Avaliação, in vitro , da resposta imune de neutrófilos de

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Avaliação, in vitro, da resposta imune de neutrófilos de
camundongos C57BL/6 estimulados com diferentes
espécies de Leishmania
MAURICIO AZEVEDO BATISTA
OURO PRETO -MG
Março de 2013
Avaliação, in vitro, da resposta imune de neutrófilos de
camundongos C57BL/6 estimulados com diferentes
espécies de Leishmania
Orientadora: Dra. Denise da Silveira Lemos Giunchetti – Laboratório de Imunoparasitologia - Departamento
de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas / Núcleo de Pesquisa em Ciências
Biológicas - Universidade Federal de Ouro Preto.
Co-orientador: Dr. Luís Carlos Crocco Afonso – Laboratório de Imunoparasitologia - Departamento de
Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas / Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas Universidade Federal de Ouro Preto.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisa em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como
parte integrante dos requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração:
Imunologia de Protozoários.
Universidade Federal de Ouro Preto
Ouro Preto - MG
Março 2013
ii
iii
BATISTA, M.A.
Prefácio
PREFÁCIO
"O principal objetivo da educação é criar indivíduos capazes
de fazer coisas novas e não simplesmente repetir o que as
outras gerações fizeram."
Jean Piaget.
iv
BATISTA, M.A.
Agradecimento
AGRADECIMENTOS
A minha família em especial a minha mãe, pelo apoio incondicional, experiência inigualável e
atitude que me motivaram e continuaram me motivando por toda a minha vida. Aos meus irmãos e
companheiros deles, que participaram e foram de grande importância na minha caminhada, pois
sem a minha família nada teria acontecido.
A Denise por todos os ensinamentos durante todos os anos que estamos juntos, por me fazer
amadurecer e crescer enquanto pessoa e pesquisador. Agradeço pela oportunidade, pela paciência e
compreensão em todos os momentos, independente dos problemas que passamos desde a minha
chegada em Ouro Preto. Você é um exemplo de pesquisadora, sempre ética, profissional e sempre
esteve disponível, independente do momento em que eu precisava de um auxilio em experimentos
ou apenas de um conselho. Serei sempre grato a você, minha felicidade por conviver com você não
pode ser descrita em palavras e sim em atitudes que pretendo continuar tendo durante toda a minha
vida, pois o nosso caminho juntos apenas começou.
Ao Luís Carlos agradeço pela oportunidade de vislumbrar um mundo diferente do que eu estava
familiarizado e, dessa forma, abrir meu horizonte. As oportunidades que ele me proporcionou são
impossíveis de serem descritas e penso que me tornei um pesquisador melhor graças as suas críticas
e sugestões para melhorar o trabalho desenvolvido. Considero-me hoje um estudante de sorte por
ter tido a oportunidade de conviver com esse pesquisador que se tornou um guia para continuar a
minha caminhada.
A Ana Carolina Campi minha eterna professora e amiga que mesmo longe esteve presente em
momentos cruciais dessa jornada, que mais do que professora é uma mestre que jamais esquecerei e
que está em meu pensamento, atitude e caminho durante toda a minha vida.
Aos amigos do laboratório Leandro (chuchu), Marco, Tiago, Bijay, Amanda, Miríam, Pauline,
Hellem, Renata, Flávia, Juliana, Letícia, Priscila, que me receberam de braços abertos e tornaram
esses dois anos muito agradáveis. Foram muitos momentos para lembrar, mais cada um de vocês
sabe o meu sentimento e o quanto gosto de cada um. São pessoas especiais que jamais pretendo
esquecer e que farei o possível e o impossível para manter contato durante toda a minha vida.
Aos fiéis amigos de todos os momentos Daniela, Bruna, Rafaela, Diogo, Cyntia, Zorel e João
Renato que tornaram esses dois anos, os melhores anos da minha vida, sem dúvida. Cada um de
vocês conquistou em meu coração um lugar que jamais perderá. Esses dois anos de convívio foram
v
BATISTA, M.A.
Agradecimento
repletos de experiências singulares, momentos inesquecíveis, algumas brigas e rusgas, mas nada
que pudesse abalar a nossa união. Sem vocês, a conquista desse título seria vazia, pois não importa
a chegada e sim as pessoas que te acompanharam durante a caminhada. Não vou citar a importância
de cada um, mas acredito que vocês saibam o quanto gosto de vocês com as suas singularidades e
peculiaridades. Muito obrigado por compartilhar ótimos momentos comigo, serei sempre grato por
toda a experiência vivida.
Aos amigos da Pós-graduação Alines (Arlindo e Costa), Ludmila, Gleiciane, Jamille, Fernando,
Carol, Milla, Gabrielas (Souza e Faria), Glaucy, Cintia, Raquel, Suianne pelo apoio, amizade e
conselhos em todos os momentos.
Aos amigos da “república Kzazul” (Ivan, Mateus, Denis e Rodrigo) que foram a minha família
durante esses dois anos, me recebendo de braços abertos. Nesse período foram muitos ensinamentos
que jamais poderia imaginar aprender em 10 anos de vida. Hoje somos grandes amigos e nunca vou
me esquecer dos apelidos, festas e todos os bons momentos vividos juntos. Todos vocês podem
contar comigo para qualquer momento.
Em geral, gostaria de agradecer a todos que colaboraram de maneira direta ou indireta para o
desenvolvimento desse trabalho.
À CAPES, À FAPEMIG, CNPq e UFOP pelo Financiamento.
vi
BATISTA, M.A.
Resumo
RESUMO
Neutrófilos prevalecem nas primeiras horas após a infecção por Leishmania e representam,
portanto, a primeira população celular a migrar para o local do inóculo, sendo cerca de 80 a 90% do
infiltrado celular e, dessa forma, pode contribuir para resposta imune protetora na infecção por este
parasito. Entretanto, diferentes estudos mostraram que neutrófilos podem auxiliar no
estabelecimento da infecção, via inativação dos mecanismos leishmanicidas de macrófagos.
Considerando que a maior parte dos trabalhos aborda a infecção por Leishmania major, torna-se de
grande relevância o estudo do papel de neutrófilos na infecção por outras espécies de Leishmania.
Neste sentido foi avaliada, in vitro, a resposta imune de neutrófilos na presença de diferentes
espécies de Leishmania. Para isso, neutrófilos obtidos de medula óssea de camundongos C57BL/6 e
isolados por gradiente de Percoll® foram cultivados na presença de Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis ou L. major, por 3 horas a 37°C / 5%CO2. Primeiramente, foi avaliada a
viabilidade dos neutrófilos infectados por parasitos do gênero Leishmania, onde os resultados
mostraram que o percentual de células viáveis não foi alterado, independentemente da espécie de
Leishmania. Em seguida, foi avaliada a capacidade fagocítica através da marcação dos parasitos
com éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE) e os resultados mostraram maior percentual
de fagocitose de L. braziliensis por neutrófilos quando comparados a L. amazonensis ou L. major.
Posteriormente, foi avaliado o perfil funcional dessas células através da avaliação da expressão de
óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares, por citometria de fluxo, e
os resultados demonstraram maior expressão tanto de NO como de EROs por neutrófilos infectados
por L. braziliensis quando comparados a L. amazonensis ou L. major. Adicionalmente, foi avaliado
a expressão de moléculas de ativação (CD11b/CD49d/CD62L e TLR2/TLR4/TLR9) e os resultados
mostraram diminuição da expressão de CD62L e aumento na expressão de TLR2 e TLR9 em
neutrófilos infectados pelas três espécies de Leishmania. Além disso, foi observado aumento na
expressão de TLR4 em neutrófilos infectados por L. braziliensis, quando comparado à população
sem estimulo, bem como, aumento de TLR2 quando comparado com as demais espécies.
Posteriormente foi realizada a dosagem dos níveis de quimiocinas (MCP-1, MCP-3, MIP-1α, MIP1β e RANTES) no sobrenadante de cultura e os resultados mostraram que apenas neutrófilos
infectados por L. amazonensis ou L. braziliensis produziram MIP-1α, além disso, independente do
estímulo, neutrófilos foram capazes de produzir MIP-1β. Por fim, os resultados da avaliação do
perfil de expressão intracelular das citocinas IL-12, TNF-α, IL-10 e TGF-β mostraram maior
expressão de TNF-α por neutrófilos infectados pelas três espécies do parasito. Além disso, esse
mesmo resultado foi observado em neutrófilos expressando IL-10 infectados por L. amazonensis ou
L. braziliensis, bem como, em neutrófilos expressando IL-12p40 infectados por L. amazonensis,
quando comparados aos neutrófilos sem estímulo. Nenhuma diferença foi observada para a citocina
TGF-β nos neutrófilos infectados pelas três espécies do parasito. Em conjunto, os dados
demonstraram que neutrófilos podem ter papel importante para o controle da infecção, bem como
no estabelecimento e direcionamento de resposta protetora. Além disso, pode-se sugerir que L.
braziliensis foi mais eficiente na indução de perfil de ativação e expressão de mediadores
inflamatórios quando comparado às demais espécies, o que indica um possível mecanismo de
controle da infecção desencadeado por neutrófilos.
Palavras-Chave: Neutrófilo, Leishmania, Resposta Imune
vii
BATISTA, M.A.
Abstract
ABSTRACT
Neutrophils prevail during the first hours after infection by Leishmania and therefore represent one
of the first cell populations to migrate to the site of the infection, representing about 80 to 90% of
the cellular infiltrate and, thus can contribute to a protective immune response on infection by this
parasite. However, different studies have shown that neutrophils may assist in establishment of
infection, via inactivation of macrophage antileishmanial mechanisms. Whereas most studies
address the infection by Leishmania major, it is of great importance to study the role of neutrophils
in other species of Leishmania. In our study, we evaluated in vitro response of neutrophils in the
presence of different Leishmania species. For this, neutrophils harvested from bone marrow of
C57BL/6 mice and then purified by Percoll gradient were cultured in the presence of L.
amazonensis, L. braziliensis or L. major for 3 hours at 37°C / 5%CO2. Initially, we evaluated the
viability of neutrophils infected by parasites of the genus Leishmania. The results showed that the
percentage of viable cells did not change, regardless of the species of Leishmania used in the
infection. We, then, evaluated the phagocytic ability by stainning parasites with carboxyfluorescein
succinimidyl ester (CFSE) and the results showed a higher percentage of neutrophil phagocytosis in
the presence of L. braziliensis when compared to L. amazonensis or L. major. Subsequently, we
assessed the functional activation of these cells through the evaluation of nitric oxide (NO) and
reactive oxygen species (ROS) intracellular expression by flow cytometry. Our results showed an
increased expression of both NO and ROS by neutrophil infected with L. braziliensis when
compared to L. amazonensis or L. major. In addition, we evaluated the expression of activation
molecules (CD11b/CD49d/CD62L and TLR2/TLR4/TLR9) and the results showed a decreased
expression of CD62L and an increase in the expression of TLR2 and TLR9 on neutrophils infected
by three Leishmania species. Moreover, we observed an increase in expression of TLR4 in
neutrophils infected by L. braziliensis, when compared to the population without stimulation, as
well as increased TLR2 when compared with the other species. In addition, we evaluated the levels
of chemokines (MCP-1, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β and RANTES) in the culture supernatant and the
results showed that only neutrophils infected by L. amazonensis or L. braziliensis produced MIP1α. Moreover, independently of the stimulus, neutrophils were able to produce MIP-1β. Finally, the
results of IL-12, TNF-α, IL-10 and TGF-β intracellular expression showed increased levels of TNFα in neutrophils infected by the three species of the parasite. Additionally, this same result was
observed in neutrophils expression of IL-10 infected by L. amazonensis or L. braziliensis and, in
neutrophils expression IL-12p40 infected by L. amazonensis, when compared to non stimulated
neutrophils. No difference was observed for the cytokine TGF-β in neutrophils infected by the three
species of the parasite. Together, these data demonstrated that neutrophils may have an important
role in the control of infection, as well as establishing and directing a protective response.
Furthermore, it can be suggested that L. braziliensis was more effective in inducing a profile
activation and expression of inflammatory mediators when compared to other species, suggesting a
possible mechanism of control neutrophils triggered by the infection.
Keywords: Neutrophils, Leishmania, Immune response
viii
BATISTA, M.A.
Índice
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS..................................................................................................................
v
RESUMO....................................................................................................................................... vii
ABSTRACT..................................................................................................................................
viii
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................................
xii
LISTA DE TABELAS..................................................................................................................
xiv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS...................................................................................
xv
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 17
1.1 - Aspectos gerais da Leishmaniose Tegumentar: epidemiologia, ciclo biológico e
formas clínicas........................................................................................................................
18
1.2 - Aspectos gerais da resposta imune inata na infecção por Leishmania ..........................
22
1.3 - Papel de neutrófilo na infecção por Leishmania: capacidade fagocítica, produção de
mediadores leishmanicidas e desenvolvimento da resposta inflamatória..........................
24
2 –JUSTIFICATIVA.....................................................................................................................
30
3 – OBJETIVOS............................................................................................................................
32
3.1 - Objetivo geral.................................................................................................................
33
3.2 - Objetivos específicos......................................................................................................
33
4 - MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................
34
4.1.1 - Caracterização dos animais.........................................................................................
35
4.1.2 - Cultura de parasitos.....................................................................................................
35
4.1.3 - Preparação dos estímulos inespecíficos zimosan e phorbol 12-myristate 13-acetate
(PMA).....................................................................................................................................
36
4.1.4 -Purificação de neutrófilos de medula óssea de camundongos C57BL/6......................
37
4.1.5 - Cultura de neutrófilos, in vitro, na presença de Leishmania amanzonesis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A......................
39
4.1.6 - Marcação imunofenotípica de neutrófilos, in vitro, após cultura na presença de
Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan A...............................................................................................................................
40
4.1.7 - Avaliação da viabilidade de neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A...
40
4.1.8 - Avaliação da fagocitose de Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis,
Leishmania major ou na presença de zimosan A por neutrófilos...........................................
41
ix
BATISTA, M.A.
Índice
4.1.9 - Detecção da expressão de óxido nítrico por neutrófilos infectados, in vitro, com
Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan A...............................................................................................................................
42
4.1.10 - Avaliação da expressão de espécies reativas do oxigênio por neutrófilos, in vitro,
infectados com Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou
na presença de zimosan A....................................................................................................... 43
4.1.11 - Avaliação da ativação celular em neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A...
44
4.1.12 - Detecção dos níveis de quimiocinas e do fator estimulador de colônia para
monócitos e granulócitos (GM-CSF) por neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A ..
45
4.1.13 – Avaliação do perfil de expressão de citocinas intracelulares e expressão de TLR9
por neutrófilos, in vitro, infectados com Leishmania amanzonesis, Leishmania
braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A...............................................
46
4.2 - Estratégia de Análise......................................................................................................
48
4.2.1 - Análise do processo de apoptose em neutrófilos infectados, in vitro, por
Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan A...............................................................................................................................
48
4.2.2 - Análise da fagocitose de Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis,
Leishmania major ou zimosan A por neutrófilos...................................................................
49
4.2.3 - Análise do perfil de expressão intracelular de espécies reativas do oxigênio e óxido
nítrico por neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania amanzonesis, Leishmania
braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A..............................................
50
4.2.4 - Análise da ativação de neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A..
51
4.2.5 - Análise do perfil de expressão de citocinas intracelulares por neutrófilos
infectados, in vitro, com Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania
major ou na presença de zimosan A.......................................................................................
52
4.3 - Análise Estatística dos Dados...............................................................................................
53
5 – RESULTADOS.......................................................................................................................
54
5.1 - Avaliação da viabilidade celular e fagocitose por neutrófilos infectados com
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major.............................
55
x
BATISTA, M.A.
Índice
5.2 – Perfil de expressão de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (EROS)
por neutrófilos infectados, in vitro, com promastigotas de Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major.......................................................................
56
5.3 – Perfil de expressão de marcadores de ativação e dos receptores do tipo Toll em
neutrófilos infectados, in vitro, por promastigotas de Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major.......................................................................
59
5.4 - Produção de quimiocinas por neutrófilos infectados, in vitro, com promastigotas de
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major...........................
62
5.5 - Avaliação do perfil de expressão de citocinas intracelulares por neutrófilos
infectados, in vitro, com promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major...........................................................................................
64
6 – DISCUSSÃO...........................................................................................................................
67
7 – CONCLUSÃO......................................................................................................................... 76
8 – PERSPECTIVAS..................................................................................................................... 78
9 – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA......................................................................................... 80
10 – ANEXO.................................................................................................................................
93
10.1 – Protocolo de Aprovação pelo Comitê de Ética............................................................
94
xi
BATISTA, M.A.
Lista de Figuras, Fluxograma e Tabelas
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de vida da Leishmania..........................................................................................
20
Figura 2: Distribuição das espécies de Leishmania causadoras da leishmaniose tegumentar no
Brasil.............................................................................................................................................. 21
Figura 3. Caracterização do perfil celular após purificação de neutrófilos da medula óssea de
camundongos C57BL/6.................................................................................................................
39
Figura 4. Marcação de Leishmania com CFSE.............................................................................
42
Figura 5: Avaliação do processo de apoptose de neutrófilos infectados por Leishmania
amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan..............
48
Figura 6: Avaliação da fagocitose de Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis,
Leishmania major ou zimosan por neutrófilos..............................................................................
49
Figura 7: Avaliação do perfil de expressão intracelular de óxido nítrico e espécies reativas do
oxigênio por neutrófilos infectados por Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis,
Leishmania major ou na presença de zimosan..............................................................................
50
Figura 8: Avaliação do perfil de ativação de neutrófilos infectados por Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan..............
51
Figura 9: Avaliação do perfil de expressão de citocinas intracelular por neutrófilos com
Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan..........................................................................................................................................
52
Figura 10: Avaliação da viabilidade celular de neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania
amazonensis,
Leishmania
braziliensis,
Leishmania
major
ou
na
presença
de
zimosan..........................................................................................................................................
55
Figura 11: Capacidade fagocítica de neutrófilos infectados, in vitro, por de Leishmania
amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan..............
56
Figura 12: Perfil de expressão de óxido nítrico intracelular por neutrófilos infectados, in vitro,
com Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan..........................................................................................................................................
57
Figura 13: Perfil de expressão de espécies reativas de oxigênio intracelular de neutrófilos
infectados, in vitro, por Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major
ou na presença de zimosan............................................................................................................
58
Figura 14: Expressão das integrinas (CD11b/CD49d) e da selectina (CD62L) por neutrófilos
infectados, in vitro, com Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major
ou na presença de zimosan............................................................................................................
60
xii
BATISTA, M.A.
Lista de Figuras, Fluxograma e Tabelas
Figura 15: Expressão dos receptores toll like (TLR2, TLR4 e TLR9) por neutrófilos
infectados, in vitro, com Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania
major, na presença de zimosan ou Phorbol 12-myristate 13-acetate............................................. 62
Figura 16: Dosagem de quimiocinas no sobrenadante de cultura de neutrófilos infectados, in
vitro, por Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na
presença de zimosan......................................................................................................................
