Perfil Molecular de Melanomas Cutâneos e de Mucosas

Anna Luiza Silva Almeida Vicente
Perfil Molecular de Melanomas Cutâneos e de Mucosas
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação da Fundação Pio XII Hospital de
Câncer de Barretos para obtenção do Título de
Mestre em Ciências da Saúde.
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Vinicius de Lima Vazquez
Barretos, SP
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570
Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
V632p
Vicente, Anna Luiza Silva Almeida.
Perfil molecular de melanomas cutâneos e de mucosas / Anna Luiza Silva
Almeida Vicente. - Barretos, SP 2016.
69 f. : il.
Orientador: Dr. Vinicius de Lima Vazquez
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital
de Câncer de Barretos, 2016.
1. Melanoma. 2. MAPK. 3. Telomerase. 4. Mutação. 5. Sequenciamento. 6.
Prognóstico. I. Autor. II. Vazquez, Vinicius de Lima. III. Título
CDD 571.6
SUPORTE À PESQUISA POR AGÊNCIA DE FOMENTO
Este trabalho recebeu apoio da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) através de Auxílio à Pesquisa – Regular (processo número 2012/4194-1).
As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de
responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão da FAPESP
“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós
Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento
do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de apresentação de Dissertações
e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordância com Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),
não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou
falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas
neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão
da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos”.
“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha
realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia
estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade
dos pesquisadores envolvidos”.
Dedico este trabalho aos meus pais e irmão, cujo
amor e gratidão superam o número de timinas,
adeninas, citosinas e guaninas existentes em toda a
Terra.
AGRADECIMENTOS
Registro neste documento o quanto sou grata e aprecio a cada um de vocês. É uma forma
simples, porém única, que eu tenho de agradecer o apoio que me deram ao longo desses
dois anos. E me senti extremamente sortuda por ter tido tantas pessoas incríveis que
caminharam ao meu lado na busca por esse sonho. A gratidão, na minha opinião, é um dos
maiores deveres do ser humano, por isso peço a quem quer que esteja lendo essa tese, que
não se importe com a extensão destes agradecimentos.
Aos pacientes com melanoma que concederam o uso de suas informações genéticas e
clínicas para o meu estudo. Foi me permitido com isso conhecer um mundo intrigante, o
qual eu acabei me interessando imensamente. Grande parte deste trabalho eu realizei com
inúmeros tubinhos contendo DNA tumoral, mas eu procurei nunca esquecer o quanto aquilo
significava sofrimento e dor para muitas famílias, para que eu pudesse sempre amadurecer e
crescer como profissional, afim de que algum dia eu contribua significativamente para que
mude o cenário de sobrevida e qualidade de vida destes pacientes.
Ao Dr. Vinicius de Lima Vazquez, meu orientador, por ter visto naquela pessoa insegura e
nervosa, um potencial que nem eu mesma via. Obrigada por ter contribuído positivamente
para essa experiência. Sou especialmente grata por ter me orientado quando preciso, mas
por ter me deixado livre o suficiente para que eu aprendesse a caminhar com as minhas
próprias pernas, o que me fez crescer enormemente como pessoa e profissional. Agradeço
por tantas vezes ter reconhecido o meu esforço, por responder meus e-mails o mais rápido
possível e por nunca ter medido esforços para me ajudar, mesmo nos feriados. Obrigada
pelas inúmeras oportunidades profissionais, por sempre ter me respeitado e por ter feito da
nossa relação a melhor possível, o que me deu ainda mais prazer e tranquilidade para
concluir este trabalho. Registro aqui a minha enorme admiração e gratidão por você.
Ao Dr. Rui Manuel Reis pela co-orientação, mesmo que tenha sido extra-oficialmente.
Obrigada por todos os ensinamentos, discussões e por ter me acolhido no seu grupo, o que
contribuiu profundamente para o meu crescimento científico. Sou especialmente grata por,
junto com o Dr. Vinicius, ter acreditado em mim e me concedido a oportunidade de
trabalhar no CPOM.
Ao Dr. Gilles Landman e a Dra. Márcia Chiquitelli, por terem feito parte da minha banca de
acompanhamento, dispensando tempo para ler a minha tese, contribuir com o meu trabalho
e me auxiliar a crescer nessa jornada.
À minha mãe, Liliana Vicente, por sempre ter segurado a minha mão, ao mesmo tempo em
que era o vento em baixo das minhas asas. Esse paradoxo é a força que me torna capaz de
conquistar tudo aquilo que eu desejo. Você faz tudo valer a pena e dá sentido para a minha
existência. Obrigada por emergir neste meu sonho ao ponto de saber o que é uma PCR! Meu
amor e gratidão por você são inexplicáveis.
Ao meu pai, Welton Vicente, por sempre apoiar meus sonhos, por acreditar em mim,
comemorar cada pequena vitória e por reconhecer meu esforço. Agradeço pelo seu amor,
dedicação e por ter me ensinado os valores que eu carrego sempre com muito orgulho no
meu coração e que procuro praticar no dia-a-dia.
Ao meu irmão, Welliton Vicente, por ser meu companheiro de vida, pela lealdade,
cumplicidade, amor e por sempre ter a palavra certa que acalma meu coração e minha alma.
Obrigada por me incentivar a ser cada vez melhor como pessoa e profissional, mas também
por aceitar meus defeitos e limitações. Sou especialmente grata por desde sempre você
andar ao meu lado tornando a minha caminhada muito mais bonita e feliz. Sua inteligência,
bondade, caráter e o modo como você enxerga a vida me inspiram. E o meu amor por você
transborda.
Agradeço especialmente ao meu avô Anagê (in memorian) por ter me concedido a
oportunidade de estudar. Avó Mirley, obrigada por todo o amor e incentivo e a minha Avó
Elmiria (in memorian) por ter construído em mim lindas memórias de infância. Ao meu avô
José (in memorian) por estar sempre comigo, me guiando e me protegendo, desde sempre e
para sempre.
À Tata e a Tia Miltes, por serem a minha referência de família. Aquela que às vezes briga,
discorda e se afasta. Mas, que sempre apoia, conforta, comemora, entende, não julga, ama
e cuida.
À Ana Lucia, João Carlos, Hugo, Rildo, Aurélia e agora a pequena Helena, por serem a minha
referência de família que você ganha da vida. Obrigada pela torcida e companheirismo
nesses longos anos de vizinhança.
À toda a minha família, que mesmo sem entender o que eu faço, me apoiou e comemorou
minhas conquistas.
Duas pessoas possuem importância ímpar nessa minha caminhada: Matias Melendez, fica
difícil agradecer por todas as vezes que você sentou comigo e me ensinou tantas coisas, que
transcenderam a genética ou a biologia molecular. Você se tornou uma inspiração pessoal e
profissional e eu jamais poderei agradecer a sua dedicação, carinho e paciência em me
ajudar. E sou ainda mais grata pela oportunidade de ter podido trabalhar com você tantas
vezes, o que me fez te admirar ainda mais e o que me permitiu crescer cientificamente.
Adriana Cruvinel, eu nunca vou conseguir te agradecer pelo cuidado que você sempre teve
comigo, por tudo que eu aprendi com você, por todas as vezes que você me ajudou, pela
confiança e por você ter acreditado tanto na minha capacidade. Me sinto abençoada por ter
tido vocês dois ao meu lado nesses dois anos. Sem dúvidas vocês foram meus alicerces nesta
jornada.
Ao André Lengert, por várias vezes ter dispensado o seu tempo para me ajudar e me ensinar.
Pelas conversas de “meia hora”, que sempre duraram horas e que aconteceram quando eu
mais precisava, que sempre me fizeram refletir e que acalmaram meus anseios. Te admiro
imensamente e devo grande parte do meu amadurecimento científico a você.
O trabalho de algumas pessoas incluía me ajudar de alguma forma. Como era trabalho, sei
que era uma obrigação, mas foi feito com tanto carinho, que me fez ser extremamente
grata: Letícia, Path e Bia (Patologia), Silvana e Brenda (Pós-graduação), Cintia (Secretária CPOM). Obrigada!
À todas as pessoas do diagnóstico molecular por terem colocado as minhas placas no
sequenciador um milhão de vezes e por terem me ajudado sempre que eu precisei: Gabi,
Flávia, André e Cris. Obrigada pela enorme paciência e disponibilidade.
Ao Gustavo Berardinelli, pela contribuição nas análises, por sempre vir falar comigo depois
das minhas apresentações, afim de contribuir com o meu crescimento e pela disposição em
me dar alíquotas de primers, sequências dos genes e protocolos. De coração, muito
obrigada!
À Camila Crovador, pela enorme ajuda sempre dispensada com muita competência e
carinho. Admiro imensamente a profissional que você é.
À Dra. Graziela Macedo, que tantas vezes reviu as minhas lâminas com tanto carinho e com
a maior paciência me ensinou muito sobre histologia.
Aos pesquisadores do CPOM Dra. Edenir Palmero, Dr. Daniel Vidal e Dr. Henrique Silveira,
por todas as conversas de corredor e discussões no Journal, que sem dúvidas foram
importantes na minha formação acadêmica.
À Fernanda Cury, pelo companheirismo, parceria, pelas palavras que sempre me confortam
e pelo apoio. Sou especialmente grata por você sempre tentar me entender, não julgando
quem eu sou ou as minhas atitudes. Sua amizade sem dúvidas foi o maior presente que o
mestrado me trouxe.
À Maraisa Costa, por ter esse jeito doce e inocente, que fez e faz eu acreditar nas pessoas.
Pelo seu jeito extrovertido e engraçado, que tantas vezes me fez rir e trouxe leveza para os
dias pesados no laboratório. Como eu gosto de dizer, o CPOM sem você seria muito menos
divertido.
Ao Renato, Viviane, Tati, Marcela e Aline, por terem me acolhido tão bem no laboratório,
pelas conversas, ensinamentos, paciência e por serem tão queridos comigo.
Ao grupo de cabeça e pescoço do HCB, do qual me sinto um pouco parte: à Lidia, por ter
parado para me ajudar quando eu precisei acelerar as análises do TERT e pelos momentos
de descontração que tornaram os dias melhores. À Carolzinha, pela disponibilidade em
sempre me ajudar. As minhas meninas, Bruna e Elisa, que com tanto companheirismo e
amizade, estiveram comigo me apoiando e tornando a rotina muito mais feliz. Obrigada pela
parceria! Vocês são muito especiais!
À Úrsula, pelo eterno companheirismo! Por ter dividido a bancada comigo e, mais do que
isso, ter dividido as angústias, problemas, alegrias, desesperos, risadas e conhecimento. Sou
grata por cada ajuda que você me deu, especialmente pelo suporte emocional e por todos
aqueles dias em que você sentou ao meu lado enquanto eu aplicava milhões de amostras
em gel e conversando comigo, fez o tempo passar mais feliz!
À Nathalia Campanella, pela amizade, por toda ajuda e conselhos. Seu foco no trabalho,
postura em algumas circunstâncias e determinação são, sem dúvidas, fontes de inspiração.
Ao Gerson, Fabiana e Andressa, as pessoas que constituem o Núcleo de Educação em Câncer
do Hospital de Câncer de Barretos (NEC), pela parceira e confiança, que me permitiram
vivenciar uma das melhores experiências da pós-graduação. Participar do concurso de
redação e ser responsável pelo estágio dos alunos dentro do laboratório instigou em mim
uma vontade inexplicável de fazer a diferença por meio da educação. E isso mudou o rumo
da minha vida, de quem eu sou e do que eu acredito. De coração, muito obrigada!
À Dra. Simone Acrani, pelos conselhos durante a graduação, que me fizeram amadurecer e
que me permitiram pensar mais longe. E à Dra. Mariangela Torreglosa Ruiz Cintra, por ter
me concedido a primeira oportunidade de trabalhar em um laboratório de genética, por ter
sido tão rígida e exigente, que me tornou uma pessoa capaz de conseguir a oportunidade
que me fez chegar até a conclusão deste trabalho.
Aos meus amigos de longa data, que já passaram comigo tantas etapas, obrigada pelos
momentos de alegria que me renovaram e obrigada por terem comemorado cada conquista
minha, como se de vocês fosse: Gean, Kubo, Kell, Bruno e Talita. A amizade de vocês é um
tesouro que eu tenho na vida.
Por fim, agradeço ao Felipe Barco, por ter feito parte da minha vida e por ter me
proporcionado conhecer o amor, sentimento que achei que passaria pela vida sem sentir.
Você entrou em minha vida, abriu os meus olhos e despertou o que de melhor havia em
mim. Você encheu de vida meu coração. Agradeço por, tantas vezes, ter sido o motivo pelo
qual eu não desisti de acreditar e de fazer inúmeras coisas em minha vida. Nessa caminhada,
sempre fiz meu trabalho com cuidado e responsabilidade, porque nunca esqueci destas suas
palavras no primeiro dia que entrei no Hospital. E elas foram decisivas para eu ter crescido e
amadurecido tanto até aqui.
“Se hoje eu consigo enxergar mais longe, é porque
me apoiei no ombro de gigantes”
Isaac Newton
SUMÁRIO
1.
Introdução....................................................................................................................................... 1
1.1. Transformação Maligna dos Melanócitos ............................................................................... 3
1.2. Epidemiologia do Melanoma ................................................................................................... 5
1.3. Fatores de Risco para Melanoma ............................................................................................ 8
1.4. Prevenção do Melanoma ....................................................................................................... 10
1.5. Subtipos Histopatológicos do Melanoma .............................................................................. 11
1.6. Diagnóstico, Estadiamento, Prognóstico e Tratamento do Melanoma ................................ 15
1.7. Alterações Moleculares e Terapia Alvo em Melanoma ......................................................... 22
1.7.1.
BRAF .............................................................................................................................. 23
1.7.2.
NRAS .............................................................................................................................. 25
1.7.3.
KIT .................................................................................................................................. 26
1.7.4.
PDGFRA ......................................................................................................................... 27
1.7.5.
