avaliação de um teste comercial de diagnóstico rápido na detecção

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
EDIVALDO COSTA SOUSA JÚNIOR
AVALIAÇÃO DE UM TESTE COMERCIAL DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO
NA DETECÇÃO DO NOVO VÍRUS INFLUENZA A/H1N1 PANDÊMICO
BELÉM - PA
2010
ii
EDIVALDO COSTA SOUSA JÚNIOR
AVALIAÇÃO DE UM TESTE COMERCIAL DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO
NA DETECÇÃO DO NOVO VÍRUS INFLUENZA A/H1N1 PANDÊMICO
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado como requisito parcial para
obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina pela Universidade Federal do
Pará – UFPa.
Orientador: Dr. Wyller Alencar de Mello.
Co-orientadora: Msc. Mirleide Cordeiro
dos Santos
BELÉM - PA
2010
iii
EDIVALDO COSTA SOUSA JÚNIOR
AVALIAÇÃO DE UM TESTE COMERCIAL DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO
NA DETECÇÃO DO NOVO VÍRUS INFLUENZA A/H1N1 PANDÊMICO
Este trabalho foi avaliado e aprovado para
obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina, sendo aprovado na sua
forma final com conceito
_____________________.
BANCA EXAMINADORA:
____________________________
Dra. Joana D’Arc Pereira Mascarenhas
Instituto Evandro Chagas (IEC)
____________________________
Msc. Jane Haruko Lima Kaiano
Instituto Evandro Chagas (IEC)
____________________________
Msc. Sylvia de Fátima dos Santos Guerra
Instituto Evandro Chagas (IEC)-Suplente
BELÉM - PA
2010
iv
“Se as doenças infecciosas ainda podem
matar mais pessoas do que uma guerra,
significa que o homem ainda não foi
capaz de perceber quem é seu verdadeiro
inimigo”.
Edivaldo Júnior
v
Á Deus e minha família; pilares sobre os
quais me sustento e fortaleço a cada dia.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela minha vida, pela força que me dá todos
os dias, pela coragem de lutar pelo que almejo e por ter me capacitado a realizar
este trabalho.
Á minha mãe Enedina, que sempre lutou para dar o melhor aos seus filhos e
que sempre vibrou com cada conquista em minha vida.
Á minhas tias Laide e Terezinha pelo amor, carinho, dedicação e apoio em
todos os momentos da minha vida, nunca duvidando da minha capacidade, mas
sempre orando para que eu pudesse alcançar todos meus objetivos.
A minha avó Josefa por cuidar de mim e por ter ainda um cuidado tão
especial comigo.
Ao meu orientador, Dr. Wyller Mello pelo apoio e atenção, por dar-me a
oportunidade de ampliar meus conhecimentos, contribuindo sobremaneira na minha
formação e caráter profissional.
A minha co-orientadora Msc. Mirleide Santos pela amizade, apoio e conselhos
que irei levar comigo para sempre. Serei sempre grato a você, por fazer em todos os
momentos, muito mais do que eu esperava de um orientador. Seu apoio foi
fundamental para que eu pudesse realizar este trabalho.
A Dra. Rita Medeiros por ter aceitado na minha primeira iniciação científica, o
que contribuiu muito em minha vida e no meu aprendizado como pesquisador.
Ao grande amigo Rodrigo Silvestre que sempre me apoiou ao qual tenho
como exemplo de vida e como pesquisador. Obrigado por ter me ajudado quando
mais precisei.
Ao meu grande amigo e irmão de bancada, James, por ter ativamente
participado deste trabalho durante os sábados. Muito obrigado por sempre ter
estendido a mão nos momentos cruciais.
Aos meus dois irmãos de bancada Allan Kaio e Luís, que muito me ajudaram
no início da minha iniciação científica e até hoje são exemplos para mim. Muito
obrigado.
Aos meus amigos do Laboratório de Vírus Respiratório que sei que sempre
posso contar: Isabel, Luana, Edna, Jessilene, Pacheco e Socorro. Obrigado por
todos os momentos de descontração e amizade vividos durante estes anos.
A Kamila, por sempre me ajudar e ter me ajudado neste trabalho. Muito
obrigado, sem você este trabalho não seria possível.
A irmã que a vida me deu Fernanda Paola, obrigado por todo apoio dado ao
longo destes anos e por esta amizade incondicional que temos. Sei que sempre
posso contar com você.
vii
A Raquel Silva por toda paciência e compreensão comigo durante a
realização deste trabalho. Obrigado por estar em minha vida.
Ao Instituto Evandro Chagas, local onde descobri a paixão de ser
pesquisador.
Aos amigos da Virologia: Yasmin, Patrícia, Jones, Dielle, Silvia e Akim e aos
demais amigos do IEC que contribuíram com meu crescimento profissional e
pessoal, muito obrigado.
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente na execução deste
trabalho, estendendo-me a mão no momento em que mais precisei. Muito Obrigado.
viii
RESUMO
Introdução: A influenza tem sido uma das principais causas de morbidade e
mortalidade em todo o mundo e o surgimento da pandemia causada pelo vírus
Influenza A/H1N1 revelou a necessidade da utilização de metodologias cada vez
mais rápidas, sensíveis e específicas. Objetivo: Este estudo objetivou avaliar a
sensibilidade e especificidade do “kit” BD DirectigenTM EZ Flu A+B, na detecção de
antígenos do vírus Influenza A/H1N1 pandêmico em amostras de aspirado de
nasofaringe e swab combinado. Materiais e Métodos: Foram analisadas 240
amostras através da metodologia de
imunocromatografia de fase sólida.
Resultados: O “kit” BD DirectigenTM EZ Flu A+B resultou em uma sensibilidade de
47,62 % e uma especificidade de 100 %. No que se refere aos valores preditivos
negativo e positivo, obteve 21,43% e 100%, respectivamente quando comparado à
técnica de RT-PCR em tempo real na detecção do vírus. O teste utilizado
apresentou uma baixa sensibilidade, mas uma alta especificidade, permitindo inferir
como definitivo os casos positivos pelo método imunocromatográfico, porém não se
pode descartar a possibilidade de infecção diante de casos negativos durante a
baixa prevalência do vírus influenza.
Palavras chave: Influenza A, IEC, TRDI.
