Reinan Sena Da Costa
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FACULDADE MARIA MILZA BACHARELADO EM BIOMEDICINA REINAN SENA DA COSTA DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS LEUCEMIAS LINFÓIDES ATRAVÉS DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO: REVISÃO GOVERNADOR MANGABEIRA-BA 2016 REINAN SENA DA COSTA DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS LEUCEMIAS LINFÓIDES ATRAVÉS DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO: REVISÃO Monografia apresentada ao Curso de Bacharelado em Biomedicina da Faculdade Maria Milza, como requisito parcial para obtenção do título de graduado. Profª Msc. Ana Paula Castro Melo (Orientadora) Profª. Drª. Luciana Souza de Aragão França (Co-Orientadora) GOVERNADOR MANGABEIRA-BA 2016 Dados Internacionais de Catalogação Costa, Reinan Sena da C837d Diagnóstico diferencial das leucemias linfóides através da imunofenotipagem por citometria de fluxo: revisão / Reinan Sena da Costa. – 2016. 43 f. Orientador: Profª. Msc. Ana Paula Castro Melo Co-Orientadora: Profª. Drª. Luciana Souza de Aragão França Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) – Faculdade Maria Milza, 2016. REINAN SENA DA COSTA 1. Leucemia. 2.. I. Melo, Ana Paula. II. Título. CDD: 616.99419 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS LEUCEMIAS LINFÓIDES ATRAVÉS DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO: REVISÃO Aprovada em ___/__/201__ BANCA DE APRESENTAÇÃO ___________________________________________ Profª. Msc. Ana Paula Castro Melo Faculdade Maria Milza-FAMAM __________________________________________ Profº. Msc. Paulo R. R. Mesquita Faculdade Maria Milza-FAMAM ___________________________________________ Prof° Marcelo Quintana Especialista em Hematologia e Hemoterapia-UFRJ Coordenador de curso e Docente da Faculdade Maurício de Nassau Diretor- sócio da CapacitaLab GOVERNADOR MANGABEIRA-BA 2016 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pelo dom da vida e por todas as oportunidades que surgiram ao longo dessa caminhada. Obrigado a Faculdade Maria Milza e toda sua equipe. Ao PROINC-FAPESB e a Profª. Drª Catiane Souza pela concessão da Bolsa de Iniciação Cientifica e todos os ensinamentos. Aos mestres e orientadores, em especial a Profª. Drª. Luciana França e Msc. Ana Paula Castro por sua disponibilidade e disposição, suas orientações foram fundamentais para a conclusão desse trabalho. Aos colegas de classe, a toda minha família, a minha noiva, meus amigos que sempre torceram e apoiaram muito obrigados. Obrigado as empresas pelos estágios (Hospital Regional de Santo Antonio de JesusHRSJ, Instituto CardioImagem e a Diagnoson a+) e toda sua equipe (especialmente aos preceptores e aos colegas de bancadas) por seus ensinamentos. A todos vocês desejo saúde, paz e muitos anos de vida, pois tudo que aconteceu foi primordial para minha formação, acredito que todo esforço irá valer a pena. Obrigado! “Verba volant, scripta manent” EPÍGRAFE “O SENHOR é o meu pastor, nada me faltará” Salmo 23. “tudo posso naquele que me fortalece” Filipenses 4.13. “Não se mede o valor de um homem pelas suas roupas ou pelos bens que possui. O verdadeiro valor do homem é o seu caráter, suas idéias e a nobreza dos seus ideais.” Charles Chaplin RESUMO A leucemia pode ser classificada em dois grandes grupos, mielóide e linfóide, sendo subclassificada em aguda ou crônica, e dividida no tipo T e tipo B. Este trabalho busca compreender a etiopatogenia das leucemias infóides, determinar seus principais marcadores imunológicos e os avanços da imunofenotipagem por citometria de fluxo multiparamétrica para o diagnóstico diferencial e avaliar a eficiência dos resultados dos exames imunohematológicos obtidos por associação com a imunofenotipagem ou outras técnicas convencionais. O presente estudo caracteriza-se por revisão de literatura do tipo descritiva envolvendo o diagnóstico diferencial das leucemias linfóides através da citometria de fluxo. Foi realizado um levantamento de artigos no banco e base de dados da PubMed/Medline, SciELO, CAPES, BVS e ScienceDirect referente a imunofenotipagem por citometria de fluxo para diagnostico das leucemias linfóides e no site do Ministério da Saúde/DATASUS e INCA para informações epidemiológicas. As classificações fenotípicas das células leucêmicas geralmente são realizadas através do método da imunofenotipagem por citometria de fluxo baseada na expressão dos antígenos celulares. Esse método de diagnóstico utiliza anticorpos monoclonais e, por isso, tem alta sensibilidade e especificidade, permitindo a identificação dos tipos celulares e dos seus estágios de diferenciação. Foram selecionados 51 artigos acerca da imunofenotipagem por citometria de fluxo das leucemias linfóides. Os principais marcadores para diagnósticos e classificação da LLA-T foram CD1a, CD2, TCRαβ, TCRγδ, CD3 Cit/Sm e para LLA-B CD10, CD19, CD20 , CD22c, CD79a/b, Kappa ou Lambda e IgM. Na determinação da LLC-T os marcadores CD4, CD7, CD8, CD3, TCR alfa/beta, CD1a foram mais apontados, enquanto os CD23, CD20, CD19, CD22 (fraco), CD10, CD79b(fraco ou ausente), FMC7 (fraco ou ausente) são mais utilizados para determina a LLC-B. Os resultados apontaram que essa técnica apresenta alta especificidade, sensibilidade, confiança, resultados rápidos e precisos. Assim, pode ser usada nos grandes centros de oncologia para as análises de marcadores imunológicos para confirmação, classificação e monitoramento das leucemias linfóides de células B e T com resultados em um curto intervalo de tempo para favorecer tratamentos imediatos aos pacientes. Palavras – chaves: Leucemias. Leucemia linfocítica. Imunofenotipagem. Citometria de fluxo. ABSTRACT Leukemia can be classified into two major groups, myeloid and lymphoid, and further classified into acute or chronic end divided into type T and type B. This work seeks to understand the pathogenesis of lymphoids leukemias, to determine its main immunological markers and advances in immunophenotyping cytometric multiparameter flow for the differential diagnosis and to evaluate the efficiency of the results of immunohematology tests obtained by association with immunophenotyping or other conventional techniques. The present study is characterized by literature review of descriptive involving the differential diagnosis of lymphoid leukemia by flow cytometry. A survey of articles in the database and database PubMed/Medline, SciELO, CAPES, BVS and ScienceDirect related immunophenotyping by flow cytometry for diagnosis of lymphocytic leukemias and the Ministry of Health website / DATASUS and INCA to epidemiological information. Phenotypic classification of leukemic cells are generally performed by the method of immunophenotyping by flow cytometry based on expression of cell antigens. This diagnostic method uses monoclonal antibodies and thus, has high sensitivity and specificity, permitting the identification of the cell types and their differentiation stages. 51 items were selected at about Immunophenotyping by flow cytometry in lymphoid leuemias. The main markers for diagnosis and classification of T-ALL were CD1a, CD2, TCRαβ, TCRγδ, CD3 Cit / Sm and LLA-B CD10, CD19, CD20, CD22c, CD79a / b, or Kappa Lambda and IgM. In determining the LLC-T CD4 bookmarks, CD7, CD8, CD3, TCR alpha / beta, CD1a were more pointed, while CD23, CD20, CD19, CD22 (weak), CD10, CD79b (weak or absent), FMC7 ( weak or absent) are best used to determine the BCLL. The results showed that this technique is highly specific, sensitive, reliable, fast and accurate results. Thus, it can be used in major cancer centers for analysis of immunological markers for confirmation, classification and monitoring of lymphoides leukemias of B and T cells results in a short period of time to facilitate immediate treatment to patients. Key-words: leukemias. lymphocytic Immunophenotyping. Flow cytometry. leukemia. lymphoblastic leukemia. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Representação esquemática da leucemia linfóide- tipos e subtipos........25 Figura 2- Representação esquemática do funcionamento do citomêtro de fluxo.....37 LISTA TABELAS Tabela 1 - Principais vantagens e desvantagens da imunofenotipagem por citometria de fluxo.......................................................................................................................40 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Principais Neoplasias Hematológicas.....................................................23 Quadro 2 - Principais marcadores imunológicos das leucemias linfoblástica aguda e linfocítica crônica de células T....................................................................................28 Quadro 3 - Marcadores imunológicos dos subtipos da leucemia linfoblástica e linfocítica de células T................................................................................................29 Quadro 4 - Principais marcadores imunológicos das leucemias linfoblástica aguda e linfocítica crônica de células B...................................................................................31 Quadro 5 - Marcadores imunológicos dos subtipos da leucemia linfoblástica e linfocítica de células B................................................................................................32 Quadro 6 -Forma de uso e características das amostras biológicas na imunofenotipagem por citometria de fluxo..................................................................39 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS BCR Receptor de células B CD Cluster diferentiation CDCit Cluster differentiation Citoplasmótico CDSm Cluster differentiation Superficie de membrana CMF Citometria de Fluxo DATASUS Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde FAB Franco – Americano – Britânico FGFR1 Fator de crescimento de fibroblastos receptor 1 FSC Forward Scatter G-CSF Fator Estimulante de Colônias Granulócitos GM-CSF Fator estimulante de colônias de Granulócitos e Macrófagos HLA HumanLeukocyteAntigens Ig Imunoglobulina IL Interleucina INCA Instituto nacional de câncer LL leucemia linfóide LLA-B Leucemia linfoblástica aguda da linhagem B LLC-B Leucemia linfocítica crônica linhagem B LL-T Leucemia linfóide-T M-CSF Fator Estimulante de Colônias de Macrófagos MHC Complexo principal de histocompatibilidade MO Medula óssea MS Ministério da saúde NMP/MD Neoplasias mieloproliferativas/ mielodisplasicas OMS Organização mundial da saúde PDGFRA Receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, alfa polipéptido PDGFRB Receptor do fator de crescimento derivado debetapolipéptido SMD Sindromesmielodisplásicas SP Sangue periférico SSC Side Scatter TdT desoxinucleotidil-transferase Th Linfocitos T helper UFC Unidade formadora de colônias SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14 2 METODOLOGIA .................................................................................................... 18 2.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO .......................................................................... 18 2.2 FONTE DOS DADOS .......................................................................................... 18 2.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ........................................................ 18 2.4 EXTRAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISE ............................................................... 19 3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 20 3.1 HEMATOPOIESE E LINFOPOIESE ................................................................... 20 3.2 PAPEL DOS LINFÓCITOS NA RESPOSTA IMUNE ........................................... 21 3.3 NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS .................................................................... 22 3.4 LEUCEMIA ......................................................................................................... 23 3.5 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA E LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA...................................................................................................................24 3.5.1 Leucemia linfoblásticaaguda-T ..................................................................... 25 3.5.2 Marcadores da leucemia linfoblásticaaguda-T ............................................ 26 3.5.3 Marcadores dos subtipos da leucemia linfoblastica da linhagem-T.......... 28 3.5.4 Leucemia linfoblástica aguda-B.................................................................... 29 3.5.5 Marcadores da Leucemia Linfoblástica Aguda da linhagem- B ................. 30 3.5.6Marcadores dos subtipos da leucemia linfoblástica e linfocítica da linhagem-B ............................................................................................................... 31 3.5.7 Leucemia linfocítica crônica ......................................................................... 32 3.5.8 Marcadores da leucemia linfocítica crônica da linhagem-T ....................... 33 3.5.9Marcadores dos subtipos da leucemia linfocítica da linhagem-T ............... 33 3.6 CARACTERÍSTICAS CLINICAS DAS LEUCEMIAS ........................................... 33 3.7 DIAGNÓSTICO DAS LEUCEMIAS DE ORIGEM LINFOIDE ............................. 34 3.8 IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO ................................... 36 3.8.1 Princípios técnicos da imunofenotipagem por citometria de fluxo ........... 36 3.9 A IMPORTÂNCIA DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO DA LEUCEMIA LINFOIDE............................................................... 37 3.9.1 Avanços, vantagens e limitações da citometria de fluxo ........................... 39 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 41 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 43 14 1 INTRODUÇÃO A medula óssea em seu estado fisiológico produz células hematopoiéticas capazes de desempenhar funções como transporte de gases, processos hemostáticos e produção das células que fazem parte do sistema imunológico do indivíduo, no entanto em estado patológico produz células imunológicas incapazes de desempenhar suas funções (SILVEIRA et al., 2008). A leucemia é a doença que afeta os leucócitos e tem como característica principal o aumento desregulado de células imaturas (BYRD, 2015). O desenvolvimento das células, em especial os linfócitos T e B, é efetivamente controlado desde as células progenitoras. A sobrevivência, proliferação e maturação dos linfócitos B são determinadas pelos receptores de antígenos específicos e a ausência dos receptores de antígenos nessas células desencadeia a apoptose. As células pré-B apresentam a cadeia pesada da Imunoglobulina (Ig) (MICHEL, 2008; BERTHO et al., 2014). Os linfócitos B que não apresentarem os receptores de células B (BCR) permitem uma verificação intermediária que assegura temporariamente a vida da célula, no entanto, cerca de 95% das células que não expressam os receptores adequados ou que apresentam defeitos moleculares morrem por apoptose (REGO et al., 2009; GARCIA-MARCO et al., 2013). No processo de especificidade das células T a seleção positiva assegura a maturação das células, isso depende da ligação de baixa avidez com as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade própria (MHC). Células que apresentam ligações de alta avidez são induzidas a morte celular por apoptose, na seleção negativa. A produção é controlada por um sistema de divisão celular que permite boa funcionalidade das células e quando defeituosa perde o controle da divisão celular possibilitando produção descontrolada de células na medula óssea, favorecendo-o excesso de células jovens sem funcionalidade denominadas blastos ou clones (BERTHO et al., 2014). O excesso de blastos na medula óssea inibe a produção de células capacitadas para desempenhar as suas funções, com isso, os indivíduos irão sofrer complicações decorrentes da baixa imunidade do organismo e acúmulo de células jovens sem funcionalidade na corrente sanguínea e nos tecidos extramedulares (BYRD, 2015). Para o Ministério da Saúde, blastos acima de 20% em sangue periférico ou na medula óssea é característica da leucemia. Entretanto o grupo Franco-Americano-Britânico 15 (FAB) sugere que o quadro leucêmico seja determinado quando forem encontrados mais de 30% de blastos em sangue periférico (SP) ou medula óssea (MO) (BRAND et al., 2009). Os blastos apresentam marcadores imunológicos denominados CDs (cluster of diferentiation) fundamentais para sua funcionalidade e permitem predizer o estágio de maturação celular. Esses CD’s são específicos para as linhagens celulares e estágio de maturação, com isso, determina-se o tipo de celular e posteriormente classifica o tipo de leucemia desenvolvido (BERTHO et al., 2014). As leucemias são classificadas em quatro categorias, leucemia de