Karinne Evaristo de Deus - Programa de Pós
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) EM PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS SOB DEFICIÊNCIA HÍDRICA KARINNE EVARISTO DE DEUS GOIÂNIA – GO 2014 KARINNE EVARISTO DE DEUS ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) EM PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS SOB DEFICIÊNCIA HÍDRICA Dissertação apresentada à coordenação ao Programa de Pós-Graduação em Biologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como requisito para obtenção do título de Mestre em Biologia. Orientadora: Dra. Rosana Pereira Vianello Coorientadora: Dra. Anna Cristina Lanna Coorientador: Dr. Claudio Brondani GOIÂNIA - GO 2014 DEDICATÓRIA Ao meu esposo Paollo, por ter permanecido ao meu lado, me apoiando a percorrer este caminho, por compartilhar dúvidas e angústias estendendo sua mão amiga nos momentos mais difíceis. “Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir.” Cora Coralina AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela sua grandeza, pelo seu amor incondicional, pelo carinho, pelo cuidado com minha família, por nunca desistir de mim e por me amparar em meus momentos difíceis. Aos meus familiares, principalmente meus pais e avós, pelo apoio, paciência e compreensão nos momentos de ausência. Ao Centro Nacional de Pesquisa Arroz e Feijão – (Embrapa Arroz e Feijão) por disponibilizar a estrutura física, reagentes e material biológico para a realização dessa pesquisa e, a todos os funcionáriospelo companheirismo e prestatividade. A Capes agradeço a concessão da bolsa de estudos. Agradeço ao pesquisador Dr. Alexandre Bryan pela primeira oportunidade de estágio na Embrapa, e pelo apoio e contribuição intelectual desde então. À Dra. Rosana Pereira Vianello e Dr. Claudio Brondani aos conselhos e orientações. À Dra. Anna Cristina Lanna pelos conselhos, apoio, disponibilidade, paciência e orientação desde o primeiro dia em que cheguei ao laboratório de Biotecnologia da Embrapa Arroz e Feijão. Agradeço aos colegas de laboratório estagiários e bolsistas, em especial à Fernanda Raquel e Wendell Jacinto pelo apoio, paciência, companhia e por dividir momentos tristes e alegres durante esses dois anos. Agradeço, especialmente, ao meu esposo Paollo, pela paciência e compreensão nos momentos de angústia, desespero, ausência; por ser um grande companheiro, amigo, cúmplice, meu grande amor. A todos que de alguma forma contribuíram para a realização dessa pesquisa, muito obrigada! SUMÁRIO RESUMO ........................................................................................................................................13 ABSTRACT ....................................................................................................................................14 1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...............................................................................................15 1.1 CULTURA DO ARROZ (Oryza sativa L.)...........................................................................15 1.2 DÉFICIT HÍDRICO E SUAS CONSEQUÊNCIAS PARA A RIZICULTURA ....................17 1.3 ESTRESSE OXIDATIVO.....................................................................................................18 1.4 SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) ..................................................................................23 1.5 GENES EXPRESSOS EM CONDIÇÕES DE DÉFICIT HÍDRICO ..................................24 1.6 ANÁLISE DE GENES-ALVOS VIA PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL (qPCR) 26 1.7 ANÁLISE DO TRANSCRITOMA COM ÊNFASE EM ENZIMAS DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO ........................................................................................................................29 2. OBJETIVOS ...............................................................................................................................31 2.1 OBJETIVO GERAL ..............................................................................................................31 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...............................................................................................31 5. CAPÍTULO 1 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES DA SUPEROXIDO DISMUTASE (SOD) EM ARROZ DE TERRAS ALTAS SOB DÉFICIT HÍDRICO .................................................................................32 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................32 2. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................................35 2.1 MATERIAL VEGETAL .....................................................................................................35 2.2 EXPERIMENTO DE RESTRIÇÃO HÍDRICA .................................................................36 2.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE SOD .................................................................37 2.4 EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL E SÍNTESE DE cDNA ...................................................38 2.5 IDENTIFICAÇÃO DA SOD E DESENHO DE PRIMERS .............................................39 2.6 EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL .........................................................................40 2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................40 3. RESULTADOS .......................................................................................................................42 3.1 EXPERIMENTO DE RESTRIÇÃO HÍDRICA .................................................................42 3.2 IDENTIFICAÇÃO DE GENES E DESENHO DE PRIMERS ........................................43 3.3 QUALIDADE DAS AMOSTRAS DE RNAs E cDNAs....................................................43 3.4 AJUSTE DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO E CURVA DE DISSOCIAÇÃO ...44 3.5 EFICIÊNCIA DA qPCR ....................................................................................................49 3.6 TECIDO FOLIAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO VEGETATIVO .........................................................................................................................50 3.6.1 ATIVIDADE DA SOD ....................................................................................................50 3.6.2 EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD .................................................................................51 3.6.3 RELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA ..............52 3.7 TECIDO FOLIAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO REPRODUTIVO .....................................................................................................................55 3.8TECIDO RADICULAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO VEGETATIVO .........................................................................................................................58 3.8.1 ATIVIDADE DA SOD ....................................................................................................58 3.8.2EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD ..................................................................................58 3.8.3 RELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA ..............59 3.9 TECIDO RADICULAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO REPRODUTIVO....................................................................................................61 3.9.1 ATIVIDADE DA SOD ....................................................................................................61 3.9.2 EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD .................................................................................61 3.9.2 RELAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA ......................62 4. ANÁLISE DE CORRELAÇÃO LINEAR DE PEARSON ....................................................64 5. DISCUSSÃO ..........................................................................................................................65 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................................70 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................71 ANEXO ...........................................................................................................................................86 APÊNDICE .....................................................................................................................................88 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACT APXs ASA BSA bZIP CAT cDNA DAE DEPC DH DHAR DNA DREB EC EDTA eEf-1α EROs GAPDH GRs GSH IP MAPA MAPK MDHAR NBT PCR PEG POXs PVP qPCR r RGAP RIN RNA RQ SDS SOD TAE UDG UN Actin Peroxidase do Ascorbato Ascorbato Albumina Sérica Bovina Basic RegionLeucineZiper Enzima Catalase DNA complementar Dias Após a Emergência diethyldicarbonate Dficiência Hídrica Dehydroascorbatereductase Ácido Desoxirribonucleico Dehydration Responsive Element Binding Protein Enzyme Comisson Ethylenediaminetetraacetic acid Elongation Factor 1 - alpha Espécies Reativas de Oxigênio Gliceraldeído-3-fosfato Peroxidase da Glutationa Glutationa Índice de Produtividade Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Mitogen-activated protein kinases Monodehydroascorbate reductase Azul de Nitrotetrazólio Reação em Cadeia da Polimerase Polietilenoglicol Peroxidases Polivinilpirrolidona Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa Coeficiente de Correlação Linear de Pearson Rice GenomeAnnotation Project Número de avaliação da integridade do RNA Ácido Ribonucleico Quantificação Relativa SequenceDetection Software Enzima Superóxido Dismutase Tampão Tris-Acetato EDTA Uracil DNA Glicosilase Unidade LISTA DE FIGURAS Figura 1- Produção e destruição de espécies reativas de oxigênio (EROs) e suas vias de regulação em células vegetais. ..................................................................... 21 Figura 2- Genes envolvidos na rota metabólica para remoção do radical superóxido em arroz (O. sativa). Setas vermelhas indicam as isoenzimas que estão entre colchetes nos respectivos transcritos ........................................................................ 23 Figura 3- Ciclos de deficiência hídrica (DH) em função das fases fenológicas, expressas em função de Dias Após Emergência (DAE), de duas cultivares de arroz de terras altas, (a) Douradão (b) BRS Primavera. ..................................................... 42 Figura 4- Curvas de melting (60°C a 95°C), utilizando a concentração de 50 nM para todos pares de primers, após 40 ciclos de PCR utilizados para verificar especificidade da amplificação dos primers desenvolvidos para estudo de expressão gênica em plantas de arroz de terras altas. (A) LOC_Os06g05110_A; (B) LOC_Os06g05110_B; (C) LOC_Os06g05110_C; (D) LOC_Os03g11960_A; (E) LOC_Os03g11960_B; (F) LOC_Os03g11960_C; (G) LOC_Os08g44770_A; (H) LOC_Os08g44770_B; (I) LOC_Os08g44770_C; (J) LOC_Os06g02500_A; (K) LOC_Os06g02500_B; (L) LOC_Os06g02500_C; (M) LOC_Os04g48410_A (N) LOC_ Os04g48410_B; (O) LOC_ Os04g48410_C; (P) LOC_Os07g46990_A; (Q) LOC_Os07g46990_B; (R) LOC_Os07g46990_C; (S) LOC_Os03g22810_A; (T) LOC_Os03g22810_B; (U) LOC_Os03g22810_C; (V) LOC_Os05g25850_A; (W) LOC_Os05g25850_B; (X) LOC_Os05g25850_C. ............................................. 45 e 46 Figura 5- Curvas de melting (60°C a 95°C), utilizando a concentração de 25 nM para 7 pares de primers, após 40 ciclos de PCR utilizados para verificar especificidade da amplificação dos primers desenvolvidos para estudo de expressão gênica em plantas de arroz de terras altas. (A) LOC_Os03g11960_C; (B) LOC_Os08g44770_C; (C) LOC_Os06g02500_C; (D) LOC_Os04g48410_C; (E) LOC_Os07g46990_B; (F) LOC_Os05g25850_B; (G) LOC_Os03g22810_C. ..................................................... 47 Figura 6- Curvas de melting (60ºC a 95ºC) após 40 ciclos de PCR dos primers utilizados para análise de expressão gênica em qPCR. A presença de um único pico nas amostras e nenhum pico na água (controle negativo) indica ocorrência de amplificação específica de cada alvo. ....................................................................... 48 Figura 7- Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos foliares de arroz de terras altas no estádio vegetativo (Época 1). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT, eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3).............. 54 Figura 8- Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos foliares de arroz de terras altas no estádio reprodutivo (Época 2). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT, eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). ........................................................................................................................ 57 Figura 9- Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos radiculares de arroz de terras altas no estádio vegetativo (Época 1). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT,eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). ........................................................................................................................ 60 Figura 10- Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos radiculares de arroz de terras altas no estádio reprodutivo (Época 2). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT, eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). ........................................................................................................................ 63 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Isoformas de SOD selecionados para avaliação da expressão gênica em plantas de arroz de terras altas em condições de seca............................................. 49 Tabela 2- Concentração de cada primer (forwarde reverse), valores de eficiência e valores de R2, obtidos a partir da construção de gráficos de CT versus valores de log (base 2) das concentrações iniciais de template – concentrações referem-se às diluições seriadas de cDNA....................................................................................... 50 Tabela 3- Atividade de SOD e significância estatística por grupo em amostras de folhas e raízes de genótipos de arroz de terras altas submetidas à restrição hídrica, em dois estádios de desenvolvimento. ...................................................................... 51 Tabela 4- Valores de RQ e significância estatística por grupo para os genes de SOD em amostras de folhas e raízes de genótipos de arroz de terras altas submetidas à restrição hídrica em dois estádios de desenvolvimento, utilizando os genes de referência ACT, eEF1-α e GAPDH. ........................................................................... 53 Tabela 5- Resumo da expressão dos genes SOD em plantas de arroz de terras altas sob estresse de seca em dois estádios de desenvolvimento vegetativo e reprodutivo e em dois tecidos, folha e raiz. ............................................................... 71 RESUMO A seca é uma das principais causas para redução da produtividade na cultura do arroz de terras altas em muitas regiões agrícolas do mundo. Uma das consequências da seca é a produção, em excesso, de espécies reativas de oxigênio (EROs), podendo causar uma série de danos oxidativos a diversas biomoléculas com consequente morte celular. Com a função de proteger estruturas e funcionamento das células dos efeitos prejudiciais das EROs, um complexo sistema antioxidativo é ativado nas plantas. Esse sistema é constituído de: (1) lipídeos solúveis e tocoferóis associados à membrana; (2) compostos redutores solúveis em água, tais como ascorbato (ASA) e glutationa (GSH), e (3) enzimas antioxidativas, sendo a superóxido dismutase (SOD) considerada como uma das principais enzimas do sistema de defesa antioxidativo. O presente estudo teve como objetivo avaliar a SOD, em nível de atividade via método espectrofotométrico e em nível de expressão gênica via qPCR, em dois genótipos de arroz de terras altas (Oryza sativa japonica), Douradão e BRS Primavera, com características contrastantes para tolerância à deficiência hídrica, contemplando parte aérea e tecido radicular, dois estádios de desenvolvimento das plantas (vegetativo e reprodutivo), cultivadas sob condição hídrica ótima e de deficiência hídrica (100 % e 50 % de água nos vasos), respectivamente. Os resultados revelaram um padrão diferencial de atividade da SOD nos diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento nos genótipos tolerante e sensível, sendo que para o genótipo tolerante essa atividade foi aumentada somente em tecido foliar fase vegetativa e radicular fase reprodutiva, enquanto no sensível foi foliar e radicular estádio reprodutivo. Quanto à expressão gênica, também observou um padrão bastante diferenciado de regulação nos genótipos tolerante e sensível. Os genes Cu/ZnSOD1, Cu/ZnSOD4 e MnSOD apresentaram expressão significativamente (p ≤ 0,05) aumentada no tolerante, sendo o primeiro em folhas e raízes do estádio reprodutivo, o segundo estádio vegetativo somente em folhas e para o terceiro gene nos dois tecidos e estádios de desenvolvimento da planta. Já para o genótipo sensível somente o gene FeSOD1 apresentou destaque com aumento da expressão em raízes no estádio reprodutivo. Certamente, os diferentes padrões de indução em nível de atividade e/ou expressão gênica da SOD, em plantas de arroz de terras altas, devem ser fortemente considerados para elucidar os mecanismos celulares de tolerância à seca, objetivando subsidiar programas de melhoramento para desenvolvimento de cultivares mais eficiente e mais bem adaptada às áreas propensas à deficiência hídrica. Palavras-chave: Oryza sativa, estresse de seca, estresse oxidativo; expressão gênica, expressão enzimática. ABSTRACT Drought is a major cause for reduced productivity in the cultivation of upland rice farming in many regions of the world. One of the consequences of the drought is the production in excess of reactive oxygen species (ROS), causing a series of oxidative damage to various biomolecules with subsequent cell death.With the function of protecting structures and functioning of cells from the damaging effects of ROS, a complex antioxidant system is activated in plants. This system consists of: (1) lipid soluble membrane-associated and tocopherols; (2) reducing water soluble compounds such as ascorbate (ASA) and glutathione (GSH) and (3) antioxidative enzymes, and superoxide dismutase (SOD) considered as a major enzymes of the antioxidant defense system.The present study aimed to evaluate the SOD in activity level via spectrophotometric method and level of gene expression via qPCR in two genotypes of upland rice (Oryza sativa japonica),Douradão and BRS Primavera, with contrasting for drought tolerance characteristics, watching the leaf and root tissue, two stages of plant development (vegetative and reproductive), grown under optimal water conditions and water deficit (100% and 50% water in the vessels), respectively. The results revealed a differential pattern of SOD activity in different tissues and developmental stages in tolerant and sensitive genotypes, and for the tolerant genotype that activity was increased only in leaf / root and vegetative/reproductive tissue, as was sensitive the leaf / reproductive and reproductive/ root. Regarding gene expression, we also observed a very different pattern of regulation in tolerant and sensitive genotypes. The CuZnSOD1, CuZnSOD4, and MnSOD genes, expression was significantly (p≤ 0.05) increased in the tolerant, the first in leaves and roots off the reproductive stage, the second vegetative stage only in leaves and the third gene in the two tissues and plant developmental stages. As for the sensitive only FeSOD1 gene had highlighted with increased expression in roots at the reproductive stage. Certainly, the different patterns of induction level of activity and / or gene expression of SOD in plants of upland rice, should be strongly considered to elucidate the cellular mechanisms of drought tolerance, aiming to support improvement programs to develop cultivars more efficient and better suited to prone areas with water deficiency. Keywords: Oryza sativa, drought stress, oxidative stress, gene expression, enzyme expression. 