63
Figura 17: Perfil de expressão de citocinas intracelulares de neutrófilos infectados, in vitro,
por Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan..........................................................................................................................................
65
Figura 18: Sumário dos resultados................................................................................................
66
xiii
BATISTA, M.A.
Lista de Figuras, Fluxograma e Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Descrição dos anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos...........................
45
Tabela 2. Anticorpos monoclonais para identificação de citocinas e receptor TLR9
intracelulares.................................................................................................................................. 47
FLUXOGRAMA
Fluxograma 1. Delineamento experimental proposto.................................................................... 35
xiv
BATISTA, M.A.
Lista de Abreviaturas e Símbolos
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AF647 – Alexa Fluor 647
AG – Aminoguanidina
ANOVA - Análise de variância
APC – Allophycocyanin
BSA – Albumina bovina sérica
carboxy-H2DCFDA – (5-ou-6)-carboxy-2′,7′ dichlorodihydro fluorescein diacetate
CEP – Comitê de ética em pesquisa
CFSE – Éster de succinimidil-carboxifluoresceína
CTCM – Meio de cultura completo para células e tecidos
Cy5– Cyanine 5
DAF-2T – Diacetato de 4,5-diaminofluoresceína
DMEM – Dulbecco Modified Eagle Médium
DPI – Diphenyleneiodonium chloride
EROs – Espécies reativas de oxigênio
FITC – isotiocianato de fluoresceína
fMLP – n-formil-metionil-leucil-fenilalanina
Gate – Região selecionada em gráfico de dispersão pontual
GM-CSF – Fator estimulador de colônia para granulócitos e macrófagos
Hank’s – Solução balanceada de sais
HEPES – [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)]
IFN-γ – Interferon gama
Ig – Imunoglobulina
IL – Interleucina
iNOS – óxido nítrico sintase induzida
IMF – Intensidade Média de Fluorescência
xv
BATISTA, M.A.
Lista de Abreviaturas e Símbolos
IP – Iodeto de Propídio
LPG – Lipofosfoglicano glicoconjugado
LPS – Lipopolissacarídeo
LT – Leishmania tegumentar
MCP– Proteína quimiotática de monócito
MFF – Solução fixadora
MIP – Proteína inflamatória de macrófago
NADPH oxidase – nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase
NETs – Redes extracelulares de neutrófilos
NK – Células natural killer
NO – Óxido nítrico
NRLs – Receptores NOD
PAMPs – Padrões moleculares associados a patógenos
PBS – Salina tamponada com fosfato
PBS (W) – PBS Wash
PBS (P) – PBS permeabilizante
PE – Phycoerythrin
PMA – Phorbol 12-myristate 13-acetate
PRR – Receptor de reconhecimento padrão
RANTES – regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
RIG-Is – Retinoic acid inducible gene 1
SFB – Soro fetal bovino
TGF-β – Fator de transformação do crescimento beta
TNF-α – Fator de necrose tumoral
TLRs – Receptores o tipo toll
UFOP – Universidade Federal de Ouro Preto
xvi
BATISTA, M.A.
Introdução
1 - INTRODUÇÃO
BATISTA, M.A.
Introdução
1.1 - Aspectos gerais da Leishmaniose Tegumentar: epidemiologia, ciclo biológico e formas
clínicas
A leishmaniose tegumentar (LT) é uma doença que acompanha o homem desde a
antiguidade, existindo relatos e descrições encontrados na literatura desde o século I d.C (Lainson,
1997). No Brasil, a primeira descrição de LT encontra-se no documento da Pastoral Religiosa
Político-Geográfica de 1827, em um relato de uma viagem pela região da Amazônia (Lainson,
1997; Basano & Camargo, 2004). Em 1909, Lindenberg encontrou formas semelhantes à
Leishmania tropica em lesões cutâneas de indivíduos que trabalhavam nas matas do interior do
Estado de São Paulo (Ministério da Saúde, 2007; Basano & Camargo, 2004). Gaspar Vianna, em
1911, por considerar o parasito diferente da L. tropica, o batizou de L. braziliensis, ficando assim
denominado o principal agente etiológico da LT no Brasil até a década de setenta. Atualmente, com
o aprimoramento de técnicas de identificação e classificação dos parasitos, já foram registradas seis
espécies causadoras da LT no Brasil (Ministério da Saúde, 2007; Basano & Camargo, 2004;
Lainson, 1997). A LT compreende um grupo de doenças não contagiosas causadas por protozoários
intracelulares obrigatórios (Desjeux, 2004). É uma antropozoonose considerada problema de saúde
pública, em regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo, que apresentam diferentes síndromes
com sinais e sintomas clínicos extremamente distintos (Desjeux, 2004; Ministério da Saúde, 2007).
O complexo ciclo de vida deste parasito permitiu a disseminação desse protozoário pelo Velho e
Novo Mundo através de diferentes vetores e animais reservatórios. A capacidade de evasão do
sistema imune faz com que essa espécie se mantenha crescendo e multiplicando-se nas próprias
células de defesa do hospedeiro. Essas e outras características do gênero Leishmania fazem com
que hoje, mais de um século após seu isolamento, ainda não se conheça completamente os
mecanismos da resposta imune do hospedeiro envolvido na destruição e controle dos protozoários
causadores das leishmanioses.
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2007) a LT é um problema de saúde pública
em diversos países em desenvolvimento em todo o mundo. Está presente em 88 países, distribuídos
nos quatro continentes e é considerada como uma das seis mais importantes doenças infecciosas
pelo seu alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir deformidades (Desjeux, 1996). A
prevalência global é de 12 milhões, com incidência estimada de 1,5 milhões de novos casos de
leishmaniose tegumentar por ano, sendo que cerca de 350 milhões de pessoas estão em risco de
contrair a doença. No âmbito mundial, levando em consideração os casos descritos, países como
Afeganistão, Arábia Saudita, Bolívia, Brasil, Irã, Peru e Síria concentram mais de 90% dos casos
(www.who.int/leishmaniasis/burden). Nesse sentido, considerando a importância epidemiológica
dos países da América do Sul é interessante destacar a distribuição geográfica da leishmaniose
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BATISTA, M.A.
Introdução
tegumentar neste continente. Segundo o Ministério da Saúde (2007) no continente americano há
registro de casos desde o extremo sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, com exceção do
Chile e Uruguai. No Brasil, a LT é uma das infecções dermatológicas que merece atenção, devido à
sua magnitude, assim como pelo risco de ocorrência de deformidades em humanos, bem como, pelo
envolvimento psicológico, com reflexos no campo social e econômico, uma vez que, na maioria dos
casos, pode ser considerada doença ocupacional (Desjeux, 2004). No período de 1988 a 2007, a LT
apresentou média anual de 27.736 casos autóctones registrados e coeficiente de detecção médio de
17,3 casos por 100.000 habitantes (Ministério da Saúde, 2007). Além disso, ao realizar uma análise
da evolução e expansão geográfica da LT no Brasil foi demonstrada que no início da década de 80
apenas 19 unidades federativas tinham registrados casos autóctones. Entretanto, no ano de 2003 foi
confirmada a presença desses casos em todas as unidades federativas (Ministério da Saúde, 2007).
Portanto, fica evidente a importância do controle da doença em nosso país.
O parasito apresenta ciclo heteroxênico, com um estágio de desenvolvimento intracelular
em mamíferos e estágio extracelular em flebotomíneos do gênero Phlebotomus (Velho Mundo) e
Lutzomyia (Novo Mundo) (Figura 1). A infecção inicia-se quando fêmeas de flebotomíneos durante
o repasto sanguíneo em indivíduos infectados (ciclo antroponótico) ou em reservatórios animais
(ciclo zoonótico), ingerem macrófagos que albergam formas amastigotas intracelulares obrigatórias
as quais são liberadas na porção anterior do intestino dos insetos. Imediatamente após a ingestão, as
formas amastigotas transformam-se em formas alongadas, flageladas e extracelulares denominadas
promastigotas capazes de multiplicar-se por divisão binária após migrarem para a porção posterior
do intestino médio do inseto. Na porção posterior do intestino do inseto as formas promastigotas
passam por diversas etapas de diferenciação, num processo chamado de metaciclogênese, se
transformando em formas promastigotas metacíclicas com alta mobilidade, corpo celular curto e
longo flagelo, sendo altamente adaptadas para a transmissão ao hospedeiro mamífero.
Posteriormente, ocorre a migração das formas metacíclicas para a probóscide dos insetos vetores
permitindo a infecção de hospedeiros mamíferos durante novo repasto sanguíneo do vetor
infectado. Uma vez no hospedeiro mamífero, as promastigotas são internalizadas por macrófagos,
principal célula hospedeira e, rapidamente, convertem-se em amastigotas multiplicando-se
avidamente no interior dos fagolisossomos de macrófagos e eventualmente ocasionam a lise celular.
As amastigotas liberadas são capturadas por outros macrófagos promovendo a continuidade do ciclo
(Awasthi e cols., 2004; Kamhawi, 2006; Chappuis e cols., 2007).
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BATISTA, M.A.
Introdução
Amastigota intracelular
Proliferação
Fagolissosomo
Lise
Fagocitose
Re-infecção
Macrófago
infecção
Flebótomo
Flebótomo
Promastigota
metacíclica
Amastigota
Promastigota
procíclica
Proliferação no intestino
Figura 1: Ciclo de vida da Leishmania. Adaptado de Chappuis e cols., 2007.
No Brasil já foram identificadas sete espécies do gênero Leishmania, sendo seis do
subgênero Viannia e uma do subgênero Leishmania. As três principais espécies causadoras da LT
são: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis e Leishmania
(Leishmania) amazonensis (Marzochi, 1992). Cada espécie tem diferentes padrões epidemiológicos
/ demográficos, sendo transmitida entre animais por meio de diferentes vetores (Marzochi, 1992). É
importante destacar que a Leishmania braziliensis destaca-se de outras espécies por apresentar
ampla distribuição no Brasil (do sul do Pará ao Nordeste, atingindo também o centro-sul do país e
algumas áreas da Amazônia Oriental) causando lesões cutâneas e mucosas metastáticas (Gontijo &
Carvalho, 2003).
O mapa abaixo representa a distribuição das principais espécies de Leishmania
responsáveis por causar a LT no Brasil (Figura 2).
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BATISTA, M.A.
Introdução
Leishmania (Viannia) braziliensis
Leishmania (Viannia) lainsoni
Leishmania (Viannia) naiffi
Leishmania (Viannia) shawi
Leishmania (Viannia) guyanensis
Leishmania (Viannia) amazonensis
Leishmania (Viannia) lindenberg
Figura 2: Distribuição das espécies de Leishmania causadoras da leishmaniose tegumentar no Brasil. Adaptada de
Ministerio da Saúde, 2007.
Do ponto de vista clínico, as diferentes manifestações da leishmaniose tegumentar resultam
de uma combinação de fatores entre a espécie do parasito causador da infecção e a resposta imune
montada pelo hospedeiro (Awasthi e cols., 2004). A leishmaniose tegumentar é subdividida em
quatro formas clínicas: (1) leishmaniose cutânea, causada principalmente por L. braziliensis e L.
guyanensis no Novo Mundo, e L. tropica, L. major (forma zoonótica) e Leishmania aethiopica no
Velho Mundo, e caracterizada por úlcera no local da picada do inseto e, na maioria dos casos, com
resolução espontânea; (2) leishmaniose cutânea disseminada, causada principalmente por L.
braziliensis, e caracterizada por várias lesões não contíguas formadas pela disseminação do parasito
por vias hematogênica ou linfática; (3) leishmaniose mucocutânea, causada normalmente por L.
braziliensis, e caracterizada por resposta imune exacerbada e ineficaz, com acometimento das
mucosas, principalmente da região nasofaringe, onde são encontradas lesões destrutivas que podem
levar a desfiguração; e (4) leishmaniose difusa, forma clínica rara, porém grave, associada à lesão
difusa não ulcerada, rica em parasito, e também a um processo anérgico, onde a resposta de
linfócitos T é ausente ou muito prejudicada, tendo como principal agente etiológico L. amazonensis
e Leishmania pifanoi (Herwaldt 1999; McMahon-Pratt & Alexander, 2004; González e cols., 2009).
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BATISTA, M.A.
Introdução
Mediante o exposto, fica evidente a importância do estudo da leishmaniose tegumentar,
principalmente pelo fato da espécie do parasito possuir diferentes graus de virulência (Handman &
Goding, 1985; Mossar & Brittingham, 1997).
1.2 - Aspectos gerais da resposta imune inata na infecção por Leishmania
A leishmaniose é um modelo interessante para demonstrar a complexa interação entre
parasito e hospedeiro. O resultado da infecção por Leishmania é determinado não só pela espécie de
parasito, mas também pela resposta imune do hospedeiro (Awasthi e cols., 2004). A maioria dos
trabalhos desenvolvidos com a intenção de avaliar as causas da resistência ou susceptibilidade a este
parasito utilizou a espécie L. major em linhagens de camundongos que eram geneticamente
resistentes (CH3, C57BL/6 ou CBA) ou susceptíveis (BALB/c) ao parasito. O modelo murino,
apesar de não apresentar perfil de resposta imune completamente semelhante ao humano, é capaz de
mimetizar muitos aspectos fisiológicos da infecção humana e permite, dessa forma, compreender
vários aspectos da resposta do hospedeiro durante a infecção (Chorilli e cols., 2007). Atualmente
sabe-se que a caracterização de um perfil de susceptibilidade ou resistência à infecção por
Leishmania, tem como base as informações obtidas nos trabalhos que utilizaram o modelo murino
infectado por L. major (Kopf e cols., 1996; Anderson e cols., 2005) ou L. amazonensis (Afonso &
Scott, 1993, Soong e cols., 1997; Jones e cols., 2000; Jones e cols., 2002). Estes trabalhos
descrevem que, utilizando o mesmo hospedeiro e diferentes cepas ou espécies dos parasitos, muito
embora a resposta protetora fosse sempre dependente da produção de interferon-gama (IFN-γ), a
susceptibilidade à infecção nem sempre dependia da produção da interleucina (IL)-4. Além disso,
estes trabalhos demonstraram que o parasito tem papel crucial no estabelecimento da infecção e na
forma clínica, como é observado em casos humanos.
Estudos de Kobayashi & DeLeo, (2009) e Charmoy e cols. (2010A) mostraram que os
eventos iniciais da infecção por Leishmania (primeiras horas até 3 dias) são de extrema importância
no desenvolvimento de uma resposta imune protetora ou favorável à infecção. Neste sentido, o
estudo das células da imunidade inata como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas são de
grande relevância para o entendimento da formação do ambiente inflamatório, bem como, para o
recrutamento de células da resposta imune adaptativa que vão efetivamente direcionar o curso da
infecção. Apesar de macrófagos serem considerados as principais células hospedeiras, permitindo a
sobrevivência e multiplicação de amastigotas de Leishmania (na ausência dos mecanismos
leishmanicidas), outros tipos celulares, como os neutrófilos e células dendríticas, são também
infectadas e desempenham papel importante na infecção (Awasthi e cols., 2004; Peters e cols.,
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BATISTA, M.A.
Introdução
2008; Ribeiro-Gomes e cols., 2012B). Neutrófilos são as primeiras células a migrarem para o local
da infecção (Beil e cols., 1992; Tacchini-Cottier e cols., 2000; Peters e cols., 2008) sendo capazes
de fagocitar os parasitos e destruí-los pela ação de enzimas proteolíticas estocadas em grânulos,
bem como, pela produção de espécies reativas do oxigênio (EROs) (Awasthi e cols., 2004).
Neutrófilos ainda produzem IL-8 e proteína inflamatória de macrófago tipo-1 alfa (MIP- 1α) e beta
(MIP-1β) que tem a função de recrutar mais neutrófilos e monócitos/macrófagos para o local da
infecção (Awasthi e cols., 2004). Entretanto, diferentes trabalhos mostraram que neutrófilos podem
prejudicar a eliminação do parasito, uma vez que, macrófagos não ativam os mecanismos
leishmanicidas após a fagocitose de neutrófilos infectados e apoptóticos, favorecendo assim a
sobrevivência do parasito no hospedeiro (Laskay e cols., 2003; Afonso e cols., 2008; John &
Hunter, 2008; Peters e cols., 2008; Novais e cols., 2009). Estudos de Beil e cols. (1992) e
Sunderkotter e cols. (1993) mostraram que em camundongos C57BL/6, após 3 dias de infecção por
L. major, o número de neutrófilos reduz significativamente, enquanto que, em camundongos
BALB/c, o número de neutrófilos no sítio de infecção permanece alto após 10 dias de infecção,
refletindo em inflamação crônica e demonstrando assim que a infecção pode aumentar a
sobrevivência de neutrófilos. Além disso, estudo de Allenbach e cols. (2008) mostraram, em
modelo murino C57BL/6 que, na ausência do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), ocorreu atraso
na apoptose de neutrófilos infectados por L. major, o que levaria ao aumento da sobrevida dessas
células. De maneira semelhante, estudos com neutrófilos humanos (van Zandbergen e cols., 2004) e
murinos BALB/c (Aga e cols., 2002) revelaram que a infecção, in vitro, por L. major inibe a
apoptose, via caspase, induzindo, dessa forma, maior sobrevida dos neutrófilos.
Estudo de Ribeiro-Gomes e cols. (2004) mostraram que a interação, in vitro, entre
macrófagos infectados e neutrófilos apoptóticos alteram o perfil da infecção por L. major, uma vez
que ocorreu aumento da carga parasitária em animais BALB/c. Entretanto, em animais C57BL/6 foi
observado aumento na produção de TNF-α e morte do parasito, além disso, este estudo mostrou
também que a depleção de neutrófilos, in vivo, causa aumento da carga parasitária em camundongos
C57BL/6. De maneira interessante, outro estudo de Ribeiro-Gomes e cols. (2012A) mostraram que
células dendríticas reduzem a expressão de marcadores de ativação e capacidade de apresentação do
antígeno após a fagocitose de neutrófilos apoptótico/infectados. Diferentes estudos, in vitro, e, in
vivo, têm buscado compreender o papel de neutrófilos na infecção por Leishmania (Tacchini-Cottier
e cols., 2000; Aga e cols., 2002; Ribeiro-Gomes e cols., 2004, 2007; Peters e cols., 2008, Peters &
Sacks, 2009; Charmoy e cols., 2010; Filardy e cols., 2010), entretanto, devido a grande diversidade
de espécies de hospedeiro (humano, cão, camundongo resistente ou susceptível), ou pelo tecido
fonte/local de recrutamento (sangue, peritônio, pele, medula óssea) ou tempo de recrutamento
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BATISTA, M.A.
Introdução
(horas, dias, semanas) o impacto da resposta de neutrófilos em promover resistência ou
susceptibilidade à infecção por Leishmania permanece em debate. Sendo assim, compreender a
contribuição dos neutrófilos no estabelecimento, bem como, no direcionamento da resposta imune
torna-se extremamente interessante.