origem mielóide aguda ou crônica e leucemia linfóide aguda ou crônica. As classificações das leucemias estão relacionadas aos tipos de clones leucêmicos encontrados nas análises laboratoriais (BRAND et al., 2009). A leucemia linfóide é dividida no tipo B e tipo T, e em subtipos L1, L2 e L3 de acordo a classificação do grupo Franco-Americano-Britânico (FAB). Sendo que a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) não reconhece os subtipos L1 e L2 indistintamente por não predizer o fenótipo B ou T (CHIARETTI et al., 2014). Portanto, observa-se que há discordância na classificação dessa patologia na literatura, e com isso, há necessidade de uma pergunta acerca do tema proposto. Como a citometria de fluxo pode ser utilizada para o diagnóstico e classificação diferencial das leucemias? As classificações fenotípicas das células leucêmicas geralmente são realizadas através do método da imunofenotipagem por citometria de fluxo baseada na expressão dos antígenos celulares. Esse método utiliza anticorpos monoclonais e, por isso, tem alta sensibilidade e especificidade, permitindo a identificação dos tipos celulares e dos seus estágios de diferenciação. É um método utilizado para classificação, prognóstico, monitoramento, estadiamento e diferenciação das células hematopoiéticas anormais para diagnóstico das leucemias e revela informações importantes para escolha do tratamento direcionado que poderá ser fundamental para sobrevida do paciente. A citometria apresenta vantagens em relação à microscopia devido à sua alta especificidade, sensibilidade, diagnósticos rápidos e preciso, podendo elevar a 99% de chances o diagnóstico dos casos suspeitos, além de utilizar multiparâmetros para identificar características heterogêneas dos clones leucêmicos (SILVEIRA et al., 2008). 16 Além do exame imunofenotípico, outras técnicas são utilizadas na determinação dos clones leucêmicos. A citogenética convencional e molecular são as técnicas mais indicadas para a analises das anormalidades genéticas, através delas o cariótipo do paciente pode ser analisado e suas informações são importantes para iniciar o tratamento direcionado. As estimativas de câncer para os anos 2012-2013 foram de mais de 518.510 novos casos. E para o Brasil, estimou-se 8.510 novos casos de leucemias, sendo 4.570 em homens e 3.940 nas mulheres (HAMERSCHLAK, 2012; MS, 2015). No entanto, a realidade superou o esperado, pois foram registradas 149.858 internações de pacientes com leucemias (DATASUS, 2015; MS, 2015). No estado da Bahia ocorreram 7.204 internações, com 650 casos de óbitos e taxa de mortalidade de 9,02%, no período de 2010 a junho 2015 (FACINA, 2011; DATASUS, 2015; INCA, 2014; MS, 2014). Os dados indicaram um aumento significante no número de pessoas acometidas por esse tipo de câncer tornando um desafio para a saúde pública, uma vez que a doença tem grande potencial de morbidade e mortalidade, com gastos expressivos em diagnóstico e tratamento. Sobre tudo, há necessidade da realização de vários exames para o diagnóstico, tais como, hemograma, esfregaço sanguíneo e de medula óssea, biópsia, citogenética e principalmente a imunofenotipagem por citometria de fluxo para diferenciação das linhagens leucêmicas (DONGEN et al., 2012). Deste modo este trabalho busca compreender a etiopatogenia das leucemias linfóides, determinar seus principais marcadores imunológicos e os avanços da imunofenotipagem por citometria de fluxo multiparamétrica para o diagnóstico diferencial e avaliar a eficiência dos resultados dos exames imunohematológicos obtidos por associação com a imunofenotipagem ou outras técnicas convencionais. Se justifica ao apresentar conteúdos relevantes para o mundo científico,abordará técnica importante para o diagnóstico das leucemias das células hematopoiéticas da linhagem linfóide visando contribuir com atualização da temática que deve permanecer em expansão no Brasil e no mundo com intuito de ajudar teoricamente a compreender o diagnóstico da doença. Neste contexto, a atual proposta pretende realizar uma revisão de literatura acerca da leucemia linfoblástica aguda (LLA) e leucemia linfocítica crônica (LLC) e enfatizar a importância da 17 imunofenotipagem por citometria de fluxo como o padrão ouro para o diagnóstico diferencial, rápido, sensível e especifico das leucemias linfocíticas (LL). 18 2 METODOLOGIA 2.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO O presente estudo caracteriza-se por revisão de literatura do tipo descritiva envolvendo o diagnóstico diferencial das leucemias linfóides através da citometria de fluxo. A busca foi realizada nos idiomas Português e Inglês utilizando os descritores e suas combinações: “neoplasia hematológica”, “imunofenotipagem”, “leucemia”, “leucemia linfocítica crônica”, “leucemia linfoblástica aguda T ou B”, “leucemia linfocítica crônica T ou B”, “leucemia linfocítica”, “diagnóstico da leucemia”, “marcadores imunológicos”, “CDs”, “sistema de lasers”, “citometria de fluxo”, “diagnósticos das leucemias linfóides”, “citogenéticas”, “citogenética convencional”, “citogenética molecular”. 2.2 FONTE DOS DADOS Foi realizado um levantamento de artigos no banco e base de dados da PubMed/Medline (National Library of Medicine), biblioteca eletrônica SciELO (Scientific Electronic Library Online), autarquia pública de pesquisa CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), BVS (Biblioteca Virtual em saúde) e Science Direct (liderada pela Elsevier) referente a imunofenotipagem por citometria de fluxo para diagnostico das leucemias linfocíticas e no site do Ministério da Saúde/DATASUS (Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde do Brasil) e INCA (Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva) para informações epidemiológicas. 2.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO Para inclusão foram utilizados artigos de ensaios experimentais (humanos ou animais) ou ensaios clínicos, revisão de literatura ou relato de caso, de língua inglesa ou portuguesa e/ ou outros idiomas com tema referido, artigos disponíveis online na íntegra e artigos publicados no período de 2008 a 2016. Os critérios de exclusão foram aplicados em artigos que contemplaram apenas outros tipos de câncer hematológicos (leucemia mielóide ou linfomas), artigos duplicados. 19 2.4 EXTRAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISE Foram avaliados criticamente os dados obtidos, síntese dos principais CDs para criação dos painéis, comparação dos resultados dos exames imunofenotipagem por citometria de fluxo com os demais métodos utilizados, baseados em evidências e descritos as limitações das técnicas. 20 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 HEMATOPOIESE E LINFOPOIESE Fisiologicamente as células sanguíneas são produzidas por um sistema denominado hematopoiético que tem como função a formação e desenvolvimento das células sanguíneas. As células sanguíneas são originadas a partir de um precursor comum pluripotente (UFC – unidade formadora de colônia; stem-cell ou célula-tronco) durante o processo de hematopoiese, que é iniciado na fase embrionária no saco vitelino (por volta da 3ª semana de gestação), posteriormente, durante a vida fetal, no fígado (da 9ª semana até a 24ª) e finalmente na medula óssea (a partir da 24ª semana) (BERTHO et al., 2014). Na medula óssea as células-troncos pluripotentes tendem a sofrer estímulos principalmente da interleucina-7 (IL-7) e dos fatores estimuladores de colônia (G-CSF, M-CSF e GM-CSF) para originar as células multipotentes diferenciadas, os precursores mielóides e linfóides, e posteriormente monócitos, eosinófilos, neutrófilos, basófilos, eritrócitos, Natural Killer (NK) e dos linfócitos. Os linfócitos denominados de células agranulares, caracterizam-se por apresentarem núcleo regular e por não possuírem granulações específicas no citoplasma, são células indispensáveis para o sistema de defesa imunológica, classificadas em linfócitos B e linfócitos T (BERTHO et al., 2014). Durante todo processo de produção e maturação dos linfócitos B (na medula óssea) e células T (maturação no timo) ocorrem expressões dos receptores dos antígenos e proteínas de membrana que permitem determinar o grau de maturação celular (HSU et al., 2016). As expressões desses receptores são fatores importantes tanto na produção, regulação e manutenção destas células, quanto para posteriormente serem liberadas da medula óssea (linfócitos B) e do timo (linfócitos T) para circulação, migrando para os órgãos linfóides secundários, sítios de elaboração da resposta imune contra antígenos circulantes (BRAND et al., 2009). 