15 1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 1.1 CULTURA DO ARROZ (Oryza sativa L.) O arroz (Oryza sativa L.) pertence à família Poaceae (gramíneas), a qual inclui mais de 5.000 espécies, um dos cereais mais produzidos e consumidos em todos os continentes (USDA, 2009; Walter et al., 2010). O arroz faz parte da dieta básica de, aproximadamente, metade da população mundial, sendo considerado um cereal importante para a alimentação humana, pois é consumido diariamente e possui características nutricionais atrativas, capaz de suprir 20% de energia devido ao seu alto teor de amido e 15% das proteínas necessárias diariamente a um adulto; além de conter vitaminas, sais minerais, fósforo, cálcio e ferro, que estão ligadas diretamente com a saúde da população (Luzzardi et al., 2005; Rabello et al., 2008; Walter et al., 2010; Hadiarto e Tran, 2011), caracterizando uma commodity de alto valor econômico e social. Atualmente, aproximadamente, 165 milhões de hectares de arroz são cultivados anualmente em todo mundo, chegando a uma produção de cerca de 720 milhões de toneladas (FAOSTAT, 2013) com adaptação a diferentes condições de solo e clima. O Brasil figura entre os dez principais produtores mundiais desse cereal, com mais de 2 milhões de hectares de arroz cultivados e mais de 11 milhões de toneladas ao ano (FAOSTAT, 2013). Para os cereais, estima-se que cerca de 20% da área plantada no Brasil seja afetada pela seca, resultando em uma perda na produção de mais de 23,7 milhões de toneladas, sendo que em anos e locais específicos, pode-se chegar à perda quase total da produção (Guimarães et al., 2008). No Brasil, há dois grandes ecossistemas para o cultivo do arroz, denominados de várzeas, em que se cultiva o arroz com irrigação por inundação controlada, e de terras altas, que considera o cultivo em sequeiro, isto é, dependente de precipitações pluviais (Guimarães et al., 2006). A espécie Oryza sativa é originária da Ásia e está amplamente dispersa por todas as regiões tropicais e temperadas do mundo. Com o processo evolutivo e de domesticação em que foi submetida essa espécie, surgiram duas subespécies, os quais foram se adaptando às mais variadas condições agroecológicas, estando à espécie subdividida em 16 japonica e indica, em que a maioria das variedades de terras altas é japonica e a de várzeas, indica (Khush, 1997). Grande parte das lavouras de arroz de terras altas do Brasil está localizada nas regiões de cerrado que se concentram, principalmente, na região Centro-Oeste compreendendo os estados de Mato Grosso e Goiás, onde há predomínio dos latossolos com boas características físicas (Guimarães et al., 2006), região Norte, Estados do Tocantins, Roraima e Pará e região Nordeste, Estado do Maranhão. Segundo Guimarães et al. (2006), a maior produção de arroz é procedente do ecossistema de várzeas, que compreende 69% da produção nacional, sendo considerado o cultivo que equilibra a safra nacional por não depender de condições climáticas. A participação do sistema de cultivo de arroz de terras altas na produção nacional de grãos no ano de 2012 foi de apenas 14% de um total de 11,4 milhões de toneladas, ocupando uma área plantada de 1,1 milhão de hectares (EMBRAPA, 2013). Como o cultivo do arroz de terras altas ocorre em condições não irrigadas, sua produção, principalmente, na Região Centro-Oeste, ocorre entre os meses de outubro a maio para haver sincronia com a estação chuvosa (Lanna et al., 2012). Entretanto, observa-se nessa época a ocorrência de períodos de estiagem de até três semanas, denominados veranicos (períodos de deficiência hídrica), tal fenômeno, devido ao déficit hídrico, causa modificações bioquímicas e fisiológicas nas plantas que comprometem funções essenciais ligadas à produção, promovendo perdas e prejuízos (Guan et al., 2010; Gowda et al., 2011; Serraj et al., 2011; Ji et al., 2012; Shi et al., 2012; Shaoo et al., 2013). De acordo com Heinemann et al. (2008), a instabilidade de produção do arroz de terras altas está associada a heterogeneidade dos ambientes que compõem sua área de produção, em que os principais fatores limitantes são a água disponível no solo e a acidez inerente dos solos dos cerrados brasileiros. Visando alcançar alta produtividade e qualidade, as variedades utilizadas em sistemas de terras altas têm sido submetidas a estudos para melhorar características de rusticidade e tolerância à seca. Hayashi et al. (2007) constataram a importância da avaliação da fenologia da cultura, sendo considerado as interações genótipo/ambiente nos estudos de tolerância à seca. Dessa forma, as expressões gênicas poderiam estar ligadas a estímulos bioquímicos internos, desencadeados pela interação dos genes com condições ambientais de adversidade, que resultaria 17 como, por exemplo, na menor produção de grãos, infertilidade de perfilhos, dentre outros. Desse modo, faz-se necessário um maior entendimento dos mecanismos da planta envolvidos na maior adaptação da mesma às condições de déficit hídrico com o objetivo principal de minimizar as perdas de produção decorrentes desse tipo de estresse. 1.2 DÉFICIT HÍDRICO E SUAS CONSEQUÊNCIAS PARA A RIZICULTURA O arroz é uma cultura bastante vulnerável às condições adversas como seca, salinidade, temperaturas extremas, deficiência de nutrientes que, em conjunto, ou isoladamente exercem um grande impacto sobre o seu rendimento (Steinmetz et al., 2006; Morison et al., 2007; Roy et al., 2011). Diante desse cenário, a agricultura moderna tem como um dos principais desafios atender a demanda por alimentos para uma população crescente, estimada em 9 bilhões de pessoas até 2050 (FAO, 2009), e desenvolver materiais adaptados às condições ambientais adversas que, atualmente, estão acentuadas devido ao efeito do aquecimento global (Boréme Ramalho, 2011; Cavatte et al., 2011; Roy et al., 2011). Segundo Souza et al. (2001), dentre todos os recursos que a planta precisa para o seu adequado crescimento e desenvolvimento, a água é o mais limitante para a produtividade agrícola, por ser essencial a diversos processos metabólicos das plantas. Segundo Bohnert e Jensen (1996), a indisponibilidade de água, pode ser devido à (i) temperaturas excessivamente altas, que aumentam a demanda evapotranspiratória do ambiente de cultivo; (ii) temperaturas excessivamente baixas, pelo congelamento e, consequentemente, indisponibilização da água; (iii) salinidade dos solos, que prejudica o equilíbrio osmótico; ou (iv) escassez de água propriamente dita. Diversos estudos têm sido conduzidos no sentido de aumentar a eficiência do sistema de cultivo do arroz sob condições de déficit hídrico (Gowdaet al., 2011; Serraj et al., 2011; Shi et al., 2012). A severidade e a frequência com que o estresse é imposto afetam vários órgãos e tecidos das plantas, sendo que a planta pode apresentar diferentes níveis de resposta dependendo do estádio de seu desenvolvimento (Fritsche-Neto et al., 2011). Para a cultura do arroz de terras altas, sob condições de deficiência hídrica, observa-se redução no número de grãos 18 cheios por panícula e no seu peso, no rendimento da matéria seca, na altura da planta e no índice de colheita (Stone, 1986), sendo que fatores como período em que a planta é submetida a estresse, duração do estresse e outras condições ambientais podem interferir no desempenho da planta quanto à produção. A seca é um complexo processo físico-químico em que muitas macromoléculas e pequenas moléculas estão envolvidas, tais como ácidos nucleicos (DNA, RNA, microRNA), enzimas, lipídios, hormônios e radicais livres (Foyer e Noctor, 2005; Ni et al., 2009). Segundo Kumar et al. (2011), a resposta à seca envolve uma rede complexa de transdução de sinal, a qual é frequentemente mediada por espécies reativas de oxigênio (EROs). Goldack et al. (2011) e Huang et al. (2012) relataram em seus estudos que muitas ações de pesquisas estão focadas em esclarecer tanto os mecanismos fisiológicos (ajustamento osmótico e desenvolvimento do sistema radicular, por exemplo) quanto os mecanismos genéticos (vias de transdução de sinais e regulação da expressão de genes) relacionados a tolerância à deficiência hídrica. Assim, estudos fisiológicos, bioquímicos e genéticos têm importância crucial para avançar no desenvolvimento de novos genótipos de plantas mais tolerantes a períodos intermitentes ou prolongados de déficit hídrico e, consequentemente, o desenvolvimento global da agricultura. Esse tema é uma das prioridades de empresas de pesquisa agropecuária, já que a escassez de água vem se agravando devido às mudanças climáticas, decorrentes do fenômeno do aquecimento global (Cavatte et al., 2011). 1.3 ESTRESSE OXIDATIVO Quando ocorre o déficit hídrico, a fim de sobreviver às plantas utilizam um complexo redirecionamento do metabolismo, relacionado a distintos e, por vezes, complementares mecanismos morfológicos, fisiológicos e bioquímicos como enrolamento foliar, sinalização via ácido abscísico, fechamento de estômatos, redução das taxas fotossintéticas e transpiratórias, acúmulo de solutos, mudanças na composição de membranas, produção de metabólitos característicos e radicais livres, bem como alterações nas atividades de enzimas antioxidantes e suas expressões gênicas (Serraj et al., 2011; Tian et al., 2011; Aydin et al., 2013). O déficit hídrico é talvez a causa mais comum de perda de produtividade da cultura, entretanto a mais difícil de solucionar por causa da forte ligação entre 19 transpiração e fotossíntese. As plantas estão constantemente sujeitas a mudanças em seu ambiente, levando-as a alterar o seu metabolismo, a fim de manter o equilíbrio de estado estacionário entre a geração de energia e consumo. No entanto, este equilíbrio depende em grande parte a uma delicada rede de sinalização que coordena três dos principais processos críticos na vida da planta: fotossíntese, respiração no escuro e fotorrespiração (Foyer e Noctor 2009; Suzuki et al., 2012). O estresse hídrico pode limitar a fotossíntese e prejudicar a fixação de CO 2, levando a diminuição de CO2 intracelular após o fechamento dos estômatos, e assim aumentando a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) (Chaves et al., 2003; Taiz 2004).Como ainda não está totalmente entendido de que forma as plantas respondem a esse fator adverso do ambiente, várias evidências sugerem que as respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares podem ser atribuídas, em parte, ao dano oxidativo originário da formação, em excesso, de espécies reativas de oxigênio (EROs), definido como estresse oxidativo (Cho e Seo, 2005; Morita et al., 2011; Goswami et al., 2013; Ma et al., 2013). Estresse oxidativo, em todos os organismos aeróbicos, surge do desbalanço entre a geração e a destruição de espécies reativas de oxigênio (EROs) que é um termo coletivo, frequentemente usado para incluir não apenas radicais livres de oxigênio tais como: radical superóxido (O 2•-) e radical hidroxila (OH•), mas também alguns não radicais derivados do oxigênio capazes de gerar radicais livres, como por exemplo, oxigênio singlet (1O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (Salvador e Henriques, 2004; Scandalios, 2005; Soares e Machado, 2007; Goswami et al., 2013).Quimicamente, os radicais livres são átomos, moléculas ou íons altamente reativos e instáveis, o qual contém um elétron desemparelhado. É este não emparelhamento de elétrons que confere alta reatividade a esses átomos (Andrade et al., 2010).As EROs são espécies químicas, altamente reativas, e, na ausência de mecanismos protetivos, podem produzir danos na estrutura e função celular (Cho eSeo, 2005). A mais reativa das EROs é o radical OH• que é formado a partir do H2O2 pelas chamadas reações de Haber-Weiss ou de Fenton, as quais são intermediadas pelos catalisadores metálicos como Fe 2+ (Halliwell e Gutterridge, 1989; Chandru et al., 2003; Stangarlin et al., 2011). Sob condições adequadas de desenvolvimento, a produção de EROs na célula é baixa (240 mM s-1 O2- e um nível steady-state de 0,5 mM s-1 H2O2 nos cloroplastos), enquanto os diferentes tipos de estresse alteram a homeostase celular 20 acentuando sua produção (240 a 720 mM s -1 O2- e 5 a 15 mM de H2O2) (Mittler, 2002). Com a função de proteger a estrutura e o funcionamento das células dos efeitos prejudiciais das EROs, um complexo sistema antioxidativo é ativado nas plantas. Antioxidantes podem ser divididos em três classes: (1) lipídeos solúveis e tocoferóis associados à membrana; (2) compostos redutores solúveis em água tais como ascorbato e glutationa e (3) enzimas antioxidativas: superóxido dismutase (SOD), catalases (CAT), peroxidases (POXs), peroxidase do ascorbato (APXs), peroxidase da glutationa (GPXs) e glutationaredutase (GRs) (Lee e Lee, 2000; Cho e Seo, 2005;Morita et al., 2011). A distinta localização subcelular e propriedades bioquímicas das enzimas antioxidantes, seus diferentes padrões de indução em nível de atividade e/ou expressão gênica, e uma grande quantidade de eliminadores não-enzimáticos tornam o sistema antioxidante uma unidade muito flexível e versátil que pode controlar o acúmulo das EROs e promover a detoxificação das células (Del Rio et al., 2002; Vranová et al., 2002; Pyngrope et al., 2013). A célula apresenta algumas maneiras de proteção contra os efeitos deletérios das EROs: a prevenção, evitando a formação de radicais livres; a interceptação, por meio da ação neutralizadora de enzimas antioxidantes ou por moléculas de baixo peso molecular como vitaminas C e E, carotenóides, dentre outros; bem como o reparo, que minimizam seus efeitos (Henriques et al., 2001; Sharma, et al., 2012; Turan e Tripathy, 2013). Em seu estado fundamental, o oxigênio molecular (O 2) é, relativamente, não reativo. No entanto, sua presença marcante em organelas como cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos, em que ocorre alta atividade metabólica oxidativa, isto é, intenso fluxo de elétrons, há o favorecimento da formação de EROs (Scandalios, 2005; Ma et al., 2013). Em outras palavras, um dos produtos colaterais do metabolismo aeróbico são as EROs; e em contrapartida as células possuem um sistema de defesa antioxidante para equilibrar a produção e degradação dessas moléculas. Em situações de estresse, a produção de EROs é aumentada, consequentemente, o balanço entre a produção de EROs e as defesas antioxidantes determina o curso do processo: se o sistema de defesa antioxidante atuar eficientemente e/ou a produção de EROs se mantiver em níveis fisiologicamente controláveis, a homeostase é mantida; por outro lado, se a produção de EROs for excessiva e/ou atuação do sistema antioxidativo for ineficiente instala-se a condição denominada estresse oxidativo (Cho e Seo, 2005; Goswami et al., 2013). 21 Figura 1 – Produção e destruição de espécies reativas de oxigênio (EROs) e suas vias de regulação em células vegetais (Miller et al., 2010). A produção em excesso dessas moléculas pode inativar enzimas, como as superóxidos dismutases (Cu/Zn e Fe-SODs) e diversas enzimas do ciclo de Calvin (Bowler et al., 1994), induzir enzimas como catalases e peroxidases, provocar danos aos ácidos nucléicos e proteínas e promover a peroxidação de lipídeos (Neill et al., 2002). O citosol não é considerado grande fonte de EROs, mas atua como um depósito para essas moléculas derivadas de outros compartimentos subcelulares (Slesak et al., 2007). Como já descrito, o H2O2 pode causar danos oxidativos e, consequentemente, morte celular (apoptose); no entanto, é a molécula mais estável entre as EROs e, em nível basal, apresenta importante papel como molécula sinalizadora em vários processos fisiológicos, sendo considerado fator chave na mediação do fenômeno de aclimatação, através do qual uma exposição prévia a um estresse pode induzir tolerância as subsequentes exposições ao mesmo ou outro estresse (Sato et al., 2001; Neill et al., 2002; Halliwell, 2006; Gadjev et al., 2008; Ma et al., 2013). Como molécula sinalizadora, os processos induzidos pelo H 2O2 são: (i) contribuição no processo de reforço das paredes celulares, tanto por ligações 22 cruzadas entre glicoproteínas, ricas em hidroxiprolinas e prolina, à matriz de polissacarídeos quanto pelo aumento da taxa de lignificação por meio da atividade das peroxidases; (ii) fechamento estomático; (iii) biogênese de peroxissomos; (iv) expressão de genes relacionados a uma grande variedade de respostas ambientais, dentre outros. No processo de expressão de genes, uma alteração sutil na homeostase de EROs conduz a ativação/repressão de fatores de transcrição e, consequentemente, modificação na regulação da expressão de um conjunto de genes, como os codificantes de enzimas antioxidantes e de proteínas envolvidas na cascata de fosforilação, através da ativação de MAPK (mitogen- activatedproteinkinases) (Scandalios, 2002; Apel e Hirt, 2004; Kotchoni e Gachomo, 2006). Em termos moleculares, uma vez identificado pela célula, o sinal do estresse deve ativar uma rota de transdução que envia esta mensagem aos fatores de transcrição, que regulam a expressão dos genes encarregados da resposta ao estresse. A perda do volume e da turgescência celular, ou a concentração de solutos altera a conformação de proteínas da parede celular e da membrana plasmática, ativando rotas de transdução de sinais que dão lugar à expressão de determinados genes, transformando o fenômeno físico da deficiência hídrica em uma resposta bioquímica (Zhu et al., 1997; Shao et al., 2009; Ma et al., 2013). Segundo Saleh e Plieth (2009) e Giannakoula et al. (2010), a explosão oxidativa (oxidativeburst) é seguida por múltiplas respostas na transcrição, tradução, atividade de enzimas, alteração do metabolismo e morte programada de células. Dessa forma, esses autores mostraram que a tolerância aos estresses abióticos e, consequentemente, a robustez das plantas estão diretamente associados à eficiência do sistema de defesa antioxidativo celular. Entende-se como robustez de uma planta a habilidade da mesma em não somente enfrentar condições adversas do ambiente como também propagar-se e produzir em qualidade suficiente mesmo em condição ambiental não ideal. A identificação dos genes diferencialmente expressos, em plantas de arroz de terras altas submetidas à deficiência hídrica, e a correlação com os principais mecanismos de tolerância, com foco na rota do estresse oxidativo para subsidiar o entendimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares de tolerância à deficiência hídrica, é uma estratégia importante para o desenvolvimento de cultivares de arroz de terras altas mais tolerantes. 23 1.4 SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) Superóxido dismutase (SOD - EC 1.15.1.1) foi isolada pela primeira vez por Mann e Keilis (1938) a partir de células vermelhas do sangue, onde se pensava que era uma proteína de armazenamento de cobre. Subsequentemente, a enzima foi identificada por inúmeros nomes, oxidase indofenol, oxidase tetrazólio, até ser descoberta sua função catalítica por McCord e Fridovitch (1969). Atualmente, sabese que a SOD é uma metaloenzima, capaz de converter o radical superóxido (O 2•-) em O2 e H2O2queé menos reativo e pode ser degradado por outras enzimas, como por exemplo, a catalase (Salvador e Henriques, 2004).Os genes que codificam as SODs participam da rota metabólica para remoção do radical superóxido, juntamente com outros genes que codificam enzimas capazes de eliminar o produto tóxicodas SODs (H2O2), como, por exemplo, as catalases e ascorbato peroxidase. A Figura 2 mostra os genes envolvidos na remoção desse radical. LOC_Os03g22810.1 Cu/Zn-SOD LOC_Os05g25850.1 Mn-SOD LOC_Os06g05110.1 Fe-SOD LOC_Os02g02400.1 (CAT) LOC_Os03g17690.1 (APX1) LOC_Os03g03910.1 (CAT) LOC_Os04g14680.1 (APX3) LOC_Os06g51150.1 (CATB) Figura 2 – Genes envolvidos na rota metabólica para remoção do radical superóxido em arroz (O. sativa). Setas vermelhas indicam as isoenzimas que estão entre colchetes nos respectivos transcritos. Segundo Alscher e colaboradores (2002), dentro da célula, as SODs constituem a primeira linha de defesa contra as EROs. Como o radical O 2•- é produzido em qualquer localização intracelular onde exista transporte de elétrons, a ativação do O2 pode ocorrer em diferentes compartimentos celulares (Elstner, 1991; 24 Goswami et al., 2013; Molina-Rueda et al., 2013), incluindo mitocôndria, cloroplastos, peroxissomos, apoplasto e citosol. Todas as isoformas de SOD são nucleares, codificadas e direcionadas aos seus respectivos compartimentos subcelulares, quando necessário, por meio de sequências de direcionamento aminoterminal (Bowler et al., 1992; Gill e Tuteja 2010). As SODs são classificadas de acordo com seu cofator metálico e/ou sua localização subcelular: Fe-SOD, presente nos cloroplastos; Mn-SOD, presente nas mitocôndrias e peroxissomos e as Cu/ZnSODs, presentes nos cloroplastos, peroxissomos, citosol e, possivelmente, no espaço extracelular (Alscher et al., 2002; Cavalcanti, 2002; Jaleel et al., 2009). Segundo Bowler et al. (1992), a isoenzimas FeSOD é sensível ao peróxido de hidrogênio (H2O2), Cu/ZnSOD é sensível ao H2O2 e ao cianeto de potássio (KCN), enquanto a MnSOD é resistente a ambos. A reação geral da SOD pode ser descrita: 2𝑂2•− + 2𝐻 + → 𝐻2 𝑂2 + 𝑂2 Aparentemente, cada uma das isoenzimas SOD são independentemente reguladas de acordo com o grau de estresse oxidativo experimentado nos respectivos compartimentos subcelulares, mas como essa comunicação ocorre em nível molecular ainda é desconhecido. Em algas, estudos recentes demonstraram que as atividades das SODs aumentaram sob vários estressores ambientais (Zanget al., 2012). Em nível molecular a expressão de SOD mostrou que pode ser modulada por splicing alternativo (Fenget al., 2006; Srivastava et al., 2009) e microRNas (Sunkar et al., 2006; Dugas e Bartel, 2008). Plantas transgênicas em que os genes de SOD foram superexpressos exibiram uma gama de fenótipos, dependendo da isoforma, o nível de expressão do transgene e a localização subcelular. Efeitos fenotípicos relatados incluem maior tolerância a estresses como seca e salinidade, entretanto a caracterização em condições ambientais de campo estão sob investigação (Kim et al., 2010; Wang et al., 2010). 1.5 GENES EXPRESSOS EM CONDIÇÕES DE DÉFICIT HÍDRICO Além das estratégias convencionais, os programas de melhoramento genético vêm investindo na busca de genes capazes de adicionar características de tolerância a estresses ambientais para que novas cultivares possam ser desenvolvidas. Muitos estudos têm identificado uma complexa e intrincada rede de respostas gênicas envolvidas desde a percepção e reconhecimento do sinal de 25 estresse até a ativação dos genes induzidos pelo estresse, incluindo arroz e Arabidopis (Menezes-Benavente et al., 2004; Chen et al., 2007; Peng et al., 2007; Todaka et al., 2012).Esses genes induzidos durante condições de estresse estão envolvidos em processos diversos da planta, atuando na proteção das células contra a deficiência de água por meio da produção de importantes proteínas metabólicas, ajuste do potencial osmótico, para assegurar a manutenção do turgor na célula e regulação de genes alvos, incluindo fatores de transcrição (Todakaet al., 2012). Corroborando com essa informação, Mir et al. (2012) relataram que as principais espécies agrícolas fornecem evidências de que os genes candidatos envolvidos na tolerância a deficiência hídrica podem ser: (a) genes envolvidos na proteção celular (por exemplo, proteínas responsáveis pelo ajustamento osmótico, degradação, reparo, detoxificação e adaptações estruturais) e/ou (b) genes envolvidos na regulação de outros genes (por exemplo, proteínas quinases e fatores de transcrição tais como: DehydrationResponsiveElementBindingprotein (DREB) envolvido na ativação de outros genes que apresentam características de proteção das estruturas celulares durante a desidratação celular, “basicregionleucineziper” (bZIP), MYB, entre outros. A identificação de genes específicos a cada tipo de resposta ao déficit hídrico tem sido realizada principalmente por análises de transcriptoma em diferentes espécies de plantas submetidas a tratamentos de estresse como calor, frio e seca (Mir et al., 2012). Considerando que a expressão de um gene está condicionada a fatores transcricionais e pós-transcricionais que dependem do grau de desenvolvimento e diferenciação celular, bem como da resposta a estímulos externos (Alberts et al., 2010), uma abordagem adequada para identificação desses genes candidatos seria a análise da expressão gênica diferencial. Nesse contexto, genes cuja expressão é significativamente alterada durante períodos de estresses, presumivelmente desempenham uma ação importante para a sobrevivência do organismo em condições adversas. Análise e estudo de tais genes responsivos ao estresse têm implicações para a produtividade agrícola e para aprofundar conhecimentos biológicos básicos (Scandalios, 2005). Vários estudos tem sido conduzidos para se descobrir à importância da enzima SOD, tanto em nível de expressão gênica, super-expressão de genes e atividade, contra o estresse oxidativo induzido por vários estresses abióticos, tais como o estresse à seca, salinidade, frio, temperaturas elevadas (Srivalli et al.,2003; Wang et al., 2005; 26 Thounaojam et al., 2012; Ara et al., 2013; Aydin et al., 2013). Bhoomika et al. (2013) identificou que tanto FeSOD e MnSOD foram encontrados na participação da tolerância ao estresse por toxidade de alumínio em cultivar de arroz tolerante a esse tipo de estresse. 