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1
1.1 BREVE HISTÓRICO............................................................................................ 1
1.1.1 A Pandemia de 1918/ 1919- “Gripe Espanhola” (H1N1).............................. 1
1.1.2 A Pandemia de 1957- “Gripe Asiática” (H2N2)............................................. 2
1.1.3 A Pandemia de 1968- “Gripe de Hong Kong” (H3N2).................................. 2
1.1.4 A re-emergência dos vírus H1N1 em 1977- “Gripe Russa”......................... 3
1.1.5 A Pandemia de 2009/ 2010- “Gripe A” (H1N1)............................................. 3
1.2 CLASSIFICAÇÃO................................................................................................ 4
1.3 MORFOLOGIA E ESTRUTURA VIRAL.............................................................. 5
1.4 ORGANIZAÇÃO GENÔMICA............................................................................. 7
1.5 REPLICAÇÃO...................................................................................................... 8
1.6 ASPECTOS CLÍNICOS....................................................................................... 11
1.7 VARIAÇÃO ANTIGÊNICA.................................................................................. 12
1.8 EPIDEMIOLOGIA.................................................................................................13
1.9 DIAGNÓSTICO..................................................................................................15
1.9.1 Cultura Viral.................................................................................................. 15
1.9.2 Imunofluorescência...................................................................................... 16
1.9.3 Reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição
reversa (RT-PCR)......................................................................................... 16
1.9.4 Os Testes de Rápido Diagnóstico de Influenza (TRDI)............................ 17
2. OBJETIVO
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 19
3.1 VÍRUS TESTADO............................................................................................... 19
3.2 ESPÉCIMES........................................................................................................ 19
3.3 BD DIRECTIGENTM EZ FLU A+B...................................................................... 19
3.4 RT- PCR EM TEMPO REAL............................................................................... 19
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................... 19
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO…....................................................................... 20
5. CONCLUSÃO….................................................................................................... 22
6. REFERENCIAL TEÓRICO…............................................................................... 23
7. ANEXOS............................................................................................................... 28
x
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
Figura 1 - Árvore filogenética das hemaglutininas e neuraminidases....................... 4
Figura 2 - Reservatórios dos vírus Influenza A.......................................................... 5
Figura 3 - Microscopia eletrônica do vírus Influenza A/H1N1 pandêmico................. 6
Figura 4 - Estrutura esquemática da partícula do vírus Influenza.............................. 7
Figura 5 - Esquema representativo do genoma do vírus Influenza A......................... 8
Figura 6 - Ácido Neuroamínico ligado à Galactose.....................................................9
Figura 7 - Ilustração do ciclo de replicação do vírus Influenza A..............................11
Figura 8 - Relação entre os vírus Influenza circulantes e o novo
Influenza A/H1N1 pandêmico.....................................................................................14
Figura 9 - Modo de atuação de um TRDI tradicional................................................ 17
Quadro 1 - Lista das funções relacionadas a cada proteína dos vírus
Influenza A.................................................................................................. 6
Quadro 2 - Comparativo entre os testes diagnósticos
disponíveis para Influenza........................................................................ 15
Quadro 3 - “kit”s para rápido diagnóstico de Influenza..............................................18
Quadro 4 - Comparação entre os resultados obtidos pela metodologia
de rRT-PCR e a imunocromatografia....................................................... 20
Quadro 5 - Desempenho do ““kit”” BD DirectigenTM EZ Flu A+B,
comparado à rRT-PCR para detecção do vírus Influenza A/H1N1
pandêmico................................................................................................. 21
Quadro 6 - Comparação entre os resultados obtidos no presente
estudo e os obtidos em outros países...................................................... 21
xi
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
Ac
anticorpo
Ag
antígeno
ANF
Aspirado de Nasofaringe
cap
Catabólito Ativador de Proteína
CDC
Centro para Controle e Prevenção de Doenças
HA
Hemaglutinina
IFD
Imunofluorescência direta
IFI
Imunofluorescência indireta
M1
Proteína de Matriz
M2
Canal de protóns
NA
Neuraminidase
NEP/ NS2 Proteína exportadora nuclear/Proteína não-estrutural 2
NP
Nucleoproteína
NS1
Proteína não-estrutural 1
OMS
Organização Mundial da Saúde
ORF
Matriz de leitura aberta
PA
Polimerase Ácida
PB1
Polimerase Básica 1
PB1-F2
Segunda matriz da Polimerase Básica 1
PB2
Polimerase Básica 2
RNA
Ácido ribonucléico
RNAc
Ácido ribonucléico complementar
RNAm
Ácido ribonucléico mensageiro
RNAv
Ácido ribonucléico viral
RNP
Ribonucleoproteína
xiii
rRT-PCR A reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição
reversa em tempo real
RT-PCR
Reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição
reversa
SC
Swab combinado
TDRI
Teste de diagnóstico rápido de Influenza
α 2,3
Carbono 3 da galactose ligado ao carbono 2 do ácido siálico
α 2,6
Carbono 6 da galactose ligado ao carbono 2 do ácido siálico
α-NeuAc Ácido neuramínico
1
1. INTRODUÇÃO
A influenza ou gripe é uma doença infecciosa causada pelos vírus
Influenza, que em seres humanos possui tropismo por células do trato respiratório.
As infecções por vírus influenza atingem cerca de 500 milhões de pessoas todos os
anos (Gerdil, 2003), constituindo-se assim, em uma das principais causas de
morbidade e mortalidade em crianças, idosos e pacientes imunocomprometidos
(Nakajima et al., 2010).
1.1 BREVE HISTÓRICO
O nome Influenza surgiu na Itália, na Idade Média, pois se acreditava que
as epidemias ocorriam devido a influência dos astros (Vélez, 2002), porém a
sintomatologia desta doença já havia sido descrita por volta do século V a.c por
Hipócrates que relata uma epidemia de tosse seguida de pneumonia. Porém o
primeiro isolamento do vírus Influenza só pode ser realizado em 1933 (Smith et al.,
1933).
As epidemias de Influenza ocorrem todos os anos, enquanto que as
pandemias possuem caráter mais esporádico. No entanto, desde o século XVI, pelo
menos 30 pandemias já foram descritas (Forleo-Neto et al., 2003).
1.1.1 A Pandemia de 1918/ 1919- “Gripe Espanhola” (H1N1)
A origem geográfica do vírus que causou esta pandemia é controversa;
alguns historiadores afirmam que este surgiu na China, outros que surgiu nos
campos militares americanos (Subbarao & Cox, 2000). Contudo, estudos têm
demonstrado que esta primeira epidemia iniciou-se com surtos em Detroid, Carolina
do Sul e Kansas no início de 1918 espalhando-se nas tropas americanas como uma
infecção comum (Potter, 2001).