1.3 – Papel de neutrófilos na infecção por Leishmania: capacidade fagocítica, produção de
mediadores leishmanicidas e desenvolvimento da resposta inflamatória
Considerando a importância das células da resposta imune inata frente à infecção por
parasitos do gênero Leishmania, vários estudos na literatura mostram o papel crítico de neutrófilos.
Charmoy e cols. (2010B) mostraram que em modelo experimental resistente, neutrófilos são
recrutados com poucas horas de infecção e diminuem sua migração após três dias de infecção.
Guimarães-Costa e cols. (2009) mostraram que neutrófilos humanos infectados, in vitro, por L.
amazonensis liberam produtos da explosão respiratória, bem como, as redes extracelulares de
neutrófilos (NETs) aumentando o tempo da Leishmania no local da infecção o que auxilia na morte
do parasito. Além disso, Jacobs e cols. (2005) mostraram que neutrófilos, in vivo, são ativados
continuamente pelo componente C3 do complemento durante a infecção por L. major,
demonstrando a cooperação entre dois componentes da resposta imune inata no auxílio da
fagocitose do parasito em animais BALB/c. De maneira interessante, o recrutamento dessas células
pode ser desencadeado por fatores liberados pelo parasito. De fato, van Zandbergen e cols. (2002)
utilizaram o ensaio de transwell, in vitro, para demonstrar que diferentes espécies de Leishmania
secretam no sobrenadante o fator quimiotático lipídico de Leishmania para atrair granulócitos
humanos, sendo essa molécula capaz de atrair neutrófilos, mas não macrófagos. Neste sentido, a
depleção de neutrófilos em camundongos C57BL/6 infectados por L. major mostrou aumento da
carga parasitária após 35 dias da infecção, entretanto, esse foi um efeito transitório e não houve
alteração no perfil de resposta Th1 e cura da lesão (Tacchini-Cottier e cols., 2000; Chen e cols.,
2005). De maneira semelhante, a depleção de neutrófilos em camundongos BALB/c infectados por
L. donovani mostrou alteração tanto no controle da carga parasitária, quanto no perfil Th1 da
resposta imune do hospedeiro (McFarlane e cols., 2008). Deste modo, fica evidente o papel de
neutrófilos na resposta imune frente à infecção por Leishmania, bem como o seu importante papel
no desenvolvimento de resposta protetora (Awasthi e cols., 2004; Peters e cols., 2008; Charmoy e
cols., 2010B; Ribeiro-Gomes e cols., 2012B).
A função clássica atribuída a neutrófilos é a capacidade de fagocitar e matar
microorganismos através da ativação dos mediadores da explosão respiratória (Scapini e cols.,
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BATISTA, M.A.
Introdução
2000; Awasthi e cols., 2004). Deane (1938) demonstrou, in vivo, que neutrófilos são capazes de
fagocitar amastigotas de L. donovani em esfregaço de medula óssea de pacientes infectados. De
maneira interessante, diferentes estudos usando parasitos marcados com fluorocromo mostraram
que a célula predominantemente infectada após poucas horas de infecção por L. major ou L.
donovani, na derme da orelha de camundongos (C57BL/6 e BALB/c), foram os neutrófilos (Peters e
cols., 2008; Thalhofer e cols., 2011; Ribeiro-Gomes e cols., 2012A). A capacidade fagocítica está
diretamente relacionada à produção de metabólitos da explosão respiratória, como as espécies
reativas de oxigênio (EROs) e óxido nítrico (NO) que são importantes mediadores leishmanicidas
(Horta e cols., 2011; Charmoy e cols., 2007). Estudo de Nathan & Shiloh (2000) mostraram que
neutrófilos e macrófagos, em resposta ao IFN-γ, juntamente com o segundo sinal gerado pelos
receptores de reconhecimento de patógenos ou TNF-α podem produzir óxido nítrico. Além disso,
Charmoy e cols. (2007) mostraram que a produção de NO por neutrófilos murinos (C57BL/6)
infectados por L. major estava relacionado ao perfil de proteção à infecção. Diferentes estudos, in
vitro, mostraram que neutrófilos humanos infectados com diferentes formas de L. donovani
induziram a morte do parasito através dos metabólitos do oxigênio gerados pela explosão
respiratória, após processo de fagocitose (Chang, 1981; Pearson & Steigbigel, 1981). Neste sentido,
diferentes estudos com Leishmania sp. mostraram que neutrófilos humanos e murinos induziram a
morte do parasito através da produção de NO (Nussler & Billiar, 1993) e EROs (Segal, 2005). De
fato, outros estudos, in vitro, mostraram que neutrófilos infectados por L. major produziram NO e
EROs em diferentes modelos experimentais como camundongos (C57BL/6 ou BALB/c), (Blos e
cols., 2003), coelhos (Mallinson e cols., 1989) e humanos (Laufs e cols., 2002).
Em virtude da rápida migração para o sítio de infecção, neutrófilos contribuem para o
início do processo inflamatório local, no qual é formado um microambiente que é essencial para o
direcionamento da resposta imune adaptativa. Poucos estudos mostram o papel dessas células pelo
fato de neutrófilos não proliferarem e apresentarem uma vida relativamente curta quando
comparada a outras populações celulares (Nathan, 2006). No entanto, esse enfoque vem sendo
mudado com trabalhos atuais que demonstram o papel de neutrófilos como componente importante
da resposta inflamatória, bem como, seu papel regulador durante infecções microbianas (Romani e
cols., 1997; Tacchini-Cottier e cols., 2000; Tateda e cols., 2001; Tsuda e cols., 2004; Easton e cols.,
2007; Charmoy e cols., 2010B; Ribeiro-Gomes e cols., 2012B).
A inflamação é um mecanismo complexo de defesa caracterizado pela migração e ativação
de leucócitos para o tecido no qual o agente infeccioso está presente. A migração de neutrófilos
para o local é um bom marcador da inflamação aguda (Ryan & Majno, 1977). Vários trabalhos vêm
estudando os mecanismos envolvidos na migração de neutrófilos para o local. Sabe-se que a
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BATISTA, M.A.
Introdução
migração dessas células está relacionada à cinética de expressão das moléculas de adesão endotelial.
A adesão de leucócitos ao endotélio é um processo com várias etapas caracterizado pela interação
inicialmente lenta mediada pelas selectinas e receptores de carboidratos que auxiliam o movimento
de rolamento. Iniciado esse rolamento, os leucócitos são ativados por agentes quimiotáticos
induzindo a ativação de β integrinas na superfície dessas células, que interagem com membros
endoteliais da superfamília das imunoglobulinas presentes no endotélio e auxiliam assim a
estabilizar a adesão entre epitélio e leucócito (Springe, 1994; Bevilacqua & Nelson, 1993).
Neutrófilos expressam grande variedade de integrinas e selectinas na sua superfície. Dentre elas é
interessante destacar o papel das integrinas CD11b e CD49d da subfamília β que apresentam papel
importante durante a migração (Coxon e cols., 1996), bem como, na infecção por L. major, como
mostrado em diferentes trabalhos (Rosenthal e cols., 1996; Sullivan e cols., 2004; Charmoy e cols.,
2007). A selectina CD62L é expressa em leucócitos, sendo a principal molécula de adesão em
neutrófilos, e comumente utilizada como marcador de ativação, uma vez que neutrófilos ativados
deixam de expressar essa molécula (Geng e cols., 1992; Berg & James, 1990; Utgaard e cols., 1998;
Smalley & Ley, 2005; Mastej & Adamiec, 2008), como mostrado em estudo, in vitro, de neutrófilos
infectados por L. major (Laufs e cols., 2002). Ainda no contexto da migração e ativação de
neutrófilos é importante comentar sobre o papel do GM-CSF na proliferação e diferenciação de
células progenitoras de neutrófilos/monócitos, bem como na modulação da ativação funcional e
maturação dessas células (Cheng e cols., 2001). Diferentes estudos mostraram que o GM-CSF é um
fator multifuncional que apresenta importante papel no desenvolvimento de neutrófilos efetores em
resposta in vivo (Fossati e cols., 1998) além de prolongar a sua sobrevivência no sítio inflamatório
(Al-Shami e cols., 1998). Neutrófilos tratados com GM-CSF aumentam a mobilização de cálcio,
bem como, produzem as quimiocinas MIP-1α, proteína quimiotática de monócitos-3 (MCP-3) e a
proteína regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) (Cheng e cols.,
2001). Além disso, Safaiyan e cols. (2011) mostraram, in vivo, que a produção de GM-CSF pode
ativar neutrófilos frente à infecção por L. major, entretanto, esses mecanismos de ativação ainda
não foram elucidados.
Durante o processo inflamatório, a produção de diferentes citocinas e outros fatores
solúveis são elementos-chave para o recrutamento de leucócitos, de forma que as quimiocinas têm
importante papel na migração de células. Quimiocinas são pequenas proteínas com quatro cisteínas
conservadas que formam duas pontes de dissulfeto. Estão agrupadas em duas diferentes famílias de
acordo com a posição das duas primeiras cisteínas, que estão adjacentes (CC), ou separadas por um
aminoácido (CXC) (Baggiolini, 1998). A maioria das quimiocinas é produzida em condições
patológicas pelas células teciduais e pelo infiltrado leucocitário (Moser & Willimann, 2004). As
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BATISTA, M.A.
Introdução
quimiocinas produzidas durante processos inflamatórios são determinantes da extensão, do tipo e da
duração do processo migratório de células para o tecido, sendo a regulação celular da expressão dos
receptores destas moléculas fator importante no processo de migração (Sallusto e cols., 2000).
Estudo de Kobayashi (2002) mostrou que neutrófilos são capazes de produzir diferentes
quimiocinas em resposta a vários estímulos, incluindo o lipopolissacarídeo (LPS), TNF-α e IFN-γ.
Cassatella e cols. (1999) demonstraram que neutrófilos liberam MIP-1α/β após diferentes estímulos
como LPS, TNF-α e produtos microbianos originados de bactérias, fungos ou protozoários. von
Stebt e cols. (2003) mostraram que neutrófilos são capazes de produzir MIP-1α/β durante o
processo inflamatório cutâneo gerado pela poliacrilaminda. Adicionalmente, Bennouna e cols.
(2003) mostraram que Toxoplasma gondii desencadeia a liberação de MIP-1α/β por neutrófilos após
a ativação pelas células dendríticas. Além disso, na infecção por L. major, foi demonstrado que
neutrófilo libera MIP-1β induzindo o recrutamento de macrófagos (van Zandbergen e cols., 2004).
Charmoy e cols. (2010A) mostraram, in vitro, que neutrófilos nos momentos iniciais da infecção
por L. major induzem o recrutamento de células dendríticas de medula pela expressão de RNAm de
MIP-1α/β e pela liberação da proteína MIP-1α no sobrenadante de cultura. Além disso, foi
observado in vivo o papel crítico de MIP-1α como importante fator quimiotático para células
dendríticas migrarem para o sítio de inoculação.
A resposta inicial do hospedeiro ao patógeno é rapidamente gerada pela resposta imune
inata que pode levar à eliminação do microorganismo. Este tipo de resposta depende de um
sofisticado arranjo de receptores de reconhecimento padrão (PRR) que reconhecem padrões
moleculares
associados
aos
patógenos
(PAMPs)
como
lipoproteínas,
lipopeptídeos,
peptidioglicanos, lipopolissacarídeos, dentre outros (Creagh & O'Neill, 2006, Meneghin &
Hogaboam, 2007). Os mais reconhecidos PRRs são os TLRs (Toll Like Receptors) (Akira, 2006,
Pasare & Medzhitov, 2005), os NLRs (Receptores NOD) (Martinon & Tschopp, 2005) e os
receptores RIG-Is (Retinoic acid-Inducible Gene-I) (Kato e cols., 2005). A expressão destes PPRs
ocorre em células do sistema imune como macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, células dendríticas,
células natural killer (NK) além de fibroblastos, células epiteliais e adipócitos (Takeda & Akira,
2004). Os receptores do tipo Toll são proteínas transmembrana capazes de reconhecer patógenos
extracelulares, direta ou indiretamente, mediando à ativação intracelular de forma específica para a
defesa do hospedeiro (Charmoy e cols., 2007). A ativação dos TLRs em uma determinada célula
pode alterar seu perfil de migração, apoptose bem como secreção de citocinas (Parker e cols.,
2005).
Parasitos do gênero Leishmania expressam em sua superfície moléculas que interagem
com células da resposta imune inata. Neste sentido, os receptores TLRs tem papel importante na
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BATISTA, M.A.
Introdução
infecção por este parasito. Diferentes trabalhos mostraram que os receptores TLR2, TLR4 e TLR9
atuam no controle da infecção por Leishmania (Kropf e cols., 2004A/B; De Veer e cols., 2003;
Charmoy e cols., 2007). O LPG presente em promastigotas de Leishmania é um dos ligantes de
TLR2 e já foi descrito como ativador de macrófagos e células NK (Beil e cols., 1992; Becker e
cols., 2003). Além disso, Kropf e cols. (2004A/B) foram os primeiros trabalhos a mostrar, em
camundongos (C57BL/6 e BALB/c), a contribuição efetiva de TLR4 no controle da carga
parasitária durante a infecção, in vivo, por L. major, uma vez que esses resultados estavam
relacionados ao menor número de parasitos e maior expressão de iNOS na lesão. Estudo de
Weinkopff e cols. (2013) demonstraram que a sinalização em células dendríticas induzida por TLR9
é importante durante a resposta inicial para o controle do desenvolvimento da lesão e da carga
parasitária, mas é dispensável para a diferenciação de células Th1 secretoras de IFN-γ em modelo
murino (C57BL/6). Além disso, mostrou que os níveis elevados dessa citocina não são suficientes
para controlar a replicação do parasito nos momentos iniciais da infecção por L. braziliensis.
No microambiente inflamatório gerado após a liberação de promastigotas metacíclicas, as
citocinas são proteínas solúveis que têm importante papel para formação deste microambiente
inflamatório, bem como, no direcionamento da resposta imune adaptativa. O conceito de que
neutrófilos são fonte de citocinas foi revisado por Cassatela (1999). Considerando a grande
diversidade de citocinas descritas (Tacchini-Cottier e cols., 2000; Ribeiro-Gomes e cols., 2004
Tsuda e cols., 2004; Charmoy e cols., 2007; Novais e cols., 2009; de Souza Carmo e cols., 2010;
Safaiyan e cols., 2011) é importante destacar as citocinas TNF-α, TGF-β, IL-10 e IL-12p40. WitkoSarsat e cols. (2000) mostraram que o TNF-α produzido por neutrófilo estimula o processo de
migração, expressão de moléculas de adesão, degranulação e produção de espécies reativas do
oxigênio, auxiliando assim a resolução da infecção. Diferentes trabalhos mostraram que
camundongos C57BL/6 deficientes em TNF-α e infectados por L. major desenvolvem lesão e não
apresentam cura (Wilhelm e cols., 2001; Chakour e cols., 2003; Ritter e cols., 2004; Allenbach e
cols., 2008). Outros estudos mostraram que a citocina TGF-β é expressa e liberada por neutrófilo
com importante papel na sobrevivência dessa célula (Grotendorst e cols., 1989; Fava e cols., 1991).
Vale mencionar que a liberação TGF-β durante a infecção por Leishmania é um dos alicerces que
suportam a teoria de que neutrófilos apoptóticos infectados por L. major silenciam a ativação dos
mecanismos leishmanicidas de macrófagos (van Zandbergen e cols., 2004; Laskay e cols., 2008).
Neutrófilos apresentam estoque intracelular de TGF-β e estímulos como n-formil-metionil-leucilfenilalanina (fMLP) e citocalasina B podem induzir a sua liberação (Bry e cols., 1994). RibeiroGomes e cols. (2004) mostraram, in vitro, que a produção de TGF-β por macrófagos de
camundongos BALB/c infectados por L. major levou ao aumento na carga parasitária. Além disso,
28
BATISTA, M.A.
Introdução
Charmoy e cols. (2007) mostraram, in vitro, a expressão do RNAm, bem como, a proteína liberada
no sobrenadante de cultura de neutrófilos infectados por L. major. Diferentes mecanismos podem
estar envolvidos no controle do processo inflamatório, sendo que a citocina IL-10 está intimamente
envolvida (Vieth e cols., 1994; Couper e cols., 2008). Vários trabalhos mostraram que a IL-10 inibe
a produção de citocinas inflamatórias como IL-12 e TNF-α em neutrófilos (Moore e cols., 2001;
Cassatela e cols., 1993) bem como, a produção das quimiocinas MIP-1α/β (Witko-Sarsat e cols.,
2000). Charmoy e cols. (2007) mostraram, in vitro, pequena expressão de RNAm, bem como,
baixos níveis de IL-10 no sobrenadante de cultura de neutrófilos de camundongos C57BL/6
infectados por L. major. Diferentes estudos mostram que a citocina IL-12 bioativa é um
heterodímero de 70 kDa, chamado de IL-12p70, que possui duas cadeias ligadas covalentemente
sendo uma de 40 kDa (IL-12p40) e outra de 35 kDa (IL-12-p35). Essa citocina tem papel crucial no
direcionamento da resposta adaptativa por polarizar a diferenciação de linfócitos TCD4+ para um
perfil Th1, além disso, apresentam papel efetor na indução da produção de IFN-γ por células NK. A
subunidade IL-12p40 é secretada na forma de monômeros ou homodímeros cerca de 5 a 90 vezes
mais que a forma biologicamente ativa IL-12p70 (Trinchieri, 2003). Além disso, a forma
homodímera da IL-12p40 apresenta papel antagônico ao IL-12, uma vez que induz resposta Th2.
Isso ocorre porque o IL-12p40 pode ser agonista da IL-12p70 se ligando competitivamente ao
receptor de IL-12, suprimindo assim a resposta contra vários antígenos, in vitro (Kato e cols., 1996;
Ling e cols., 1995) e in vivo (Heizel e cols., 1997; Hino e cols., 2004; Obata e cols., 2006).
Charmoy e cols. (2007) mostraram, in vitro, a expressão do RNAm, bem como, os níveis dessa
proteína no sobrenadante de cultura de neutrófilos infectados por L. major.
Portanto, considerando os vários estudos relacionados à biologia dos neutrófilos e seu
papel na infecção por diferentes espécies de Leishmania, fica evidente o importante papel dessas
células como componente da resposta inflamatória, entretanto, ainda não está claro os mecanismos
utilizados por neutrófilos para destruição e controle dos protozoários causadores da leishmaniose.
Dessa forma, o estudo do papel dos neutrófilos durante os eventos iniciais da infecção por
diferentes espécies de Leishmania torna-se extremamente relevante, pois contribuirá para melhor
compreensão dos mecanismos imunológicos advindos dos neutrófilos visando o melhor
entendimento e o controle da infecção.
29
BATISTA, M.A.
