Estudo da Indução do sistema SoxRS e da mutagênese pelo cloreto

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Estudo da Indução do sistema SoxRS e da mutagênese
pelo cloreto estanoso
Maciel, VB; Motta, ES; Melo, AFB; Lima, PVS; Souza-Santos PT; Oliveira, MBN; Dantas, FJS;
Caldeira-de-Araujo, A.; De Mattos, JCP
Laboratório de Radiobiologia e Fotobiologia, Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes,
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: SOXRS, ames, cloreto estanoso, cromoteste, procariotos
O estanho, classificado como metal pertencente ao grupo 14 da tabela periódica é um dos mais antigos elementos
químicos conhecidos, sendo encontrado, na natureza, sob a forma de cassiterita. Seu uso remonta à pré-história,
quando era empregado junto com o cobre na produção de armas e de ferramentas. Atualmente é utilizado em
diversos setores industriais, o que coloca os seres humanos em contato direto com este agente. Na forma de cloreto
estanoso (SnCl2) está presente em kits para produção de radiofármacos e é amplamente empregado em exames
de medicina nuclear, sendo um dos compostos mais utilizados como agente redutor para a fixação do tecnécio99m a estruturas e moléculas de interesse biológico. Neste caso, sua administração é feita por via endovenosa,
não restando dúvidas quanto a sua absorção. Resultados anteriormente obtidos pelo Laboratório de Radio e
Fotobiologia demonstraram que as principais lesões induzidas por este agente sobre o DNA são as quebras e
sítios AP e que o sistema de reparo por excisão de bases (BER) estaria envolvido na restauração destes danos,
sendo que o produto do gene nfo (a enzima endonuclease IV – Nfo) teria um papel relevante nesse processo. O
objetivo desse trabalho foi confirmar, com o ensaio cromoteste, a importância da proteína Nfo através da indução,
pelo SnCl2, do sistema SoxRS em E. coli. Além disso, como as lesões reparadas pelo BER constituem eventos que
podem contribuir para mutagênese, a potencialidade mutagênica deste agente foi avaliada através do teste de
Ames para as cepas de S. typhimurium TA97, TA98, TA100 e TA102. Os resultados indicam que o SnCl2 induziu
o sistema SoxRS em níveis acima da cepa não tratada (p<0,05), reforçando a importância da proteína Nfo no
processo de reparo, já que a indução desta enzima está sob o controle do sistema SoxRS. A aplicação do teste de
Ames demonstrou não haver potencialidade mutagênica para a concentração de SnCl2 testada (25mg/ml). No
momento estão sendo realizados estudos complementares, em E. coli, de mutagênese no gene rpoB para indução
de resistência ao antibiótico rifampicina.
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Recognition of the SOS genes from the pathogenic
agent Leptospira interrogans
Momo, LHS¹; Costa, RMA1
¹Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André , Brazil.
[email protected]
Keywords: DNA repair, SOS system, gene expression, Leptospira interrogans
Leptospirosis is a zoonotic disease spread through the world that affects human and other animals, It has a
worldwide distribution but is more common in the tropics where conditions for its transmission are particularly
favourable. These areas are not provided by proper treatment of drain water, what facilitates the transmission
of the disease by the contaminated water from urine rats. In humans, leptospirosis have many symptoms that
may be confused with other diseases, which makes the diagnosis more difficult. This sickness is caused by the
pathogenic species of the genus Leptospira (the interrogans complex). The genus includes saprophytic species
as well ( the biflexa complex). Although its importance, the bacteria is poorly studied and few inforrmations
are available concerning the mechanisms employed by the bacteria for dealing with the environmental and
host factors threatening on DNA. This work has the aim to identify the SOS genes in Leptospira interrogans by
in silico search. The SOS system is a global DNA damage response, induced by threatening of genome integrity.
This system facilitates cell survival when massive DNA damage occurs and the normal DNA replication of the
bacterial cell is disturbed.The open reading frames of L. interrogans were identified, based on the ones taken
from E.coli. A databank was made with the sequences from many other organisms related to the SOS system.
The genes studied were then compared to the sequences from the saprophyte Leptospira biflexa. It was found
that the SOS system works differently in Leptospira spp than on E. coli, as many crucial genes were absent.
One point that was made, was that the genes lexA and recA remain of high importance on these organisms.
Funding agency: CNPq, FAPESP
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O uso do reparo de DNA como ferramenta na
pesquisa de fatores envolvidos na patogenicidade de
Corynebacterium pseudotuberculosis.
Resende, BC¹; Lopes, DO¹, Bucker, DH²; Azevedo, VA²; Santos, AR²; Miyoshi, A²; D’Afonseca, V², Santos, LL¹
Laboratório de Genética Molecular - Universidade Federal de São João Del-Rei CCO – Divinópolis/MG-Brasil.
Laboratório de Genética Celular e Molecular - Departamento de Biologia Geral ICB-Universidade Federal de Minas Gerais – Belo
Horizonte/MG – Brasil.
[email protected]
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Palavras-chave: bioinformática, reparo de DNA, Corynebacterium pseudotuberculosi, mutagênese, Linfadenite Caseosa.
Introdução: A Linfadenite Caseosa é uma doença crônica que afeta rebanhos de caprinos e ovinos, principalmente
na região norte e nordeste do Brasil. Causada por uma bactéria gram-positiva chamada Corynebacterium
pseudotuberculosis a Linfadeníte Caseosa é distribuída globalmente causando grandes perdas econômicas. O
reparo de DNA é um mecanismo de grande importância para a manutenção da estabilidade genômica de qualquer
organismo, o que o torna uma ferramenta valiosa na busca da cura contra agentes infecciosos, pois a ineficiência
deste sistema pode promover a instabilidade genômica e levar o organismo à morte. A eficácia dos tratamentos
existentes hoje para a cura de animais infectados é muito baixa, necessitando assim de um estudo detalhado do
genoma desse organismo para melhor entendimento dos fatores relacionados à sua virulência e patogenicidade.
Objetivos: Identificar e caracterizar as vias de reparo de DNA de Corynebacterium pseudotuberculosis e de outras
sete espécies de Corynebacterium, patogênicas ou não, e relacionar o sistema de reparo do DNA com fatores
envolvidos na patogenicidade e virulência deste organismo. Métodos: A partir do genoma completo da C.
pseudotuberculosis disponibilizado pela Rede Genoma de Minas Gerais, foram feitas analises in silico com o objetivo
de se levantar as vias de reparo presentes neste organismo e buscar os genes homólogos em outras sete espécies de
Corynebacterium. Foram usados os programas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) e CoryneRegNet, onde
foram obtidas as seqüências homólogas das outras espécies. Para a construção da árvore filogenética foi usado o
programa PHYLIP (Phylogeny Inference Package) do Expasy Proteomic Server. Resultados: As vias de reparo do
DNA, em geral, são bem conservadas, sendo que as vias NER e de recombinação se destacaram por possuírem
praticamente todos os genes conservados. Um fato interessante foi a presença do gene mug, que codifica uma
enzima da família das uracil DNA-glicosilases, ser encontrado apenas em bactérias patogênicas. Este gene, que
faz parte do reparo por excisão de bases, é de grande importância no reconhecimento da base uracil do DNA para
posterior remoção da lesão. Através das árvores filogenéticas apresentadas, vê-se que as bactérias patogênicas que
apresentam o gene mug ficaram agrupadas no mesmo ramo da árvore filogenética. Conclusões: Através da analise
filogenéticas verifica-se que apenas duas bactérias patogênicas possuem o gene mug e estas estão agrupadas no
mesmo cluster, fato que nos estimula a verificar o envolvimento desse gene com a patogenicidade do organismo.
Como perspectiva, pretende-se clonar o gene mug para a realização de testes de complementação funcional em
bactérias deficientes nesta via de reparo, após tratamento com bissulfito de sódio e outros agentes mutagênicos.
Suporte financeiro: FAPEMIG e UFSJ
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Identification of genes involved in oxidative stress
response in Leptospira spp
Bomediano, LM¹; Costa, RMA¹
¹ Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André, Brazil.
Keywords: DNA repair, gene expression, oxidative stress, Leptospira Biflexa, Leptospira interrogans.
Leptospirosis is an important zoonosis that figures as a neglected tropical disease, being responsible for serious
public health problems, resulting in costs to the economy. The disease is caused by pathogenic bacteria of the
genus Leptospira, which has both pathogenic (the interrogans complex) and saprophytes (the biflexa complex)
species belonging to the order Spirochaetales. Like any infectious agent, leptospires must overcome a great
challenge posed by the host immune system: the reactive oxygen and nitrogen produced by macrophages. The
model organism, Escherichia coli, responds rapidly to oxidative stress by activating the transcription of genes
with antioxidant function. Two regulons are involved in this response, OxyR and SoxRs. However, the genome
sequencing of Leptospira spp showed an absence of both regulators, suggesting that during evolution, Leptospira
developed specific antioxidant defense mechanisms. The identification of these mechanisms is important because
it may suggest potential targets for immunological intervention. This work presents the in silico identification and
comparison of homolog sequences to genes already characterized in other organisms in the saprophyte, L. biflexa,
and the pathogenic, L. interrogans, species. The search for open reading frames showed unexpected results, like the
duplication of two important genes and the presence of an important regulator only in the saprophytic specie. These
results confirm that the pathogenic and saprophytic species have different strategies for dealing with oxidative stress.
Funding agency: CNPq, FAPESP
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Importância relativa de enzimas do reparo por excisão
de bases na restauração de lesões induzidas pela
radiação UV A e cloreto estanoso
Melo, AFB; Motta, ES; Maciel, VB; Meirelles, PG; Souza-Santos, PT; Oliveira, MBN; Dantas, FJS;
De Mattos, JCP; Caldeira-de-Araujo, A.
Laboratório de Radiobiologia e Fotobiologia, Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes,
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: reparo por excisão de bases, ultravioleta A, cloreto estanoso, eletroforese DNA bacteriano, cinética de reparo.
A exposição dos seres vivos a agentes como o cloreto estanoso (SnCl2) e a radiação UV A pode induzir lesões
no material genético, mediadas pela geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). As lesões produzidas no
DNA pelas ERO são corrigidas, principalmente, pelo reparo por excisão de bases (BER). Resultados obtidos
anteriormente no Laboratório, através de ensaios de sobrevivência bacteriana, demonstraram que o BER estaria
envolvido na restauração destes danos, sendo que o produto do gene nfo (a enzima endonuclease IV - Nfo) teria
um papel relevante e que a enzima Fpg ( formamidopirimidina DNA glicosilase) também poderia participar desse
processo, provavelmente, reparando lesões como a 8-oxoguanina (8-oxodG). O presente trabalho teve como
objetivo confirmar a importância dessas enzimas na cinética de reparação das quebras de DNA induzidas pelo
SnCl2, UVA e sua associação, através da técnica de eletroforese em gel alcalino de agarose. Para tanto, cepas de
E. coli, deficientes em diferentes genes do BER, foram tratadas com os agentes em questão e as quebras no DNA
foram visualizadas por eletroforese e quantificadas pelo programa Image J. Os resultados obtidos com a cepa
selvagem e os mutantes simples (AB1157, BH20, BW372, BW527 e BW9091) foram comparados e a cepa BH20,
deficiente na enzima Fpg, foi a que apresentou menor grau de reparo das quebras no DNA induzidas pelo UV A.
As cepas BW372, BW527 e BW9091, deficientes nas enzimas endonuclease III, endonuclease IV e exonuclease
III, respectivamente, foram estatisticamente idênticas quanto à capacidade de restaurar as quebras geradas pelo
UVA. Porém, esses mutantes apresentaram maior eficiência de reparação, em relação a BH20 (p<0,05), o que
pode ser explicado pela presença da enzima Fpg funcionante. Com relação ao tratamento realizado somente com
SnCl2, observou-se que a cepa deficiente no produto do gene nfo (BW527) foi a que apresentou maior retardo no
reparo das lesões, seguida pelas cepas BW9091 (xthA), BH20 (fpg) e BW372 (nth). Quando essas cepas foram préiluminadas com UVA e, posteriormente, incubadas com SnCl2, os resultados obtidos mostraram que a associação
do UVA com SnCl2 foi capaz de induzir um maior número de quebras no DNA de todas as cepas testadas, quando
comparado ao tratamento com SnCl2 isoladamente (p<0,0001). A análise dos géis mostrou, mais uma vez, assim
como ocorreu com o tratamento somente com SnCl2, que a cepa BW527 foi a menos eficiente na restauração dos
danos causados por essa associação. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a via de reparação das
lesões produzidas por estes agentes, isoladamente ou associados, ocorra preferencialmente pela ação das enzimas
Fpg e Nfo e indicam que as proteínas XthA e Nth também possam participar em alguma etapa do reparo, quando
Fpg e Nfo estiverem ausentes.
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Análise comparativa da infectividade de uma linhagem
de Trypanosoma cruzi superexpressora da enzima
MutT da via de reparo da 8-oxoguanina
Aguiar, PHN1; Furtado, C1; Macedo, AM¹; Franco, GR¹; Pena, SDJ¹; Andrade, LO2; Machado, CR1
Lab. Genética Bioquímica, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas - UFMG, Belo Horizonte, MG
Lab. Prof. Conceição Machado, Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas - UFMG, Belo Horizonte, MG
[email protected]
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Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, MutT, 8-oxoguanina, reparo de DNA, infectividade
O agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, é um parasito intracelular obrigatório no hospedeiro
mamífero. Sua estratégia de infecção celular pode representar um importante mecanismo de evasão da resposta
imune. A invasão em células do hospedeiro mamífero ocorre por uma série de eventos envolvendo interações
de diversas moléculas do parasito com componentes celulares do hospedeiro, culminando na internalização do
parasito. Esse processo depende do recrutamento e fusão de lisossomos para o sítio de interação do parasito com
a célula hospedeira e é essencial para a retenção do mesmo e formação de um vacúolo parasitóforo estável. Em
seguida, o vacúolo parasitóforo é rompido, liberando os parasitos no citosol da célula hospedeira, onde estes podem
se diferenciar na forma replicativa amastigota. O T. cruzi apresenta então uma diferença marcante em relação a
outros patógenos intracelulares, pois ele não evita a fusão lisossomal e reside por um tempo significativo dentro
deste vacúolo antes de escapar para o citosol. Aparentemente, lisossomos fornecem não só a membrana para a
formação do vacúolo, mas também o ambiente ácido que é essencial para o rompimento do vacúolo e escape do
parasito para o citosol. No entanto, este ambiente lisossomal pode também representar uma fonte de estresse
oxidativo para as tripomastigotas, sendo que a maquinaria de reparo de DNA poderia ter um papel importante
em manter a integridade do conteúdo genético do T. cruzi durante o processo de invasão e replicação intracelular.