21 3.2 PAPEL DOS LINFÓCITOS NA RESPOSTA IMUNE Durante o processo inflamatório os linfócitos são recrutados para os órgãos e tecidos que sofreram injúria para então iniciar a resposta imunológica aos antígenos. A resposta imune ocorre a partir do reconhecimento de antígenos apresentados por células apresentadoras de antígenos (macrófagos e das células dendríticas) aos linfócitos T (MESQUITA et al., 2010). Os linfócitos T tendem a se diferenciar em duas classes, que podem ser identificadas de acordo as proteínas de superfícies, tais como, CD4+ e CD8+. Os que apresentam CD4+ são denominados linfócitos TCD4+ ou células T auxiliar, capazes de produzir e secretar citocinas para estimular outras células imunológicas, além do reconhecimento de antígenos via MHC de classe II, que nos humanos é denominado de HLA (human Leukocyte antigens), do tipo HLA-D (DP, DQ, DR) (HSU et al., 2016). Estes linfócitos TCD4+ podem ser subdivididos em quatro classes, Th1, Th2, Th17 e TRegulatórios, essa classificação é de acordo a produção de citocinas que cada célula produz após estimulo. Os linfócitos Th1 podem secretar citocinas para de ativar os macrófagos, como interleucinas2 (IL-2) e interferom gama. Os linfócitos Th2 irão atuar dentro dos tecidos linfóides secundários, estimulando os linfócitos B, eosinófilos, mastócitos através das citocinas IL-4, IL-5 ,IL-6 e IL-10. Os linfócitos Th17 desempenham papel importante na resposta imunológica contra microrganismo extracelular. Produzem citocinas IL-22, IL-26 e citocinas da família IL-17, que podem estar associadas as doenças autoimunes como esclerose múltipla, doença intestinal inflamatória, psoríase e lúpus. Essas citocinas estão envolvidas em processos associados à inflamação e infiltração celular e síntese de outras citocinas com características pro-inflamatórias (MESQUITA et al., 2010). Os linfócitos T reguladores apresenta função imunorreguladora responsável pelo controle da autotolerância imunológica e das reações autoimunes. São classificados em LT reguladores de ocorrência natural – (TREGS CD4+ CD25+), Linfócitos T Reguladores Duplo Negativos ou Linfócitos T Reguladores CD8+CD28-, de acordo a capacidade da produção de citocinas do tipo TGF-β, IL-4 e IL-10. Sua a atuação permite regular os mecanismos das respostas imunológicas frente aos antígenos tumorais, aloantígenos, alégenos, autoantígenos e agentes infecciosos (MAURI et al., 2008). 22 As células T que apresentam CD8+ em sua superfície são denominadas de linfócitos TCD8+ ou células T citotóxicas, estas células reconhecem antígenos ligados ao MHC de classe I, que no homem é denominado HLA-A, HLA-B, e HLA-C. Os linfócitos TCD8+ agem sobre as células infectadas por vírus, células cancerígenas e outros microrganismos intracelulares e impede que esses patógenos sofram replicação (MESQUITA et al., 2010) Em linfócitos B, responsáveis pela resposta humoral, a ativação ocorre através de reconhecimento de epítopos antigênicos pelo receptor de célula B (BCR) formado por imunoglobulinas de membrana, com participação de MHC classe II, além da participação de moléculas co-estimuladoras presente nos TCD4+, e também das células dendríticas dos folículos linfóides (MAURI et al., 2008). Esse contato leva a diferenciação e proliferação dos linfócitos B em plasmócitos, que são as células produtoras de anticorpos (IgG, IgA, IgM, IgE), com funções especificas contra os antígenos para os quais foram gerados e geração de linfócitos de memória. A resposta imune dos linfócitos B pode ser do tipo: resposta antígenos T independente e resposta T dependente. A resposta antígenos T independente é desencadeada por estruturas não protéicas, poliméricas, de baixa afinidade em sua maioria, pertencente, à classe IgM, em contrapartida, a resposta T dependente a ativação ocorre nos tecidos linfóides secundários, onde irá ser formado o complexo linfócitos B-antígenos específicos- linfócitos TCD4+ (MAURI et al., 2008; MESQUITA et al., 2010). Durante todo processo de maturação e ativação dos linfócitos T e B ocorre a produção e expressão de marcadores imunológicos e podem ser identificados através da imunofenotipagem por citometria de fluxo, assim, esse conhecimento permite a distinção de um evento fisiológico de uma neoplasia (ZERBINI et al., 2011a; ZERBINI et al., 2011b). 3.3 NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS A neoplasia é uma proliferação celular descontrolada associada à supressão de um ou mais mecanismos regulatórios da diferenciação celular, geralmente resulta na formação de tumores, estes tumores podem apresentar características benignas ou malignas (BRAND et al., 2009). 23 A neoplasia hematológica origina células leucêmicas heterogêneas com fenótipos distintos que determinam seu grupo neoplásico e suas características permitem a classificação descrita no quadro abaixo (Quadro 1) (ZERBINI et al., 2011a; ZERBINI et al., 2011b). Quadro 1 - Principais Neoplasias Hematológicas NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS 1.Neoplasias mieloproliferativas (NMP) 2.Neoplasias mieloproliferativas/ mielodisplásicas (NMP/MD) 3.Síndromes mielodisplásicas (SMD) 4.Neoplasias de células linfóides precursoras 5.Neoplasias de células linfóides B maduras 6. Neoplasias mielóides e linfóides com eosinofilia e anormalidades dos genes PDGFRA, PDGFRB ou FGFR1. 7.Leucemia mielóide aguda (LMA) e Neoplasias de células precursoras relacionadas. 8.Leucemias agudas de linhagem ambígua. 9.Neoplasias de células T e NK maduras. 10.Linfoma de Hodgkin (LH). 11.Neoplasia de células histiocíticas e dendríticas. 12.Doenças linfoproliferativasassociadas à imunodeficiência (DLP-ID). PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS Neoplasias de caráter clonal com alterações nos genes BCR-ABL, JAK2, Kit, PDGFRA, PDGFRB e FGFR1. Estão ligadas as alterações nos genes que codificam as cadeias α e β de receptores com atividade tirosina quinase. É caracterizada por presença de células clonais precursoras hematopoiética com citopenias, displasia de uma das linhagens com deficiência na hematopoese, aumento da apoptose e tendência a LMA. >20% de blastos da linhagem linfóide na MO ou SP Aumento de linfócitos B maduro sem funcionalidade. São consideradas neoplasias raras derivadas de células progenitoras pluripotente de origem mielóide-linfóide. Clinicamente apresenta-se heterogenia com características de neoplasias mieloproliferativa ou de origem linfóide. Blastos acima de 20% em SP quando contada 200 células ou 500 células em MO relacionadas a alterações genéticas. Células leucêmicas jovens que apresentam antígenos de origem linfóide e mielóide concomitantemente. Apresenta-se com aumento de células leucêmicas com marcadores específicos para células T. E na neoplasia de NK madura ocorre aumento crônico e indolente da contagem de células NK, com difícil diagnóstico diferencial utilizando os processos reacionais. Acomete os linfonodos (gânglios) do sistema linfático Apresenta-se como neoplasias hematológicas, porém, envolve linfonodos, pele, pulmão e tecidos de outros sistemas. Doença hematológica decorrente de doença autoimune primária, ao HIV, pós- transplante. Fonte: ZERBINI et al. (2011a ); INCA (2014). PDGFRA: Receptor do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas, Alfa polipéptido; PDGFRB: Receptor do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas, Beta polipéptido; FGFR1:Fator de Crescimento de Fibroblastos Receptor 1;MO: Medula óssea; SP: Sangue periférico. 