Justificativa
2 -JUSTIFICATIVA
BATISTA, M.A.
Justificativa
A infecção por parasitos do gênero Leishmania causa uma série de manifestações clínicas,
que podem variar dependendo da espécie do parasito e da resposta imune do hospedeiro. A resposta
inicial do hospedeiro a um patógeno é rapidamente gerada pela resposta imune inata que pode levar
à eliminação do microorganismo. Neste sentido, estudos em macrófagos se destacam devido ao
tropismo do parasito por estas células, permitindo a sobrevivência e multiplicação das formas
amastigotas desse parasito, na ausência de mecanismos leishmanicidas. No entanto, considerando a
importância e a participação de diferentes células da resposta imune inata na defesa do hospedeiro
frente à infecção por Leishmania, vale ressaltar que diversos trabalhos na literatura têm mostrado
extensivamente que os neutrófilos desempenham importante papel na morte da Leishmania, bem
como, no desenvolvimento de resposta imune adquirida efetora. Entretanto, vários estudos
mostraram que os neutrófilos podem auxiliar no estabelecimento da infecção, via inativação dos
mecanismos leishmanicidas de macrófagos, bem como pela permanência no sítio inflamatório
devido ao aumento de sua sobrevivência. Em contrapartida, diferentes estudos mostraram que essas
células podem ter papel protetor na infecção por Leishmania, uma vez que, podem matar o parasito
através de seus mediadores leishmanicidas (EROS e NO), além de auxiliarem no direcionamento da
resposta adquirida efetora pela produção de quimiocinas (IL-8 e MIP-1α/β) a fim de atrair outras
células para o local da infecção ou pela produção de citocinas como o TNF-α e IL-12 que auxiliam
no estabelecimento e direcionamento da resposta adaptativa. Ainda é importante mencionar que a
maior parte dos trabalhos aborda a infecção por L. major e, nesse sentido, é de grande relevância a
abordagem proposta nesse trabalho a fim de ampliar os conhecimentos atuais sobre o papel de
neutrófilos durante a infecção por parasitos do gênero Leishmania. Dessa forma, neste trabalho foi
avaliado o efeito da infecção por diferentes espécies de Leishmania, com graus de virulência
variáveis, sobre a resposta imune de neutrófilos. Assim, este trabalho constituiu ferramenta
importante para o entendimento do papel desta célula nos eventos iniciais da infecção por diferentes
espécies de Leishmania, a fim de, contribuir para melhor compreensão dos mecanismos
imunológicos advindos dos neutrófilos visando o melhor entendimento da infecção.
31
BATISTA, M.A.
Objetivos
3 - OBJETIVOS
BATISTA, M.A.
Objetivos
3.1 - Objetivo geral
Avaliar, in vitro, a resposta imune de neutrófilos de camundongos C57BL/6 estimulados com
diferentes espécies de Leishmania.
3.2 - Objetivos específicos
3.2.1 – Avaliar a viabilidade de neutrófilos infectados por Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major.
3.2.2 – Avaliar a capacidade fagocítica de neutrófilos na presença de Leishmania
amazonensis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major.
3.2.3 – Avaliar o perfil de expressão de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio
intracelulares em neutrófilos infectados por Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major.
3.2.4 – Avaliar a expressão de moléculas de ativação CD11b/CD49d/CD62L e
TLR2/TLR4/TLR9 em neutrófilos infectados por Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major.
3.2.5 – Avaliar os níveis do fator estimulador de colônia para macrófagos e granulócitos
(GM-CSF) e das quimiocinas MCP-1, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β e RANTES em
sobrenadante de cultura de neutrófilos infectados por Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major.
3.2.6 – Avaliar o perfil de expressão das citocinas intracelulares IL-12, TNF-α, IL-10 e
TGF-β em neutrófilos infectados por Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis
ou Leishmania major.
33
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4 - MATERIAL E MÉTODOS
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.1.1 - Caracterização dos animais
Com relação ao modelo experimental utilizado, sabe-se que a infecção utilizando formas
promastigotas de L. major, em linhagens de camundongos resistentes (C57BL/6, C3H ou CBA)
levam a formação de pequenas lesões que normalmente se curam e controle da carga parasitária.
Entretanto, linhagens de camundongos susceptíveis (BALB/c) observam-se o desenvolvimento de
lesão inflamatória e ausência no controle da carga parasitária (Sacks & Nober-Trauth, 2002; Louis e
cols., 1998). Baseado no que foi descrito até o momento foi escolhida à linhagem isogênica
C57BL/6 para a realização dos experimentos. Camundongos foram obtidos e mantidos no Centro de
Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto. Todos os experimentos aos quais os
animais foram submetidos foram aprovados pela Câmara de Experimentação Animal do Comitê de
Ética em Pesquisa, dessa mesma instituição, pelo Oficio CEP n° 005/2009, de 16 de janeiro de 2009
(documento em anexo). O fluxograma abaixo apresenta o delineamento experimental proposto, com
o número total de animais utilizado para cada objetivo específico, bem como, as principais
condições de controle dos animais.
Camundongos C57BL/6 Saudáveis*
50 animais de 8-10 semanas
25 Machos 25 Fêmeas
Padronização dos Métodos
10 animais
8M 8F
*Condições:
Temperatura ambiente 21-22 C
Umidade 50-55%
12h dia/12h noite
Ração/água ad libitum.
Controle parasitológico
Peso 20-25g
ic. = intracelular
Viabilidade Celular
4 animais
2M 2F
Fagocitose
6 animais
3M 3F
NO ic.
6 animais
3M 3F
EROs ic.
6 animais
3M 3F
Ativação celular
6 animais
3M 3F
Citocina ic.
6 animais
3M 3F
Sobrenadante
de cultura
Quimiocinas
Fluxograma 1. Delineamento experimental proposto. Apresentação das principais condições sanitárias e de
saúde animal, bem como, o número de animais utilizados para cada objetivo específico.
4.1.2 - Cultura de parasitos
Promastigotas de L. amazonensis, cepa PH8 (IFLA/BR/67/PH8), L. braziliensis, cepa
M2903 (MHOM/BR/75/M2903) e L. major, cepa Friedlin (MHOM/IL/80/Friedlin) foram
cultivadas em meio Grace (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro
35
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
fetal bovino inativado (SFB – LGC, Cotia, SP, Brasil), L-glutamina (Gibco BRL, Grand Island, NY,
EUA) 2mM e penicilina G (USB Corporation, Cleveland, OH, EUA) 100 U/mL, pH 6,5 e mantidas
em estufa à 25°C. Promastigotas de fase estacionária obtidas após cultivo de 5 dias em meio Grace
(Afonso & Scott, 1993) foram lavadas duas vezes com salina tamponada com fosfato (PBS- pH 7,2)
e centrifugadas à 1540 x g / 4°C / 10 minutos. As células foram ressuspendidas em meio de cultura
completo para células e tecidos (CTCM), constituído de DMEM (Sigma-Aldrich) suplementado
com 10% de SFB inativado, L-glutamina 2mM, penicilina G 100 U/mL, 50µM de mercaptoetanol
(Pharmacia Biotech, Uppsala, Suíça) e HEPES 25mM, pH 7,2. Para ajustar a concentração, as
promastigotas foram contadas em câmara de Neubauer, em microscópio óptico. Para os
experimentos de viabilidade, taxa de fagocitose, expressão de óxido nítrico, espécies reativas do
oxigênio e citocinas intracelulares foram utilizados 25x105 parasitos/mL, e nos experimentos de
avaliação do fenótipo celular foi utilizado 5x105 parasitos/mL.
4.1.3- Preparação dos estímulos inespecíficos zimosan e phorbol 12-myristate 13-acetate
(PMA)
O zimosan A (Sigma-Aldrich) é formado por um complexo proteína-carboidrato obtido da
parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O zimosan A induz perfil pró-inflamatório
em células da resposta imune inata (Macrae & Pryzwansky, 1984) levando a produção de citocinas
pró-inflamatórias, produção de espécies reativas do oxigênio e do nitrogênio sendo, também,
utilizado como controle positivo de fagocitose (Vasconcelos e cols., 2012; Takeuchi e cols., 2012).
Nesse sentido, o zimosan A foi utilizado como controle positivo nos experimentos de fagocitose,
expressão dos receptores de superfície, produção de citocinas intracelulares, quimiocinas, espécies
reativas do oxigênio e óxido nítrico. Inicialmente o zimosan foi preparado conforme descrito por
Nuutila & Lilius (2005), com pequenas modificações. Dessa forma, 100mg de zimosan foi diluído
em 5mL de PBS (pH 7,2) e submetido a aquecimento (90°C) por 30 minutos, sob agitação. A
suspensão foi submetida à centrifugação à 11 x g / 25°C / 2 minutos. O sobrenadante foi descartado
e o pellet foi ressuspendido em 20mL de PBS (pH 7,2). Posteriormente, a solução foi guardada no
freezer -80 °C em alíquotas de 1mL na concentração de 20mg/mL.
Para promover e facilitar o processo de fagocitose, o zimosan foi opsonizado utilizando
soro de camundongos C57BL/6 não infectados, conforme descrito por Lovrien e cols. (1989), com
pequenas modificações. Assim, 240L de zimosan (20mg/mL) foi diluído em 760L PBS (pH 7,2)
e submetido a centrifugação à 11 x g / 25°C / 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet
36
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
ressuspenso em 200L de soro autólogo fresco e 800L de PBS (pH 7,2). A solução foi incubada
por 30 minutos em banho-maria à 37°C, e agitada em intervalos de 10 minutos. Posteriormente, a
solução foi submetida novamente a centrifugação à 11 x g / 25°C / 2 minutos, o sobrenadante
descartado e o pellet ressuspendido em 1mL de PBS (pH 7,2). O volume de zimosan A opsonizado
utilizado nos experimentos foi de 30L para cada mL de cultura, na concentração de 36g/mL.
Essa concentração e volume utilizados correspondem a aproximadamente cinco partículas de
zimosan por célula. Essa estimativa foi realizada após contagem das partículas de zimosan A em
microscópio óptico.
O PMA (Sigma-Aldrich) é um éster de forbol diterpeno com características inespecíficas.
Diferentes trabalhos (de Mello e cols., 1994; Sharma e cols., 2004) mostraram o seu papel na
produção de radicais livres, como ativador da proteína quinase C ou diferenciador celular, sendo
comumente utilizado como controle positivo de ativação celular (Azuma e cols., 1993; Pan e cols.,
2011). Assim, neste trabalho, o PMA foi utilizado como estímulo inespecífico nos experimentos de
ativação celular relacionados à avaliação da expressão do receptor TLR9. Para a preparação do
PMA, o mesmo foi ressuspendido em 1mL de RPMI, na concentração de 1mg/mL. O PMA diluído
foi separado em alíquotas de 10L e estocadas no freezer -20°C. Para o experimento foi utilizado
50L para cada mL de cultura, na concentração de 50ng/mL.
4.1.4 -Purificação de neutrófilos de medula óssea de camundongos C57BL/6
A metodologia para purificação de neutrófilos de medula óssea foi realizada segundo
Tanaka e cols. (2004) modificada por Itou e cols. (2006) com pequenas modificações. Os fêmures e
tíbias de camundongos C57BL/6 foram retirados e imergidos em álcool 70°GL por 2 minutos,
seguido da imersão em PBS (pH 7,2). Posteriormente, as epífises foram cortadas e foram injetados,
pelas extremidades, 10mL de solução balanceada de sais (Hank’s) sem Ca2+ e Mg2+ (pH 7,4). A
suspensão celular obtida foi submetida à centrifugação à 400 x g / 4°C / 10 minutos. O sobrenadante
foi descartado e a suspensão celular lavada por mais duas vezes com 10mL de Hank’s, empregandose as mesmas condições de centrifugação citadas acima. As células foram ressuspendidas em 2mL
de Hank’s e aplicadas sobre o gradiente de Percoll®. O gradiente de Percoll® foi preparado
conforme descrito por Itou e cols. (2006) com pequenas alterações. Dessa forma, as células de
medula óssea foram adicionadas acima de três distintos gradientes de Percoll ® com densidade de
1.095, 1.085 e 1.070g/mL. Em tubos de 15mL de poliestireno foram adicionados 3mL de cada uma
das soluções de Percoll® preparada nas densidades descritas acima e posteriormente foi adicionado
37
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
as células de medula óssea para centrifugação à 500 x g / 4°C / 80 minutos. A fração de neutrófilos
foi obtida na interface dos gradiente 1.085 e 1.095. Os neutrófilos foram lavados em 10mL de
Hank’s, sendo submetidos à centrifugação à 400 x g / 4°C / 10 minutos, por duas vezes. As células
foram ressuspendidas em meio CTCM e ajustadas para uma concentração de 1x105 células/mL e
utilizadas nos experimentos da avaliação do fenótipo celular. Para os demais experimentos a
suspensão celular foi ajustada para uma concentração de 5x105células/mL, sendo realizada a
contagem do número total de células em microscopia óptica.
A fração de neutrófilos obtida na interface dos gradiente 1.085 e 1.095 foi submetida a
imunofenotipagem, a fim de caracterizar a população celular obtida após a centrifugação em
gradiente de Percoll®. Neste sentido, foram utilizados anticorpos monoclonais anti-Ly6G APC,
CD11b PE , F4/80 PE, CD14 FITC, CD3 PECy5 e CD19 FITC (Tabela 1). A figura 3 apresenta a
avaliação da pureza após a purificação em gradiente de Percoll®, sendo todas as análises realizadas
com as mesmas células. Dessa forma, a figura 3A representa o perfil de dispersão celular de
tamanho versus granulosidade. A figura 3B representa um gráfico de fluorescência para avaliar o
perfil gerado pela combinação de anticorpos anti-Ly6G APC/CD11b PE, a fim de determinar a
população de neutrófilos (R1). A figura 3C representa um gráfico de fluorescência para avaliar o
perfil gerado pela combinação de anticorpos anti-Ly6G APC/F4/80 PE, para determinar a
população de macrófagos (R2). A figura 3D representa um gráfico de fluorescência para avaliar o
perfil gerado pela combinação de anticorpos anti-Ly6G APC/CD14 FITC, para determinar a
população de monócitos (R4). A figura 3E representa um gráfico de fluorescência para avaliar o
perfil gerado pela combinação de anticorpos anti-CD19 FITC/CD3 PECy5, para determinar a
população de linfócitos B (R6) e linfócitos T (R7).
38
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
B
C
R1
F4/80 PE
CD11b PE
R2
R3
Granulosidade
A
Ly6G APC
Ly6G APC
D
E
R4
R5
CD3 PECy5
CD14 FITC
Tamanho
R7
R6
Ly6G APC
CD19 FITC
Figura 3. Caracterização do perfil celular após purificação de neutrófilos da medula óssea de camundongos
C57BL/6. A fração de neutrófilos foi obtida na interface dos gradiente 1.085 e 1.095 submetida a uma
imunofenotipagem utilizando os anticorpos monoclonais anti-Ly6G APC, CD11b PE, F4/80 PE, CD14 FITC, CD3
PECy5 e CD19 FITC a fim de caracterizar a população celular obtida, bem como a eficiência de purificação da
metodologia. A – Perfil de distribuição pontual em gráfico de tamanho versus granulosidade. B – Perfil de distribuição
celular em gráfico de fluorescência 4 (FL4-Ly6G/APC) versus fluorescência 2 (FL2- CD11b/PE). C – Perfil de
distribuição celular em gráfico de fluorescência 4 (FL4-Ly6G/APC) versus fluorescência 2 (FL2- F4/80/PE). D – Perfil
de distribuição celular em gráfico de fluorescência 4 (FL4-Ly6G/APC) versus fluorescência 1 (FL1- CD14/FITC). E –
Perfil de distribuição celular em gráfico de fluorescência 1 (FL1- CD19/FITC) versus fluorescência 3 (FL3CD3/PECy5). O número ao lado de cada região (R1-R7) selecionada nos gráficos indica porcentagem de células
relativa à região selecionada.
4.1.5 - Cultura de neutrófilos, in vitro, na presença de Leishmania amanzonesis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A
Para a avaliação dos marcadores de ativação, neutrófilos de camundongos C57BL/6 foram
purificados e obtidos de medula óssea, conforme descrito anteriormente. Os neutrófilos (1x105/mL)
foram cultivados na presença ou ausência de promastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis, L.
major (5x105/mL), zimosan (36g/mL) ou PMA (50ng/mL), em tubos de polipropileno. A cultura
foi mantida em meio de cultura completo para células e tecidos (CTCM), por 3 horas a 37°C / 5%
CO2. É importante salientar que para os demais experimentos realizados nesse trabalho a quantidade
39
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
de neutrófilos foi de 5x105/mL e a quantidade de parasito foi 25x105/mL, sendo mantidas as
mesmas condições de cultura descritas anteriormente. Para a realização de cada objetivo específico
proposto nesse projeto foram utilizados dois animais (n=2) para cada repetição.
4.1.6 - Marcação imunofenotípica de neutrófilos, in vitro, após cultura na presença de
Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan A
Após o tempo de cultura, como descrito acima, a suspensão celular foi submetida à
centrifugação à 400 x g / 4°C / 10 minutos. O sobrenadante foi coletado e mantido em freezer -20°C
para a dosagem de quimiocinas. A suspensão celular foi lavada em 2mL de PBS 1%BSA (pH 7,2),
empregando as mesmas condições de centrifugação anteriormente citadas. Neutrófilos foram
submetidos ao bloqueio do receptor de imunoglobulina – Fc-gama (anticorpo anti-CD16/CD32)
(Tabela 1), por 10 minutos. Posteriormente, a suspensão celular foi incubada com a combinação dos
anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo para o receptor celular de interesse anti-Ly6G
FITC ou APC e anti-CD11b FITC ou PE (Tabela 1) para determinação da população de neutrófilos.
A suspensão foi mantida a temperatura ambiente, por 30 minutos, ao abrigo da luz. Em seguida,
foram realizadas marcações específicas para cada objetivo específico deste trabalho, que serão
descritos posteriormente.
4.1.7 - Avaliação da viabilidade de neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A
Para a avaliação da viabilidade de neutrófilos infectados, in vitro, por L. amazonensis, L.
braziliensis ou L. major foram empregados dois procedimentos, como descritos a seguir. A
avaliação do processo de apoptose foi realizada posteriormente ao cultivo e marcação
imunofenotípica descrita anteriormente. Dessa forma, no momento em que os neutrófilos foram
incubados na presença dos anticorpos anti-Ly6G FITC foi também adicionado com anexina V
Alexa Fluor 647 (Tabela 1). As amostras foram incubadas por 20 minutos, a temperatura ambiente e
ao abrigo de luz. Após a incubação foi adicionado a cada tubo o corante Iodeto de Propídio (IP) na
concentração 0,5µg/mL e novamente os tubos com a suspensão celular foram incubados por 10
minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo de luz. Posteriormente, a suspensão celular foi lavada
40
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
com 2mL de PBS (pH 7,2). Em seguida, as células foram fixadas com 200L de solução fixadora –
Macs Facs Fix (MFF) (10g/L de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67g/L de cloreto de
sódio, pH 7,2-SIGMA, E.U.A.). A aquisição dos dados foi realizada e foram lidos 10.000 eventos
dentro do “gate” de neutrófilos. Além da avaliação da viabilidade celular empregando marcadores
de apoptose, ao final das 3 horas de incubação da cultura a viabilidade celular foi avaliada também
em microscópio óptico através da contagem de células que conseguem eliminar o corante azul de
Tripan do seu interior, utilizando a câmara de Neubauer.