1.6 ANÁLISE DE GENES-ALVOS VIA PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL (qPCR) A biotecnologia é uma ferramenta tecnológica robusta, capaz de impactar o conhecimento e a geração de produtos e processos relacionados ao setor agrícola. O avanço ininterrupto das técnicas de biologia molecular, aliado à disponibilidade massiva de sequências genômicas estruturais e funcionais, têm proporcionado o surgimento de novas metodologias para geração e análise de dados em genotipagem e expressão gênica a uma velocidade, precisão e escala sem precedentes (Carneiro, 2011). A técnica de qPCR é considerada uma ferramenta importante para a validação de genes-alvo ou diferencialmente expressos em condições de um determinado estresse, permitindo até mesmo que genes fracamente expressos sejam detectados com precisão (Caldana et al., 2007). Por meio dessa estratégia é possível quantificar de modo preciso o nível de expressão de genes alvo em diferentes condições ambientais e de desenvolvimento da planta, conforme amplamente relatado na literatura (Inghamet al., 2001; Gachon et al., 2004; Yuan et al., 2007; Visarada et al., 2009; Wurtzel et al., 2012).Dentre esses estudos, SoriaGuerra et al. (2010) relataram que por meio do uso da técnica de qPCR a validação de genes potencialmente envolvidos na resistência da soja à ferrugem, os quais poderão ser utilizados em ações de seleção assistida por marcadores nos programas de melhoramento genético dessa cultura. A padronização dos métodos experimentais utilizados na qPCR ocorreu em 2009, decorrente da necessidade de adotar critérios de qualidade adequados para padronizar e gerar resultados confiáveis (Bustin et al., 2009; Manoli et al., 2012). Conforme relatado por Bustin e Mueller (2005), para a análise de expressão gênica é fundamental a normalização dos dados para a interpretação adequada dos resultados gerados e isso se faz através da utilização dos genes de referência. Os genes de referência se caracterizam por apresentarem transcritos com expressão estável em um determinado tecido, ou entre tecidos, em diferentes fases de 27 desenvolvimento da planta e sob diferentes condições ambientais. Genes de referência são geralmente genes constitutivos, antigamente denominados housekeeping, alguns dos mais conhecidos genes de referência utilizados em plantas incluem os genes da actina, ubiquitina, β-tubulina e Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato(GAPDH) (Wang et al., 2009; Zhang et al., 2009). A técnica de qPCR se baseia na detecção e quantificação de um repórter fluorescente, em que a expressão do repórter é monitorada pela capitação de luz emitida pelo fluoróforo incorporado ao produto de PCR recém-sintetizado, e o sinal monitorado é diretamente proporcional à quantidade de produto da PCR (Gachon et al., 2004; Lemos et al., 2004; Alberts et al., 2010). Essa técnica permite a detecção, ciclo a ciclo, com alta sensibilidade e especificidade da intensidade de fluorescência emitida em decorrência da amplificação de sequência de DNA-alvo, proporcionando a análise comparativa da expressão do gene em estudo entre as amostras utilizadas no ensaio logo no início da fase exponencial de amplificação (Nascimento et al., 2010). O procedimento da técnica de PCR em tempo real segue o princípio geral da PCR convencional, apresenta as três fases características da PCR: (i) fase de crescimento exponencial (ii) fase de crescimento linear e (iii) a fase estacionária. A fase exponencial é bastante específica e precisa, na fase de crescimento linear os produtos da reação são consumidos e iniciam o processo de degradação e a fase estacionária corresponde o final da análise devido ao elevado nível de degradação dos produtos da PCR. O DNA molde utilizado na PCR em Tempo Real pode ser DNA genômico, quando objetiva-se a análise do número de cópias de um genoma, ou cDNA (DNA complementar) quando o objetivo é estudar os níveis de expressão de um determinado gene (Lemos et al., 2004). Os sistemas de detecção da PCR em tempo real utilizam fluoróforos, que são moléculas com capacidade de receberem e emitirem luz em um determinado comprimento de onda, possibilitando o acompanhamento da reação durante os ciclos de amplificação. A detecção do sinal emitido ocorre durante a amplificação e a medida da intensidade desse sinal retrata o quanto o fragmento-alvo está sendo amplificado. Os compostos fluorescentes mais utilizados são SYBR® Green e TaqMan®. As moléculas do SYBR® Green são excitadas com a luz emitida pelo sistema ótico do termociclador e emitem fluorescência verde ao ligarem entre a fita dupla de DNA. As vantagens de utilizar o SYBR® Green são o baixo custo, facilidade de uso e maior sensibilidade. O SYBR® Green liga-se a fita dupla de nucleotídeos 28 podendo ser utilizado na identificação de qualquer tipo de sequência, pois apresenta uma incorporação homogênea para diversos tipos de amplicons (pequenos pedaços de DNA formados como produto de amplificação natural ou artificial), incluindo dímeros de primers e outros produtos inespecíficos. Essa característica pode se tornar desvantajosa por comprometer uma exata quantificação do fragmento-alvo, podendo superestimar a quantificação do mesmo (Novais e Pires-Alves, 2004). No início do processo a fluorescência é reduzida, visto que moléculas SYBR® Green livres, não estão ligadas ao DNA de dupla cadeia e como tal, o sinal produzido é mínimo que é subtraído durante a análise do software. Ao longo do processo, após a detecção dos primers, quantidades crescentes dos fluoróforos ligam-se a dupla cadeia de DNA pré-sintetizada pela enzima Taq DNA polimerase. No fim da fase de extensão de cada ciclo, a fluorescência é monitorada e quantificada, e consequentemente o DNA amplificado é determinado. No ciclo seguinte, na etapa de desnaturação do DNA, as moléculas do SYBR® Green são liberadas levando a queda do sinal de fluorescência (Novais e Pires-Alves, 2004; Correia, 2007; Mackay et al., 2007). A sonda-TaqMan® (sonda de hidrólise) é utilizada para detectar sequências específicas dos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Esta sonda, que corresponde a um pequeno fragmento de DNA com homologia ao fragmentoalvo, apresenta em uma extremidade um fluoróforo, e na outra um quencher que corresponde a uma molécula que recebe energia do fluoróforo na forma de luz dissipando-a na forma de luz ou calor. Durante a qPCR a sonda de hidrólise se hibridiza com a sequência da fita simples de cDNA alvo e, a partir da amplificação do fragmento alvo os primers flanqueiam o mesmo, a sonda é degradada devido a atividade exonuclease 5’→ 3’da Taq DNA polimerase. Durante a degradação da sonda o fluoróforo e o quencher são liberados da molécula resultando na emissão da fluorescência (Novais e Pires-Alves, 2004). Como já mencionado a tecnologia SYBR® Green apresenta como principais vantagens à alta sensibilidade, o reduzido custo e a facilidade de manuseio. Em compensação, apresenta como principal desvantagem a possibilidade de ligação a todo o DNA em cadeia dupla, durante a reação de polimerização, incluindo os dímeros de primers e outros produtos não específicos. Além disso, a detecção com SYBR® Green exige uma otimização extensiva, uma vez que não é específico para uma determinada sequência de DNA, e não permite 29 análises em multiplex (Novais e Pires-Alves, 2004). Portanto, torna-se imperativo o acompanhamento dos ensaios de forma a validar os resultados (Mackayet al., 2007; Oliveira, 2009). Recentes estudos relatam a utilização da tecnologia SYBR® Green para identificar organismos geneticamente modificados em alimentos (BarbauPiednoir et al., 2012), auxiliando na detecção de agentes patogênicos de origem alimentar (Postollec et al., 2011) e na identificação e expressão de genes relacionados a tolerância a seca em arroz (Jeong et al., 2010). De acordo com Bustin et al. (2009), o desempenho do ensaio da análise de qPCR é influenciado por diversos fatores, como a qualidade de armazenamento da amostra, o procedimento utilizado para o isolamento do DNA/RNA, a seleção de oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados para a transcrição reversa e realização da PCR em tempo real. A qPCR possui inúmeras vantagens como: simplicidade, especificidade, elevada sensibilidade no que se refere à utilização de uma sonda ou de um corante apropriado, rapidez, redução do risco de contaminação pós-amplificação, utilização de uma instrumentação de maior confiabilidade, dentre outros (Alonso, 2008). 1.7 ANÁLISE DO TRANSCRITOMA COM ÊNFASE EM ENZIMAS DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO Segundo Alberts et al. (2010), os avanços em biotecnologia e engenharia genética tem impactado profundamente todos os aspectos da biologia celular, propulsionando significativos avanços em diversas áreas do conhecimento e permitindo ampliar os conhecimentos em relação aos sistemas biológicos. A análise global desses sistemas é caracterizada pela terminologia “ômicas”, compreendendo a áreas de genômica, transcritômica, proteômica e metabolômica, referente ao estudo das biomoléculas como ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos ribonucleicos (RNA), proteínas e metabólitos, respectivamente (Binneck, 2004; Rocha et al., 2006; Ma et al., 2013), as quais estão diretamente integradas ao desenvolvimento da bioinformática. O termo transcritoma é referente ao produto da expressão gênica de um dado organismo e que compreende um conjunto completo de transcritos, como RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs. O perfil do transcritoma pode variar segundo o momento (numa dada fase do ciclo 30 celular, por exemplo), estado fisiológico, estímulos físicos, químicos e biológicos ou doenças, pelos quais um organismo está submetido. O avanço das tecnologias em larga escala de sequenciamento e de análise do transcritoma via bioinformática têm possibilitado o estudo simultâneo da expressão e regulação de genes em diferentes processos biológicos. A identificação de genes expressos pela planta em resposta a diferentes tipos de estresse é um dos passos críticos que levam a elucidação dos mecanismos de resposta da planta. A percepção de estresses abióticos e a transdução de sinais são passos importantes na determinação da sobrevivência e na reprodução de plantas expostas a diferentes estresses (Chinnusamy et al., 2004). A comparação da expressão gênica em diferentes células, tecidos, estádios de desenvolvimentos da planta e tratamentos, devem fornecer informações necessárias para análise e compreensão de processos biológicos que controlam as respostas dos organismos às diferentes situações (Liang e Pardee, 1995; Ye et al., 2011). A identificação de genes envolvidos com a tolerância ao déficit hídrico tem sido uma das ações de pesquisa de maior interesse em todo mundo no que diz respeito aos programas de melhoramento genético de plantas. A partir desse estresse é desencadeada uma série de respostas diversas e complexas que resultam em alterações no padrão de expressão de genes, acúmulo de metabólitos ou componentes osmoticamente ativos e a síntese de proteínas específicas (Todaka et al., 2012). Através do acúmulo de dados da expressão diferencial de vários genes sob diferentes condições é possível reconstruir as vias reguladas por esses genes, predizer onde eles atuam e identificar novos genes associados ao processo (Todaka et al., 2012; Wurtzel et al., 2012). Muitos genes induzidos pela deficiência hídrica são tidos como protetores das estruturas celulares e dos efeitos da perda de água (Bray, 1997; Shen et al.,1997). Sob condições de déficit hídrico têm sido demonstrada a formação e liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs) que desencadeiam múltiplas respostas celulares relacionados aos processos de transcrição, tradução, metabolismo e possível morte celular (Desikan et al., 2001; Allan et al., 2008; Saleh e Plieth, 2009). 31 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a atividade enzimática e a expressão diferencial dos genes da superóxido dismutase (SOD) em folhas e raízes de dois genótipos de arroz de terras altas, em diferentes estádios de desenvolvimento e condições hídricas. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS i) Avaliar a atividade da enzima SOD a partir de folhas e raízes de genótipos de arroz de terras altas com características contrastantes para a deficiência hídrica; ii) A partir dos bancos de dados públicos identificar os genes que codificam as isoformas da enzima SOD no genoma do arroz; iii) Desenhar pares de primers para cada gene identificado através dos bancos de dados públicos; iv) Avaliar o padrão de expressão diferencial dos genes da SOD em diferentes estádios de desenvolvimento em arroz de terras altas cultivado em condições de déficit hídrico. 32 5. CAPÍTULO 1 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES DA SUPEROXIDO DISMUTASE (SOD) EM ARROZ DE TERRAS ALTAS SOB DÉFICIT HÍDRICO 1. INTRODUÇÃO O arroz (Oryza sativa L.) é um cereal de elevado valor socioeconômico, sendo alimento básico para mais da metade da população do mundo (Hadiarto e Tran, 2010). Dentre os fenômenos climáticos, a seca é um dos principais problemas para a agricultura mundial; para os cereais, estima-se que cerca de 20% da área plantada no Brasil seja afetada pela seca, resultando em uma perda na produção de mais de 23,7 milhões de toneladas, considera-se ainda que em anos e locais específicos, pode-se chegar à perda quase total da produção (Guimarães et al., 2008). Em âmbito mundial, aproximadamente, 164 milhões de hectares de arroz são cultivados em diferentes condições de solo e clima, com produção em torno de 720 milhões de toneladas (FAOSTAT, 2013). O Brasil figura entre os dez principais produtores mundiais, com mais de dois milhões de hectares de área plantada (FAOSTAT, 2013), sendo o estado do Rio Grande do Sul o maior produtor utilizando o sistema de cultivo de várzeas, e as regiões Centro-Oeste, Norte e Nordeste responsável pela produção de arroz de terras altas (MAPA, 2014). No sistema de várzeas se cultiva o arroz com irrigação por inundação controlada, e no de terras altas, que corresponde ao cultivo em sequeiro, o sistema de produção dependente da precipitação pluvial ou irrigação (Guimarães et al., 2006). Em 2012, a participação do sistema de cultivo de arroz de terras altas na produção nacional de grãos foi de apenas 14% de um total de 11 milhões de toneladas, ocupando uma área plantada de 1,1 milhão de hectares (EMBRAPA, 2014). Do ponto de vista econômico e ambiental, há um grande apelo para aumentar a produção do arroz de terras altas, por demandar menor necessidade hídrica, uma vez que a escassez de água potável disponível é fato alarmante com a iminência do agravamento ambiental devido ao aquecimento global (Quan et al., 2010). Plantas, quando enfrentam períodos sem chuva durante seu ciclo de vida, utilizamse de um complexo redirecionamento do metabolismo, relacionado a distintos e, por 33 vezes, complementares mecanismos fisiológicos e bioquímicos como fechamento de estômatos, enrolamento foliar, sinalização via ácido abscísico, redução das taxas fotossintética e transpiratória, acúmulo de solutos, mudanças na composição de membranas, produção de metabólitos característicos e radicais livres, bem como alterações nas atividades de enzimas antioxidantes e suas expressões gênicas (Serraj et al., 2011; Tian et al., 2011; Aydin et al., 2013). Além disso, a severidade, duração e frequência com que o estresse de seca é imposto, bem como o estádio de desenvolvimento da planta serão determinantes sobre os diferentes níveis de resposta (Fristche-Neto et al., 2011). Um dos processos bioquímicos primários observados nas plantas em decorrência da baixa disponibilidade de água no solo é a produção, em excesso, de espécies reativas de oxigênio (EROs) amplamente descrito na literatura (Levine et al., 1994; Scandalios, 2005; Gill e Tuteja 2010; Sharma et al., 2012), disparando a atuação do sistema de defesa antioxidativo que tende a modular o estado redox da célula, na tentativa de manter a homeostase celular (Morita et al., 2011; Ma et al., 2013). Os processos metabólicos em organismos aeróbicos, como respiração, fotossíntese e fotorrespiração, levam à produção contínua deEROsnas mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos, conforme descrito por Sharma et al. (2012). Em condições fisiológicas ótimas, a produção e a degradação de EROs existem em equilíbrio devido a diversos mecanismos de detoxificação celular (Alscher et al., 1997). Em uma situação de perturbação desse equilíbrio, que pode ser desencadeada por uma série de fatores bióticos e abióticos, ocorre um aumento na concentração intracelular de EROs (taxa de produção maior do que a taxa de degradação) que, por consequência, causa uma série de danos oxidativos a biomoléculas, tais como lipídeos, proteínas e DNA, o que pode ocasionar a morte celular dependendo da severidade do estresse (Mittler, 2002; Sharma et al., 2012). O estresse oxidativo, em nível celular, é caracterizado pelo excesso de EROs, as quais podem ser constituídas por radicais livres, tais como superóxido (O 2•-) e hidroxila (OH•), como também espécies químicas altamente reativas, como oxigênio singleto ( 1O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (Salvador e Henriques, 2004; Scandalios, 2005; Soares e Machado, 2007; Goswami et al., 2013). Com a função de proteger a estrutura e o funcionamento das células dos efeitos prejudiciais das EROs, um complexo sistema antioxidativo é ativado nas plantas, o qual pode ser divididos em 34 três classes: (1) lipídeos solúveis e tocoferóis associados à membrana; (2) compostos redutores solúveis em água, tais como ascorbato (ASA) e glutationa (GSH) e (3) enzimas antioxidativas (Cho e Seo, 2005; Morita et al., 2011). Os principais componentes enzimáticos do sistema de defesa antioxidativo, nos organismos aeróbicos, são superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), catalase (CAT, EC 1.11.1.6), peroxidase do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11), peroxidase da glutationa (Guaiacol peroxidase) (GPX, EC 1.11.1.7), glutationa redutase (GR, EC 1.8.1.7), monodehydroascorbate reductase (MDHAR, EC 1.6.5.4) e dehydroascorbate reductase (DHAR, EC 1.8.5.1) (Noctor et al., 1998; Lee e Lee, 2000; Cho e Seo, 2005; Morita et al., 2011). As enzimas do complexo antioxidativo operam em distintos compartimentos subcelulares e detém propriedades bioquímicas específicas. Seus diferentes padrões de indução em nível de atividade e/ou expressão gênica, e uma grande quantidade de eliminadores não-enzimáticos, tornam o sistema antioxidante muito flexível e versátil que pode controlar o acúmulo das EROs e promover a detoxificação das células (Del Rio et al., 2002; Vranová et al., 2002; Pyngrope et al., 2013). Dentre as enzimas antioxidantes, a superóxido dismutase (SOD) é considerada umas das principais do sistema, visto que elimina radicais superóxido (O•-), o qual é o primeiro a ser produzido pela adição de um elétron ao oxigênio molecular (O2), caracterizando o burst oxidativo (Ferreira e Abreu, 2007; Aydin et al., 2013). SOD são isoenzimas classificadas como metaloproteínas que catalisam a dismutação de radicais superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio (Gill e Tuteja, 2010). Essa enzima é onipresente em todos os organismos aeróbicos e em todos os compartimentos celulares propensos ao estresse oxidativo, cujos grupos variam de acordo com seu cofator metálico: isoformas presentes nos cloroplasto (FeSOD, MnSOD, Cu/ZnSOD ), nas mitocôndrias (MnSOD), nos peroxissomos (MnSOD e Cu/ZnSOD), no citosol e, possivelmente, no espaço extracelular (Cu/ZnSOD) (Alscher et al., 2002; Jaleel et al., 2009; Gill e Tuteja 2010; Aydin et al., 2013). Segundo Bowleret al. (1992), a isoenzimas FeSOD é sensível ao peróxido de hidrogênio (H2O2), Cu/ZnSOD é sensível ao H2O2 e ao cianeto de potássio (KCN), enquanto a MnSOD é resistente a ambos. Todas as isoformas de SOD são nucleares, codificadas e direcionadas aos seus respectivos compartimentos subcelulares, quando necessário, por meio de sequências de direcionamento amino- 35 terminal (Bowler et al., 1992; Gill e Tuteja 2010). A regulação positiva de SODs está relacionada ao combate do estresse oxidativo e tem um papel crítico na sobrevivência das plantas sob estresses ambientais (Gill e Tuteja, 2010). O aumento significativo na atividade e/ou expressão de SOD em plantas submetidas à seca tem sido observada em diversas espécies, tais como feijoeiro comum (Zlatev et al., 2006), feijão de corda (Brou et al., 2007), plantas transformadas de arroz (Prashanth et al., 2008) e batata doce (Lu et al., 2010). Nesse contexto, a ativação dos mecanismos de defesa do sistema antioxidativo em resposta à deficiência hídrica ampara subsídios para estudo investigativos com ênfase no desenvolvimento de cultivares de arroz de terras altas mais bem adaptadas para cultivo em áreas propensas a veranicos. Esse estudo foi proposto com base na hipótese de que enzimas antioxidantes podem desencadear mecanismos de proteção e/ou adaptativos da planta de arroz de terras altas submetidas ao cultivo sob deficiência hídrica, via alterações na expressão gênica e/ou regulação pós-transcricional de sua atividade. Diante disso, o objetivo aqui proposto foi de avaliar a atividade e expressão da enzima SOD, em dois genótipos de arroz de terras altas (Oryza sativa japonica), Douradão e BRS Primavera com características contrastantes para tolerância à deficiência hídrica, contemplando análises da parte aérea e tecido radicular, bem como dois estádios de desenvolvimento das plantas (vegetativo e reprodutivo), cultivadas sob condição hídrica ótima (100% de água) e condição de deficiência hídrica (50 % de água). 