24 3.4 LEUCEMIA As leucemias são neoplasias do sistema hematopoiético, resultantes das alterações do mecanismo de controle da divisão celular. A leucemia tem como principal característica o aumento do número de células imaturas na medula óssea que compromete o processo de maturação e funcionalidade na corrente sanguínea (CHIARETTI et al., 2014). São classificadas de acordo com a célula de origem, e seu grau de maturação em quatro categorias, leucemia mielóide e linfóide, forma aguda ou crônica. A busca pela etiologia das leucemias ainda deve continuar, pois não se sabe ao certo a origem da doença. Vários autores correlacionam a leucemia a diversos fatores ambientais e hereditários. As interações complexas entre características genéticas do hospedeiro a agentes físicos, químicos, biológicos e ambientais são mais propicio a causar as leucemias agudas (MICHEL, 2008). Acredita-se que modelos de estudos de experimentação animal possa ajudar no entendimento leucemogênese, pois, a exposição da espécie animal a agentes ionizantes e carcinógeno químico causa aumento nos casos de leucemias. Assim, Larson (2010), sugere que fusão dos genes BCR/ABL em células germinativas de origem animal não humanos podem ser experimentalmente analisados. Sobre tudo a translocação do gene ABL no cromossomo 9 ao gene BCR no cromossomo 22, produza uma proteína ausente em células normais. Essa translocação t(9; 22) dar origem ao cromossomo Philadelphia (Ph). Está presente em todos os pacientes com leucemias mielóide crônica (LMC) e em cerca de 1/3 dos adultos com LLA (HALLEK et al., 2008). Em relação aos dados epidemiológicos, foram registradas mais de 149.858 internações de pacientes com leucemias - no período de 2010 a junho 2015, no Brasil. As análises epidemiológicas registraram maiores incidências em homens com estimativas de 5 casos/100 mil homens e 4 casos/100 mil mulheres. A relação sexo masculino por região do Brasil, no Norte ocupa a quinta neoplasia mais freqüente, nas regiões Sul e Sudeste a décima primeira posição e as regiões Nordeste e CentroOeste, encontra-se na oitava e décima posição de neoplasias, respectivamente. Em relação ao sexo feminino, nas mulheres da região Norte a leucemia é a sétima neoplasia mais frequente, a décima no Centro-Oeste e Nordeste, no Sudeste é a décima segunda e no Sul a décima terceira (MS/INCA, 2014). 25 3.5 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA E LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA A leucemia linfoblástica aguda é um distúrbio maligno das células progenitoras das linhagens linfóides (HARSINI et al., 2014). É subdividida em tipo T e tipo B e tem como característica principal o aumento das células jovens estagnadas em um dos estágios da maturação celular. Os principais indicativos são elevações no número de blastos na medula óssea e sangue periférico, prejuízo na produção das hemácias, plaquetas e glóbulos brancos maduros (HAMERSCHLAK, 2008). Geralmente apresenta anemia normocítica/normocrômica, baixa produção de neutrófilos (neutropenia), plaquetopenia e aumento no número de blastos, o mielograma apresenta células jovens difusas. Corresponde a 80% das leucemias aguda na infância (entre 2 a 5 anos de idade) e 20% nos adultos, entretanto, as crianças apresentam taxa de sobrevida excelente (MICHEL, 2008; ZANICHELLI et al., 2010; MAUDE, 2015). As crianças do sexo masculino e indivíduos com ataxia-telangiectasia, trissomia do cromossomo 21, síndrome de Bloom e neurofibromatose tipo I tem maior susceptibilidade de desenvolver a doença (MICHEL, 2008; HAMERSCHLAK, 2012; MS/INCA, 2014; SILVA et al., 2014). As características imunofenotípicas e morfológicas são importantes fatores para leucemia, pois determina a classificação em tipo T ou B e seus subtipos (Figura 1). 26 Figura1 - Representação esquemática da leucemia linfóide- tipos e subtipos Fonte: adaptado INCA (2014). LLA-T: Leucemia linfoblásticaAguda-T; LLA-B: Leucemia linfoblástica Aguda-B; LLC-B: Leucemia Linfocítica Crônica-B; LLC-T: Leucemia Linfocítica Crônica-T. 3.5.1 Leucemia linfoblástica aguda-T A Leucemia Aguda Linfoblástica- T (LLA-T) é uma consequência das alterações nos mecanismos de regulação da divisão celular das células hematopoiéticas das linhagens linfóide das células precursoras dos linfócitos T. O processo de maturação é interrompido e condiciona aumento significante de células imaturas na medula óssea (MO), liberação de blastos imaturos na corrente sanguínea, prejuízos ao sistema imunológico do indivíduo e diminuição na produção de glóbulos vermelhos e plaquetas (SILVEIRA, 2008; MICHEL, 2008; REGO et al., 2009; LOPES, 2010). 3.5.2 Marcadores da leucemia linfoblástica aguda-T A LLA-T é uma neoplasia que pode ser diagnosticada e classificada por um conjunto de marcadores imunológicos expressos durante seu estágio de maturação (MICHEL, 2008; PIER, 2008; CHIARETTI et al.,2014; DORGEN et al., 2014;SUKUMARAN et al., 2015). Segundo Dorgen e colaboradores (2014), os principais marcadores que podem ser utilizados para diagnosticar e classificar a LLAT são CD1a, CD2, CD4, CD45, CD45RA, CD99, HLADR, TCRαβ, TCRβcy, TCRγδ, porém, outros marcadores (CD3 Cit/Sm, CD5, CD33, CD34, CD44, CD56, CD117 e TdTNu) são indicados para determinação da LLA-T (Quadro 2). Esses marcadores 27 fazem parte do painel para determinação da LLA-T criado pelo grupo Euroflow, atualmente referência para os casos de neoplasias hematológicas da linhagem T. O marcador CD2 faz parte do grupo de marcadores para LLA-T e é considerado um marcador de células imaturas (PIER, 2008; DORGEN et al., 2012; CHIARETTI et al.2014), especificamente está presente em células leucêmicas da LLA-Pré-T (CHIARETTI et al.,2014). No entanto, apenas sua positividade não define o diagnóstico, sendo necessário associar a outros marcadores (p.e. CD7) para confirmação. O CD3Cit/Sm é apontado como um importante marcador para investigação das leucemias de células T (MICHEL, 2008; PIER, 2008; LOPES, 2010; CHIARETTI et al., 2014; SUKUMARAN et al., 2015). Para Ikoma (2015), o CD3 Cit/Sm são marcadores que podem ser utilizados na quantificação de blastos T, sobre tudo a sua utilização deve estar associada ao marcador CD7, pois as células NK também o expressam. Por sua vez, Rawstron (2015), sugere que os marcadores CD3 Cit/Sm devem ser utilizados como forma de exclusão de neoplasias relacionadas as células B. Larson (2010) aprova o CD3 cit/Sm para fazer parte do painel de marcadores controle na determinação da leucemia mielóide aguda (LMA), uma vez que esses marcadores são próprios dos linfócitos T (LOPES, 2010), assim permitirá a imunofenotipagem correta da amostra. Por fim, o CD3 cit/Sm foi inserido no painel de marcadores validados pelo grupo EuroFlow, orientado por Dorgen e colaboradores (2012), para diagnóstico da LLA-T. O CD3 citoplasmático foi incluído no painel de marcadores para o diagnóstico das LLA-T, pois demonstrou positividade para 10 casos (1 caso de B / T e 9 casos de T/mielóide) dos 506 casos de leucemias submetidos a imunofenotipagem (SUKUMARAN et al., 2015). Por sua vez, o CD5 está presente na maioria das células imaturas e é utilizado em painéis para classificação das leucemias da linhagem linfóide, porém, sua expressão não é especifica das células T, contudo, outros blastos (p.e. NK) também expressam esse marcador. Segundo REGO et al (2009), o CD45 é bastante utilizado na imunofenotipagem visto que os blastos apresentam baixa expressão desse marcador. No entanto, CD34 apresenta-se com alta intensidade, assim é utilizado como marcador de células imaturas, porém não faz parte do painel do grupo Euroflow para investigação da LLAT. Entretanto, Béné (2011), sugerem que o CD34 e o CD45 devem fazer parte dos painéis para determinação das LLA-T através da imunofenotipagem. 28 Quadro 2- Principais marcadores imunológicos das leucemias linfoblástica aguda elinfocítica crônica de células T LLC-T LLC-T LLA-T LLA-T MARCADORES IMUNOLÓGICOS DAS LEUCEMIAS LINFOBRÁSTICAS E LINFOCITICAS T LLA CDs Autor (es) LLC CDs Autor (es) CHIARETTI et al., CD3cit/Sm CD4 LOPES, 2010 2014; DORGEN et CD7 al., 2014; MICHEL, CD8 LOPES, 2010 2008; PIER, 2008; CD3 SUKUMARAN et TCR alfa e beta al., 2015 DORGEN et al., CD2 2014 CD5 CD10 SAULO, 2011 CHIARETTI et al., CD5 TdT 2014; DORGEN et al., 2014 CD1a CD103 LOPES, 2010 CD34 SAULO, 2011 CD14, CD1a FMC 7 CD4 CD8 CD10 CD33 CD44 DORGEN et al., CD45 CD45RA 2014 CD56 CD99 CD117 HLADR TCRαβ TCRβcy TCRγδ TdTNu LLA-T- Leucemia linfoblástica Aguda-T; LLC-T- Leucemia Linfocítica Crônica-T. 3.5.3 Marcadores dos subtipos da leucemia linfoblastica da linhagem-T A LLA-T apresenta subtipos que estão relacionados aos estágios de maturação que ocorre estagnação de clones leucêmicos. Esses clones expressam marcadores imunológicos que são usados como parâmetro para determinar os subtipos. Assim, a LLA-T é subclassificadas em LLA-Pró-T, LLA- Pré-T, LLA-T cortical e LLA- T maduros (Quadro 3). 