2
O contato entre as forças expedicionárias americanas e britânicas durante
a guerra na Europa permitiu a disseminação deste vírus, logo foram observados os
primeiros casos na Europa. Após uma calma nas taxas de infecção com a chegada
do inverno uma forma altamente virulenta, causou uma segunda onda de infecções
que acometeu cerca de 50% da população mundial com um total de 40-50 milhões
de mortes, mais do que a I Guerra Mundial, tornando-se o evento mais destrutivo da
história médica (Potter, 2001).
1.1.2 A Pandemia de 1957- “Gripe Asiática” (H2N2)
A Gripe Asiática iniciou em fevereiro de 1957 no sudeste da China, na
Província de Guizhou e se espalhou para a Província de Yunan e em abril para
Singapura e Hong Kong. Este vírus pandêmico foi o primeiro a ser isolado que
possuía antígenos diferentes das linhagens H1N1 circulantes e rapidamente se
espalhou pelo mundo inteiro em novembro de 1957. Esta pandemia foi seguida por
duas
ondas
que
infectaram
40-50%
da
população
mundial
causando
aproximadamente 68.800 mortes (Potter, 2001).
1.1.3 A Pandemia de 1968- “Gripe de Hong Kong” (H3N2)
Onze anos após a emergência do vírus H2N2, este subtipo foi
completamente substituído pelo H3N2. Os primeiros sinais de uma nova pandemia
foram noticiados no sudeste asiático no verão de 1968, e o vírus isolado em Hong
Kong em julho de 1968. Este vírus espalhou-se pelo mundo durante o inverno de
1968 e no inverno de 1969 a 1970. Da população infectada por este vírus cerca de
40% eram crianças de 10 a 14 anos de idade. Apesar da baixa gravidade das
infecções estima-se que a taxa de mortalidade nos Estados Unidos foi de
aproximadamente 33.800 mortes. Desde sua emergência este subtipo viral se
mantém circulante na população humana até os dias atuais (Subbarao & Cox, 2000).
3
1.1.4 A re-emergência dos vírus H1N1 em 1977- “Gripe Russa”
Os sinais de um novo surto causado pelo vírus Influenza foram
observados em Tiajin, China, em maio de 1977. De novembro 1977 a janeiro de
1978 muitos jovens foram acometidos por um surto de gripe na antiga União
Soviética e China. No inverno de 1978 em vários países, foram observados surtos
que acometiam em mais de 50% dos casos, crianças em idade escolar. A morbidade
foi majoritariamente limitada a pessoas com menos de 25 anos de idade, sugerindo
que pessoas com mais idade estavam protegidas por uma imunidade pré-existente.
Isto foi confirmado quando o agente etiológico foi identificado como vírus Influenza
H1N1(A/URSS/77) que estava estritamente relacionado à cepas circulantes em
1950. Esta estrita relação e a ausência de mutações que são tipicamente adquiridas
durante a replicação viral descartam a manutenção deste em hospedeiros não
humanos. Hoje se acredita que a liberação acidental deste vírus tenha sido a causa
de sua reintrodução na população humana causando este surto. Juntamente com o
vírus Influenza A H3N2 este subtipo apresenta-se causando as epidemias anuais,
ora de forma simultânea ou intercalando entre os anos (Subbarao & Cox, 2000).
1.1.5 A Pandemia de 2009/ 2010- “Gripe A” (H1N1)
Em 2009, o programa de monitoramento de doenças infecciosas na
Fronteira dos Estados Unidos com o México detectou dois casos de gripe em
crianças causados por uma cepa viral não-tipável pelos métodos de biologia
molecular utilizados pelos laboratórios de referência. A caracterização através da
espectrometria de massa indicou tratar-se um vírus de origem suína que em pouco
tempo espalhou-se pelo México, e depois por vários países causando um surto
global, levando a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 11 de junho de 2009
declarar a Pandemia (HHO, 2009; CDC, 2009; Shen et al., 2009; Gibbs et al., 2009).
4
1.2 CLASSIFICAÇÃO
Os vírus Influenza pertencem à família Orthomyxoviridae, que é formada
por cinco gêneros: Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Isavirus e
Thogotovirus, entretanto somente os gêneros Influenzavirus A, B e C apresentam
relevância clínica em humanos (Falquet et al., 2004).
Os vírus do gênero A, ou tipo A, ainda podem ser classificados em
subtipos baseados na antigenicidade de suas proteínas de superfície hemaglutinina
(HA) e neuraminidase (NA); atualmente, 16 subtipos de HA (H1-H16) e nove
subtipos de NA (N1-N9) são conhecidos (Figura 1) (Wright et al., 2007). Este gênero
pode infectar um amplo espectro de hospedeiros, que além do homem, inclui
mamíferos aquáticos, cavalos, porcos e uma grande variedade de aves (Figura 2).
Embora existam relatos de casos humanos de infecções por vírus Influenza que
possuem hemaglutinina dos tipos H1, H2, H3, H5, H7 e H9, atualmente existem
apenas três tipos (H1, H2 e H3) e dois tipos de neuraminidase (N1 e N2) adaptados
a infectar humanos (Wright et al., 2007).
Figura 1: Filogenia dos 16 tipos de hemaglutinina e dos 9 tipos de neuraminidase. As árvores
filogenéticas de máxima verossimilhança foram geradas pela comparação de nucleotídeos das HA
(A) e das NA (B). A escala das barras representa aproximadamente 10% das trocas de nucleotídeos
entre os ramos próximos. Fonte: Imagem adaptada de Fields Virology 5a ed., capitulo 47.
5
Figura 2: Reservatório dos vírus Influenza A. As aves aquáticas selvagens são o principal
reservatório destes vírus. A transmissão viral tem sido relatada das aves aquáticas para as aves
domésticas, mamíferos aquáticos, porcos, cavalos e humanos. Os vírus também podem ser
transmitidos entre porcos e humanos e das aves domésticas para humanos. Os vírus Influenza
equinos têm sido transmitidos a cães. Fonte: Imagem retirada de Fields Virology 5a ed., capitulo 48.
