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Acta Tecnológica, Vol. 7, N° 2 (2012), 8 - 12
Acta Tecnológica
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Identificação de bactérias ruminais via PCR - Multiplex utilizando DNA extraído diretamente do
líquido ruminal fresco e conservado em metanol
Ana Paula Del Vesco1 , Stefania Caroline Claudino da Silva1 , Adriana Bagatoli2, Eliane Gasparino1 , Maria Amélia Menck
Soares2, Débora Marques Voltolini1 , Álida Mariana dos Reis Buzzo1 , Liegie Alher Marques1 , Angélica de Souza Khatlab1
RESUMO
O rumem contém várias espécies de bactérias habitando um sistema anaeróbico. Um método bastante utilizado na
identificação de bactérias em diferentes ambientes é a amplificação do gene que codifica o 16S rRNA. Entretanto, para que
seja possível o sucesso nas identificações e quantificações desses microrganismos, a extração do DNA total do líquido
ruminal é uma etapa fundamental no processo; desta forma, o objetivo desse trabalho foi verificar a eficiência na
identificação de bactérias do rúmen de bovinos utilizando DNA extraído diretamente do líquido ruminal fresco e conservado
em metanol, e utilizando um sistema de amplificação multiplex. Foram avaliadas seis bactérias presentes no líquido ruminal
de bovinos pelos métodos da PCR convencional e multiplex. O sistema de PCR convencional mostrou-se eficiente
apresentando resultado positivo nas reações de amplificação para o DNA das bactérias estudadas. A mesma eficiência
também foi observada utilizando o sistema multiplex. O armazenamento de líquido ruminal de bovinos no metanol mostrouse eficiente, pois permitiu a extração e amplificação da região do DNA bacteriano, tanto pelo sistema de PCR convencional
quanto pelo sistema multiplex.
Termos para indexação: extração, bovinos, PCR.
Identification of ruminal bacteria by PCR – Multiplex using DNA extracted directly from fresh
ruminal fluid and stored in methanol.
ABSTRACT
The rumen contains several species of bacteria inhabiting an anaerobic system. One method widely used in
identification of bacteria in different environments is the amplification of the gene encoding the 16S rRNA. However to
succeed in the identification and quantification of these bacteria, the extraction of total DNA from rumen fluid is a
fundamental step in the process; thus the aim of this study was to evaluate the efficiency in the identification of bacteria
from the rumen bovine using DNA extracted directly from fresh rumen fluid and stored in methanol, using a multiplex
amplification system. We evaluated six bacteria in bovine rumen fluid by conventional methods ofPCR and multiplex. The
conventional PCR system was efficient presenting positive amplification reactions for DNA of the bacteria studied. The
same efficiency was also observed using the multiplex. The storage ofbovine rumen fluid in methanol was efficient because
it allowed the extraction and amplification of the region of bacterial DNA by both conventional PCR system and the
multiplex.
Index terms: cattle, extraction, PCR
1 Departamento
de Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringá - Paraná, Brasil.
2Departamento
de Genética da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Av. Min. Fernando Costa, 23890-000, Seropédica- Rio de Janeiro, Brasil.
DEL VESCO et al. , Acta Tecnológica, Vol. 7, N° 2 (2012)
INTRODUÇÃO
O rúmen contém várias espécies de bactérias,
habitando um sistema anaeróbio com pH em torno da
neutralidade proporcionado pelos tampões salivares de
fluxo constante para o órgão. Um pH próximo da
neutralidade facilita a manutenção de uma população
microbiana diversificada, com grande capacidade
fermentativa (LETTAT et al., 2010). Além das bactérias, o
rúmen é habitado por protozoários, fungos anaeróbios e
ainda bacteriófagos (KAMRA, 2005), entretanto, são as
bactérias os microrganismos com maior atividade
enzimática, apresentando mais de 20 espécies, com uma
população entre 1.000.000.000 a 10.000.000.000 de
células/g de conteúdo ruminal (TEIXEIRA, 1991).