29 Quadro 3- Marcadores imunológicos dos subtipos da leucemia linfoblástica e linfocítica de células T LLA-T SUBTIPOS DAS LEUCEMIAS LINFÓIDES T AGUDAS E CRÔNICAS CDS Autor (s) LLC-T CDs Pró-T CD3cit+ CD7+ CD2+ CD3cit+ CD5+ CD7+ Pré-T LLA-T Cortical CD1a+ CD3c+ CD3Sm CHIARETTI et al.,2014 CHIARETTI et al.,2014; SUKUMARAN et al., 2015; BÉNÉ et al., 2011 CHIARETTI et al.,2014 Pró-linfocítica T CD3+ CD2+ CD4+ CD5+ CD7+ CD8CD16CD25-/+ CD56CD57- Autor (s) PIER, 2008 (fraco) T- Maduros CD3cit+ CD1aCD3Sm CHIARETTI et al.,2014, SUKUMARAN et al., 2015 (fraco) Cit- citoplamático; Sm- superfície de membrana; + (presença); -/+ ( presença ou ausência) Na LLA-Pró-T são observados os marcadores CD3Cit+ e CD7+ (CHIARETTI et al.,2014). Entretanto, na LLA-Pré-T são observados blastos poucos diferenciados que segundo Chiaretti (2014) e Sukumaran (2015), apresentam os marcadores CD2+, CD3Cit+, CD5+, CD7+ determinantes na subclassificação. Para a LLA-T cortical os CDs utilizados são CD1a+, CD3cit+, CD3Sm (fraco). Na LLA- T maduros foram observados CD3Cit+, CD1a- e CD3Sm (fraco) (CHIARETTI et al., 2014; SUKUMARAN et al., 2015). É observado que esses marcadores estão presentes nos mais variados subtipos de LLA-T, por tanto, a aplicação da técnica da citometria de fluxo para sua determinação deve ser cuidadosa para evitar resultados falsos ou indeterminados. 3.5.4 Leucemia linfoblástica aguda-B Assim como a LLA-T, a LLA-B é resultante do descontrole da proliferação de células jovens na medula óssea e liberadas para corrente sanguínea, acarretando infiltrações em sítios extramedulares (ZANICHELLI et al., 2010). É mais comum em crianças, entre 2 a 5 anos de idade com 85% dos casos e nos adultos com 75% (INCA,2014). A identificação da linhagem é fundamental e de grande relevância para o diagnóstico, classificação, terapia dos pacientes e prognósticos (MICHEL, 2008; LOPES, 2010; BERTHO et al., 2013). 30 3.5.5 Marcadores da Leucemia Linfoblástica Aguda da linhagem- B Os principais marcadores imunológicos das células da linhagem B que permitem diagnóstico e classificação da LLA-B são HLA-DR, TdT, CD10, CD19, CD20, CD21 e CD22c (imunocitopasmático), CD34, CD79 e IgS (imunoglobulina de superfície) Kappa ou Lambda (Quadro 2). Para que o caso seja definido da linhagem B, é preciso que seja encontrado os marcadores CD19 e CD79a. Com esses achados as leucemias linfoblásticas agudas de tipo B podem ser subclassificadas em leucemia linfoblástica aguda Pró-B, leucemia linfoblástica aguda tipo comum, leucemia linfoblástica aguda Pré-B ou leucemia linfoblástica aguda B- maduro (MICHEL, 2008). O quadro 4 demonstra uma síntese dos principais marcadores utilizados para o diagnóstico da leucemia de células B. Esses achados remetem a criação de painéis de anticorpos monoclonais para o diagnóstico por imunofenotipagem dessa neoplasia. Todavia a presença de CDs (CD5+, CD19+, CD23+, CD20 fraco, CD79b fraco ou ausente), imunoglobulina de superfície monoclonal cadeia leve Kappa e Lambda fraca são importantes achados (GARCÍA-CANDEL et al., 2012; KERN et al., 2012). A monoclonalidade de linfócitos que apresentam CD5 na ausência de marcadores T (CD19, CD20, CD22, CD79b e IgS é sugestivo a LLC-B (REGOet al., 2009). A LLA-B apresenta marcadores característicos (CD19, CD79a, CD10, HLA-DR e TdT+) que devem ser considerados na investigação da doença, podendo ser também inserido ao painel de investigação os CD20 e CD22. No entanto, nota-se que o CD5+, CD23+, na presença de IgM e IgDlow e na ausência de marcadores de linfócitos T, são importantes para a investigação diferencial desse tipo de leucemia (LOPES, 2010). Para Craig (2008), o marcador CD5+ deve ser associado a outro marcador (p.e. CD10) devido a sua expressão em células B normais. 31 Quadro 4 - Principais marcadores imunológicos das leucemias linfoblástica aguda e linfocítica crônica de células B. MARCADORES IMUNOLÓGICOS DAS LEUCEMIAS LINFOBRÁSTICAS E LINFOCITICAS B LLA CDs Autor (es) LLC CDs Autor (es) CD10, CD19 PIER, 2008; CD5 PIER, 2008; GARCÍACHIARETTI et al., CANDEL,et al.,2012; KERN, CD20, CD23 CD79a 2014; 2012; LOPES, 2008 REICHARD et al., 2011 CD24 LLA-B LLA-T CD34, CD45 Kappa ou Lambda sup REICHARD et al., 2011 IgMcit FALCÃO, 2009 IgMem CD38 CD13 Legenda: TdT- SAKUMARAN et al., 2015 PIER, 2008, GARCÍACANDEL,et al.,2012; KERN, 2012; LOPES, 2008 HLA-DR LOPES, 2010 CD22 (fraco) PIER, 2008; GARCÍACANDEL,et al.,2012 LLC-T TdT+ CD19 CD20(fraco) PIER,2008;CHIAR ETTI et al., 2014; REICHARD et al., 2011 PIER, 2008; REICHARD et al., 2011 CHIARETTI et al.,2014; LLC-B CD22c CD11c FMC7(fracoo uausente) CD25 PIER, 2008; GARCÍACANDEL,et al., 2012 PIER, 2008; GARCÍACANDEL,et al.,2012 PIER, 2008 CD10 PIER, 2008 CD79b (fracoouause nte) TdT, CD24 CD56, CD38 CD103, CD16 Kappa ou lambda PIER, 2008;GARCÍACANDEL,et al.,2012; KERN, 2012; FALCÃO, 2009 LOPES, 2010; GARCÍACANDEL et al.,2012 desoxinucleotidil-transferase, cit- citoplamático, 3. 5.6 Marcadores dos subtipos da leucemia linfoblástica e linfocítica da linhagem-B O quadro 5 apresenta a relação de marcadores imunológicos utilizados para determinação e subclassificação das leucemias aguda e crônicas da linhagem células B. Vários autores apontam tais marcadores como determinantes para as subclassificações dessas leucemias (MICHEL, 2008; PIER, 2008; CHIARETTI et al., 2014). 32 Quadro 5 - Marcadores imunológicos dos subtipos da leucemia linfoblástica e linfocítica de células B SUBTIPOS DAS LEUCEMIAS LINFÓIDES B AGUDAS E CRÔNICAS CDs Autor (s) LLC-B CDs CD19+ Ig sup + CD10+ PIER, 2008, CD19+ MICHEL,2008;CHIARETTI CD20/CD22 + et al.,2014 CD23 CD5-/+ PIER, 2008, CHIARETTI et CD34Pré-B CD11c al.,2014 FMC7+ CHIARETTI et al.,2014 TdT+ PróCD25 -/+ CD22 linfocítica CD10CD79aCy+ B CD79b+ CHIARETTI et al.,2014 CD19+ CD34 Pró-B CD22 TdT+ CD79aCy+ CD10Legenda: Ig- imunoglobulina, sup- superfície, positivo (+), negativo (-) LLA-B Autor(s) PIER, 2008 Todos os CDs utilizados para montagem do painel são importantes, no entanto, os marcadores CD19+ e CD79+ são característicos desse tipo de leucemia aguda, e por ser quase que exclusivo de células B e permanecer durante o processo de desenvolvimento, diferenciação, são necessários estarem presentes no painel para determinação dessa neoplasia (MICHEL, 2008; PIER, 2008; CHIARETTI et al.,2014). 3.5.7 Leucemia linfocítica crônica A leucemia linfocítica crônica também denominada leucemia linfoproliferativa crônica é uma neoplasia que apresenta malignidade e afeta as células maduras da linhagem linfóide (GARCÍA-CANDEL et al., 2012). É uma doença heterogênea com aumento gradativo do número de linfócitos no sangue periférico e órgãos do sistema imunológico, é considerada a leucemia mais vistas pelos hematologistas e sua prevalência aumenta com a idade (BYRD, 2015). Apresenta baixa incidência em indivíduos <50 anos (5 casos/100.000 habitantes, 20% de todo diagnóstico) e maior incidência acima dos 70 anos (30 casos/100.000) com média de diagnóstico entre 6470 anos, geralmente os homens são mais acometidos pela a LLC (2:1) (LAKOUMENTAS et al., 2012). A etiologia é desconhecida até o presente momento, pois não foi demonstrada relação com radiações e poucos casos apresentaram relação com o meio ambiente, vírus ou agentes tóxicos (MARCO et al., 2013) Na LLC, alguns pacientes podem sem assintomáticos sem necessidade de tratamentos, enquanto outros podem evoluir com sinais e sintomas agressivos antes 33 ou após o diagnóstico (VERONESE et al., 2015). A patologia cursa geralmente com linfocitose (>5.0x109/dL) por pelo menos 90 dias, esplenomegalia, adenopatias, infecções de repetições, infiltração tissular ou insuficiência medular, não sendo regra, pois alguns pacientes encontram-se assintomáticos (KERN et al., 2012). 3.5.8 Marcadores da leucemia linfocítica crônica da linhagem-T Na LLC-T são observados os marcadores CD1a, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TCR alfa/bet, CD10, CD14, CD103, TdT e FMC7 (Quadro 1) (LOPES, 2010; SOUTO, 2011). 3.5.9 Marcadores dos subtipos da leucemia linfocítica da linhagem-T Os marcadores imunológicos característicos das leucemias linfocíticas de células T estão descritos no quadro 4. São marcadores importantes na determinação e subclassificação das LLC-T, a depender da sua expressão nas células T maduras determina-se o subtipo da LLC-T (CHIARETTI et al., 2014). 3.6 CARACTERÍSTICAS CLINICAS DAS LEUCEMIAS Mesmo apresentando características imunofenotípicas distintas as leucemias podem apresentar características clínicas peculiares comuns entre si. Os indivíduos com leucemia apresentam quadro clinico característico, tais como, aumento de blastos leucêmicos na medula óssea que dificulta a produção de células normais capazes de desempenhar as funções imunológicas (leucócitos) e nas trocas gasosas (eritrócitos) (MARCO et al., 2013; KERN et al., 2012).Apresenta-se leucocitose com febre, anemia com queixas de fadigas constante, e baixa produção de plaquetas, na maioria das vezes podendo apresentar sangramento cutaneomucoso. A depender do tipo de leucemia o paciente ainda pode apresentar quadro clinico com infiltração de outros tecidos (fígado, baço, linfonodos, meninges e boca (MARCO et al., 2013; KERN et al., 2012; INCA, 2014). 