TERT ............................................................................................................................... 28
1.8. Justificativa ............................................................................................................................ 29
1.9. Objetivo Geral ........................................................................................................................ 29
1.10. Objetivos Específicos .............................................................................................................. 30
1.11. Casuística e Métodos ............................................................................................................. 30
1.11.1. Delineamento e População de Estudo .......................................................................... 30
1.11.2. Critérios de Inclusão e Exclusão .................................................................................... 30
2. Métodos ........................................................................................................................................ 30
2.1. Extração de DNA .................................................................................................................... 30
2.2. Análise Mutacional dos Genes Alvos ..................................................................................... 31
2.3. Associação dos Dados Moleculares com os Fatores Demográficos, Clínicos e
Histopatológicos dos Pacientes ......................................................................................................... 33
2.4. Análise Estatística .................................................................................................................. 34
2.5. Questões Éticas ...................................................................................................................... 34
3. Resultados..................................................................................................................................... 34
4. Discussão....................................................................................................................................... 49
4.1. Caracterização demográfica, clínica e histopatológica dos pacientes e amostras ............... 49
4.2. Características moleculares e suas associações com as demais variáveis estudadas e a
sobrevida ........................................................................................................................................... 51
5. Conclusão ...................................................................................................................................... 56
7. Anexos........................................................................................................................................... 67
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - ESTRUTURA DO TECIDO EPITELIAL ..................................................................................................................... 1
FIGURA 2 - MODELO DE PROGRESSÃO DO MELANOMA......................................................................................................... 4
FIGURA 3 - ESTIMATIVAS MUNDIAIS DE INCIDÊNCIA E PREVALÊNCIA DE MELANOMA ................................................................... 5
FIGURA 4 - 20 PAÍSES COM MAIOR ESTIMATIVAS DE INCIDÊNCIA E PREVALÊNCIA DE MELANOMA .................................................. 6
FIGURA 5 - ESTIMATIVA DE INCIDÊNCIA E MORTALIDADE DE MELANOMA NOS PAÍSES EUROPEUS................................................... 7
FIGURA 6 - MELANOMA EXTENSIVO SUPERFICIAL. ............................................................................................................ 14
FIGURA 7 - MELANOMA LENTIGO MALIGNO. ................................................................................................................... 14
FIGURA 8 - MELANOMA NODULAR. ............................................................................................................................... 14
FIGURA 9 - MELANOMA LENTIGINOSO ACRAL. ................................................................................................................. 14
FIGURA 10 - RELAÇÃO ENTRE NÍVEIS DE CLARK E DE BRESLOW ............................................................................................ 17
FIGURA 11 - VIA DE SINALIZAÇÃO MAP QUINASE ............................................................................................................. 23
FIGURA 12 - EXEMPLOS DAS MUTAÇÕES ENCONTRADAS EM NOSSA CASUÍSTICA. ..................................................................... 37
FIGURA 13 - PADRÃO DE MUTAÇÃO NOS PACIENTES DURANTE A EVOLUÇÃO TUMORAL............................................................. 41
FIGURA 14 -DISTRIBUIÇÃO DAS MUTAÇÕES NOS PACIENTES COM MELANOMA INCLUÍDOS NO ESTUDO. ........................................ 42
FIGURA 15 - SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA DE 459 PACIENTES COM MELANOMA. ................................................................... 45
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - ESTADIAMENTO DO TUMOR PRIMÁRIO, SEGUNDO A AJCC – 2009. ......................................... 18
TABELA 2 - ESTADIAMENTO DA METÁSTASE À DISTÂNCIA, SEGUNDO A AJCC – 2009. ................................. 19
TABELA 3 - ESTADIAMENTO DA METÁSTASE LINFONODAL, SEGUNDO A AJCC – 2009. ................................ 19
TABELA 4 - ESTADIAMENTO DO MELANOMA SEGUNDO AJCC- 2009. ..................................................... 20
TABELA 5 - VIAS DE SINALIZAÇÃO ALTERADAS EM MELANOMA E SUAS RESPECTIVAS ALTERAÇÕES. ................... 22
TABELA 6 - INFORMAÇÕES DA PCR PARA OS GENES ALVOS. .................................................................... 33
TABELA 7 - CARACTERÍSTICAS
PORTADORES DE MELANOMA
TABELA 8 - PERFIL
DEMOGRÁFICAS, CLÍNICAS E HISTOPATOLÓGICAS PATOLÓGICAS DOS
459
DO HOSPITAL DE CÂNCER DE BARRETOS. ............................................. 36
HCB DE ACORDO COM O
DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA. ............................................................................................... 37
MOLECULAR DOS PORTADORES DE MELANOMA DO
TABELA 9 - TIPOS DE MUTAÇÕES ENCONTRADAS NOS 459 PACIENTES DO HCB DE ACORDO COM OS GENES
ALVOS. ................................................................................................................................. 38
TABELA 10 - DISTRIBUIÇÃO DOS SÍTIOS ANALISADOS NOS PACIENTES INCLUÍDOS NO ESTUDO. ........................ 41
TABELA 11 - ASSOCIAÇÃO
459 PACIENTES DO HCB INCLUÍDOS NO
ESTUDO E AS MUTAÇÕES NOS GENES ALVOS. ................................................................................ 43
ENTRE OS DADOS DEMOGRÁFICOS DOS
TABELA 12 - ASSOCIAÇÃO ENTRE OS DADOS CLÍNICOS DOS 459 PACIENTES DO HCB INCLUÍDOS NO ESTUDO E AS
MUTAÇÕES NOS GENES ALVOS. .................................................................................................. 44
TABELA 13 - SOBREVIDA
459 PACIENTES DO HCB DE ACORDO COM O STATUS
MUTACIONAL DOS GENES ALVOS. ............................................................................................... 46
ESPECÍFICA POR CÂNCER DOS
TABELA 14 - SOBREVIDA ESPECÍFICA
POR CÂNCER DOS
TABELA 15 - SOBREVIDA ESPECÍFICA
POR CÂNCER DOS
459
PACIENTES DO
HCB DE ACORDO COM O STATUS
MUTACIONAL DOS GENES ALVOS E CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS. ............................................... 46
459
PACIENTES DO
HCB DE ACORDO COM O STATUS
MUTACIONAL DOS GENES ALVOS E CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS. ......................................................... 47
TABELA 16 - ANÁLISE MULTIVARIADA DE SOBREVIDA ESPECÍFICA POR MELANOMA DOS 459 PACIENTES DO HCB.
........................................................................................................................................... 48
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO ÉXON 15 DO GENE BRAF. .......................... 38
GRÁFICO 2 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO GENE NRAS. ........................................... 19
GRÁFICO 3 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NA REGIÃO PROMOTORA DO GENE TERT.. ......... 38
GRÁFICO 4 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO GENE KIT. .............................................. 38
GRÁFICO 5 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO GENE PDGFRA........................................22
LISTA DE ABREVIATURAS
BRAF – v-raf murina sarcoma viral oncogene homolog B
TERT – Telomerase reverse transcriptase
NRAS – Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog
CDKN2A – Cyclin-dependent Kinase inhibitor 2A
PTEN – Phosphatase and tensin homolog
MTAP – Methylthiodenosine phosphorylase
PLA2G6 – Phospholipase A2 goup VI
IRF4 – Interferon regulator factor 4
MC1R – Melanocortin 1 receptor
cMAP – amp cíclico
ANVISA – Agência nacional de vigilância sanitária
DHL – Desidrogenase lática
AJCC – American Joint Committee on Cancer
DNA – Ácido desoxirribonucleico
RNA – Ácido ribonucleico
TCGA – The cancer genome atlas network
PDGFRA - Platelet derived growth factor receptor alpha
WT – Wild type
HCB – Hospital de Câncer de Barretos
PCR – Reação em cadeia da polimerase
LISTA DE SÍMBOLOS
≤
menor ou igual
≥
maior ou igual
%
porcentagem
<
menor
>
maior
x
vezes
µL
microlitros
µg
microgramas
˚C
graus Celsius
nM
nanomolar
mM
milimolar
µM
micromolar
U
unidades
cm
centímetros
RPM
rotações por minuto
G
gravidade
mL
mililitro
M
molar
ng
nanograma
bp
base pair
V
volts
p
valor de p
mm
milímetros
mm2
milímetros quadrados
RESUMO
Vicente, ALSA. Perfil Molecular de Melanomas Cutâneos e de Mucosas. Dissertação
(mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2016.
O melanoma é a forma mais agressiva de câncer de pele e surge a partir de células normais
de pigmento, os melanócitos, localizadas na membrana basal de superfícies epiteliais.
Pesquisas indicam que há um crescimento da incidência de melanoma nos últimos anos. O
aumento do conhecimento da heterogeneidade da doença e do surgimento de terapias-alvo
com sucesso em ensaios clínicos e aprovados como tratamento para melanoma em todo
mundo, tornou necessário caracterizar o perfil molecular do melanoma na população
brasileira, para nortear pesquisas futuras e melhorar o tratamento dos pacientes. Diante
disso, 459 pacientes com melanoma diagnosticados no Hospital de Câncer de Barretos foram
incluídos no estudo e sequenciados pelo método de Sanger para os hotspots dos genes alvos
BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA. Além disso, os achados moleculares foram associados com
dados demográficos, clínicos e histopatológicos. Em nossa casuística, houve a predominância
do subtipo nodular (38,9%) e disseminativo superficial (34,4%), sendo os membros a
localização tumoral mais frequente (50,0%). Os fatores ulceração, nível de Clark, índice
mitótico, Breslow e estádio TNM em nossa casuística foram associados ao prognóstico. As
frequências de mutações para BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA foram, respectivamente,
34,1%, 7,9%, 34,3%, 6,2% e 2,9%, sendo que os tipos de alterações ou localizações mais
frequentes para cada gene foram V600E, Q61, C250T, éxon 11 e éxon 12, respectivamente.
Mutações em BRAF foram associadas a pacientes mais novos (p= 0,014), assim como para
mutações em TERT (p= 0,006) e mutações em PDGFRA a pacientes com cor da pele negra (p=
0,023). Além disso, mutações em BRAF e TERT estão associadas a diferentes localizações
anatômicas, principalmente a região do tronco (p= 0,0001, para ambos) e ao subtipo
tumoral disseminativo superficial e nodular, respectivamente (p= 0,0001, para ambos).
Ainda, mutações em TERT estão associadas a ausência de ulceração (p= 0,037) e valor de
DHL menor ou igual 400 U/L. O status mutacional dos genes alvos não foi associado a
sobrevida dos pacientes. De forma geral, os pacientes possuem perfil molecular similar ao
que se observa em outras populações e acreditamos que pacientes brasileiros podem se
beneficiar das terapias-alvo já existentes e emergentes direcionadas a estas alterações mais
frequentes.
Palavras-chave: Melanoma, MAPK, Telomerase, Mutação, Sequenciamento e Prognóstico.
ABSTRACT
Vicente, ALSA. Molecular Profiling of Cutaneous and Mucosal Melanomas. Dissertation
(Master´s Degree). Barretos: Barretos Cancer Hospital; 2016.
Melanoma is the most aggressive form of skin cancer and it is originate from the
melanocytes located in the basement membrane of epithelial surfaces and recent studies
demonstrated its increasing incidence in the last years around the globe. The knowledge of
heterogeneity and multiple specific molecular profile of the disease and development of
successful target therapies, raise the question of the characterization of the molecular
profile of melanoma in the Brazilian population. Thus, 459 patients diagnosed with
melanoma in the Barretos Cancer Hospital were tested for specific molecular alterations by
Sanger direct sequencing method of the hotspot region of BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA.
Beyond that, the molecular findings were correlated with demographic, clinical and
histopathological data. We found predominance of the nodular subtype (38.9%) and
superficial spreading melanoma (34.4%), and the limbs were the most frequent tumor
location (50.0%) The factors such as ulceration, Clark level, mitotic index, Breslow and TNM
stage were related to the prognosis. . The frequencies of mutations for BRAF, NRAS, TERT,
KIT e PDGFRA were respectively, 34.1%, 7.9%, 34.3%, 6.2% and 2.9%. The most frequent
types of changes or locations for each gene were V600E, Q61, C250T, éxon 11 e éxon 12,
respectively. BRAF mutations were associated with younger patients (p = 0.014) as well as
mutations in TERT (p = 0.006) and PDGFRA mutations in patients with black skin (p= 0.023).
Furthermore, mutations in BRAF and TERT were associated with different anatomical
locations, particularly the trunk (p= 0.0001, for both) and superficial spreading and nodular
subtype respectively (p= 0.0001, for both). TERT promoter mutations were associated with
absence of ulceration (p= 0.037) and less than or equal LDH levels of 400 U/L. The
mutational status of target genes was not associated with survival. In general, patients have
similar molecular profiling to that observed in other populations. Brazilian patients can
benefit from targeted therapies already used and emerging ones directed to these more
frequent alterations.
Key words: Melanoma, MAPK, Telomerase, Mutation, Sequencing and Prognostic.
1
1. Introdução
A pele é o maior órgão do corpo humano, sendo composta por diversos tecidos, tipos
celulares e estruturas especializadas, tornando-se assim um órgão extremamente complexo
(Figura 1). Ela é constituída por uma porção epitelial mais externa de origem ectodérmica, a
epiderme, e uma porção conjuntiva intermediária de origem mesodérmica, a derme. Há
ainda uma estrutura inferior, a hipoderme, que embora não possa ser considerada parte da
pele é sob ela que as duas camadas já citadas repousam1.
1
Figura 1 - Estrutura do tecido epitelial .
A hipoderme é formada por tecido conjuntivo que varia do tipo frouxo ao denso e em
determinadas regiões do corpo contém células adiposas formando o panículo adiposo,
importante como reserva de energia, isolante térmico e para absorção de choques 1.
A derme também é formada por tecido conjuntivo e é constituída por fibras de
colágeno, elastina e gel coloidal, sendo responsável pelas propriedades de elasticidade e
resistência que a pele apresenta. Ela possui inúmeros corpúsculos sensoriais e táteis e
2
terminações nervosas, portanto é ricamente vascularizada, sendo inclusive, responsável pela
nutrição sanguínea da epiderme. A derme é subdividida em uma camada papilar, de tecido
conjuntivo frouxo que forma as papilas dérmicas e onde são encontradas fibrilas especiais
de colágeno que contribuem para prender a derme à epiderme, e uma camada reticular,
constituída por tecido conjuntivo denso1.
A epiderme é composta de quatro tipos celulares: os queratinócitos, células de
Langerhans, células de Merkel e os melanócitos. Os queratinócitos são derivados da
ectoderme, possuem função principal de síntese de queratina e são as células epidérmicas
mais populosas2. As células de Langerhans localizam-se em toda a epiderme entre os
queratinócitos, porém são mais frequentes na camada espinhosa1. Estas células se originam
de células precursoras da medula óssea que são transportadas pelo sangue circulante e
atuam como células apresentadoras de antígeno em respostas imunológicas2.
As células de Merkel possuem origem incerta e se localizam na parte profunda da
epiderme, apoiadas na membrana basal. Atuam como mecanoreceptores devido às
terminações nervosas aferentes se aproximarem destas células1.
Os melanócitos são células dendríticas localizadas no estrato basal da epiderme,
cujos prolongamentos penetram na camada espinhosa, mas não formam desmossomos com
os queratinócitos. Estas células se diferenciam a partir do melanoblasto, uma célula
precursora migratória da crista neural, controlado pelo ligante do fator de células-fonte
interagindo com o c-Kit, uma tirosinaquinase1. Estas células invadem a pele entre a 12ª e 14ª
semana da vida intrauterina e apresentam renovação mais lenta do que os queratinócitos e
se caracterizam por produzirem melanina1.
A melanina é derivada do aminoácido tirosina, o qual é transportado para dentro de
vesículas especializadas contendo tirosinase, conhecidas como melanossomas, derivadas da
rede trans-Golgi. No interior dessas melanossomas, a tirosinase converte tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (dopa), a qual é transformada em dopaquinona e, finalmente, em
melanina2.
Os melanossomas seguem para aos prolongamentos dos melanócitos, os quais são
englobados e endocitados pelos queratinócitos dos estratos basal e espinhoso. Os
melanossomas liberados migram para as proximidades do núcleo do queratinócito de modo
a formar um capuz protetor contra os raios ultravioleta da radiação solar. Logo em seguida,
os lisossomas atacam e destroem os melanossomas2.
3
São três as principais neoplasias malignas da pele: o carcinoma de células basais, o
carcinoma de células escamosas e o melanoma maligno. A primeira consiste na mais comum
neoplasia maligna, ocorrendo em virtude da radiação ultravioleta e se desenvolve no estrato
basal, sendo as áreas cronicamente expostas da pele como a face, as mais acometidas. A
cirurgia é normalmente efetiva em 90% dos casos, sem recaída2.
O carcinoma de células escamosas ou carcinoma epidermóide está relacionado a
fatores ambientais, tais como radiação ultravioleta e os raios X, além de carcinógenos
químicos. Esta neoplasia origina-se nas células do estrato espinhoso e aparece clinicamente
como uma placa escamosa hiperqueratótica, com invasão profunda dos tecidos subjacentes,
frequentemente acompanhada por sangramento. A cirurgia neste caso, geralmente é o
tratamento de escolha2.
O melanoma, foco central deste estudo, é a forma mais agressiva dentre as
neoplasias de pele e surge a partir de células normais de pigmento, os melanócitos 3, que se
tornam mitoticamente ativos e invadem a derme, podendo penetrar nos sistemas
circulatório e linfático para formar metástases em outros órgãos2.
Mais de 90% dos melanomas surgem na pele, em especial nos sítios expostos ao sol,
como membros, tronco e face. Em torno de 3 a 5% dos melanomas se originam de
melanócitos do trato uveal e raramente em superfícies epiteliais não cutâneas, incluindo
membranas mucosas dos seios, orofaringe, esôfago, reto e vagina. Em pessoas com pele
negra esta forma de câncer surge em geral em locais não expostos ao sol, como membranas
mucosas, região palmo-plantar e subungueal, com baixa frequência destas apresentações
clínicas na população de pele branca3.
1.1. Transformação Maligna dos Melanócitos
Melanomas se desenvolvem a partir de um dos melanócitos num processo marcado por
sucessivas alterações genéticas. Ainda não existe um consenso sobre o padrão de
desenvolvimento da doença4, no entanto, um artigo recente publicado por Shain e
colaboradores (2015)5, mostrou com os dados de sequenciamento de 37 melanomas
primários, em um total de 150 áreas, com histologias distintas de lesões precursoras, que a
evolução da doença a partir dessas lesões realmente se estabelece com o acúmulo de
mutações somáticas, enquanto que variações no número de cópias do DNA é um processo
4
importante para a metastização. Além disso, propuseram um modelo de progressão da
doença (Figura 2), onde a radiação ultra-violeta possui papel importante desde o surgimento
da lesão benigna, até se tornar invasivo e que a maioria dessas lesões possui mutações
condutoras (driver mutations) importantes, que levam ao desenvolvimento da doença. Eles
postulam três possíveis caminhos de surgimento do melanoma. O primeiro é quando a lesão
benigna já possui a mutação V600E do gene BRAF (v-Raf murine sarcoma viral oncogene
homolog B) e a mutação na região promotora do TERT (telomerase reverse transcriptase) é a
responsável pela transição da lesão intermediária para o melanoma in situ. A segunda e
terceira teoria é a existência de uma lesão intermediária entre a lesão benigna e o
melanoma in situ, que surge por mutações no NRAS (neuroblastoma RAS viral oncogene
homolog) mais TERT ou por BRAF V600K mais TERT, respectivamente. O fato é que a
transição do melanoma in situ para invasivo, independente das três teorias, seria em virtude
de alterações no gene CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), importante supressor
tumoral, que leva a perda da função do gene e alterações nos genes SWI/SNF, responsáveis
por mecanismos epigenéticos de enovelamento da cromatina nas histonas. E a metastização
do tumor provavelmente se estabelece por perda de função de PTEN (phosphatase and
tensin homolog) e P53.