Mudança na dieta, na idade do animal, no estado
geral de saúde, no uso de antibióticos entre outros fatores,
pode alterar a atividade fermentativa favorecendo um
determinado tipo de microrganismo. O número e atividade
predominante das bactérias ruminais nativas podem ser
manipuladas, oferecendo vantagens seletivas às de
interesse (WANAPAT, 2000).
Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com o
objetivo de isolar e identificar linhagens bacterianas do
rúmen de bovinos submetidos a diferentes condições
ambientais (YU et al., 2010; GREBEN & SIGAMA, 2009;
JOHNSON et al., 2009). Contudo, considerando que
apenas uma pequena fração do total da diversidade
microbiana no ecossistema natural do rúmen pode ser
recuperada por métodos de cultura (AMANN et al, 1995),
por não serem cultiváveis ou pela dificuldade de cultivo,
faz-se necessário o uso de métodos mais refinados e
acurados na identificação de bactérias ruminais. Um
método bastante utilizado na identificação de bactérias em
diferentes ambientes é a amplificação via PCR do gene que
codifica o 16S rRNA (TAJIMA et al, 1999, GRIFITHS et
al, 2000). O RNA ribossômico (rRNA) é fundamental nos
processos celulares e sua codificação é feita pelo DNA
ribossômico (rDNA). Os genes ribossomais apresentam
regiões altamente conservadas entre as espécies, sendo
utilizados em estudos de evolução (WOESE & FOX,
1977), mas apresentam também regiões variáveis e essas
variações de nucleotídeos observadas entre as espécies
podem ser utilizadas na identificação de diferentes
microrganismos. A distinção de bactérias através de análise
genética pode solucionar problemas apresentados pelas
técnicas convencionais de taxonomia (SULLIVAN, 2000).
Uma adaptação da PCR é a reação de PCR
multiplex, esta permite que as reações de amplificação seja
9
menos laboriosas e mais rápidas, diversas sequências podem
ser amplificadas simultaneamente em uma mesma reação,
utilizando-se de mais de um par de primers. Para que a PCR
multiplex atinja a máxima eficiência é necessário otimizar as
condições da reação, as concentrações dos reagentes, a
temperatura de anelamento, bem como uma combinação
ótima entre esses fatores (MARKOULATOS et al., 2002).
Essa técnica possui alta sensibilidade além de possibilitar
amplificações múltiplas em uma única reação, o que a torna
altamente desejável para fins práticos (WOLFFS et al.,
2009).
Estudos utilizando a sequência do gene 16S rRNA
tem sido desenvolvidos com bactérias do rúmen (TAJIMA et
al., 1999, TAJIMA et al., 2000, WHITFORD at al., 1998)
entretanto para que seja possível o sucesso nas
identificações e quantificações desses microrganismos a
extração do DNA total do líquido ruminal é etapa
fundamental no processo, desta forma o objetivo desse
trabalho foi verificar a eficiência na identificação de
bactérias do rúmen de bovinos utilizando DNA extraído
diretamente do líquido ruminal fresco e conservado em
metanol,utilizandoumsistemamultiplex.
MATERIAL E MÉTODOS
Matéria-prima
Foi coletado líquido ruminal de bovino da raça
Holandesa e retirado uma alíquota de 15 mL do material
ainda fresco a qual foi centrifugada a 10.000 rpm por 2
minutos. Logo após, o sobrenadante foi vertido e adicionouse 50 mL de metanol. Em seguida, a amostra foi armazenada
em freezer a -20ºC.
A extração de DNA foi realizada segundo o
protocolo proposto por Boom et al. (1990), para as amostras
frescas (recém coletadas) e conservadas em metanol.