34 3.7 DIAGNÓSTICO DAS LEUCEMIAS DE ORIGEM LINFÓIDE O grupo FAB determina que indivíduos com blastos acima de 30% é sugestivo a um quadro leucêmico, entretanto, a OMS sugere 20% de blastos em sangue periféricos ou medula óssea como alerta para suspeita da leucemia (BRAND et al., 2009). Para o diagnóstico da leucemia é necessário hemograma, esfregaço sanguíneo e da medula óssea, biópsia medular ou mielograma, citogenética, biologia molecular e imunofenotipagem por citometria de fluxo para diferenciação das linhagens leucêmicas (DONGEN et al., 2012). Os resultados dos exames hematológicos (hemograma, leucograma, plaquetograma, esfregaço sanguíneo e medular), citogenética, biologia molecular e atualmente a imunofenotipagem por citometria de fluxo, são necessários para a classificação da leucemia linfóide (Brand et al., 2009). Cada um apresenta sua peculiaridade para o diagnóstico, classificação, prognóstico e monitoramento da doença (SILVEIRA et al., 2008). Os exames hematológicos apontam os primeiros achados para suspeita das doenças, irá sinalizar eventos importantes, por ex.: presença ou ausência de leucocitose, linfocitose, neutropenia ou plaquetopenia (BEZERRA et al., 2011). O microscopista ao analisar o esfregaço sanguíneo e/ ou medular deverá fazer uma descrição das características morfológicas das células observadas indicando se há presença de blastos granulares ou agranulares, essa descrição é importante para que o médico hematologista solicite exames mais específicos. Mesmo sendo acessível e rápido, o hemograma é considerado um exame relativamente simples não é possível dizer através dele o fenótipo necessário para determinação da leucemia linfoide necessitando de exames complementares de citogenética e imunofenotipagem para o diagnóstico correto (SOULIER et al., 2015). As técnicas mais usadas para determinar o padrão genético das leucemias são: citogenética convencional, citogenética molecular (FISH: hibridização fluorescente in situ; CGH: hibridização genômica comparativa), além dos métodos de biologia molecular (Southern blotting, PCR), entre outras (HALLEK et al., 2008; QUIXABEIRA et al., 2008). As analises citogenéticas são preconizadas pela OMS para confirmação das leucemias. Através dessas análises é realizado prognóstico e a estratégia para o tratamento. 35 A citogenética é importante para determinar o genótipo das amostras com suspeitas de leucemia e fornece várias informações, tais como: confirmação do diagnóstico, informação sobre a classificação e estadiamento da doença, clonalidade celular do clone leucêmico, evidencias da linhagem celular do clone leucêmico, indicação dos mecanismos de leucemogênese, demonstração de fatores etiológicos implicado no processo neoplásico e monitoramento de transplante medular (HALLEK et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2014). Geralmente cerca de 80% das leucemias agudas apresentam anormalidades, sua determinação é fundamental para estratégia do tratamento. As alterações cromossômicas e aquelas associadas a alterações de expressão gênica são as duas principais categorias genéticas estudadas nas leucemias através da citogenética (QUIXABEIRA et al., 2008) A citogenética convencional ainda é caracterizada uma das principais técnicas utilizadas para determinação das anormalidades cromossômicas das células hematopoiéticas, permite a análise global do cariótipo com informações genômicas importantes relacionadas à deleção, inserção ou translocação dos cromossomos ( OLIVEIRA et al., 2014). As desvantagens estão relacionadas ao uso do material retirado diretamente da medula óssea tornando uma técnica indiretamente invasiva, o material colhido deve está em processo de metáfase, além do mais, é importante que os cromossomos alcancem o máximo de condensação e alinhamento, caso contrário é difícil a visualização das anormalidades (HARRISON et al., 2010). Cerca de 80% das alterações citogenéticas presente na LLC podem ser identificadas pela técnica de FISH. Essa técnica é utilizada para a análise das anormalidades genéticas moleculares e tem papel importante nas classificações das leucemias linfóides. A análise tem valor no prognóstico e na decisão terapêutica do paciente. Por tanto, recomenda-se que a citogenética pode ser realizada antes e depois do tratamento. Apresenta vantagens quando comparada a citogenética convencional, apresentando uma maior sensibilidade, no entanto, é uma técnica relativamente com custo elevado. (HALLEK et al., 2008). As evidências apontam que a imunofenotipagem por citometria de fluxo complementa os achados do estudo anatomopatológico/imunoistoquímico, permitindo um diagnóstico hematopatológico rápido e preciso das doenças linfoproliferativas. Bezerra e colaboradores (2011), afim de evidenciar e correlacionar a Imunofenotipagem por citometria de fluxo ao exame de anatomia patológica de 36 doenças linfoprolifetivas avaliou 157 amostras de biopsias e punções aspirativas de gânglios ou nódulos de 142 pacientes durante 10 anos (1999 -2009). As concordâncias entre os resultados dos exames alcançaram 81% entre as duas técnicas.Os resultados apontados pela citometria de fluxo elevaram essa técnica como uma das melhores para estudos imunohematológicos, tornando a imunofentotipagem mais especifica e sensível na classificação e monitoramento das leucemias (SILVEIRA et al., 2008). 3.8 IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO 3.8.1 Princípios técnicos da imunofenotipagem por citometria de fluxo O aparelho citômetro de fluxo surge de uma variedade de ferramentas e tecnologias desenvolvidas na área da computação, biotecnologia, tecnologia de raios laser e da eletrônica que utiliza o princípio físico, químico e biológico para identificação celular. É formado por uma fonte de luz (laser) que incide sobre as células marcadas por fluorocromos para excitação dos mesmos; sistema de fluxo continua hidrodinâmico; câmara de fluxo; sistema ótico; fotosensores e um sistema de software para visualização e interpretação dos resultados, conforme demonstrado na figura 2 (BERTHO et al., 2013). Por meio de um sistema fluídico as células em suspensão são transportadas para dentro de uma câmera de fluxo para serem interceptadas pelo sistema de laser. O sistema fluídico é composto basicamente por compressor de ar que determina a passagem da amostra em diferentes velocidades, podendo ser ajustada em baixa, média ou alta (BERTHO et al., 2013). A câmara de fluxo é determinante para a análise da amostra pois permite que as células passem em fileira, em um fluido de revestimento, individualmente para serem interceptadas pelo laser (QUIXABEIRA et al., 2008). O sistema óptico é composto por filtros e espelhos com a capacidade de captar e direcionar a luz emitida pelos fluorocromos e pela dispersão da luz do laser. A dispersão da luz tem propriedade de classificar as células de acordo a sua morfologia e granulosidade, baseado no sistema de lente frontal (Forward Scatter- FSC) que capta a dispersão ou espalhamento da luz para determinar a morfologia celular e outra lateral (Side Scatter-SSC) com a capacidade de terminar as características intracitoplasmáticas (granulosidade celular) (WILKERSON, 2012). 37 Após a excitação dos fluorocromos os sinais emitidos são captados pelo sistema óptico e direcionado para os fotomultiplicadores (FL1,FL2, FL3, FL4), que detectam a intensidade de fluorescência das células marcadas, identificando em uma mesma amostra populações celulares distintas através de software específico (QUIXABEIRA et al., 2008). Figura 2- Representação esquemática do funcionamento do citomêtro de fluxo Fonte: Bertho et al., (2014). FSC - dispersão frontal; SSC – dispersão lateral; PMT – fotomultiplicador; dotplot – gráfico de pontos. 