5
Figura 2 - Modelo de progressão do melanoma .
5
1.2. Epidemiologia do Melanoma
Estudos indicam que há uma incidência crescente de melanoma em todo mundo 6. A
Sociedade Americana de Câncer estima cerca de 76.380 novos diagnósticos de melanomas
na população norte-americana em 2016, em torno de 46.870 em homens e 29.510 em
mulheres. Além disso, estima que 10.130 pessoas morram pela doença neste mesmo ano7.
Segundo as estimativas do Globocan 2012 em todo o mundo aproximadamente
232.000 novos casos de melanoma seriam diagnosticados. Ainda segundo esta estimativa a
incidência e prevalência mundial de melanoma não diferem entre os gêneros, é maior nos
países desenvolvidos (Figura 3), sendo que os vinte com maior estimativa de incidência e
prevalência são: EUA, Alemanha, Reino Unido, Austrália, Itália, França, Rússia, China,
Canadá, Holanda, Espanha, Brasil, Suécia, Suíça, Nova Zelândia, Ucrânia, Polônia, República
Tcheca, Bélgica e Dinamarca (Figura 4)8.
8
Figura 3 - Estimativas mundiais de incidência e prevalência de melanoma .
6
8
Figura 4 - 20 países com maior estimativas de incidência e prevalência de melanoma .
7
Segundo a EUCAN (Figura 5), em 2012, os cinco países com maior estimativa de
incidência de melanoma na Europa incluem Suíça, seguida de Noruega, Holanda, Dinamarca
e Suécia. Enquanto que o país com maior estimativa de mortalidade é Noruega, seguida de
Eslovênia, Suécia, Holanda e Islândia9.
9
Figura 5 - Estimativa de incidência e mortalidade de melanoma nos países europeus .
8
Na Austrália o melanoma é o terceiro câncer mais incidente e as estimativas em 2016
é de 15.270 novas casos10. Em 2011 ocorreram 1.544 mortes por este tipo tumoral neste
país, sendo que a sobrevida é maior em homens. A incidência de melanoma entre 1982 e
2007 na Austrália foi de 47 a cada 100.000 pessoas e a taxa de mortalidade neste período foi
de 5.7 a cada 100.000 pessoas11.
No Brasil, em 2006 a Sociedade Brasileira de Dermatologia publicou dados
decorrentes de uma Campanha Nacional de Prevenção do Câncer de Pele, que ocorreu entre
1999 e 2005. Embora não sejam dados frutos de uma pesquisa, a análise destes pode dar
uma ideia do panorama geral. Nos sete anos que durou a campanha 205.869 exames
dermatológicos foram feitos e 1.057 melanomas foram diagnosticados12.
Em 2011 foi publicado um estudo epidemiológico de melanoma, que avaliou a
incidência deste câncer em 30 anos na cidade de Blumenau. Entre os anos de 1980 e 2009
foram encontrados 10.981 casos de câncer de pele, dos quais 1.002 melanomas. A incidência
passou de 4.4 para 22 por 100.000 habitantes entre os anos de 1980 e 2009 13. Enquanto que
Moreno e colaboradores mostraram em 2012 que entre 2002 e 2009 a incidência de
melanoma aumentou em Santa Catarina de 7.4 para 9.3 por 100.000 habitantes14.
Segundo o Instituto Nacional do Câncer, embora a incidência de melanoma na
população brasileira seja baixa, sua letalidade é alta. As estimativas deste câncer em 2016,
segundo este mesmo órgão nacional, são 3.000 casos novos em homens e 2.670 em
mulheres. A cidade de Porto Alegre possui a maior estimativa de incidência de melanoma do
país, sendo 9.41 a cada 100.000 homens e 7.45 a cada 100.00 mulheres. Essa baixa
incidência quando comparada ao panorama mundial, muito provavelmente, é em virtude da
subnotificação15. A sobrevida por melanoma no Brasil é baixa comparada a população
mundial, muito devido ao diagnóstico tardio que pode ser relacionado à dificuldade de
acesso da população ao sistema de saúde16.
1.3. Fatores de Risco para Melanoma
Os fatores de risco associados ao desenvolvimento do melanoma incluem: exposição
intermitente ao sol, dificuldade no bronzeamento, xeroderma pigmentoso, história familiar
de melanoma, nevos melanocíticos congênitos, múltiplos nevos displásicos, dentre outros17.
9
A exposição intermitente ao sol é o maior fator de risco para melanoma. Alguns
estudos demonstram que p53, p21, p16 e a proteína retinoblastoma são importantes na
estabilidade genômica quando os melanócitos são expostos a radiação ultra-violeta e,
consequentemente, na prevenção da transformação maligna destas células18.
Há fortes evidências de que um padrão de exposição intermitente ao sol (curta e
intensa, em virtude de banhos de sol e recreações ao ar livre) aumenta o risco de melanoma,
enquanto que a exposição crônica (contínua, principalmente ocupacional) demonstra menor
associação com o risco de melanoma. Isto pode ser em virtude da exposição crônica ao sol
promover o espessamento epitelial e em conjunto com um efeito de bronzeamento poder
oferecer uma modesta proteção contra a exposição à radiação solar mais tarde19.
Além disso, há evidências que sugerem que o risco de melanoma continua a
aumentar com o acúmulo da exposição intermitente ao sol. Meta-análises relatam o
aumento do risco de melanoma com o aumento do número de queimaduras solares durante
todos os períodos da vida (infância, adolescência e idade adulta), sem diferenças
significativas entre queimaduras solares na infância e na idade adulta20.
O xeroderma pigmentoso é uma doença autossômica recessiva que ocorre em
virtude de mutações em genes de reparo do DNA21. Levando-se em consideração isto, tornase fácil entender que tendência ao fácil bronzeamento e xeroderma pigmentoso constituem
fatores de risco ao desenvolvimento do melanoma porque tornam os indivíduos mais
susceptíveis à radiação ultra-violeta.
Em relação ao melanoma familiar, de 25 a 40% estão associados a mutações em
CDKN2A, sendo este classicamente um supressor tumoral, acarretando assim uma perda de
função. Este gene codifica a proteína p16 e p14, ambas envolvidas na regulação do ciclo
celular, supressão tumoral e senescência dos melanócitos17. A proteína p16 inibe a atividade
de CDK4 e CDK5 e influencia a proteína retinoblastoma a regular a progressão de G1 para a
fase S. A proteína p14 afeta a via do p53, impedindo o ciclo celular e induzindo a apoptose 22.
O nevo melanocítico congênito é uma alteração benigna que se origina entre a 5ª e 24ª
semana de gestação e acredita-se que ocorra em virtude de um erro morfológico na
neuroectoderma durante a embriogênese, levando ao crescimento descontrolado de
melanoblastos, as células precursoras dos melanócitos. Há evidências claras na literatura de
que indivíduos portadores de nevos congênitos possuem de 5 a 10% a chance de
desenvolver melanoma23.
10
O número de nevos displásicos é um dos maiores fatores de risco para melanoma19.
Há uma ampla discussão sobre os critérios histopatológicos para os nevos displásicos na
literatura patológica e dermatopatológica, entretanto, de forma geral, pode-se definir como
uma desordem estrutural e uma atipia citológica24. Uma meta-análise conduzida em 2005
por Gandini e colaboradores com 10.499 casos e 14.256 controles, em um total de 47 bancos
de dados, demonstrou que os indivíduos com mais de 100 nevos displásicos estão em um
risco quase sete vezes maior de desenvolver melanoma do que os indivíduos com poucos
(≤15) nevos25. Ainda, há evidências de que polimorfismos nos genes IRF4 (interferon
regulatory factor 4), MTAP (methylthioadenosine phosphorylase) e PLA2G6 (phospholipase
A2 group VI) em nevos displásicos estão associados ao risco à doença26.
Além desses fatores de risco, algumas variantes do gene MC1R (melanocortin 1
receptor), por sua característica polimórfica, podem estar relacionadas à maior
susceptibilidade ao melanoma19. Também foi demonstrado que este gene está superexpresso em melanomas quando comparados a qualquer tecido saudável. Inclusive há
muitos estudos que já discutem o seu papel no diagnóstico e condução de tratamento para
este tipo tumoral. Este gene codifica um receptor acoplado à proteína G, cuja ativação
resulta na elevação dos níveis intracelulares de AMP cíclico (cAMP), numa cascata de
transdução de sinal que termina com a produção de melanina26.
1.4. Prevenção do Melanoma
As intervenções se baseiam principalmente na informação e educação, por meio de
políticas públicas e órgãos não governamentais, em ambientes que vão desde locais de
recreação ao ar livre, creches, escolas e em locais de trabalho. A prevenção do melanoma
tem se baseado, principalmente, em precaver queimaduras solares, reduzir o tempo de
exposição ao sol e o uso de fotoprotetor19.
Em alguns países o uso de bronzeamento artificial é uma prática comum, entretanto,
muitos estudos já demonstraram que esses equipamentos podem ser um causador do
melanoma, portanto, intervenções no sentido de conscientizar sobre essa prática, também
vêm sendo empregadas27.
11
Segundo a Sociedade Brasileira de Dermatologia não há nenhuma medida fotoprotetora
que, de forma independente, garante fotoproteção adequada. Sendo assim, a combinação
do maior número possível de medidas é a estratégia mais correta. As recomendações do
consenso brasileiro sobre fotoproteção incluem evitar a exposição solar entre 10:00 e 15:00,
sendo que no nordeste a exposição deve ser evitada a partir das 9:00 e no centro-oeste até
as 16:00, devido a posição geográfica. Este consenso ainda indica para pessoas calvas o uso
de chapéus e fotoprotetor no couro cabeludo, a atenção para fotoproteção das orelhas, o
uso de óculos de sol com proteção solar, bem como o uso de produtos com fotoproteção
nos lábios28 e recomenda que os protetores solares indicados por dermatologistas estejam
de acordo com a legislação da ANVISA (Agência nacional de vigilância sanitária) e que a
população seja orientada a aplicá-los de forma correta 28. O Consenso brasileiro afirma que o
bronzeamento artificial deveria ser proibido no país, embora a radiação artificial possa ser
empregada para o tratamento de algumas doenças, desde que haja a indicação e orientação
de um dermatologista. E que fotoproteção mecânica, como bonés, chapéus e guarda-chuvas,
devem ser estimulados28.
1.5. Subtipos Histopatológicos do Melanoma
A classificação do melanoma que é amplamente utilizada tanto por clínicos e
pesquisadores, bem como pela Organização Mundial de Saúde foi estabelecida por Clark em
1969 e se baseia nos padrões microscópicos de crescimento e está associada às
características clínicas, tais como localização anatômica do tumor primário e idade do
paciente. Esta classificação distingue quatro subtipos principais de melanoma29:
 Melanoma Extensivo Superficial (MES): é um subtipo de melanoma que
tende a ocorrer na pele e é caracterizado por uma fase de crescimento radial composto de
neoplasia com grandes melanócitos que se estendem entre os queratinócitos 30. Além disso,
é o subtipo mais frequente, compreendendo 2/3 de todos os melanomas e exposição solar
aguda na infância, bem como exposição intermitente na vida adulta, constituem fatores
importantes na sua etiologia31.
12
O MES (Figura 6) pode ocorrer em todo corpo, sendo mais frequentemente
observado nas pernas em mulheres e no tronco em homens. Um dos primeiros sinais clínicos
é a variação de cor, decorrente à presença de melanócitos nas diferentes camadas da
epiderme, e de melanófagos na derme. Outros reconhecimentos clínicos desta lesão incluem
assimetria, irregularidade das bordas e diâmetro maior do que 6.0mm30.
O MES tem uma incidência elevada de mutações no oncogene BRAF e alterações
cromossômicas incluem, principalmente, perda do 9, 10, 6q, 8p e ganhos de cromossomos 1,
6p, 7, 8q e 20. A perda do cromossomo 9 geralmente inclui o locus 9p21 onde se encontra o
gene CDKN2A, já discutido como sendo importante supressor tumoral31.
 Melanoma Lentigo Maligno (MLM): é uma forma de melanoma que ocorre na
pele de idosos em regiões cronicamente expostas ao sol, principalmente na face (Figura 7).
Caracteriza-se histologicamente por proliferação melanocítica linear e aninhado, ao longo da
junção derme-epiderme, cuja lesão está associada à atrofia epidérmica e elastose solar. Nos
países de população predominantemente branca, estima-se que esse subtipo compreende
de 4 a 15% dos melanomas30.
O MLM surge como uma extensa mácula irregular, de limites imprecisos, com uma
pigmentação heterogênea em tons variáveis de cinza, marrom ou preto. Normalmente, as
lesões apresentam uma proliferação de melanócitos atípicos, confluentes ao longo da junção
dermo-epiderme, com fusão das cristas epiteliais, atrofia epidérmica e extensa elastose,
como já dito31.
Quanto às alterações moleculares deste subtipo, parece que mutações no oncogene
BRAF são menos frequentes e as perdas cromossômicas mais comuns envolvem o
cromossomo 13 e menos frequentemente o 1030.
 Melanoma Nodular (MN): é o segundo subtipo mais frequente entre os
melanomas e cuja etiologia se assemelha a descrita para o MES. O componente dérmico é
caracterizado por um nódulo coeso ou pequenos ninhos de células tumorais que têm um
padrão expansivo de crescimento (Figura 8). As células tumorais são frequentemente mais
epitelióide, mas outros tipos de células, incluindo células fusiformes, podem predominar ou
haver uma mistura entre elas. Além disso, os nucléolos são proeminentes e índices mitóticos
são altos31.
13
É mais comum para MN começar “de novo” do que ser proveniente de um nevo préexistente. Em relação às alterações genéticas, ainda não há uma alteração que o defina
como um tipo único30.
 Melanoma Lentiginoso Acral (MLA): é um subtipo de melanoma cutâneo com
características histopatológicas bem distintas e acomete as palmas das mãos, plantas dos
pés e regiões subungueais (Figura 9). A incidência desse subtipo de melanoma varia
enormemente de acordo com a raça e etnia, sendo que na população branca compreende
aproximadamente 2% dos melanomas, mas chegando a 80% na população negra e 77% na
população asiática30.
A incidência de MLA permaneceu estática, embora a incidência mundial de melanoma
esteja aumentando ao longo dos últimos anos. Esse subtipo ocorre em pacientes idosos,
com pico na sétima década de vida e em população onde MLA é mais comum, este tumor é
mais frequente em homens do que em mulheres31.
Clinicamente o MLA na fase radial é caracterizado por acantose, alongamento das
cristas epiteliais e proliferação de melanócitos atípicos com grandes prolongamentos
dendríticos ao longo da epiderme basal. O componente intraepidérmico apresenta
melanócitos com grandes núcleos e nucléolos, e citoplasma preenchido com grânulos de
melanima. Embora acometam sítios que, muitas vezes, não recebem alta incidência de
radiação ultra-violeta, esta constitui um fator de risco para MLA somando-se a isto, um
número alto de nevos30.
As alterações genéticas em MLA se diferem em relação aos outros subtipos de
melanoma. Alteração em BRAF é menos comum em comparação ao MES, MN e MLM,
enquanto que mutações em KIT, NRAS e PDGFRA parecem ser importantes na etiologia
deste subtipo31.
14
Figura 6 - Melanoma Extensivo
Superficial.
Figura 8 - Melanoma Nodular.
Figura 7
Maligno.
-
Melanoma
Lentigo
Figura 9 - Melanoma Lentiginoso
Acral.
15
Além dessas quatro formas clássicas de melanoma, há ainda formas mais raras, como
o melanoma de mucosas, ocular, desmoplásicos, associados a nevos congênitos, infantil,
nevóide, persistente e associado a nevo azul30.
O melanoma de mucosas se caracteriza por acometer a região de cabeça e pescoço,
genitália feminina, região anorretal e urinária. Clinicamente se apresenta frequentemente
multifocal e com pigmentação escura irregular. São mais frequentes no sexo feminino e
geralmente incidem na sétima década de vida. Por ser um subtipo raro, poucos estudos
investigaram até o momento suas alterações genéticas. Entretanto, sabe-se que mutações
em KIT ocorrem em 40% desse subtipo32 e parece haver um papel importante do gene NRAS
em sua etiologia dependendo do sítio acometido33.
1.6. Diagnóstico, Estadiamento, Prognóstico e Tratamento do Melanoma
O diagnóstico do melanoma é eminentemente clínico e o uso da dermatoscopia
(equipamento óptico para visão ampliada) ajuda a observação mais detalhada da lesão.
Além disso, o exame histopatológico é fundamental para confirmação diagnóstica, do
subtipo de melanoma e para programar o tratamento adequado31.