4.1.8 - Avaliação da fagocitose de Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis,
Leishmania major ou na presença de zimosan A por neutrófilos
O ensaio da fagocitose por neutrófilos, in vitro, foi realizado utilizando-se promastigotas
após 5 dias de cultivo, como descrito anteriormente. Os parasitos foram ressuspendidos em PBS 5%
SFB, pH 7,2, e ajustados na concentração de 25x105 parasitos/mL. Posteriormente, os mesmos
foram incubados com éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE – Sigma-Aldrich) 5mM, a
37°C, por 10 minutos, ao abrigo de luz, e lavados por duas vezes, sendo que na primeira lavagem
foi utilizado PBS 10% SFB, pH 7,2, e na segunda foi utilizado PBS (pH 7,2) (Gonçalves e cols.,
2005). Adicionalmente, o zimosan A (Sigma-Aldrich) foi submetido ao mesmo protocolo de
marcação com CFSE descrito acima. A eficiência da marcação foi avaliada por citometria de fluxo,
como exemplificado na figura 4. A figura 4A representa o perfil de dispersão celular de tamanho
versus granulosidade, para determinação da região R1. A figura 4B representa a sobreposição
(overlay) das células selecionadas na região R1 em relação a intensidade de fluorescência da
marcação com CFSE, onde o histograma preenchido (cinza) representa os parasitos não marcados e
o histograma vazio representa os parasitos marcados com CFSE, com percentual de marcação de
99,9%. A figura 4 é representativa para a marcação das demais espécies de Leishmania e estímulo
inespecífico zimosan.
41
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
A
B
N de Células
Granulosidade
R1
Tamanho
CFSE
Figura 4. Marcação de Leishmania com CFSE. Promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis foram
incubadas na presença de CFSE, conforme descrito anteriormente e realizada a aquisição por citometria de fluxo para
avaliar a eficácia de marcação por CFSE. A - Perfil de distribuição celular em gráfico de tamanho versus granulosidade
para selecionar a população de L. amazonensis na janela R1 do gráfico A. B – Histograma representativo referente a
sobreposição (overlay) da população celular selecionada na janela R1 do gráfico A, onde o histograma preenchido em
cinza representa a L. amazonensis não marcada com CFSE e o histograma sem preenchimento representa a L.
amazonensis marcada com CFSE. A figura 4 é representativa para a marcação das demais espécies de Leishmania e
estímulo inespecífico zimosan.
Posteriormente à marcação com CFSE, os parasitos foram colocados em cultura com os
neutrófilos isolados da medula óssea por 3 horas a 37°C / 5% CO2. Posteriormente, a suspensão
celular foi lavada para retirar os parasitos que não foram fagocitados com 2mL de PBS (pH 7,2) e
os tubos foram submetidos à centrifugação à 400 x g / 4°C / 10 minutos. Em seguida, as células
foram fixadas com 200L de solução fixadora (MFF). A aquisição dos dados foi realizada em
citômetro de fluxo BD FACSCalibur™, utilizando o software CellQuestTM , onde foram lidos
30.000 eventos dentro do “gate” de neutrófilos, conforme descrito anteriormente. A análise dos
resultados foi feita utilizando o programa FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, EUA).
4.1.9 - Detecção da expressão de óxido nítrico por neutrófilos infectados, in vitro, com
Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan A
A detecção da produção do óxido nítrico (NO) foi realizada utilizando o diacetato de 4,5diaminofluoresceína (DAF-2DA) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) (Strijdom & Lochner, 2004)
que permite a detecção do NO intracelular por citometria de fluxo. A técnica utiliza um marcador
42
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
fluorogênico não fluorescente (4,5-diaminofluoresceína - DAF-2), que quando oxidado pelo NO
torna-se fluorescente (DAF-2T), e a medida da fluorescência obtida é proporcional a concentração
de NO intracelular (Havenga e cols., 2001; Strijdom & Lochner, 2004). A inibição da produção do
NO foi realizada através da inibição da isoforma induzida da enzima óxido nítrico sintase,
utilizando a aminoguanidina (AG) (Uchida e cols., 2007). A detecção da produção de óxido nítrico
em neutrófilos infectados, in vitro, por L. amazonensis, L. braziliensis, L. major ou na presença de
zimosan A foi realizada posteriormente ao cultivo e marcação imunofenotípica descrita
anteriormente. É importante salientar que 10L da solução de DAF-2DA 10M (concentração final
de 2M) foi adicionado após 10 minutos do início do cultivo celular. Além disso, foi adicionado a
esse desenho experimental um tubo contendo neutrófilos estimulados com zimosan no qual foi
também adicionado AG (10mM), sendo o protocolo de cultura e marcação imunofenotípica
realizado conforme descrito anteriormente. Posteriormente, os neutrófilos foram lavados com 2mL
de PBS (pH 7,2). Em seguida, as células foram fixadas com 200µL de solução fixadora (MFF). A
aquisição dos dados foi realizada em citômetro de fluxo BD FACSCalibur™, utilizando o software
CellQuestTM , onde foram lidos 30.000 eventos dentro do “gate” de neutrófilos, conforme descrito
anteriormente.
4.1.10 - Avaliação da expressão de espécies reativas do oxigênio por neutrófilos infectados, in
vitro, com Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na
presença de zimosan A
A avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) foi realizada utilizando o
Kit Image-iT™ LIVE Green Reactive Oxygen Species (Invitrogen®) que permite a detecção de
EROs intracelular por citometria de fluxo. A técnica utiliza um marcador fluorogênico não
fluorescente (5-ou-6)-carboxy-2′,7′ dichlorodihydro fluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA),
que quando quebrado por esterases intracelulares não específicas, gera a molécula carboxy-DCFH
que é susceptível a reagir com as EROs não específicas tornando-se fluorescente. A inibição da
produção de EROs foi realizada através do bloqueio da enzima NADPH oxidase. O
Diphenyleneiodonium chloride (DPI) é capaz de inibir a enzima NADPH oxidase que é a principal
produtora de espécie reativa de oxigênio intracelular (Osaki e cols., 2011). A detecção da produção
de EROs em neutrófilos infectados, in vitro, por L. amazonensis, L. braziliensis, L. major ou na
presença de zimosan A foi realizada posteriormente ao cultivo e marcação imunofenotípica descrita
anteriormente, sendo importante salientar que no mesmo momento em que neutrófilos foram
43
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
incubados na presença dos anticorpos anti-Ly6G APC/CD11b PE foi adicionado 1L do marcador
carboxy-H2DCFDA 10mM (concentração final de 20M). Além disso, foi adicionado a esse
desenho experimental um tubo contendo neutrófilos estimulados com zimosan A no qual foi
também adicionado DPI (10mM) na cultura, sendo o protocolo de cultura e marcação
imunofenotípica realizado conforme descrito anteriormente. As amostras foram incubadas por 30
minutos a temperatura ambiente e ao abrigo de luz. Posteriormente, a suspensão celular foi lavada
com 2mL de PBS (pH 7,2). Em seguida, as células foram fixadas com 200L de solução fixadora
(MFF). A aquisição dos dados foi realizada em citômetro de fluxo BD FACSCalibur™, utilizando o
software CellQuestTM , onde foram lidos 30.000 eventos dentro do “gate” de neutrófilos, conforme
descrito anteriormente.
4.1.11 - Avaliação da ativação celular em neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A
A avaliação da ativação em neutrófilos infectados, in vitro, por L. amazonensis, L.
braziliensis, L. major ou na presença de zimosan A foi realizada posteriormente ao cultivo e
marcação imunofenotípica descrita anteriormente. Dessa forma, a estratégia de marcação foi
realizada da seguinte forma: neutrófilos foram incubados na presença dos anticorpos anti-Ly6G
FITC e CD11bPE para caracterizar a população de neutrófilos e ao mesmo momento foi adicionado
o anti-TLR2 Alexa Fluor 647. Além disso, em outros tubos foram adicionados os anticorpos antiLy6G APC e CD11b FITC para caracterizar a população de neutrófilos e ao mesmo momento
foram adicionados os anticorpos anti-CD49d PE/CD62L PE/TLR4 Biotina (Tabela 1) em diferentes
tubos. As amostras foram incubadas por 30 minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Após a incubação, a suspensão celular foi lavada com 2mL de PBS (pH 7,2). No caso do anticorpo
anti-TLR4 Biotina foi necessária uma segunda incubação com o revelador da biotina, estreptavidina
(Cy5). Essas células foram incubadas e lavadas, novamente, nas mesmas condições descritas
anteriormente. Em seguida, as células foram fixadas com 200L de solução fixadora (MFF). A
aquisição dos dados foi realizada em citômetro de fluxo BD FACSCalibur™, utilizando o software
CellQuestTM , onde foram lidos 10.000 eventos dentro do “gate” de neutrófilos, conforme descrito
anteriormente.
44
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
Tabela 1. Descrição dos anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos.
Anticorpo anti
Fluorocromo
Clone
CD3 ε
PECy5
145–2C11
Linfócito T
CD19
FITC
6D5
Linfócito B
CD14
FITC
rmC5-3
Monócito
F4/80
PE
BM8
Macrófago
CD11b
FITC ou PE
M1/70
Molécula de adesão de granulócito (Integrina)
CD49d
PE
R1-2
Molécula de adesão de granulócito (Integrina)
CD62L
PE
MEL-14
Molécula de adesão de neutrófilos (selectina)
LY 6G
FITC ou APC
RB6-8C5
Neutrófilos
TLR2
Alexa Fluor 647
6C2
Neutrófilo ativado
MTS510
Neutrófilo ativado
TLR4
Biotina /
Streptoavidina Cy5
Anexina V
Alexa Fluor 647
-
Anti-CD16/CD32
-
2.4G2
Fenótipo Alvo
Fase inicial de apoptose
Bloqueio dos receptores de Fc
4.1.12 - Detecção dos níveis de quimiocinas e do fator estimulador de colônia para monócitos e
granulócitos (GM-CSF) por neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania amanzonesis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A
A avaliação das quimiocinas produzidas por neutrófilos infectados, in vitro, por L.
amazonensis, L. braziliensis, L. major ou na presença de zimosan A foi realizada posteriormente ao
cultivo, no sobrenadante de cultura, dos experimentos de expressão de EROs e marcadores de
ativação. A dosagem foi realizada utilizando microesferas fluorescentes presentes no Kit comercial
FlowCytomix Mouse Chemokine 6plex Kit (BMS821FF) – Bender MedSystems®. Esse Kit permite
a dosagem das quimiocinas MCP-1, MCP-3, MIP1-α, MIP1-β e RANTES e do fator estimulador de
colônia para monócitos e granulócitos (GM-CSF). A metodologia empregada permite a avaliação
simultânea de diversas quimiocinas ou GM-CSF no mesmo ensaio, empregando pequeno volume de
amostra. Assim, alíquotas de 10µL do padrão de quimiocinas ou de GM-CSF foram submetidas à
diluição seriada com uma solução tampão presente no Kit (“Top Standart” – 20.000pg/mL, 1:2 –
6.666pg/mL, 1:4 – 2.222pg/mL, 1:8 – 741pg/mL, 1:16 – 247pg/mL, 1:32 – 82pg/mL, 1:64 –
27pg/mL). Em seguida, a cada tubo foram adicionados 25µL do sobrenadante, juntamente com
25µL da mistura de esferas de captura, conjugadas com anticorpos monoclonais anti-MIP1-β/MCP1/GM-CSF e conjugadas com anticorpos policlonais anti-MCP-3/MIP1-α/RANTES. Ao mesmo
45
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
momento foi adicionado 50µL da mistura dos conjugados de biotina para cada esfera de captura
com subsequente incubação por 120 minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a
incubação, as esferas de captura foram lavadas por duas vezes com 1mL da solução tampão e, o
sobrenadante, cuidadosamente aspirado e descartado nos dois momentos. As esferas foram então
novamente incubadas na presença de 50µL da solução de estreptavidina, por 60 minutos, a
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após incubação, as esferas de captura foram novamente
lavadas com 1mL da solução tampão e o sobrenadante cuidadosamente aspirado e descartado. As
esferas foram ressuspendidas em 250µL da solução tampão. A aquisição de 1.800 eventos nas
regiões (R1) e (R2) foi realizada no citômetro BD FACSCanTM, para posterior análise utilizando o
software FlowCytomix Pro 2.2 indicado pelo Kit.
4.1.13 – Avaliação do perfil de expressão de citocinas intracelulares e expressão de TLR9 por
neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis ou
Leishmania major ou na presença de zimosan A
A detecção intracelular da expressão de citocinas e expressão do receptor TLR9 por
neutrófilos infectados, in vitro, com L. amazonensis, L. braziliensis, L. major ou na presença de
zimosan A foi realizada posteriormente ao cultivo e marcação imunofenotípica descrita
anteriormente. É importante mencionar que foi adicionado 1L de Brefeldina A (SIGMA 1mg/mL
concentração final de 1g/mL) em todos os tubos no mesmo momento da preparação da cultura
com intuito de assegurar a retenção das citocinas no interior da célula. Dessa forma, após a
incubação com os anticorpos anti-Ly6G FITC ou APC/CD11b FITC ou PE, as amostras foram
lavadas com 2mL de PBS Wash (W) (PBS contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica –
reagentes SIGMA). Em seguida, as amostras foram fixadas utilizando 2mL de solução de lise
comercial (BD FACSTM Lysing Solution), por 10 minutos, à temperatura ambiente. Posteriormente,
as preparações celulares foram permeabilizadas com 2mL de PBS-permeabilizante (P) (PBS
contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5% de saponina - reagentes SIGMA) por 10
minutos, a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram incubadas com os anticorpos anticitocinas (anti-IL-10 APC/IL-12 PE/TGF-PETNF-APCbem como com o anticorpo antiTLR9 Biotina por 30 minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo de luz (Tabela 2). Após a
incubação, a suspensão celular foi lavada com 2mL de PBS (pH 7,2). No caso do anticorpo antiTLR9 Biotina foi necessário uma segunda incubação com o revelador da biotina, estreptavidina
(Cy5). Essas células foram incubadas e lavadas, novamente, nas mesmas condições descritas
46
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
anteriormente. Em seguida, as células foram fixadas com 200L de solução fixadora (MFF). A
aquisição dos dados foi realizada em citômetro de fluxo BD FACSCalibur™, utilizando o software
CellQuestTM , onde foram lidos 30.000 eventos dentro do “gate” de neutrófilos, conforme descrito
anteriormente.
Tabela 2. Anticorpos monoclonais para identificação de citocinas e receptor TLR9 intracelulares.
Anticorpo anti
Fluorocromo
Clone
IL-12
PE
C17.8
TNF-α
APC
MP6XT22
TGF-β
PE
TW7-16B4
IL-10
APC
JES5-16E3
TLR9
Biotina
eB72-1665
47
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.2 - Estratégia de Análise
4.2.1 - Análise do processo de apoptose em neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan A
Para análise do percentual de neutrófilos viáveis após a cultura, in vitro, os neutrófilos
foram selecionados por suas características morfométricas e imunofenotípicas, através de gráficos
de distribuição pontual de FL1/Ly6G FITC versus granulosidade (Figura 5A). Após a seleção da
região de interesse (R1), a mesma foi analisada para verificar o processo de apoptose através da
construção de gráficos de fluorescência 4 (Anexina V Alexa Fluor 647) versus fluorescência 3
(Iodeto de propídio - IP) (Figura 5B).
B
A
IP FL3
Granulosidade
R1
Ly6G FITC
Anexina V AF647
Figura 5: Avaliação do processo de apoptose de neutrófilos infectados por Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de medula óssea foram purificados em
gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis ou
L. major na proporção de 5 parasitos por célula para análise do processo de apoptose. A - Perfil de distribuição celular
em gráficos de fluorescência 1 (Ly6G/FITC) versus granulosidade. B - Perfil de distribuição celular em gráficos de
fluorescência 4 (Anexina V /Alexa Fluor 647) versus fluorescência 3 (Iodeto de Propídio - IP) da população
selecionada na janela R1 do gráfico A. O percentual de células viáveis foi obtido a partir do quadrante 4 (Q4) do gráfico
5B. A figura 5 é representativa para a marcação dos neutrófilos frente ao estímulo com as demais espécies de
Leishmania.
48
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.2.2 - Análise da fagocitose de Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania
major ou zimosan A por neutrófilos
Para análise do percentual de neutrófilos infectados por Leishmania marcadas com CFSE,
os neutrófilos foram selecionados por suas características morfométricas e imunofenotípicas,
através de gráficos de distribuição pontual de FL4/Ly6G APC versus FL2/CD11b PE (Figura 6A).
Após a seleção da região de interesse (R1), a mesma foi analisada para verificar a capacidade
fagocítica com os parasitos marcados com CFSE através da construção de gráficos de fluorescência
1 (CFSE) versus fluorescência 4 (Ly6G APC) (Figura 6B).
A
B
CD11b PE
Ly6G APC
R1
Ly6G APC
CFSE FL1
Figura 6: Avaliação da fagocitose de Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou
zimosan por neutrófilos. Neutrófilos de medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll® e incubados por 3
horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis, L. major ou zimosan marcados com CFSE
na proporção de 5 parasitos ou partículas por célula para análise da taxa de fagocitose. A - Perfil de distribuição celular
em gráfico de fluorescência 4 (Ly6G/APC) versus fluorescência 2 (CD11b/PE). B - Perfil de distribuição celular de
fluorescência 1 (CFSE) versus fluorescência 4 (Ly6G/APC) da população selecionada na janela R1 do gráfico A. O
percentual da fagocitose foi obtido a partir do quadrante 2 (Q2) do gráfico 6B. A figura 6 é representativa para a
marcação dos neutrófilos frente ao estímulo com as demais espécies de Leishmania e estímulo inespecífico zimosan.
49
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.2.3 - Análise do perfil de expressão intracelular de espécies reativas do oxigênio e óxido
nítrico por neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania amanzonesis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A
Para análise do perfil de expressão de NO e EROs por neutrófilos infectados com
Leishmania, os neutrófilos foram selecionados por suas características morfométricas e
imunofenotípicas, através de gráficos de distribuição pontual de FL4/Ly6G APC versus
FL2/CD11b PE independentes (Figura 7A). Após a seleção da região de interesse (R1), a mesma foi
analisada para verificar a expressão de óxido nítrico intracelular através da construção de gráficos
de fluorescência 4 (Ly6G APC) versus fluorescência 1 (DAF-2T) (Figura 7B), bem como, pela
construção de fluorescência 4 (Ly6G APC) versus fluorescência 1 (EROs) para avaliar a expressão
de EROs intracelular (Figura 7C).