Com o objetivo de investigar a importância da via de reparo da 8-oxoguanina (via de reparo GO) durante a infecção
do parasito às células de mamíferos uma cepa de CL Brener que superexpressa a enzima MutT de Escherichia coli
foi comparada a um clone CL Brener do tipo selvagem. A enzima MutT faz parte da via de reparo GO, esta proteína
hidrolisa o produto da oxidação da guanina 7,8-dihidro-8-oxoguanina (também conhecido como 8-oxoguanina,
8-oxoG) removendo-a do pool de nucleotídeos e impedindo que seja incorporada no DNA por polimerases. A
enzima MutT de E. coli foi clonada no vetor de expressão pROCK e subsequentemente transfectada em T. cruzi
epimastigotas da cepa CL Brener. Em seguida, as epimastigotas foram diferenciadas em formas infectivas
tripomastigotas metacíclicas através da metaciclogênese in vitro. A infectividade e a multiplicação intracelular
do clone selvagem e da cepa mutante foram quantificadas por experimentos de infecção em fibroblastos murinos
em intervalos de 0, 24, 48, 72 e 96 horas. A cepa mutante mostrou diferença significativa no crescimento após
48 horas da infecção em fibroblastos quando comparada ao controle selvagem, indicando que a superexpressão
da enzima MutT de E. coli pode conferir vantagem ao T. cruzi durante a replicação intracelular do parasito.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG, HHMI
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Differential role of UVB-induced photolesions on mouse skin
Quayle, C1,2 ; Bombardieri, CR2; Hoeijmakers, J2; Menck, CFM1; van der Horst, G2
Laboratório de Reparo de DNA, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo-Brazil
Genetics Department, Erasmus Medical Center, Rotterdam-The Netherlands.
[email protected]
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Keywords: photolesions, UV, DNA repair, photolyase, pigmentation, skin
The ultraviolet (UV) component of the sun is the most abundant genotoxic factor present in our environment.
UV light induces two types of photolesion on DNA: the cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) and the pyrimidine
(6-4) pyrimidone photoproduct (6-4PP). Photolyases are enzymes capable of converting these dimers directly
to monomers, using a photon of light as source of energy. These enzymes are absent in placental mammals,
leaving us with only one DNA repair pathway capable of removing photolesions: the nucleotide excision repair
(NER) pathway. Deficiencies in genes involved in this pathway lead to the development of severe syndromes,
such as Xeroderma Pigmentosum (XP) which shows high photosensitivity and a substantial increase in skin
cancer incidence. Although the deleterious effects of UV on the skin are widely known, the specific role of each
photolesion is still in question. Previous works in vitro have demonstrated that while in NER-proficient cells only
the removal of CPDs increases survival after UVB irradiation, in NER-deficient cells both lesions play an important
role in apoptosis. It has been shown in vivo that CPDs are responsible for the majority of the effects seen after
UVB skin irradiation of DNA repair proficient mice, such as erythema, apoptosis, hyperplasia and tumorigenesis.
Therefore, it is of the upmost importance to define the specific role of each photolesion in vivo in a system where
the removal of photolesions by NER does not mask their role on the skin response to UV. For that purpose,
transgenic XPA mice expressing CPD-photolyase or 6-4PP-photolyase were irradiated for 25 days with UVB (100 J/
m2) immediately followed by 3 hours of photoreactivation. In this work, we show that the removal of CPD lesions
prevents hyperplasia and induces dark skin pigmentation. When 64-PPs were removed, UVB promoted hyperplasia
but no dark skin pigmentation, only tanning (brown pigmentation). Also, unlike 6-4PP removal, CPD removal is
capable of preventing the development of p53 epidermal patches, which have a direct correlation with carcinoma
development. These results indicate that, even in a DNA repair-deficient background, CPDs play the most important
role on skin outcome after UVB irradiation and that each lesion leads to different types of skin pigmentation.
Financial support: FAPESP, CNPq, Erasmus MC, USP
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Influência do silenciamento do gene APE1/REF-1 na
proliferação e da cinética do ciclo celular em células
de glioblastoma tratadas com o quimioterápico
temozolomida
Montaldi, AP1; Sakamoto-Hojo, ET1,2
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP
Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, SP, Brasil.
[email protected]
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2
Palavras-chave: siRNA Ape1/Ref-1, Temozolomida, glioblastoma, BER, resistência.
Uma recente estratégia para sensibilizar células de câncer a agentes causadores de dano no DNA é a inibição
de proteínas de reparo. Uma destas é a Apurinic endonuclease 1/Redox factor-1 (APE1/REF-1), cuja expressão é
encontrada aumentada em numerosos tipos de câncer, incluindo glioblastoma. A enzima APE1 é essencial no
reparo por excisão de base (BER) e também atua como fator de oxido-redução, mantendo fatores de transcrição
envolvidos na promoção e progressão do câncer, em um estado ativo reduzido. No presente trabalho, foi
proposto avaliar a influência do silenciamento do gene APE1/REF-1 em células de gliobastoma T98G resistentes
à temozolomida (TMZ), estudada pelo teste de proliferação celular (Kit XTT) e cinética da progressão no ciclo
celular, sendo realizados três experimentos independentes. Foram observadas reduções significativas (p≤0,05) na
proliferação celular após a transfecção do gene APE1/REF-1, em relação ao controle, e mesmo quando estas foram
tratadas com TMZ (600 µM), nos tempos de 24h (89,3 e 89,4%), 48h (66,6 e 53,3%) e 72h (85,1 e 57,1%). As células
transfectadas e tratadas com TMZ também mostraram diferenças significativas (p≤0,01) quando comparadas
com as células silenciadas (não tratadas), nos tempos de 48 e 72h. O tratamento unicamente com TMZ mostrou
diferenças significativas apenas no tempo de 72h (87,5%). Nos experimentos de ciclo celular, o tratamento com
TMZ mostrou um aumento na porcentagem de células na fase G2 do ciclo, nos tempos de 24h (26,5%), 48h (34,8%)
e 72h (26,5%), mesmo quando o gene foi silenciado (22,8; 28,9 e 28%, respectivamente). Assim, o tratamento com
a TMZ causou um aumento em G2 nas células transfectadas, o que não foi observado nas células que sofreram
inibição de APE1/REF-1 somente, mostrando que o silenciamento não foi capaz de alterar a progressão das células
no ciclo, sendo esse efeito causado pela droga TMZ. Baseado nesses resultados verifica-se que a expressão reduzida
do gene APE1/REF-1 aliada ao efeito do tratamento com a TMZ induziu maior porcentagem de morte, indicando
que o reparo via BER pode ser um fator de resistência ao tratamento com esse quimioterápico. Entretanto, estudos
adicionais são necessários no sentido de avaliar os mecanismos pelos quais essas células são eliminadas e as vias
de sinalização comprometidas sob condições de silenciamento gênico, com ou sem tratamento com a droga.
Apoio financeiro: FAPESP (Proc. Nº 2009/10925-6; 2009/10106-5); CNPq; CAPES; FAEPA-HC-FMRP-USP.
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Caracterização funcional de 8-oxoguanina DNA
glicosilase de Trypanosoma cruzi
Kunrath-Lima, M1; Furtado, C1; Macedo, AM1; Franco, GR1; Pena, SDJ1; Teixeira, SMR1; Machado, CR1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: BER, 8-oxoguanina DNA glicosilase, Trypanosoma cruzi
A manutenção da integridade do material genético é essencial para a sobrevivência dos organismos vivos.Uma
das maiores ameaças à integridade do genoma é a oxidação de bases nitrogenadas, gerada principalmente por
espécies reativas de oxigênio (ROS). Um dos produtos mais freqüentes da oxidação do DNA é a 7,8-dihidro-8oxoguanina (8-oxoguanina).Essa lesão é particularmente deletéria por fazer com que a guanina oxidada possa
parear erroneamente com uma adenina, levando a uma mutação por transversão do par de bases.O reparo por
excisão de base (BER) é o processo celular mais importante na remoção da 8-oxoguanina. O reparo por excisão de
base cliva apenas a base, deixando no DNA o esqueleto de açúcar-fosfato e gerando um sítio abásico.A 8-oxoguanina
é removida pela 8-oxoguanina DNA glicosilase (OGG1 ou Fpg), possibilitando que outras enzimas possam inserir
uma guanina normal no lugar da guanina oxidada. O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, causador
da doença de Chagas, que assim como os demais organismos vivos está susceptível ao estresse oxidativo. A
fim de caracterizarmos o gene OGG1 de T. cruzi (TcOGG1), realizamos ensaios de complementação funcional
heteróloga. Inicialmente, os experimentos foram realizados em Escherichia coli, entretanto, não fomos capazes
de obter resultados, uma vez que a expressão do gene TcOGG1 foi tóxica tanto para a célula selvagem (AB1157)
quanto na deficiente para fpg (BH20). Porém, a expressão do gene TcOGG1 não foi tóxica para leveduras.Células de
leveduras deficientes no gene OGG1 (CD138) apresentam um aumento na taxa de mutação, e quando estas foram
complementadas com o gene TcOGG1, a taxa de mutação apresentou valores similares aos da levedura selvagem
(FF18733). Para confirmarmos a função do gene TcOGG1, construímos uma cepa de T. cruzi que superexpressa
esse gene. Apesar da célula TcOGG1 superexpressora apresentar um crescimento similar ao de células selvagens
em condições padrões, ela é mais sensível ao tratamento com água oxigenada, o que pode ser fruto da geração
de uma maior quantidade de sítios apurínicos/apirimidínicos que são letais. Esses dados estão de acordo com
o nível de 8-oxoguanina em células superexpressoras de TcOGG1, que é menor tanto no núcleo quanto no
kDNA, mas este nível é acentuado após o tratamento com água oxigenada. A diminuição de 8-oxoguanina dos
genomas mitocondrial e nuclear deve estar associada com a proteína TcOGG1, uma vez que experimentos de
localização com TcOGG1 em fusão com a proteína GFP revelaram que esta proteína é direcionada tanto para o
núcleo (em maior quantidade) quanto para a mitocôndria. Os dados por nós obtidos mostram que o Trypanosoma
cruzi possui uma enzima OGG1 funcional e que a mesma está participando do BER nuclear e mitocondrial.
Apoio financeiro: CAPES, FAPEMIG, CNPq, Howard Hughes Medical Institute.
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RNA de interferência: ferramenta para o estudo da
função do gene E2F1 no mecanismo celular de reparo
ao dano no DNA
Oliveira, MT¹; Schoof, CRG2; Menck, CFM3; Vasques, LR¹
¹Departamento de Bioquímica – Universidade Federal de São Paulo
²Departamento de Genética – Universidade de São Paulo
3
Departamento de Microbiologia – Universidade de São Paulo
Palavras-chave: E2F1, RNAi, apoptose, reparo de DNA.
E2F é uma família de fatores de transcrição composta por oito genes, E2F1 a E2F8. E2F1 apresenta papel fundamental
na progressão do ciclo celular em mamíferos, uma vez que é responsável pela ativação de genes que participam
da síntese de DNA. E2F1 é regulado pela proteína Rb que, ao liberar este fator, promove a proliferação celular.
Além disso, E2F1 atua em outra via antagônica, promovendo a apoptose. Assim, foram objetivos deste trabalho:
(a) inativar o gene E2F1 através de RNA de interferência em diferentes linhagens humanas deficientes em reparo
de DNA; (b) analisar seu efeito na apoptose induzida por radiação ultravioleta (UVB). Duplexes de siE2F1 foram
inicialmente utilizados para verificação da eficiência da inativação gênica em linhagem humana de fibroblastos
transformados (MRC5). A eficiência dos duplexes de siE2F1, com o uso de oligofectamina como veículo, mostrou
ser bastante satisfatória, onde observou-se que a análise da expressão de E2F1 estava diminuída em 73% a nível
de mRNA (qRT-PCR) e 78% a nível protéico (Western Blot). Após a confirmação da eficiência da inativação, foram
iniciados experimentos em linhagens de células deficientes em reparo ao dano de DNA (XPA e XPC). Células XPA
não mostraram redução no nível do mRNA, porém houve diminuição de aproximadamente 60% na expressão
da proteína E2f1 (Western Blot), ambas quando comparadas ao controle. A eficiência da inativação de E2F1 na
linhagem XPC foi semelhante, onde na análise por qRT-PCR e por Western Blot pode-se observar redução de cerca
de 50%, quando comparadas ao controle. Pode-se averiguar, portanto, que a inativação por RNAi é uma potente
ferramenta para o estudo da função gênica de E2F1. Para o ensaio de apoptose foi quantificada a população sub-G1,
através de citometria de fluxo (Guava Express Plus). Para tanto, células das diferentes linhagens foram tratadas
com siE2F1 e irradiadas com doses de UVB previamente estipuladas, utilizando-se de células não irradiadas como
controle. Após a irradiação, observou-se leve aumento da morte celular nas linhagens XPA e XPC, sugerindo que
a ausência de E2F1 não promoveu uma significativa diferença em relação a apoptose nas células deficientes em
reparo ao dano no DNA, quando comparadas às células proficientes em reparo, indicando que E2F1 está à montante
da via de NER. Entretanto, os resultados aqui obtidos surpreendem, pois após a irradiação, células deficientes e
proficientes em reparo, tratadas com siE2F1, apresentaram um aumento de morte, apesar de E2F1 ser um fator
de transcrição pró-apoptótico, sugerindo que o mesmo protege a célula da apoptose após irradiação com UVB.