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 MATERIAL VEGETAL Duas cultivares de arroz de terras altas foram analisados neste estudo sendo Douradão tolerante à seca, e BRS Primavera, sensível à seca. Douradão foi lançada em 1989, e se originou de um cruzamento entre a cultivar IAC-25 e a linhagem Africana 63-83 (Soares et al., 1989; Soares et al., 1991). Esta cultivar tem características de grande importância para o melhoramento de arroz de terras altas, como ciclo curto, robustez inicial das mudas, adaptabilidade ambiental, a tolerância ao estresse hídrico, tipo de grão longo, claro e transparente. A floração ocorre em cerca de 80 dias após a semeadura e a maturidade da semente 30-40 dias após o 36 florescimento (Soares et al., 1989). A cultivar BRS Primavera foi lançada pela Embrapa Arroz e Feijão em 1987, por meio de um cruzamento realizado entre as linhagens IRAT 10 e LS 85-158 (Soares et al., 2001); se destaca por seus grãos longos e finos, mas é sensível a herbicidas, tem baixa resistência ao acamamento e é bastante sensível à seca. A floração ocorre em média 85 dias após a semeadura; o ciclo de maturação ocorre cerca de 30 dias após o florescimento (Soares et al., 2001). 2.2 EXPERIMENTO DE RESTRIÇÃO HÍDRICA O experimento foi conduzido no ano de 2011/2012, entre os meses de novembro e março, em ambiente de casa de vegetação na Embrapa Arroz e Feijão. Duas épocas de restrição hídrica foram selecionadas para avaliação das plantas de arroz de terras altas submetidas à deficiência hídrica: (I) Época 1 (estádio vegetativo) corte da irrigação no estádio vegetativo V3 (início do perfilhamento; classificação conforme Counce et al., 2000) e reinício da irrigação no estádio vegetativo V6, e (II) Época 2 (estádio vegetativo) - corte da irrigação no estádio reprodutivo R3 (emissão da panícula) e reinício da irrigação no estádio reprodutivo R6 (grão leitoso), respeitando o ciclo fenológico de cada cultivar. Dois regimes de irrigação foram utilizados: (1) grupo A (grupo controle) - conjunto de plantas sem restrição hídrica; (2) grupo B - conjunto de plantas submetidas a 50% de água no solo em relação às plantas sem restrição hídrica. A irrigação foi realizada, normalmente, a partir da semeadura. Para o conjunto de plantas da Época 1, quando 50 % das plantas de arroz de terras altas, de cada cultivar, atingiram o estádio vegetativo V3, a irrigação foi interrompida para que o regime hídrico proposto fosse alcançado no solo. A irrigação continuou normalmente para o conjunto de plantas da Época 2, até o momento em que mais de 50% das plantas atingiram o estádio reprodutivo R3 (emissão da panícula), quando foi feito o corte da irrigação. Para estabelecer a quantidade de água no vaso para os dois regimes hídricos, foi determinada a capacidade de campo (CC) do solo, definida como o máximo de conteúdo de água retido pelo solo após o excesso ter sido drenado (Mello et al., 2002), executado por Lanna et al., 2013. A perda de água diária, nos dois períodos de deficiência hídrica, foi medida por meio da pesagem dos vasos, individualmente, em balança eletrônica (Marte, modelo LC20). A duração do estresse (plantas submetidas ao cultivo com 37 50% de água no solo em relação às plantas sem restrição hídrica) foi de seis dias. De acordo com Campos et al. (2004) a produtividade foi utilizada como atributo balizador da severidade da deficiência hídrica. Subsequentemente, os dados de produtividade foram normalizados por meio da razão entre o valor de produtividade das plantas submetidas a 50% de restrição hídrica pelo valor de produtividade das plantas do tratamento controle (100% irrigadas), denominado Índice de Produtividade (IP) (Lanna et al., 2013). Para avaliação dos atributos bioquímicos e moleculares o material vegetal, folhas e raízes, foi coletado no último dia de restrição hídrica, em cada época de deficiência hídrica, as amostras foram acondicionadas em papel alumínio, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, e armazenadas em ultra freezer (- 80 °C) para posteriores análises. 2.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE SOD Amostras de folhas e raízes (1g), dos dois estádios de desenvolvimento (vegetativo e reprodutivo) foram trituradas em nitrogênio líquido e homogeneizados em 3mL de tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7.8, contendo 0,1 mM de EDTA, 1% (p/v) de polivinilpirrolidona PVP e 0,5% (v/v) de Triton X-100. O homogeneizado foi centrifugado a 18.000 g, por 20 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade de SOD e da quantidade de proteínas solúveis totais. A atividade de SOD foi determinada de acordo com a metodologia descrita por Del Longo et al. (1993), com modificações nas concentrações das soluções mencionadas abaixo. O método baseia-se no monitoramento da habilidade de SOD em inibir a redução fotoquímica do azul de nitrotetrazólio (NBT). O meio reacional constituiu-se de extrato bruto de folhas e raízes, 78 mmol L-1 de DL-metionina, 60 µmol L-1 de riboflavina, 100 µmol L-1 de EDTA, 900 µmol L-1 de NBT e solução 100 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7.8. O volume de solução tampão variou de acordo com o volume de extrato bruto de folha e de raiz adicionado à mistura reacional para obtenção de volume final de 1mL em cada repetição. A reação foi conduzida a 25ºC numa câmara de reação sob iluminação (15 W). Após 15 minutos de exposição à luz, a iluminação foi interrompida e a formazana azul produzida, produto da redução do NBT, foi lida a 560 nm em espectrofotômetro UV-Vis. A absorbância a 560nm, de um meio de reação 38 exatamente igual ao anterior, mas mantido no escuro, por igual tempo, serviu de "branco" e foi subtraído da leitura da amostra que recebeu iluminação. Cálculo da atividade de SOD: [ABS 560 nm (amostra com iluminação) – ABS 560 nm (amostra sem iluminação)] % de inibição = ABS 560 nm (amostra com iluminação) X 100 Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para inibir 50% da fotorredução do NBT (Corte et al., 2010). No entanto, uma curva de calibração foi obtida plotando a porcentagem de inibição versus volume de extrato bruto de folha e raiz. Todos os tratamentos foram feitos em triplicata e a curva hiperbólica obtida foi linearizada em gráfico duplo-recíproco com o objetivo de obter o volume de extrato correspondente a 50% de inibição da fotorredução do NBT. Os resultados foram expressos como Unidades de SOD mg-1 de proteína, que é a razão entre a atividade de SOD (50% de inibição da fotorredução do NBT obtido em um determinado volume de extrato bruto de folha e de raiz) e a quantidade de proteínas solúveis totais contido nesse volume. A dosagem de proteínas solúveis totais foi realizada de acordo com o método de Bradford (1976), utilizando Albumina Sérica Bovina (BSA) como padrão, na concentração de 1 mg mL-1. Após 15 minutos à temperatura ambiente a intensidade da cor da solução foi medida em espectrofotômetro UV/Vis a 595 nm. 2.4 EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL E SÍNTESE DE cDNA Apartir de amostras de tecido foliar e radicular de plantas adultas oriundas dos ensaios de déficit hídrico, o RNA total foi extraído a partir de um pool de três plantas, replicatas biológicas, a fim de aumentar a eficiência no isolamento de sequências expressas. O protocolo de extração de RNA seguiu o método descrito por Chomczynski & Sacchi (1987). As amostras de RNA foram tratadas com Dnase (Deoxyribonuclease I, Invitrogen) para remoção de possíveis resíduos de DNA genômico. Ao final, o RNA total foi ressuspenso em água livre de RNase e mantido a -80C. A avaliação da quantidade e qualidade de RNA foi conduzida em gel desnaturante de agarose 1% em TAE livre de RNase (Tampão Tris-Acetato EDTA) e 39 nos aparelhos NanoVueTM (GE Healthcare) e Bioanalyser 2100 (Agilent) com RIN ≥ 6,0. A reação de transcrição reversa para síntese do DNA complementar (cDNA) foi realizada partir do RNA utilizando random primers e SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen), conforme instruções do fabricante. Em seguida, foi realizada a quantificação do cDNA no aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer (Life Technologies) utilizando o kit Qubit® ssDNAAssay, seguido pelo ajuste das concentrações para 12,5𝑛𝑔 × 𝜇𝐿−1 e armazenamento a -20ºC. Ao final, uma PCR controle amplificando o gene Elongation factor 1-alpha1 (eEF-1α) foi conduzida utilizando o cDNA sintetizado para certificar sobre a ausência de DNA contaminante uma vez que são gerados amplicons de tamanhos diferentes (pb) pela presença e ausência de região intrônica no DNA e cDNA, respectivamente. 2.5 IDENTIFICAÇÃO DA SOD E DESENHO DE PRIMERS A partir dos bancos GenomeAnnotation de Project dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), (http://rice.plantbiology.msu.edu) e Rice UniProt (http://web.expasy.org/docs /swiss-prot_guideline.html) foram realizadas buscas referentes aos genes que codificam a enzima superóxido dismutase (SOD) e suas isoformas. As sequências genômicas e CDS (sequência de codificação do DNA) identificadas foram alinhadas (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) no e programa EMBOSS clustalW2 (https ://www.ebi.ac.uk /Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) com ênfase na identificação dos éxons, íntrons e de sequências consenso com a finalidade de desenvolver primers comuns entre sequências. Utilizando o programa OligoPerfect™ Designer (Invitrogen), disponível em [http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716] sob os parâmetros padrão, foram desenvolvidos pares de primers prioritariamente na junção dos éxons adjacentes a fim de garantir a amplificação do transcrito-alvo. Para assegurar a amplificação adequada de, no mínimo, um fragmento utilizando o sistema SYBR ® Green, foram derivados três pares de primers por sequência. 40 2.6 EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL Todos os ensaios foram executados em triplicata utilizando reagentes padronizados para PCR em tempo real acrescido dos primers específicos para cada gene. Foram utilizados três genes de referência que correspondem aos genes da actin (ACT) (GenBank™ ID: X15865), eukaryoticelongationfactor-1α (eEF-1α) (GenBank™ ID: AK061464) e glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) (GenBank™ ID: AK064960) conforme estabelecido por Abreu et al. (em preparação). As reações de amplificação foram conduzidas utilizando-se Platinum®SYBR®GreenqPCRSuperMix com UDG (uracil DNA glycosylase) e 25ng de cDNA em um volume final de 20 µL, conforme indicado pelo fabricante. A amplificação e leituras foram conduzidas no equipamento Life technologies®7500 Real-Time PCR Systems (Life technologies®), seguido pela análise utilizando o Sequence Detection Software (SDS) v2.0.5 (Life technologies). As condições de termociclagem consistiram de um passo a 50°C por 2min (incubação da UDG); 95°C por 2min (desnaturação); 40 ciclos de 95°C por 15s e 60°C por 30s (anelamento e extensão). −1 Por meio da equação 𝐸 = (10𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 − 1) × 100 (Bustin et al., 2009) obteve-se em porcentagem uma estimativa de valores de eficiência dos primers dos genes-alvo e referência, este último elaborado por Abreu et al (em preparação) (Anexo 1). Para análise de expressão gênica foi utilizado o método comparativo (ΔΔCT), que determina a quantificação relativa (RQ), utilizando o programa DataAssist versão 3.01 (LifeTechnologies). A estabilidade dos genes de referência foi avaliada utilizando o NormFinder software (Andersen et al., 2004). 2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todas as análises foram realizadas em triplicata biológica e técnica (repetição em laboratório). Os dados obtidos das análises de expressão gênica e atividade enzimática foram analisados estatisticamente em ambiente do softwareR V 3.0.2 (software R disponível em CRAN, [http://cran.r-project.org/] p-valor≤ 0.05). A análise de variância (ANOVA) foi realizada para avaliar: 1) as variações observadas para o mesmo genótipo submetido aos tratamentos controle (100% de irrigação) e com restrição hídrica (manutenção de 50% de água nos vasos); e 2) as variações 41 observadas entre genótipos contrastantes (tolerante e sensível) submetidos à mesma condição de estresse hídrico. O teste de Tukey foi empregado para testar as significâncias das variações nas condições 1 e 2 ao nível de significância de 5%. 42 3. RESULTADOS 3.1 EXPERIMENTO DE RESTRIÇÃO HÍDRICA Os períodos de restrição hídrica foram impostos de acordo com as fases fenológicas de cada genótipo. O primeiro período ocorreu entre o 17º e o 31º DAE (dia após emergência), em ambos os genótipos; e o segundo, ocorreu entre o 60º e o 72º DAE para o genótipo Douradão e entre o 67º e o 77º DAE para o genótipo Primavera (Figura 3). O nível de restrição hídrica nas plantas de arroz de terras altas foi mantido por meio da reposição de água evapotranspirada diariamente. Foi observado menor índice de Produtividade (IP) quando a restrição hídrica foi imposta na fase reprodutiva das plantas de Douradão e BRS Primavera (Lanna et al., 2013). Os menores IPs obtidos em plantas submetidas à restrição hídrica em relação às plantas controle indicaram que os mecanismos de resposta, com maior ou menor intensidade, foram acionados em ambos os genótipos. Figura 3. Ciclos de deficiência hídrica (DH) em função das fases fenológicas, expressas em função de Dias Após Emergência (DAE), de duas cultivares de arroz de terras altas, (a) Douradão (b) BRS Primavera (Adaptado Lanna et al., 2013). 43 3.2 IDENTIFICAÇÃO DE GENES E DESENHO DE PRIMERS A partir do banco de dados Rice Genome Annotation Project - RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/) foram identificados oito genes que codificam para enzima SOD. Os genes diferenciam-se pelas suas localizações subcelulares e pelos cofatores que se ligam aos seus centros reativos, com seis desses genes apresentando formas de splicing alternativo (Tabela 1). A partir das 16 sequências de nucleotídeos dos genes identificados, incluindo sequência genômica e CDS, foi realizado o alinhamento com ênfase na identificação dos éxons, íntrons e sequência consenso a partir das quais foram desenvolvidos os oligonucleotídeos iniciadores. O número médio de íntrons e de éxons ao longo das oito sequências genômicas foi de 6 e 5, respectivamente, com o gene CuZnSOD3 apresentando o maior comprimento em pares de base (5.697pb) e o CuZnSOD4 (3.319pb), o menor. Ao todo, foram desenhados 24 pares de oligos, sendo 17 em junções dos éxons adjacentes, com uma média de três pares de oligos por sequência. Para os 3 pares de primers, derivados da sequência do gene FeSOD2 e 1 par de primers do gene CuZnSOD1, não foi possível fazer o desenho na junção dos éxons adjacentes pelo fato da sequência CDS possuir apenas dois éxons; e para 3 pares de oligonucleotídeos iniciadores, 1 par derivado da sequência do gene CuZnSOD3 e 2 pares derivados do gene MnSOD, também não foi possível fazer o desenho na junção dos éxons adjacentes pelo fato do primeiro éxon ser muito grande e o segundo muito pequeno, dificultando o desenho na junção entre esses éxons (Apêndice 1). O tamanho médio dos amplicons em pares de base (pb) foi de 117, variando de 100pb para os oligonucleotídeos iniciadores Cu/ZnSOD2 e FeSOD2,Cu/ZnSOD4 eCu/ZnSOD5 a 170pb para iniciador Cu/ZnSOD3 (Apêndice2 e 3). 3.3 QUALIDADE DAS AMOSTRAS DE RNAs E cDNAs As amostras de tecidos de folhas e raízes resultaram em uma boa qualidade e quantidade de RNA total (Apêndice 4 e 5). As leituras espectrofotométricas mostraram valores adequados considerando a razão 260nm/280nm, que muitas vezes é usado para identificar a presença de proteínas contaminantes. As amostras de RNA mostraram valores adequados de integridade (RIN) variando 6,0-8,1 de tecido foliar e 6,8-9,7 para o tecido radicular, enquanto que as razões das 44 subunidades correspondentes aos RNAr 28S e 18S variou de 0,9 a 3,7 (Apêndice 6). As concentrações obtidas para o RNA extraído variaram de 88,4 ng / uL de 2,386 ng / uL. 3.4 AJUSTE DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO E CURVA DE DISSOCIAÇÃO Nessa primeira etapa de triagem verificou-se que dos 24 pares de oligonucleotídeos desenvolvidos e amplificados nas condições padrão de qPCR somente um par de iniciadores apresentou na concentração de 50nM perfil satisfatório de amplificação, com especificidade e tamanho de amplicon de acordo com o esperado (Figura 4C). Para os demais iniciadores, a concentração de oligos adequada foi de 25nM Figura 5 (A a G). As reações de amplificação, conduzidas em duplicata, foram interpretadas através de suas curvas de dissociação, cujas temperaturas de melting variaram de 60ºC a 95ºC. Foram selecionadas as concentrações de oligos que, quando combinadas, resultaram em produtos amplificados com especificidade, ou seja, ausência de formação de dímeros (Figura 6; Tabela 1), assim como menores valores de Ct (variou de 24,96 a 37,24) e maiores Rn (variou de 0,05375 a 0,016769) (dados não apresentados). 45 A B C D E F G H I J K L Figura 4. Curvas de melting (60°C a 95°C), utilizando a concentração de 50 nM para todos pares de primers, após 40 ciclos de PCR utilizados para verificar especificidade da amplificação dos primers desenvolvidos para estudo de expressão gênica em plantas de arroz de terras altas. (A) LOC_Os06g05110_A; (B) LOC_Os06g05110_B; (C) LOC_Os06g05110_C; (D) LOC_Os03g11960_A; (E) LOC_Os03g11960_B; (F) LOC_Os03g11960_C; (G) LOC_Os08g44770_A; (H) LOC_Os08g44770_B; (I) LOC_Os08g44770_C; (J) LOC_Os06g02500_A; (K) LOC_Os06g02500_B; (L) LOC_Os06g02500_C (Continua). 46 M N P S V Q T W O R U X Figura 4. Curvas de melting (60°C a 95°C), utilizando a concentração de 50 nM para todos pares de primers, após 40 ciclos de PCR utilizados para verificar especificidade da amplificação dos primers desenvolvidos para estudo de expressão gênica em plantas de arroz de terras altas. (M) LOC_Os04g48410_A (N) LOC_ Os04g48410_B; (O) LOC_ Os04g48410_C; (P) LOC_Os07g46990_A; (Q) LOC_Os07g46990_B; (R) LOC_Os07g46990_C; (S) LOC_Os03g22810_A; (T) LOC_Os03g22810_B; (U) LOC_Os03g22810_C; (V) LOC_Os05g25850_A; (W) LOC_Os05g25850_B; (X) LOC_Os05g25850_C (Continuação). 47 B A C D E G F Figura 5. Curvas de melting (60°C a 95°C), utilizando a concentração de 25 nM para 7 pares de primers, após 40 ciclos de PCR utilizados para verificar especificidade da amplificação dos primers desenvolvidos para estudo de expressão gênica em plantas de arroz de terras altas. (A) LOC_Os03g11960_C; (B) LOC_Os08g44770_C; (C) LOC_Os06g02500_C; (D) LOC_Os04g48410_C; (E) LOC_Os07g46990_B; (F) LOC_Os05g25850_B; (G) LOC_Os03g22810_C. 48 (a) (b) (c) Amostras Controle negativo (d) (e) (f) (g) (h) (i) Figura 6. Curvas de melting (60ºC a 95ºC) após 40 ciclos de PCR dos primers utilizados para análise de expressão gênica em qPCR. A presença de um único pico nas amostras e nenhum pico na água (controle negativo) indica ocorrência de amplificação específica de cada alvo. 49 Tabela 1. Isoformas de SOD selecionados para avaliação da expressão gênica em plantas de arroz de terras altas em condições de seca. Gene ID Nome b alternativo LOC_Os03g11960 Os03g0219200 LOC_Os03g22810 a Cofator c Formas de splicing alternativo Forward Reverse (5’→3’) (5’→3’) Ampliconsize(bp) Cu/ZnSOD1 LOC_Os03g11960.4; LOC_Os03g11960.3; LOC_Os03g11960.2 ACCGGGTATACCGAGGTGA GTAGAGTTGCAGCCGTTGGT 104 Os03g0351500 Cu/ZnSOD2 - TCAACTGGGCCACACTACAA CTTCTCCAGCGGTGACATTT 100 LOC_Os04g48410 Os04g0573200 Cu/ZnSOD3 LOC_Os04g48410.2 AAGGGAACCCAAATGATTTTT GCTTCAACTATAGCCAATTCCA 115 LOC_Os05g25850 Os05g0323900 MnSOD LOC_Os05g25850.2 ACGTCGCCAACTACAACAAG GTTGAACTTGATGGCGCTCT 101 LOC_Os06g02500 Os06g0115400 FeSOD1 - GGATGGGTTTGGCTTTGTTA AAGAGGATTGATGGCATTCG 123 LOC_Os06g05110 Os06g0143000 FeSOD2 LOC_Os06g05110.3 GCGATATTTTCGCATCCATT TCCAAAGGCCATTACATTCAT 100 LOC_Os07g46990 Os07g0665200 Cu/ZnSOD4 LOC_Os07g46990.2 CACTTCAATCCTACTGGGAAGG TAGCAACACCATCTGCTCCA 100 LOC_Os08g44770 Os08g0561700 Cu/ZnSOD5 LOC_Os08g44770.2 ACTTGCATGCGGTGTTGTT TCAGGCTCGAAGATGACAAA 107 aIDs dos genes foram obtidos a partir de RGAP – (http://rice.plantbiology.msu.edu/); bOs nomes dos genes foram arbitrariamente determinados pelos autores desta pesquisa, de acordo com o cofator de cada gene; c Nome alternativo encontrado no banco de dados (RGAP); 3.5 EFICIÊNCIA DA qPCR As estimativas de eficiência da qPCR derivadas das curvas padrão obtidas pelos dados de diluição seriada dos cDNAs para as oito isoformas de SOD variaram de 93% a 101% (Tabela 2) de eficiência do par de primers em amplificar o cDNA-alvo exponencialmente a cada ciclo. A maior eficiência de qPCR foi observada para o gene FeSOD2, enquanto a menor foi para o Cu/ZnSOD3. Os valores do slope se encontraram na faixa de -3,285 a -3,5, enquanto os valores dos coeficientes de correlação (R2) variaram de 0,91 a 1 (Tabela 2). Em relação aos três genes de referência utilizados (ACT, GAPDH e eEF-1α) as estimativas de eficiência foram de 96,74%, 99,25% e 100,16%, respectivamente (Anexo 1). A análise de estabilidade dos genes de referência avaliada através do algoritmo NormFinder revelaram valores baixos e desejáveis, com estimativas de 0,007 para ACT, 0,012 para o GAPDH e de 0,006 para eEF-1α. 50 2 Tabela 2.Concentração de cada primer (forwarde reverse), valores de eficiência e valores de R , obtidos a partir da construção de gráficos de CT versus valores de log (base 2) das concentrações iniciais de template – concentrações referem-se às diluições seriadas de cDNA. Concentração (nM) forward reverse Eficiência da PCR R Slope Cu/ZnSOD1 25 25 100% 0,99 -3,3123 Cu/ZnSOD2 25 25 97% 0,99 -3,4 Cu/ZnSOD3 25 25 93% 0,91 -3,5 Gene 2 MnSOD 25 25 98% 0,99 -3,3621 FeSOD1 25 25 94% 0,99 -3,468 FeSOD2 50 50 101% 0,98 -3,285 Cu/ZnSOD4 25 25 99% 1 -3,34 Cu/ZnSOD5 25 25 98% 0,99 -3,3734 3.6 TECIDO FOLIAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO VEGETATIVO 3.6.1 ATIVIDADE DA SOD A atividade de SOD (Tabela 3) foi influenciada pelo estresse de seca em folhas de Douradão e BRS Primavera, nas plantas em fase inicial de seu desenvolvimento (estádio vegetativo) (Figura 7A). Entre os genótipos, a atividade de SOD foi significativamente superior em folhas de plantas de BRS Primavera cultivada em condição hídrica ótima. Já na condição de restrição hídrica, a atividade de SOD foi similar entre genótipos. Entre os regimes hídricos aplicados, folhas de plantas de BRS Primavera, quando submetidas à deficiência hídrica, apresentaram atividade de SOD significativamente reduzida (cerca de 29%), comparativamente às suas plantas controle; enquanto folhas de plantas de Douradão apresentaram tendência de aumento na atividade de SOD, quando submetidas à deficiência hídrica, comparativamente às suas plantas controle. 