A
C
B
EROs FL1
DAF-2T FL1
CD11b PE
R1
Ly6G APC
Figura 7: Avaliação do perfil de expressão intracelular de óxido nítrico e espécies reativas do oxigênio por
neutrófilos infectados com Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de
zimosan. Neutrófilos de medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll ® e incubados por 3 horas a
37°C/5%CO2 com promastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis, L. major ou zimosan na proporção de 5 parasitos
ou partículas por célula para análise da expressão de NO e EROs. A - Perfil de distribuição celular em gráficos de
fluorescência 2 (CD11b/PE) versus fluorescência 4 (Ly6G/APC). B - Perfil de distribuição celular de fluorescência 4
(Ly6G/APC) versus fluorescência 1 (DAF-2T) da população selecionada na janela R1 do gráfico A. A expressão de NO
foi obtido a partir do quadrante 2 (Q2). C - Perfil de distribuição celular de fluorescência 4 (Ly6G/APC) versus
fluorescência 1 (EROs) da população selecionada na janela R1 do gráfico A. A expressão de EROs foi obtido a partir do
quadrante 2 (Q2). A figura 7 é representativa para a avaliação da expressão de NO e EROs por neutrófilos frente ao
estímulo com as demais espécies de Leishmania e estímulo inespecífico zimosan.
50
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.2.4 - Análise da ativação de neutrófilos infectados, in vitro, com Leishmania amanzonesis,
Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na presença de zimosan A
Para análise do percentual de neutrófilos ativados infectados por Leishmania, os
neutrófilos foram selecionados por suas características morfométricas e imunofenotípicas, através
de gráficos de distribuição pontual de FL1/CD11b FITC versus FL4/Ly6G APC (Figura 8A) ou
através de gráficos de distribuição pontual de FL2/CD11b PE versus FL1/Ly6G FITC (Figura 8C).
Após a seleção da região de interesse (R1 ou R2), a mesma foi analisada para verificar o perfil de
ativação através da construção de gráficos de fluorescência 2 (anti-CD49/CD62L PE ou
TLR4/TLR9 Biotina) versus fluorescência 4 (Ly6G APC) (Figura 8B) ou através da construção de
gráficos de fluorescência 4 (anti-TLR2 APC) versus fluorescência 1 (Ly6G FITC) (Figura 8D)
respectivamente.
A
B
C
R2
CD11b FITC
CD49d PE
Ly6G FITC
Ly6G FITC
Ly6G APC
Ly6G APC
R1
D
CD11b PE
TLR2 APC
Figura 8: Avaliação do perfil de ativação de neutrófilos infectados por Leishmania amanzonesis, Leishmania
braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de medula óssea foram purificados em
gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis, L.
major ou zimosan na proporção de 5 parasitos ou partículas por célula para análise do perfil de ativação celular
utilizando marcadores fenotípicos. A - Perfil de distribuição celular em gráfico de fluorescência 1 (CD11b/FITC) versus
fluorescência 4 (Ly6G/APC). B - Perfil de distribuição celular em gráficos de fluorescência 2 (CD49d/PE) versus
fluorescência 4 (Ly6G/APC) da população selecionada na janela R1 do gráfico A. C - Perfil de distribuição celular em
gráfico de fluorescência 2 (CD11b/PE) versus fluorescência 1 (Ly6G/FITC). D - Perfil de distribuição celular em
gráficos de fluorescência 4 (TLR2/APC) versus fluorescência 1 (Ly6G/FITC) da população selecionada na janela R2 do
gráfico C. O percentual do perfil de ativação celular foi obtido a partir do quadrante 2 (Q2) do gráfico 8B e 8D. A figura
8 é representativa para a avaliação do perfil de ativação dos neutrófilos frente ao estímulo com as demais espécies de
Leishmania e estímulo inespecífico zimosan.
51
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.2.5 - Análise do perfil de expressão de citocinas intracelulares por neutrófilos infectados, in
vitro, com Leishmania amanzonesis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major ou na
presença de zimosan A
Para análise do percentual de expressão de citocinas por neutrófilos infectados com
Leishmania ou na presença de zimosan, os neutrófilos foram selecionados por suas características
morfométricas e imunofenotípicas, através de gráficos de distribuição pontual de FL2/CD11b PE
versus FL1/Ly6G FITC (Figura 9A) ou através de gráficos de distribuição pontual de FL1/CD11b
FITC versus FL4/Ly6G APC (Figura 9C). Após a seleção da região de interesse (R1 ou R2), a
mesma foi analisada para verificar a expressão de citocinas intracelulares através da construção de
gráficos de fluorescência 4 (anti-TNF-α/IL-10 APC) versus fluorescência 1 (Ly6G FITC) (Figura
9B) ou através da construção de gráficos de fluorescência 2 (anti-IL-12/TGF-β PE) versus
fluorescência 4 (Ly6G APC) (Figura 9D) respectivamente.
C
D
Ly6G APC
R2
Ly6G APC
R1
B
Ly6G FITC
Ly6G FITC
A
R1
CD11b PE
TNF- APC
CD11b FITC
TGF- PE
Figura 9: Avaliação do perfil de expressão de citocinas intracelulares por neutrófilos infectados com Leishmania
amanzonesis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de medula óssea
foram purificados em gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO 2 com promastigotas de L.
amazonensis, L. braziliensis, L. major ou zimosan na proporção de 5 parasitos ou partículas por célula para análise da
expressão de citocinas. A - Perfil de distribuição celular em gráfico de fluorescência 2 (CD11b/PE) versus fluorescência
1 (Ly6G/FITC). B - Perfil de distribuição celular em gráficos de fluorescência 4 (TNF-α/APC) versus fluorescência 1
(Ly6G/FITC) da população selecionada na janela R1 do gráfico A. C - Perfil de distribuição celular em gráfico de
fluorescência 1 (CD11b/FITC) versus fluorescência 4 (Ly6G/APC). D - Perfil de distribuição celular em gráficos de
fluorescência 2 (TGF-β/PE) versus fluorescência 4 (Ly6G/APC) da população selecionada na janela R2 do gráfico C. O
percentual da produção de citocinas foi obtido a partir do quadrante 2 (Q2) do gráfico 9B e 9D. A figura 9 é
representativa para a avaliação da expressão de citocinas intracelulares por neutrófilos frente ao estímulo com as demais
espécies de Leishmania e estímulo inespecífico zimosan.
52
BATISTA, M.A.
Material e Métodos
4.3 - Análise Estatística dos Dados
O software Graph Pad Prism 5.0 (San Diego, CA) foi utilizado para as análises estatísticas
desse estudo. As análises foram feitas através do teste ANOVA one-way seguida do pós teste de
Tukey, comparando os dados de cada grupo entre si, uma vez que os dados apresentaram
distribuição normal. Os dados obtidos foram considerados estatisticamente significativos quando o
valor de p foi menor que 0,05 (p<0,05). As diferenças significativas estão identificadas pelo
símbolo “#”, quando comparado ao grupo de neutrófilos sem estímulo e pelo símbolo “*” quando
comparado ao grupo de neutrófilos na presença de zimosan (controle positivo). As demais
diferenças foram representadas por linhas conectoras entre os grupos avaliados.
53
BATISTA, M.A.
Resultados
5 - RESULTADOS
BATISTA, M.A.
Resultados
5.1 – Avaliação da viabilidade celular e fagocitose por neutrófilos infectados com Leishmania
amazonensis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major
Neutrófilos isolados da medula óssea de camundongos C57BL/6 foram cultivados na
presença de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major, para avaliação da viabilidade celular, uma
vez que neutrófilos não viáveis (apoptóticos) influenciam o perfil e o direcionamento da resposta
imune frente à infecção por Leishmania (Ribeiro-Gomes e cols., 2004; Ribeiro-Gomes e cols.,
2012A). Nesse sentido, a viabilidade dos neutrófilos na ausência ou presença de diferentes espécies
de Leishmania foi avaliada por exclusão de azul de Trypan (Figura 10A) ou pela marcação com
anexina V (AF647) juntamente com o corante iodeto de propídio (IP) (Figura 10B) que avaliam a
apoptose celular. Os resultados mostraram que após as 3 horas de cultivo celular, a viabilidade dos
neutrófilos não foi afetada, independentemente do estímulo utilizado (Figura 10A e B).
B
A
120
4.0 10 4
0
% Neutrófilo- IP-/Anexina V-
N Neutrófilos v iáveis
8.0 10 4
60
0
Figura 10: Avaliação da viabilidade celular de neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania amazonensis,
Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de medula óssea foram
purificados em gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de Leishmania na
proporção de 5 parasitos por célula e zimosan (36µg/mL). Posteriormente, foi realizada a análise da viabilidade celular
por exclusão de azul de Trypan em microscópio óptico (A) ou por marcação com anexina V e com o corante iodeto de
propídio, por citometria de fluxo (B). Os resultados representam a média e desvio padrão de dois experimentos
independentes (n=4).
Uma vez observado que os neutrófilos infectados estavam viáveis, posteriormente foi
avaliada a capacidade fagocítica dessas células após cultivo na presença de L. amazonensis, L.
braziliensis ou L. major, previamente marcadas com CFSE. Os resultados mostraram que após 3
horas de incubação, neutrófilos fagocitaram mais L. braziliensis quando comparados com a
fagocitose de L. amazonensis ou L. major (p<0,01). Além disso, a fagocitose da L. amazonensis foi
55
BATISTA, M.A.
Resultados
superior quando comparada a L. major (p<0,05). É importante comentar ainda que os neutrófilos
fagocitaram mais zimosan (controle positivo da fagocitose) quando comparados à fagocitose por
neutrófilos frente às diferentes espécies de Leishmania (Figura 11).
% Neutrófilos Leish-CFSE+
120
*
*
60
*
0
Figura 11: Capacidade fagocítica de neutrófilos infectados, in vitro, por Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de medula óssea foram purificados em
gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de Leishmania na proporção de 5
parasitos por célula e zimosan (36µg/mL) marcados com CFSE. Posteriormente foi realizada a análise da porcentagem
de células CFSE+ por citometria de fluxo. Os resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos
independentes (n=6). A diferença estatística (p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está
representada na forma de símbolo acima do grupo, onde “*”diferença em relação aos neutrófilos na presença de
zimosan; as linhas conectoras representam a diferença em relação aos grupos infectados por Leishmania.
5.2 – Perfil de expressão de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (EROS) por
neutrófilos infectados, in vitro, com promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major
Com intuito de verificar se neutrófilos possuem papel funcional/protetor na resposta imune
frente à infecção por Leishmania, foi realizada a avaliação da expressão de NO intracelular.
Diferentes trabalhos mostraram que a fagocitose induz a produção de óxido nítrico e
consequentemente a morte do parasito (Horta e cols., 2011; Charmoy e cols., 2007 Laufs e cols.,
2002; Nathan & Shiloh 2000; Nussler & Billiar, 1993). Neste sentido, neste trabalho foi avaliada a
expressão de NO intracelular, através da sonda DAF-2DA, por neutrófilos infectados, in vitro, com
diferentes espécies de Leishmania. Os resultados mostraram aumento na expressão de NO por
neutrófilos na presença de zimosan e quando infectados por L. amazonensis ou L. braziliensis em
comparação aos neutrófilos sem estímulo (p<0.05). Além disso, a análise entre as espécies mostrou
56
BATISTA, M.A.
Resultados
maior expressão de NO em neutrófilos infectados por L. braziliensis quando comparados às demais
espécies de Leishmania (p<0.05). Os resultados mostraram ainda que os neutrófilos infectados por
L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major tiveram menor produção de NO quando comparados aos
neutrófilos na presença de zimosan. Vale ressaltar que foi utilizado o controle negativo da
expressão de NO, utilizando a aminoguanidina (AG), inibidor da enzima óxido nítrico sintase
induzida e principal indutora de NO em neutrófilos. Os resultados mostraram que neutrófilos na
presença de zimosan e tratados com AG apresentaram uma redução de aproximadamente 50% na
expressão de NO quando comparados aos neutrófilos na presença de zimosan (p<0.05) (Figura 12).
% Neutrófilos DAF-2T
+
100
#*
#
50
#*
*
#*
0
Figura 12: Perfil de expressão de óxido nítrico intracelular por neutrófilos infectados, in vitro, com de
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de
medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de
Leishmania na proporção de 5 parasitos por célula e zimosan (36µg/mL). Posteriormente foi realizada a análise da
expressão de NO por citometria de fluxo. Os resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos
independentes (n=6). A diferença estatística (p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está
representada na forma de símbolo acima do grupo, onde “#” representa diferença em relação aos neutrófilos sem
estímulo; “*”diferença em relação aos neutrófilos na presença de zimosan; a linha conectora representa a diferença em
relação aos grupos infectados por Leishmania.
Outro componente relacionado ao papel funcional/protetor de neutrófilos na resposta
imune à infecção por Leishmania é a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) (Chang,
1981; Pearson & Steigbigel, 1981). Diferentes trabalhos mostram que a fagocitose induz a produção
de metabólitos da explosão respiratória pela ativação da enzima NADPH oxidase (Segal, 2005; Blos
e cols., 2003; Laufs e cols., 2002; Mallinson e cols., 1989; Pearson & Steigbigel, 1981) e que a
produção de EROs é importante para a morte desse parasito (Chang, 1981; Pearson & Steigbigel,
1981). Dessa forma, foi avaliada a expressão intracelular de EROs, através da marcação com a
57
BATISTA, M.A.
Resultados
sonda carboxy -H2DCFDA, por neutrófilos infectados com diferentes espécies de Leishmania por
citometria de fluxo. Os resultados mostraram que neutrófilos expressam EROs independente do
estímulo (zimosan ou Leishmania), quando comparados aos neutrófilos sem estímulo (p<0.05). No
entanto foi observado maior expressão de EROs por neutrófilos infectados por L. braziliensis,
quando comparados as demais espécies (p<0.05). Além disso, os resultados mostraram maior
expressão de EROs em neutrófilos estimulados por L. amazonensis quando comparados a L. major
(p<0.05). Os resultados mostraram ainda que os neutrófilos infectados por L. amazonensis ou L.
major tiveram menor expressão de EROs quando comparado aos neutrófilos na presença de
zimosan (p<0.05). É interessante comentar ainda que foi utilizado o Diphenyleneiodonium chloride
(DPI) como controle negativo da expressão de EROS, pois o DPI atua como inibidor da enzima
NADPH oxidase, principal responsável pela produção de EROs. Assim, neutrófilos estimulados por
zimosan e tratados com DPI apresentaram uma redução de aproximadamente 50% na expressão de
NO quando comparados aos neutrófilos estimulados com zimosan (p<0.05) (Figura 13).
% Neutrófilos EROs+
150
#
#
#*
75
#*
#*
0
Figura 13: Perfil de expressão de espécies reativas de oxigênio intracelular por neutrófilos infectados, in vitro,
com Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos
de medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll ® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas
na proporção de 5 parasitos por célula e zimosan (36µg/mL). Posteriormente foi realizada a análise dos níveis de EROs
por citometria de fluxo. Os resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos independentes (n=6).
A diferença estatística (p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está representada na forma de
símbolo acima do grupo, onde o “#” representa diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo; “*” representa
diferença em relação aos neutrófilos na presença de zimosan; a linha conectora representa a diferença em relação aos
grupos infectados por Leishmania.
58
BATISTA, M.A.
Resultados
5.3 – Perfil de expressão de marcadores de ativação e dos receptores do tipo Toll em
neutrófilos infectados, in vitro, por promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania
braziliensis ou Leishmania major
Diversos trabalhos têm mostrado que diferentes espécies de Leishmania são capazes de
alterar a expressão de moléculas de superfície em neutrófilos (Beil e cols., 1992; Becker e cols.,
2003; Kropf e cols., 2004; De Veer e cols., 2003; Charmoy e cols., 2007; Weinkopff e cols., 2013).
A imunofenotipagem dos neutrófilos foi realizada após 3 horas de cultivo com diferentes espécies
de Leishmania com intuito de caracterizar o perfil de ativação de neutrófilos. Os resultados
mostraram aumento da intensidade média de fluorescência de CD11b (Figura 14A) e CD49d
(Figura 14B) em neutrófilos na presença de zimosan, quando comparados aos neutrófilos sem
estímulo (p<0,05). Entretanto, não foi observada alteração na expressão dessas moléculas quando a
comparação foi realizada entre as diferentes espécies de Leishmania (Figura 14A-B).
Diferentemente, quando avaliada a intensidade média de fluorescência de CD62L foi observada
redução significativa em neutrófilos infectados independente da espécie de Leishmania (Figura
14C), quando comparadas aos neutrófilos sem estímulo (p<0,05).
59
BATISTA, M.A.
Resultados
A
B
400
300
IMF Neutrófilo CD11b +
IMF Neutrófilos CD49d +
#
#
150
200
0
0
C
IMF Neutrófilos CD62L+
300
150
#
#
#
0
Figura 14: Expressão das integrinas (CD11b/CD49d) e da selectina (CD62L) por neutrófilos infectados, in vitro,
com Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos
de medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll ® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas
de Leishmania na proporção de 5 parasitos por célula e zimosan(36µg/mL). Posteriormente foi realizada a análise do
perfil de ativação de neutrófilos através da expressão de CD11b (A), CD49d (B) e CD62L (C) por citometria de fluxo.
Os resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos independentes (n=6). A diferença estatística
(p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está representada na forma de símbolo acima do grupo,
onde “#” representa diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo.
O reconhecimento realizado pelas células da resposta imune inata tem papel crucial para a
eliminação do parasito (Akira, 2006, Pasare & Medzhitov, 2005; Parker e cols., 2005). A avaliação
dos Toll Like Receptors (TLR2, TLR4 e TLR9) foi realizada nos neutrófilos após 3 horas de cultivo
com diferentes espécies de Leishmania com intuito de verificar quais os receptores participam do
reconhecimento desse patógeno, uma vez que, Parker e cols. (2005) mostraram que a ativação dos
receptores do tipo Toll pode levar a alteração na migração, produção de citocinas e apoptose de
neutrófilos, demonstrando a importância dessa molécula na ativação celular, bem como no
direcionamento da resposta imune adaptativa. Vale salientar que a utilização do PMA como
60
BATISTA, M.A.