Apoio financeiro: FAPESP e CAPES
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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11
Analysis of gene-specific DNA damage and repair of
Trypanosoma Cruzi and localization examination of its
DNA repair proteins
Rajao, MA1; Nardelli, SC2; Macedo, AM1; Franco, GR1; Pena, SDJ1; Teixeira, SMR1; Van Houten, B3;
Machado, CR1
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Belo Horizonte, MG
Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, UNIFESP, SP
3
University of Pittsburgh Cancer Institute – Pittsburgh, PA, EUA
[email protected]
1
2
Keywords: DNA repair, Trypanosoma Cruzi, localization, nucleotide excision repair, homologous recombination
The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, a debilitating illness that afflicts
9 million people in Latin America. Despite being a eukaryote, it has several unique adaptations. T. cruzi contains
only one mitochondrion. Inside this organelle, mitochondrial DNA is localized in one region, forming a condensed
network of thousands of minicircles and a dozen maxicircles. Maxicircle gene products include rRNAs and
subunits of respiratory complexes, whereas minicircles encode guide RNAs involved on maxicircle RNA processing.
Surprisingly several DNA polymerases commonly found in the nucleus of other higher eukaryotes have been found
in the mitochondria of T. cruzi. The precise role of these polymerases is not totally clear. In this present work, we
assessed the DNA repair capacity of T. cruzi following treatment with different genotoxic agents. The formation and
repair of nuclear and mitochondrial DNA lesions resulting from hydrogen peroxide, MMS or cisplatin were examined
using quantitative PCR of an 11 kb nuclear sequence and a 11.5 kb region of maxicircles of mtDNA. Treatment
of MMS or cisplatin gave a dose dependent increase in DNA lesions in either the nucleus or mtDNA genomes.
However, when parasites were challenged with H2O2, we observed that the nuclear DNA of this parasite was more
prone to oxidative DNA damage, while the mitochondrial DNA acquired lower amounts of lesions even when treated
with higher concentrations. Despite the higher number of hydrogen peroxide-induce lesions within the nucleus,
parasite cells were able to repair almost 100% of nuclear lesions after 10 hours of recovery, whereas mtDNA damage
persisted and showed little change over 24 hrs. This persistent mtDNA damage was followed by a reduction in
oxidative phosphorylation. T. cruzi showed efficient repair of mitochondrial lesions caused by MMS and remarkably,
cisplatin. In order to examine whether this repair is carried out by a distinct nucleotide excision repair (NER) or
by homologous recombination (HR) we are currently identifying the localization of most proteins from these two
DNA repair pathways. So far, we verified that the NER proteins HR23B and XPD are target to nucleus and localize
to euchromatin regions. In addition, ERCC1 (NER) and XRCC3 (HR) localize to the cytoplasm, with stronger spots
close to the mitochondrial DNA. At this point, we are examining the localization of the other NER and HR proteins.
Financial support: Machado CR: CNPq, FAPEMIG, Howard Hughes Medical Institute, CAPES Van Houten B: UPCI
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Análise da expressão de APE1 após estresse oxidativo
em células proficientes e deficientes na via de reparo
por excisão de nucleotídeos
Melo, JTA; Silva, AE; Brandão, JA; Oliveira, AHS; Silva, TA; Petta-Lajus, TB; Agnez-Lima, LF
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, LBMG. Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, UFRN.
[email protected]
Palavras-chave: Estresse oxidativo, riboflavina, APE1, NER.
O reparo de lesões oxidativas no DNA ocorre primariamente através da via de reparo por excisão de bases (BER),
onde a proteína APE1 destaca-se por ser a principal AP endonuclease em mamíferos. Por sua vez, a via de reparo
por excisão de nucleotídeos (NER) atua reparando lesões que causam distorções na dupla hélice do DNA. Tem
sido evidenciado que a via NER também atua na remoção de danos oxidativos e na estimulação da função de
reparo da endonuclease APE1. O objetivo desta pesquisa foi analisar os efeitos citotóxicos de agentes oxidativos
em células humanas proficientes e deficientes na via NER, correlacionando à expressão de APE1. Para tanto, as
linhagens proficientes e deficientes no NER foram submetidas ao tratamento com riboflavina fotossensibilizada
(RF*). Os resultados evidenciaram perfis de sensibilidade distintos, onde as linhagens XPA e CSB foram mais
sensíveis, enquanto a linhagem XPC mostrou resistência similar à linhagem proficiente MRC5. As análises do
fracionamento celular demonstraram que APE1 é recrutada e se torna fortemente ligada à cromatina após estresse
oxidativo nas linhagens MRC5 e XPA. Os resultados também evidenciaram um aumento nos níveis endógenos
da proteína γ-H2AX, indicando a ocorrência de danos oxidativos. Conclui-se que a RF* foi capaz de promover a
morte de linhagens deficientes na via NER e a proteína APE1 pode estar envolvida no reparo de danos oxidativos
causados pela RF*, já que APE1 é recrutada para cromatina e se liga fortemente a esta após o tratamento.
Apoio Financeiro: CNPq, Redoxoma.
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13
O papel da Asf1, uma chaperona do dímero de
histonas H3-H4, na resposta ao dano no DNA em
tripanossomatídeos
Vieira da Rocha, JP1; Garcia, JBF2; Pascoalino, BS3; Schenkman, S3; Cruz, AK2; Machado, CR1
Laboratório Genética Bioquímica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. 3Universidade Federal de São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Asf1, estrutura da cromatina, tripanossomatídeos, reparo de DNA e resposta a danos no DNA.
A montagem da cromatina é um processo que está acoplado à transcrição, replicação e reparo do DNA. Nesse
contexto, Asf1 (anti-silencing function 1) liga-se ao dímero de histonas H3-H4, durante a formação do nucleossomo.
Além de atuar na dinâmica da montagem e desmontagem dos nucleossomos, Asf1 atua em outros processos
celulares, tais como o controle da expressão gênica e a resposta a danos gerados no DNA. Nesse último, Asf1
participa da desativação do checkpoint dependente de dano, fazendo com que a célula retorne ao ciclo celular.
Essa proteína demonstra efeito protetor aos diferentes tipos de lesão no DNA, uma vez que cepas de levedura
nocautes para o gene asf1 são sensíveis ao tratamento com vários agentes genotóxicos (metilmetanosulfonato,
cisplatina e radiação gama). Asf1 é uma proteína ubíqua, estando presente em todos os eucariotos analisados até o
momento. Neste projeto, pretendemos, portanto, analisar o papel dessa proteína na resposta ao dano no DNA em
tripanossomatídeos (Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi e Leishmania major). Para tal, foram geradas cepas
de T. brucei e L. major superexpressoras de Asf1, sendo que a obtenção da cepa de T. cruzi que superexpressa essa
proteína ainda está em andamento. Resultados preliminares indicam que L. major superexpressando Asf1 é mais
resistente ao tratamento com peróxido de hidrogênio em relação à cepa controle. Além disso, a análise por PFGE
(pulsed field gel electrophoresis) sugere que a superexpressão dessa proteína em L. major aumenta a integridade
do DNA desse parasito, após o tratamento com 400 μM de H2O2. No entanto, a superexpressão de Asf1 não
modifica o grau de quebras-duplas induzidas por radiação gama. Já em T. brucei, a superexpressão de Asf1 induziu
a morte desses parasitos após o tratamento com MMS, H2O2 e radiação gama. Nossos resultados sugerem que
diferentes mecanismos de resposta a danos no DNA, envolvendo a proteína Asf1, atuam entre essas duas espécies.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG e FAPESP.
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14
Resposta transcricional de potenciais marcadores gênicos
de estresse genotóxico ligados ao sistema ubiquitinaproteassomo em fibroblastos humanos normais
Berardinelli, GN1; Sakamoto-Hojo, ET1,2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP; Universidade de São Paulo, Campus USP
de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marcadores gênicos, estresse genotóxico e fibroblasto
Muitos genes têm sido indicados como responsivos ao estresse genotóxico sob determinadas condições testadas,
mas muitos ainda permanecem sem confirmação, visto que é grande a influência do background genético das
células. Muitos genes de resposta ao estresse têm funções relacionadas ao reparo do DNA, ao sistema ubiquitinaproteassomo (UPS) e UPR (unfolded-protein response). O UPS tem sido considerado o principal mecanismo
responsável pela remoção de proteínas, discriminando proteínas normais de alteradas e assim removendoas seletivamente por degradação. Falhas no funcionamento do UPS têm sido relacionadas a diversas doenças
neurodegenerativas e ao câncer. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar potenciais marcadores
gênicos por meio do estudo da expressão transcricional de vários genes previamente relatados como responsivos
ao estresse genotóxico, visando à confirmação dessas respostas em linhagens de fibroblasto sob tratamento com
peróxido de hidrogênio (H2O2). As linhagens GM07492A e AS405 foram submetidas ao tratamento com H2O2 (80
μM) por 30 minutos. Subsequentemente foi realizado o Ensaio Cometa e extração de RNA, nos tempos de 0, 2, 4 e 6
h, pós-tratamento. A análise de expressão gênica foi feita por qPCR em tempo real sendo estudados os genes: ERN1,
EIF2AK3, GADD153 e TRAF2, participantes do UPS. Os resultados mostraram um nível de dano significativo no
tempo 0 h em ambas as linhagens (55% para GM07492A e 44% para AS405). Após 6 h houve recuperação também
em ambas, atingindo valores próximos ao controle (aproximadamente 10% de dano). Na análise de expressão
gênica, obtiveram-se variações na expressão transcricional. Para GM07492A, houve um aumento significativo
na expressão de ERN1 após 6 h do tratamento. Para GADD153 a indução foi observada em todos os tempos,
sendo significativa em 0 h. Para AS405, o ERN1, que apresentava uma repressão em 0 h, mostrou-se induzido
significativamente nos tempos de 2 e 6 h. O nível de indução diminuiu ao longo desses tempos concomitantemente
à diminuição do nível de dano. GADD153 também foi induzido nos tempos 0 e 2 h. Essa modulação transcricional,
apresentada por esses genes, mostra uma relação com os danos observados no DNA pelo Ensaio Cometa e sugere
o envolvimento do UPS, nas respostas celulares ao estresse oxidativo. Em trabalhos paralelos do laboratório, os
genes EIF2AK3, GADD153 e TRAF2 mostraram-se também modulados quando analisados após tratamento com
drogas antitumorais em linhagens de glioblastoma e linfócitos de pacientes com Doença de Alzheimer. No presente
trabalho, as alterações nos perfis de expressão de genes da via UPS demonstraram a importância do estresse
genotóxico ao nível do retículo endoplasmático, confirmado por alguns genes que respondem a esse estresse.
Suporte financeiro: FAPESP (2009/03991-2), CNPq e CAPES
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Expressão gênica transcricional e proteica em
linfócitos de indivíduos portadores da Doença de
Alzheimer
Leandro, GS1; Oliveira, DVNP1; Moriguti, JC²; Sakamoto-Hojo, ET1,3
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto, S.P.
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto, S.P.
3
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto, S.P.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: doença de Alzheimer, estresse oxidativo, linfócitos
A patogênese de doenças neurodegenerativas e o processo de envelhecimento estão, de maneira geral, relacionados
ao estresse oxidativo. Sendo assim, a Doença de Alzheimer(DA), que é uma demência senil neurodegenerativa
crônica com grande impacto na saúde pública, apresenta uma importante relação com o estresse oxidativo,
havendo evidências de que há deficiência dos mecanismos de reparo dos danos causados por esse estresse.
Assim, o estudo de genes e proteínas relacionados ao processo de reparo do DNA em portadores de DA constitui
importante objeto de estudo na identificação de fatores de risco e de proteção ligados à doença. Este trabalho teve
como objetivo investigar a expressão gênica (por qPCR em tempo real) dos genes ATM, ATR, FANCG, HUS1 e MTH1
além da expressão das proteínas SOD1, TP53 e fosfoTP53ser15 (por Western blot) em linfócitos de indivíduos com
DA, visando testar a hipótese de que essas células exibem alterações nos níveis de transcrição e tradução de genes
relacionados ao reparo do DNA, podendo ser relevantes na etiopatogenia da DA. As proteínas e os transcritos
foram extraídos de linfócitos provenientes de amostras de sangue periférico coletadas de 7 pacientes com DA
e 7 idosos sadios (controles) e submetidas à análise por Western blot e qPCR em tempo real. Os resultados de
expressão gênica apontaram uma elevada indução do gene FANCG (checkpoint e reparo do DNA) e repressão
de MTH1 (papel na remoção de bases oxidadas do pool gênico) em indivíduos portadores da DA, enquanto que
os níveis de expressão dos genes ATM e ATR, HUS1 e ERCC6, responsáveis pela detecção, sinalização e reparo
de danos no DNA, não se mostraram significativamente diferentes dos níveis observados para os controles. A
proteína SOD1 (enzima responsável pela defesa contra radicais superóxido) não apresentou alterações nos níveis
de expressão nos linfócitos estudados. A expressão da proteína TP53 foi maior em DA, no entanto, sua forma
fosforilada não apresentou diferença entre os grupos. A TP53 foi associada a processos neurodegenerativos e
considerada um biomarcador para DA, sendo relatado um comprometimento da estrutura terciária dessa proteína,
o que altera a sua atuação levando a uma resposta diferente sob condições de injúria citotóxica. Os resultados
deste trabalho mostraram que, apesar de TP53 ser bastante expressa em DA, a sua ativação ( fosforilação na
serina 15), geralmente mediada pelas proteínas ATM/ATR (que não se mostraram estatisticamente induzidas)
ou DNAPK, não foi observada. A expressão gênica diferencial, principalmente de FANCG e da proteína TP53
em indivíduos com DA suportam a hipótese de que os mecanismos de reparo do DNA estão alterados nos
linfócitos de portadores da DA. Além disso, mostra que os tecidos periféricos são capazes de apresentar
alterações em biomoléculas, que podem ser potenciais biomarcadores da DA e merecem ser melhor investigados.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAEPA, FAPESP
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The Human Regulatory Protein Ki-1/57 is a Target of
Sumoylation
Saito, A1,2; Gonçalves, KA1,2; Santos, MT1,3; Kobarg, J1,2,3
Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Centro de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), Campinas, SP, Brazil.