Vários métodos têm sido utilizados na interpretação dos achados dermatoscópicos,
sejam por meio de métodos semiquantitativos como a regra do ABDCE e dos setes pontos,
ou qualitativos, como método de Menzies e análise dos padrões31.
A regra do ABCDE avalia a lesão com base em cinco parâmetros34:
1- Assimetria: são traçados dois eixos perpendiculares entre si, para análise
da simetria em cada metade, quanto à forma, estrutura e cor. Esse critério
possui peso 1.3, então se a lesão for assimétrica em um eixo, multiplica-se
um eixo de assimetria por 1.3 e se obtém 1.3. Entretanto, se a lesão for
assimétrica em dois eixos, então multiplica-se dois eixos de assimetria por
1.3 e se obtém 2.6.
16
2- Borda: são traçados quatro eixos sobre a lesão, perpendiculares dois a
dois, dividindo-se em 8. Então, para cada octante com interrupção brusca
de borda é multiplicado o peso de 0.1.
3- Cores: para cada cor que a lesão apresentar, multiplica-se por 0.5.
4- Diferentes Estruturas: multiplica-se por 0.5 a presença de cada uma dessas
estruturas: rede pigmentada, estrias, glóbulos, pontos e área sem
estrutura.
5- Evolução: ampliação ou evolução da lesão.
Assim, considera-se a lesão como benigna quando o escore varia entre 1.0 e 4.75,
suspeita entre 4.75 e 5.45, e altamente suspeita quando o escore é maior do que 5.45 34.
A regra dos sete pontos descrita por Argenziano avalia e pontua sete critérios, divididos
em maiores e menores. Os critérios maiores valem dois pontos cada e incluem véu brancoazulado e padrão vascular atípico, enquanto que os critérios menores valem um ponto cada
e incluem estrias irregulares, pigmentação irregular, glóbulos/pontos irregulares e estruturas
de regressão. Assim, escore maior do que 3 é diagnóstico para melanoma31.
No método descrito por Menzies, pelo menos um dos seguintes critérios deve estar
presente para o diagnóstico do melanoma, entretanto, apenas um critério não é suficiente,
devendo se considerar o contexto da lesão: pigmentação assimétrica, ausência de uma única
cor, véu branco-azulado, múltiplos pontos marrons, pseudópodes, estrias radiais, rede
pigmentada negativa, despigmentação irregular, despigmentação crucial, pontos e glóbulos
pretos periféricos, múltiplas cores, múltiplos pontos azul-acinzentado e rede alargada35.
A análise de padrões descrita por Pehamberger se dividem em: padrões globais, padrões
específicos, critérios adicionais e padrões relacionados à localização. Os padrões
multicomponentes e inespecíficos são indicativos de melanoma, enquanto que padrões
regular, globular e homogêneo azul-acinzentada, são sugestivos de lesão benigna. Além
disto, atividade melanocítica irregular, resultando em assimetria na cor e na distribuição das
estruturas, bem como presença de véu-branco-azulado, estrias radiais e pseudópodes. Esse
método praticamente se sobrepõe ao de Menzies31.
Apesar da importância inicial dos achados dermatoscópicos, os principais fatores
prognósticos estão relacionados aos dados histopatológicos, sendo o nível de Clark e
espessura de Breslow os mais clássicos em melanoma (Figura 10). O primeiro determina a
17
invasão do tumor nas camadas da pele e está relacionado, portanto, a extensão da
espessura do tumor, sendo que quanto menor o nível histopatológico da lesão, melhor o
prognóstico31.
Assim, o nível I de Clark corresponde à epiderme; enquanto que o nível II corresponde à
invasão parcial da derme papilar; o nível III corresponde à invasão definitiva da derme
papilar, estendendo-se à interface derme papilar; o nível IV corresponde à invasão definitiva
da derme reticular; e o nível V corresponde à invasão do tecido subcutâneo 35.
Enquanto que a espessura de Breslow é complementar aos níveis de Clark e determina
diferentes prognósticos em relação à espessura vertical máxima do melanoma medido em
milímetros através de uma régua acoplada ao microscópio na análise histopatológica36.
33
Figura 6 - Relação entre níveis de Clark e de Breslow .
Além disso, a ulceração está associada a maior agressividade tumoral, com maior
probabilidade de metástase e menor sobrevida. Assim como o índice mitótico é um
importante fator prognóstico para melanomas “finos” (espessura inferior a 1mm)36. A DHL
(dehidrogenase lática) está envolvida na síntese de energia celular e a sua super-expressão
correlaciona-se com o metabolismo anaeróbio tumoral e reduz a dependência celular de
oxigênio37. Há um tempo pesquisas demonstram que o nível de DHL encontra-se aumentado
no soro de pacientes com melanoma e que está associado com uma menor sobrevida
naqueles com doença avançada38. Esses achados levaram à incorporação de DHL nos
critérios prognósticos estabelecidos pela AJCC (American Joint Committee on Cancer)38.
O estadiamento do melanoma é crucial para a orientação clínica do paciente, sendo um
sistema de classificação que leva em conta fatores prognósticos já discutidos. Neste
18
momento o estadiamento dos tumores malignos é regido por normais internacionais do
AJCC, que publica regulamente o livro TNM – Classification of Malignant Tumors. A última
revisão ocorreu em 2009 e é a que está atualmente em vigor36.
O sistema TNM visa à análise da extensão anatômica da doença e possui como base a
avaliação de três componentes: T - a extensão do tumor primário; N - a ausência ou
presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais; e M - a ausência ou presença
de metástase à distância. A adição de números a estes três componentes indica a extensão
da doença maligna36.
Existe a classificação TNM clínica (cTNM) que se baseia nas evidências obtidas antes do
tratamento, em virtude do exame físico, diagnóstico por imagem, endoscopia, biópsia,
exploração cirúrgica e outros exames relevantes. Também existe a classificação TNM
patológica (pTNM), cujas bases são
as evidências conseguidas antes do tratamento,
complementadas ou modificada pela evidência adicional conseguida através da cirurgia e do
exame histopatológico39.
Dessa forma, os estadiamentos clínicos ou patológicos categorizam os portadores de
melanoma localizado sem evidência de metástase (estadios I e II), em portadores de
metástase regionais (estádio III) ou portadores de metástase distantes (estádio IV)31. As
Tabelas de 1 a 4 representam de forma geral os estadios clínicos do melanoma segundo a
versão de 2009 da AJCC36. Vale ressaltar que nesta versão o índice mitótico distingui as
categorias T1a e T1b, sendo a primeira com índice mitótico ≥1 mm2 e a segunda < 1mm2.
Além disso, desde 2010 o nível de Clark é facultativo19.
Tabela 1 - Estadiamento do tumor primário, segundo a AJCC – 2009.
Classificação T
Espessura do Tumor
TX
Tumor não avaliável
Tis
Melanoma in situ
T1
Menor ou igual a 1mm
T2
1.01-2.00mm
T3
2.01-4.00mm
T4
>4.0mm
Fatores de prognóstico adicionais
Estádio não determinável
Melanoma in situ, sem invasão da derme
a: sem ulceração e menos de uma mitose/ mm2
b: com ulceração e/ou com uma ou mais mitose/ mm2
a: sem ulceração
b: com ulceração
a: sem ulceração
b: com ulceração
a: sem ulceração
b: com ulceração
19
Tabela 3 - Estadiamento da metástase linfonodal, segundo a AJCC – 2009.
Classificação N
N° de Linfonodos Metastáticos (LM)
Nx
Não avaliáveis
N0
Sem metástase linfonodal
N1
1 LM
Extensão da Metástase Linfonodal
a: Micrometástase
b: Macrometástase
a: Micrometástase
b: Macrometástase
c: Metástase em trânsito/satelitose sem metástase
linfonodais
N2
2-3 LM
N3
≥ 4 LM; conglomerado linfonodal;
combinação de metástase em
trânsito/satélites com metástases linfonodais
Tabela 2 - Estadiamento da metástase à distância, segundo a AJCC – 2009.
Classificação M
Local da Metastização
Nível sério de LDH
MX
avaliação de metástase à distância não executada
M0
sem metástase à distância
M1a
pele, tecido celular subcutâneo ou ganglionares não locoregionais
Normal
M1b
Pulmão
Normal
M1c
Outros órgãos viscerais
Normal/Elevada
20
Tabela 4 - Estadiamento do melanoma segundo AJCC- 2009.
Estádio
Tumor Primário (pT)
Linfonodos loco-regionais (N)
Metástase à
distância (M)
0
Tumor in situ
N0
M0
IA
≤1.0mm, não ulcerado, IM <1/mm2
NO
M0
≤1.0mm, com ulceração ou IM ≥1/mm
NO
M0
1.01-2.0mm sem ulceração
NO
M0
1.01-2.0mm com ulceração
NO
M0
2.01-4.00mm sem ulceração
NO
M0
2.01-4.00mm com ulceração
NO
M0
> 4.00mm, sem ulceração
NO
M0
IIC
> 4.00mm, com ulceração
NO
M0
IIIA
Qualquer espessura sem ulceração
N1a, N2a
M0
Qualquer espessura com ulceração
N1a, N2a
M0
Qualquer espessura sem ulceração
Até 3 macrometástases (N1b, N2b)
M0
Qualquer espessura sem ulceração
Metástase em trânsito/satelitose sem
metástases linfonodais
M0
Qualquer espessura com ulceração
Até 3 macrometástases (N1b, N2b)
M0
2
IB
IIA
IIB
IIIB
IIIC
IV
N3 (≥4 linfonodos; conglomerado
linfonodal; combinação de metástase em
Qualquer espessura com ou sem ulceração
trânsito/satélites com metástases
linfonodais)
Qualquer T
IM = Índice Mitótico.
Qualquer N
M1
21
O objetivo do tratamento inclui o controle local da doença evitando quando possível
a disseminação à distância. O principal tratamento do melanoma ainda é a cirurgia 31.
Nas fases iniciais (estadios I e II) o tratamento é cirúrgico e o prognóstico é favorável,
enquanto que para estadios avançados, a literatura demonstra benefícios na sobrevida
global em pacientes submetidos a ressecção completa, embora muitos pacientes não são
elegíveis a cirurgia, quer pelo estado geral e/ou por co-morbidades associadas3.
A pesquisa de linfonodo sentinela é a maneira atual de diagnóstico de doença
linfonodal metastática. Nesta técnica identifica-se com o auxílio de injeção perilesional de
contrastes radioativos e outros pigmentos com tropismo para a via linfática, os primeiros
linfonodos que drenam a região acometida. Com isto pode-se fazer diagnóstico de
metástases linfonodais subclínicas (micrometástases) e o tratamento com cirurgia
complementar de resseção completa da cadeia linfonodal. Metástases linfonodais
diagnosticadas clinicamente também são tratadas com cirurgia e o prognóstico é
relacionado com a carga tumoral linfonodal. A presença de maior acometimento linfonodal é
indicador de menores taxas de sobrevivência16, 40-42.
O melanoma é um tumor considerado radio resistente e a radioterapia é utilizada em
situações específicas, principalmente para tratamento paliativo e eventualmente adjuvante,
sendo que esta deve ser indicada para pacientes considerados de alto risco para recaída
locorregional ou naqueles em que a localização da lesão limita o tratamento cirúrgico
adequado43.
Nas últimas três décadas, a dacarbazina foi o gold-standard do tratamento do
melanoma metastático, apesar de nunca ter sido demonstrado um aumento consistente da
sobrevida global. Este quimioterápico é um análogo das purinas, que inibe a síntese de DNA
(ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico). Desde 2011 este tratamento deixou
de ser considerado a primeira opção para terapia sistêmica do melanoma, devido ao
advento de terapia alvo e imunoterapias mais eficientes, que serão discutidas mais a frente6.
Junto com o avanço de inibidores de alterações específicas relacionadas à
carcinogênese do melanoma, houve mais recentemente grande avanço na imunoterapia
para este tipo tumoral. Ipilimumabe é um anticorpo monoclonal de imunoglobulina humana
(IgG1) que bloqueia totalmente CTLA-4 (linfócito citotóxico associado a antigeno-4) e
promove imunidade antitumoral44. Foi o primeiro agente a demonstrar uma melhoria na
sobrevida global em um estudo randomizado de fase III em pacientes com melanoma
22
avançado45. O PD-1 (proteína de morte celular programada 1) está envolvido na regulação
imune, mediada pela ligação de PD-1 e os seus ligantes PD-L1/PD-L2. O desenvolvimento de
anticorpos PD-1 já mostrou benefício clínico em pacientes com melanoma, bem como uma
ampla variedade de tipos de tumores46. Assim, os tratamentos direcionados e novos avanços
na imunoterapia vêm se mostrando eficientes em melhorar a sobrevida e são agora uma
parte do atendimento clínico de rotina dos pacientes com melanoma em vários países e
devem em futuro próximo ser incorporados ao arsenal terapêutico brasileiro 45.
1.7. Alterações Moleculares e Terapia Alvo em Melanoma
Um número grande de vias celulares encontra-se alterada em melanoma (Tabela 5)47. A
via MAP quinase (Figura 11) é uma das mais importantes no desenvolvimento do melanoma,
sendo que esta é ativada por um receptor de tirosina quinase, que fosforila e ativa a família
RAF, consequentemente NRAS, MEK, ERK, que migra para o núcleo onde ativa vários fatores
de transcrição, incluindo ELK-1, ETS e c-MYC47.
Tabela 5 - Vias de sinalização alteradas em melanoma e suas respectivas
alterações.
Vias de Sinalização
Genes Alterados
Receptores de tirosina quinases
Integrinas/sinalização ECM
RAS/RAF/MEK/ERK
RAS/PI3K/PTEN/AKT/Mtor
NF1 (PI3K + MAPK)
KIT
EGFR
MET
ERBD4
FGFR
NEDD9/HEF
Tipo de Alteração
Mutação/amplificação
Ativação
Ativação
Mutação
Amplificação
Amplificação
NRAS
BRAF
MEK1
PIK3CA
PTEN
AKT1, AKT2
AKT3
Mutação
Mutação
Mutação
Mutação
Mutação
Mutação rara
Amplificação
NF1
Mutação
RAC
MAP3K5 e MAP3K9
PREX
GRIN2A
Receptores de Glutamato
GRM3
Proteínas G exceto RAS, envolvidas na GNAQ
MAPK
GNA11
Mutação
Mutação
Mutação
Mutação
Mutação
Mutação
Apoptose
BCL2A1
Amplificação
WTN/β-catenina
CTNNB1
Mutação
CDK4
Mutação/amplificação
CCND1
Amplificação
P14ARF (CDKN2A)
Mutação/deleção
MDM4
Amplificação
RB1
P116INK4A (CDKN2A)
Mutação/deleção
MITF processo transcricional
MITF
Mutação/amplificação
MYC processo transcricional
MYC
Amplificação/superexpressão
ETV1 processo transcricional
ETV1
Amplificação
Região promotora da subunidade catalítica
Mutação
RHO/RAC/ outros MAPKs
Mutação
CDK
P53
TERT
47
Fonte: SHTIVELMAN et al .
23
29
Figura 7 - Via de sinalização MAP quinase .
1.7.1.
BRAF
O BRAF codifica uma proteína quinase serina/treonina membro da família RAF, no
cromossomo 7q34, que ativa a MAP quinase47. No melanoma, BRAF é o gene mais
comumente mutado, com uma frequência de 50 a 70%. Análises de subtipos anatômicos
demonstraram que as mutações em BRAF são relativamente comuns em melanomas
cutâneos (42,5%), mas incomum em melanomas de mucosas (5,6%) e raras em melanoma
uveal (menos de 1%). Entre os melanomas cutâneos, mutações em BRAF são comuns em
melanomas extensivos superficiais (53%), mas é menos frequente em lentiginoso acral (18%)
e ocorre em apenas 9% do subtipo lentigo maligno48.
As mutações em BRAF ocorrem particularmente com maior frequência em
melanomas cutâneos com exposição intermitente ao sol, como aqueles situados nos
membros, do que aqueles com exposição crônica, como no rosto 25. Mais de 90% dessas
mutações resultam em uma substituição da valina por ácido glutâmico na posição 600
(Val600Glu ou V600E). BRAF V600E conduz à ativação da ERK, resultando em proliferação e
vantagem de sobrevivência de células de melanoma6.
Um artigo recente fruto dos dados do TCGA (The Cancer Genome Atlas Network)
mostrou que 52% dos 331 pacientes analisados possuíam mutações em BRAF, das quais
24
74,7% eram V600E, 10,8% V600K, 1,8% V600R e 12,7% eram mutações em outras
localizações do gene49. Além disso, este artigo e outros demonstraram que mutações nesse
gene são mutuamente exclusivas com mutações em NRAS e são mais frequentes em
pacientes mais jovens5, 45, 49.