51 Tabela 3. Atividade de SOD e significância estatística por grupo em amostras de folhas e raízes de genótipos de arroz de terras altas submetidas à restrição hídrica, em dois estádios de desenvolvimento. GRUPO 1 2 3 4 ESTÁDIO TECIDO GENÓTIPO TRATAMENTO UNIDADE DE SOD Mg PROTEÍNA* VEGETATIVO FOLHA DOURADÃO 100% 91,06 VEGETATIVO FOLHA DOURADÃO 50% 125,43Cc VEGETATIVO FOLHA PRIMAVERA 100% 164,70Aa VEGETATIVO FOLHA PRIMAVERA 50% 116,82 REPRODUTIVO FOLHA DOURADÃO 100% 131,68 REPRODUTIVO FOLHA DOURADÃO 50% 104,95Cb REPRODUTIVO FOLHA PRIMAVERA 100% 52,64Bd REPRODUTIVO FOLHA PRIMAVERA 50% 112,17 VEGETATIVO RAIZ DOURADÃO 100% 139,87Ab VEGETATIVO RAIZ DOURADÃO 50% 76,53Bc VEGETATIVO RAIZ PRIMAVERA 100% 170,65Aa VEGETATIVO RAIZ PRIMAVERA 50% 112,15Ba REPRODUTIVO RAIZ DOURADÃO 100% 85,84Cb REPRODUTIVO RAIZ DOURADÃO 50% 268,00Aa REPRODUTIVO RAIZ PRIMAVERA 100% 93,84Cd REPRODUTIVO RAIZ PRIMAVERA 50% 172,56Bc -1 Bc Cb Aa Cc * letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). 3.6.2 EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD Considerando o mesmo genótipo submetido aos diferentes regimes hídricos, os níveis de transcritos das várias isoformas de SOD foram diferenciados (Figura 7B). Entre regimes hídricos, a expressão dos oito genes SOD (Tabela 4) foi significativamente aumentada em plantas submetidas ao tratamento de 50% do genótipo tolerante (Douradão) quando comparado ao tratamento controle (tratamento 100%). Para o genótipo sensível (BRS Primavera), aumentos significativos de expressão foram observadas para os genes Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD4, Cu/ZnSOD5, FeSOD2, enquanto para o gene CuZnSOD2, observou-se uma redução da expressão gênica na presença do estresse hídrico. Quanto aos genes Cu/ZnSOD1 e Cu/ZnSOD3 observou-se uma resposta similar quanto ao padrão de expressão nos genótipos tolerante e sensível, ou seja, um aumento na 52 expressão desses genes quando os genótipos isoladamente foram submetidos ao estresse, sendo que para o Douradão e BRS Primavera os níveis de expressão variaram de 1,43x a 2,62x e 1,47x a 2,48x, respectivamente, sem e com restrição hídrica (Figura 7B). Considerando os diferentes genótipos submetidos ao mesmo regime hídrico, cinco genes apresentaram maiores níveis significativos de indução de expressão (p ≤ 0,05) no genótipo tolerante quando submetido ao déficit hídrico (Cu/ZnSOD2, Cu/ZnSOD4, Cu/ZnSOD5, MnSOD, FeSOD1) em comparação com o genótipo sensível BRS Primavera. Apenas o gene FeSOD2 apresentou nível de expressão aumentado no genótipo sensível com restrição hídrica (1,57x) (Figura 7B). Em relação ao gene Cu/ZnSOD2, o aumento significativo na expressão observada no genótipo tolerante na presença do estresse foi acompanho de uma redução significativa (p ≤ 0,05) de expressão no genótipo sensível(BRS Primavera) na mesma condição (0,84x). As expressões foram aumentadas no genótipo tolerante submetido ao estresse em níveis que variaram do mínimo de 1,36x para o gene Cu/ZnSOD2ao máximo de2,05xpara Cu/ZnSOD5, apresentando valores intermediários de 1,90, 2 e 2,02x para os genes FeSOD1, MnSOD e Cu/ZnSOD4 respectivamente (Figura 7B). 3.6.3 RELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA Dentre as oito isoformas de SOD avaliadas nesse estudo, apenas o gene FeSOD2 apresentou nível de expressão aumentado no genótipo sensível com restrição hídrica (1,57x) em relação ao genótipo tolerante (1,23x) e não revelou uma associação com a atividade de SOD no genótipo BRS Primavera (Figura 7A), uma vez que o nível de atividade de SOD foi reduzido na presença do estresse. Quanto ao nível similar de atividade de SOD nos dois genótipos submetidos à deficiência hídrica, entende-se que os níveis de transcrição aumentados em cinco genes no genótipo tolerante não foram correlacionados com um aumento na atividade total da SOD na presença do déficit hídrico. Essa diferença pode indicar que alterações póstranscricionais, tais como inativação ou degradação das isoformas SOD pode ocorrer em função da seca no genótipo tolerante a esse tipo de estresse. 53 Tabela 4. Valores de RQ e significância estatística por grupo para os genes de SOD em amostras de folhas e raízes de genótipos de arroz de terras altas submetidas à restrição hídrica em dois estádios de desenvolvimento, utilizando os genes de referência ACT, eEF1-α e GAPDH. Grupo 1 Estádio de desenvolvimento 2 3 4 Cu/ZnSOD1 VEGETATIVO D. 100% F VEGETATIVO D. 50% F VEGETATIVO RQ* Amostra* P. 100% F Bb 1,00 1,43Aa Cu/ZnSOD2 Cb Cu/ZnSOD3 Bb MnSOD Cb FeSOD1 Cb FeSOD2 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Cd Cu/ZnSOD4 Cu/ZnSOD5 Cb Cb 1,00 1,00 1,36Aa 2,62Aa 2,00Aa 1,90Aa 1,23Bc 2,02Aa 2,05Aa Bc 1,07Cc 1,20Bd 0,84Cc 0,27Dc 0,95Cb 0,46Dd 0,92Cd Ac 1,47 0,84Bd 2,48Ac 1,03Bc 0,35Bc 1,57Aa 0,94Bc 1,22Bc 1,13 VEGETATIVO P. 50% F REPRODUTIVO D. 100% F 1,00Aa 1,00Ba 1,00Bb 1,00Cb 1,00Aa 1,00Cb 1,00Bb 1,00Cc REPRODUTIVO D. 50% F 0,45Bb 0,99Aa 1,94Aa 1,59Aa 0,38Db 1,62Aa 1,45Aa 0,76Bd REPRODUTIVO P. 100% F 0,09Cd 0,89Cc 1,23Bc 0,44Dd 0,003Bd 0,18Dd 1,04Bc 0,31Db Bc Ab Cc Bc Bc Cd REPRODUTIVO P. 50% F VEGETATIVO VEGETATIVO 0,48 1,03 1,12 0,95 0,54 0,93 D. 100% R 1,00Cb 1,00Aa 1,00a 1,00Cb 1,00Cb D. 50% R 5,51Aa 0,69Cb 0,39Cb 1,54Aa Cc Bc 0,71 Bc 0,24 Dc 0,63 0,65 Bc 0,70 Cc 0,10 Dd 0,66 Bc 0,30 Cb 1,00 Bb 1,00 Dc 1,00 Cb 1,00 Aa 0,52 Dc 0,45 Bc 8,33 Aa 2,25 VEGETATIVO P. 100% R 0,83 VEGETATIVO P. 50% R 0,64 REPRODUTIVO D. 100% R 1,00 REPRODUTIVO D. 50% R 9,43 REPRODUTIVO REPRODUTIVO Cc P. 100% R P. 50% R Cd 0,75 Bc 3,97 Aa 1,19 Ca 1,31 Cb 2,25 Aa 3,14 Cd 0,99 Bc 1,89 Aa 0,47 1,02 1,00Cb 1,00Aa 1,00Aa 2,38Aa 2,78Aa 0,86Cb 0,95Ca Dc 0,50 Dc Bc 0,37 0,43 Bd 0,39 Bc 0,29 Dd 0,45 Cc 1,00 Cb 1,00 Bc 1,00 Bc 6,17 Aa 0,67 Cd 1,09 0,30 Cc Cb 0,15 Aa 18,0 0,70 Bc Bb Db Dc Bc Aa 1,49 Db 3,99Aa 1,04 0,41 Cb * (D.) Douradão; (P.) Primavera; (F) Folha; (R) Raiz; (RQ) Quantificação Relativa. letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). 54 Figura 7. Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos foliares de arroz de terras altas no estádio vegetativo (Época 1). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT, eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). 55 3.7 TECIDO FOLIAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO REPRODUTIVO 3.7.1 ATIVIDADE DA SOD Análises da atividade de SOD em folhas de Douradão e BRS Primavera, em plantas na fase reprodutiva, demonstraram que o estresse de seca influenciou significativamente a resposta dessa enzima em ambos os genótipos (Figura 8A). Entre os genótipos, a atividade de SOD foi significativamente inferior em folhas de plantas de BRS Primavera cultivada em condição hídrica ótima quando comparada à atividade de SOD em folhas de plantas de Douradão na mesma condição. Em condições de restrição hídrica, os dois genótipos apresentaram similaridade na atividade de SOD. Entre os regimes hídricos, enquanto plantas de BRS Primavera apresentaram aumento significativo na atividade de SOD, cerca de 213%, quando cultivadas sob deficiência hídrica; plantas de Douradão apresentaram redução significativa, em torno de 20%. Entretanto, mesmo tendo observado declínio na atividade de SOD em folhas de plantas de Douradão, verifica-se que essa atividade (104,9 UN SOD mg-1 de proteína) foi similar estatisticamente, à de folhas de BRS Primavera (112,1 UN SOD mg-1 de proteína), quando cultivadas com disponibilidade de 50% de água. Isso sugere que ambos os genótipos, em folhas na fase reprodutiva, possuem um sistema de defesa antioxidativo bem ativo, representado nesse estudo pela enzima SOD. 3.7.2 EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD Padrão diferencial de expressão foi observado para as isoformas SOD, em folhas de plantas de Douradão e BRS Primavera no estádio reprodutivo, quando cultivadas sob condições normais e de restrição hídrica (Figura 8B). Para o genótipo Douradão submetido aos diferentes regimes hídricos (Letras minúsculas nos gráficos) dos oito genes avaliados, quatro apresentaram expressão significativamente aumentada (p ≤ 0,05) na presença da deficiência hídrica (Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD4, MnSOD e FeSOD2) quando comparados aos respectivos tratamentos controle. Contrariamente, os genes CuZnSOD1, CuZnSOD5 e FeSOD1 apresentaram redução do nível de expressão no genótipo tolerante na presença do estresse. 56 Para o genótipo BRS Primavera em plantas com restrição hídrica os genes mais significativamente expressos foram Cu/ZnSOD1, Cu/ZnSOD2, Cu/ZnSOD5, MnSOD, FeSOD1 e FeSOD2, enquanto os genes CuZnSOD3 e CuZnSOD4 reduziram a expressão (Figura 8B). A comparação entre genótipos nas mesmas condições de irrigação revelou quatro genes com expressão aumentada em plantas tolerantes estressadas, quando comparados ao sensível nas mesmas condições, (Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD4,MnSOD e FeSOD2). Os níveis de expressão aumentados foram da ordem de 1,94x, 1,45x, 1,59x e 1,62x respectivamente. Já os genes Cu/ZnSOD1 e FeSOD1 foram negativamente regulados em plantas tolerantes quando comparadas com sensível, ambas com estresse (p ≤ 0,05). Apenas o gene CuZnSOD5 apresentou indução no nível de expressão no genótipo sensível com estresse (1,02x), enquanto no tolerante houve redução (Figura 8B). 3.7.3 RELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA Tomando o conjunto de resultados, conclui-se que não houve associação entre o nível de expressão e a atividade de SOD em plantas do genótipo BRS Primavera, pelo fato de que, de uma forma geral, não foi observado aumento significativo da expressão em nenhum dos genes SOD; em contraste houve aumento significativo da atividade de SOD em plantas cultivadas sob restrição hídrica. Os três genes (Cu/ZnSOD1, FeSOD1 e CuZnSOD5) que em conjunto apresentaram aumento de expressão em plantas submetidas à restrição hídrica no genótipo sensível, quando comparado a planta-controle, pode ter contribuído para o aumento significativo da atividade de SOD nesse mesmo genótipo quando submetida ao estresse. Já para o genótipo Douradão o aumento da expressão dos quatro genes Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD4, MnSOD e FeSOD2 não contribuiu para manter e/ou aumentar a atividade de SOD em condições hídricas desfavoráveis, mantendo o mesmo nível de atividade da SOD quando comparado ao genótipo sensível (p ≤ 0,05). 57 Figura 8. Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos foliares de arroz de terras altas no estádio reprodutivo (Época 2). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT, eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3) 58 . 3.8TECIDO RADICULAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO VEGETATIVO 3.8.1 ATIVIDADE DA SOD A atividade de SOD foi influenciada pelo estresse de seca em raízes de plantas de Douradão e BRS Primavera, em fase inicial de seu desenvolvimento (estádio vegetativo) (Figura 9A). Entre os genótipos, não houve diferença significativa na atividade de SOD em raízes de plantas cultivadas sob condição hídrica ótima, como também naquelas cultivadas sob condição de deficiência hídrica. Entre os regimes hídricos aplicados, tanto raízes de plantas de Douradão quanto às de BRS Primavera apresentaram redução na atividade de SOD; enquanto no primeiro a redução foi da ordem de 45% no segundo a redução foi de, aproximadamente 34%, comparativamente às respectivas plantas controle. O genótipo BRS Primavera, sensível à deficiência hídrica, experimentou um decréscimo na atividade de SOD, tanto na parte aérea quanto na raiz de plantas cultivadas sob deficiência hídrica, em fase inicial do desenvolvimento das plantas; Douradão, genótipo tolerante à deficiência hídrica, experimentou decréscimo na atividade de SOD na raiz e aumento na parte aérea. Isso sugere que a ativação do sistema de defesa antioxidativo, no genótipo Douradão, pode ter sido em decorrência de outros tipos de estresse abiótico, como alta temperatura e/ou alta radiação, os quais ocorreram concomitantemente com o estresse de seca, uma vez que a experimentação foi conduzida em casa de vegetação e, nesse ambiente, é natural a ocorrência de sobreposição de estresses. 3.8.2EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD Para o tecido radicular, estádio vegetativo, observou-se resposta diferencial quanto ao nível de expressão para as isoformas de SOD de modo independente para os genótipos na presença e ausência de estresse hídrico (Figura 9B). Considerando o mesmo genótipo submetido aos diferentes regimes hídricos, maior expressão, com aumento da ordem de 5,51x em relação ao tratamento controle, foi para o gene Cu/ZnSOD1no genótipo tolerante com estresse, enquanto no genótipo sensível, nas mesmas condições de cultivo, foi observado a menor expressão (0,64x). Do mesmo 59 modo, os genes FeSOD1, FeSOD2 e MnSOD foram mais expressos no genótipo tolerante com estresse (p ≤ 0,05) da ordem de 2,38x, 2,78x e 1,54x, respectivamente, enquanto no sensível as expressões foram reduzidos em 0,30x, 0,39x e 0,66x (Figura 9B). Quanto ao contraste entre os genótipos nas mesmas condições de irrigação os genes CuZnSOD1, MnSOD, FeSOD1 e FeSOD2 foram mais expressos no genótipo tolerante, quando comparado ao sensível, ambos com estresse. Todos os demais genes (CuZnSOD2, CuZnSOD3, CuZnSOD4 e CuZnSOD5) foram downregulated nos genótipos contrastantes com restrição hídrica (p ≤ 0,05). Para nenhum gene foi observado aumento do nível de expressão em plantas estressadas do genótipo sensível, quando comparado ao tolerante (Figura 9B). 3.8.3 RELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA Em raízes de plantas de Douradão cultivadas sob deficiência hídrica, quatro genes que codificam a isoforma CuZn (Cu/ZnSOD2, Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD4 e Cu/ZnSOD5) foram regulados negativamente tendo como referência o genótipo tolerante sem restrição hídrica (1x). Em raiz de BRS Primavera foi verificada redução na atividade e do nível de expressão de todos os genes SOD em plantas cultivadas com restrição hídrica de 50%, corroborando com a redução de expressão de três isoformas de SOD, enquanto as demais não alteraram níveis de expressão na presença de estresse. Paralelamente, no genótipo tolerante, ocorreu também redução acentuada na atividade de SOD, indicando que a superexpressão de várias isoformas de SOD não contribuíram de modo direto em maior atividade da enzima. Essa diferença pode indicar que alterações pós-transcricionais, tais como inativação ou degradação das isoformas SOD, ocorrem em função da seca no genótipo tolerante a esse tipo de estresse em raízes durante o estádio vegetativo. 60 Figura 9. Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos radiculares de arroz de terras altas no estádio vegetativo (Época 1). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT,eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). 61 3.9 TECIDO RADICULAR DE PLANTAS DE ARROZ DE TERRAS ALTAS NO ESTÁDIO REPRODUTIVO 3.9.1 ATIVIDADE DA SOD Análises da atividade de SOD em raízes de Douradão e BRS Primavera, em plantas na fase reprodutiva, demonstraram que o estresse de seca influenciou significativamente a resposta da enzima da linha de frente do sistema de defesa antioxidativo (Figura 10A). Em raízes de plantas de Douradão e BRS Primavera, cultivadas sem restrição hídrica, não diferiram entre si, apresentando atividade de SOD igual a 85,8 UN SOD mg-1 proteína e93,84 UN SOD mg-1 proteína, respectivamente. Já para condição de baixa disponibilidade hídrica, raízes de plantas de Douradão apresentaram atividade de SOD (268,0 UN SOD mg -1 proteína), significativamente superior, às raízes de plantas de BRS Primavera (172,6 UN SOD mg-1 proteína). Entre os regimes hídricos impostos, tanto raízes de Douradão quanto raízes de BRS Primavera apresentaram atividade de SOD significativamente superior quando as plantas foram cultivadas em condição de deficiência hídrica. Enquanto o genótipo Douradão apresentou aumento de 212%, o genótipo BRS Primavera apresentou aumento de 84% em relação às suas respectivas plantas controle. 3.9.2 EXPRESSÃO GÊNICA DA SOD No tecido radicular, estádio reprodutivo, para o genótipo tolerante na presença do estresse observou-se aumento na expressão dos genes Cu/ZnSOD1, MnSOD e FeSOD2, enquanto no genótipo sensível o aumento foi para os genes Cu/ZnSOD1, Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD5, MnSOD e FeSOD1, em relação às respectivas plantacontrole (p ≤ 0,05). O gene e FeSOD2 foi aumentado, exclusivamente, no genótipo tolerante, enquanto os genes Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD5 e FeSOD1 foram aumentados somente no sensível. Para os genes Cu/ZnSOD2 e Cu/ZnSOD3 enquanto a regulação no genótipo tolerante foi negativa (downregulated),no sensível, sob a mesma condição de estresse, esses genes foram upregulated. Já para o gene Cu/ZnSOD4 observou-se uma regulação negativa significativa nos genótipos Douradão e BRS Primavera na presença do estresse hídrico, com estimativas de expressão reduzidas da ordem de 0,67x e 0,41x, respectivamente (Figura 10B). 62 Considerando os diferentes genótipos submetidos ao mesmo regime hídrico (Figura 10B), para os genes CuZnSOD1, MnSOD e FeSOD2 o nível de expressão foi superior em plantas estressadas do genótipo tolerante, quando comparados ao genótipo sensível nas mesmas condições, da ordem de 9,43x, 8,33x e 6,17x, respectivamente. O maior nível de expressão foi observado para o gene FeSOD1, cuja expressão foi aumentada no genótipo BRS Primavera com estresse (18x). Os genes CuZnSOD5 e CuZnSOD3 também apresentaram níveis superiores de expressão na presença do déficit hídrico, apresentando aumento na ordem de 3,99x e 3,14x respectivamente, quando comparados ao genótipo tolerante nas mesmas condições hídricas. 3.9.2 RELAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EXPRESSÃO GÊNICA O tecido radicular de plantas no estádio reprodutivo foi o único a apresentar atividade de SOD aumentada nos dois genótipos na presença da deficiência hídrica, sendo maior para o genótipo tolerante (p ≤ 0,05). Esse mecanismo de defesa pode estar potencialmente relacionado ao estresse sofrido pela falta de água em uma fase crítica de desenvolvimento para planta. Para os genótipos tolerante e sensível, somente dois genes foram coincidentes quanto ao padrão de expressão aumentados quando submetidos ao estresse (CuZnSOD1, MnSOD), sendo que o nível de expressão desses genes foi significativamente maior para o tolerante. Desse modo, a atividade aumentada de SOD no genótipo tolerante pode ser resultante tanto da maior expressão desses dois genes, quanto devido ao gene FeSOD2 cuja expressão foi aumentada somente no tolerante. 63 Figura 10. Efeito do déficit hídrico sobre a atividade de SOD e os níveis de expressão dos genes que codificam as isoformas de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD e FeSOD) em tecidos radiculares de arroz de terras altas no estádio reprodutivo (Época 2). (a) Atividade de SOD, letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Primavera 100%); e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa (ex.: Douradão 100% x Douradão 50%) (p ≤ 0,05, n = 3). (b) Quantificação relativa (RQ) da expressão diferencial dos genes de SOD determinada por qPCR, utilizando ACT, eEF-1α e GAPDH como normalizadores; letras maiúsculas distintas entre os diferentes genótipos com o mesmo regime hídrico indicam diferença estatística significativa; e letras minúsculas distintas entre regimes hídricos diferentes do mesmo genótipo indicam diferença estatística significativa para cada gene (p ≤ 0,05, n = 3). 64 4. ANÁLISE DE CORRELAÇÃO LINEAR DE PEARSON Para se conhecer o relacionamento entre as variáveis atividade enzimática (AE) e expressão gênica (RQ), calculou-se o coeficiente de correlação linear de Pearson, r, a partir dos valores médios de atividade enzimática (AE), obtida pelo método espectrofotométrico, e expressão gênica, obtida pelo método de quantificação relativa (RQ), de ambos os genótipos Douradão (genótipo tolerante) e BRS Primavera (genótipo sensível) nos tratamentos 100% e 50% em folhas e raízes em cada estádio de desenvolvimento (vegetativo e reprodutivo). A partir da análise de correlação verificou-se que no estádio vegetativo (época 1), tecido foliar, não houve correlação entre as variáveis em estudo, com r→0. Já no tecido radicular foram observadas correlações negativas para atividade enzimática e a expressão dos genes CuZnSOD1, com r = -0,78, MnSOD, com r = -0,76, e FeSOD2, com r = -0,76, com destaque para o aumento nos valores de RQ e diminuição nos valores de AE do genótipo tolerante após a imposição de restrição hídrica. No estádio reprodutivo (época 2), foi observada no tecido foliar correlação positiva para os genes CuZnSOD1, com r = 0,92, CuZnSOD2, com r = 0,89, CuZnSOD5, com r = 0,96, FeSOD1, com r = 0,94 com diminuição nos valores de RQ e AE no genótipo tolerante e aumento dos valores de RQ e AE no genótipo sensível. No tecido radicular foi observado correlação positiva de CuZnSOD1, com r = 0,99, MnSOD, com r = 0,94, e FeSOD2, com r = 0,88, com aumento nos valores de RQ e AE nos dois genótipos. 