Instituto de Biologia, Departamento de Bioquímica, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.
3
Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.
1
2
Keywords: Mutagenesis, Sumoylation, post-translational modification, lysine, Ki-1/57
Ki-1/57 is a nuclear and cytoplasmic human protein that was first identified through the cross reactivity of the
anti-CD30 monoclonal antibody Ki-1, in Hodgkin lymphoma cells. When isolated from the Hodgkin’s lymphoma
analogous cell line L540 Ki-1/57 co-immunoprecipitated with a Thr/Ser protein kinase activity, showing to
be phosphorylated on their serine and threonine residues. Ki-1/57 is also methylated at arginine residues. In
addition to phosphorylation and methylation, recent studies have identified sumoylation as another important
reversible post-translational modification that regulates the biological functions of proteins. Sumoylation
is the covalent attachment of small ubiquitin-like modifier (SUMO) to lysine residues of targeted proteins in a
ΨKXE sequence (in which Ψ is a large hydrophobic residue and X is any amino acid). We have identified seven
potential SUMO target sites, K166, K171, K213, K276, K306, K313 and K336, in the Ki-1/57 amino acid sequence
by using the program SUMOplot. To identify which lysine residues are covalently attached to SUMO-1, sitedirected mutagenesis of the sumoylation target lysine was performed. Ki-1/57-Flag wild type (wt) and mutants
were superexpressed in HEK293 cells, immunoprecipitated with the antibody anti-Flag and probed with the
polyclonal anti-SUMO-1. The immunoprecipitation showed that three lysines, K213, K276 and K336, are the
major in vivo sumoylation sites on Ki-1/57 protein. Furthermore, we have found that Ki-1/57 wt is a target of
SUMO-1 and SUMO-2/3 in vitro. Through immunocytochemistry we found that EGFP-Ki-1/57 co-localizes with
SUMO-1 in both the nucleus and the cytoplasm of HEK293 cells. These results will help to better understand the
mechanisms underlying the sumoylation of Ki-1/57 and its role in regulating the proteins function in the cell.
Financial support: FAPESP, CNPq and CNPEM
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Análises mutacionais da proteína NIK1 e os impactos
na atividade de autofosforilação
Almeida, FCS1; Santos, AA1; Lopes, KVG1; Fontes, EPB1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular - BIOAGRO; Universidade Federal de Viçosa, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: NIK1, docking site, autofosforilação, receptor-like kinase, mutagênese sítio dirigida.
Os receptores do tipo cinase serina/treonina (RLKs) exercem papel fundamental na sinalização celular em plantas,
usando sua fosforilação reversível para transdução de sinais externos para o interior das células. A família RLK
é representada por 417 seqüências no genoma de Arabidopsis, sendo organizadas em uma configuração típica
de receptor cinase, abrigando um domínio N-terminal extracelular seguido por um segmento transmembrana e
um domínio cinase C-terminal. Dentre as RLKs, 214 genes codificam uma super classe de proteínas, contendo
em sua região extracelular repetições ricas em leucina (Leucine-Rich-Repeat – LRR). Estas proteínas LRR-RLKs
estão envolvidas em uma grande variedade de processos biológicos como desenvolvimento, resistência a doenças
e crescimento. A proteína NIK1 é uma autêntica LRR-RLK, localizada na membrana plasmática, que atua na
resposta antiviral. Análises mutacionais demonstraram que NIK1 é ativada por transfosforilação. Ativação de NIK1
ocorre por meio de um padrão gradual de fosforilação na alça de ativação com papéis distintos para os diferentes
resíduos de treonina. Fosforilação do resíduo Thr-474 é crucial para ativação da atividade de cinase de NIK1. Em
contraste, uma mutação no Thr469 não impacta a autofosforilação, mas causa um aumento na fosforilação do
substrato rpL10, sugerindo um papel inibitório para Thr469 na função cinase. Fora da alça de ativação, a região
C-terminal tem sido analisada por meio da introdução de um códon de parada nas posições 609 e 588. Ambas
as deleções dos fragmentos 588-638 e 609-638 diminuíram a atividade de autofosforilação similarmente e aboliu
totalmente fosforilação do substrato, demonstrando a possível existência de sítios de fosforilação entre as posições
588 e 638. Inspeção da região C-terminal deletada revelou a presença de três resíduos de serina na posição 613, 615
e 619 com o potencial de ser substrato para serina cinases. Entretanto, mutação nos referidos sítios não alterou
a atividade de cinase de NIK1. Em contraste, substituição de uma tirosina na posição 618 por alanina reduziu
consideravelmente autofosforilação de NIK1. Estes resultados indicam que o resíduo Tyr-618 é um sítio provável
de fosforilação e, consequentemente, NIK1 comporta-se como uma cinase de dupla especificidade. Experimentos
para análise do impacto da fosforilação Tyr-618 na atividade de fosforilação do substrato estão em progresso.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEMIG, FINEP.
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Emprego de gene repórter luciferase para determinação
de atividade de reparo de DNA em células animais.
Rocha, CRR; Munford, V; Menck, CFM.
Laboratório de Reparo de DNA, Depto. de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Reparo de DNA, vetores virais, luciferase, renilla.
Introdução: O uso de genes repórteres, como o que expressa a proteína luciferase, permite a avaliação do reparo de
DNA celular a partir de determinação da atividade do gene transcrito, que é reduzida na presença de lesões. Dessa
forma, a existência de processos de reparo de DNA resulta em uma expressão mais elevada do gene repórter se este
estiver tratado com algum agente genotóxico, em relação a células deficientes em reparo de DNA. A essa atividade
se denomina reativação pela célula hospedeira (HCR, do inglês, Host cell reactivation). Objetivo: Construir vetores
adenovirais para expressão do gene luciferase e renilla para estabelecer a metodologia do HCR, através da eficiente
transdução gênica desses vetores. Metodologia: O gene da luciferase (Luc) de vagalume e foi obtido do vetor pGL4
(PROMEGA) e subclonado no vetor de expressão de células humanas (pShuttle, sob o controle do promotor CMV).
Após isso, o cassete de expressão contendo Luc foi transferido para o vetor Adeno-X. O vetor obtido (AdLuc) foi
transfectado em células HEK 293 de baixa passagem para a produção de partículas virais. Resultados: Após a
construção intermediária, foi avaliada, utilizando luminômetro, a atividade da Luc em células HEK293 transfectadas
com pShuttle-Luc. Após a adição de luciferina, verificou-se uma alta atividade da Luc em células transfectadas
com pShuttle-Luc. Após verificação da atividade da Luc o cassete de expressão foi introduzido no vetor Adeno-X.
A presença de Luc, no AdLuc, foi confirmada por enzimas de restrições específicas e por PCR. Como a expressão de
vetores adenovirais é transiente, foi também iniciada a construção de vetores lentivirais que expressem Luc ou RL
sob o controle do promotor CMV, possuindo múltiplos sítios de clonagem e sistema de seleção com o antibiótico
puromicina. Esse tipo de vetor viral tem a capacidade de integrar no genoma da célula em que foi transfectada e, dessa
forma, perpetuar sua expressão gênica. Nossa expectativa é que com esses vetores lentivirais poderemos construir
linhagens celulares, incluindo de origem tumorais que expressam luciferase. Conclusões: Acreditamos que o emprego
do gene reporter luciferase ou renilla, clonados em adenovírus ou lentivírus, deverá servir de apoio a uma série de
experimentos que dependem da determinação do reparo celular em determinado tratamento. Além disso, será nosso
primeiro passo para o uso de luciferase empregada em ensaios in vivo, utilizando a técnica de imagem intravital.
Suporte financeiro: FAPESP, CNPq.
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Analysis of histone modifications by using genetic tools
in Trypanosoma cruzi
NardellI, SC; Vizioli, V; Pascoalino, BS; Schenkman, S
Departamento de Microbiologia, Imunonologia e Parasitologia, Universidade Federal de São Paulo, R. Botucatu 862 8A, 04023-052 São
Paulo, S.P. Brasil
[email protected]
Keywords: Trypanosoma cruzi, histona, acetilação, reparo, gene
As in most eukaryotes, the chromatin of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas’ disease, is composed by histones
associated with DNA. In general, histones undergo several post-translational modifications. One of them is lysine
acetylation that acts as signal for binding of specific factors, which modulate transcription, replication and DNA repair.
However, trypanosome histones are highly divergent when compared to other organisms. Therefore it is relevant
to understand whether they are modified and what is the role of these modifications. We initially demonstrated
that histone H4 is acetylated at lysine 4, 10 and 14. To study the role of these modifications, we generated parasites
expressing mutated histone H4 in each one of these residues, which also contained a Myc-epitope in the C-terminus
to follow their expression and intracellular localization. The expression of the modified histone was achieved in a
tetracycline-regulated promoter driven by the presence of T7-RNA polymerase expressed in the parasite. Thus,
after tetracycline addition, the modified histones correspond to 10% of the wild type histones, and are found in the
cell nucleus associated with the chromatin. The parasites harboring lysine 14 substituted by alanine (K14A) show
a decreased growth rate with accumulation of cells in G2 phase of the cell cycle. The K10A modification, and at
less extent K14A, affects growth on parasites submitted to gamma rays that induce double strand breaks into DNA.
No growth phenotype was observed with K4A, but the modified histone has a different nuclear distribution as
compared to unmodified histones. Taken together these results demonstrate the use of genetic tools to study histone
modifications in T. cruzi. Lysine 14 modification of histone H4 is required for entry into mitosis, lysine 10 is relevant
for allowing double strand DNA repair and the modification at lysine 4 seems to affect the chromatin organization.
Support: FAPESP, CNPq
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A ORF YGR102c de Saccharomyces cerevisiae é
necessária para expressão coordenada da citocromo c
oxidase e da ATPase mitocondrial
Barros, MH1; Paulela, J1; Rak, M2; Tzagoloff, A2#
Current address, Department of Microbiology, University of São Paulo, São Paulo, Brazil
Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mitocôndria, Saccharomyces cerevisiae, Citocromo c, mutagênese, PET112-HER2
O produto gênico da ORF YGR102c de Saccharomyces cerevisiae faz parte de um complexo envolvido na
transamidação do RNA transportador Gln-tRNAGln mitocondrial. Pet112 e HER2 também são parte desse complexo
que remonta o complexo bacteriano Gat-CAB. Mutantes de YGR102c apresentam deficiência na manutençaõ do
DNA mitocondria. Através de mutantes condicionais a temperatura identificamos que na ausência de Ygr102p os
produtos gênicos mitocondriais: Atp8p e Cox2p são mais severamente afetados. Ensaios de tradução revelaram que
esses mutantes apresentam uma nova variante eletroforética da proteína Cox2p que é inacessíviel a protease em
mitoplasto e uma rápida degradação de Atp8. Tais deficiências específicas em ambos poleptídeos mitocondriais
constrastam com um defeito geral na maquinaria de tradução mitocondrial resultante da perda de transamidação
do RNA transportador Gln-tRNAGln mitocondrial que afetaria todos os polipetídeos mitocondriais. Sugere-se
portanto aqui uma nova função para o complexo Ygr102-Pet112 e Her2.
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Caracterização bioquímica de linhagens celulares cíbridas
homoplásmicas para mutações no DNA mitocondrial
Oliveira, KK1; Kiyomoto, BH1; Tengan, CH1
Laboratório de Neurobiologia Molecular, Disciplina de Neurologia Clínica, Universidade Federal de São Paulo.
[email protected]
1
Palavras-chave: Doenças mitocondriais, DNA mitocondrial, fosforilação oxidativa, cadeia respiratória
Introdução: Mutações em genes específicos do DNA nuclear (nDNA) ou do DNA mitocondrial (mtDNA) podem
causar disfunções na atividade dos complexos respiratórios mitocondriais, trazendo prejuízos a função celular
e causando doenças. No citoplasma de uma única célula, existem centenas de cópias do mtDNA. Em casos de
homoplasmia, todas as moléculas de mtDNA da célula são do mesmo tipo (mutante ou selvagem). Já casos de
heteroplasmia, dentro de uma mesma célula coexistem mtDNA mutante e mtDNA selvagem. Quando algum
tecido apresenta uma quantidade de mtDNA mutante acima de um determinado limiar, as células passam a
produzir menos energia e podendo ocorrer, assim, o comprometimento da função mitocondrial. Na grande
maioria das doenças causadas por mutações no mtDNA, existe heteroplasmia nos tecidos o que dificulta a análise
dos efeitos bioquímicos em homogenados de tecidos. Objetivo: Investigar as características bioquímicas de células
homoplásmicas para mutações no DNA mitocondrial. Métodos: Foram estudadas linhagens cíbridas derivadas de
osteosarcoma e homoplásmicas para as mutações A3243G, A8344G, uma deleção de 7.5 kb (∆16:10:40 abrangendo
os nucleotídeos 7982-15504) e uma linhagem normal (143B). Atividades enzimáticas por espectrofotometria foram
obtidas para os complexos enzimáticos: complexo I (NADH decilubiquinona redutase), complexo II (succinato
ubiquinona oxido redutase), complexo II+III (succinato citocromo c oxido-redutase) e complexo IV (citocromo c
oxidase). As atividades foram obtidas em nmol/min/mg de proteina e corrigidas pela atividade da citrato sintase.