A descoberta dessa alta frequência da mutação V600E em melanoma fez desta
proteína oncogênica um alvo ideal para a terapia. O objetivo da pesquisa molecular-alvo tem
sido identificar alterações moleculares relevantes em pacientes individuais e usar este
conhecimento para orientar as decisões de tratamento50.
PLX4032 (Vemurafenibe) é um inibidor que induz a parada do ciclo celular, a
proliferação e inicia a apoptose em células exclusivamente portadoras da mutação V600E50.
Os primeiros ensaios clínicos com esta terapia-alvo demonstraram até 80% de taxa de
resposta clínica em portadores de melanoma metastático com esta mutação em BRAF51. Em
contraste, o uso de Vemurafenibe associou-se ao crescimento das lesões nos pacientes
portadores do gene selvagem e em particular naqueles com mutação em NRAS52.
Enquanto esta alta taxa de resposta global foi sem precedentes para um único agente
em melanoma, vários pacientes desenvolveram resistência após a resposta inicial, sendo
observada recidiva e/ou progressão do tumor. A duração média da resposta à PLX4032 é de
aproximadamente sete meses48.
Em 17 de agosto de 2011 a instituição governamental norte-americana “Food and
Drug Administration” (FDA) aprovou o ZelborafTM (Vemurafenibe) para o tratamento de
melanomas inoperáveis ou metastáticos com a mutação BRAF V600E. A FDA também
aprovou o Teste de Mutação Cobas 4800 BRAF V600E®, um teste de diagnóstico
desenvolvido pela empresa Roche para identificar os pacientes elegíveis para o tratamento.
ZelborafTM foi o primeiro medicamento personalizado para melanoma aprovado pelo FDA,
demonstrando os benefícios da abordagem de medicina personalizada53.
Posteriormente a isto, outro inibidor de BRAF chamado Dabrafenib mostrou
resultados promissores42. Foi demonstrado que pacientes com melanoma com mutação
BRAF V600E eram mais sensíveis ao tratamento, com uma taxa de resposta confirmada de
57% em comparação com 37% em pacientes com mutações V600K. Pacientes com mutação
V600E ou V600K tiveram sobrevida livre de doença semelhante, com médias de 5,5 e 5,6
meses, respectivamente54.
25
No geral, foi comprovado que pacientes tratados com Dabrafenibe apresentaram
taxas de resposta e sobrevida livre de doença em taxas significativamente mais elevadas,
juntamente com um perfil de toxicidade bem tolerada em pacientes com melanoma
metastático com mutação BRAF V600E50, 55.
O desenvolvimento de Trametinibe, um inibidor MEK, também parte da mesma via
de sinalização mudou o interesse de identificação de inibidor desta via em melanomas
metastáticos com mutações em BRAF. Trametinibe possui o desempenho melhor do que
qualquer outro inibidor MEK avaliados até agora, permitindo, além disso, uma otimização da
inibição da sinalização MAPK55.
Isto foi observado no estudo clínico fase II conduzido por Keith e colaboradores
(2012)56, no qual os pacientes que receberam a terapia de combinação com 150mg de
Dabrafenibe e 2mg de Trametinibe mostraram taxa de sobrevida livre de doença
estatisticamente diferente daqueles que foram tratados apenas com Dabrafenibe, sendo 9,4
e 5,8 meses, respectivamente (taxa de risco de progressão ou morte 0.39, IC 95%, 0.25-0.62,
p < 0.001). A terapia de combinação também induziu maior extensão de regressão do tumor,
com uma resposta de 76%, em comparação com 54% da monoterapia (p < 0.03).
Diante destas evidências, a FDA aprovou em maio de 2013 a monoterapia de
Dabrafenibe e Trametinibe e, em janeiro de 2014, a terapia de combinação destas duas
drogas em pacientes com melanoma metastático com mutação V600E e V600K 57.
1.7.2.
NRAS
Mutações ativadoras no NRAS podem estimular tanto a via MAP quinase quanto as
vias PI3K/AKT, entretanto estas mutações são mutuamente exclusivas com mutações em
BRAF, como mencionado anteriormente49, 58.
Em torno de 90% das mutações que ocorrem em NRAS nos melanomas estão nas
posições 12/13 e 61, possuindo esta última maior frequência6. Os dados do TCGA
demonstraram que 28% dos 331 pacientes possuíam mutações em NRAS, sendo que 86 das
88 mutações encontradas, se localizavam em uma região hotspot. Destas, 91,9% no códon
61 e 8,1% do códon 12/13 de NRAS49.
Estudos demonstram que frequências de mutações neste gene em melanoma sejam
diferentes entre os subtipos, sendo que cerca de 26% de melanomas cutâneos apresentam
26
mutações no NRAS, enquanto melanomas de mucosas apresentam frequência em torno de
14% e melanoma uveal menos de 1%51. Dentre os melanomas cutâneos, a frequência de
mutações em NRAS parece ser em torno de 22% em melanomas extensivos superficiais, 28%
em nodulares, 4% em lentiginoso acral e 0% em lentigo maligno54.
Devido à ausência de inibidores específicos da família RAS, atualmente não existem
ensaios clínicos registados para a avaliação de inibidores de NRAS. A próxima quinase na via,
MEK, tem provado ser um alvo mais favorável59. Um estudo conduzido por Jaykumar e
colaboradores (2014) testou a eficácia de inibidores MEK em sete linhagens primárias de
melanoma com mutação em NRAS e concluíram que elas eram particularmente sensíveis ao
inibidor MEK16260. Devido a essa e outras evidências, um ensaio clínico de fase II foi
conduzido utilizando o inibidor de MEK1/2 (MEK 162) e demonstrou que pacientes
metastáticos com NRAS mutado possuíam uma taxa de resposta de 25% e que possuíam
uma sobrevida livre de progressão semelhante àqueles pacientes com melanoma
metastático BRAF mutado61.
1.7.3.
KIT
O gene KIT codifica um receptor tirosina-quinase e é composto por cinco domínios
imunoglobulina extracelular, uma região transmembrana, um domínio justamembrana e um
domínio citoplasmático. Esta quinase ativa as vias de sinalização MAPK, PI3K e AKT6.
A amplificação de KIT foi identificada em 8% de melanomas de mucosa e em 7% de
lentiginoso acral. Número de cópias aumentadas deste gene foi encontrado em 6% de
melanomas cutâneos com evidências de danos causados pela exposição crônica ao sol. Além
disso, cerca de 21% de melanomas de mucosa possuem mutações neste gene, enquanto que
em melanoma lentiginoso acral essa frequência é de 11% e 0% em melanomas cutâneos sem
danos causados pela exposição crônica ao sol48.
Os dados do TCGA mostram a importância de mutações, amplificações e rearranjos
complexos do gene KIT naqueles melanomas que são WT para BRAF e RAS49. Em um artigo
do nosso grupo, com parte desta casuística, mostramos que 20,7% de 48 pacientes com
melanoma acral, possuem mutação em KIT, corroborando que este gene é importante na
oncogênese deste subtipo62.
27
Um dos inibidores de KIT testado foi o Sunitinibe, que também possui efeito sob os
receptores do VEGF59. Um estudo conduzido por Minor e colaboradores (2012) verificou a
ação deste inibidor em quatro pacientes com mutação em KIT no éxon 11 (W557G, V559G
ou L576P) demonstrando respostas diferentes ao tratamento. Um deles apresentou uma
remissão completa por quinze meses, um por sete meses, outro por um mês e um
apresentou a progressão da doença63.
Imatinibe é uma pequena molécula ATP-competitiva inibitória da tirosina-quinase
BCR-ABL, KIT, PDGFRA e PDGFRB6. Em 2011, Guo e colaboradores64 administraram 400 mg
de Imatinibe ao dia para 43 pacientes com melanoma metastático com mutações ou
amplificações em KIT. As respostas parciais foram observadas em 10 pacientes (23,3%);
doença estável em 13 pacientes (30,2%) e progressão da doença em 20 pacientes (46,5%). A
média de sobrevida livre de doença para os 43 pacientes foi de 3.5 meses e uma taxa global
de sobrevida em um ano de 51%. A taxa global de controle da doença foi de 53,5%. Este
estudo concluiu que Imatinibe aumentou a taxa global de sobrevida livre de doença, a taxa
de resposta e a sobrevida global em pacientes que apresentam mutações em KIT nos éxons
11 e 13.
Dasatinibe é uma droga alvo responsável pela inibição da família de quinases src e foi
aprovado pela FDA em 2010 para o tratamento de leucemia mielóide crônica 59. Um estudo
de fase II selecionou 17 pacientes com melanoma avançado para o tratamento com
Dasatinibe. A taxa de resposta objetiva foi de 5%, com evidências de regressão do tumor
após quatro ciclos de terapia. A média de sobrevida livre de doença foi de oito semanas. Este
estudo revelou que o Dasatinibe teve atividade limitada em pacientes com melanoma
avançado ou inoperável65. No artigo resultado dos dados do TCGA os autores recomendam o
uso de Imatinibe e Dasatinibe para aqueles pacientes com melanoma cutâneo e com
mutação ou amplificação em KIT49.
1.7.4.
PDGFRA
O fator de crescimento derivado de plaquetas receptor α (PDGFRA), localizado em
4q12, codifica um receptor transmembrana tirosina-quinase, o PDGFRA. Embora o estado
mutacional de PDGFRA em melanoma não seja intensamente investigado, esse gene é um
candidato potencial para a terapia-alvo baseada em inibidores de tirosina-quinases66.
28
Um estudo do final de 2013 analisou 351 amostras de tecido de melanoma quanto à
presença de mutações no éxon 12, 14 e 18 do gene PDGFRA. Além disso, verificaram a
resposta de linhagens celulares com mutação em PDGFRA a Imatinibe e Crenolanibe. Dai e
colaboradores verificaram que a frequência de mutações deste gene em melanomas é de
4,6% e que são mais comuns nos subtipos lentiginoso acral e de mucosas e concluíram que
pacientes com melanoma com mutações em PDGFRA podem eventualmente se beneficiar
do tratamento com estas duas drogas66.
Os dados do TCGA mostram que as amplificações em PDGFRA ocorrem em
concomitância com amplificações em KIT naqueles pacientes WT (wild type) para BRAF e
RAS. Um estudo recente mostrou que de 137 pacientes com melanoma cutâneo e 14 com
melanoma de mucosas, apenas 0,7% possuíam mutação em PDGFRA67 e dados do nosso
grupo mostram que 14,8% de 43 pacientes com melanoma acral, possuem mutação neste
gene62.
1.7.5.
TERT
O gene TERT codifica a subunidade catalítica da telomerase. Mutações somáticas na
região codificante deste gene são infrequentes em tumores humanos. Mas, mutações
somáticas e germinativas na sua região promotora foram recentemente encontradas com
uma alta frequência em melanomas (71%) e em 16% das linhagens celulares primárias de
câncer68.
Simultaneamente a esta publicação, Horn e colaboradores (2013)69 identificaram que
85% dos melanomas metastáticos, 33% de melanomas primários e 74% de linhagens
celulares derivadas de melanoma metastático, possuem mutações na região promotora do
TERT. Posteriormente, Vinagre e colaboradores (2013)70 avaliaram o perfil mutacional desta
região do TERT em alguns tipos de câncer, encontrando a frequência de 43% em cânceres do
sistema nervoso central, 59% de bexiga, 10% de tireóide e 29% de melanomas cutâneos. Nos
três estudos as mutações mais frequentes eram C228T e C250T, sendo estas mutuamente
exclusivas.
Após essas publicações, alguns trabalhos surgiram com o intuito principal de
caracterizar a frequência dessas mutações em diversos subtipos de melanoma e em diversas
29
populações. Foi evidenciado que mutações neste gene são infrequentes em melanomas
sinonasal (8%)71, possui uma frequência que varia entre 671 e 9,3%62 em melanomas acrais e
que mutações germinativas na região promotora deste gene são raras em melanoma
familial72. No TCGA 64,4% dos 115 pacientes possuíam mutações neste gene, sendo que
23,5% eram C228T e 40,9% eram C250T49.
Uma série de estudos demonstrou que estas mutações são fatores prognósticos
independentes em melanomas cutâneos68, 69, 73, 74. Em conjunto, eles podem indicar que a
presença de mutações na região promotora de TERT seja um potencial preditor biológico de
maior mortalidade e também pode representar um preditor de metástases em pacientes
com melanoma cutâneo73.
1.8. Justificativa
Praticamente não existe informação do perfil molecular dos portadores de melanoma
no Brasil e a população brasileira possui uma característica marcante: a heterogeneidade
étnica regional. O Hospital do Câncer de Barretos (HCB) é um dos maiores hospitais de
câncer no Brasil e abriga uma grande coleção de melanomas de pacientes provenientes de
todos os estados brasileiros, na qual nenhuma análise genética foi realizada.
A definição das características moleculares dos pacientes com melanoma no Brasil
poderá nortear pesquisas futuras no país, a fim de melhorar o tratamento dos pacientes.
Além disso, a definição molecular e evolução clínica dos pacientes brasileiros com melanoma
vão permitir comparações objetivas com os resultados obtidos em outros países.
1.9. Objetivo Geral
Caracterizar o perfil clínico e mutacional de genes alvos de pacientes brasileiros
portadores de melanoma
30
1.10. Objetivos Específicos
1. Avaliar a frequência de mutações nos genes BRAF, NRAS, KIT, PDGFRA e TERT;
2. Associar
as
mutações
com
parâmetros
demográficos,
clínicos
e
histopatológicos;
3. Associar as mutações com a sobrevida dos pacientes.
1.11. Casuística e Métodos
1.11.1. Delineamento e População de Estudo
O presente estudo trata-se de uma coorte retrospectiva, cuja casuística é
quatrocentos e cinquenta e nove pacientes com melanomas diagnosticados na instituição
entre 2001 e 2012.
1.11.2. Critérios de Inclusão e Exclusão
Material biológico armazenado no departamento de patologia do HCB, bem como ter
sido diagnosticado entre os anos de 2001 e 2012 constituem critérios de inclusão, enquanto
que os de exclusão são material biológico insuficiente ou tratamento antes de 2001 ou
depois de 2012.
2. Métodos
2.1. Extração de DNA
Ao menos uma lâmina corada com hematoxilina e eosina foi revisada por um
patologista em cada amostra para assegurar a presença de ao menos 70% de células
tumorais viáveis para a realização das análises. Para a extração de DNA, foi utilizado 3 cortes
de 10 micra para a macrodissecção da região tumoral.
31
A extração de DNA foi realizada utilizando o kit de extração de DNA (QIAamp DNA
MicroKit - Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. De forma geral, o protocolo inclui
desparafinização a 80 °C por vinte minutos, seguido por dois banhos de Xilol, cada um por
cinco minutos, reidratação do tecido tumoral com banhos de etanol em concentrações
crescentes (100, 70 e 50%), cada um por um minuto, e banho em água Milli-Q pelo mesmo
período de tempo.
Em seguida, foi realizada a macrodissecção da área tumoral com agulha hipodérmica
e o tecido tumoral foi incubado overnight à 56 °C e 700 rpm, com 80 µL de ATL, 1 µL de RNA
Carrier e 15 µL de proteinase K. Após, adicionou-se mais 15 µL de proteinase K e incubação
por pelo menos uma hora na mesma temperatura e agitação. Então, houve incubação de 20
minutos, à 98 °C e 600 rpm. Em seguida, adicionou-se 110 µL de tampão AL, 110 µL de
etanol 100% e incubação por 5 minutos. Então, transferiu-se o volume para a coluna e após
2 lavagens com tampões AW1 e AW2, à 14.000 rpm, por 1 minuto, a eluição do DNA foi feita
em 30 µL de água Milli-Q. O DNA foi quantificado no equipamento NanoDrop2000 (Thermo
Scientific).
Já foi relatado que a melanina é um inibidor da PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase), por reduzir a capacidade da polimerase em sintetizar DNA ou por diminuir o
tempo de interação entre a enzima e o DNA molde75. Então, para ultrapassar esta
dificuldade testamos sete protocolos para chegarmos naquele cuja qualidade de DNA fosse
melhor e cuja técnica fosse mais viável (Anexo 1).
Desta forma, o protocolo final e que nos deu o melhor resultado para a purificação da
melanina foi utilizar o OneStep PCR Inhibitor Removal Kit (Zymo Research), que inclui
remover a tampa, quebrar a base da coluna e adicionar 400 µL de água Milli-Q caso a mesma
esteja seca. Em seguida, acoplá-la a um tubo coletor e centrifugar à 8.000g por 3 minutos.
Por fim, colocar a coluna em um tubo 1,5 mL devidamente identificado, transferir o DNA
para a coluna e centrifugar na mesma rotação e tempo.
2.2. Análise Mutacional dos Genes Alvos
Para a análise de mutações nos éxons hotspots dos genes BRAF (éxon 15), NRAS (códon
12, 13 e 61), KIT (éxon 9, 11, 13, 17), PDGFRA (éxon 12, 14, 18) e região promotora do TERT
foi utilizado o sequenciamento de Sanger. O primeiro passo consistiu em amplificar as
32
regiões de interesse utilizando a técnica de PCR, cujas sequências de primers, tamanhos dos
fragmentos e temperatura de annealing estão descritas na Tabela 6.