Inicialmente 50 µL de líquido ruminal foram lavados em
200 µL de TE, em seguida, centrifugados a 8.000 rpm por 2
minutos. 20 µL da suspensão de bactérias foram retirados
para a extração de DNA. Para lise celular foram utilizados
1.000 µl de tampão L6 (120g de Isoticianato, 100 mL de Tris
HCl (0,1M e pH 6,4), 22 mL de EDTA (0,2M e pH 8,0) e 2,6
mL de Triton X100, juntamente com 20 µL de sílica e 20 µL
de amostra. A amostra foi agitada em vórtex por 10 minutos
e em seguida centrifugada a 14.000 rpm, por 30 segundos. O
sobrenadante foi descartado. O pellet de sílica foi lavado
com 500 µL de tampão L2 (120g de Isoticianato, 100 mL de
Tris HCl (0,1M e pH 6,4)), misturado em vórtex e
centrifugado a 14.000 rpm, durante 30 segundos, a lavagem
DEL VESCO et al. , Acta Tecnológica, Vol. 7, N° 2 (2012)
lavagem com L2 foi realizada 2 vezes. Posteriormente
foram realizadas duas lavagens com etanol 70% gelado.
Para finalizar procedeu-se uma lavagem com acetona
absoluta, no qual 1.000 µL de acetona gelada foram
adicionadas a amostra, seguida de agitação vigorosa e
centrifugação a 14.000 rpm, por 30 segundos, o
sobrenadante foi descartado. A amostra foi deixada em
37°C durante 10 minutos para secagem da sílica. Em
seguida foram adicionados 80 µL de água ultra-pura,
agitou-se vigorosamente e deixou-se em banho-seco a
56°C, por 15 minutos. Logo após centrifugou-se as
amostras a 14.000 rpm, por 2 minutos e recuperou-se 40
µL do sobrenadante.
Para a detecção das bacterias, Fibrobacter
succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Streptococcus
bovis, Prevotella ruminicola, Eubacterium ruminantium e
Anaerovibrio lipolytica foram utilizados primers proposto
por Tajima et al. (2001) (Tabela 1). O volume total de
reação foi de 15 µL, contendo concentrações variadas de
MgCl2 e Primers, (Tabela 2), o programa de amplificação
foi o mesmo para todos os primers, mudando apenas a
temperatura de anelamento. As condições da PCR foram de
uma etapa inicial a 95°C por 3 minutos, seguido de 35
ciclos, de 95°C por 30 segundos, anelamento por 30
segundos, variando a temperatura de anelamento de cada
primer e extensão de 72°C por 30 segundos, seguido de
uma extensão final de 72°C por 1 minuto.
As concentrações dos reagentes nas reações de
PCR variaram para cada primer (Tabela 2), sendo que os
primers de Fibrobacter succinogenes e Ruminococcus
flavefaciens foram utilizados em sistema multiplex, e os
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demais primers utilizados emsistemaPCRconvencional.
Após as reações de amplificações as amostras
foram visualizadas em gel de agarose 2% corado com
Brometo de Etídeo.
RESULTADO E DISCUSSÃO
Os primers utilizados para amplificar uma região
menos conservada do gene 16S rRNA nas bactérias
Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens,
Streptococcus bovis, Prevotella ruminicola, Eubacterium
ruminantium e Anaerovibrio lipolytica, se mostraram
específicos para os estudos de identificação como
encontrado por Tajima et al. (2001). O conjunto de primers
produziu produtos de PCR de tamanho esperado para as
bactérias em estudo, sendo respectivamente 445 pb para F.
succinogenes, 835 pb para R. flavefaciens , 869 pb para S.
bovis, 485 pb para P. ruminicola, 681 pb para E.
ruminantium
e 597 pb para A. lipolytica.