As análises foram realizadas em duplicata. Resultados: Observamos importante redução das atividades dos
complexos I, II+III e IV nas linhagens A8344G, A3243G e ∆16:10:40. As atividades observadas foram as seguintes
( em nmol/min/mg de proteína) para o complexo I: 143B 42,44; A8344G 1,72; A3243G 4,44; ∆16:10:40 1,72); para o
complexo II+III: 143B 70,68; A8344G 15,71; A3243G 31,41; ∆16:10:40 0,79; para o complexo IV: 143B 78,53; A8344G
8,01; A3243G 29,84; ∆16:10:40 9,03. Mesmo após correção para o conteúdo mitocondrial (citrato sintase), as reduções
nas linhagens homoplásmicas para mutações permaneciam importantes. Complexo I (143B: 38,68; A8344G:
0,48; A3243G: 0,99; del: 0,79), para o complexo II+III (143B: 64,41; A8344G: 4,35; A3243G: 7,03; del: 0,36) e para o
complexo IV (143B: 71,56; A8344G: 2,22; A3243G: 6,68; del: 4,16). Conclusões: Nossos resultados demonstram que as
diferentes mutações analisadas levaram a um mesmo padrão de deficiência mitocondrial com comprometimento
dos complexos I, III e IV, que apresentam subunidades codificadas pelo mtDNA. Apesar das mutações estarem
localizadas em regiões diferentes, não observamos diferenças no grau de comprometimento entre elas.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPESP
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Parâmetros de citometria de fluxo e citogenética para
análise de citogenotoxidade e morte celular em células
meristemáticas de Allium cepa
Oliveira, CE1; Gomes, SSL1; Marques, JS1; Campos, JMS1; Viccini, LF1
Laboratório de Genética e Biotecnologia, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora-MG.
[email protected]
1
Palavras-chave: Allium cepa, citogenotoxidade, morte celular, citometria de fluxo, ciclo celular
Introdução: Modelos vegetais tem sido rotineiramente utilizados para avaliação de citogenotoxidade com diferentes
propósitos, como análises de ecotoxicologia e prospecção de efeitos biológicos. De forma geral, parâmetros de
citogenética, tais como índice mitótico e alterações cromossômicas são utilizados. Um aspecto pouco explorado
em plantas é o uso da citometria de fluxo para detecção de mudanças no ciclo celular e/ou detecção de morte
celular. O objetivo do presente trabalho foi correlacionar dados obtidos por análise citogenética convencional com
informações obtidas pela citometria de fluxo para o estudo de citogenotoxidade, utilizando como modelo células
meristemáticas de Allium cepa. Métodos: Como tratamentos para avaliação de alterações de ciclo celular e indução
de morte celular foram utilizadas soluções de NaCl 500mM por 4, 8, 12 e 24h. Análise citogenética convencional foi
utilizada para obtenção de parâmetros morfológicos dos núcleos. As raízes de A. cepa coletadas foram fixadas em
etanol:ácido acético (3:1), posteriormente hidrolisadas em HCl 5N por 15 minutos. As lâminas foram preparadas
pela técnica de esmagamento e coradas com Giemsa. Os mesmos tratamentos foram realizados para análise por
citometria de fluxo. Os meristemas foram macerados em tampão para liberação de núcleos (LB01) e as amostras,
posteriormente filtradas e coradas com iodeto de propídeo. Análises de FSC foram empregadas no citômetro a fim
de correlacionar os dados de citometria e citogenética. Resultados: A análise citogenética convencional evidenciou
núcleos medindo entre 5 e 18mM, distribuídos em 3 categorias: núcleos condensados, núcleos médios (G1 e início
de S) e núcleos maiores ( final de S e G2). Os tratamentos com NaCl induzem um aumento significativo de núcleos
condensados, além de evidenciar degradação celular (indicativos de morte celular). O uso de beads em conjunto
com análise dos núcleos por citometria de fluxo permitiu a correlação dos dados de citogenética com os parâmetros
obtidos por citometria, evidenciando também um aumento significativo dos percentuais de núcleos condensados
após tratamento com NaCl. Adicionalmente, tanto a análise citogenética como a citometria permitem evidenciar
uma diminuição nos percentuais de células em divisão. Conclusões: A análise em conjunto por citogenética e
citometria permitiu uma abordagem pioneira na obtenção de parâmetros de citometria de fluxo para células
meristemáticas de Allium cepa que podem ser rotineiramente utilizados para análise de citogenotoxidade.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG.
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Avaliação do potencial bioantimutagênico e
desmutagênico do licopeno através do Teste SMART
em Drosophila melanogaster
Costa, MP; Abreu, BRR; Rigo, MPM; Nascimento, VLV; Dihl, RR; Lehmann, M
PPG em Genética e Toxicologia Aplicada, Laboratório da Toxicidade Genética – TOXIGEN, Universidade Luterana do Brasil, Canoas-RS.
[email protected]
Palavras-chave: licopeno, antimutagênese, teste SMART, Drosophila melanogaster, recombinação somática, mutação.
Introdução: Estudos epidemiológicos fornecem evidências de que o alto consumo de tomate reduz de forma
efetiva o risco de doenças relacionadas com a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), tais como o câncer.
O tomate e seus derivados são fontes ricas de licopeno (LIC), um carotenóide que possui elevada capacidade
de sequestrar o oxigênio singleto. Além de sua ação antioxidante, o LIC apresenta outras atividades biológicas,
que incluem cardioproteção, ação antiinflamatória, antimutagênica e anticarcinogênica. Apesar de vários estudos
demonstrarem a capacidade do LIC em prevenir a indução de danos químicos no DNA, os mecanismos envolvidos
ainda não estão esclarecidos. Objetivos: O presente estudo avaliou a atividade bioantimutagênica e desmutagênica
do licopeno em relação aos danos induzidos pelos agentes mutagênicos etilmetanossulfonato (EMS) e mitomicina C
(MMC). Métodos: Foi utilizado o teste para detecção de mutação e recombinação somática (SMART) em Drosophila
melanogaster através do cruzamento padrão, que apresenta níveis normais de enzimas de metabolização do tipo
citocromo P450. Resultados: Em relação à ação desmutagênica do licopeno, onde este carotenóide foi administrado
na mesma solução que as genotoxinas (co-tratamento), os resultados nos mostram que este composto foi capaz de
exercer efeito protetor sobre os danos induzidos pelo EMS e pela MMC nas duas concentrações utilizadas (0,06%
e 0,12%), ainda que de forma fraco-positiva. Adicionalmente, através da comparação dos dois genótipos obtidos
no cruzamento padrão, mwh/flr3 e mwh/TM3, foi possível verificar que o LIC reduziu a frequência de eventos
recombinacionais e mutacionais induzidos pela MMC nas duas concentrações utilizadas, o mesmo ocorrendo
para o EMS na concentração de 0,06%. Em relação ao EMS, na dose mais alta este carotenóide reduziu apenas
eventos recombinacionais. Os dados obtidos em relação à atividade bioantimutagênica, através do sistema de
pós-tratamento, evidenciaram que o LIC (0,06 e 0,12%) não alterou a mutagenicidade e a recombinogenicidade do
EMS e MMC em ambos os genótipos. Além disso, os resultados mostraram que o LIC não interferiu na proporção
entre danos recombinogênicos/mutacionais, sugerindo que este carotenóide não interfere nos mecanismos de
reparo envolvidos na correção das lesões induzidas por estes agentes alquilantes. Conclusão: Os dados obtidos
até o momento com o teste SMART, somados a demais estudos descritos na literatura, demonstram que o LIC é
capaz de exercer efeito protetor sobre a indução de danos gerados por diferentes agentes mutagênicos, que ocorre
preferencialmente quando este carotenóide é aplicado nos protocolos de pré- e co-tratamento. Esta atividade protetora
pode estar relacionada com a inativação das vias metabólicas de bioativação dos mutágenos ou com a ativação das
vias de detoxificação dos mesmos, entretanto parece não estar relacionada aos mecanismos de reparo do DNA.
Apoio Financeiro: FAPERGS, CNPq e ULBRA.
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Estudo comparativo das técnicas de extração e
purificação do DNA genômico submetido a condições
de exposição ambiental
Carvalho, S1; Fonseca, IBFC2; Júnior, RLS2; Miranda, CT3; Silva, EM1; Felício, LP1; Cruz, AD2; Silva, CC2
Laboratório de Mutagênese com Drosophila, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de
Goiás
2
REPLICON, Pontifícia Universidade Católica de Goiás
3
Faculdade de Tecnologia, Universidade de Brasília.
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, PCR, polimorfismo, identificação biológica.
Os exames para a identificação humana por DNA podem ser utilizados para estabelecer vínculo genético, construir
bancos de dados genéticos e para a identificação criminal. A validade dos resultados desses exames depende de
vários fatores. A degradação devido à coleta e armazenamento inadequados das amostras; contaminação; flutuações
de temperatura e umidade, condição de preservação, vestimentas coloridas e inúmeros artefatos podem atuar
como fatores limitantes, contribuindo diretamente para o insucesso dessa metodologia de análise. A pesquisa de
métodos alternativos de extração de DNA que possam ser rápidos, práticos, baratos, livres de toxicidade e eficazes
em relação à quantidade, qualidade e possibilidade de amplificação por PCR, do DNA extraído, é fundamental para
algumas áreas de estudos que visam o DNA como principal ferramenta. No presente estudo, foi realizada uma análise
experimental do rendimento e eficiência das metodologias de extração de amostras biológicas de sangue periférico
(100µL). Foram analisados o acondicionamento e exposição das amostras, submetidas às diferentes condições
ambientais de temperatura e umidade e períodos de exposição. Foram utilizados os métodos de Wizard Genomic®,
Fenol-Clorofórmio e Salinização. As amostras extraídas foram submetidas à quantificação por fluorometria pelo
DyNA Quant™ e análise molecular por PCR para o marcador RH92600. De acordo com os resultados obtidos, as
condições ambientais, como temperatura e umidade, possuem influência direta na preservação das amostras. Em
relação à superfície de exposição, os tecidos de algodão e jeans apresentaram menor interferência na obtenção
de DNA, comparados com a exposição da superfície do piso, para o ambiente interno e externo. O método fenolclorofórmio apresentou melhor rendimento na obtenção de DNA, semelhante ao encontrado pelo kit comercial
Wizard Genomic®. Adicionalmente, a técnica de fenol-clorofórmio apresentou melhor eficiência na retirada de
inibidores potenciais obtidos a partir da superfície de exposição das amostras biológicas. O kit comercial Wizard
Genomic® apresentou um bom rendimento quanto à obtenção de DNA, porém mostrou-se pouco eficiente na
eliminação de inibidores de PCR, diferente do método por salinização. Outros estudos devem ser elaborados, a fim
de se obter maior abrangência no aproveitamento de vestígios biológicos analisados pela Genética Forense.
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Avaliação dos Efeitos do Brometo de Etídio em Nível
Gênico e Bioquímico de Drosophila melanogaster
(Diptera-Drosophilidae).
Ouchi, RY1; Granzotto, A2; Manzato, AJ3; Ceron, CR1; Bonilla-Rodriguez, GO1.
Laboratório de Bioquímica de Proteínas e Laboratório de Isoenzimas de Insetos do Departamento de Química e Ciências Ambientais,
IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto SP
2
Laboratório de Evolução Molecular de3 Insetos do Departamento de Biologia, IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto SP
3
Departamento de Ciências da Computação e Estatística, IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: Brometo de Etídio, Elemento Transponível Bari-1, Biomonitoramento, Drosophila melanogaster
O brometo de etídio (EB) é um corante intercalante em ácidos nucléicos, eventualmente mutagênico e também
um inibidor intercalante da enzima topoisomerase II, que atua na manutenção da integridade do material
genético. Com o objetivo de verificar alguns efeitos provocados pelo EB em diferentes níveis em D. melanogaster,
analisamos o efeito em nível bioquímico (baseado na análise proteômica) e níveis gênicos, avaliando os efeitos
em cromossomos e genes (baseado no ensaio cometa). Além disso, avaliamos se há alguma variação no número
de cópias do elemento Bari-1, já que elementos transponíveis podem provocar mutações. Analisamos ainda a
produtividade em 20 gerações de D. melanogaster submetidas a diferentes concentrações do EB (1uM, 5uM e 30
uM) e 1uM de EMS (mutagênico), além da longevidade de machos, fêmeas e do casal (5 réplicas). Os dados revelam
que a longevidade média dos casais dos grupos tratados é sempre menor do que a do controle, sendo esta por
volta da 7ª semana, enquanto que para os expostos a EB é por volta da 3ª semana, e para o EMS, verificou-se
entre a 5ª e a 6ª semanas. A longevidade média dos machos do controle foi por volta da 9ª semana, enquanto que
para o 1 mM e 5 mM EB foi na 7ª semana. A média para 30 mM EB ficou em torno da 3ª semana, enquanto que
para o EMS o gráfico foi irregular, mostrando três intercepções da proporção relativa ao 50%, sendo a primeira
em torno da 3ª semana. A maior longevidade foi para o grupo de 30 mM EB, de 8 semanas; para os demais foi
de 4. Para as fêmeas do 30 mM EB a longevidade média foi de 8 semanas. Na produtividade diária para cada
geração houve diferença significante na quantidade de indivíduos expostos emergidos em relação ao controle.
A freqüência de indivíduos emergidos com alterações morfológicas (asas e tergitos) dos grupos tratados, em
relação ao controle, foi sempre maior. Entretanto, a análise cromossômica mostrou-se inviável pela dificuldade de
obtenção de lâminas para análise. A análise do elemento Bari-1 foi realizada por meio de Southern Blot, usando o
kit Alkaphos e o sistema de detecção Gene Images CDP-Star (Amersham). Verificou-se o mesmo padrão de bandas
entre grupos controles e tratados. Assim, pode-se inferir que não há polimorfismo de inserção e também sugerir
que não há diferenças significantes da transposição desse elemento entre os grupos analisados. Os protocolos
para realização da eletroforese bidimensional e ensaio cometa estão sendo estabelecidos. Embora os resultados
sejam parciais, pode-se verificar que o EB foi capaz de induzir alterações significativas em vários aspectos, com
grande variabilidade de resposta, conseqüência da variabilidade genética e adaptativa existente nas populações.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Cebus apella: modelo experimental na genética do câncer
Rosal TS, C1; Burbano, RR2; Matos, LA2; Muniz, JPC4; Indeloni, A4; Assumpção, PP3; Ribeiro-dos-Santos, A1
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciencias Biológicas –ICB, Universidade Federal do Pará – UFPA, Cidade
Universitária Prof. José Silveira Netto, Belém, PA
2
Laboratório de Citogenética Humana, Instituto de Ciencias Biológicas –ICB, Universidade Federal do Pará – UFPA, Cidade Universitária
Prof. José Silveira Netto, Belém, PA
3
Hospital Universitário João de Barros Barreto, Belém, PA
4
Centro Nacional de Primatas – Cenp, Ananindeua, PA
e-mail: [email protected]
1
Palavras-chave: CANOVA, Cebus apella, NMU, Tp53, TNF-α, GSTT1.