65 5. DISCUSSÃO Os componentes do sistema de defesa antioxidativo trabalham de forma bem coordenada e ativa em resposta às situações de estresse que normalmente intensificam a produção de EROs causando danos ao organismo (Mittler 2002; Foyer e Noctor, 2005). Nesse estudo, as condições de restrição hídrica no qual o arroz de terras altas foi submetido em ambiente de casa de vegetação nos estádios vegetativo e reprodutivo, induziram o estresse de seca nas plantas conforme descrito por Silveira et al (em elaboração). Na cultivar tolerante, Douradão, menores índices de redução de produtividade foram observados no tratamento de 50% de restrição hídrica, quando comparado com a cultivar sensível BRS Primavera (Lanna et al., 2013). Diversos autores têm relatado que plantas de arroz de terras altas sofrem estresse hídrico acentuado devido ao sistema radicular relativamente pequeno, rápido fechamento estomático durante estresse moderado por seca, provocando uma redução acentuada na taxa fotossintética (Hirasawa, 1999; Ji et al., 2012). A avaliação da metaloproteina SOD tanto em nível de expressão gênica, quanto de atividade enzimática, na presença e ausência de estresse hídrico, possibilitou avaliar e avançar no conhecimento de um importante mecanismo de tolerância à deficiência hídrica em planta de arroz de terras altas. A SOD representa um dos componentes enzimáticos do sistema de defesa antioxidativo, integrando um grupo de metaloenzimas multiméricas que catalisa a conversão de O2•- a H2O2,em diferentes compartimentos celulares (Salvador e Henriques, 2004). A indução desta enzima reflete o seu importante papel no mecanismo de defesa da planta (Ashraf e Ali 2008) e vários estudos, em nível de expressão gênica e atividade enzimática, têm sido conduzidos para se descobrir a importância da enzima SOD na presença de estresses abióticos, tais como o estresse à seca, salinidade, frio, temperaturas elevadas (Srivalli et al.,2003; Wang et al., 2004; Ara et al., 2013; Thounaojam et al., 2012; Aydin et al., 2013). Na análise do tecido foliar para ambas cultivares, em estádios vegetativo e reprodutivo, diferentes níveis de atividade de SOD foram observados. Enquanto no estádio vegetativo a atividade de SOD decresce no sensível e permanece estável no tolerante, no reprodutivo observa-se um aumento no sensível e uma redução no tolerante. Resultados semelhantes foram observados por Basu et al (2010), em 66 arroz da subespécie Indica quando induzidos à seca por polietilenoglicol (PEG), os quais relataram diminuição na atividade de SOD em tecido foliar no genótipo sensível, enquanto no tolerante a atividade não foi alterada. Segundo esses autores, manutenção na atividade de SOD no genótipo tolerante é decorrente de uma provável redução na síntese de EROs, uma vez que plantas tolerantes apresentam ativação paralela de outros mecanismos de tolerância, especialmente, àqueles ligados ao rearranjo na composição da membrana lipídica, modificação no aparato fotossintético, maior indução de antioxidantes não enzimáticos, dentre outros, enquanto plantas sensíveis, podem não possuir a capacidade de fazer todos esses ajustes celulares quando submetidas a severas condições de estresse hídrico. Em raízes, aumentos significativos na atividade de SOD foram observados para os dois genótipos no estádio reprodutivo (maior para o tolerante, p ≤ 0,05), enquanto no vegetativo houve redução. Os resultados mostram que a planta de arroz de terras altas, no estádio vegetativo, pode não ativar o sistema de defesa antioxidativo em detrimento da ativação de outros mecanismos, e que, no estádio reprodutivo, esse mecanismo seja mais demandado, provavelmente para desencadear uma maior proteção em uma etapa crítica da planta, onde o genótipo necessita assegurar a produção de sementes. No experimento de deficiência hídrica conduzido por Silveira et al (em elaboração) utilizando os mesmos genótipos desse estudo, foi demonstrado que a variedade Douradão (tolerante), apesar de apresentar redução nos índices de produtividade quando o estresse foi aplicado no estádio reprodutivo, ainda produziu mais do que o genótipo sensível (BRS Primavera). Esses resultados, em conjunto, demonstram que o estresse hídrico no período reprodutivo é mais crítico, porém, observou-se através do estudo atual que a planta tolerante tende a aumentar consideravelmente a produção de SOD, provavelmente, como mecanismo de proteção celular que promove reflexo direto em minimizar as perdas de produtividade. Segundo Sairam e Saxena (2000), as enzimas antioxidantes e metabólitos que regulam o status redox celular aumentam sob vários estresses, com sua atividade comparativamente mais elevada em genótipos tolerantes, sugerindo que uma maior atividade antioxidante transmite maior tolerância à planta. No estudo atual, atividade de SOD foi maior na raiz, o que é bastante coerente já que o principal órgão de percepção inicial da condição de baixa disponibilidade 67 hídrica no solo é a raiz, bem como pelo fato de que o processo antioxidativo nas folhas pode não ter sido desencadeado em função da severidade e duração do estresse. Na parte aérea da planta, diversos mecanismos de adaptação morfofisiológicos podem integrar os mecanismos de defesa, como a estrutura da planta, fechamento estomático, redução das taxas fotossintética e transpiratória, dentre outros (Gloser e Gloser, 1996; Yordanov et al., 2000). Em plantas de arroz submetidas à toxicidade de alumínio e deficiência de fósforo no solo observou-se aumento na atividade de SOD na raiz, enquanto em tecido foliar houve decréscimo (Tian-rong et al., 2012). A partir de análise in silico foram identificados, até o momento oito genes da SOD diferencialmente expressos ao longo do desenvolvimento de plantas de arroz. Análises filogenéticas revelaram que os genes MnSOD, FeSOD1 e FeSOD2 apresentam-se mais próximas filogeneticamente (agrupadas em um clado), enquanto a Cu/ZnSOD é mais divergente (outro clado), além de apresentar uma sequência gênica mais conservada (Nath et al., 2013). O gene CuZn-SOD CCh, mais divergente, não é uma enzima e sim um homólogo à chaperona de cobre para CuZnSOD (Huang et al., 2012). Segundo Fink e Scandalios (2002) a maior diferença entre as SOD está nas sequências reguladoras dos genes que codificam estas proteínas e cada proteína responde de modo diferenciado ao estresse oxidativo, em diferentes níveis. Quanto as oito isoformas de SOD avaliadas nesse estudo, observou-se bastante variação no padrão de expressão e ativação de um maior número de genes no tecido foliar, quanto comparado ao radicular, para um mesmo genótipo quando imposto o estresse hídrico. Os oito genes caracterizados foram upregulated no tecido foliar, com mais genes expressos na fase vegetativa do tolerante (oito genes no tolerante e quatro no sensível), quando comparada com a reprodutiva (quatro no tolerante e seis no sensível). Entretanto, a atividade enzimática da SOD foi aumentada (p ≤ 0,05) somente no estádio reprodutivo no genótipo sensível, não demonstrando, com base nesses resultados, uma relação direta entre expressão gênica e atividade enzimática. Essas observações podem tanto decorrer de um componente de variação experimental, quanto indicarem a ação de prováveis mecanismos pós-transcricionais, traducionais e pós-traducionais que podem estar sendo ativados, reduzindo a atividade da SOD (Nelson e Cox, 2013). Nesse cenário, certamente, outros mecanismos de detoxificação de EROS, 68 tais como as enzimas ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT), glutatione peroxidase (GPX), dentre outras, estão desempenhando essa função de proteção (Miller et al., 2008), principalmente no genótipo tolerante. Quanto ao nível de expressão dos genes de SOD em folhas, durante o estádio reprodutivo, foi observado para o genótipo tolerante o aumento da expressão de quatro genes Cu/ZnSOD3, Cu/ZnSOD4, MnSOD e FeSOD2, ou seja, nesse genótipo houve a participação de todas isoformas SOD, o que pode ter auxiliado a manter um maior nível de atividade de SOD mesmo em condições hídricas desfavoráveis. Já para o genótipo BRS Primavera não foi observado aumento expressivo em nenhum gene nas mesmas condições citadas acima quando comparado ao genótipo Douradão. Para o tecido radicular, fase vegetativa, somente quatro genes foram superexpressos, sendo todos no genótipo tolerante, enquanto no reprodutivo, seis genes foram upregulated, dos quais três (Cu/ZnSOD1, MnSOD, FeSOD2) tiveram significativamente mais transcritos no genótipo tolerante, podendo estar diretamente relacionados com níveis aumentados (p ≤ 0,05) de atividade de SOD nesse mesmo genótipo. Como a atividade de SOD decresceu na fase vegetativa, seguido por um aumento significativo na fase reprodutiva, pode-se sugerir uma relação positiva entre os níveis de expressão das isoformas Cu/ZnSOD1, MnSOD, FeSOD2 e uma maior tolerância da planta na presença da deficiência hídrica. Bhoomika et al. (2013) também relatam um aumento na expressão do gene FeSOD em tecido radicular de arroz de plantas tolerante submetidas ao estresse de alumínio. De acordo com Raychaudhuri (2000) a enzima FeSOD é predominantemente encontrada em plastídeo em planta superiores, já a MnSOD em matriz mitocondrial. Diversos estudos têm relatado uma correlação positiva entre a expressão aumentada do gene MnSOD e maior tolerância das plantas a estresses ambientais (Bowler et al., 1991; Wu et al., 1999; Wang et al., 2005; Dai et al., 2009; Bai et al., 2009; Que et al., 2012). Foi possível observar que os genes da SOD, cujo metal do centro ativo é o Cu/Zn, tiveram as expressões aumentadas para um mesmo genótipo na presença do estresse hídrico, predominantemente, em tecido foliar, fase vegetativa e genótipo 69 tolerante. Trata-se de uma enzima encontrada principalmente no cloroplasto e citosol, o que justifica a expressão aumentada em parte aérea. Adicionalmente os genes MnSOD, FeSOD1 e FeSOD2 tiveram suas expressões aumentadas em todos os tecidos e estádios de desenvolvimento, sendo que a MnSOD foi sempre aumentada no genótipo tolerante submetido ao estresse. Desse modo, a avaliação desses genes pode ser fortemente sugerida como um candidato para seleção indireta de materiais vegetais resistentes à seca, a exemplo do sugerido por Zaefyzadeh et al. (2009). Portanto, esses resultados, tomados em conjunto, sugerem que plantas de Douradão, com baixa disponibilidade de água, possuem maior ativação do sistema de defesa antioxidativo, via SOD, tanto em nível de transcrição quanto de tradução e isso pode ser melhor visualizado no tecido radicular, estádio reprodutivo. Apesar do aumento da atividade de enzimas antioxidantes sob estresse hídrico ser extremamente variável entre as várias espécies de plantas e até mesmo entre duas cultivares de uma mesma espécie (Reddy et al., 2004), certamente, os diferentes padrões de indução em nível de atividade e/ou expressão gênica da SOD, reportados nesse estudo em plantas de arroz de terras altas, devem ser fortemente considerados para elucidar os mecanismos celulares de tolerância à seca. Esses achados têm como objetivo subsidiar programas de melhoramento para desenvolvimento de cultivares mais eficiente e mais bem adaptada às áreas propensas à deficiência hídrica. 70 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 1 – Plantas de arroz de terras altas durante o estádio vegetativo, podem não ativar o sistema de defesa antioxidativo em detrimento da ativação de outros mecanismos, tais como, fechamento estomático, aumento de eliminadores não enzimáticos, dentre outros; 2 – Os genes da SOD, cujo metal do centro ativo é o Cu/Zn, apresentaram maior expressão em folhas de Douradão durante a fase vegetativa na presença do estresse hídrico, provavelmente pelo fato desses genes serem encontrados principalmente nos cloroplastos e citosol; 3 – Plantas tolerantes tendem a aumentar a produção de SOD, provavelmente, como mecanismos de proteção celular que promove reflexo direto em minimizar as perdas de produtividade; 4 – Plantas de Douradão sob estresse hídrico possuem maior ativação do sistema de defesa antioxidativo, via SOD, tanto em nível de transcrição quanto de tradução, principalmente na fase reprodutiva em tecido radicular; Tabela 5. Resumo da expressão dos genes SOD em plantas de arroz de terras altas sob estresse de seca em dois estádios de desenvolvimento vegetativo e reprodutivo e em dois tecidos, folha e raiz. Vegetativo Reprodutivo Gene Genótipo Folha Raiz Folha Raiz Douradão + +ꜛ - +ꜛ Primavera Douradão CuZnSOD2 Primavera Douradão CuZnSOD3 Primavera Douradão CuZnSOD4 Primavera Douradão CuZnSOD5 Primavera Douradão MnSOD Primavera Douradão FeSOD1 Primavera Douradão FeSOD2 Primavera + = - + + - = - CuZnSOD1 - = + = + - +ꜛ - + - - +ꜛ +ꜛ - + - + - - - +ꜛ = - = + = +ꜛ +ꜛ +ꜛ +ꜛ +ꜛ +ꜛ = = + + +ꜛ +ꜛ - + = - + +ꜛ = +ꜛ +ꜛ +ꜛ +ꜛ = + = +ꜛ aumento significativo da expressão em relação ao controle ; = a expressão se manteve igual ao controle; + aumento da expressão em relação ao controle. 71 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, RAFF M, ROBERTS K, WALTER P. Biologia molecular da célula. Título original: Molecular biologyofthecell. Tradução de Ana Letícia de Souza Vanz ... [et al.]. 5 ed. Porto Alegre: Artmed;2010. p. 1268. ALLAN WL, SIMPSON JP, CLARK SM, SHELP BJ. Gamma-Hydroxybutyrate accumulation in Arabidopsis and tobacco plants is a general response to abiotic stress: putative regulation by redox balance and glyoxylate reductase isoforms. J. Exp. Bot 2008 59(9)2555-2564. ALONSO CES. Pesquisa de Cereulida em isolados do grupo Bacilluscereus. Lisboa.Dissertação – [Faculdade de Medicina Veterinária] - Universidade Técnica de Lisboa;2008. ALSCHER RG,DONAHUE JL, CRAMER CL. Reactive oxygen species and antioxidants: Relationships in green cells. PhysiologiaPlantarum 1997 100(2):224-233. ALSCHER RG, ERTURK N, HEATH LS. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany, 2002 53(372)1331-1341. ANDERSEN CL, JENSEN JL, ØRNTOFT TF. Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets. CancerResearch, 200464(15)5245-5250. ANDRADE ER, MELO-STERZA FA, SENEDA MM, ALFIERIAA. Consequências da produção das espécies reativas de oxigênio na reprodução e principais mecanismos antioxidantes. Rev. Bras. Reprod. Animabr./jun. 2010 34(2)79-85. APEL K,& HIRT H. Reative oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review Plant Biotechnology 2004 55(2)373-399. ARA N, NAKKANONG K, LV W, YANG J, HU Z, ZHANG M. Antioxidant enzymatic activities and gene expression associated with heat tolerance in the stems and roots of two cucurbit species (“Cucurbita maxima” and Cucurbitamoschata”) and their interspecific inbred line “Maxchata”. Int. J. Mol. Sci. 2013 14(1)24008-24028. ASHRAF M, ALI, Q. Relative membrane permeability and activities of some antioxidante enzymes as the key determinats of salt tolerance in canola (Brassica napus L.). Environmental and Experimental Botany 2008 63:266-273. 72 AYDIN SS, BÜYÜK I, ARAS S. Relationships among lipid peroxidation, SOD enzyme activity, and SOD gene expression profile in Lycopersicumesculentum L. exposed to cold stress. Genet.Mol. Res.2013 12(3)3220-3229. BAI T, WANG Y, ZHANG X, XU X, HAN ZH. The effect of ultraviolet radiation on water-logging resistance in Tibetan peach.African Journal Biotechnology 2009 8(23)6596-6602. BARBAU-PIEDNOIR E, LIEVENS A, VANDERMASSEN E, MBONGOLOMBELLA EG, LEUNDA-CASI A, ROOSENS N, SNEYERS M, BULCKE MVD. Four new SYBR® Green qPCR screening methods for the detection of Roundup Ready®, LibertyLink®, and CryIAb traits in genetically modified products. Eur Food Res Technol.2012 234:13-23. BASUS, ROYCHOUDHURY A, SAHA PP, SENGUPTADN. Differential antioxidative responses of indica rice cultivars to drought stress. Plant Growth Regul 2010 60:51–59. BHOOMIKA K, PYNGROPE S, DUBEY RS. Differential responses of antioxidant enzymes to aluminum toxicity in two rice (Oryza sativa L.) cultivars with marked presence and elevated activity of Fe SOD and enhanced activities of Mn SOD and catalase in aluminum tolerant cultivar. PlantGrowthRegul. 2013 71:235–252. BINNECK E. As ômicas: integrando a bioinformação. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento 2004 1(32)28-37. BOHNERT HJ, JENSEN RG. Strategies for engineering water-stress tolerance in plants. TrendsBiotechnol1996 14:89-97. BORÉM A, RAMALHO MAP. Estresses abióticos: desafios do melhoramento de plantas nas próximas décadas. In: FRITSCHE-NETO, R.; BORÉM, A. Melhoramento de plantas para condições de estresses abióticos. 1. ed. Visconde do Rio Branco: Suprema, 2011.p. 9-28. BOWLER C, SLOOTEN L, VANDENBRANDEN S, DE RYCKE R, BOTTERMAN J, SYBESMA C, VAN MONTAGU M, INZÉ D.Manganesesuperoxide dismutase canreducecellulardamagemediatedbyoxygenradicals in transgenicplants. EMBO J. 1991 7: 1723-173. BOWLER C, MONTAGU MV, INZÉ D. Superoxide dismutase and stress tolerance. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992 43: 83-116. BOWLER C, VAN CAMP W, VAN MONTAGU M, INZE D. Superoxide dismutase in plants. Critical Reviews in Plants Sciences. Palo Alto 1994 13(3)199-218. 73 BRADFORD MM. A rapide and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 1976 72(1-2):248-254. BRAY, EA. Plant responses to water deficit. Trends Plant Sci. 1997 2: 48-54. BROU YC, ZÉZÉ A, DIOUF O, EYLETTERS M. Water stress induces overexpression of superoxide dismutases that contribute to the protection of cowpea plants against oxidative stress. African Journal of Biotechnology 2007 6(17):1982-1986. BUSTIN SA, BENES V, GARSON JA, HELLEMANS J, HUGGETT J, KUBISTA M, MUELLER R, NOLAN T, PFAFFL MW, SHIPLEY GL, VANDESOMPELE J, WITTWER, CT. The MIQE Guidelines: Minimum information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry. 2009 55(4). BUSTIN SA, MUELLER R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 2005 109: 365–379. CALDANA C, SCHEIBLE WR, MUELLER-ROEBER B, RUZICIC S. A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors.Plant Methods, London, 2007 3(7)1-9. CAMPOS H, COOPER M, HABBEN JE, EDMEADES GO, SCHUSSLER JR. Improving drougth tolerance in maize: a view from industry. Field Crops Research. 2004, 90(1)19-34 DOI: 10.1016/j.fcr.2004.07.003. CARNEIRO NP. Abordagens genômicas para tolerância a seca em cereais. In: SIMPÓSIO SOBRE TOLERÂNCIA À DEFICIÊNCIA HÍDRICA EM PLANTAS: ADAPTANDO AS CULTURAS AO CLIMA DO FUTURO, 2010, Goiânia. Trabalhos apresentados... Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão, 2011. p. 89-99. (Embrapa Arroz e Feijão. Documentos, 265). CAVALCANTI FR. Atividade de enzimas antioxidativas e integridade de membranas em plantas de feijão-de-corda [Vignaunguiculata (L.) Walp] submetidas ao estresse salino. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Centro de ciências, Universidade Federal do Ceará. 62p. 2002. CAVATTE PC, MARTINS SCV, MORAIS LE, SILVA PEM, SOUZA LT, DAMATTA FM. A fisiologia dos estresses abióticos. In: FRITSCHE-NETO, R.; BORÉM, A. Melhoramento de plantas para condições de estresses abióticos. 1. ed. Visconde do Rio Branco: Suprema,. p. 39-79, 2011. CHANDRU HK, KIM E, KUK Y, CHO K, HAN O. Kinects of wound-induced activation of antioxidative enzymes in Oryza sativa: differential activation at different growth stages. Plant Science, London, 2003 64: 935-941. CHAVES MM, MAROCO JP, PEREIRA JS. Understanding plant response to drought – from genes to the whole plant. Functional Plant Biology, 2003, 30: 239-264. 74 CHEN M, WANG QY, CHENG XG, XU ZS, LI LC, YE XG, MA YZ. GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants. Biochemical and Biophysical Research Communications, New York, 2007 353:299-305. CHINNUSAMY V, SCHUMAKER K, ZHU J-K. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress sinalling in plants. Journal of Experimental Botany, 2004, 55(395)225-236. CHO Un-H, SEO NAM-H. Oxidative stress in Arabidopsis thaliana exposed to cadmium is due to hydrogen peroxide accumulation. Plant Science 2005, 168:113-120. CHOMCZYNSKI P, SACCHI N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 1987, 156-159. CORREIA FLA. Desenho e montagem de método rápido para diagnóstico da Borreliose de Lyme por PCR em tempo real. Dissertação de Mestrado, Universidade Fernando Pessoa. Porto, 70 pp. 2007. CORTE VB, BORGES ELL, LEITE HG, PEREIRA BLC, GONÇALVES JFC. Estudo enzimático da deterioração de sementes de Melanoxylonbrauna submetidas ao envelhecimento natural e acelerado. Revista Brasileira de Sementes. 2010, 32(1):083-091. COUNCE PA, KEISLING TC, MITCHEL AJ. A uniform, objective, and adaptive system for express in rice development. Crop Science, 2000, 40(2):436-443. DAI QL, CHEN C, FENG B, LIU TT, TIAN X, GONG YY, SUN YK, WANG J, DU SZ. Effects of NaCl treatment on the antioxidant enzymes of oilseed rape (Brassica napus L.) seedlings. Afr. J. Biotechnol. 2009, 8:5400-5405. DEL LONGO, O. T.; GONZÁLEZ, C. A.; PASTORI, G. M.; TRIPPI, V. S. Antioxidant Defences under Hyperoxygenic and Hyperosmotic Conditions in Leaves of Two Lines of Maize with Differential Sensitivity to Drought. Plant Cell Physiol. 34(7):1023-1028, 1993. DEL RIO LA, CORPAS FJ, SANDALIOS LM, PALMA JM, GOMEZ M, BARROSO JB. Reactive oxygen species, antioxidant systems and nitric oxide in peroxisomes. Journal of Experimental Botany, Oxford, 2002, 53:1255-1272. DESIKAN R, MACKEMESS AHS, HANCOOK JT, NEILL SJ. Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiol, 2001, 127(1)159172. DUGAS DV, BARTEL B. Sucrose induction of Arabidopsis miR398 represses two Cu/Zn superoxide dismutases. Plant molecular biology, 2008, 67: 403–417. 75 ELSTNER EF. Oxygen radicals: Biochemical basis for their efficacy. Journal of Molecular Medicine, New York, 1991, 69(21)449-956. EMBRAPA (2014) Embrapa arroz e feijão – sócio economia. http://www.cnpaf.embrapa.br/socioeconomia/index.htm, EMBRAPA, acesso em 21 de fevereiro de 2014 EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, <http:/ /sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/ FontesHTML/Arroz/ArrozIrrigadoBrasil/cap01.htm> EMBRAPA, acesso em: 15 de julho de 2013. FAO (2013) Food and Agriculture Organization of the United Nations - Water. http://www.fao.org/wsfs/world-summit/wsfs-challenges/en/. Acessoem 06 de junho de 2013. FAOSTAT (2013) Food and Agriculture Organization of the United Nations – Statistical Database.http :/ /faostat3.fao.org/ faostat-gateway/go/to/download/Q /QC /E. Acesso em 30 de outubro de 2013. FENG W, HONGBIN W, BING L, JINFA W. Cloning and characterization of a novel splicing isoform of the iron-superoxide dismutase gene in rice (Oryza sativa L.). Plant cell reports, 2006, 24:734–742. FERREIRA ICFR, ABREU RMV. Fitoquímicos. Bioanálise 2007, 2. Stress Oxidativo, Antioxidantes e FINK RC, SCANDALIOS JG. Molecular Evolution and struture-function relationships of the superoxide dismutase gene families in angiosperms and their relationship to other eukaryotic and prokaryotic superoxide dismutases. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002, 399(1)19-36. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO) Disponível em: <http://www.fao.org/wsfs/world-summit/wsfschallenges/en/>. Acesso em: 06 de junho de 2013. FOYER, C. H.; NOCTOR, G. Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling, acclimation, and practical implications. 10.1089/ars.2008.2177, Volume 11, Nº 4, 2009. FOYER CH, NOCTOR G. Oxidant and antioxidant signaling in plants: a reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant Cell Environ, 2005, 28:1056-1071. FRITSCHE-NETO R, DOVALE JC, CAVATTE PC. Melhoramento para tolerância a estresses ou para eficiência no uso de recursos? In: FRITSCHENETO, R.; BORÉM, A. Melhoramento de plantas para condições de estresses abióticos. 1. ed. Visconde do Rio Branco: Suprema, p. 39-79, 2011. 76 GACHON C, MINGAM A, CHARRIER B. Real-time PCR: what relevance to plant studies? Journal of Experimental Botany, Oxford, 2004, 55(402)14451454. GADJEV I, STONE JM, GECHEV TS. Programmed Cell Death in Plants: New Insights into Redox Regulation and the Role of Hydrogen Peroxide. In International Review of Cell and Molecular Biology; Kwang, W.J., Ed.; Academic Press: Waltham, MA, USA, 2008, 270:87–144. GIANNAKOULA A, MOUSTAKAS M, SYRUS T, YUPSANIS T. Aluminum stress induces up-regulation of an efficient antioxidant system in the Al-tolerant maize line but not in the Al-sensitive line. Environ Exp Bot. 2010 67: 487-494. GILL SS, TUTEJA N. Reactive oxygen species and antioxidante machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry. 2010, 909-930. GLOSER V, GLOSER J. Acclimation capability of Calamagrostisepigejos and C. arundinacea to changes in radiation environment. Photosynthetica, 1996, 32(2): 203-212. GOLDACK D, KING IL, YANG O. Plant tolerance to drought and salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular transcriptional network. Plant Cell Reports, 2011, 30:1383-1391. GOSWAMI A, BANERJEE R, RAHA S. Drought resistance in rice seedlings conferred by seed priming. Protoplasma, 2013. GOWDA VRP, HENRY A, YAMAUCHI A, SHASHIDHAR HE, SERRAJ R. Root biology and genetic improvement for drought avoidance in rice. Field Crops Research, 2011, 1-13. GUAN YS, SERRAJ R, LIU SH, XU JL, ALI J, WANG WS, VENUS E, ZHU HL, LI ZK. Simultaneously improving yield under drought stress and non-stress conditions: a case study of rice (Oryza sativa L.). Journal of Experimental Botany, 2010,12 p. GUIMARÃES CM, SANTOS AB, MAGALHÃES AM, STONE LF. Sistemas de cultivo. In: SANTOS, A. B.; STONE, L. F.; VIEIRA, N. R. (Ed.). A cultura do arroz no Brasil. 2 ed. Santo Antônio de Goiás: Embrapa, cap. 3, p. 53-96, 2006. HADIARTO T, TRAN LP. Progress studies of drought-responsive genes in rice. Plant Cell Reports, Berlin, 2011, 30(3)297-310. HALLIWELL B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol. 2006 141:312–322. HALLIWELL B, GUTTERIDGE JMC. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, 1989, 543. 77 HAYASHI S, KAMOSHITA A, YAMAGISHI J, KOTCHASATIT A, JONGDEE B. Genetypic differences in grain of transplanted and direct-seeded rainfed lowland rice (Oryza sativa L.) in northeastern Thailand. Field Crops Research, 2007, 102:9-21. HEINEMANN AB, DINGKUHN M, LUQUET D, COMBRES JC, CHAPMAN S. Characterization of drought stress environments for upland rice and maize in central Brazil. Euphytica, wageningen, 2008, 162(3)395-410. HENRIQUES JAP, DAFRÉ AL, PICADA JN, MARIS AF, SALVADOR M. Espécies reativas de oxigênio e avaliação de antioxidantes em sistemas biológicos. In: SERAFIN, L. A.; BARROS, N.M.; AZEVEDO, J. L.; (Ed) Biotecnologia na agricultura e na Agroindústria, Guaíba: Agropecuária, v. 1 p. 227-252, 2001. HIRASAWA T. Physiological characterization of rice plant for tolerance of water deficit.In: Ito O, O’Toole JC, Hardy B, editors. Genetic improvement of rice for water-limited environments. Los Baños, Philippines: International Rice Research Institute. 1999, p. 89–98. HUANG G-T, Ma SL, BAI LP, ZHANG L, Ma H, JIA P, LIU J, ZHONG M, GUO ZF. Signal transduction during cold, salt, and drought stresses in plants. Molecular Biology Reports, 2012, 39:969-987. INGHAM DJ, BEER S, MONEY S, HANSEN G. Quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants. BioTechniques, New York, 2001, 31:132-140. JALEEL CA, RIADH K, GOPI R, MANIVANNAN P, INÈS J, AL-JUBURI HJ, CHANG-XING Z, HONG-BO S, PANNEERSELVAM R. Antioxidant defense responses: physiological plasticity in higher plants under abiotic constraints. Acta Physiol Plant, 2009 31:427-436. JEONG JS, KIM YS, BAEK KH, JUNG H, HA SH, CHOI YD, KIM M, REUZEAU C, KIM JK. Root-Specific Expression of OsNAC10 Improves Drought Tolerance and Grain Yield in rice under Field Drought Conditions. Plant Physiology, 2010, 153:185-197. JI K, WANG Y, SUN W, LOU Q, MEI H, SHEN S, CHEN H. Drought-responsive mechanisms in rice genotypes with contrasting drought tolerance during reproductive stage. Journal of Plant Physiology, 2012, 336-344. KHUSH GS. Origin, dispersal, cultivation and variation of rice. Plant Molecular Biology, Zurich, 1997, 35(1/2)25-34. KIM MD, KIM Y-H, KWON S-Y, YUN D-J, KWAK S-S.et al. Enhanced tolerance to methyl viologen-induced oxidative stress and high temperature in transgenic potato plants overexpressing the Cu/ZnSOD, APX and NDPK2 genes. Physiologia plantarum. 2010, 140:153–162. 78 KOTCHONI SO, & GACHOMO EW. The reactive oxygen species network pathways: na essential prerequisite for perception of pathogen attack and the acquire disease resistance in plants. Journal of Bioscience, 2006, 31(3)389404. KUMAR A, JOHN MM, GUL MZ, BIMOLATA W, GHAZI IA. Differential Responses of Non-enzymatic Antioxidative System under Water Deficit Condition in Rice (Oryza sativa L.).vol. 9, International Conference on Food Engineering and Biotechnology IPCBEE, IACSIT Press, Singapore, 2011. LANNA AC, CARVALHO MAF, SILVEIRA RDD, HEINEMANN AB, BRONDANI C. Protocolo de deficiência hídrica em arroz de terras altas para análise de transcriptoma. Comunicado Técnico 210, ISSN 1678-961X, 2013. LANNA AC, CARVALHO MAF, HEINEMANN AB, STEIN VC. Panorama Ambiental e Fisio-Molecular do Arroz de terras altas - Santo Antônio de Goiás: Embrapa arroz e Feijão, 2012, 32p. LEE DH, LEE CB. Chilling stress induced changes of antioxidant enzymes in the leaves of cucumber: in gel enzyme activity assays. Plant Scien, 2000, 159:75-85. LEMOS NG, STOLF R, MARIN SRR, POLIZEL AM, BENEVENTI MA, YAMANAKA N, NEPOMUCENO AL. Caracterização molecular pela técnica de pcr em tempo real de soja geneticamente modificada. In: CONGRESO DE SOJA DEL MERCOSUL, 3., 2006, Rosario. Resumos... Rosario: AC SOJA, 2004. p. 287-289. LEVINE A, TENHAKEN R, DIXON R, LAMB C. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell 1994, 79:583‑93. LIANG P, PARDEE AB. Recent advances in Differential Display. Current Opinion in Immunology, 1995, 7: 274-280. LU YY, DENG XP, KWAK SS. Over expression of CuZn superoxide dismutase (CuZnSOD) and ascorbate peroxidase (APX) in transgenic sweet potato enhances tolerance and recovery from drought stress. African Journal of Biotechnology, 2010, 9(49):8378-8391. LUZZARDI R. et al. Avaliação preliminar da produtividade em campo e qualidade industrial de híbridos de arroz no Rio Grande do Sul. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ARROZ IRRIGADO, 4.; REUNIÃO DA CULTURA DO ARROZ IRRIGADO, 26., 2005, Santa Maria, RS. Anais... Santa Maria: SOSBAI, (2005) V.1, 567p. p.70-72. MA NL, RAHMAT Z, LAM SS. A Review of the “Omics” Approach to Biomarkers of Oxidative Stress in Oryza sativa. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 7515-7541. 79 MACKAY IM, MACKAY JF, NISSEN MD, SLOOTS TP. Real-time PCR: History and Fluorogenic Chemistries in Mackay, p.1-40, I.M. (Ed.), Real-Time PCR in Microbiology, From Diagnosis to Characterization. (2007). Caister Academic Press Norfolk, UK. MANN T, KEILIS D. Homocuprein and heptacuprein, copper-protein cornpounds of blood and live in mamma1s. Proc. R, Soc. London. B. L, 1938, 26:303-315. MANOLI A, STUTARO A, TREVISAN S, QUAGGIOTTI S, NONIS A. Evaluation of candidate reference genes for qPCR in maize. Journal of Plant Physiology. 2012, 169:807-815. MAPA (2014) MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO Cultura do Arroz. http://www.agricultura. gov.br/vegetal/culturas/arroz/saiba-mais. Acesso em: 08 de maio de 2014. McCORD JM & FRIDOVICH I. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J. Biol. Chem.1969, 244:6049-55. MELO CRde, OLIVEIRA GCde, RESCK DVS, LIMA JMde, DIAS JUNIOR MdeS. Estimativa da capacidade de campo baseada no ponto de inflexão da curva característica. Ciência e Agrotecnologia 2002, 26(4):836-841. MENEZES-BENAVENTE L, TEIXEIRA FK, KAMEI CLA, MARGIS-PINHEIRO M. Salt stress inducesaltered expression. Of genes encoding antioxidante enzymes in seedlings of a Brazilian indica rice (Oryza sativa L.). Plant Science. 2004, 166: 323-331. MILLER G, SHULAEV V, MITTLER R. Reactive oxygen signaling and abiotic stress. Physiologia Plantarum, 2008, 133(3):481-489. MILLER G, SUZUKI N, CIFTCI-YILMAZ S, MITTLER R. Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stress. Plant, Cell and Environment. 2010, 33: 453–467. MIR RR, ZAMAN-ALLAH M, SREENIVASULU N, TRETHOWAN R, VARSHNEY RK. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theorappl Genet, june 2012. MITTLER R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci, 2002, 7(9)405-410. MOLINA-RUEDA JJ, TSAI CJ, KIRBY EG. The Populus superoxide dismutase gene Family and its responses to drought stress in transgenic poplar overexpressing a pine cytosolic glutamine synthetase (GS1a). PLoS ONE. 2013, 8(2). 80 MORISON JIL, BAKER NR, MULLINEAUX PM, DAVIES WJ. Improving water use in crop production. Philosophical Transactions of the royal society, 2007 363: 639-658. MORITA S, NAKATANI S, KOSHIBA T, MASUMURA T, OGIHARA Y, TANAKA K. Differential Expressions of Two Cytosolic Ascorbate Peroxidase and Two Superoxide Dismutase Genes in Response to Abiotic Stress in Rice. Rice Science, 2011, 18(2). NASCIMENTO S, SUAREZ ER, PINHAL MAdaS. Tecnologia de PCR e RTPCR em tempo real e suas aplicações na área médica. Moreira Jr. 2010, 67. NATH K, KUMAR S, POUDYAL RS, YANG YN, TIMILSINA R, PARK YS, NATH J, CHAUHAN PS, PANT B, LEE C-H. Developmental stage-dependent differential gene expression of superoxide dismutase isoenzymes and their localization and physical interaction network in rice (Oryza sativa L.). Genes Genorm, 2014, 36:45–55. NEILL S, DESIKAN R, HANCOCK J. Hydrogen peroxide signaling. Current Opinion in Plant Biology, 2002, 5:388-395. NELSON DL. AND COX MM. Lehninger Principles of Biochemistry, Sixth Edition (W.H. Freeman Publishers), New York, 2013. NI FT, CHU LY, SHAO HB, LIU ZH. Gene Expression and Regulation of Higher Plants Under Soil water Stress. Current Genomics, 2009, 10:269-280. NOCTOR G, FOYER CH. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 1998. NOVAIS CM, PIRES-ALVES M. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. ed. 33, p. 10-13, jul./dez. 2004. OLIVEIRA ARR. Quantificação de ADN nuclear e ADN mitocondrial por PCR em tempo real. Dissertação de mestrado, Universidade de Lisboa – Faculdade de Ciências. Lisboa, 131 pp. 2009. PENG Y, LIN W, CAI W, ARORA R. Overexpression of a Panax ginseng tonoplast aquaporin alters salt tolerance, drought tolerance and cold acclimation ability in transgenic Arabidopsis plants. Planta, Berlin, 2007, 226:729-740. POSTOLLEC F, FALENTIN H, PAVAN S, COMBRISSON J, SOHIER D. Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology. Food microbiology, 2011, 848-861. PRASHANTH SR, SADHASIVAM V, PARIDA A. Over expression. Of cytosolicc copper/zinc superoxide dismutase from a mangrove plant Avicennia marina in indica rice varpusa basmati-1 confers abiotic stress tolerance. Transgenic Res, 2008, 17:281-291. 81 PYNGROPE S, BHOOMIKA K, DUBEY RS, Reactive oxygen species, ascorbate-glutathione pool, and enzymes of their metabolism in droughtsensitive and tolerant indica rice (Oryza sativa L.) seedlings subjected to progressing levels of water deficit. Protoplasma, 2013, 250: 585-600. QUAN R, HU S, ZHANG Z, ZHANG H, ZHANG Z, HUANG R. Overexpression of na ERF transcription fator TSRF1 improves rice drought tolerance. Plant Biotechnology Journal, 2010, 8:476-488. QUE Y, LIU J, XU L, GUO J, CHEN R. Molecular cloning and expression analysis of an Mn-superoxide dismutase gene in sugarne. African Journal of Biotechnology, 2012, 11(3) 552-560. . RABELLO AR, GUIMARÃES CM, RANGEL PHN, SILVA FR, SEIXAS D, SOUZA E, BRASILEIRO ACM, SPEHAR CR, FERREIRA ME, MEHTA A. Identification of drought-responsive genes in roots of upland rice (Oryza sativa L). BMC Genomics, 2008, 9: 485. RAYCHAUDHURI SS, DENG XW. The role of Superoxide dismutase in combating oxidative stress in higher plants. The Botanical Review 2000, 66(1):89-98,. REDDY AR, CHAITANYA KV, VIVEKANANDAN. Drought-induced responses of photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants. Journal of Plant Physiology, 2004, 161:1189-1202. ROCHA TL, EVARISTO RGS, SILVA LP, SOUZA DSL, MARRA BM, COSTA PHA, MAGALHÃES JCC, MATTAR MCS, GROSSI-DE-SÁ MF. METABOLÔMICA: Aplicações e persperctivas. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Brasília, 1 ed. P.38, 0102- 0110; 189, 2006. ROY SJ, TUCKER EJ, TESTER M. Genetic analysis of abiotic stress tolerance in crops. ScienceDirect, 2011, 14:1-8. SAIRAM RK, SAXENA DC. Oxidative stress and antioxidants in wheat genotypes: Possible mechanism of water stress tolerance. J. Agronomy & Crop Science, 2000, 184:55-61. SALEH L. and PLIETH C. Fingerprinting antioxidative activities in plants. Plant Methods, 2009, doi:10.1186/1746-4811-5-2. SALVADOR M, HENRIQUES JAP. Radicais livres e a resposta celular ao dano oxidativo. 1ª edição. Canoas, RS: editora ULBRA, 2004. SATO Y, MURAKAMI T, FUNATSUKI H, MATSUBA S, SARUYAMA H, TANIDA M. Heat shock-mediated APX gene expression and protection against chilling injury in rice seedlings. Journal of experimental Botany, 2001, 52(354)145-151. 82 SCANDALIOS JG. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Brasilian Journal of Medical and Biological Research, 2005, 38:995-1014. SCANDALIOS JG. The rise of ROS.Trends in Biochemical Sciences, 2002, 9:483-486. SERRAJ R, McNALLY KL, SLAMET-LOEDIN I, KOHLI A, HAEFELE SM, ATLIN G, KUMAR A. Drought Resistance Improvement in Rice: An Integrated Genetic and Resource Management Strategy. Plant Production Science, 2011, v. 14. SHAO HB, CHU LY, JALEEL A, MANIVANNAN P, PANNEERSELVAM R, SHAO MA. Understanding water deficit stress-induced changes in the basic metabolism of higher plants – biotechnologically and sustainably improving agriculture and the ecoenvironment in arid regions of the globe. Critical Reviews in Biotechnology, 2009, 29(2)131-151. SHAOO KK, TRIPATHI AK, PAREEK A, SINGLA-PAREEK SL. Taming drought stress in rice through genetic engineering of transcription factors and protein kinases. Plant Stress, 2013. SHARMA P, JHA AB, DUBEY RS, PESSARAKLI M. Reactive oxygen species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants undes stressful conditions. Journal of Botany, 26 pag. 2012. SHEN B, JENSEN RG, BOHNERT HJ, MANNITOL protects against oxidation by hydroxyl radicals. Plant Physiology. 1997, 115:527-532. SHI B, NI L, ZHANG A, CAO J, ZHANG H, QIN T, TAN M, ZHANG J, JIANG M. OsDMI3 Is a Novel Component of Abscisic Acid Signaling in the Induction of Antioxidant in Leaves of Rice. Molecular Plant, 2012, 5(6)1359-1374. SLESAK I, LIBIK M, KARPINSKA B, KARPINSKA S, MISZALSKI Z. The role of hydrogen peroxide in regulation of plant metabolism and cellular signalling in response to environmental stress. Acta Biochimica Polonica, 2007, 54(1)39-50. SOARES AA, CORNÉLIO VMO, SOARES PC, SANTOS PG, REIS MS. Primavera: Cultivar de arroz com grãos agulhinha para cultivo em terras altas. Revista Ceres, 2001, 48(277)381-388. SOARES AA, GUIMARAES EP, MORAIS OPde, SOARES PC. Cultivares de arroz de sequeiro recomendadas para Minas Gerais e região Centro-Oeste do Brasil. Informe Agropecuário, 1989, 14(161)12-16. SOARES AA, SOARES PC, PEREIRA EB, REIS MdeS. Douradão, nova cultivar de arroz de sequeiro para Minas Gerais. Revista Ceres, 1991, 38(215):75-80. 83 SOARES AMdosS, MACHADO OLT. Defesa de plantas: Sinalização química espécies reativas de oxigênio. Ciências Agrárias e biológicas, 2007 1(1)9. SORIA-GUERRA RE, ROSALES-MENDOZA S, CHANG S, HAUDENSHIELD JS, PADMANABAN A, RODRIGUEZ-ZAS S, HARTMAN GL, GHABRIAL SA, KORBAN SS. Transcriptome analysis of resistant and susceptible genotypes of glycine tomentella during Phakopsorapachyrhizi infection reveals novel rust resistance genes. Theor ApplGenet. 2010, 120:1315-1333. SOUZA CR, SOARES AM, REGINA MA. Trocas gasosas de muda de videira, obtidas por dois porta enxertos, submetida à deficiência hídrica. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, 2001, 36(10)1221-1230. SRIVALLI B, SHARMA G, KHANNA-CHOPRA R. Antioxidantive defense system in an upland rice cultivar subjected to increasing intensity of water stress followed by recovery. Physiol. Plant. 2003, V. 119. SRIVASTAVA V, SRIVASTAVA MK, CHIBANI K, NILSSON R, ROUHIER N, et al. Alternative splicing studies of the reactive oxygen species gene network in Populus reveal two isoforms of high-isoelectric-point superoxide dismutase. Plant physiology. 2009, 149:1848–1859. STANGARLIN JR, KUHN OJ, TOLEDO MV, PORTZ RL, SCHWAN-ESTRADA KRF, PASCHOLATI SF. A defesa vegetal contra fitopatógenos. Scientia Agraria Paranaenis. 2011, 10(1)18-46. STEINMETZ S, SILVA SC, SANTANA NM. P.Clima. In:. In: SANTOS, A. B. dos; STONE, L. F.; VIEIRA, N. R. de A. (Ed.). A cultura do arroz no Brasil. 2. ed. rev. ampl. Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão, 2006, 117-160. STONE LF, MOREIRA JAA, SILVA SC. Tensão da água do solo e produtividade do arroz. Goiânia: EMBRAPA-CNPAF. Comunicado técnico 19.p. 6, 1986. SUNKAR R, KAPOOR A, ZHU J. Posttranscriptional Induction of Two Cu/Zn Superoxide Dismutase Genes in Arabidopsis Is Mediated by Downregulation of miR398 and Important for Oxidative Stress Tolerance. The Plant Cell. 2006, 18: 2051–2065. SUZUKI N, KOUSSEVITZKY S, MITTLER R, MILLER GAD. ROS and redox signaling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell and Environment. 2012, 35:259–270. TAIZ L, ZEIGER E. Fisiologia vegetal. Porto Alegre: Artmed, 719p, 2004. THOUNAOJAM TC, PANDA P, MAZUMDAR P, KUMAR D, SHARMA GD, SAHOO L, PANDA SK. Plant Physiology and Biochemistry. 2012, 53:33-39. 84 TIAN L, WANG H, ABDALLAH AM, PRINYAWIWATKUL W, XU Z. Red and white wines inhibit cholesterol oxidation induced by free radicals. J. Agric. Food Chem., 2011, 59:6453–6458. TIANG-RONG G, PENG-CHENG Y, ZI-DONG Z, JIANG-JIA W, MEI W. Devolvement of antioxidative defense system in rice growing seedlings exposed to aluminum toxicity and phosphorus deficiency. Rice Science, 2012, 19(2). TODAKA D, NAKASHIMA K, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Toward understanding transcriptional regulatory networks in abiotic stress responses and tolerance in Rice. The rice journal, 2012, 5(6)15 Mar. TURAN S, TRIPATHY BC. Salt and genotype impact on antioxidativo enzymes and lipid peroxidation in two rice cultivars during de-etiolation. Protoplasma, 2013, 250:209-222. USDA - UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE, Foreign Agricultural Service. Production, supply and distribution online: custom query. USA, 2009.Disponívelem: <http://www.fas.usda.gov/psdonline/psdQuery.aspx. Acessoem: 20 de junho 2013>. VISARADA KBRS, MEENA K, ARUNA C, SRUJANA S, SAIKISHORE N, SEETHARAMA N. Transgenic Breeding: Perspectives and Prospects. Crop Science, Madison, 2009, 49:1555-1563, Sep./Oct. VRANOVÁ E, INZE D, VAN BREUSEGEM F. Signal transduction during oxidative stress. Journal Experimental Botany, Oxford, 2002, 53:1227-1236. WALTER LC, STREEK NA, ROSA HT, KRÜGER CAMB. Mudança climática e seus efeitos na cultura de arroz. Ciência Rural, Santa Maria, 2010, 40(11)24112418, nov.. WANG FZ, WANG QB, KWON SY, KWAK SS, SU WA. Enhanced drought tolerance of transgenic rice plants expressing a pea manganese superoxide dismutase. Journal of Plant Physiology, 2005, 162:465-472. WANG L, XIE W, CHEN Y, TANG W, YANG J, YE R, LIU L, LIN Y, XU C, XIAO J, ZHANG Q. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of Rice. The Plant Journal, Wuhan, 2009, 61(5)752–766 Dec. WANG YC, QU GZ, LI HY, WU YJ, WANG C, LIU GF, YANG CP. Enhanced salt tolerance of transgenic poplar plants expressing a manganese superoxide dismutase from Tamarixandrossowii. Molecular biology reports. 2010, 37:1119– 1124. WU GH, WILEN RW, ROBERTSON AJ, GUSTA LV. Isolation, chromosomal localization, and differential expression of mitochondrial manganese superoxide dismutase and chloroplastic copper/zine superoxide dismutase genes in wheat. Plant Physiol. 1999, 2:513-520. 85 WURTZEL O, SESTO N, MELLIN JR, KARUNKER I, EDELHEIT S, BÉCAVIN C, ARCHAMBAUD C, COSSART P, SOREK R. Comparative transcriptomics of pathogenic and non-pathogenic Listeria species. Molecular Systems Biology, 2012, 8(583)1-14, Mar. YE N, ZHU G, LIU Y, LI Y, ZHANG J. ABA Controls H2O2 Accumulation through the induction of OsCATB in rice leaves under water stress. Plant Cell Physiol. 2011, 52(4)689–698. YORDANOV I, VELIKOVA V, TSONEV T. Plant responses to drought, acclimation, and stress tolerance.Photosynthetica, 2000, 38(2):171-186. YUAN JS. et al. Statistical tools for transgene copy number estimation based on real-time PCR. BMC Bioinformatics, 2007, 8(7)1-12, Nov. ZAEFYZADEH M, QULIYEV RA, BABAYEVA SM, ABBASOV MA. The effect of the interaction between genotypes and drought stress on the superoxide dismutase and chlorophyll contente in durum wheat landraces. Turk J Biol, 2009, 33:7. ZANG NLX, ZHANG X, CHEN H, FENG X, ZHANG L. Gene Cloning, Expression and Activity Analysis of Manganese Superoxide Dismutase from Two Strains of Gracilarialemaneiformis (Gracilariaceae, Rhodophyta) under Heat Stress. Molecules, 2012, 17:4522-4532. ZHANG Y, ZHU H, ZHANG Q, LI M, YAN M, WANG R, WANG L, WELTI R, ZHANG W, WANG X. Phospholipase Dα1 and phosphatidic acid regulate NADPH oxidase activity and production of reactive oxygen species in ABAmediated stomatal closure in Arabidopsis. Plant Cell, Nanjing, 2009, 21(8)2357–2377, Aug. ZHU JK, Hasegawa PM, Bressan RA. Molecular aspects of osmotic stress in plants.Critical Review in Plant Science, 1997,16:253-277. ZLATEV ZS, LIDON FC, RAMALHO JC, YORDANOV IT. Comparison of resistance to drought of three bean cultivars. Biologia Plantarum, 2006 50(3):389-394. 