Os gêneros B e C estão predominantemente relacionados a infecções em
humanos, com quadros clínicos moderados a assintomáticos. Entretanto, existem
relatos de isolamento de vírus do tipo B em focas e do tipo C em porcos (Boon et al.,
2001).
O sistema de nomenclatura para os vírus Influenza especifica o gênero, o
hospedeiro de origem (exceto quando se trata de humanos), a localização
geográfica do primeiro isolamento, número do registro laboratorial e o ano de
isolamento. A descrição antigênica é dada entre parênteses e somente para o tipo A:
A/Califórnia/7/2004 (H3N2) (Palese & Shaw, 2007).
1.3 MORFOLOGIA E ESTRUTURA VIRAL
6
Os vírus Influenza apresentam-se como partículas pleomórficas que
medem de 80-120 nm de diâmetro (Figura 3) (Nakajima et al., 2010). Os
influenzavirus A possuem uma estrutura complexa formada por onze proteínas com
funções específicas (Quadro 1) e o genoma viral com oito segmentos de RNA,
envolvida por uma bicamada lipídica derivada da célula hospedeira (Figura 4)
(McHardy et al., 2009).
Na membrana citoplasmática estão as proteínas HA, NA e M2 que se
projetam da superfície do vírus. A proteína M1 reveste internamente a bicamada
lipídica e no interior da partícula viral encontra-se o complexo ribonucleoprotéico
(RNP). Este complexo consiste no genoma viral (segmentos de RNA); nas proteínas
PB1, PB2, PA e NP. Cada partícula viral empacota oito segmentos de RNA. As
proteínas de exportação nuclear NEP/ NS2 e a NS1 estão presentes apenas nas
células infectadas durante a replicação viral (Webster et al., 1992; Palese & Shaw,
2007).
Figura 3: Microscopia eletrônica: a) Partículas isoladas do vírus H1N1 em sobrenadante de cultivo
celular. b) Partículas virais na forma filamentosa em corte histológico. Fonte Adaptado de Nakajima et
al.(2010).
Quadro 1: Lista das funções relacionadas a cada proteína dos vírus Influenza A.
Proteína
Atuação
Polimerase básica 2 (PB2)
Componente da RNA polimerase, atua no reconhecimento do cap.
Polimerase básica 1 (PB1)
Componente da RNA polimerase, possui atividade de endonuclease
e participa no processo de elongação.
Segunda matriz da Polimerase Básica 1
Atividade pró-apoptótica.
7
(PB1-F2)
Polimerase acida (PA)
Componente da RNA polimerase, atua como protease.
Hemaglutinina (HÁ)
Glicoproteína de superfície atua como receptor de ligação e fusão.
Constitui-se o maior antígeno dos vírus Influenza A.
Nucleoproteína (NP)
Atua na ligação, síntese e importação nuclear do RNA.
Neuraminidase (NA)
Glicoproteína de superfície que clivagem do ácido siálico.
Proteína de matriz interage com os RNPs e glicoproteínas de
superfície, participando também da exportação nuclear.
Proteína de matriz (M1)
Canal iônico (M2)
Proteína de membrana que funciona como canal iônico.
Proteína não-estrutural 1 (NS1)
Proteína de exportação nuclear/
Proteína não-estrutural (NEP/NS2)
Proteína multifuncional.
Exportação nuclear das RNPs virais.
a
Fonte: Fields Virology 5 ed., capitulo 47.
Figura 4: Estrutura esquemática da partícula do vírus Influenza. Fonte: Adaptado de McHardy et al. (2009).
1.4 ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Os vírus Influenza apresentam genoma de RNA de fita simples,
segmentado com polaridade negativa, sendo que os vírus de tipo A e B possuem
oito segmentos e os de tipo C, sete segmentos com diferentes tamanhos. Cada
8
segmento contém regiões conservadas não codificantes nas extremidades 5’ e 3’
flanqueando as regiões codificantes, sendo algumas destas sequencias específicas
para cada segmento (Claas et al., 1992).
O segmento PB1 contém uma segunda matriz de leitura aberta (ORF) que
vem depois da ORF que origina a PB1, resultando na proteína PB1-F2. As proteínas
M2 e NEP/NS2 são codificadas por splicing do RNA mensageiro (RNAm) (os íntrons
estão indicados pelas linhas em formato V) (Figura 5) (Palese & Shaw, 2007).
Figura 5: Esquema representativo do genoma do vírus Influenza A/Puerto Rico/8/84. Cada um dos
retângulos representa um segmento de RNA (sentido positivo) e a sua proteína codificada. Os
tamanhos e nucleotídeos e em aminoácidos, respectivamente, estão pelos algarismos localizados na
extremidade. As linhas esquematizadas nas extremidades 5’ e 3’ representam
as regiões não
a
codificadoras. Fonte: Imagem modificada de Fields Virology 5 ed., capitulo 47.
1.5 REPLICAÇÃO
Os vírus Influenza se ligam aos ácidos siálicos da superfície das células
hospedeiras para iniciar sua infecção e replicação. A proteína viral de superfície HA
reconhece o ácido siálico da célula de forma que os vírus que se replicam em
9
diferentes espécies de hospedeiros possuem HA com especificidade a diferentes
resíduos de açúcar ligados ao ácido siálico celular (Palese & Shaw, 2007).
Vírus adaptados à espécie humana ligam-se preferencialmente aos
ácidos siálicos que tem o ácido N-acetilneuramínico anexados a penúltima galactose
através de uma ligação do tipo α 2,6 (o carbono 6 da galactose liga-se ao carbono 2
do ácido siálico), enquanto que vírus Influenza aviários, principalmente, ligam-se a
ácidos siálicos que possuem ligação do tipo α 2,3 (Pillai & Lee, 2010) (Figura 6).
A especificidade está associada aos tipos de ácidos siálicos presentes
nas células epiteliais dessas espécies (epitélio do trato respiratório humano: α 2,6;
epitélio do trato digestivo de aves: α 2,3). Porém deve ser enfatizado que essa
especificidade viral não é absoluta e que tanto o epitélio humano, quanto o aviário
podem vir a ter os dois tipos de ácidos siálicos, dessa forma permitindo a infecção
de vírus aviários em humanos, por exemplo. Além disso, a especificidade de ligação
pode ser alterada por mutações sofridas pelo vírus (Palese & Shaw, 2007).
humano
Acetamida
Glicerol
aviário
α-NeuAc
Gal
Figura 6: Ácido Neuroamínico (α-NeuAc) ligado ao resíduo de açúcar (Galactose), ilustrando a
afinidade dos vírus Influenza humano e aviário ao se ligarem ao ácido siálico de acordo com a ligação
deste ao açúcar.