O Bioproduto Canova (CA) é um imunomodulador homeopático, com componentes encontrados na biodiversidade
brasileira, indicado em patologias nas quais o sistema imune esteja comprometido, incluindo neoplasias. A Canova
estimula a proliferação e a diferenciação de células hematopoiéticas mesenquimais, induzindo a diferenciação
mononuclear em células da medula óssea e, indiretamente, induz a proliferação de linfócitos por meio da ativação
de macrófagos, além de reduzir infecção e inflamação. Por outro lado, o composto químico N-nitrosometilurea
(NMU) é um agente carcinogênico alquilante que interagem com o DNA originando danos estruturais e alterações
genéticas (mutações pontuais, aberrações cromossômicas, metilação do DNA). O objetivo do presente trabalho
foi avaliar os possíveis danos gerados à molécula de DNA pelo NMU, assim como da ação do Bioproduto Canova
na imunoterapia de células gástricas. Para atingir este objetivo, o presente experimento foi dividido em duas
etapas: i) Aplicação do composto NMU e ii) tratamento com o Bioproduto CA. As análises hematológicas e
genéticas foram realizadas, nas duas etapas, em amostras de sangue e de tecido gástrico de quatro animais da
espécie Cebus apella submetidos a administração de NMU por via oral durante 8 meses (16mg/kg). A coleta de
sangue periférico para a realização das análises hematológicas e genéticas ocorreu antes do início da aplicação
do NMU e após, em intervalos de 30, 60, 90 e 240 dias. Ao final do 8º mês, iniciou-se a administração de CA em
três aplicações intravenosas (1,6 ml/kg) com intervalos de 48 horas entre as aplicações (48H, 96H, 144H) e 1
mês após a administração da primeira dose de CA. Na análise hematológica observou-se a redução gradual dos
elementos celulares sanguíneos durante a administração de NMU e sua recuperação ao final do tratamento com
CA. Nas análises genéticas foram investigados genes ligados ao controle do ciclo celular e ao metabolismo de
drogas, tais como o TP53, TNF-α e GSTT1, pelo sequenciamento direto. Como resultado, observou-se alterações
no DNA de um único indivíduo nos genes: i) TP53 éxons 7 e 8 (uma e três mutações, respectivamente); ii) na
região promotora do TNF-α (três pontos de mutação); e iii) GSTT1 (uma mutação). Apenas uma das oito
mutações foi do tipo transversão. Todas as mutações foram observadas na segunda etapa do experimento, o
que sugere que, apenas com o aumento da proliferação celular nesta etapa, foi possível observar as mutações
induzidas por NMU. Adicionalmente, o resultado demonstra que o NMU causa mutações irreversíveis in vivo
e o CA não foi capaz de eliminar o clone mutado, embora induza a proliferação de células hematopoiéticas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESPA.
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Estudo do polimorfismo no códon 399 no gene XRCC1
e da frequência de micronúcleos em indivíduos
infectados com os vírus das hepatites B e C
Leite, STAP1; Guimarães, NM2; Oliveira, JCS2; Souto, FJD3; Santos, RA4; Bassi, CL5
Pós-Graduação em Ciências Médicas, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Federal de Mato Grosso (FCM-UFMT)
FCM-UFMT
3
Departamento de Clínica Médica, FCM-UFMT
4
Departamento de Clínica Médica, FMRP-USP
5
Departamento de Ciências Básicas em Saúde, FCM-UFMT.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: polimorfismo, micronúcleo, hepatites B e C, XRCC1, reparo no DNA.
As hepatites virais (B e C) acometem milhões de pessoas em todo mundo, sendo um importante problema de saúde
mundial. A infecção viral é acompanhada de processo inflamatório, o qual gera estresse oxidativo, um potencial
agente causador dano no DNA. O principal mecanismo de reparo de dano oxidativo é o mecanismo de reparo
por excisão de bases (BER), do qual participa o gene XRCC1. O presente estudo teve como objetivos a) avaliar a
freqüência do polimorfismo arg399gli no gene XRCC1 em indivíduos infectados pelos vírus das hepatites B (HBV)
e C (HCV), comparando com indivíduos não infectados, bem como sua associação com manifestações clínicas e
laboratoriais das doenças, e b) avaliar a freqüência de micronúcleo (MN) no grupo HBV comparando com o grupo
controle. Para o estudo do polimorfismo foram analisadas amostras de DNA de 101 pacientes com hepatite B e
92 com hepatite C, além de 180 controles, por meio de PCR-RFLP, sendo os fragmentos visualizados em gel de
poliacrilamida a 10% corado com nitrato de prata. A freqüência de MNs foi avaliada em culturas de linfócitos de
sangue periférico de 6 pacientes HBV e 6 controles. Quando as freqüências genotípicas e alélicas foram comparadas,
não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos com hepatite B e C em comparação
com o grupo controle. Também não houve diferença significativa quando comparados os grupos HBV e HCV. No
entanto, houve um aumento da freqüência do polimorfismo 399gli em pacientes HCV apresentando atividade
viral (p= 0,01, OR= 5,4, IC 95%= 1,42-20,5). Com relação à freqüência de MNs, os pacientes HBV apresentaram um
aumento significativo de MNs (19,33 ± 5,32), de pontes nucleoplasmáticas (12,50 ± 2,28) e de brotos nucleares
(12,50 ± 2,19) quando comparados aos controles (6,17 ± 2,06; 3,33 ± 0,92; 6,17 ± 0,95, respectivamente). O valor do
índice de divisão nuclear não foi significativo quando comparados pacientes HBV e controle. Os resultados parciais
sugerem que a) há uma associação entre a presença do alelo 399gli e a atividade viral do HCV e b) a infecção pelo
HBV está relacionada com maior dano no DNA. Existem evidências de que a menor eficiência do BER poder estar
relacionada com aumento da variabilidade e da replicação de certos vírus, contribuindo assim para a atividade viral.
Por outro lado, estudos relatam que a proteína X, produzida pelo vírus HBV, está associada com uma freqüência
significativa de MNs em indivíduos acometidos pela hepatite B. No entanto, a contribuição dos polimorfismos em
genes de reparo para o aumento dos níveis de dano no DNA nesses pacientes ainda precisa ser melhor investigada.
Apoio financeiro: FAPEMAT, CAPES.
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Validação do camundongo rodador como modelo
para Síndrome de Usher tipo 1F (USH1F), desordem
genética humana caracterizada por deficiência auditiva
e retinite pigmentosa
Torres, AA1; Massironi, SMG2; Guénet, JL3; Godard, ALB1
Laboratório de Genética Animal e Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Biotério de Experimentos do Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
3
Unité de Génétique dês Mammifères, Institut Pasteur, França.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mapeamento genético, mutação induzida por ENU, modelo animal, protocaderina 15, validação de mutação
A mutação rodador é uma desordem monogênica, autossômica recessiva, caracterizada por perda auditiva,
comportamento circular e disfunção de equilíbrio. Análises histológicas do aparelho vestíbulo-coclear revelaram
estereocílios anormais e a análise de ligação feita com animais recombinantes utilizando marcadores microssatélites
mapeou a mutação no cromossomo 10, entre 29.0 e 49.0 cM. A caracterização da região permitiu a seleção do gene da
Protocaderina 15 (Pcdh15) como forte gene candidato, uma vez que está envolvido com a função auditiva e modelos
murinos descritos para este gene apresentam fenótipo muito semelhante ao rodador. A protocaderina 15 é um
membro da superfamília das caderinas, moléculas responsáveis pela adesão célula-a-célula dependente de cálcio,
e é componente dos filamentos extracelulares que controlam a morfogênese e função dos estereocílios das células
mecano-sensórias do ouvido interno. Com o objetivo de identificar a mutação, 41 éxons do gene Pcdh15, incluindo
regiões intrônicas flaqueadoras, foram sequenciados, e uma transição AT-para-GC foi encontrada no íntron 25.
Três camundongos rodador foram sequenciados e todos apresentaram a mesma alteração quando comparados
com o animal controle da linhagem parental BALB/c. Com o intuito de excluir a possibilidade de a alteração ser um
polimorfismo entre linhagens, camundongos C57BL/6, DBA e NZB foram sequenciados e todos apresentaram uma
Adenina na posição em questão. Uma vez que a alteração observada levou a uma troca de um dinucleotídeo ApA para
ApG em uma posição próxima ao sítio aceptor de splicing, nossa hipótese é que pode ter sido criado um sítio críptico
de splicing mais forte dentro do íntron, que estaria levando à incorporação de 8 bases da região intrônica no mRNA.
Como resultado, a matriz de leitura seria alterada e o aparecimento de um códon de parada prematuro produziria
uma proteína truncada. Duas evidências suportam esta hipótese: 1) aproximadamente 80% das mutações causadas
por ENU conhecidas são transições AT-para-GC ou transversões AT-para-TA; e 2) 26% das mutações induzidas por
ENU causam splicing anormal. Com o intuito de validar esta alteração serão realizados testes de PCR em tempo
real para avaliar os níveis de expressão de Pcdh15 para camundongos controle e mutantes, e será sequenciada
a porção do cDNA que compreende a junção dos éxons 25 e 26, para verificar se houve a incorporação de bases
intrônicas. Primers específicos já foram desenhados, amostras de RNA coletadas do ouvido interno e moléculas de
cDNA confeccionadas. No homem, mutações no gene PCDH15 causam perda auditiva e Síndrome de Usher tipo 1F
(USH1F). A validação desta mutação tornará o camundongo rodador um bom modelo para a doença, permitindo
estudos dos mecanismos envolvidos na mecanotransdução, na função auditiva e no desenvolvimento da síndrome.
Apoio financeiro: CAPES/FAPESP e FAPEMIG - Brasil e Institut Pasteur - França
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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29
Alterações no gene CSRP3 em Cardiomiopatia
Dilatada e Hipertrófica
Santos, DGB1; Mill, JG2; Mansur, AJ1; Krieger, JE1; Pereira, AC1
Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology, Heart Institute (InCor), Sao Paulo University Medical School, Sao Paulo, Brazil
Department of Physiology, Federal University of Espirito Santo, Vitoria, Brazil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cardiomiopatia Dilata, Cardiomiopatia Hipertrófica, CSRP3
A Cardiomiopatia Hipertófica (CH) e Dilatada (CD) causam insuficiência cardíaca severa e morte súbita.
Descobertas recentes demonstraram que mutações em um mesmo gene podem levar ao desenvolvimento de
ambas as doenças. Diversos genes foram causalmente relacionados a pelo menos um dos fenótipos, incluindo
genes codificantes para proteínas contráteis, componentes do disco-Z e regulação do cálcio intracelular. O gene
CSRP3 foi descoberto como um importante gene estrutural pertencente ao disco-Z estando envolvido com a
miogênese e montagem do sarcômero, além de ser parte da maquinaria sensitiva do estresse em cardiomiócitos.
Até hoje, apenas sete mutações foram descritas no gene em pacientes com CH, e uma em um paciente com CD
associada com fibroelastose do endocárdio, além disso, há descrita a associação do polimorfismo rs45550635 com
ambas as doenças, contudo, com resultados contraditórios. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi
investigar a relação do gene CSRP3 com CD e CH em pacientes do Incor – Hospital das Clínicas da Universidade
de São Paulo. As amostras de DNA de 190 pacientes com CD, 116 com CH e de 525 indivíduos da população
controle foram obtidas pela técnica de extração por sal, em seguida foram realizadas técnicas básicas de biologia
molecular para padrozinação da PCR e sequenciamento direto no equipamento ABI 3500xL (Applied Biosystems,
CA – USA). Nos pacientes com CH foi identificado somente o polimorfismo no éxon 2 em um paciente, a alteração
leva à substituição p.Trp4Arg. Nos pacientes com CD foram identificadas 4 alterações: uma no éxon 6, p.Gly182Arg
(predita computacionalmente como não afetando a função da proteína e encontrada em um indivíduo de 288
da população controle); duas alterações no exón 3 em um mesmo indivíduo, sendo que somente uma levava a
mudança de aminoácido p.Thr47Met (esta alteração se encontra na região do domínio LIM da proteína onde estão
descritas as 8 outras mutações do gene). Esta última alteração é predita como afetando a função da proteína e não
foi encontrada em 288 indivíduos da população controle; a última alteração é o mesmo polimorfismo no éxon
2 encontrado em um paciente com CH e que também foi encontrado em três indivíduos de 525 da população
controle. Conclusão: Há relação de alterações no gene csrp3 com o desenvolvimento da doença em pacientes com
Cardiomiopatia Dilatada. Não encontramos evidência de que o polimorfismo rs45550635 está associado a um
maior risco de miocardiopatia estrutural em nossa população.