Resultados
estímulo inespecífico nos experimentos relacionados a expressão do receptor TLR9 foi devido a
incapacidade do zimosan ativar esse receptor (dados não mostrados). A análise da expressão de
TLR2/TLR9 mostrou aumento na expressão desses marcadores independente do estímulo utilizado
quando comparados aos neutrófilos sem estímulo (p<0,05). Além disso, a expressão de TLR4
mostrou aumento em neutrófilos infectados com L. braziliensis e na presença de zimosan quando
comparados aos neutrófilos sem estímulo (p<0,05) (Figura 15). Além disso, a análise entre as
espécies de Leishmania mostrou maior expressão de TLR2 em neutrófilos infectados por L.
braziliensis, quando comparados às demais espécies (p<0,05) (Figura 15A). De maneira
semelhante, a expressão de TLR4 foi maior em neutrófilos infectados por L. braziliensis, quando
comparados aos neutrófilos infectados por L. amazonensis (p<0,05) (Figura 15B). Os resultados
mostraram ainda que os neutrófilos infectados por L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major
tiveram menor expressão de TLR2 do que neutrófilos na presença de zimosan (p<0.05), entretanto,
apenas observamos uma menor expressão de TLR4 em neutrófilos infectados por L. amazonensis
quando comparados aos neutrófilos na presença de zimosan. Vale ressaltar que houve maior
expressão de TLR9 em neutrófilos infectados por L. amazonensis quando comparados ao estímulo
inespecífico PMA (p<0.05) (Figura 15C).
61
BATISTA, M.A.
Resultados
B
A
100
100
#
#*
50
#*
#*
% Neutrófilos TLR4 +
% Neutrófilos TLR2 +
#
0
#
*
50
0
C
% Neutrófilos TLR9
+
30
#*
#
#
15
#
0
Figura 15: Expressão dos receptores toll like (TLR2, TLR4 e TLR9) por neutrófilos infectados, in vitro, com
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major, na presença de zimosan ou Phorbol 12myristate 13-acetate. Neutrófilos de medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll ® e incubados por 3 horas
a 37°C/5%CO2 com promastigotas na proporção de 5 parasitos por célula, zimosan (36µg/mL) e o PMA (50ng/mL).
Posteriormente foi realizada a analise do perfil de ativação de neutrófilos através da expressão de TLR2 (A), TLR4 (B)
e TLR9 (C) por citometria de fluxo. Os resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos
independentes (n=6). A diferença estatística (p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está
representada na forma de símbolos acima do grupo, onde “#” indica diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo;
“*”diferença em relação aos neutrófilos na presença de zimosan; a linha conectora representa a diferença em relação aos
grupos infectados por Leishmania.
5.4 - Produção de quimiocinas por neutrófilos infectados, in vitro, com promastigotas de
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis ou Leishmania major
Durante o processo inflamatório gerado pela infecção por parasitos do gênero Leishmania,
os mediadores solúveis, em especial, as quimiocinas, são extremamente importantes no
recrutamento de diferentes células (Awasthi e cols., 2004). Dessa forma, foi avaliado se neutrófilos
infectados por diferentes espécies de Leishmania, são capazes de produzir quimiocinas, auxiliando
assim o recrutamento de células da resposta imune. Neste sentido, foi utilizado o Kit comercial
62
BATISTA, M.A.
Resultados
FlowCytomix Mouse Chemokine 6plex Kit que permite a dosagem simultânea no sobrenadante de
cultura de diversas quimiocinas (MCP-1, MCP-3, MIP1-α, MIP1-β e RANTES) e GM-CSF. Os
resultados mostraram que apenas neutrófilos estimulados por zimosan, L. amazonensis e L.
braziliensis foram capazes de produzir MIP-1-α (Figura 16A). Além disso, foi verificada redução na
produção por neutrófilos na presença de L. amazonensis e L. braziliensis quando comparado aos
neutrófilos estimulados por zimosan (p>0,05) (Figura 16A). A avaliação de MIP-1 β mostrou
aumento desta quimiocina independente do estímulo (zimosan ou Leishmania) (Figura 16B).
Adicionalmente, foi verificada maior produção de MIP-1β em neutrófilos estimulados com zimosan
e L. amazonensis quando comparado aos neutrófilos sem estímulo (p>0,05). Além disso, foi
observada redução na produção desta quimiocina independente da espécie de Leishmania quando
comparado aos neutrófilos na presença de zimosan. Vale ressaltar ainda que a análise entre as
espécies do parasito mostrou que neutrófilos estimulados por L. amazonensis produziu mais MIP-1β
quando comparado ao estímulo gerado pela L. major (Figura 16B). Por fim, é importante comentar
que não foi possível detectar as demais quimiocinas presentes neste Kit.
A
B
400
400
*
*
0
MIP-1β + (pg/mL)
MIP-1α+ (pg/mL)
800
#
200
#*
*
*
0
Figura 16: Dosagem de quimiocinas no sobrenadante de cultura de neutrófilos infectados, in vitro, por
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de
medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll® e por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas na proporção
de 5 parasitos por célula e zimosan (36µg/mL). Após a incubação, o sobrenadante foi coletado e acondicionado em
freezer -20°C para posterior dosagem pelo kit FlowCytomix Mouse Chemokine 6plex Kit para determinar os níveis das
quimiocinas por citometria de fluxo. Os resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos
independentes (n=6). A diferença estatística (p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está
representada na forma de símbolos acima do grupo, onde “#” indica diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo;
“*”diferença em relação aos neutrófilos na presença de zimosan; a linha conectora representa a diferença em relação aos
grupos infectados por Leishmania.
63
BATISTA, M.A.
Resultados
5.5 – Avaliação do perfil de expressão de citocinas intracelulares por neutrófilos infectados, in
vitro, com promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis ou Leishmania
major
Na instalação inicial do microambiente inflamatório, as citocinas têm importante papel no
direcionamento da resposta imune adaptativa (Ritter e cols., 2008; Witko-Sarsat e cols., 2000; Liew
e cols., 1990). Dessa forma, torna-se de extrema importância a avaliação da expressão de citocinas
por neutrófilos infectados com Leishmania. Neste sentido, foi avaliado o perfil de expressão
intracelular das citocinas TNF-α, IL-12p40, IL-10 e TGF-β por neutrófilos infectados com
diferentes espécies de Leishmania. Os resultados mostraram aumento na expressão de neutrófilos
TNF-α+ independente do estímulo (zimosan ou Leishmania) quando comparados aos neutrófilos
sem estímulo (p<0.05) (Figura 17A). Além disso, esse mesmo perfil de expressão de citocina foi
observado por neutrófilos IL-10+ infectados com L. amazonensis, L. braziliensis ou na presença de
zimosan quando comparados aos neutrófilos sem estímulo (p<0.05) (Figura 17B). Adicionalmente,
neutrófilos infectados com L. amazonensis ou na presença de zimosan expressam mais IL-12p40
quando comparados aos neutrófilos sem estímulo (p<0.05) (Figura 17C). Diferentemente, não foi
observada alteração na expressão de TGF-β por neutrófilos infectados com diferentes espécies de
Leishmania, quando comparados aos neutrófilos sem estímulo, no entanto, houve aumento de TGFβ em neutrófilos na presença de zimosan (p<0.05) (Figura 17D). Vale ressaltar a expressão das
diferentes citocinas por neutrófilos na presença de Leishmania foi inferior quando comparados aos
neutrófilos na presença de zimosan. Além disso, a análise entre as espécies de parasito não mostrou
nenhuma diferença (Figura 17).
64
BATISTA, M.A.
Resultados
A
B
100
#
50
#*
15
#*
#*
% Neutrófilo IL-10 +
% Neutrófilo TNF-α+
100
50
10
#*
#*
*
0
0
C
D
30
100
#
#
50
15
#*
*
*
% Neutrófilo TGF-β+
% Neutrófilo IL-12p40 +
#
15
5
*
*
*
0
0
Figura 17: Perfil de expressão de citocinas intracelulares de neutrófilos infectados, in vitro, por
Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania major ou na presença de zimosan. Neutrófilos de
medula óssea foram purificados em gradiente de Percoll® e incubados por 3 horas a 37°C/5%CO2 com promastigotas de
Leishmania na proporção de 5 parasitos por célula e zimosan (36µg/mL). Posteriormente foi realizada a análise da
expressão das citocinas intracelulares TNF-α (A), IL-10 (B), IL-12p40 (C) e TGF-β (D) por citometria de fluxo. Os
resultados representam a média e desvio padrão de três experimentos independentes (n=6). A diferença estatística
(p<0,05, ANOVA one-way seguida pelo pós-teste de Tukey) está representada na forma de símbolo acima do grupo,
onde “#” representa diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo; “*”diferença em relação aos neutrófilos na
presença de zimosan.
A fim de sumarizar os resultados encontrados nesse projeto foi montada a figura 18. As
cores representam as diferenças entre os grupos, onde a cor vermelha e azul representam diferenças
entre as espécies de Leishmania, onde o vermelho esta associado ao aumento e o azul a redução.
Além disso, a cor preta representa diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo. A direção da
seta indica aumento ou redução da molécula posterior, bem como, o quadrado verde chama a
atenção para os dados mais importantes encontrados nesse projeto.
65
BATISTA, M.A.
Resultados
Sumário dos resultados
L. amazonensis
L. braziliensis
L. major
↑ Infecção
↑ ↑ Infecção
↓ Infecção
↓ NO
↑ ↑ NO
↓ NO
↑ EROs
↑ ↑ EROs
↓ EROs
↓ TLR2 / TLR4
↑ TLR2 / TLR4
↓ TLR2 / -------
↑ TLR9 / ↓ CD62L
↑ TLR9 / ↓ CD62L
↑ TLR9 / ↓ CD62L
---------↑ MIP-1β
-------------------
---------↓ MIP-1β
↑ TNF-α
↑ IL-12p40
↑ IL-10
↑ TNF-α
---------↑ IL-10
↑ TNF-α
-------------------
BATISTA, M.A.
Discussão
Figura 18: Sumário dos resultados. Nessa figura foram compilados os resultados desse projeto. Cor vermelha
(aumento) e azul (redução) representam diferenças entre as espécies de Leishmania. A cor preta representa diferença em
relação aos neutrófilos sem estímulo. A seta indica aumento ou redução da molécula posterior. O quadrado verde chama
a atenção para os resultados mais importantes.
66
BATISTA, M.A.
Discussão
6 - DISCUSSÃO
BATISTA, M.A.
Discussão
Os efeitos da infecção por parasitos do gênero Leishmania na sobrevivência, bem como, o
perfil de ativação fenotípico/funcional de neutrófilos depende de fatores como a espécie do parasito,
estágio de desenvolvimento do mesmo, bem como, do modelo utilizado para o estudo da função
biológica dos neutrófilos (estudos in vitro, in vivo, modelo susceptível ou resistente à infecção),
como revisado por Ribeiro-Gomes & Sacks, (2012B).
Neutrófilos são células de vida curta que podem prejudicar a eliminação do parasito, uma
vez que, macrófagos não ativam os mecanismos leishmanicidas após a fagocitose de neutrófilos
apoptótico/infectados, favorecendo assim a sobrevivência do parasito no hospedeiro (Laskay e cols.,
2003; Afonso e cols., 2008; John e Hunter, 2008; Peters e cols., 2008; Novais e cols., 2009).
Ribeiro-Gomes e cols. (2004) mostraram que a interação in vitro entre macrófagos infectados e
neutrófilos apoptóticos pode alterar o destino da infecção por L. major, uma vez que em animais
suscetíveis, ocorre um aumento da carga parasitária e em animais resistentes ocorre um aumento da
produção de TNF-α e morte do parasito. Além disso, a depleção de neutrófilos in vivo leva ao
aumento na carga parasitária em camundongos C57BL/6 (Ribeiro-Gomes e cols., 2004). RibeiroGomes e cols. (2012A) mostraram, in vivo, que células dendríticas reduzem a expressão de
marcadores de ativação e capacidade de apresentação do antígeno após a fagocitose de neutrófilos
apoptótico/infectados. Vale ressaltar que os nossos resultados mostram que não houve alteração na
viabilidade celular e que neutrófilos não estão em processo apoptótico após 3 horas de cultivo,
independente da espécie do parasito (Figura 10). Aga e cols. (2002) e Zandbergen e cols. (2004)
demonstraram que a infecção por L. major leva a um aumento na sobrevivência de neutrófilos.
Além disso, Charmoy e cols. (2010) mostraram que a infecção por L. major em neutrófilos, in vitro,
leva a uma redução na expressão dos marcadores de fase inicial e tardia de apoptose, após 24 horas
de interação entre neutrófilos e L. major. Adicionalmente, Sarkar e cols. (2013) mostrou que a
neutrófilos infectados por L. major ativa a fosforilação de ERK1/2, aumenta e mantém a expressão
de fatores anti-apoptóticos (Bcl-1 e Bf1, respectivamente) e reduz a expressão de FAS indicando
que a infecção por L. major afeta as vias de apoptose utilizadas por neutrófilos, levando a um
aumento da sua sobrevivência. Considerando o exposto, os resultados do projeto mostraram que a
viabilidade dos neutrófilos não foi alterada após 3 horas de cultura, in vitro, com diferentes espécies
de Leishmania, entretanto, vale salientar que a capacidade de diferentes espécies de Leishmania
induzir apoptose em neutrófilos deve ir além dos eventos inicias da infecção com intuito de
caracterizar melhor os momentos tardios da infecção.
Neutrófilos são as primeiras células a migrarem para o local da infecção (Beil e cols.,
1992; Tacchini-Cottier e cols., 2000; Peters e cols., 2008), sendo capaz de fagocitar e destruir o
parasito (Awasthi e cols., 2004). No presente trabalho foi demonstrada a fagocitose de diferentes
68
BATISTA, M.A.
Discussão
espécies de Leishmania por neutrófilos (Figura 11). Os resultados deste estudo foram semelhantes
aos apresentados por Deane (1938), in vivo, que demonstrou através da análise de esfregaço de
medula óssea de pacientes infectados que neutrófilos são capazes de fagocitar amastigotas de L.
donovani. Além disso, diferentes estudos empregando parasitos marcados (L. major ou L.
donovani), por citometria de fluxo, mostraram que neutrófilos são as células predominantemente
infectadas após horas de infecção, na derme da orelha de camundongos (Peters e cols., 2008;
Thalhofer e cols., 2011; Ribeiro-Gomes e cols., 2012A). Nosso estudo mostrou também que
neutrófilos fagocitam diferentes espécies de Leishmania de maneira distinta, e foi observado que
neutrófilos fagocitam mais L. braziliensis quando comparado a L. amazonensis ou L. major, bem
como, mais L. amazonensis quando comparado a L. major (Figura 11). Em um estudo com células
dendríticas realizado por Colmenares e cols. (2004) mostraram que o CD209 presente em células
dendríticas seria o responsável por reconhecer as formas promastigotas e amastigotas de L. infantum
ou L. pifanoi, mas o CD209 não interagiu com formas promastigotas metacíclicas de L. major.
Além disso, a ligação entre Leishmania e a célula dendrítica, via receptor CD209, mostrou ser
independente de LPG. Vale ressaltar que esse trabalho mostrou que o receptor presente em células
dendríticas apresenta afinidade variável entre diferentes espécies de parasito, o que reflete
diretamente no estabelecimento e direcionamento da resposta imune. Considerando o exposto,
podemos sugerir que exista também em neutrófilos algum receptor semelhante ao demonstrado por
Colmenares e cols. (2004) que explicaria a distinta capacidade fagocítica de neutrófilos frente à
infecção por diferentes espécies de Leishmania. Além disso, outros fatores como características
particulares das espécies de Leishmania e estágio de desenvolvimento dos parasitos, além do
modelo experimental empregado nesse trabalho poderiam influenciar nessa distinta capacidade
fagocítica, uma vez que, existe uma escassez de estudos sobre nessa linha de pensamento.
A produção de NO e EROs está diretamente ligada a capacidade fagocítica de neutrófilos,
bem como, a sua capacidade de matar patógenos (Horta e cols., 2011; Charmoy e cols., 2007). Com
o objetivo de avaliar a resposta imune funcional de neutrófilos, neste trabalho foi realizada a análise
da expressão intracelular de NO e EROs por neutrófilos infectados por diferentes espécies de
Leishmania, após 3 horas de co-cultivo. Os resultados mostraram que neutrófilos expressam NO e
EROs independente da espécie do parasito (Figura 12 e 13, respectivamente). Além disso, foi
observado que a infecção por L. braziliensis induz maior expressão de NO e EROs quando
comparada a infecção por L. amazonensis e L. major. Vale salientar ainda que a expressão de EROs
em neutrófilos infectados por L. amazonensis foi superior ao encontrado na infecção por L. major.
Neutrófilos são classicamente conhecidos pela liberação dos produtos da explosão respiratória
induzido pela fagocitose (Chang, 1981; Pearson & Steigbigel, 1981). Apesar dos poucos estudos
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BATISTA, M.A.
Discussão
disponíveis mostrando a produção de NO e EROs por neutrófilos infectados por diferentes espécies
de Leishmania, vale destacar que estudo de Charmoy e cols. (2007) mostraram que a produção de
NO por neutrófilos inflamatórios de camundongos C57BL/6 co-cultivados com formas metacíclicas
de L. major estava relacionado a um perfil de proteção a infecção. Além disso, Rousseau e cols.
(2001) e McFarlane e cols. (2008) mostraram que neutrófilos de camundongos BALB/c induzem a
morte do parasito e auxiliam no estabelecimento de uma resposta protetora na infecção por L.
donovani ou L.infantum através da produção de NO e EROs. Neste sentido, os dados deste trabalho
mostraram que neutrófilos fagocitam mais L. braziliensis e são capazes de expressar mais NO e
EROs, quando comparados à infecção por L. amazonensis ou L. major. Dessa forma, estes
resultados permitem inferir que neutrófilos têm importante papel no controle da infecção por L.
braziliensis.
Neutrófilos são células fagocíticas profissionais que utilizam receptores do complemento
como o CR1 (CD35) e integrinas αMβ2 (Mac-1) para fagocitar microorganismos opsonizados pelo
complemento (C3b e C3bi) (Ravetch, 1997; van Egmond e cols., 2001). Além disso, Mac-1 é
composto pela combinação das moléculas CD11b/CD18, sendo rapidamente expresso na superfície
de neutrófilos após a ativação por citocinas e quimiocinas (Sengelov e cols., 1993), sendo o
principal receptor presente em neutrófilos que reconhece β-glicano, principal componente
polissacarídeo expresso na membrana de fungos e leveduras (van Bruggen e cols., 2009). Além
disso, o CD11b faz parte da molécula Mac-1 que é importante para criar a sinapse imunológica, de
forma que, a presença das integrinas tornam a fagocitose de bactérias opsonizadas mais eficiente
(van Spriel e cols., 2001). Nessa perspectiva, o nosso trabalho avaliou a expressão da integrina
CD11b em neutrófilos infectados por diferentes espécies de Leishmania, após 3 horas de co-cultivo
e não foi observada alteração na expressão dessa molécula em neutrófilos infectados por diferentes
espécies de Leishmania (Figura 14), no entanto, neutrófilos estimulados com zimosan foram
capazes de aumentar a expressão dessa molécula quando comparados aos neutrófilos sem estímulo.