Quando ocorre ligação do vírus aos ácidos sialicos da superfície celular, a
partícula viral entra na célula por endocitose (Figura 7). Este endossoma é
acidificado no citoplasma até pH= 5.0, provocando a quebra da HA em HA1 e HA2.
Esta clivagem permite a fusão das membranas viral e endossomal. A acidificação do
endossoma leva a ativação do canal iônico M2 que transporta íons H+ para o interior
do vírion, desestabilizando a M1, facilitando a liberação dos RNPs virais no
citoplasma celular (Palese & Shaw, 2007).
10
Dentro do citoplasma, os RNPs são transportados de forma ativa para o
núcleo celular por meios de três sinais de transporte nuclear que estão localizados
nas proteínas NP. Dentro do núcleo os segmentos de RNA de polaridade negativa
são transcritos em RNAm por um mecanismo primer-dependente. Ao RNAm ocorre
a adição do cap e cauda poli A. A replicação ocorre em duas etapas: a primeira é
realizada a cópia de sentido positivo completa do RNA viral, que é o RNA
complementar, que será posteriormente utilizado na síntese do RNAv genômico de
fita negativa. Este processo é catalisado pelo complexo de polimerases virais com
as funções distintas de cada subunidade sendo empregadas em diferentes passos
(Palese & Shaw, 2007).
Dentro do núcleo ocorrem os processos de transcrição (síntese do RNAm)
e replicação (síntese do RNAc com polaridade negativa, seguido do RNAv de fita
negativa e de RNPs). A tradução dos RNAm que codificam proteínas de membrana
(HA, NA e M2) é feita nos ribossomos do retículo endoplasmático, os demais são
traduzidos nos ribossomos citoplasmáticos. As RNPs (RNA viral ligado à
nucleoproteínas) ligadas a M1 e a NS2 dirigem-se para a membrana plasmática e
associam-se com a região desta que já contém as proteínas de membrana (HA, NA
e M2), isto ocorre cerca de 8 horas após o início da infecção (Scheiffele et al., 1999).
O mecanismo de empacotamento responsável pela escolha dos oito
segmentos distintos numa só partícula ainda é desconhecido. A neuraminidase
remove os ácidos siálicos terminais das glicoproteínas de superfície celular e viral,
facilitando assim a liberação de partículas virais e evitando sua agregação, de modo
que cada uma possa atuar como unidade infecciosa distinta (Jawets et al., 1998).
Após vários ciclos virais, as proteínas NA e NS1 induzem a morte celular por
apoptose (Shultz-Cherry et al., 1998).
11
Figura 7: Ilustração do ciclo de replicação do vírus Influenza. Após a ligação com a superfície de
célula hospedeira, o vírus é internalizado por endocitose mediada por receptor. O baixo pH no
endossoma alavanca a fusão as membranas do endossomo e do vírus, liberando as RNP virais para
o citoplasma. As novas proteínas são sintetizadas do RNAm viral. O genoma viral (RNAv) é replicado
por intermédio do RNAc. Recém-sintetizada as RNPv são exportadas do núcleo para o local de
montagem na membrana plasmática apical, onde as novas partículas são formadas e liberadas.
Fonte Imagem modificada de Fields Virology 5a ed., capitulo 47.
1.6 ASPECTOS CLÍNICOS
A sintomatologia da gripe pode incluir febre, tosse, coriza, obstrução
nasal, dor de cabeça, dor de garganta e mialgia, e manifesta-se no paciente por um
período de uma semana. Com menor frequência pode ser evidenciada dor
abdominal, náuseas e diarréia (CDC, 2009).
12
O período de incubação do vírus pode variar de 1 a 4 dias e um único
individuo infectado pode potencialmente transmitir a doença a um grande número de
pessoas susceptíveis. Os adultos começam a expelir o vírus 24 horas antes do início
dos sintomas e até sete dias após. As crianças podem transmitir por um período
mais prolongado desde dias antes até 10 dias após início dos sintomas (OMS, 2010)
O vírus Influenza é facilmente transmitido de pessoa a pessoa, ao ser
inalado por meio de aerossóis instalando-se nas células do epitélio do trato
respiratório. A destruição do epitélio respiratório ocorre devido à proliferação viral e
apoptose celular facilitando a colonização bacteriana, originando, em muitos casos,
quadros de pneumonia (Palese & Shaw, 2007).
A resposta imune inata do hospedeiro é responsável pela contenção da
proliferação viral inicialmente, e é precedida pela resposta imune adquirida, na qual
linfócitos B produzem anticorpos na tentativa de neutralizar as partículas virais, e
linfócitos T promovem a destruição de células infectadas (Palese & Shaw, 2007).
O aumento na produção de citocinas inflamatórias é responsável por
grande parte da sintomatologia da doença, sendo que na maioria das vezes a
infecção pelo vírus é auto-limitada. Contudo, em caso da total ausência de
imunidade ao vírus, como numa infecção por um novo tipo viral, a resposta
inflamatória exacerbada mediada pelo hospedeiro poderá resultar numa síndrome
respiratória aguda, levando ao óbito em muitos casos (Palese & Shaw, 2007).
1.7 VARIAÇÃO ANTIGÊNICA
Os vírus Influenza têm sido objeto de intensa vigilância epidemiológica
devido ao seu potencial de causar epidemias e pandemias. Isto ocorre devido à
variabilidade genética que esse vírus apresenta, propiciando alterações antigênicas
que permitem aos vírus escaparem das defesas do hospedeiro. Esta variação
genética ocorre por dois processos, drift e shift antigênico (Miotto et al., 2010).
O drift antigênico, ou deriva antigênica, se caracteriza pelo acúmulo de
mutações que ocorrem durante a replicação viral. As variações por drift afetam
principalmente o gene codificante da proteína superfície HA que é o maior alvo da
13
resposta imune, porém a NA também está susceptível à essas variações. Isto ocorre
devido à pressão seletiva exercida pelo sistema imune do hospedeiro, o que leva,
com o passar do tempo, ao surgimento de novas linhagens de vírus influenza, daí a
emergência deste vírus causando epidemias anuais (Miotto et al., 2010).