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Mutação no loci DYS391 do cromossomo Y identificada
em amostra de mesma linhagem masculina
Ramos, AT3; Brasil, SMV1; Cavalcanti, IA1; Rocha, TCL1; Sobreira, ACM1; Silva, SC2 ; Ceccato, VM3
Laboratório de DNA Forense do Estado do Ceará, Perícia Forense do Ceará
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Estadual do Ceará
3
Laboratório de Bioquímica e Cultura de Células, Universidade Estadual do Ceará
1
2
Palavras-chave: cromossomo sexual Y, linhagem patrilinea, mutação, crime sexual, perfil genetico
O processo de herança do cromossomo sexual Y, está presente apenas em indivíduos do sexo masculino ocorrendo
de pai para filho. A obtenção de perfis coincidentes nos marcadores do cromossomo Y indicam mesma origem ou
mesma linhagem patrilínea, com isso, os alelos encontrados no pai deverão ser encontrados de forma idêntica nos
filhos do sexo masculino podendo ser alterados apenas com a ocorrência de algum tipo de mutação. Alguns casos
de mutação ocorrem durante o percurso da DNA polimerase na leitura da seqüência de DNA, isso pode explicar a
diferença em alelos entre as linhagens patrilíneas. Foi encaminhado ao laboratório de DNA Forense do Estado do
Ceará material proveniente de aborto ( feto) coletado de uma vítima de estupro. O objetivo pericial foi investigar
a ocorrência de um possível crime sexual praticado dentro de uma mesma família, por meio de comparações
dos perfis genéticos do pai (principal suspeito), irmão da vítima e feto abortado estabelecendo eventual relação
de vínculo genético. As amostras referência foram coletadas com uso de swab bucal, enquanto que a amostra
questionada ( feto) foi obtida a partir do tecido cardíaco. Após a colheita das amostras iniciou-se o processo de
extração de DNA. A extração tanto da amostra questionada como da amostra referência foi realizada pelo método
de resina de troca iônica Chelex (Coombs, 2003). A amplificação ocorreu por meio de PCR ( Polimerase Chain
Reaction) com o emprego do sistema Identifiler (16 loci analisados) e AmpFlSTR Yfiler (16 loci analisados). A leitura
das genotipagens realizou-se através do seqüenciador automático ABI 3130 da Applied Biosystems. Dentre os
dados obtidos após a genotipagem foi observado um perfil de Y coincidente entre o irmão da vítima e o feto em
todos os loci analisados. Contudo, quando confrontado o perfil do irmão da vítima com o seu pai, herança paterna
conhecida, notou-se a presença de uma mutação no loci DYS391 sendo esta mesma mutação encontrada no perfil
do feto. Por se tratar de uma região do DNA nuclear o cromossomo Y possui um sistema que auxilia na reparação
de mutações ao acaso. O alto grau de divisões o qual está submetido o cromossomo Y pode interferir diretamente
no controle desta mutação e esta ser repassada para a prole. No caso em questão essa mutação teve bastante valia
na elucidação desse caso de crime sexual, pois devido a sua identificação pode-se constatar a paternidade direta
sendo do irmão da vítima, eliminando assim a premissa inicial da suposta paternidade do principal suspeito.
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HPV 16/18, polimorfismo genético DNMT3B e status da
metilação P16CDKN2A em Leucoplasia oral
Barros, LO1; Oliveira, ES1; Fonseca-Silva, T1; Oliveira, MVM1; Fraga, CAC1; De-Paula, AMB12; Guimarães, ALS12
Laboratório de Pesquisa em Saúde, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual de Montes Claros
Departamento de Odontologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual de Montes Claros.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNMT3B; polimorfismo; p16CDKN2A; metilação; câncer de cabeça e pescoço.
Introdução: Uma vez que evidências sugerem um possível papel da metilação no desenvolvimento do câncer bucal,
um número crescente de estudos por meio de análises de metilação foram publicados. Recentemente,trabalhos
evidenciaram a possibilidade dos HPV de alto risco alterarem a regulação epigenética do hospedeiro,
especificamente no status de metilação do gene p16CDKN2A. Objetivos: Investigar se a infecção pelo HPV
16/18 poderia interferir na expressão de DNMTs, alterar status de metilação p16CDKN2A e reduzir a expressão
de P16CDKN2A em lesões pré-malignas. Além disso, investigar se o polimorfismo genético DNMT3b (C46359T)
pode interferir nesse mecanismo. Métodos: Um estudo caso-controle foi realizado com 104 pacientes divididos
em três grupos: mucosa normal, a Leucoplasia (OL) e Líquen plano oral (OLP). Resultados: A presença de HPV
16 e / ou 18 e metilação p16CDKN2A foram associados com Leucoplasia oral, mas não teve impacto sobre a
expressão imunohistoquímica da DNMT1, DNMT3B e P16CDKN2A. Por outro lado, OLP foi associado com
o alelo T do DNMT3D (C46359T) polimorfismo. Apenas DNMT1 e expressão DNMT3B foram associadas com
maior pontuação de displasia epitelial. Conclusões: Embora nem a infecção pelo HPV 16/18 nem o polimorfismo
DNMT3B (C46359T) pode interferir na expressão de DNMTs, HPV 16 ou 18 e metilação p16CDKN2A foram
associados à OL duradoura, o alelo T do polimorfismo DNMT3b (C46359T) foi fortemente associada com OLP.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG.
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Efeito do Polimorfismo Ala16Val do gene da enzima
superóxido dismutase dependente de manganês
(SOD2) na modulação de biomarcadores oxidativos
inflamatórios e sua interação com sobrepeso/obesidade
Montano, MAE1; Cadoná, FC2; Flôres, ERS2; Duarte, MMMF3; Duarte, T4; Lera, JPB1; Moresco, RN4; Rocha,
MIUMR2; Cruz, IBM2
Programa de Doutorado em Biomedicina, Universidade de Leon, Espanha
Laboratório de Biogenômica. Departamento de Morfologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria-RS
3
Universidade Luterana do Brasil
4
Departamento de Morfologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria-RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Polimorfismo, SOD, Ala16Val, sobrepeso, oxidativo-inflamatório.
Introdução: considera-se que a obesidade está relacionada com alterações no metabolismo oxidativo-inflamatório.
Até pouco tempo acreditava-se que tais alteracoes seriam apenas consequencia das alterações metabólicas
presentes nos obesos. Entretanto, estudos prévios conduzidos pela nossa equipe de pesquisa em 815 idosos
sugeriram que alterações genéticas no metabolismo oxidativo poderiam contribuir para a obesogênese. O estudo
avaliou as freqüências genéticas do polimorfismo Ala16Val do gene a enzima SOD2 e observou associação entre
o genótipo VV e obesidade. Entretanto, estudos complementares sobre o possível papel deste polimorfismo em
marcadores oxidativo-inflamatórios relacionados a obesogênese precisam ser conduzidos. Objetivos: avaliar
associação entre o polimorfismo Ala16Val-SOD2 e níveis marcadores de marcadores sorológicos oxidativoinflamatórios em adultos jovens saudáveis averiguando a possível influencia do sobrepeso/obesidade.
Metodologia: estudo-controle (Índice de Massa Corporal (IMC) < 25 kg/m2= controle, IMC> 25 kg/m2= sobrepeso/
obesidade) que incluiu120 adultos jovens universitários, caucasianos, sem parentesco, sem morbidades crônicas
não-transmissíveis genotipados para o polimorfismo Ala16Val-SOD2 (PCR-RFLP). Os níveis de marcadores
sangüíneos oxidativo-inflamatórios em jejum foram analisados e comparados: Resultados: portadores controle
com pelo menos um alelo V apresentaram níveis elevados de colesterol, LDL-colesterol, proteína C reativa,
LDL-oxidado, anti-LDL oxidado do que portadores do genótipo AA. Nos obesos portadores de pelo menos
um alelo V observou-se níveis elevados de colesterol, LDL-colesterol, triglicerídeos e anticorpo anti-LDL do
que obesos-AA. Conclusão: os resultados sugerem que fatores genéticos associados ao metabolismo oxidativo
influenciam a modulação de marcadores oxidativo-inflamatórios associados a obesidade em adultos jovens
saudáveis corroborando a hipótese de que o estresse oxidativo pode ser um fator causal não besogênese.
Apoio Financeiro: FAPERGS.
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Avaliação in vitro dos efeitos citotóxicos da droga
antimalárica artesunato em linhagem celular de
neoplasia gástrica (PG100)
Correa, RMS1; Alcântara, DFA; Nascimento, HFS1; Burbano, RR1; Bahia, MO1
Laboratório de Citogenética Humana,Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Antimalárico, Artemisininas, Artesunato, Citotoxicidade, MTT
Introdução: O Artesunato é um derivado da artemisinina, que é o principal componente ativo da erva chinesa
Artemisia annua L.O artesunato é reconhecido por possuir atividade antimalárica, além disto, outtros estudos
demonstram que esta substância possui efeito citotóxico em células de câncer, incluindo leucemia, câncer
de cólon e melanoma. Dentre os diferentes tipos de câncer que afetam o homem, o câncer gástrico é um dos
mais freqüentes no mundo. Apesar da diminuição de sua incidência nos países desenvolvidos do Hemisfério
Norte, o câncer gástrico ainda é neoplasia maligna freqüente em países em desenvolvimento. Em 2008, o câncer
de estômago foi o terceiro em incidência entre homens e o quinto entre as mulheres no Brasil. Objetivos: Este
trabalho visa avaliar in vitro os possíveis efeitos citotóxicos do Artesunato, em cultura de linhagem celular de
neoplasia gástrica (PG100). Métodos: Para os testes de sobrevivência celular, as células foram expostas a
diferentes concentrações do Artesunato (1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0; 32,0; 64,0; 128,0 µg/ml) por 24 horas. Ao final
do tratamento, foi realizado o teste bioquímico MTT, sendo os resultados obtidos por espectrofotometria
(densidade óptica=DO). Resultados: O teste MTT mostrou uma diminuição na sobrevivência celular a partir
da concentração de 32µg/ml de Artesunato, sendo esta redução estatisticamente significativa (p<0,05) na
concentração de 128,0 µg/ml (DO=0,1), quando comparada ao controle (DO=0,4). Conclusão: O Artesunato
demonstrou um efeito citotóxico na linhagem celular PG100 em nossas condições experimentais. Estudos de
indução de apoptose estão em curso para uma melhor caracterização da morte celular induzida pelo Artesunato.
Apoio Financeiro: UFPa/CNPq/CAPES
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Toxicogenetic late effects of antineoplastic therapies
for lymphomas
Marcondes, JPC1; Torres, BP1; Niéro-Melo, L2; Gaiolla, RD2; Luisi, FAV3; Salvadori, DMF1.
Department of Pathology, Botucatu Medical School, UNESP
Department of Internal Medicine, Botucatu Medical School, UNESP
3
Pediatric Oncology Institute, GRAACC, UNIFESP.
1
2
Keywords: toxicogenetic, DNA damage, antineoplastic therapies, late effects, lymphoma
Introduction: The treatment of patients with Hodgkin’s Disease and Non-Hodgkin Lymphoma is based on
polychemotherapy associated or not with radiotherapy. Although the patients diagnosed with lymphomas
have a high cure rate (about 85%), these therapies can induce gene and chromosomal mutations, increasing
the risk for development of second malignancies and other degenerative diseases related to DNA damage.
Objectives: The aim of this study was to evaluate the late effect of antineoplastic treatment on lymphocytes
DNA from 25 patients diagnosed with lymphoma, and who finished chemotherapy for at least two years (posttherapy group). A total of 15 healthy subjects with no history of radio or chemotherapy were used as controls.
Methods: A volume of 4 mL of peripheral blood was collected from each subject by venipuncture; lymphocytes
were isolated by Ficoll gradient method and processed by the comet assay. The slides were stained with
SYBR Gold (at 1:10.000 dilution) and analyzed at 400X magnification under an epifluorescence microscope
connected to an imaging analysis system (Comet Assay IV - Perceptive Instruments). Results: No differences
in the levels of DNA damage were detected between lymphoma post-therapy patients and controls. Similarly,
no difference was also observed between both groups when lymphocytes were in vitro exposed to hydrogen
peroxide. Therefore, there was no difference in the DNA repair capability. Conclusions: It was not observed
any toxicogenetic effect of chemotherapy in lymphoma patients who finished treatment for at least two years.
Supported by FAPESP and CNPq.
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35
Genotoxicidade de material magnético desenvolvido
para o tratamento do câncer
Campos da Paz, M; Romez, CC; Matos, BN; Almeida Santos, MFM; Lacava, ZGM
Departamento de Genética e Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, 70910-900 Brasília, DF, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: Magnetolipossomas, Nanopartículas Magnéticas, Maghemita, Genotoxicidade, Câncer
Introdução: Materiais baseados em nanopartículas magnéticas tem despertado crescente interesse na área
biomédica, pois podem ser utilizados como carreadores de drogas e no tratamento de diversas patologias,
principalmente o câncer. Para que possam ser utilizados com fins terapêuticos, entretanto, faz-se necessária a
avaliação preliminar da sua toxicidade. Em consonância, este trabalho teve como objetivo avaliar efeitos in vitro
de magnetolipossomas catiônicos - lipossomas contendo nanopartículas magnéticas à base de maghemita
funcionalizadas com fosfato (ML-F). Metodologia: Células de adenocarcinoma mamário de camundongo (4T1)
foram cultivadas por 48 horas na presença de diferentes concentrações de ML-F para a determinação, por meio
do ensaio de MTT (3 (4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), da concentração que mata 50%
das células (CL50). Para os testes de genotoxicidade e citotoxicidade, as células foram submetidas ao ML-F nas
concentrações de 0,9 × 109 e 1,8 × 109 nanopartículas/µL de meio de cultura, que correspondem a 40 e 80% da
CL50 (2,257 × 109 nanopartículas/µL de meio de cultura). Após 48 horas de cultivo, as células foram avaliadas por
meio do ensaio cometa e do ensaio de coloração com brometo de etídio e alaranjado de acridina. Além disso,
foi realizada a análise morfológica dessas células ao microscópio de luz. Resultados: O ensaio cometa mostrou
que as células tratadas com ML-F nas concentrações 40 e 80% da CL50 apresentaram, respectivamente, 77 e 64,5
% do DNA fragmentado, enquanto que as células sem tratamento apresentaram 20% do DNA fragmentado. As
duas concentrações de ML-F utilizadas foram citotóxicas, induzindo morte das células 4T1 por apoptose. Essa
citotoxicidade também foi observada na análise morfológica. Ao microscópio de luz, as células, quando cultivadas
com ML-F, apresentaram redução do volume citoplasmático e condensação aumentada da cromatina. Além
disso, foi observado aumento na frequência de células gigantes, especialmente na maior concentração estudada.
