do sinal.
Análise do perfil de expressão para
correção de detecção de ganho.
PALETTE – Range Indicator
Ferramenta usada para identificar a
intensidade dos fluoróforos.
AZUL – representa o fundo preto, sinal
que o OFFSET está elevado.
CINZA a BRANCO – representa a
expressão suave à intensa do fluoróforo na
amostra.
VERMELHO – representa um pico elevado
nos parâmetros, sinal que o ganho (Detector
Gain) está elevado.
Uma
imagem
com
parâmetros
adequados não expressa Vermelho ou
Azul por esta ferramenta (Palette).
Scan Control
6.5
- 19 -
Saturação do Sinal de acordo com a potência de
Transmissão do Laser
Quanto maior a % de transmissão
maior a saturação do laser (linear)
Se houver muita saturação, diminua a % de
transmissão do laser e o Detector Gain (item
6.4).
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
7.
BARRAS DE FERRAMENTAS
7.1
Escaneamento
1. NEW image
2. FAST – XY: para corrigir foco e intensidade de ganho
rapidamente.
3. SINGLE – escanemaento mais lento da amostra, em
melhor definição.
4. STOP
5. Salvar
Canais requisitados no escaneamento
XY – merge
Split XY – separa os canais
Aumento na tela ou zoom digital
Brilho e Contraste
Copiar para transportar imagem para outro software (p. ex.
Power-Point ou Word).
Barras de Ferramentas
7.2
- 21 -
Overlay
Ferramentas para edição da imagem.
1
Ao final de cada edição de imagem inserir a barra de representação do
tamanho real da amostra (1).
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
7.3
Zoom por escaneamento
CROP
Selecionar área de interesse para aumento:
Zoom: aumento de até 6x.
Por exemplo, uma amostra escaneada
com uma objetiva de 20x, ao selecionar um
zoom de 5x obtemos um aumento real de
100x.
Rotation: rotação (0-360°) da área
vizualizada para escaneamento.
Salvar as imagens em New MDB no drive (D)
Para salvar a imagem: click em NEW MDB
ou OPEN MDB para os arquivos existentes.
- 23 -
Barras de Ferramentas
7.4
Excluir um Canal – Alterar cor
CHAN
Channels
Ch2-T1, Ch3-T2, etc...
Clicar onde desejar excluir (OFF)
ou trocar de cor.
7.5
Informações
INFO
Detalhamento do
escaneamento.
7.6
Visualizar impressão
Pré-visualização da impressão.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
8.
Z- STACK – 3D
Avaliar a espessura e co-localização de proteínas em amostras 3D.
- 25 -
Z- Stack – 3D
8.1
Z- Settings
Fatiamento da amostra (série Z)
(1) Z-Stack
(2) Z- Settings
2
1
4
3
Delimitar espessura no
Optical slice que deverá ser a
mesma para todos os canais; e
escolher um dos canais para indicar
o início e o fim da amostra (ver item
6.2)
(2)
Optar por ‘Keep Slice’
(3)
Determinar o inicio e o fim da
amostra (Mark First / Mark Last).
(4)
Determinar o número de fatias
e intervalo desejado (Num. Slices /
Interval). É necessário determinar
um único intervalo para todas as
amostras pertencentes ao mesmo
grupo.
(1)
6
5
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
8.2
Galeria – Barra de Ferramentas
Análise individual da galeria (z-stack)
Análise 3D dos marcadores.
Ferramentas para o Z-stack
Início e fim da amostra em plano único (Gallery) e
visualização em 3D.
Análise de co-localização e gráficos bidimensionais.
8.2.1 Espessura de cada fatia
Gallery
Data – indicará a espessura de
cada quadro.
XY – Amostra em plano único
- 27 -
Z- Stack – 3D
8.2.2 Slice – quadro individual em profundidade.
Display XY
Slice – quadro individual em
profundidade.
8.2.3 Ortho - Seção Orthogonal
Ortho - Seção Orthogonal
Selecione Mouse Select para cortar
as linhas.
Para salvar as seções ortogonais,
entre em Export e salve o arquivo.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
8.3
Projeções (3D)
8.3.1 Projeções Zero
A partir da galeria salva, entrar em (a) 3D View na barra de tarefas e
(b) Projection
P.Zero
(1) First Angle Zero
(2) Number Projection: 1
(3) Difference Angle: Panorâmica
(360)
- 29 -
Z- Stack – 3D
8.3.2 Projeções 3D (vídeos)
8.3.2.1. Exportar imagens em 3D para o formato (*.AVI)
8.3.2.2. Abrir em Mídia Player, Quick Time, etc...
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
9.
ARQUIVO JÁ EXISTENTE
9.1
REUSE - Acompanhar macros anteriores do projeto
desejado
FILE – OPEN em IMAGE (no DRIVE “D”)
Abrir a galeria e a imagem desejada, usar REUSE, para assumir padrões
anteriores e/ou adicionar configurações.
Adotar padrões anteriores de escaneamento.
Abrir imagem do experimento anterior.
Acionar os Laser e aguardar que esquentem.
Clicar em REUSE para assumir padrões anteriores.
Focar a nova amostra e escanear.
Fazer os ajustes necessários.
Adicionar ou remover canais, se necessário.
Lembre-se mudou o dia, novo experimento, novos marcadores,
novos tecidos, novos controles...
OBS: É necessário mais de um experimento para finalizar um estudo. Assim, se
faz necessário adotar os parâmetros anteriores para que no final do estudo
possamos parear ensaios com critérios adequados.
A. Assim, abra a imagem do Controle NEGATIVO da última análise.
Observe se usou os mesmos tecidos ou células, mesmos
secundários e mesmos títulos da análise atual.