86 ANEXO 87 Anexo 1.Primers de genes de referência utilizados para normalização de dados de expressão gênica em ensaio de seca. As sequências dos primers estão dispostas da região 5’ para 3’, todos eles foram obtidos a partir da literatura. Os valores de eficiência, assim como os valores de R2, foram obtidos a partir da construção de gráficos de valores de CT versus valores de log (base 2) das concentrações iniciais de template – as concentrações se referem a diluições seriadas, 6 diluições, de cDNA. Os valores de estabilidade foram obtidos a partir do conjunto amostral completo utilizando o NormFinder software (Abreu et al., 2014 manuscrito em andamento). Gene Descrição ACT Actin eEF-1α eukariotElongation factor1α Glyceraldeid-3GAPDH phosphate dehidrogenase Sequência F/R (5' → 3') F TGCGATAATGGAACTGGTATGG R ACAGCCCTGGGCGCAT F TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT R GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA F GGGCTGCTAGCTTCAACATC R TTGATTGCAGCCTTGATCTG Amplicon em cDNA Referência Eficiência da PCR R2 Valor de estabilidade 147 pb Imin et al., 2006; Zhang et al., 2009 96,74% 0,997 0,007 103 pb Jain et al., 2006; Zhang et al., 2009 100,16% 0,996 0,006 190 pb Kim et al., 2003 99,25% 0,998 0,012 88 APÊNDICE 89 Apêndice 1. Resumo dos primers que foram desenhados na junção de éxons adjacentes. GENE ID LOC_Os03g11960 LOC_Os03g22810 LOC_Os04g48410 LOC_Os05g25850 LOC_Os06g02500 LOC_Os06g05110 LOC_Os07g46990 LOC_Os08g44770 PRIMER JUNÇÃO ÉXON-ÉXON A NÃO B SIM C SIM A SIM B SIM C SIM A NÃO B SIM C SIM A NÃO B NÃO C SIM A SIM B SIM C SIM A NÃO B NÃO C NÃO A SIM B SIM C SIM A SIM B SIM C SIM 90 Apêndice 2. Sequências genômicas, sequências consenso e/ou CDS, alinhamento, identificação de éxons/íntrons e desenho de primers.*Em destaque de verde e amarelo são os éxons. Gene 1: >LOC_Os03g11960 AAGACGGTGATCTTGTGTTTCAGGTGTCCGACAGGGTTCAAGTGCGGGATAAACTACCAG CCGCCGACGGCGGTGCCGGGAGGGGACCTGGCGAAGGTGAGGAGGGCGGTGTGCATGA TCAGCAACAACACGGCGGTGGCGGAGGTGTTCTCGCGGATCGACCGCAAGTTCGACCTC ATGTACGCCAAGCGCGCGTTCGTGCACTGGTACGTGGGCGAAGGGATGGAGGAAGGGGA GTTCTCCGAGGCCAGGGAGGACCTCGCCGCGCTGGAGAAGGACTACGAGGAGGTCGGC GCCGAAGTCGAGGACGACGACGAGGAACAGGGCGAGTACTGATCGGGCTAGCCTGCTAG GTGAATCTAGCACGGTAGATAAACCGCAAGTTTGTAAGGTCGGTGGAAGGGGGTCTCTCG GTTTACATGGACTCTTGTGACTTTGTGGTGTGAGAGTGGGTTTTGTTGTACTTGCATCACAA AAAATAAAAGAATTCGTCAGAAATCAAAATGTGAATCAAAAGCAAATCACAGTGAGTATGTA TGTCGATAAATTATTCGCGGCACAATTATTTGTGCCCCATTTGGAACATAGAAATCCACATG AAATAATCCAAAAAGAAAAGACAAATGTCATAGAAGACACAAAAACGGTTTCACAGAAACCA AAATGTGAAAGCAAATGAAAAACCGCATATCGATAACTTTCTCCCAACAAAAATTGTCATAT CGATCGTTTCAAAAAAAAAAAATCATATATCGATAATTTATTCGCGGCCCAATTATTTAAGCC CCATTTGAAACATAGAAATCCACATGAAGCAATTCAATTCTAGGCCCACAAGACAAATTCCG TCCCTGGCCCAAAAGCGGGCTGCTGTTTCCCGTGGGCGCCGGACGGGCAGACGACGAAC CAGTGGTTTTGGGCGAACCGAAAAAAATAAATAAAAAAAAGAGCCGAAAAAAGTGAAAGGC CTGGGAGCGAAGCGGCAGAGAATGGCAGGGAAAGCCGGCGGCCTCAAGGGCGTCGCCC TCATCGGCGGCGCCGGCGGCAACAGCGCGGTCGCCGGCGCCCTCCACTTCTTCCAGGAC CCCTCCACCGGTACGCGTCTCCTCCCTGTAGCTCCGTGCTGTTCGCCTGCGCGCACAGCA GCTCGTCTCGTAAGTGAATTGACCTCTTCTCGCTGATGTGATTTTGGTGGACTACTCGATCT CTGCGTGGTTTTTTAGGGTATACCGAGGTGAGGGGGAGGGTCACCGGCCTCGCTCCGGG CCTCCATGGCTTCCACATCCACTCCTTTGGCGACACCACCAACGGCTGCAACTCTACCGGT TCGTTGCCTTCCGTTTCCCTTGCTTGGTTTTGTGACTTAGGTTGTGAAATTGATGGGGGATT TGGCCATTTGGAGCACTGCTCGATAAGATCGTGTATTGCAATTGTGAACTCGCATACTCCT ATATTATGTATAAGTAGAACTTACAACGCTAACTACCATAAGAGAAGATAGGCATCTAATTT GAGTTGACTGCTGATCAAAACATGGATAGGACGAAAACGTCACTGAGGTAGGAACTTCGTT TACCAATTGAGTTGTGCTGTGAAGAATTATCAAATGACCGATTTATTTGTTAAAAAGTGCAC TGGACAAAACTTTTTTTTTTGTCGGGACGGCCAAAGATAGGCCGGCCAATTTCATTAAGATT GGGGGAAATAAAGTTTTAATTACAACGACATGAAGGATGTCGCGCCGGTCTCAAGCAAACT CAAGCACTGGACAAAACTGTTGGTTGTATTTATGTGTGCACTACAAAAAGAGATTGTCACG CCTCCCGCAGAGTTTTTATGAGTTACAATGCCTTCGGCAAGCCTATGGAAACACTACTATTA GCCTTTGCCCAATGAATGATGGATCATGGAATGGGTAGTGAGTGTACTCAGGTGAAAGTTT TGGGGAACTGCATAAGCTCAATGTATGCTGCAAAAAATGTTTCCAATACAGAATCATCTGCT CACCCTTCCATTCTAATTGTCCTGTTCAAATCTTGCTACTGCATTTTTAAGTGAATGGTTTTC ATTTCTTTTATTTAGGGTTTGTTTTTCATGAAAATTTGACTTTTTTCTTCTTCACGTGTACGGG GTCTATATTTGAAATGTTATGGAGAGATGGATAACATCAAACTCTATGTTACTAGATTTATTT GAGAATTTTCATAACCCAAGTTGGGGGTGCTCCATGGAGCAGCTGAAGTGTTCTCTCATGC CATCTTGCAATTGTTATTTTTCATTTGTTCTGATTAAATTACTTGTCCCAGGGCCCCATTTTA ATCCTCACAATAAGTCCCATGGGGCACCATCTGATGATGAAAGACATGTGGGCGACCTGG GAAACATAGTAGCCAACAAAGATGGTTAGCACTCTGTCAGGCCGTCTACATTAAGACCTTT GAGGCAACTAACGCAAAGAAACTTTGTAAATTAATTCATGTGTGTCTACCAATAATACATCA CCTTTTTGTTCCAGGTGTTGCAGATATCTTCATAAAGGACCTACAGGTTCCATTGTCTTGAA ATATGTAAAATATCAGTTTGTTCATCTTATTGTTTATGCTAATGCATTGGTAATTCATATTCAT TGCTTTGTGAAGATTTCACTAAGCGGGCCTCATTCCATATTGGGAAGGGCAGTTGTTGTTC ATGCTGATTCTGATGACCTAGGAAGGGGTAAGCATTATGTCATTACTCTTGCAAGATTGTTA TTGGTCATTCAGAATTGAAGAGAAGTCTCCCTTCCTACATTATATATGTCCTCTTATTTTAGA AAATATTGAATTCACTATTTAGAGGGTAATTTAGAGCTTATTACCTGCCGAATGGCGTGCTA TCATGCATTTGAATATTCATATAACTATTTAACGTAGAAGTTCCCTTGTTAGCTATGGTTGAT ATGGGATTATTCGGTGTTCCAAAGCTGCCTGAGATTTGGCTCTTCAACCTTGAGTGTAACTA CTAGTAAAAATCATATTCATAAGACAGGTAATCCCTCCCAAGCCCAACTAACCTGGGATATG CTGAATTGCTGATAGCTGTCATGAAATTATTGTGGACTGTGGTACTATGTTAACATACAGTA GGGTATAAATCATAATCCAGTAGGCAAGGGCCCAAAACAGGTCCAGATAACAGGATTTGCA TGGGCTGTACCATGCTGCAGTTCAAAATCTAACTGCCCATGGGCTGTACAATGCTACAGGT CAAAAATCTAATTGCCAGTCTCTGTTCCTCTGCTGCATTTATGCTAGGTTTGTGGTAGCAGA 91 CAAATGTTACTGTGGTGCCTTAAGAAATACATTTCTAGCAATCTAGATCTAGGATTCTGGCA CTATCTATGCTGCATTGTTTTGCCAATTATTTTCAGTGCCTCCAGAGGCCTTTTTATACATTA TTTGTGCAAGACATGTCCTAGGAGTTGGGATGATAAAGCTCTTGCCATTACCATCAATAACT GCGTCATACTCAATTCTGAACAACATCTGTTTGTGTCCAATTATTTAAGTATGAAATATTTTG GTATAATATTTTTCTCTCCTGTTCAAACTCTATGTTCCATTTGTTAACAATTGGCTAACTTTGA CTAGTGGTAGGTTCCAAAATACATGCTCAAGTATCCATCAGTTGAGTCAAATTACGGATTGC GAGCCTAATGTTAGAATAGGTTTCATGCACAATTATGTTTTGCCATTTAGTATCACATGGTG AAGCATTCACTTTTTATGCTGCTGCTCATTGTACTACTTTGATATTTTGAAGGTGGTCATGAA CTCAGTAAAACAACAGGAAATGCAGGAGCAAGAATTGGATGCGGTAAGTGAGAATCTTTTT GTAGTTTCTGAAACTGAGAGGAGGAAAGAACCATTCGGACATACTAGTACTCAGGAACACA TAGGACAAATATTGTACAAAATAAAAAGAAACTTTTTTTTTCTCTGCAAGACCGATCCTTCCA GTGGAATGACAAGCTAATATGTCTGCTAATAACTTGTAGGTATCATTGGACTTCGATCTGCA GTTTAACAATCTATAGTCATGAAGCTTGAGGTGGTGGTGGTATGCTGTTCAGAGATATGGA AATCATTGGCGCTCCTCATTCCAGACTGTTTCAAGAATGGCTTTTGACGTGTTATCACTGCC TTCAGTTATCTATACGTACTTTGTTACGGAGTATATTCTTTTTTTGAACGAACATACGGAGTA TATTCTATAAATAAAGGAAAAGTTTCCTCATACTTATACTGTACCTTGGACTGAAGCTGTGC AAACTCACAATAATGTGTTACTATTTCTCAATCTTCAGCTTACAAGCGATGCTGCTTTGAATT TGGCCATAAGCCAATGTCCTTTATGGTACTATTAAATGAATACATAGCAGCTTTTTGTGAAT ATATATGCTCGTAATACTGTTATACTACGACCTTAAGGCACTCCTGTTGCCTGGCAACCAAG CAAACGCTGACAAATCTGGAAACGGGTTTGTCATGGTGTGTGTTTTATCTTTGCTTCAAACA TACTGAAACACAATTTGTCAACTTCAAACCTGTGTCAGATTCTACTCCCTATTGGATCGAAG AACTGGAAGTGCTCGCCTACCCTCTGTTTAACCAACCATTCCAATTTGTCAACTTCAAACTT GTGTCAGATTCTACTCCCTACCGTATTGAAAAAACTGGAAATGCTCAAGGATCAAAGTATCC TGACAGCGTATGACGTCGTGAGCACCAGCCGGCCATGATCCGTGAGTGACCATCAAAGGC TGTGACAGTCCCAAGACACTCCGTCCAAACACTACAATCTTCCGTCTCCAAGATGCAAACA AGAGCAAGAGTTCATGCTACATTAATAGGACTTGCAGTTTGCAGGTTAAGTAAATCACGCTT AGCCTCCGGTTGATGCTGATACCAAGGTCAGCCCTGGGCCCTGGGGGGGTAAGAATGCC TCGACGGGAACCGGACACACCGGAACGCGCCAAAAGGGCGAGCGAGCCGTGCG >sequenciaconsenso(CDS) TGAAAGGCCTGGGAGCGAAGCGGCAGAGAATGGCAGGGAAAGCCGGCGGCCTCAAGGG CGTCGCCCTCATCGGCGGCGCCGGCGGCAACAGCGCGGTCGCCGGCGCCCTCCACTTCT TCCAGGACCCCTCCACCGGGTATACCGAGGTGAGGGGGAGGGTCACCGGCCTCGCTCCG GGCCTCCATGGCTTCCACATCCACTCCTTTGGCGACACCACCAACGGCTGCAACTCTACC GG Alinhamento ClustalW2: Éxon-éxon TGAAAGGCCTGGGAGCGAAGCGGCAGAGAATGGCAGGGAAAGCCGGCGGCCTCAAGGG CGTCGCCCTCATCGGCGGCGCCGGCGGCAACAGCGCGGTCGCCGGCGCCCTCCACTTCT TCCAGGACCCCTCCACCGGGTATACCGAGGTGAGGGGGAGGGTCACCGGCCTCGCTCCG GGCCTCCATGGCTTCCACATCCACTCCTTTGGCGACACCACCAACGGCTGCAACTCTACC GG 92 PRIMER A Primer F: AGAGAATGGCAGGGAAAGC Primer R: GGGTCCTGGAAGAAGTGGA 103pb TGAAAGGCCTGGGAGCGAAGCGGCAGAGAATGGCAGGGAAAGCCGGCGGCCTCAAGGG CGTCGCCCTCATCGGCGGCGCCGGCGGCAACAGCGCGGTCGCCGGCGCCCTCCACTTCT TCCAGGACCCCTCCACCGGGTATACCGAGGTGAGGGGGAGGGTCACCGGCCTCGCTCCG GGCCTCCATGGCTTCCACATCCACTCCTTTGGCGACACCACCAACGGCTGCAACTCTACC GG PRIMER B Primer F: AGAGAATGGCAGGGAAAGC Primer R: CTCGGTATACCCGGTGGAG 122pb TGAAAGGCCTGGGAGCGAAGCGGCAGAGAATGGCAGGGAAAGCCGGCGGCCTCAAGGG CGTCGCCCTCATCGGCGGCGCCGGCGGCAACAGCGCGGTCGCCGGCGCCCTCCACTTCT TCCAGGACCCCTCCACCGGGTATACCGAGGTGAGGGGGAGGGTCACCGGCCTCGCTCCG GGCCTCCATGGCTTCCACATCCACTCCTTTGGCGACACCACCAACGGCTGCAACTCTACC GG 93 PRIMER C Primer F: ACCGGGTATACCGAGGTGA Primer R: GTAGAGTTGCAGCCGTTGGT 104pb TGAAAGGCCTGGGAGCGAAGCGGCAGAGAATGGCAGGGAAAGCCGGCGGCCTCAAGGG CGTCGCCCTCATCGGCGGCGCCGGCGGCAACAGCGCGGTCGCCGGCGCCCTCCACTTCT TCCAGGACCCCTCCACCGGGTATACCGAGGTGAGGGGGAGGGTCACCGGCCTCGCTCCG GGCCTCCATGGCTTCCACATCCACTCCTTTGGCGACACCACCAACGGCTGCAACTCTACC GG Gene 2: >LOC_Os03g22810 ATGGTTCAGGTCATCAGTGATGAGCTCAGACTATCACCTCTTACGGGTAGGGCACTGGTGA GAGATAAGTGGTCAATGATGACTAAACTTATCTCTATTATGGGACACCTCTTATGAGCTACA AATGGTAACCCGTCAGAGGTGATGTTGACCCCTTTGACTGGTGACATCATAACTCGTCACA GGTAACACCTGTGACAGGTAGCACAATGCGGCCCATCAATGATGTAGATTACCAATGAAAA AACAATATTTGTTCCATTCTATTGCTCATTCAGTTGCATTCATCTCACAAATTCACAAATCAT AAAAATAATCACAATCACATTCTCAATCACACATCCGAGCATCACGGAATCAACACGAAACA CATCACAAAATTAACCAGAATAGAACACGGGGCAAAGGAGGATATATCCAGTGGTCCCCAA CTACCTGGACACCGGATCTAGCGCCAAGGAGCTCGGCGTGACGGAAAGGCGGCAGTCCG TGACCTTGGGCGCAAGGTGAAGGAGGCTAGAGCTCAGGGATGGACGAGACGAGCAGACA ATGGCAGCGGCGACCGACGCTCGAGGGGCCATCCCGATCCAGTGGCTCCTAACCACCTA GAGACTAGATCTAGTGCACCAGAGCTCGAGGCGGCTGCCGACGACCTTGGGCGGTGGGT GAAGGAGGCAGTGGCCGGAGCTTAGGGGCGGAGAGACGGCCGACAACGCTTGGGGGTG AATGAGATGAGCAGACAATCGGCAGCAGGCGAAGGAGACGGCGATGCTTGTGGAGGCTG AATCCGATGGCTGACGATCGTGGGAAAGAGGTCAGTGCGGCTGATGGTCGGCGGTTGCA TGAGGGCATGGGAAGACAGCTCCTAACAATCGACGACGACGATAAGTGGTCGGAGAAGAA GAAAGGGAGAAAGAGAAAAGGGAGAGAGATCGGGGGAGAGAGATCGGAGGAGGAGAGG AGAAGGGACGGGAGGAGGGGAGGAGAAAGGGCAAGCAGGCTAGCGGGTTGGCAGGCCC 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GGAGTTATTGGACTAGCCAACAGACAGTTTCCTCGTGAATTCGATCCCTTCATGCAGAAAT GAATGGAGGGATAGGATGAAATGGGGTGAGAAGAATGGATAGCTAAGATTGAAACTTACC CTTTAGATGGGTGGGAAATCATATCCCAAACCGATTTTCTAGGGATAATTCCTCTATACTAG ACGTGTGTTTTGTTTGTATCTAGTATGTTTGCAGTGGGCAGTGGCATTTGTTCTATGATGCC TTTGGTTTACATGCTTTGGAAAAAACAATAGATCATTGGGCCATATTGTTATCTTTTTCTGAC TAGTAGTAAATGATGCGTCTGTGTTGCTTCTGCTTTAACATCTTTTCAATCTTCACTAGGATA ATTTCATAGTTCAATATGTTCTTTGGGAACTTGGTTGGGTTTTAGGACCTCTAGAGGCTACT TCTGCCACTTGCTAAGTAACTGTTTTGTGGAATTTGTTTACAGATCACATTAACAATGGTGA AGGCTGTTGTTGTGCTTGGTAGCAGTGAGATTGTTAAGGGCACTATCCACTTTGTCCAAGA GGGAGATGGTATGCCATCAGTCATCACCATTTTCATGATTGTCTTGAATTGAATTTTAGTCC TTGAATCGTTGAGATTTACTGGCATGTTTGATTCTTAGGTCCCACCACTGTGACTGGAAGTG TCTCTGGCCTCAAGCCTGGTCTCCATGGGTTCCATATTCATGCACTTGGTGACACCACCAA TGGTTGCATGTCAACTGGTAATTATTATTGTTATTACATATATATTGGCTTCTCGCCTGCCTA GATGTACCATCAGGATTGATACAGGCTATCATCATCTGTTGAATTGATTACTTATGATGCAC TTGTTTCATAATGTAGGGCCACACTACAATCCTGCCGGAAAGGAGCATGGAGCACCAGAA 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CCTCCTTCATCCTCCTCGTCGTCGCCGCGGGGGTCGCCTGAGATCACATTAACAATGGTG AAGGCTGTTGTTGTGCTTGGTAGCAGTGAGATTGTTAAGGGCACTATCCACTTTGTCCAAG 95 AGGGAGATGGTCCCACCACTGTGACTGGAAGTGTCTCTGGCCTCAAGCCTGGTCTCCATG GGTTCCATATTCATGCACTTGGTGACACCACCAATGGTTGCATGTCAACTGGGCCACACTA CAATCCTGCCGGAAAGGAGCATGGAGCACCAGAAGATGAGACCCGCCATGCTGGTGATCT TGGAAATGTCACCGCTGGAGAAGATGGTGTTGCTAATATCCATGTTGTTGACAGTCAGATT CCACTTACTGGACCAAATTCAATCATTGGCAGAGCCGTCGTTGTGCATGCCGATCCTGATG ATCTTGGAAAGGGTGGGCACGAGCTGAGCAAGACCACCGGAAACGCTGGTGGCCGTGTT GCTTGCGGGATCATCGGACTTCAAGGCTGA Alinhamento ClustalW2 96 Éxon-éxon ATGGTTCAGGTCATCAGTGATGAGCTCAGACTATCACCTCTTACGGGTAGGGCACTGAACA CGGGGCAAAGGAGGATATATCCAGTGGTCCCCAACTACCTGGACACCGGATCTAGCGCCA AGGAGCTCGGCGTGACGGAAAGGCGGCAGTCCGTGACCTTGGGCGCAAGGGCCCTCAAT GTTGGCTGGTGGCTGCAACTGCAAGCTGCCAGTTTGACTACAAATACCACCGCACACCGC TGGAGGGAGGGGAACCTTCCAGAAGCTCCAGATTCCAAACCAGCAGGAGTCGCCTCGCCT CCTCCTTCATCCTCCTCGTCGTCGCCGCGGGGGTCGCCTGAGATCACATTAACAATGGTG AAGGCTGTTGTTGTGCTTGGTAGCAGTGAGATTGTTAAGGGCACTATCCACTTTGTCCAAG 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AAGAGCACCCACAATGGTAAAGTAAGGTGCTCTCTATAAAACATGTACATCTCAGCAATAG 121 ACTAGATTAATAGTAAACCACCTCAATAGTATGTCTACATGGGTATATATAGCTCTCTAATCC ATTGCCTCATTTTTCTCTATAGACTATCTCCAGGATAGTAGATAGCTTTGCTCTCTCTCTTCA TTTAATCTCTTCCAAGTAGGACAATATGCTGACATGGATCTATTGTAGAGAGCCTATAGATA ACCATTGCGGGTGCCCTAAGGCCTGTCTACTCAGGCCCTGTTTGGCTAATGGGACAGGGA AATCATTTCGCAACTACTAAAAGACATCTTAAAATCCTAACCATTCATTCTCACTCTTTCATT TAATCCTAACCCTTCATTCATTTCCAAATCTCAATCCCACCTCACATTTCCCATTATCCAAAC ACACCCTCACATTACATGGCAAAACTTTGTCCTGCAGGACCACATTTTAACCCAAACAATTT GACGCACGGTGCACCAGAAGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAACATTGTTGC CAATGCTGAAGGTATAGCCTTCATGTAATCACTACGAATGCATTTTTGATGTTTCTCTCTAAA ACAATCTTCTTGGCATACTTATTTTATGGTGTGTCTGTTTAATTGTTGTCATACAGGTGTAGC TGAGGCAACCATTGTTGATAAGCAGGTAGAGTAAAAAAGATCATACTTTTACCACTAGGAG AGTTGCTGCATTGCTGTTTTAAGTTACGAAACTCAGCTTACCTACTTTTGATGGTTTCTTCTA AATAGATTCCTCTGAGTGGCCCAAATTCTGTTGTTGGGAGAGCATTCGTTGTTCATGAGCTT GAAGATGATTTGGGGAAGGGTATGCCTAATTATATTGATGCTCAGCATTTTTTTTTCTACGA GTTTACACACACCTCATTTTTTATCCATCACTTTTAGGTGGCCATGAGCTTAGTCTCAGTAC TGGAAATGCTGGTGGGCGACTTGCATGCGGTATGTTCTCTGAATCATATTTCTGTTCCATAA ATGTTCTTGTAACGTTAATGTGGTACATAGGTGCACGCATGAATAAAATATTGGAACAAACA TATCGTAGTAACGAACAATATTATAAACCTTGTATTTCAAAAAAATAAAAACGTCAAAACATG TTTTCTGGGGTACATTCCACTTGCTGGTGATCAGACATTGGATTAGTAGCGAATTCCTCACA TGGTTATCCAAATAATAAGTTACTACAACTGTTATTCATGAAATGTTCATTTCGACTGTGAAG CGTTTGTAACTCTTCGGTCTTCACCTATAATGTAACCATTGGCTGGTGTTTGCTCTGTGAAA TGTATGAAATGCAAACGCATCTGTTCTCTTTTATTCTTTTAAGGAAGAAGTGTAACTGTTTCC AACACTAATATGTTTGTTGTGCAGGTGTTGTTGGGCTGACCCCGTTGTAGGTCGCTGCAAG TTGCAGCTGAAGTGTCAGTATCGCATCCATGTCACCCTTTTTGTCATCTTCGAGCCTGAGG CAGTCGTTCTTGTATCACATGGATTTCGCAACATGGATGCTTAATAGTATCTGTTGATCGTT CGTCTCACAGTAATAAAATTTAGTTGAGCAAATAAGTGTCGTCACATCCCCTGTTCTCCACC CTGTCAAACTATAAATTGTGAAACATGAGCTGTTCTGGGTATACAACGCATAAAAAAAACCA TGTGTTATACATAACAGCCTTGTTGCTGGCTGTACTTTCGTGCTTCTGATCTAATCTTTGTG CTACACTTTTTTTTTCCTTTGAGCTCCAGTACAATGTCATAAGCATAACATGGTCAGCATATC TCTATCTAAGCCATCCTTTTTTTCCCCCGTGTCGCCTCCCCGCGAGGGCGGCGACAGCCC AAGCCGCCGCTGCAACCTACCACCCTCGCCTCTTGCCTCGCCGCCGCTCGAGCGAGGTG CCGGCAAAGCCAGCGTCTCGCCAGGACGGCGGCGGGGTTCGCAGCTCTCGCTCCTCCGG TTTTCGACGCGGGCAGACCTAAGGGCGGAGGTTGGCGGCACCGTTTCCTGCAGCGGGCG GAGGCCATGGCAGCTCGTGGCGTTGGGCGGAGGAGGCGTCGCCGGCGGGGCAGAGGGA GTGGCGCACGGGAGAGGGAGCAGCGGCGGTTGGTAGAGATGGTGGCGGTGGAAGTGCC GCCAGATCCACGCCTGGATCTGGCGGGGAGGCGACCGGCGGTGGGGCCTGCTGGTGGC GGCGGCGACGGCGACGCCCGGTGGAGCAGAGGTGGGCGAGGTCCGACTCCGTGACGGC CGGATCCGGCTGGACGACGACAGACGGCGGTGGGTGCATCCTTAGATGCGCGGCCGGC GTCGGGGCGAGCGGGCAACGGAGGCAGCGGCTGGCGGCGATGGTGCGACGGCGTGGA GGCCGGCGGCGG >sequenciaconsenso TCCGTGTGACGGGACTTACTCCTGGACTTCACGGCTTCCACCTCCACGAGTTTGGCGATA CTACGAATGGGTGCATATCAACAGGACCACATTTTAACCCAAACAATTTGACGCACGGTGC ACCAGAAGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAACATTGTTGCCAATGCTGAAGG TGTAGCTGAGGCAACCATTGTTGATAAGCAGATTCCTCTGAGTGGCCCAAATTCTGTTGTT GGGAGAGCATTCGTTGTTCATGAGCTTGAAGATGATTTGGGGAAGGGTGGCCATGAGCTT AGTCTCAGTACTGGAAATGCTGGTGGGCGACTTGCATGCGGTGTTGTTGGGCTGACCCCG TTGTAGGTCGCTGCAAGTTGCAGCTGAAGTGTCAGTATCGCATCCATGTCACCCTTTTTGT CATCTTCGAGCCTGAGGCAGTCGTTCTTGTATCACATGGATTTCGCAACATGGATGCTTAA TAGTATCTGTTGATCGTTCGTCTCACAGTAATAAAATTTAGTTGAGCAAATAAGTGTCGTCA CATCCCCTGTTCTCCACCCTGTCAAACTATAAATTGTGAAACATGAGCTGTTCT 122 Alinhamento ClustalW2 ÉxonéxonTCCGTGTGACGGGACTTACTCCTGGACTTCACGGCTTCCACCTCCACGAGTTTG GCGATACTACGAATGGGTGCATATCAACAGGACCACATTTTAACCCAAACAATTTGACGCA CGGTGCACCAGAAGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAACATTGTTGCCAATGC TGAAGGTGTAGCTGAGGCAACCATTGTTGATAAGCAGATTGCTGTTTTAAGTTACGAAACT CAGCTTACCTACTTTTGATGGTTTCTTCTAAATAGATTCCTCTGAGTGGCCCAAATTCTGTT GTTGGGAGAGCATTCGTTGTTCATGAGCTTGAAGATGATTTGGGGAAGGGTGGCCATGAG CTTAGTCTCAGTACTGGAAATGCTGGTGGGCGACTTGCATGCGGTGTTGTTGGGCTGACC CCGTTGTAGGTCGCTGCAAGTTGCAGCTGAAGTGTCAGTATCGCATCCATGTCACCCTTTT TGTCATCTTCGAGCCTGAGGCAGTCGTTCTTGTATCACATGGATTTCGCAACATGGATGCT TAATAGTATCTGTTGATCGTTCGTCTCACAGTAATAAAATTTAGTTGAGCAAATAAGTGTCGT CACATCCCCTGTTCTCCACCCTGTCAAACTATAAATTGTGAAACATGAGCTGTTCT PRIMER A 123 Primer F: CCGTGTGACGGGACTTACTC Primer R: TGGGTTAAAATGTGGTCCTGTT 100pb TCCGTGTGACGGGACTTACTCCTGGACTTCACGGCTTCCACCTCCACGAGTTTGGCGATA CTACGAATGGGTGCATATCAACAGGACCACATTTTAACCCAAACAATTTGACGCACGGTGC ACCAGAAGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAACATTGTTGCCAATGCTGAAGG TGTAGCTGAGGCAACCATTGTTGATAAGCAGATTGCTGTTTTAAGTTACGAAACTCAGCTTA CCTACTTTTGATGGTTTCTTCTAAATAGATTCCTCTGAGTGGCCCAAATTCTGTTGTTGGGA GAGCATTCGTTGTTCATGAGCTTGAAGATGATTTGGGGAAGGGTGGCCATGAGCTTAGTCT CAGTACTGGAAATGCTGGTGGGCGACTTGCATGCGGTGTTGTTGGGCTGACCCCGTTGTA GGTCGCTGCAAGTTGCAGCTGAAGTGTCAGTATCGCATCCATGTCACCCTTTTTGTCATCT TCGAGCCTGAGGCAGTCGTTCTTGTATCACATGGATTTCGCAACATGGATGCTTAATAGTA TCTGTTGATCGTTCGTCTCACAGTAATAAAATTTAGTTGAGCAAATAAGTGTCGTCACATCC CCTGTTCTCCACCCTGTCAAACTATAAATTGTGAAACATGAGCTGTTCT PRIMER B Primer F: AGGACCACATTTTAACCCAAA Primer R: CAATGGTTGCCTCAGCTACA 119pb TCCGTGTGACGGGACTTACTCCTGGACTTCACGGCTTCCACCTCCACGAGTTTGGCGATA CTACGAATGGGTGCATATCAACAGGACCACATTTTAACCCAAACAATTTGACGCACGGTGC ACCAGAAGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAACATTGTTGCCAATGCTGAAGG TGTAGCTGAGGCAACCATTGTTGATAAGCAGATTGCTGTTTTAAGTTACGAAACTCAGCTTA CCTACTTTTGATGGTTTCTTCTAAATAGATTCCTCTGAGTGGCCCAAATTCTGTTGTTGGGA GAGCATTCGTTGTTCATGAGCTTGAAGATGATTTGGGGAAGGGTGGCCATGAGCTTAGTCT CAGTACTGGAAATGCTGGTGGGCGACTTGCATGCGGTGTTGTTGGGCTGACCCCGTTGTA GGTCGCTGCAAGTTGCAGCTGAAGTGTCAGTATCGCATCCATGTCACCCTTTTTGTCATCT TCGAGCCTGAGGCAGTCGTTCTTGTATCACATGGATTTCGCAACATGGATGCTTAATAGTA TCTGTTGATCGTTCGTCTCACAGTAATAAAATTTAGTTGAGCAAATAAGTGTCGTCACATCC CCTGTTCTCCACCCTGTCAAACTATAAATTGTGAAACATGAGCTGTTCT PRIMER C Primer F: ACTTGCATGCGGTGTTGTT Primer R: TCAGGCTCGAAGATGACAAA 107pb TCCGTGTGACGGGACTTACTCCTGGACTTCACGGCTTCCACCTCCACGAGTTTGGCGATA CTACGAATGGGTGCATATCAACAGGACCACATTTTAACCCAAACAATTTGACGCACGGTGC ACCAGAAGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAACATTGTTGCCAATGCTGAAGG 124 TGTAGCTGAGGCAACCATTGTTGATAAGCAGATTGCTGTTTTAAGTTACGAAACTCAGCTTA CCTACTTTTGATGGTTTCTTCTAAATAGATTCCTCTGAGTGGCCCAAATTCTGTTGTTGGGA GAGCATTCGTTGTTCATGAGCTTGAAGATGATTTGGGGAAGGGTGGCCATGAGCTTAGTCT CAGTACTGGAAATGCTGGTGGGCGACTTGCATGCGGTGTTGTTGGGCTGACCCCGTTGTA GGTCGCTGCAAGTTGCAGCTGAAGTGTCAGTATCGCATCCATGTCACCCTTTTTGTCATCT TCGAGCCTGAGGCAGTCGTTCTTGTATCACATGGATTTCGCAACATGGATGCTTAATAGTA TCTGTTGATCGTTCGTCTCACAGTAATAAAATTTAGTTGAGCAAATAAGTGTCGTCACATCC CCTGTTCTCCACCCTGTCAAACTATAAATTGTGAAACATGAGCTGTTCT 125 Apêndice 3. Desenho de primers para estudo de expressão gênica em ensaio de restrição hídrica (Continua). LOC_Os03g11960_A F AGAGAATGGCAGGGAAAGC R GGGTCCTGGAAGAAGTGGA 52.63 57.90 Pares de Amplicon base (pb) 59.38 19 103 60.03 19 LOC_ Os03g11960_B F AGAGAATGGCAGGGAAAGC R CTCGGTATACCCGGTGGAG 52.63 59.38 19 63.16 60.34 19 LOC_ Os03g11960_C* F ACCGGGTATACCGAGGTGA R GTAGAGTTGCAGCCGTTGGT 57.90 60.20 19 55.00 60.32 20 LOC_Os03g22810_A F TTACGGGTAGGGCACTGAAC R GCCCAAGGTCACGGACTG 55.00 59.99 20 66.67 62.74 18 LOC_Os03g22810_B F GGGTCGCCTGAGATCACATTA R CATCTCCCTCTTGGACAAAGT 52.38 62.32 21 47.62 58.24 21 LOC_Os03g22810_C* F TCAACTGGGCCACACTACAA R CTTCTCCAGCGGTGACATTT 50.00 60.15 20 50.00 60.26 20 LOC_Os04g48410_A F AGTGGAAATTCCCTGCACAC R GGAGGAAGAGGAGGAGTTGG 50.00 59.97 20 60.00 60.19 20 LOC_Os04g48410_B F CAAGTTCCAAACTCTTGAAGGAA R TGCAGAGTATCCAGCATTGTG 39.13 59.79 23 47.62 59.88 21 LOC_Os04g48410_C* F AAGGGAACCCAAATGATTTTT R GCTTCAACTATAGCCAATTCCA 33.33 58.72 21 40.91 58.41 22 LOC_Os05g25850_A F ACCTCCCCTACGACTACGG R TCGAGGGCCTTGTTGTAGTT 63.16 59.03 19 50.00 59.73 20 LOC_Os05g25850_B* F ACGTCGCCAACTACAACAAG R GTTGAACTTGATGGCGCTCT 50.00 58.85 20 50.00 60.41 20 LOC_Os05g25850_C F CACCTACGTCGCCAACTACA R TCGCTGATAGGCTTGAGGTT 55.00 59.78 20 50.00 59.98 20 LOC_Os06g02500_A F CTGCAGGGGAGAGAGTACGA R ATCCATTTCAGCATCGGAAG 60.00 60.55 20 45.00 60.04 20 LOC_Os06g02500_B F CAGATGCCCTAGAGCCATACA R CACTCACTGCCACCAATCAT 52.38 60.24 21 50.00 59.55 20 LOC_Os06g02500_C* F GGATGGGTTTGGCTTTGTTA R AAGAGGATTGATGGCATTCG 45.00 59.80 20 45.00 60.04 20 LOC_Os06g05110_A F TGATGCTTCAGGATGACAGG R AGGTTCACAAAAGCCTCAGC 50.00 59.79 20 50.00 59.48 20 LOC_Os06g05110_B F GAGGCTTTTGTGAACCTTGG R CTCATGCATGCGAATCTCAG 50.00 59.71 20 50.00 60.53 20 LOC_Os06g05110_C* F GCGATATTTTCGCATCCATT R TCCAAAGGCCATTACATTCAT 40.00 59.90 20 38.10 59.29 21 LOC_Os07g46990_A F TCCCAAGAGGGAGATGGTC R CAGTTGACATGCAGCCATTAG 57.90 59.99 19 47.62 59.36 21 LOC_Os07g46990_B* F CACTTCAATCCTACTGGGAAGG R TAGCAACACCATCTGCTCCA 50.00 59.99 22 50.00 60.41 20 LOC_Os07g46990_C F CCGAGTTGCTTGCGGAAT R TTTTTATTTCAACATCCATACGAG 55.56 62.29 18 29.17 57.39 24 Identificação Sequência F/R (5' → 3') Conteúdo %GC Tm °C 122 104 125 100 100 170 108 115 112 101 162 124 109 123 109 159 100 118 100 101 126 Apêndice 3. Desenho de primers para estudo de expressão gênica em ensaio de restrição hídrica (Continuação). Identificação Sequência F/R (5' → 3') Conteúdo %GC LOC_Os08g44770 _A F CCGTGTGACGGGACTTACTC R TGGGTTAAAATGTGGTCCTGTT 60.00 Pares de Amplicon base (pb) 60.57 20 100 40.91 60.49 22 LOC_Os08g44770 _B F AGGACCACATTTTAACCCAAA R CAATGGTTGCCTCAGCTACA 38.10 58.34 21 50.00 59.86 20 F ACTTGCATGCGGTGTTGTT R TCAGGCTCGAAGATGACAAA 47.37 60.18 19 45.00 59.52 20 LOC_Os08g44770 _C* *Primers selecionados para qPCR. Tm °C 119 107 127 Apêndice 4. Gel desnaturante de agarose 1%. As bandas correspondem às subunidades 25S rRNA, banda superior, e 18S rRNA, banda inferior, de cada amostra de RNA extraído de plantas de arroz submetidas à restrição hídrica. À esquerda, Ladder 100 pb (ThermoScientificGeneruer). 300pb 200pb 100pb Apêndice 5. Gel de agarose 1%. As bandas correspondem à amplificação de cDNA das amostras utilizadas para avaliação de expressão gênica de plantas de arroz submetidas a restrição hídrica utilizando o par de primers eEF1α, ladder 100pb (ThermoScientificGeneruer), à esquerda, e uma amostra de DNA como controle, à direita. A verificação de apenas uma banda indica que houve amplificação apenas de cDNA. 128 Apêndice 6. Resultado de quantificação em espectrofotômetro Nanovue Plus™ (GE Healthcare), a pureza da amostra foi verificada por meio da relação entre as absorbâncias de ácidos nucleicos, 260nm, e proteínas, 280nm. O número de integridade de RNA, RIN, das amostras utilizadas para o estudo de expressão gênica em plantas de arroz submetidas a déficit hídrico foi obtido por meio do Bioanalyzer 2100 (Agilent). Genótipo Estádio Tecido Tratamento [] (ng/µL) NanoVue ABS(260/280) ABS (260/230) RIN RNA rRNA Douradão Vegetativo Folha 100% 1832 2,025 1,621 6.40 1.3 Douradão Vegetativo Folha 50% 1922 2,033 1,068 6.30 1.6 Douradão Vegetativo Raiz 100% 244,4 2,03 1,66 7.90 2.4 Douradão Vegetativo Raiz 50% 88,4 2,028 0,969 7.70 2.7 Douradão Reprodutivo Folha 100% 2386 1,953 1,189 7.30 1.4 Douradão Reprodutivo Folha 50% 601,6 1,946 1,202 6.90 1.8 Douradão Reprodutivo Raiz 100% 173,2 1,8 0,663 8.40 0.9 Douradão Reprodutivo Raiz 50% 421,6 1,989 0,925 7.70 1.5 Primavera Vegetativo Folha 100% 1108 1,928 1,074 6.20 1.5 Primavera Vegetativo Folha 50% 1746 1,985 1,019 6.00 1.1 Primavera Vegetativo Raiz 100% 140,8 1,978 1,117 8.00 3.7 Primavera Vegetativo Raiz 50% 230,8 2,039 1,687 8.10 2.5 Primavera Reprodutivo Folha 100% 934,8 2,14 1,335 8.10 1.6 Primavera Reprodutivo Folha 50% 1207 2,028 1,927 7.00 1.4 Primavera Reprodutivo Raiz 100% 795,2 2,229 1,06 9.70 1.7 Primavera Reprodutivo Raiz 50% 122 2,075 2,179 6.80 1.4