3.9 A IMPORTÂNCIA DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO DA LEUCEMIA LINFÓIDE Este é um método diagnóstico de extrema importância porque permite diferenciação dos clones leucêmicos através das características fenotípicas, sendo indispensável para o entendimento, tratamento, prognóstico e acompanhamento da doença, que eleva a determinação para 99% dos casos (REGO et al., 2009; SILVEIRA et al., 2008; PAIVA et al., 2010). O quadro 6 se refere aos principais materiais 38 biológicos utilizados no diagnóstico através da imunofentotipagem por citometria de fluxo. Para a realização da técnica da imunofenotipagem por citometria de fluxo é necessário um painel de anticorpos monoclonais criados a partir da suspeita diagnósticos dos especialistas no intuito de analisar qualitativamente e quantitativamente as populações e características celulares. Segundo Chiaretti (2014), a imunofenotipagem por citometria de fluxo tornou-se um importante procedimento padrão para determinação das leucemias devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Vários estudos têm demonstrado resultados satisfatórios na utilização da citometria de fluxo para caracterização imunofenotípica da clonalidade celular para diagnóstico das leucemias. Um estudo desenvolvido por Lopes (2010), a fim de avaliar os padrões de expressões de antígenos procedentes de células leucêmicas analisou amostras de 80 pacientes (45 homens e 35 mulheres, média de idade 65 anos) pelo método da imunofenotipagem, tendo como resultado a detecção dos marcadores monoclonais para células B (CD5+, CD19+, CD20+, CD23+ e HLADR+), sendo que na maioria dos casos (59,7%) as células leucêmicas dos pacientes expressaram IgM e IgD de baixa intensidade e cadeia leve Kappa. Esse estudo demonstrou através imunofenotipagem importantes marcadores para o diagnóstico da leucemia linfocítica crônica-B, evidenciando marcadores específicos. Iwamoto e colaboradores (2011), utilizaram a citometria de fluxo para avaliar a expressão de antígenos em crianças com leucemia linfoblástica aguda em um grupo de 1.774 crianças. Foram observados que os marcadores CD3Cit e CD7 apresentaram positividades para todos os casos. Do total, foram encontrados 87% na LLA-B e 13% na LLA-T. Os antígenos CD2, CD5 e TdT corresponderam a 80% das LLA-T. 39 Quadro 6 - Forma de uso e características das amostras biológicas na imunofenotipagem por citometria de fluxo CARACTERÍSTICA DA AMOSTRA BIOLÓGICA, ENVIO, E VIABILIDADE NA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO Tipo da amostra Anticoagulant e usado Volume (mL) Tempo útil (horas) Temperatura para o envio Conservação Aspirado de gânglio ou tumores Líquidos biológicos (Líquor, L. Pleural, ascético, etc) Massas tumorais (gânglio, baço, etc) Medula óssea NA NA 2-3 Temp. ambiente NA 10-20 2-3 Temp. ambiente Em solução SF 0,9% ou meio RPMI NA NA NA 2-3 Temp. ambiente EDTA ou Heparina EDTA ou Heparina 2-3 24 5-10 24 Temp. ambiente Temp. ambiente Sangue Em solução SF 0,9% ou meio RPMI NA N Fonte: Adaptado de Souto (2011) - NA - Não atribuído, SF- Soro fisiológico, EDTA- ácido etilenodiamino tetra-acético , RPMI- Roswell Park Memorial Institute Medium 3.9.1 Avanços, vantagens e limitações da citometria de fluxo Após o advento da citometria de fluxo ocorreu uma melhora considerável na identificação e analises das estruturas biológicas. A incorporação dos diversos hardwares e softwares para estudar e analisar melhor a natureza celular, bem como, o desenvolvimento de lasers cada vez mais sofisticados, produção de sondas fluorescentes e reagentes, automação, gerações de sinais digitais mais claros tem permitido com precisão a análiseda região intra e extracitoplasmática das células, assim como, a caracterização mais adequada dos eventos imunológicos e moleculares fundamentando a saúde e a doença (O’DONNELL et al., 2013). Para Craig e colaboradores (2008), a citometria de fluxo se tornou uma ferramenta de grande importância para a imunofenotipagem nessas últimas décadas e ressalta a importância dos profissionais possuírem conhecimentos elevados sobre as características da linhagem celulares em estudo. Assim, dentre as vantagens apresentadas pela imunofenotipagem por citometria de fluxo a mais notada é a capacidade de possuir uma ampla aplicação para o diagnóstico e nas investigações para fins de resultados de pesquisas (SILVEIRA et al., 2008) Entretanto, a técnica também possui algumas desvantagens, dentre elas,a variabilidades das expressões antigênicas, perda celular (por fragilidade no momento 40 da preparação) e trabalhar com material a fresco com um número considerável de células neoplásicas (BEZERRA et al., 2011). Outra limitação da técnica é manter as células em suspensão para não ficarem presas nas placas de culturas (ROBINSON et al., 2012). Um dos grandes desafios ainda é padronizar os protocolos entre os laboratórios e tornar o prognóstico menos confuso. A tabela 1 faz uma breve comparação entre as principais vantagens e desvantagens da imunofenotipagem por citometria de fluxo multiparamétricas. Tabela 1 - Principais vantagens e desvantagens da imunofenotipagem por citometria de fluxo Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo Vantagens Analise diferencial de células Desvantagens normais e Variabilidades das expressões antigênicas. anormais em MO ou SP. Perda celular. Análise heterogênea e clonalidade das células Material a fresco. malignas. Número considerável de células neoplásicas. Análise multiparamétricas das amostras em Manter as células em suspensão. único tubo. Encontrar profissional treinados. Alto grau de especificidade e sensibilidade. Custo elevado. Detecção simultânea de marcadores múltiplos em população de células distintas. Identificação objetiva de antígenos mutados coexpressos. Resultados rápidos. Fontes: Craig (2008); Quixabeira (2008); Silveira et al. (2008); Bezerra et al. (2011); Robinson et al. (2012); Bertho et al. (2014); 41 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS O avanço técnico-científico no diagnóstico das doenças imunohematológicas é inegável e sem dúvida a imunofenotipagem por citometria de fluxo transformou o padrão do diagnóstico das leucemias. A etiopatogenia da leucemia linfóide ainda não está completamente elucidada, entretanto, fatores ambientais, genéticos, físicos, químicos, biológicos e infecções por alguns tipos de vírus podem desencadear esse tipo de neoplasia. Acredita-se que as alterações fenotípicas apresentadas pelas células da origem linfóide são consequências dessas interações. Os estudos epidemiológicos, análise citogenética molecular em conformidade com a imunofenotipagem podem ajudar nesta compreensão. A literatura mostra que o painel para fenotipagem das células leucêmicas varia entre os laboratórios e que o entendimento da fisiopatologia da doença é fundamental. No entanto, alguns marcadores são essenciais para determinação da linhagem leucêmica envolvida. Os marcadores CD1a, CD2, TCRαβ, TCRγδ, CD3 Cit/Sm definem LLA-T, enquanto CD10, CD19, CD20 , CD22c, CD79a/b, Kappa ou Lambda e IgM determina LLA-B. Para LLC-T, os marcadores CD4, CD7, CD8, CD3, TCR alfa/beta, CD1a , foram os mais indicados, enquanto para a LLC-B, CD23, CD20, CD19, CD22 (fraco), CD10, CD79b(fraco ou ausente), FMC7 (fraco ou ausente). Muitos dos resultados apontaram que essa técnica apresenta alta especificidade, sensibilidade, confiança, resultados rápidos e precisos. Assim, pode ser usada nos grandes centros de oncologia para as análises de marcadores imunológicos para confirmação, classificação e monitoramento das leucemias linfoides de células B e T com resultados em um curto intervalo de tempo para favorecer tratamentos imediatos aos pacientes. Neste estudo não avaliamos como ocorre à acessibilidade dos pacientes usuários do sistema único de saúde- SUS à imunofenotipagem por citometria de fluxo. Indagações do tipo, quantos aparelhos de citometria de fluxo existem no Brasil e quantos são disponibilizados para o uso dos pacientes do SUS ainda estão sem reposta. Esse tipo de questionamento é necessário e importante para as políticas de saúde pública do Brasil, pois, deve-se avaliar a importância e inserção dessa técnica nos centros de oncologia imunohematológica para o diagnóstico correto da doença. 42 Por fim, observa-se e sugere-se a necessidade de um consenso nacional para o uso de painéis de marcadores monoclonais para classificação e diagnostico diferencial das leucemias linfóides através da imunofenotipagem por citometria de fluxo. 43 REFERÊNCIAS BÉNÉ, M. C. et al. Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia, Vandoeuvreles Nancy, v. 25, n. 4, p. 567-574, 2011. BERTHO, Á. L. et al. 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