O processo de rearranjo genético que leva ao shift antigênico é favorecido
pela natureza segmentada do genoma do vírus Influenza e é responsável pela
ocorrência de rearranjos genéticos entre diferentes tipos de vírus. O shift antigênico
ocorre mais raramente que o drift, no entanto ele contribui de forma drástica para a
diversidade genética do vírus Influenza. Tende a ocorrer durante infecções por mais
de um subtipo viral, no momento da redistribuição dos segmentos que se fazem
aleatoriamente nos vírions neoformados (Shen et al., 2009; Furuse et al., 2009).
1.8 EPIDEMIOLOGIA
A Gripe é uma das mais importantes infecções do trato respiratório, sendo
responsável por cerca de 3 a 5 milhões de casos e 250.000 a 500.000 mortes todos
os anos, constituindo-se uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no
mundo inteiro (OMS, 2010).
Esta é uma infecção que atinge todas as faixas etárias causando excesso
de hospitalizações principalmente na população considerada de alto risco como
idosos com mais de 65 anos de idade, crianças menores de 2 anos (Louie et al.,
2010),
paciente
portadores
de
pneumopatias
crônicas,
hemoglobinopatias,
neoplasias, diabete mellitus, insuficiência renal crônica, cardiopatia congênita e
imunosuprimidos (OMS, 2010; Nakajima et al., 2010)
Nos países de clima temperado as epidemias de gripe ocorrem nos
meses que correspondem ao outono e inverno, e nos países de clima tropical as
infecções por Influenza ocorrem ao longo do ano (Finkelman et al., 2007). No Brasil
ocorre elevação dos casos de gripe nos meses mais frios do ano (junho, julho e
agosto) nas regiões Sul e Sudeste e nas estações de chuva (janeiro, fevereiro e
março) nas regiões Norte e Nordeste (Cunha et al., 2005), sendo uma importante
14
causa de absenteísmo na escola e no trabalho, elevação do número de internações
hospitalares por pneumonia, e mortes (Keech & Beardsworth, 2008).
A alta taxa de variabilidade, a ocorrência de rearranjos ou a transmissão
direta ao homem de vírus animais, principalmente de vírus Influenza de tipo A,
podem dar origem na população humana, a cepas circulantes com grandes
diferenças antigênicas, passíveis de causar epidemias ou até mesmo pandemias.
Estas variações possibilitam os vírus de não serem reconhecidos pelas defesas
imunitárias do hospedeiro, principalmente quando as variações ocorrem nas
glicoproteínas de superfície, principais alvos dos anticorpos neutralizantes (Reid et
al., 1999).
A ultima pandemia foi causada pelo subtipo H1N1 que é resultado de
rearranjos de segmentos genéticos de uma cepa suína da Eurásia (H1N1), uma
cepa suína da América do Norte (H1N2) que já havia sofrido triplo rearranjo,sendo
formada por PB1 e NA oriundas de cepas humanas H3N2, pelas proteínas PB2 e
PA de uma cepa aviária e pelas proteínas HA, NP, M, NS de cepas H1N1 Norte
Americanas (Figura 8) (Trifonov et al., 2009). Este novo vírus foi primeiramente
detectado na fronteira entre Estados Unidos e México e causou infecções por todo o
mundo com uma sintomatologia muito similar ao vírus sazonal: Febre, tosse, coriza,
dor de garganta, dores no corpo, dor de cabeça, calafrio e em alguns casos vômito
e/ou diarréia (OMS, 2010).
Figura 8: Relação entre os vírus Influenza circulantes e o novo Influenza A/H1N1 pandêmico. Fonte
Adaptado de Trifonov et al.(2009).
15
1.9 DIAGNÓSTICO
A confirmação laboratorial de influenza e o rápido diagnóstico das
infecções causadas por este vírus são fundamentais para as decisões de medida de
controle, principalmente no que se refere a terapia antiviral, que necessita ser
administrada 30 a 48 horas após o início dos sintomas para maior eficácia do
tratamento (Moscona, 2005). O quadro 2 traz um resumo das principais
metodologias utilizadas atualmente para o diagnóstico de Influenza em espécimes
respiratórios, descrevendo suas principais características.
Quadro 2: Dados comparativos entre os testes diagnósticos disponíveis para Influenza.
Procedimento
Cultura viral
Método de IFI1 e
IFD2
RT-PCR
Sorologia
Tipos de
Influenza
detectados
AeB
Ensaio
imunoenzimático
(ELISA)
AeB
AeB
AeB
Espécimes
utilizados
Tempo para
resultado
SC3 e ANF4
SC e ANF
3-10 dias
2-4 horas
SC e ANF
Soro
2-4 horas
+ de 2
semanas
2 horas
SC e ANF
Rapidez na
disponibilidade
de resultados
Não
Não
Não
Não
Não
AeB
Fonte: Adaptado de CDC. Lab Diagnosis of Influenza. 2009
1
Imunofluorescência Indireta
2
Imunofluorescência Direta
3
SC: Swab combinado
4
ANF: Aspirado de nasofaringe
1.9.1 Cultura Viral
Atualmente o método padrão ouro para diagnóstico é o isolamento do
vírus em cultura de células ou em ovos embrionados, que seguidos da detecção de
antígenos virais, utilizando anticorpos específicos, é uma metodologia que apresenta
alta especificidade e sensibilidade, além de permitir o isolamento de novos vírus,
16
porém requer infra-estrutura e pessoal especializado, pois é uma técnica demorada
(Allwinn et al., 2002).
1.9.2 Imunofluorescência
Para a imunofluorescência direta, células epiteliais do trato respiratório,
potencialmente infectadas são fixadas em lâminas e os antígenos virais presentes
nas células são detectados por anticorpos específicos que podem estar diretamente
ligados a um marcador fluorescente (imunofluorescência direta) ou detectado por
anti-anticorpos ligados a um marcador fluorescente (imunofluorescência indireta).
Em ambos os casos as reações são visualizadas sob microscopia de
imunofluorescência e as células positivas são distinguidas pela intensidade de cor e
morfologia das áreas fluorescentes (Allwinn et al., 2002).
A imunofluorescência direta é mais rápida, porém é geralmente menos
sensível do que o método indireto que utiliza um único conjugado anti-anticorpo. É
uma técnica de diagnóstico confiável e relativamente rápida, de 2 a 4 horas, embora
estudos de sensibilidade diagnóstica tenham demonstrado resultados de 40% a 70%
(Allwinn et al., 2002).