A reação de PCR foi realizada com um volume final de 15 µL, sob as seguintes condições:
1,5 µL tampão (Qiagen); 2 mM MgCl2 (Qiagen); 200 µM dNTPs (Invitrogen); 0,3 mM de
primer, sense e anti-sense (Sigma Aldrich), 0,5 unidade de Platinum Taq DNA polimerase
(Qiagen) e 50 ng de DNA. A ciclagem da reação consistiu em 15 minutos à 96 °C, 45 segundos
à 96 °C, annealing de 45 segundos e temperatura variável de acordo com o primer, extensão
por 45 segundos à 72 °C e extensão final por 10 minutos na mesma temperatura, sendo que
a reação foi repetida por 45 vezes. Para a análise da PCR foi realizada eletroforese em gel de
agarose 1,5% por 40 minutos à 100 Volts.
Então, 5 µL do produto da PCR foi purificado com 2 µL ExoSap-IT (GE Techonology) por
15 minutos à 37 °C e 80 °C pelo mesmo período de tempo. Para a reação de sequenciamento
foi utilizado 0,3 µL de BigDye (Applied Biosystems), 2,0 µL de tampão para sequenciamento
(Applied Biosystems, USA) e 1 µL de primer (3,2 µM). A ciclagem da reação consistiu em 10
segundos à 96 °C, 5 segundos à 50 °C e 60 °C por 4 minutos, 30 vezes.
A reação de sequenciamento foi purificada com 25 µL de EDTA (125 mM), 1µL de etanol
100% e 1 µL de citrato de sódio (3 M). Então, houve agitação por 2 minutos, seguido de 15
minutos de incubação e centrifugação por 45 minutos à 2.000g. Após, a placa foi invertida
para descartar os reagentes não consumidos, então adicionou-se 35 µL de etanol 70%,
centrifugação por 15 minutos à 1.650g e, após nova inversão, incubou-se a placa por 30
minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a reação foi ressuspendida em formamida
HiDi (Applied Biosystems). O sequenciamento foi realizado no equipamento 3500 series
Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Todas as mutações foram confirmadas por duas
reações independentes.
33
Tabela 6 - Informações da PCR para os genes alvos.
Gene
Sequência do Primer
Forward- 5'-AGTGGATTCGCGGGCACAGA-3'
BRAF - exon 15
NRAS - códon 12/13
NRAS - códon 61
KIT – exon 9
KIT – exon 11
KIT – exon 13
KIT – exon 17
PDGFRA – exon12
PDGFRA – exon14
PDGFRA – exon18
TERT
Reverse- 5'-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3'
Forward- 5'-ATGACTGAGTACAAACTGGT-3'
Reverse- 5'-CTCTATGGTGGGATCATATT-3'
Forward- 5'-TCTTACAGAAAACAAGTGGT-3'
Reverse- 5'-GTAGAGGTTAATATCCGCAA-3'
Forward- 5'-AGAGTAAGCCAGGGCTTTTG-3'
Reverse- 5'-AGACAGAGCCTAAACATCC-3'
Forward- 5'-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3'
Reverse- 5'-GGAGTTCCTTAAAGTCACTG-3'
Forward- 5'-CATGCGCTTGACATCAGTTT-3'
Reverse- 5'-TGACAGACAATAAAAGGCAGCTT-3'
Forward- 5'-GGTTTTCTTTTCTCCTCCAACC-3'
Reverse- 5'-GGATTTACATTATGAAAATCACAGG-3'
Forward- 5'-TCCAGTCACTGTGCTGCTTC-3'
Reverse- 5'-GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT-3'
Forward- 5'-TGGTAGCTCAGCTGGACTGAT-3'
Reverse- 5'-GGGATGGAGAGTGGAGGATT-3'
Forward- 5'-ACCATGGATCAGCCAGTCTT-3'
Reverse- 5'-TGAAGGAGGATGAGCCTGACC-3'
Forward- 5'-AGTGGATTCGCGGGCACAGA-3'
Reverse- 5'-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3'
Tamanho do Fragamento Temperatura de Annealing
254 bp
55,5°C
111 bp
56,5°C
174 bp
56,5°C
272 bp
58°C
266 bp
58°C
212 bp
58°C
249 bp
58°C
260 bp
58°C
245 bp
58°C
251 bp
58°C
235 bp
64°C
2.3. Associação dos Dados Moleculares com os Fatores Demográficos, Clínicos e
Histopatológicos dos Pacientes
A partir dos registros hospitalares dos pacientes foram levantados os dados
demográficos (data de nascimento, gênero, cor e local de nascimento), data do tumor
primário e suas características (localização, subtipo histopatológico, índice de Breslow, Clark,
ulceração e índice mitótico), presença ou ausência de metástases linfonodais regionais e
características de metástases distantes (localização e DHL sérica).
O tempo livre de progressão e a sobrevida específica por melanoma foram
calculados, sendo os pacientes categorizados de acordo com critérios diagnósticos validados
(classificação TNM). A sobrevida global e a sobrevida livre de doença foram calculadas da
data do diagnóstico do tumor primário, da metástase regional e da metástase distante até o
último evento (avaliação ou óbito). Estes dados foram associados com os eventos
moleculares.
34
2.4. Análise Estatística
Para
identificar
associações
entre
as
características
demográficas,
clínicas,
histopatológicas e moleculares, o teste exato de Fisher ou qui-quadrado foram utilizados.
Associações das variáveis à sobrevida livre de doença e global foram avaliadas através de
construção de curvas de sobrevida estimadas com o método de Kaplan Meier e com o teste
de log-rank para avaliar as diferenças entre as curvas. Pacientes portadores de melanoma in
situ foram excluídos das análises de sobrevivência e para esta análise o paciente foi
considerado mutado para o gene quando pelo menos uma região ou sítio possuía alteração.
Análises multivariadas foram realizadas com o método de regressão de Cox para variáveis
que foram significantes na análise univariada ou consideradas de ajuste no modelo
multivariado.
2.5. Questões Éticas
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do HCB 548/2011 (Anexo 2). Por se
tratar de um estudo observacional, do ponto de vista ético é um projeto de baixo risco,
sendo os únicos riscos aos participantes a quebra acidental do sigilo das informações. Para
que isso não ocorresse, a equipe de pesquisa envolvida no estudo tomou todos os cuidados
para não expor as informações dos pacientes. Nenhum membro da equipe tinha ou tem
conflito de interesse quanto a realização da pesquisa.
3. Resultados
No presente estudo, não houve diferença na distribuição entre os gêneros, a maioria dos
pacientes se autodenominou da cor branca (96,5%), residente no ambiente urbano (89,2%) e
possuía idade média de 58 anos (Tabela 7). A localização tumoral mais frequente foi nos
membros (50%) e o subtipo mais predominante na casuística foi o nodular (38,9%), seguido
de disseminativo superficial (34,4%) e acrolentiginoso (21,1%).
35
A maioria dos pacientes possuía estadiamento TNM II ou III e as informações clínicas
mais relevantes, como nível de Clark, Breslow, ulceração e índice mitótico, demonstraram
que a maioria dos pacientes possuía prognóstico desfavorável.
A Figura 12 mostra um exemplo de mutações encontradas em nossa casuística, bem
como o padrão considerado mutado em nosso trabalho. Do total de pacientes, 308 casos
tiveram o gene BRAF sequenciado com êxito (67,1% do total de casos considerados), 290
NRAS (63,1%), 213 TERT (46,4%), 145 KIT (31,6%) e 139 (30,2%) o PDGFRA. O éxon 15 do
gene BRAF encontra-se mutado em aproximadamente 34,1% das amostras e mais da
metade das metástases, bem como das recorrências, apresentam alterações neste gene. Os
hotspots do gene NRAS (códon 12/13 e 61) encontram-se mutados em cerca de 8% das
amostras, sendo que 11% das metástases linfonodais possuem mutações nesse gene. O gene
TERT possui mutações em aproximadamente 34% das amostras, sendo que mais de 50% das
metástases apresentam alterações neste gene. E o gene KIT encontra-se mutado em cerca
de 6% das amostras, enquanto que o PDGFRA possui alterações em aproximadamente 3%
(Tabela 8).
36
Tabela 7 - Características demográficas, clínicas e histopatológicas patológicas dos 459 portadores
de melanoma do Hospital de Câncer de Barretos.
Idade (média/DP)
58,3 (16,0)
Gênero n (%)
Masculino
Feminino
242 (52,7)
217 (47,3)
Cor da Pele n (%)
Branca
Negra
438 (96,5)
16 (3,5)
Ambiente de Moradia n (%)
Rural
Urbana
38 (10,8)
313 (89,2)
Localização Anatômica n (%)
Membros
Tronco
Cabeça e pescoço
Mucosas
215 (50,0)
123 (28,6)
86 (20,0)
6 (1,4)
Tipo Histológico n (%)
Acrolentiginoso
Nodular
Disseminativo Superficial
Lentigo Maligno
Melanoma de Mucosa
Ocular
71 (21,1)
131 (38,9)
116 (34,4)
7 (2,1)
10 (3,0)
2 (0,5)
Clark n (%)
I
II
III
IV
V
9 (2,5)
19 (5,3)
84 (23,3)
157 (43,5)
92 (23,5)
Breslow n (%)
até 1 mm
1.0 a 2.0 mm
2.1 a 4.0 mm
> 4 mm
53 (14,4)
88 (23,9)
85 (23,1)
142 (38,6)
Ulceração n (%)
Presente
Ausente
158 (61,5)
99 (38,5)
Índice Mitótico (mm2) - n (%)
0
10 (4,1)
1
46 (18,8)
>1
189 (77,1)
Estadio TNM n (%)
in situ
I
II
III
IV
14 (3,1)
73 (16,3)
147 (32,9)
133 (29,8)
80 (17,9)
37
.
Figura 8 - Exemplos das mutações encontradas em nossa casuística.
Tabela 8 - Perfil molecular dos portadores de melanoma do HCB de acordo com o desenvolvimento
da doença.
Sítios
BRAF
Primário
28/127 (22,0%)
Metástase linfonodal
19/55 (34,5%)
Metástase à distância 26/51 (51,0%)
Recorrência
5/9 (55,5%)
Sem informação
27/66 (40.9%)
Total
105/308 (34,1%)
NRAS
11/162 (6,8%)
7/66 (10,6%)
5/53 (9,4%)
0/9 (0%)
23/290 (7,9%)
Genes
TERT
29/118 (24,6%)
24/47 (51,1%)
18/39 (46,2%)
2/9 (22,2%)
73/213 (34,3%)
KIT
8/78 (10,3%)
0/29 (0%)
1/29 (3,4%)
0/9(0%)
9/145 (6,2%)
PDGFRA
4/73 (5,5%)
0/28 (0%)
0/29 (0%)
0/9 (0%)
4/139 (2,9%)
38
A Tabela 9 descreve todas as mutações encontradas nos genes analisados. Em nossa
casuística a alteração mais comum em BRAF foi a V600E (Gráfico 1 ), o códon 61 abrange
81% de todas as alterações no gene NRAS (Gráfico 2), enquanto que aproximadamente 80%
das alterações na região promotora de TERT são C250T (Gráfico 3). Além disso, em torno de
45% das mutações em KIT ocorreram no éxon 11 (Gráfico 4 ) e 60% das alterações em
PDGFRA no éxon 12 (Gráfico 5
Tabela 9 - Tipos de mutações encontradas nos 459 pacientes do HCB de acordo com
os genes alvos.
Tipo de Mutação
BRAF
V600E
V600K
V600M
T599I
NRAS
G12A
G12C
G13A
Q61H
Q61K
Q61L
Q61R
TERT
C228T
C250T
n(%)
87(89,7)
8(8,3)
1(1,0)
1(1,0)
1(4,8)
1(4,8)
2(9,5)
1(4,8)
2(9,5)
7(33,3)
7(33,3)
15(20,8)
57(79,2)
Tipo de Mutação
KIT
Asp816Val
Glu562Lys
Glu635Lys
Leu576Pro
Lys642Glu
Pro467Leu
Pro551Leu
Val559Ala
n(%)
1(11,1)
1(11,1)
1(11,1)
1(11,1)
2(22,3)
1(11,1)
1(11,1)
1(11,1)
PDGFRA
Arg590Lys
Val658Ile
GIn828*
Pro581Leu
2(40,0)
1(20,0)
1(20,0)
1(20,0)
39
Gráfico 1 - Frequências das alterações
encontradas no éxon 15 do gene BRAF.
Gráfico 3 - Frequências das alterações encontradas
na região promotora do gene TERT.
Gráfico 2 - Frequências das alterações
encontradas no gene NRAS.
Gráfico 4 - Frequências das alterações
encontradas no gene KIT.
Gráfico 1 - Frequências das alterações encontradas no
gene PDGFRA.
40
A Tabela 10 mostra a distribuição do tipo de amostra (tumor primário/metastático
linfonodal ou órgão distante) ente os pacientes. Um paciente que possuía amostra de tumor
primário, metástase linfonodal e à distância tinha o gene selvagem para BRAF, NRAS e TERT
nas três amostras e WT para KIT na doença linfonodal e metastática. Além disso, outro
paciente com estas três amostras possuía mutação V600E na doença linfonodal e ela se
manteve na metástase à distância, enquanto ele era WT para NRAS na metástase linfonodal
e à distância e WT para TERT nos três níveis da doença (Figura 13).
Um paciente adquiriu a mutação V600E na transição de doença linfonodal para
metastática, enquanto que outro adquiriu essa mesma mutação na transição de doença
primária para a linfonodal. Um paciente adquiriu mutação em NRAS na transição ente tumor
primário e linfonodal. Ao todo quatro pacientes tiveram discordância em relação ao status
mutacional de um gene no tumor primário em relação à doença linfonodal, sendo estes
NRAS, TERT e dois pacientes com discordância em KIT (Figura 13).
Em nossa casuística mutações em BRAF foram mutuamente exclusivas com mutações
em NRAS, ao passo que mutações em TERT ocorrem com uma frequência maior em conjunto
com mutações em BRAF, quando comparadas a NRAS. E mutações em KIT e PDGFRA estão
presentes em uma pequena fração de pacientes com melanoma (Figura 14).
41
Tabela 10 - Distribuição dos sítios analisados nos pacientes incluídos
no estudo.
n(%)
143(40.8)
51 (14.5)
45 (12.9)
8 (2.3)
19 (5.4)
12 (3.4)
1 (0.3)
2 (0.6)
3 (0.9)
66 (18.9)
350 (100)
BRAF
NRAS
TERT
KIT
PDGFRA
BRAF
NRAS
TERT
KIT
PDGFRA
V600E
Primário
P5
Metástase
Linfonodo
Primário
Metástase
Linfonodo
Primário
Metástase
P4
V600E
G12A
Q61H
C250T
Q635K
Q562K
Metástase
Linfonodo
Primário
P4
Metástase
Linfonodo
Primário
P3
Metástase
Linfonodo
Primário
P2
Metástase
Linfonodo
P1
Primário
Gene
P3
V600E V600E
Paciente
Lesão
Linfonodo
Primário
P2
Metástase
Gene
Primário
Lesão
Linfonodo
P1
Paciente
Metástase
Somente primário
Somente metástase linfonodal
Somente metástase à distância
Somente Recorrência
Primário e metástase linfonodal
Primário e metástase à distância
Primário e recorrência
Metástase linfonodal e à distância
Primário, metástase linfonodal e à distância
Sem informação
Total
Linfonodo
Sítio
Legenda
Não avaliado
WT
Mutado
Figura 9 - Padrão de mutação nos pacientes durante a evolução tumoral.
Figura 10 -Distribuição das mutações nos pacientes com melanoma incluídos no estudo.
NA = Não Avaliado.
Legenda
PDGFRA
KIT
TERT
NRAS
BRAF
42
43
De acordo com a Tabela 11, os pacientes com idade até 50 anos possuem frequência
maior de mutações em BRAF (p= 0,014), assim como em TERT (p= 0,006), ao passo que
mutações em PDGFRA ocorrem com maior frequência naqueles pacientes com cor da pele
negra (p= 0,023). Entre os principais parâmetros clínicos e histopatológico tradicionalmente
relacionados ao prognóstico, nota-se pela Tabela 12 que as mutações em BRAF e TERT estão
associadas a diferentes localizações anatômicas, principalmente a região do tronco (p=
0,0001, para ambos) e ao subtipo tumoral disseminativo superficial e nodular,
respectivamente (p= 0,0001, para ambos). Além disso, mutações em TERT estão associadas a
ausência de ulceração (p= 0,037) e valor de DHL menor ou igual 400 U/L.
Tabela 11 - Associação entre os dados demográficos dos 459 pacientes do HCB incluídos no
estudo e as mutações nos genes alvos.