As bactérias selecionadas para este estudo foram
utilizadas para avaliar a eficiência na identificação de DNA
bacteriano extraído de amostras de líquido ruminal fresco e
conservado em metanol, utilizando um sistema de PCR
multiplex. O sistema de PCR convencional mostrou-se
eficiente apresentando resultado positivo nas reações de
amplificação do DNA. A mesma eficiência também foi
observada neste trabalho utilizando o sistema multiplex para
as bactérias cujos fragmentos apresentavam tamanhos
diferentes, e temperaturas de anelamento semelhantes
(Figura
1).
Tabela 1. Primers utilizados para amplificação, temperaturas de anelamento e tamanho de fragmento.
Tabela 2. Concentrações de reagentes utilizados nas reações de PCR, para cada primer utilizado.
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sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus
and Bos indicus embryos. Theriogenology, Maryland
Heights,
v.59,
n.5,
p.1415-1419,
2003.
DEL VESCO et al. , Acta Tecnológica, Vol. 7, N° 2 (2012)
Figura 1. Gel de agarose. Canaleta 1: Padrão de 100 pb. Canaleta 2 e 3:
Multiplex Primer (Primer Fibrobacter succinogenes, 445 pb e Primer
Ruminococcus flavefaciens, 835 pb). Canaleta 4 e 5: Primer
Streptococcus bovis, 869 pb. Canaleta 6 e 7: Primer Prevotella
ruminicola, 485 pb. Canaleta 8 e 9: Primer Eubacterium ruminantium, 671
pb. Canaleta 10 e 11: Primer Anaerovibrio lipolytica, 597 pb.
A maioria dos estudos de identificação de
bactérias ruminal vem de estudos de culturas, o que muitas
vezes dificulta sua correta identificação, uma vez que
apenas uma pequena fração da diversidade microbiana
ruminal pode ser identificada por métodos tradicionais
(AMANN et al, 1995). O uso te técnicas moleculares
baseada na amplificação do gene que codifica o RNA
ribossômico (16S rRNA), tem confirmado que a população
microbiana do rúmen pode estar sendo subestimada e a
utilização do 16S rRNA pode ser uma ferramenta poderosa
na classificação e identificação desses microrganismos
(WEIDONG et al, 2007). O uso da técnica de PCR para
análise das variações do gene 16S rRNA trouxe grande
progresso a esses estudos, permitindo resultados com maior
confiabilidade. A PCR multiplex para análise do gene 16S
rRNA utilizada juntamente com o método tradicional de
cultura, pode contribuir para o diagnostico rápido e preciso
na identificação de bactérias (KIN et al., 2010).
CONCLUSÃO
O armazenamento de líquido ruminal de bactérias
no metanol mostrou-se eficiente na conservação das
bactérias, pois permitiu a extração e amplificação da região
do DNA bacteriano tanto pelo sistema de PCR
convencional quanto pelo sistema PCR multiplex. A
amplificação via PCR do gene 16S rRNA foi capaz de
identificar as bactérias ruminais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, B.C.A.; HOSSEPIAN DE LIMA, V.F.M.;
TEIXEIRA, C.M. et al. Use of primers from a new
AMANN, R.I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K.H.
Phylogenetic identification and in situ detection of
individual microbial cells without cultivation.
Microbiological Reviews, Washington, v.59, p.143-169,
1995.
BOOM, R.; SOL, C.J.A.; SALIMANS, M.M.M. et al. Rapid
and simple method for purification of nucleic acids. J Clin
Microbiol., Washington, v.28, n.3, p.459-503, 1990.
GREBEN, H.; SIGAMA, J. The effect of adapting cellulose
degrading microorganisms to 25 degrees C providing energy
sources for biological sulphate removal. Water Sci. Technol.,
London,
v.60,
n.7,
p.1711-1719,
2009.
GRIFFITHS, R.I.; WHITELEY, A.S.; DONNELL, A.G.O.
et al. Rapid Method for Coextraction of DNA and RNA
from Natural Environments for Analysis of Ribosomal
DNAand rRNA-Based Microbial Community Composition.
Applied and Environmental MIcrobiology,Washington, v.66,
n.12, p.5488-5497, 2000.