1.9.3 Reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição
reversa (RT-PCR)
Reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição
reversa (RT-PCR) e suas variações como multiplex RT-PCR, por exemplo, são
métodos alternativos, rápidos e sensíveis para a detecção do vírus e apresentam
melhor sensibilidade analítica e diagnóstica que o método padrão (Steininger et al.,
2002). Esta técnica permite não só detectar os tipos Influenza A, B e C, mas também
realizar a subtipagem dos vírus Influenza A (Allwinn et al., 2002).
A RT-PCR em tempo real (rRT-PCR) apresenta vantagens em relação à
técnica tradicional por ser um método que apresenta maior rapidez, sensibilidade,
reprodutibilidade e redução de risco de contaminação durante o procedimento.
17
Porém devido ao alto custo, estes testes podem não estar prontamente disponíveis
e a liberação de resultados pode levar de um a vários dias (Agrawal et al., 2009).
1.9.4 Os Testes de Rápido Diagnóstico de Influenza (TRDI)
Os Testes de Diagnóstico Rápido de Influenza (TDRI), baseados na
técnica de imunocromatografia de fase sólida (Figura 9), estão amplamente
distribuídos e comercialmente disponíveis para laboratórios e clínicas que desejem
utilizá-los. Alguns testes liberam resultados dentro de 15 minutos e atualmente nos
Estados Unidos, vários testes já são aprovados para uso. Os testes podem ser
utilizados na triagem para detecção e/ou identificação de Influenza A e B e a
sensibildade e especificidade pode variar entre 40-70% e 90-95%, respectivamente,
quando comparadas com isolamento viral e RT-PCR (CDC, 2010).
Figura 9: Modo de atuação de um TRDI tradional: (a) O anticorpo marcado com corante (Ac),
específico para a identificação de antígeno (Ag), está presente na extremidade inferior da tira de
nitrocelulose ou em recipiente fornecido com a tira. Um anticorpo, igualmente específico para a
identificação do antígeno, é ligado à tira numa linha fina (de teste); e um anticorpo ou um antígeno
18
específico para o anticorpo marcado é ligado à linha de controle; (b) O espécime respiratório e o
elemento de separação, que foram colocados na tira ou no recipiente, são misturados com o
anticorpo marcado e arrastados pela tira ao longo das linhas de anticorpo ligado; (c) Caso o antígeno
esteja presente, uma porção do anticorpo será capturada na linha de teste. Outros anticorpos
marcados são capturados na linha de controle. Fonte: OMS 2010. Utilização de Testes Rápidos para
Diagnóstico da Influenza
Os TDRIs possuem uma sensibilidade que pode variar de 40% a 79% e
especificidade de 96,5% a 100% para este novo vírus quando comparado à técnica
de rRT-PCR. Dessa forma um resultado negativo de um TDRI não exclui a
possibilidade de infecção por esta cepa pandêmica (Lee et al., 2010; Faix et al.,
2009; Keitel et al., 2010; CDC, 2009; Kok et al., 2009). Quadro 3 mostra os principais
TRDIs utilizados atualmente para o diagnóstico de Influenza em espécimes
respiratórios, descrevendo suas principais características.
Quadro 3: “Kit’s utilizados para diagnóstico rápido de vírus Influenza
Tipos de
Influenza
detectados
Espécimes
utilizados
Tempo para
resultado
Rapidez na
disponibilidade
de resultados
AeB
SC e ANF
15 minutos
Sim
AeB
SC e ANF
<15 minutos
Sim
AeB
SC e ANF
<15 minutos
Sim
OSOM® Influenza A&B
(Genzyme)
AeB
SC e ANF
<15 minutos
Sim
QuickVue Influenza Test
(Quidel)
AeB
SC e ANF
<15 minutos
Sim
QuickVue Influenza A+B
Test (Quidel)
AeB
SC e ANF
<15 minutos
Sim
SAS FluScientificAlert
(SA)
AeB
SC e ANF
<15 minutos
Sim
TRU FLU
(Meridian Bioscience)
AeB
SC e ANF
15 minutos
Sim
“kit” de
Imunocromatografia
3M™ Rapid Detection
Flu A+B Test (3M)
Directigen EZ Flu A+B
(Becton-Dickinson)
BinaxNOW® Influenza
A&B (Inverness
Medical)
Fonte: Adaptado de CDC. Lab Diagnosis of Influenza. 2009
2. OBJETIVO
Este estudo objetivou avaliar a sensibilidade e especificidade do “kit” BD
DirectigenTM EZ Flu A+B, na detecção de antígenos do vírus Influenza A/H1N1
pandêmico em amostras de aspirado de nasofaringe e swab combinado. Este “kit”
foi um dos mais utilizados pela rede de influenza no Brasil durante a pandemia de
2009-2010.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 VÍRUS TESTADO
Foram analisadas amostras para presença do vírus Influenza A (H1N1)
2009 que causou a pandemia entre o período de 2009 a 2010.
3.2 ESPÉCIMES
Foram selecionadas 240 amostras de aspirado de nasofaringe e/ou swab
combinado encaminhadas ao Laboratório de Vírus Respiratório do Instituto Evandro
Chagas para o diagnóstico de vírus Influenza A (H1N1) 2009, dentre elas 210
amostras com resultado positivo e 30 com resultado negativo por rRT-PCR para
análise da sensibilidade, especificidade e valores preditivos negativo e positivo do
“kit” BD DirectigenTM EZ Flu A+B.
3.3 BD DIRECTIGENTM EZ FLU A+B
Estas
amostras
foram
posteriormente
submetidas
à
técnica
de
imunocromatografia de fase sólida utilizando-se o “kit” BD DirectigenTM EZ Flu A+B
(Becton Dickinson, Sparks, MD) de acordo com as instruções do fabricante (anexo
A).
3.4 RT- PCR EM TEMPO REAL (RRT-PCR)
O resultado deste foi utilizado para determinar os espécimes clínicos
verdadeiros positivos e negativos para a presença do vírus. Esta reação foi realizada
segundo o protocolo estabelecido pelo CDC (anexo B) (OMS 2010).
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
20
Na análise estatística utilizou-se o software BioEstat 5.0 para o cálculo
dos parâmetros de sensibilidade e especificidade e valores preditivos negativo e
positivo, utilizando o rRT-PCR como método de referência.