Gênero
Masculino
Feminino
Idade (anos)
≤ 50
> 50
Ambiente de Moradia
Rural
Urbana
Cor da pele
Branca
Negra
*Teste exato de Fisher.
BRAF
WT
Mutado
79
41
64
28
p= 0,658
NRAS
WT
Mutado
134
14
113
7
p=0,272
TERT
WT
Mutado
67
45
58
27
p= 0,236
KIT
WT
Mutado
70
5
56
4
p=1,000*
PDGFRA
WT
Mutado
74
1
56
3
p= 0,205*
36
29
106
40
p= 0,014
WT
Mutado
5
3
69
35
p= 1,000*
WT
Mutado
131
67
10
2
p= 0,344*
82
8
164
13
p= 0,658*
WT
Mutado
15
1
140
11
p= 1,000*
WT
Mutado
234
18
11
3
p= 0,088*
33
33
91
39
p= 0,006
WT
Mutado
5
3
47
39
p= 0,728*
WT
Mutado
114
69
10
2
p= 0,217*
36
2
89
7
p= 1,000*
WT
Mutado
4
0
27
4
p= 1,000*
WT
Mutado
117
8
8
1
p= 0,476*
37
1
92
3
p= 0,872*
WT
Mutado
4
0
27
4
p= 1,000*
WT
Mutado
122
2
7
2
p= 0,023*
44
Tabela 12 - Associação entre os dados clínicos dos 459 pacientes do HCB incluídos no estudo e as
mutações nos genes alvos.
Breslow
até 1mm
1.1 a 2.0 mm
2.1 a 4,0 mm
>4
Índice mitótico (mm2)
0
até 1
>1
Localização Anatômica
Membros
Tronco
Cabeça e pescoço
Mucosas
Tipo Histológico
Acrolentiginoso
Nodular
Disseminativo Superficial
Lentigo Maligno
Melanoma de Mucosa
Ocular
Ulceração
Presente
Ausente
Estadio TNM
in situ
I
II
III
IV
Clark
I
II
III
IV
V
BRAF
WT
Mutado
7
5
24
10
27
20
50
19
p= 0,327*
WT
Mutado
1
0
17
7
80
34
p= 1,000*
WT
Mutado
84
26
19
29
22
8
5
0
p= 0,0001*
WT
Mutado
50
8
31
22
24
23
1
0
8
0
1
0
p= 0,0001*
WT
Mutado
58
20
22
16
p= 0,072
WT
Mutado
0
0
13
8
49
18
52
29
26
14
p= 0,627
WT
Mutado
0
1
3
1
19
11
40
29
42
13
p= 0,114*
NRAS
WT
Mutado
21
0
40
2
47
6
80
9
p= 0,347*
WT
Mutado
1
0
28
1
108
7
p= 0,511*
WT
Mutado
125
11
59
6
38
2
5
0
p= 0,840*
WT
Mutado
53
7
63
6
53
3
2
0
8
0
1
0
p=0,710*
WT
Mutado
84
8
44
2
p=0,496*
WT
Mutado
2
0
30
0
82
7
77
10
50
4
p=0,361*
WT
Mutado
1
0
5
0
42
1
82
11
54
5
p=0,356*
TERT
WT
Mutado
11
4
20
13
26
16
47
19
p= 0,603
WT
Mutado
1
0
17
12
75
25
p= 0,143*
WT
Mutado
78
23
18
28
15
13
5
1
p= 0,0001*
WT
Mutado
53
6
21
23
26
19
0
1
9
0
1
0
p= 0,0001*
WT
Mutado
49
19
20
19
p= 0,037
WT
Mutado
0
1
13
10
49
19
43
25
18
15
p= 0,214*
WT
Mutado
1
0
2
1
16
14
46
22
33
15
p= 0,593*
KIT
WT
Mutado
8
0
21
1
23
5
45
3
p= 0,310*
WT
Mutado
1
0
14
2
75
7
p=0,671*
WT
Mutado
66
8
26
0
17
1
5
0
p=0,303*
WT
Mutado
45
7
18
1
33
1
0
0
9
0
1
0
p=0,381*
WT
Mutado
45
6
16
2
p=1,000*
WT
Mutado
0
0
13
0
47
4
41
4
22
1
p=0,848*
WT
Mutado
1
0
1
0
17
0
41
4
34
5
p=0,484*
PDGFRA
WT
Mutado
8
0
21
1
25
3
48
0
p= 0,088*
WT
Mutado
1
0
16
0
79
3
p= 1,000*
WT
Mutado
70
4
26
0
18
0
4
0
p= 0,531*
WT
Mutado
48
4
19
0
34
0
0
0
8
0
1
0
p= 0,356*
WT
Mutado
48
3
17
1
p=1,000*
WT
Mutado
0
0
12
1
49
1
43
2
23
0
p=0,437*
WT
Mutado
1
0
1
0
16
1
42
3
39
0
p=0,339*
47
20
35
11
p= 0,090
61
8
43
3
p= 0,440*
52
18
37
9
p= 0,001
61
6
43
1
p= 0,309*
65
1
41
3
p= 0,307
DHL
≤400
>400
*Teste exato de Fisher.
45
A sobrevida específica por câncer pode ser estimada em 459 pacientes, com média
de 88,8 meses (DP: 3,8), mediana de 68,2 meses (DP: 10.4) e em 5 anos de 51,1% (Figura 15).
Variáveis clínicas como ulceração (p= 0,101), idade (p= 0,078), índice mitótico (p= 0,542) e
valor de DHL (p= 0,397), não foram associadas a diferentes taxas de sobrevida. No entanto, o
estadiamento TNM (p= 0,001), o gênero (p= 0,0001), a localização anatômica (p= 0,0001), o
subtipo histológico (p= 0,0009), o nível de Clark (p= 0,0001) e espessura de Breslow (p=
0,0001), foram fatores associados a diferentes taxas de sobrevida.
Além disso, pela Tabela 13 nota-se que a presença ou ausência das mutações nos
cinco genes não conferem diferentes taxas de sobrevida por melanoma em cinco anos para
os pacientes. As Tabela 14 e 15 demonstram que também não há diferença na sobrevida
específica por câncer pela associação entre as mutações nos genes alvos com as
características demográficas, clínicas, e histopatológicas, respectivamente.
A análise multivariada demonstrou que o estadiamento TNM IV, a localização
anatômica e o nível de Clark foram associados de forma independente a diferentes taxas de
sobrevida (Tabela 16).
Figura 11 - Sobrevida livre de doença de 459 pacientes com melanoma.
46
Tabela 13 - Sobrevida específica por câncer dos 459 pacientes do HCB de acordo com o
status mutacional dos genes alvos.
Variável molecular
BRAF
NRAS
TERT
KIT
PDGFRA
Categoria
WT
Mutado
WT
Mutado
WT
Mutado
WT
Mutado
WT
Mutado
n
141
69
245
21
123
72
124
9
128
4
Sobrevida em 5 anos (%)
42,1
33,3
46,1
31,6
45,3
39,5
38,4
48,6
40,8
0
p
0,619
0,587
0,251
0,898
0,553
Tabela 14 - Sobrevida específica por câncer dos 459 pacientes do HCB de acordo com o status
mutacional dos genes alvos e características demográficas.
Gênero
Masculino
Feminino
BRAF
WT
Mutado
NRAS
WT
Mutado
TERT
WT
Mutado
KIT
WT
Mutado
PDGFRA
WT
Mutado
78
41
63
28
p= 0,686
133
14
112
7
p= 0,660
66
45
57
27
p= 0,400
69
5
55
4
p= 0,929
73
1
55
3
p= 0,528
35
29
105
40
p= 0,511
81
8
163
13
p= 0,556
32
33
90
39
p= 0,400
35
2
88
7
p= 0,822
36
1
91
3
p= 0,547
68
35
5
3
p= 0,502
139
11
15
1
p= 0,273
46
39
5
3
p= 0,403
26
4
26
4
p= nc
p= nc
129
67
10
2
p= 0,802
232
18
11
3
p= 0,544
112
69
10
2
p= 0,863
115
8
8
1
p= 0,151
120
2
7
2
p= 0,141
Idade
≤ 50
> 50
Ambiente da Moradia
Urbana
Rural
Cor da pele
Branca
Negra
nc = não calculado pelo SPSS.
4
0
4
0
47
Tabela 15 - Sobrevida específica por câncer dos 459 pacientes do HCB de acordo com o status
mutacional dos genes alvos e características clínicas.
WT
BRAF
Mutado
WT
NRAS
Mutado
WT
TERT
Mutado
WT
KIT
Mutado
PDGFRA
WT
Mutado
Estadio TNM
I
II
III
IV
13
8
47
18
52
29
26
14
p= 0,922
30
80
77
50
7
5
24
10
26
20
49
20
p= 0,258
21
40
46
80
48
31
24
1
1
8
51
63
53
2
1
8
0
7
10
4
p= nc
13
10
47
19
43
25
18
15
p= 0,148
13
45
41
22
11
4
20
13
25
16
46
20
p= 0,222
8
21
22
45
51
21
29
0
1
9
43
18
33
0
1
9
0
4
4
1
12
47
43
23
p= nc
1
1
2
0
p= nc
Breslow
até 1mm
1.1 a 2.0 mm
2.1 a 4,0 mm
>4
Tipo Histológico
Acrolentiginoso
Nodular
Disseminativo superficial
Melanoma lentigo maligno
Ocular
Melanoma de mucosa
8
22
23
0
0
0
0
2
6
9
p= nc
p= nc
7
6
3
0
0
0
p= nc
6
23
19
1
1
0
0
1
5
3
8
21
24
48
p= nc
p= nc
0
1
3
0
p=nc
7
1
1
0
0
0
46
19
34
0
1
8
p= nc
4
0
0
0
0
0
p= nc
Clark
I
II
III
IV
V
Ulceração
Presente
Ausente
Localização Anatômica
Membros
Tronco
Cabeça e pescoço
Mucosas
0
3
18
39
42
1
1
11
29
13
0
0
1
11
5
1
2
14
45
33
0
1
14
22
15
1
1
16
40
34
0
0
0
4
5
1
1
15
41
39
0
0
1
3
0
p= nc
p= nc
p= nc
p= nc
p= nc
57
20
21
16
p= 0,863
83
8
43
2
p= 0,056
48
19
19
19
p= 0,433
44
6
15
2
p= 0,702
47
3
16
1
p= 0,540
82
19
22
5
123
59
38
5
76
23
18
28
15
13
5
1
p= 0,276
64
26
17
5
68
26
18
4
26
29
8
0
p= nc
nc = não calculado pelo SPSS.
1
5
41
81
54
11
6
2
0
p= nc
8
0
1
0
p= nc
4
0
0
0
p= nc
48
Tabela 16 - Análise multivariada de sobrevida específica por melanoma dos 459
pacientes do HCB.
Variável
Estadio TNM
I
II
III
IV
Localização Anatômica
Membros
Tronco
Cabeça e Pescoço
Mucosas
Clark
I
II
III
IV
V
Idade
n
HR
95% IC (HR)
p-valor
65
109
97
30
0,116
0,181
0,333
1,000
0,055-0,245
0,105-0,310
0,201-0,553
-
< 0,001
< 0,001
< 0,001
-
153
98
48
2
0,183
0,255
0,344
1,000
0,043-0,777
0,060-1,091
0,078-1,507
-
0,021
0,065
0,157
-
1
17
73
135
75
0,708
0,213
0,792
1,000
0,640
0,094-5,327
0,047-0,959
0,472-1,327
0,419-0,979
0,992-1,017
0,737
0,044
0,376
0,040
0,474
1,004
49
4. Discussão
4.1. Caracterização demográfica, clínica e histopatológica dos pacientes e amostras
Os pacientes incluídos neste estudo fazem parte de um trabalho maior, cujo objetivo
principal se centrou em observar as características dos melanomas e seus fatores
prognósticos, em uma população pouco estudada anteriormente, no sentido de contribuir
com um esforço comum de caracterizar este tipo tumoral. Neste foram incluídos cerca de
mil pacientes de origem única hospitalar – Hospital de Câncer de Barretos, com parte deles
incluída nesta casuística16.
A média de idade dos pacientes incluídos neste estudo foi de aproximadamente 58 anos
e não houve diferença na distribuição da doença, de acordo com o gênero. A média de idade
encontrada em outros estudos foi similar14,
76-78
, no entanto, apesar do nosso modelo
multivariado não demonstrar o gênero como fator prognóstico independente, outros
estudos demonstraram resultados apostos16, 77, 79.
Nossa casuística é predominantemente caucasiana (96,5%) e como encontrado
anteriormente nesta população, observamos uma prevalência do subtipo histológico
disseminativo superficial, seguido de melanoma nodular, no entanto, encontramos uma
frequência considerável do subtipo acrolentiginoso (21,1%), o que não é observado em
outros estudos78, 79. Este subtipo é mais comum em populações negras, com frequência em
torno de 30%80, 81, enquanto que em populações caucasianas, já foi relatado frequências em
torno de 10%78.
Um estudo realizado em 2008 com 354 pacientes com melanoma da população
brasileira, demonstrou uma frequência de 22,3% do subtipo acrolentiginoso82, sendo esta
similar ao encontrado no presente estudo. Já em um estudo mais extensivo já publicado
pelo nosso grupo de pesquisa, que incluiu cerca de mil pacientes, com parte deles incluída
nesta casuística, a porcentagem de subtipo acrolentiginoso foi de acordo com o esperado na
prevalência de populações caucasianas, cerca de 7%16. Portanto, a diferença encontrada na
frequência deste subtipo, provavelmente está associada ao tamanho amostral.
Em nosso estudo demonstramos que localização anatômica é um fator prognóstico
independente, como já descrito anteriormente83. Dados de uma meta-análise que abrangeu
vários continentes e localizações geográficas, demonstrou a possibilidade de existir
50
diferentes caminhos etiológicos de desenvolvimento do melanoma por localização
anatômica, isto em virtude das diferenças de risco observadas para o desenvolvimento da
doença em nevos e por padrões de exposição ao sol84. Foi demonstrado em outros estudos
uma predominância de extremidades (27,3%), seguido da região da cabeça e pescoço
(25,7%) e tronco (23,1%)40, 78, 76, entretanto, na população brasileira foi demonstrado pelo
nosso grupo16, assim como em outros estudos, a predominância da região dos membros,
seguido do tronco e região da cabeça e pescoço14, 77 e este trabalho vai de encontro aos já
publicados em nossa população.
O nível de Clark possui cinco estágios que medem a extensão do melanoma e,
segundo a AJCC, não é um critério prognóstico obrigatório, visto que quando se considera o
índice mitótico, ele não é um fator prognóstico independente. No entanto, ele ainda é
importante para aqueles melanomas finos83. No presente trabalho, quase 70% dos pacientes
possuíam nível de Clark entre IV e V, sendo que esta frequência alta também foi observada
no outro trabalho publicado pelo nosso grupo16, e o que vai de encontro com um estudo que
incluiu 430 pacientes brasileiros com melanoma e mostrou que a maioria deles possuía
predominantemente estes mesmos níveis14. Além disso, um outro estudo que incluiu 198
pacientes desta mesma população também demonstrou que 60% dos pacientes possuíam
níveis mais avançados de Clark77. Quando se observa outras populações, não parece haver
diferença neste padrão78.
O índice de Breslow mede a profundidade de invasão das células neoplásicas no tecido
epitelial, é considerado o principal fator prognóstico nos melanomas localizados14 com
relato que este índice está associado a recorrência e capacidade metastática do tumor 83. Em
nossa casuística 38,6% dos pacientes possuíam Breslow acima de 4mm e esta variável está
associada a menores índices de sobrevida (p= 0,0001). No entanto, não apareceu como fator
prognóstico independente em nosso modelo multivariado, como já amplamente
conhecido83. Isso se deve ao Breslow fazer parte do componente T do estadiamento, que faz
parte da variável testada como estadio clínico.
Na literatura internacional, a espessura de Breslow menor do que 2mm é encontrado na
grande maioria dos trabalhos76, 78, 85, 86. Moreno e colaboradores, em 2012, encontraram em
462 pacientes brasileiros com melanoma uma maior frequência de índice de Breslow menor
do que 1 mm (45%)14, enquanto que um outro estudo com 199 pacientes demonstrou uma
frequência de mais de 70% dos pacientes com Breslow maior do que 1mm 77. O primeiro
51
estudo foi conduzido na região sul do país, onde o índice de desenvolvimento humano
municipal é maior, quando comparado a região nordeste, alvo do segundo estudo 87. Isto
pode significar maior acesso a saúde pública na primeira região, o que justificaria seu
achado.
Uma característica do nosso centro é ser altamente especializado no tratamento
oncológico e público, o que favorece o encaminhamento de pacientes com doença avançada
para tratamento de alta complexidade, o que pode explicar tanto a espessura média de
Breslow ser mais alta que a literatura internacional, bem como estádio TNM avançado, tal
como observado por nosso grupo e também no trabalho conduzido em uma região com
baixo índice de desenvolvimento humano municipal do nosso país16, 77.