JOHNSON, M.C.; DEVINE, A.A.; ELLIS, J.C. et al. Effects
of antibiotics and oil on microbial profiles and fermentation
in mixed cultures of ruminal microorganisms. J. Dairy Sci.,
Champaign, v.92, n.9, p.4467-4480, 2009.
KAMRA, D.N. Rumen microbial ecosystem. Current
Science, Bangalore, v.89, n.1, p. 124-134, 2005.
KIN, H.; KIN, J.; IHM, C. The usefulness of multiplex PCR
for the identification of bacteria in joint infection. J. Clin.
Lab. Anal., Washington, v.24, n.3, p.175-181, 2010.
LETTAT, A.; NOZIERE, P.; SILBERBERG, M. et al.
Experimental feed-induction of ruminal lactic, propionic, or
butyric acidosis in sheep. J. Anim. Sci., Champaign, v.88,
p.3041-3046,
2010.
MARKOULATOS, P.; SIAFAKAS, N.; MONCANY, M.
Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach.
J. Clin. Lab. Anal., Washington, v.16, p.47-51, 2002.
SULIVAN, D.J. Methods for Analysis of the Intestinal
Microflora. Curr. Issues Intest. Microbiol., Reading, v.1, n.2,
p.39-50,
2000.
DEL VESCO et al. , Acta Tecnológica, Vol. 7, N° 2 (2012)
TAJIMA, K.; AMINOV, R.I.; NAGAMINE, T. Rumen
bacterial diversity as determined by sequence analysis of
16S rDNA libraries. FEMS Microbiology Ecology,
Reading,v.29,p.159-169,1 999.
TAJIMA, K.; ARAI, S.; OGATA, K. Rumen bacterial
community transition during adaptation to high-grain diet.
Anaerobe, Los Angeles, v.6, p.273-284, 2000.
TAJIMA, K.; AMINOV, R.I.; NAGAMINE, T. DietDependent Shifts in the Bacterial Population of the Rúmen
Revealed with Real-Time PCR. Applied and Envonmental
Microbiology, Washington, v.67, n.6, p.2766-2774, 2001.
TEIXEIRA, J.C. Nutrição dos ruminantes. Lavras:
ESALQ/FAEPE,
1991.
WANAPAT, M. Rumen Manipulation to Increase the
Efficient Use of Local Feed Resources and Productivity of
Ruminants in the Tropics. Asian-Aus. J. Anim. Sci., Seoul,
v.13, p.59-67, 2000.
WEIDONG, D.; DONGMEI, X.; HUAMING, M. et al.
The use of molecular techniques based on ribosomal RNA
andDNA for rumen microbial ecosystem studies: a review.
Molecular Biology Reports, Basel, v.35, n.2, p.265-274,
2007.
WHITFORD, M.F.; FORSTER, R.J.; BEARD, E. et al.
Phylogenetic analysis of rumen bacteria by comparative
sequence analysis of cloned 16S rRNA genes. Anaerobe,
Los
Angeles,
v.4,
p.153-163,
1998.
WOESE, C.R.; FOX, G.E. Phylogenetic structure of the
prokaryotic domain: The primary kingdoms. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., Washington, v.74, n.11, p.5088-5090,
1977.
WOLFFS, P.F.G.; VINK, C.; KEIJDENER, J. et al.
Evaluation of MeningoFinder, a Novel Multiplex LigationDependent Probe Amplification Assay for Simultaneous
Detection of Six Virus Species Causing Central Nervous
System Infections. Journal of Clinical Microbiology,
Washington, v.47, n.8, p.2620-2622, 2009.
YU, C.W.; CHEN, Y.S.; CHENG, Y.H. et al. Effects of
fumarate on ruminal ammonia accumulation and fiber
digestion in vitro and nutrient utilization in dairy does. J.
Dairy Sci., Champaign, v.93, n.2, p.701-710, 2010.
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