A sensibilidade foi calculada pelo número de positivos reconhecidos pelo
“kit” de rápido diagnóstico dividido pelo número de positivos identificados pelo rRTPCR, e o resultado expresso em porcentagem (Altman & Bland, 1994). De forma
similar a especificidade foi calculada pelo número de negativos reconhecidos pelo
“kit” de rápido diagnóstico dividido pelo número de negativos identificados pelo rRTPCR e o resultado expresso em porcentagem (Altman & Bland, 1994).
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de 240 amostras foi testado neste estudo. Dentre as amostras,
210 eram positivas e 30 negativas para a presença do vírus Influenza A (H1N1)
2009 pandêmico através da metodologia de rRT-PCR. Todos estes espécimes foram
submetidos à imunocromatografia de fase sólida.
Comparação entre os resultados da detecção pela metodologia de rRTPCR e pelo “kit” BD DirectigenTM EZ Flu A+B podem ser visualizados no quadro 4.
Quadro 4: Comparação entre os resultados obtidos pela metodologia de rRT-PCR e a
imunocromatografia.
RT-PCR em tempo real
Resultado BD Directigen™ Flu A+B
Positivo
Negativo
Total
Positivo
100
110
210
Negativo
0
30
30
100
140
240
Total
21
O desempenho do “kit” de imunocromatografia comparado à rRT-PCR
para detecção do vírus Influenza A/H1N1 pandêmico pode ser observado no quadro
5, e mostram 47,62% de sensibilidade e 100% de especificidade.
Quadro 5: Desempenho do ““kit”” BD DirectigenTM EZ Flu A+B, comparado à rRT-PCR para detecção
do vírus Influenza A/H1N1 pandêmico.
Sensibilidade
Especificidade
VPP
VPN
47,62% (100/210)
100% (30/30)
100% (100/100)
21,43%(30/140)
A sensibilidade encontrada concorda com os resultados obtidos em
estudos que utilizaram os TDRI para a detecção do vírus Influenza A (H1N1) 2009
pandêmico que variaram de 40% a 79% (Lee et al., 2010; Faix et al., 2009; Keitel et
al., 2010; CDC, 2009; Kok et al., 2010).
Quando comparado a estudos que utilizaram o mesmo protocolo para a
rRT-PCR (Quadro 6), a sensibilidade variou em menos de 1,5%, concordando com
os resultados obtidos em investigação conduzida nos Estados Unidos por Karre et
al. (2010) que utilizaram espécimes clínicos frescos, alcançando uma sensibilidade
de 48,7% e com Vasoo et al. (2009) que realizaram sua pesquisa com amostras
congeladas e obtiveram uma sensibilidade de 46,7%.
Quadro 6: Comparação entre os resultados obtidos no presente estudo e os obtidos em outros
países.
Local
Sensibilidade
Especificidade
Referência
Brasil
47,6%
100%
Presente estudo
EUA
46,7%
100%
Vasoo et al. (2009)
EUA
48,7%
96,5%
Karre et al. (2010)
EUA
76,6%
98,7%
Welch et al. (2010)
França
57,7%
100%
Nougairede et al. (2010)
22
Nossos resultados foram menores do que os achados por Welch et al.
(2010), provavelmente, devido a utilização conjunta de duas metodologias
moleculares, a rRT-PCR e a Luminex, que detectam RNA viral. Quando comparado
ao trabalho executado na França por Nougairede et al. (2010), nossos achados
foram inferiores, devido diferenças na execução da rRT-PCR, que utiliza o sistema
SYBR Green em detrimento do sistema TaqMan, metodologia desenvolvida pelo
Centro de Referência Nacional de Influenza na França.
A especificidade obtida no presente estudo está dentro dos valores
encontrados na literatura para o “kit” em questão (Quadro 6), que se estende de
96,5% a 100%, demonstrando elevada especificidade deste no diagnóstico de
Influenza A (H1N1) 2009 pandêmico. Foi observada a concordância com os
resultados obtidos tanto em estudos conduzidos nos estado Unidos (Vasoo et al.,
2009; Karre et al., 2010; Welch et al., 2010) quanto na França (Nougairede et al.,
2010), uma vez que a diferença entre o nosso resultado e os valores na literatura
não excede 3,5%.
Os relatos na literatura que mostram valores diferentes, mesmo quando
se utiliza o mesmo “kit”, estão relacionados a mudanças no protocolo do fabricante,
nos diferentes alvos e metodologia escolhidos para a reação de RT-PCR, bem como
na diferença antigênica entre as nucleoproteínas vrais, o que pode provocar estas
diferenças (Kok et al., 2010). Um exemplo é o estudo realizado por Keitel et al.,
(2010) no qual se verificou que a sensibilidade de um determinado “kit” aumentava
de 64% para 92%, quando se utilizava amostras coletadas entre 24 e 48 horas após
o início dos sintomas.
5.
CONCLUSÃO
O teste de diagnóstico rápido tem se mostrado de grande importância no
manejo clínico de pacientes.
A sensibilidade do “kit” BD DirectigenTM EZ Flu A+B foi baixa, contudo
devido a sua rapidez e facilidade de manuseio torna-se uma ferramenta de grande
23
utilidade, contribuindo significativamente durante a tomada de decisões no uso de
terapia antiviral, isolamento do paciente e investigação de contatos.
A especificidade deste foi elevada, permitindo inferir que este “kit”
dificilmente reage com outros antígenos, além dos pertencentes aos vírus Influenza.
O valor preditivo positivo de 100% nos permite considerar como definitivo
os casos positivos detectados pelo “kit” em questão. Porém, deve-se estar
consciente da alta taxa de falsos negativos devendo-se então recorrer a métodos
mais sensíveis como rRT-PCR por exemplo.
Este estudo se reveste de importância, pois é em nosso conhecimento, a
primeiro a descrever um estudo avaliativo de um teste de rápido diagnóstico na
detecção do vírus Influenza A (H1N1) 2009 pandêmico no hemisfério sul, bem como,
esclarece sobre a eficácia do uso desta metodologia durante surtos e epidemias
nesta parte do globo.
24
6. REFERENCIAL TEÓRICO
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28
7. ANEXOS
ANEXO A – Protocolo para a detecção diferenciada e direta dos antígenos
virais de Influenza A e B.
ANEXO B – CDC protocol of realtime RTPCR for influenza A (H1N1) Geneva: World
Health Organization, April 2009.