Esse resultado pode ser explicado pela presença do complemento no co-cultivo com zimosan, uma
vez que o zimosan foi tratado com soro, conforme descrito na metodologia, e observamos um
aumento da expressão de CD11b nesse grupo de neutrófilos. Além disso, vale salientar que
Charmoy e cols. (2007) demonstraram que neutrófilos inflamatórios de camundongos C57BL/6 cocultivados com formas metacíclicas de L. major apresentaram maior expressão de CD11b. Dessa
forma, podemos sugerir que a expressão de CD11b por neutrófilos, é dependente de opsonização
pelo complemento ou do estágio evolutivo do parasito. Além disso, foi avaliada a expressão da
integrina CD49d em neutrófilos infectados por diferentes espécies de Leishmania, após 3 horas de
co-cultivo e não foi observada alteração na expressão dessas moléculas em neutrófilos infectados
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BATISTA, M.A.
Discussão
por Leishmania (Figura 14). Esse resultado foi semelhante ao apresentado por Charmoy e cols.
(2007) onde neutrófilos inflamatórios de camundongos C57BL/6 co-cultivados com formas
metacíclicas de L. major não alteram a expressão de CD49d. Além disso, Tsuda e cols. (2004)
mostraram, in vitro, que neutrófilos resistentes a Staphylococcus aureus não alteram a expressão de
CD49d. Neste sentido, alterações fenotípicas de moléculas de superfície como integrinas (CD11b e
CD49d) são importantes para a migração, mas também nos eventos posteriores à migração, como
para a ativação de neutrófilos no sítio inflamatório (Charmoy e cols., 2007; Charmoy e cols.,
2010B). Nesse contexto de avaliação das moléculas de superfície de neutrófilos é importante
destacar o papel da selectina CD62L que é a principal molécula de adesão em neutrófilos, e
comumente utilizada como marcador de ativação, uma vez que neutrófilos ativados deixam de
expressar essa molécula (Geng e cols., 1992; Berg & James, 1990; Utgaard e cols., 1998; Smalley e
cols., 2005; Mastej & Adamiec, 2008). Dessa forma, foi avaliada a expressão de CD62L em
neutrófilos infectados por diferentes espécies de Leishmania, após 3 horas de co-cultivo e foi
observada uma redução na expressão dessas moléculas em neutrófilos infectados pelas diferentes
espécies de Leishmania (Figura 14). Estes dados são semelhantes aos já descritos na literatura e
citados acima. Além disso, Laufs e cols. (2002) demonstraram que neutrófilos humanos infectados,
in vitro, por L. major apresentam redução na expressão de CD62L e aumento na expressão de
CD66, o que caracteriza a ativação celular de neutrófilos. Sendo assim, podemos inferir
fundamentado nos resultados apresentados nesse projeto que neutrófilos co-cultivados com
diferentes espécies de Leishmania se apresentam ativados, entretanto, não existindo perfil de
ativação distinto entre as espécies avaliadas.
Os receptores da imunidade inata são de extrema importância no reconhecimento de
patógenos, uma vez que esses reconhecimentos levam a ativação intracelular específica que auxilia
na defesa do hospedeiro (Charmoy e cols., 2007). Além da avaliação de integrina e selectinas foi
analisada a expressão dos receptores da imunidade inata do tipo Toll (TLRs) nos neutrófilos
infectados por diferentes espécies de Leishmania. Os resultados mostraram que neutrófilos
infectados por Leishmania apresentaram maior expressão de TLR2 e TLR9 quando comparado aos
neutrófilos sem estímulo, além disso, neutrófilos infectados por L. braziliensis apresentaram maior
expressão de TLR4 quando comparados aos neutrófilos sem estímulo. Além disso, foi observado
que a infecção por L. braziliensis induz maior expressão de TLR2 quando comparada a infecção por
L. amazonensis e L. major. Vale salientar ainda, que a expressão de TLR4 foi maior em L.
braziliensis quando comparada à L. amazonensis (Figura 15). Nesse sentido, Charmoy e cols.
(2007) mostraram que existe perfil distinto da expressão de toll (TLR2, TLR4, TLR7, TLR9) em
neutrófilos infectados por diferentes espécies de Leishmania e que esse diferente perfil de expressão
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BATISTA, M.A.
Discussão
pode refletir no controle da carga parasitária do hospedeiro. Além disso, Safaiyan e cols. (2011)
mostraram que neutrófilos de pacientes com leishmaniose tegumentar, com lesões não curadas,
apresentam aumento na expressão de TLR2, TLR4 e TLR9, sugerindo que estas células estão
ativadas, uma vez que esses receptores são importantes para o reconhecimento do patógeno, além
de auxiliar no direcionamento da resposta imune adaptativa e na progressão da doença. Becker e
cols. (2003) mostraram a ativação via TLR2 de células NK humanas infectadas, in vitro, por formas
promastigotas procíclica ou metacíclica de L. major. Além disso, Charmoy e cols. (2007)
mostraram que neutrófilos de camundongos C57BL/6 infectados, in vitro, também apresentam
aumento na expressão de TLR2. Estudo de Kropf e cols. (2004A/B) foram os primeiros trabalhos a
mostrar, em camundongos (C57BL/6 e BALB/c), a contribuição efetiva de TLR4 no controle da
carga parasitária durante a infecção, in vivo, por L. major, uma vez que os resultados estavam
relacionados ao menor número de parasitos e maior expressão de iNOS na lesão. Os resultados
encontrados no nosso projeto estão de acordo com o papel atribuído ao TLR2 e TLR4 que é de
reconhecimento do patógeno, sendo importante ainda salientar que esse resultado mostra mais uma
vez que os neutrófilos são ativados na presença, principalmente, de L. braziliensis, e que desta
forma, os neutrófilos poderiam ter importante papel no controle da infecção. No entanto, estudos in
vivo, são necessários para relacionar o controle da carga parasitária com o perfil de ativação dos
neutrófilos. Outro resultado interessante em nosso estudo mostrou que neutrófilos infectados, in
vitro, têm maior expressão de TLR9, quando comparado aos neutrófilos sem estímulo (Figura 15).
Esses resultados foram semelhantes aos dados apresentados por Weinkopff e cols. (2013) em
camundongos C57BL/6 onde foi demonstrado que a sinalização em células dendríticas de induzida
por TLR9 é importante no controle da resposta inicial, bem como para o controle do
desenvolvimento da lesão e da carga parasitária, mas é dispensável para a diferenciação de células
Th1 secretoras de IFN-γ. Além disso, estes autores mostraram que os níveis elevados de IFN-γ não
são suficientes para controlar a replicação do parasito nos momentos iniciais da infecção por L.
braziliensis. Os resultados encontrados no nosso estudo estão de acordo com esse papel atribuído ao
TLR9, onde neutrófilos são capazes de reconhecer diferentes espécies de Leishmania e, uma vez
ativados, poderiam auxiliar no controle da carga parasitária e consequentemente da infecção.
Neutrófilos são importantes na resposta inflamatória bem como para o controle de
infecções microbianas (Tacchini-Cottier e cols., 2000; Tsuda e cols., 2004). Vale salientar que Ryan
& Majno, (1977) descreveram que a migração de neutrófilos para o foco inflamatório é um bom
marcador da inflamação aguda. Durante o processo inflamatório, a liberação de fatores solúveis é de
grande importância no direcionamento e migração de células para o sítio de infecção. Dentre a vasta
gama de fatores liberados, as quimiocinas têm papel crucial nesse contexto. Dessa forma,
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BATISTA, M.A.
Discussão
considerando que neutrófilos são capazes de produzir quimiocinas (Kobayashi, 2002), foi realizada
a análise da produção de quimiocinas por neutrófilos infectados por diferentes espécies de
Leishmania, após 3 horas de cultivo. Os resultados encontrados mostram que após o cultivo, apenas
neutrófilos na presença de L. amazonensis e L. braziliensis produziram MIP-1α. Com relação à
MIP-1β, foi possível detectar a produção em todos os grupos avaliados, sendo que neutrófilos na
presença de L. amazonensis produziram mais dessa quimiocina quando comparado a L. major
(Figura 16). Cassatella e cols. (1999) demonstraram que neutrófilos liberam MIP-1α/β após
diferentes estímulos como LPS, TNF-α, e produtos microbianos originados de bactérias, fungos ou
protozoários. Vale destacar que o MIP-1β é um importante fator quimiotático para a migração de
monócitos (Wang e cols., 1993). Além disso, Zandbergen e cols. (2004) mostraram que neutrófilos
infectados, in vitro, por L. major produzem MIP-1β que auxiliam na migração (ensaio transwell) de
monócitos. Charmoy e cols. (2010A) mostraram, in vitro, que neutrófilos de camundongos
(C57BL/6 ou BALB/c) infectados por L. major induzem, parcialmente, o recrutamento de células
dendríticas de medula pela liberação da proteína MIP-1α no sobrenadante de cultura. Além disso,
foi observado, in vivo, o papel crítico de MIP-1α como importante fator quimiotático para células
dendríticas migrarem para o sítio de inoculação. de Moura e cols. (2010) mostraram, in vivo, que a
imunização utilizando saliva de Lutzomyia intermedia aumenta o número de neutrófilos no sítio de
infecção, além de aumentar a expressão de MIP-1α/β e TNF-α no local da infecção. Além disso, foi
observado que a infecção, in vivo, por L. braziliensis associada a saliva de L. intermedia em animais
já sensibilizados com esta saliva apresentam aumento na expressão de MIP-1α/β, TNF-α e IL-10
quando comparado aos animais infectados apenas com L. braziliensis. Esses resultados demonstram
que neutrófilos ativados produzem quimiocinas que estão envolvidos no recrutamento de monócitos
e células dendríticas para o sítio de infecção, caracterizando assim papel funcional para estas células
nos momentos iniciais da infecção por Leishmania. Assim, os resultados deste trabalho referente às
quimiocinas sugerem que neutrófilos podem contribuir no estabelecimento de resposta protetora a
infecção, sendo este um possível mecanismo que auxilia no controle da infecção local,
considerando que são as primeiras células a migrarem para o sítio de infecção.
A produção de citocinas é crucial para o estabelecimento do microambiente inflamatório,
bem como, no direcionamento da resposta imune adaptativa. Estudo de Cassatela (1999) mostrou
que neutrófilos são produtores de diferentes citocinas como TNF-α, IL-12, IL-6, IL-1 β, TGF-β.
Dessa forma, neste estudo foi avaliado se neutrófilos infectados por diferentes espécies de
Leishmania são capazes de produzir citocinas após 3 horas de cultivo. Os resultados demonstram
que neutrófilos foram capazes de produzir as citocinas TNF-α, IL-12p40, TGF-β bem como IL-10.
De maneira interessante, nossos resultados mostraram que L. amazonensis, L braziliensis ou L.
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BATISTA, M.A.
Discussão
major estimularam neutrófilos a produzirem TNF-α quando comparado aos neutrófilos sem
estímulo (Figura 17A). Esses resultados são semelhantes aos apresentados por Tsuda e cols. (2004)
que demonstram que a produção de TNF-α por neutrófilos, in vitro, está relacionada à morte do
Staphylococcus aureus. Além disso, Ritter e cols. (2004) demonstraram que a infecção, in vivo, por
L. major em animais knockout para TNF causa lesão progressiva que não se cura, além de ser fatal
para o animal. Vale ressaltar que o trabalho de Novais e cols. (2009) mostraram que neutrófilos de
animais BALB/c infectados por L. braziliensis matam o parasito através da produção de ROS e
TNF no local da infecção. De maneira interessante, o resultado desse projeto mostrou que
neutrófilos produzem TNF-α, independente da espécie de Leishmania, podendo assim induzir a
formação de um microambiente inflamatório. Neste sentido, podemos sugerir que, semelhante ao
trabalho de Novais e cols. (2009), os neutrófilos avaliados neste estudo são capazes de matar a
Leishmania através da produção de EROs e TNF-α. Além do TNF-α, diferentes estudos mostraram
que a citocina IL-12 também é de extrema importância para a formação do microambiente
inflamatório (Cassatella e cols., 1995; Trinchieri, 2003). Resultados deste trabalho mostraram que
apenas neutrófilos infectados por L. amazonensis expressam IL-12p40 quando comparados aos
neutrófilos sem estímulo (Figura 17C). Sabe-se que IL-12p40 tem papel antagônico a forma
bioativa da IL-12 (IL-12p70), já que a IL-12p40 compete pelo receptor reprimindo respostas in
vitro (Kato e cols., 1996; Ling e cols., 1995) e in vivo (Heizel e cols., 1997; Hino e cols., 2004;
Obata e cols., 2006). Vale destacar que a IL-12p40 é secretada de 5 a 90 vezes mais que a forma
bioativa (Trinchieri, 2003). Vale ressaltar que Charmoy e cols. (2010B) mostraram que neutrófilos
de animais resistentes infectados, in vitro, por L. major secretam IL-12p70, entretanto, esse
resultado não foi observado após o desafio por L. major em neutrófilos de camundongos BALB/c.
Outro trabalho de Charmoy e cols. (2007) mostraram que neutrófilos de camundongos BALB/c
quando infectados, in vitro, por L. major são fonte de IL-12p40. Considerando o exposto podemos
sugerir que L. amazonensis induz a expressão de IL-12p40 por neutrófilos sendo esse um possível
mecanismo modulador da resposta imune desencadeado pela infecção.
Citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-β são importantes para regularem o
microambiente inflamatório. Os resultados desse trabalho mostram que neutrófilos infectados por L.
amazonensis ou L braziliensis produziram IL-10 quando comparados aos neutrófilos sem estímulo
(Figura 17B). Sabe-se que a citocina IL-10 tem papel modulador da resposta imune podendo atuar
em várias células e inibir a resposta inflamatória (Vieth e cols., 1994; Couper e cols., 2008). Em
neutrófilos essa modulação pode ser via inibição de citocinas, como IL-12 e TNF-α (Moore e cols.,
2001; Cassatela e cols., 1993), bem como, das quimiocinas MIP-1α/β (Witko-Sarsat e cols., 2000).
Vale ressaltar que Charmoy e cols. (2010B) mostraram que neutrófilos de animais resistentes
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BATISTA, M.A.
Discussão
infectados, in vitro, por L. major secretam IL-10, entretanto, esse resultado não foi observado após
o desafio por L. major em neutrófilos de camundongos BALB/c. Esse resultado é interessante, já
que demonstra que neutrófilos podem apresenta papel modulador durante a infecção por parasitos
do gênero Leishmania, o que nos permite sugerir que esse perfil de resposta pode ser importante a
fim de evitar danos no hospedeiro, gerado pelo processo inflamatório local.
Os resultados da produção de TGF-β por neutrófilos mostraram que não existe diferença na
produção de TGF-β por neutrófilos infectados por diferentes espécies de Leishmania em relação aos
neutrófilos sem estímulo (Figura 17D). Sabe-se que a produção/liberação da citocina TGF-β durante
a infecção por Leishmania é um dos alicerces que suportam a teoria de que neutrófilos apoptóticos
infectados por L. major silenciam a ativação dos mecanismos leishmanicidas de macrófagos (van
Zandbergen e cols., 2004; Laskay e cols., 2008). Neutrófilos apresentam estoques intracelulares de
TGF-β que após estímulo por fMLP e citocalasina B são liberados (Bry e cols., 1994). RibeiroGomes e cols. (2004) mostraram, in vitro, que a produção de TGF-β por macrófagos de
camundongos BALB/c infectados com L. major estava associada ao aumento na carga parasitária.
Além disso, Charmoy e cols. (2007) mostraram, in vitro, a expressão de RNAm dessa citocina, bem
como, a proteína liberada no sobrenadante de cultura de neutrófilos infectados por L. major. De
maneira interessante, ao contrário do observado em relação aos neutrófilos produtores de TNF-α, os
resultados do nosso estudo trabalho mostraram que neutrófilos são capazes de produzir TGF-β,
entretanto não existe diferença em relação aos neutrófilos sem estímulo, além disso, não existe
diferença independente da espécie de Leishmania, reforçando nossa hipótese de que os neutrófilos
possuem um perfil pró-inflamatório e podem, portanto controlar a infecção. Assim, os resultados
deste trabalho no que se refere às citocinas sugerem que neutrófilos podem contribuir no controle da
infecção e, além disso, podem contribuir no estabelecimento de resposta protetora.
Em conjunto, nossos resultados contribuem para ampliar os conhecimentos a respeito da
resposta imune de neutrófilos frente à infecção por três diferentes espécies de Leishmania, sendo
esta uma abordagem importante no sentido de compararmos os efeitos causados por cada espécie
desse parasito. O papel dos neutrófilos no controle da infecção verificado através da avaliação da
capacidade fagocítica de neutrófilos, bem como pela produção de mediadores leishmanicidas (NO e
EROs) foi muito relevante na infecção por L. braziliensis. A ativação funcional de neutrófilos
infectados por L. braziliensis refletiu também em alteração fenotípica de moléculas importantes que
estão diretamente relacionadas à ativação celular, como o CD62L, TLR2, TLR4 e TLR9. Além
disso, vale ressaltar que em relação às citocinas e quimiocinas, os resultados sustentam nossa
hipótese de que neutrófilos estão contribuindo no estabelecimento de resposta protetora a infecção,
e podem, dessa forma, direcionar a resposta imune.
75
BATISTA, M.A.
Conclusão
7 – CONCLUSÃO
BATISTA, M.A.
Conclusão
Nossos dados demonstraram que neutrófilos podem ter papel importante para o controle da
infecção, bem como no direcionamento e estabelecimento de resposta protetora. Além disso, os
resultados da avaliação da capacidade fagocítica e da ativação dessas células mostraram ser espécie
dependente. Neste sentido, pode-se sugerir que L. braziliensis foi capaz de induzir a expressão de
mediadores inflamatórios, como NO e EROs, após 3 horas de cultivo, in vitro, além de apresentar
perfil de ativação mais proeminente quando comparado às demais espécies utilizadas nesse trabalho
o que indica um possível mecanismo de controle da infecção desencadeado por neutrófilos.
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BATISTA, M.A.
Perspectivas
8 – PERSPECTIVAS
BATISTA, M.A.
Perspectivas
O trabalho proposto é o início de uma linha de pesquisa que busca aprofundar os
conhecimentos sobre o papel de neutrófilos na infecção por diferentes espécies de Leishmania, uma
vez que poucos estudos abordam o papel de neutrófilos em diferentes infecções, apesar de ser uma
célula extremamente importante nos momentos iniciais do processo patológico bem como no
direcionamento da resposta imune adaptativa. Nesse sentido, para dar continuidade ao projeto,
pretende-se ainda realizar experimentos, in vivo, com as três espécies de Leishmania com intuito de
confirmar o papel dos neutrófilos. Além disso, pretende-se avaliar neutrófilos no contexto das vias
de sinalização purinérgica na infecção por diferentes espécies de Leishmania.
79
BATISTA, M.A. .
Referências Bibliográficas
9 - REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS
BATISTA, M.A.
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Anexos
10 - ANEXO
BATISTA, M.A.
Anexo
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