A ulceração é uma perda do epitélio no local do tumor, enquanto que o índice mitótico é
a mensuração da taxa de proliferação do tumor primário, ambos importantes fatores
prognósticos de melanoma, segundo a AJCC83. Em nossa casuística mais de 60% dos
pacientes apresentaram ulceração tumoral, enquanto que 70% destes apresentaram índice
mitótico maior do que um, o que esta associado, portanto, a menor sobrevida dos pacientes.
Nossos resultados são semelhantes com os encontrados em outros trabalhos conduzidos na
população brasileira14, 77, inclusive com o trabalho publicado pelo nosso grupo 16. Além disso,
esta característica tumoral se manteve em estudos com outras populações78, 88.
Antes de mais nada, é importante frisar que um estudo retrospectivo sempre enfrenta
dificuldades em obter informações e material de qualidade. Esta é a maior explicação do
total de pacientes incluídos serem mais de 450 e apenas uma fração deste universo
apresentar dados clínicos e histopatológicos completos como amostra adequada e de
qualidade para análise de todos os genes de interesse.
4.2. Características moleculares e suas associações com as demais variáveis estudadas
e a sobrevida
O gene BRAF é o que possui papel mais importante na tumorigênese do melanoma,
sendo que a primeira terapia-alvo aprovada pelo FDA destinada a esta câncer é contra a sua
alteração mais frequente e que acontece neste gene, a mutação V600E 53. No presente
trabalho a frequência de mutações em BRAF foi de aproximadamente 34%, sendo a mutação
V600E a mais comum, representando quase 90% das alterações. Muitos estudos visam
52
analisar a frequência deste genótipo mutante em BRAF em diversas populações, no entanto,
variações são comumente encontradas. Um estudo conduzido por Mazurenko e
colaboradores em 2015, mostrou que 55% dos 137 pacientes com melanoma possuíam
mutações em BRAF67, além disso, os dados do estudo do TCGA mostraram que 52% dos 331
pacientes, possuíam mutações neste gene49.
Estes estudos encontraram frequências maiores de mutações em BRAF, quando
comparado com o nosso estudo. Especificamente no caso do TCGA, provavelmente isto seja
em virtude da grande maioria das amostras ser metastática, sabidamente com frequências
maiores de mutações neste gene49, além disso, não foram incluídas amostras do subtipo
lentiginoso acral, visto que sabe-se que ele possui característica genética diferente dos
demais, com frequências menores de mutações em BRAF62.
Um estudo realizado na população japonesa mostrou que mutações neste gene ocorrem
em 30,4% dos 171 pacientes89, sendo esta frequência a mais próxima do nosso estudo,
embora nossa casuística seja maior. Ao observar a população deste estudo, nota-se que o
subtipo acrolentiginoso também possui uma representatividade importante, ao mesmo
tempo em que as amostras primárias representam a maioria da casuística, assim como no
presente trabalho, o que poderia explicar as frequências similares. Embora existam
diferenças nas frequências das mutações quando compara-se os trabalhos, em todos eles a
mutação V600E é mais frequente, seguida de mutações V600K49, 67, 89.
Muitos trabalhos mostram a predominância de mutações em BRAF em pacientes
jovens49, 89 e neste estudo encontramos associação entre pacientes até 50 anos e alterações
neste gene. Além disso, encontramos associação entre mutações em BRAF e localização
anatômica no tronco e ao subtipo disseminativo superficial. Um estudo que analisou 66
pacientes com tumores primários, encontrou associação entre mutações neste gene e
localização tumoral no tronco, no entanto, também demonstrou associação entre mutações
neste gene e melanomas finos e ausência de ulceração90, o que não foi observado no
presente estudo. Thomas e colaboradores em 2015 mostraram que em 812 tumores
primários de melanoma, as mutações em BRAF estavam associadas ao subtipo disseminativo
superficial e nodular, e também demonstraram associações desta mutação com índice
mitótico91, o que não foi observado em nosso estudo.
Estes dois artigos demonstraram que mutações em BRAF
não estão associadas a
sobrevida específica por câncer90, 91 e este trabalho vai de encontro a estes achados. Quando
53
se analisa esses parâmetros em populações metastáticas, há evidência de que mutações em
BRAF também estão associadas aos subtipos histopatológicos disseminativo superficial e
nodular, bem como a localização no tronco92.
Em nosso estudo aproximadamente 8% das amostras possuíam mutações em NRAS,
entretanto, não encontramos associações entre mutações neste gene e características
clínicas e de sobrevida dos pacientes. Quando observamos os trabalhos que analisaram
tumores primários ou que estes eram mais predominantes na casuística, como em nosso
estudo, nota-se que a frequência de mutações em NRAS está entre 10,6%67 e 14%90, sendo
que o trabalho com maior casuística observou a frequência de 13% em 912 pacientes91. Ao
passo que Carlino e colaboradores, em 2014, encontraram uma alta frequência de mutações
em NRAS, sendo 32% dos 193 pacientes com metástase a distância93, assim como na
população analisada pelo TCGA, a frequência de mutações neste gente também foi alta,
aproximadamente 28% dos 331 pacientes analisados49. A diferença de frequências de
mutações observadas nos estudos em pacientes com tumor primário e metastáticos, pode
ser justificada pelo melanoma ser uma doença que se desenvolve pelo acúmulo de
mutações, logo, espera-se que tumores primários possuam frequências menores destas
alterações, quando comparado com tumores avançados5. Além disso, este trabalho
corrobora com outros que demonstraram que mutações em BRAF e NRAS são mutuamente
exclusivas e que o códon 61 é a localização mais frequentemente mutada neste gene.
Assim como no presente trabalho, outros não demonstraram associações entre
mutações em NRAS e características clínicas e de sobrevida89,
94
, entretanto, Thomas e
colaboradores, em 2015, encontraram associação entre mutações neste gene e tumor
localizado nas extremidades, bem como presença de mitoses, mas não encontraram
associações com a sobrevida dos pacientes91, ao passo que Egberts e colaboradores, em
2016, encontraram relação entre mutações em NRAS e pacientes mais velhos, melanomas
mais profundos e sobrevida livre de metástase à distância90.
A importância de mutações na região promotora do gene TERT na tumorigênese de
melanoma foi recentemente descoberta68,
69
e este parece ser importante em estágios
iniciais da doença em tumores que se desenvolvem a partir de lesões precursoras 5. Em
virtude de ser uma descoberta recente, ainda não há uma vasta gama de artigos que
analisou a frequência destas mutações em melanomas.
54
Apesar das variações de frequência entre os estudos, em comum encontra-se o fato de
que esta é elevada. O TCGA encontrou que 64,4%49 dos pacientes possuíam mutações na
região promotora deste gene, assim como Egberts e colaboradores, em 2016, mostraram
frequência de 47,3% em 96 pacientes e a análise de 362 melanomas mostrou uma
frequência de mutações de 43%95. Em nossa casuística, a frequência de mutações foi de
34,4%, que apesar de alta é bastante inferior aos demais estudos. Este achado pode ser
justificado por Liau e colaboradores, em 2014, demonstrarem que mutações nesta região do
gene TERT serem incomuns em melanomas acrolentiginoso (6%)96 e nossa casuística possuir
uma representatividade importante deste subtipo de melanoma. Na literatura, a mutação
mais frequente encontrada em TERT é a C250T e as duas mutações são mutuamente
exclusivas, bem como ocorrem em concomitância com mutações em BRAF49,
90
,
características estas também encontradas neste estudo.
No presente trabalho encontramos associação entre mutações neste gene e idade
inferior a 50 anos, bem como associação com tumores localizados no tronco, ao passo que
foi demonstrado esta associação em pacientes mais velhos e tumores localizados na região
da cabeça e pescoço e extremidades90. Além disso, foi demonstrado a associação entre
estas mutações e melanoma nodular e disseminativo superficial95, bem como com doença
mais profunda90, 95, 97, no entanto, no presente estudo foi demonstrado somente associação
com o subtipo nodular.Um trabalho conduzido por Macerolla e colaboradores, em 2015, não
demonstrou relação entre as mutações e presença de ulceração, entretanto, houve
associação com índice mitótico, o que não foi observado em nosso estudo97.
Foi demonstrado em outro trabalho que mutações em TERT não estão relacionados a
sobrevida90, assim como o que foi encontrado neste estudo, ao passo que outros trabalhos
demonstram que esta alteração está associada a pior sobrevida global95, 98. Assim, um artigo
recente concluiu que mutação na região promotora de TERT é um potencial marcador
biológico preditor de mortalidade mais elevada, assim como preditor de metástases em
pacientes com melanoma cutâneo98.
O gene KIT encontra-se mutado, nesta casuística, em cerca de 6% dos pacientes e ocorre
de forma predominante em melanomas acrolentiginoso (88,9%), sendo que apenas um
paciente diferia do restante, apresentando o subtipo nodular. De forma similar, Yimalz e
colaboradores encontraram frequência de 8,5% e uma distribuição equivalente das
mutações nestes dois subtipos de melanoma99. Além disso, como em nosso estudo, eles não
55
encontraram relação com sobrevida e com variáveis clínicas, no entanto, também
demonstraram uma frequência maior de alterações no éxon 11 99. Outros estudos prévios
também verificaram frequências de mutações parecidas, bem como predominância destas
no subtipo acrolentiginoso e no éxon 11100, 101, no entanto, um artigo na população Coreana,
demostrou uma frequência maior destas alterações no éxon 13 do gene KIT102.
Há na literatura uma grande escassez de estudos quanto à avaliação de mutações em
PDGFRA em melanomas. A maior análise deste gene na doença foi conduzida por Dai e
colaboradores, em 2013, onde eles observaram uma frequência de 4,6% de mutações em
351 pacientes e ausência de associação destas alterações com parâmetros clínicos,
entretanto, observaram a relação com o subtipo acrolentiginoso, o qual representava 56,2%
das alterações66. De forma semelhante, nosso estudo encontrou uma frequência de 2,9% e
relação com o subtipo acrolentiginoso. Foi relatado em outro estudo que alterações no gene
PDGFRA ocorrem em cerca de 4,0% dos 137 pacientes com melanoma67 e um estudo que
incluiu 17 pacientes da população japonesa não encontrou mutações neste gene103.
Em alguns pacientes o nosso estudo analisou as mutações em mais de um sítio, sendo
que em dois pacientes haviam concordância do status mutacional entre estes, o que sugere
que nestes pacientes o mecanismo de oncogênese se estabeleceu por alterações em outros
genes ou por outros tipos de modificações genéticas não analisadas neste estudo. Sabe-se
que o melanoma é um acúmulo de alterações genéticas, que durante o processo de
tumorigênese são selecionadas por conferirem vantagem proliferativa5. Neste sentido, dois
pacientes adquiriram a mutação durante o desenvolvimento da doença, o que sugere que
nestes pacientes, estas mutações contribuíram para potencializar a taxa proliferativa e a
capacidade de metastização da doença. Além disso, em nossa casuística quatro pacientes
diferiram quanto o status mutacional nos diferentes sítios, o que já foi observado em outros
estudos104,
105
. Em um artigo recente de Bradish e colaboradores eles postularam duas
hipóteses para explicar este fenômeno, sendo a primeira a heterogeneidade tumoral e a
segunda a existência de dois melanomas primários que podem produzir resultados
discordantes se o primeiro melanoma primário é testado, enquanto que o segundo foi o
responsável por originar a metástase106.
Neste estudo a nossa casuística foi maior para os dados clínicos, visto a dificuldade de
amplificação das nossas amostras. Solucionamos parte do problema estabelecendo um
protocolo que eliminasse um dos inibidores desta reação, a melanina, no entanto, a
56
qualidade das amostras diminuiu consideravelmente, o que continuou dificultando a
amplificação e, muitas vezes, o sequenciamento. Além disso, em nossa instituição o formol
tamponado foi utilizado para armazenamento de tecido biológico somente a partir de
2005/2006, o que torna as amostras anteriores a este período um material de baixa
qualidade e altamente degradado. Para mostrar isto, de forma aleatória selecionados 10
amostras de 2001 a 2007 e realizamos uma PCR para o gene BRAF (Anexo 3). Observamos
uma baixa taxa de sucesso até 2004 e a partir de 2005 o número de amostras amplificadas
aumentou de forma considerável.
Devido a dificuldade de inserção do subtipo lentiginoso acral nos estudos, visto que ele
é uma forma rara de melanoma, pouco se conhece sobre suas alterações moleculares, o que
dificultou comparações mais profundas em relação a ele em nosso trabalho e o que nos fez
escolher por publicar nossos achados sobre este subtipo separadamente do restante desta
casuística (Anexo 4). Provavelmente a informação mais contundente seja que este possui
perfil molecular distinto dos demais subtipos de melanoma62. Nesse sentido, o TCGA, maior
análise molecular de melanomas em larga escala já realizado até este momento, não incluiu
este subtipo, o que corrobora para que tenhamos mais perguntas, do que respostas, e o que
justifica que outros trabalhos existam para respondê-las.
5. Conclusão
De acordo com nossos objetivos podemos concluir:
1. Conforme demonstrado, de forma inédita, avaliamos em uma população
brasileira portadora de melanoma, a frequência de mutações nos genes BRAF
(34,1%), NRAS (7,9%), KIT (6,2%), PDGFRA (2,9%) e TERT (34,2%);
2. De acordo com características demográficas, clínicas e histopatológicas
identificamos que mutações em BRAF estão associadas a pacientes mais
jovens, assim como mutações em TERT e mutações em PDGFRA a pacientes
com cor da pele negra. Além disso, mutações em BRAF e TERT estão
associadas a diferentes localizações anatômicas, principalmente a região do
tronco e ao subtipo tumoral disseminativo superficial e nodular,
respectivamente). Ainda, mutações em TERT estão associadas a ausência de
ulceração (p= 0,037) e valor de DHL menor ou igual 400 U/L.
57
3. A sobrevida dos pacientes teve associação com fatores prognósticos já
conhecidos em análise univariada e multivariada. Nenhuma mutação
estudada foi associada a diferenças de prognóstico.
Nosso estudo também pôde demonstrar que nossa população possui doença avançada e
fatores prognóstico desfavoráveis. De forma geral, os pacientes possuem perfil molecular
similar ao que se observa em outras populações, principalmente aquelas cuja casuística se
assemelha ao deste estudo, e as frequências dos tipos de mutações são semelhantes. Por
fim, devido a frequência expressiva das mutações estudadas, os portadores de melanoma
brasileiros podem se beneficiar das terapias-alvo já empregadas e futuras.
58
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7. Anexos
Anexo 1 – Padronização de protocolo de purificação da melanina testando a PCR para
BRAF éxon 15. Ao todo foram testados 7 protocolos, aqui apresentado aqueles que
funcionaram. Protocolo A- amostras purificadas por eletroforese e com o Kit Wizard® SV Gel
and PCR Clean-Up System (Promega); B- amostras purificadas por eletroforese e com o Kit
GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e C- amostras purificadas com o Kit OneStep PCR
Inhibitor Removal Kit (Zymo Research).
A - PCR para BRAF éxon 15 das amostras
purificadas com o Kit Wizard® SV Gel and
PCR Clean-Up System (Promega).
PM= Peso Molecular = 100 bp. CP = Controle Positivo.
CN = Controle negativo.
B – PCR para BRAF éxon 15 das amostras
purificadas com o Kit GeneJET™ PCR
Purification Kit (Fermentas).
Para este teste não houve amostra D, pois não havia mais
lâmina disponível para extração. Entretanto, este era um
caso que já havia funcionado pelo método convencional de
extração (Kit QIAmp DNA Micro Kit- Qiagen) e utilizado
apenas como comparativo. PM = Peso Molecular = 100 bp.
CP = Controle Positivo. CN = Controle negativo.
C – PCR para BRAF éxon 15 das
amostras purificadas com o Kit
OneStep PCR Inhibitor Removal
Kit (Zymo Research).
PM= Peso Molecular = 100 bp. CP =
Controle Positivo. CN = Controle
negativo.
68
Anexo 2 - Aprovação do presente estudo pelo Comitê de Ética em pesquisa do HCB.
.
69
Anexo 3 – Teste para comparar a taxa de sucesso de amplificação de BRAF de amostras
entre os anos de 2001 a 2007. Foram selecionadas 10 amostras de cada ano de forma
aleatória.
D
A
B
E
C
F
G
PM = Peso molecular. A – amostras de 2001; B – 2002; C – 2003; D – 2004; E – 2005; F – 2006; G – 2007.
70
Anexo 4 - Artigo publicado pelo nosso grupo com dados preliminares deste trabalho, cujo
objetivo foi analisar o perfil molecular de pacientes com o subtipo de melanoma lentiginoso
acral.