B. Ligue os lasers de interesse.
C. Dê REUSE na imagem do controle negativo anterior.
D. As plataformas CONFIG e SCAN CONTROL assumirão os padrões.
E. Coloque sua lâmina de Controle NEGATIVO atual e escanei todos
os canais.
F. Faça as correções necessárias, pois somente o canal dos núcleos
deverá aparecer. E sempre há variáveis a serem consideradas.
Mark and Find
G. Inicie sua leitura.
- 31 -
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
10. HISTOGRAMAS – CO-LOCALIZAÇÃO
10.1 Tabela de Correlação entre os Canais
Para maiores informações sobre estes parametros, procure material
de apoio disponível na pagina do Confocal no site da Rede PREMiUM.
Histogramas – co-localização
10.2 Profile – Gráficos Bidimensionais
10.3 Representações Bidimensionais - 2.5 D
- 33 -
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
11. GERAR ARQUIVOS E EXPORTAR IMAGENS
11.1 Salvar arquivos: Salvar as imagens em New MDB no
drive (D)
Abra uma nova pasta no Drive D.
Para salvar a imagem: click em NEW
MDB ou OPEN MDB para o arquivos
existentes.
Ao nomear os arquivos por data ficará
mais fácil encontrá-los futuramente.
Ex. PASTA em (D) Laboratório de
Biologia Vascular: Alunos, Jorge, Data,
nome da imagem – OK!
- 35 -
Gerar Arquivos e Exportar Imagens
11.2 Informaçoes sobre o arquivo MBD
11.2.1
FORM
Formulário - Para cada data será
gerado um formulário.
11.2.3
11.2.2
GALLERY
Todos as imagens daquele formulário
TABLE
Em Table temos informações das descrições adotadas, objetivas e recursos
utilizados.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
11.4 Exportar Imagens
11.5 Exportar em Melhor Resolução
Também possível fazer no LSM Browser, ferramenta disponível no site
www.zeiss.org. Microscopy – downloads.
Abra o arquivo pelo OPEN, a galeria e a figura que deseja. A barra de Ferramenta
disponibilizará o ícone EXPORTAR, siga as indicações acima.
11.6 PEN-DRIVE
Salvar os arquivos no PEN-DRIVE do Confocal, somente depois (utilizando
o outro computador disponível da sala) repasse o arquivo para o pen-drive do
usuário.
- 37 -
Final do Procedimento
12. FINAL DO PROCEDIMENTO
12.1 Desligar os Lasers
Somente os Lasers Enterprise (UV) e ARGON são necessários passar de
ON para STANDBY para resfriar e após 5 minutos clicar em OFF.
12.2 Ajustes do Microscópio
- Delicadamente,
-
-
conduza a platina do
microscópio à direita do condensador.
Retire sua lâmina do suporte.
Delicadamente,
volte
a
platina
do
microscópio à posição central, em direção ao
condensador.
Ajuste a menor objetiva, e deixe o carrossel
de objetivas sempre em posição inferior –
FOCUS para baixo.
Limpar as objetivas para remover o óleo de
imersão com lenço de papel e após, lenço de
papel e álcool.
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
12.3 Após resfriar os Lasers - SAIR DO SISTEMA
12.4 Aviso do Sistema
Ao SAIR do Software de Escaneamento, AGUARDAR o Sistema lançar
três avisos de desligamento de componentes.
- 39 -
Considerações Finais
13. DESLIGAR OS COMPONENTES E O SISTEMA
Controle Remoto, nesta ordem:
2
(1) COMPONENTES e
(2) SISTEMA.
1
3
4
13.1 Cobrir o microscópio
DESLIGAR as chaves de
funcionamento do SISTEMA (3)
e dos LASERs (4).
Núcleo de Microscopia Confocal - REDE PREMiUM
14. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A implantação do Núcleo de Microscopia Confocal na Rede PREMiUM do
Complexo HC-FMUSP/ LIMs nos possibilita avaliação de amostras biólogas que
até então os recursos em microscopia comum, de varredura ou eletrônica não
atendiam em requisitos específicos : múltiplas marcações, avaliação de amostras
mais espessas e eventos bioquímicos. A interpretação criteriosa de colônias de
células tronco, das linhagens oncogênicas, de embriões e biofilmes geram um
imenso leque de possibilidades nas pesquisas até então realizadas em nossa
Instituição,
colocando-nos
em
um
patamar
mais
elevado
nos
critérios
internacionais para publicações.
A implantação da Rede de Multiusuários nos impele ao exercício da
solidariedade, da formação de parcerias produtivas e responsabilidades com esta
Instituição de ensino. Além da formação de pesquisadores com credibilidade e
respaldo intelectual, estamos formando seres humanos conscientes da parcela
que lhes cabe no progresso cientifico e social em âmbito mundial.
Que o amor à ciência fecunde nossas almas de generosidade e
conseqüentemente o sucesso virá a todos, pois impossível dizer que caminhamos
sozinhos, há ao nosso lado uma equipe de profissionais que nos dão sustentação,
aparam arestas e orientam nossos resultados para sua ampla publicação. Por isso
o desenho do projeto, a coleta de materiais, o preparo das amostras, as técnicas a
serem desenvolvidas e a leitura dos experimentos são etapas que se
complementam. Não há como esperar resultados inéditos e confiáveis onde houve
falhas de continuidade. Apesar de estarmos lidando com um SOFTWARE que nos
possibilita ajustarmos padrões, se o material que entra é de baixa qualidade, o
resultado final será visivelmente o resultado do que colocamos em análise.
Sucesso a todos!