Conclusão: Nas condições experimentais testadas, a amostra ML-F foi genotóxica e citotóxica para células 4T1.
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Expressão dos genes MYC e FBXW7 em linhagem
celular de adenocarcinoma gástrico (PG100) exposta
ao medicamento homeopático
Ribeiro, HF¹; Calcagno, DQ²; Alcântara, DFA¹; Melazzo, NMM¹,³; Smith, MAC², Burbano, RR¹; Bahia, MO¹
¹Laboratório de Citogenética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém – PA
²Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo – SP
³Escola Superior da Amazônia, Belém – PA
[email protected]
Palavras-chave: Câncer gástrico, MYC, FBXW7, expressão gênica.
O Canova (CA) é um medicamento imunomodulador homeopático que tem apresentado atividade antimutagênica
tanto in vivo quanto in vitro, além de ser empregado no tratamento de câncer. O câncer gástrico, apesar de ter
apresentado um declínio em mortalidade e incidência a partir da década de 50 ainda é o segundo maior responsável
pela mortalidade causada por neoplasias. Uma das principais alterações genéticas em carcinomas gástricos é a
desregulação da expressão do gene MYC, um importante regulador da proliferação, diferenciação, crescimento
celular e do processo apoptose. A desregulação deste gene está associada ao aumento da instabilidade genômica,
contribuindo para o processo de transformação maligna. MYC é regulado negativamente pelo produto do gene
FBXW7, um supressor tumoral haploinsuficiente, membro família das ubiquitinases, que encaminha MYC e
outros genes, para degradação proteolítica. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a quantificação relativa
da expressão dos genes MYC e FBXW7 por PCR em tempo real na linhagem celular de adenocarcinoma gástrico
PG100 em resposta ao tratamento com CA. As células foram separadas em quatro grupos de tratamento, que
durou 24 horas, e os experimentos foram realizados em triplicata biológica. Os grupos foram: sem tratamento
(controle negativo), CA a 25% no meio de cultura, Doxorrubicina na concentração de 0,0173 µg/µl (controle
positivo) e uma combinação de Doxorrubicina a 0,0173 µg/µl e CA a 25% no meio de cultura. Na quantificação
da expressão relativa em PCR em tempo real através do sistema TaqmanTM, utilizamos o cDNA da amostra sem
tratamento como calibrador e os genes RN18S1 (subunidade 18S do ribossomo) e ACTB (beta-actina) como
controles endógenos. Observamos uma diminuição da expressão de MYC no grupo tratado com CA e no grupo
tratado com a associação de CA+Doxorrubicina, sendo este último de forma menos pronunciada do que no
grupo tratado apenas com CA. As células tratadas apenas com doxorrubicina não apresentaram alterações na
expressão de MYC. A expressão do gene FBXW7 não apresentou alteração significante entre os grupos estudados.
Desta forma, concluímos com este estudo que o medicamento homeopático CA age como modulador da
expressão do gene MYC demonstrando a efetividade do uso deste fármaco no tratamento do câncer de estômago.
Suporte financeiro: CAPES e CNPq.
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The compound cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III)
chloride induces caspase-mediated apoptosis in K562 cells
Aliny Pereira de Limaa, Flávia de Castro Pereiraa, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa,
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiroa and Elisângela de Paula Silveira Lacerdaa*
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética - Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
[email protected]
[email protected]*
a
Keywords: Apoptosis; cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride; Cytotoxicity; K-562; MRC-5.
Current inorganic drugs such cisplatin and related compounds widely used in the treatment cancer, however its
application is limited by its severe toxicity and drug resistance. These limitations have prompted a search for news
metal-based antitumor agents. Ruthenium(III) complexes are increasingly attracting the interest of researchers
due to their promising pharmacological properties. In the present study, was investigated in vitro the effects of
the cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride compound on cell viability, distribution cell cycle phases and
mechanisms of induce apoptosis on K-562 leukemia cells. The MTT tetrazolium reduction test and the trypan blue
exclusion assay revealed that the IC50 (compound concentration (µM) that produces a 50 % reduction in cellular
viability) after 48 h of incubation with K562 cells was approximately 10.74 and 73.45 µM, respectively. Interestingly, it
was observed that this compound exhibits mild cytotoxicity towards MRC-5 human fibroblast cells (IC50 > 383 µM).
Flow cytometric analysis revealed that cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride was capable of change cell
cycle distribution since the percentage of cells in the G1, S and G2 phases decreased. In addition, treatment with
this compound induced apoptotic cell death in K562 cells, demonstrated by increased DNA content in the sub-G1
peak and a significant increase in caspase-3 activity. In summary, cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride
displayed a significant anti-tumor effect through cell cycle arrest and apoptotic induction in K562 cells, which
suggests that cis-(dichloro)tetrammine ruthenium(III) chloride might have therapeutic potential against leukemia.
Financial support: CNPq, FINEP
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DNA damage and apoptosis induced by nonylphenol in
human mesangial cells
Romez, CC1; Campos-da-Paz, M1; Dias, ABA1; Dorea, JG2; Grisolia, CK1; Almeida Santos, MFM 1*
Departamento de Genética e Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, 70910-900 Brasília, DF, Brasil.
Departamento de Nutrição, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, 70910-900 Brasília, DF, Brasil.
[email protected]
1
2
Key words: endocrine disruptors, nonylphenol, comet assay, apoptosis, necrosis.
Nonylphenol ethoxylate is widely used in industrial products and after environmental discharge it is found
in aquatic environments. Because it’s estrogenic-like effect is considered an endocrine disruptor. In the
environment it breaks down to 4-nonylphenol (NP), which is more stable and persistent. Despite environmental
concerns, little research has been conduct to evaluate its genotoxicity on human cells. In vitro cell viability
(lethal concentration - LC) was evaluated using 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
(MTT). Genotoxicity of NP was tested in human mesangial cells using comet assay while cell morphology was
evaluated by light microscopy and ability of to induce apoptosis and necrosis was assessed by the acridine
orange/ethidium bromide fluorescent-dyeing test. On the basis of the MTT assay the LC50 values were estimated
as 0.7 x 10-4 µl/ml and nonylphenol at concentration over than 0.5 x 10¬3 µl/ml caused 78% cellular death.
Thus, the concentrations of nonylphenol used for genotoxicity test were 0.28 x 10-3 µl/ml and 0.56 x 10-3 µl/ml,
which means 40 e 80% of the LC50 respectively. The comet assay showed that untreated cells had 1.32% of DNA
damage while cells NP treated showed DNA damage ranging from 61.27% and 55.19% in response to tested
concentration. No differential morphological changes were observed in cells exposed to different concentrations
of nonylphenol. Acridine orange/ethidium bromide fluorescent-dyeing test demonstrate that nonylphenol
induce cell death meanly by apoptosis. This data revealed the genotoxicity of nonylphenol to in vitro test-system.
Apoio Financeiro: CNPq e FINATEC.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Ação dos compostos L3 e LNO3 na citotoxicidade,
genotoxicidade e indução de apoptose in vitro
da Silva, PBG1;Zanelatto, LC1; Fátima, A2; Mantovani, MS1
Laboratório de Genética Toxicológica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina
Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Talidomida, Óxido Nítrico, L3, LNO3, Micronúcleo, Apoptose, Citotoxicidade.
A talidomida foi relatada em 1953 como agente antiemético e sedativo, porém logo foi suspendido pelo seu efeito
teratogênico. Alguns anos após sua proibição, foram descobertas novas ações do medicamento tais como o uso no
tratamento de lepromas, infecção pelo HIV, doenças auto-imunes e câncer. As moléculas orgânicas e inorgânicas
e os átomos que contêm elétrons não pareados são classificados como radicais livres. Essa configuração faz dos
radicais livres moléculas altamente instáveis e quimicamente muito reativas. O radical óxido nítrico (NO•) participa
de uma variedade de funções regulatórias no organismo como nas respostas anti-patogênicas e anti-tumoral do
sistema imune. O NO• também pode agir como agente deletério em diversas condições fisiopatológicas incluindo o
câncer. Alguns relatos sugerem que o NO• possui atividade anti-tumoral e outros implicam em promoção do tumor.
Os compostos L3 e LNO3 são sintéticos, análogos a talidomida, pertencentes à família de compostos que possuem o
núcleo isoindolina 1,3-diona sendo que o LNO3 é estruturalmente capaz de liberar NO• por possuir ainda um radical
NO3 em sua estrutura. No presente trabalho foram analisadas a citotoxicidade pelo ensaio de MTT, indução de
apoptose e de formação de micronúcleo na presença dos compostos L3 e LNO3 em cultura de células de hepatoma
de rato (HTC). Para o ensaio MTT, os compostos foram testados em três tempos de tratamento: 24, 48 e 72 horas e
em quatro concentrações: 50μg/mL, 100μg/mL, 250μg/mL e 500μg/mL. No ensaio de indução de apoptose foram
testados em 24 horas três concentrações: 125μg/mL, 250μg/mL e 500μg/mL. Para o ensaio de micronúcleo, as
células foram tratadas por 26 horas nas concentrações de 125μg/mL, 250μg/mL e 500μg/mL, e como controle
positivo foi utilizado Benzo[a]pireno 25µg/mL. O composto L3 foi citotóxico no MTT apenas na concentração
de 500μg/mL em 72 horas enquanto que o composto LNO3 apresentou citotoxicidade a partir de 250μg/mL nos
três tempos testados. Ambos os compostos foram indutores de apoptose em todas as concentrações testadas,
no entanto, na concentração de 500μg/mL, o LNO3 apresentou maior número de células apoptóticas. O teste de
micronúcleo demonstra que ambos os compostos apresentaram efeito genotóxico nas concentrações de 250μg/
mL e 500μg/mL Os resultados sugerem que os compostos L3 e LNO3 possuem efeitos citotóxicos e genotóxicos
em células HTC, além de serem capazes de induzir apoptose sendo que a maior citotoxidade e apoptose
apresentada pelo LNO3 em relação ao L3 provavelmente é causada pelo radical NO3 presente neste composto.
Apoio Financeiro: CNPq, Fundação Araucária, CAPES.
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Efeito da procianidina B2 na fragmentação do
DNA e inibição do crescimento de linhagem de
adenocarcinoma mamário humano
Avelar, MM; Gouvêa, CMCP
Laboratório de Cultura de Células, Instituto de Ciências da Natureza, Universidade Federal de Alfenas, Minas Gerais.
[email protected]
Palavras-chave: Tumor mamário, barbatimão, lesão de DNA, cultura de células, células MCF-7
O câncer de mama é o mais frequente entre as mulheres. O tratamento preconizado pela OMS à paciente com câncer
de mama baseia-se na quimioterapia. A ciclofosfamida (CP), utilizada no tratamento do câncer de mama como neoadjuvante e adjuvante, é alquilante do DNA. Entretanto, a efetividade terapêutica é limitada por sua alta toxicidade
hematopoética, renal e cardíaca. Assim, é importante a prospecção de novas substâncias que possam contribuir
para o controle desta enfermidade. Estudos prévios do laboratório demonstraram que a fração aquosa obtida, a
partir do extrato acetônico de folhas de barbatimão [Stryphnodendron adstringens (Martius), Coville, Mimosaceae],
foi citotóxica para células de adenocarcinoma humano em cultura, MCF-7. A fração era composta, principalmente,
por procianidina B2 (principal componente). O objetivo do presente trabalho foi verificar se a procianidina B2 induz
a fragmentação do DNA e apresenta atividade antiproliferativa para células de adenocarcinoma mamário, MCF-7.
As células (2x104 cel/mL), provenientes do Banco de Células do Rio de Janeiro, foram cultivadas em meio RPMI,
20% de soro fetal bovino e antibióticos, em placas de 96 poços, para a extração de DNA e análise da proliferação
celular. As células foram incubadas por 24 e 48 h com procianidina B2 (Sigma) em diferentes concentrações (0,5;
1,0; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 mM). Decorrido o tempo o DNA foi extraído utilizando-se fenol:clorofórmio e analisado por
eletroforese em gel de agarose a 1%. Para avaliar a proliferação celular foi realizado o teste da sulforrodamina B (SRB).
Os resultados demonstraram que o tratamento das células com a procianidina B2 não induziu a fragmentação do
DNA, com padrão de clivagem internucleossômica. Isto pode ter ocorrido porque estas células apresentam mutação
no gene CASP3 e a expressão de caspase 3 ativa é importante para a clivagem internucleossômica do DNA. O ensaio
de SRB demonstrou diminuição significativa (p<0,001) do crescimento das células tratadas com procianidina B2,
em comparação ao controle. A inibição (%) obtida para as diferentes concentrações de procianidina B2 foi: 17,97
± 2,94; 14,73 ±1,21; 15,41 ± 0,60; 27,24 ± 2,11; 64,39 ± 3,07; 53,11 ± 5,50 respectivamente. Os resultados permitem
concluir que a procianidina B2 inibiu a proliferação de células MCF-7 (efeito dependente da concentração) e não
induziu a fragmentação do DNA, provavelmente porque as células MCF-7 apresentam mutação no gene CASP3.
Agradecimentos: FAPEMIG, PROBIC-UNIFAL, PET-MEC-SESU.
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Estudo da amplificação do gene MYC em linhagens
celulares de câncer gástrico
Albuquerque, CI1; Bona, AB1; Calcagno, DQ1; Leal, MF²; Smith, MAC²; Burbano, RR1
Laboratório de Citogenética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
²Disciplina de Genética, Universidade Federal de São Paulo.
[email protected]
1
Palavras–chave: MYC, câncer gástrico, amplificação, RT - PCR
O câncer gástrico é o terceiro tumor maligno mais frequente no mundo. Sendo caracterizado pelo acúmulo
de alterações que favorecem a expressão de genes vinculados ao controle do ciclo celular. Dentre estes, se
destacam o gene C-MYC e o complexo SFC (SKP1-cullin-F-box). A super expressão do gene MYC é uma alteração
frequentemente descrita em casos de câncer gástrico humano, e tem grande importância no controle do
crescimento celular, diferenciação, apoptose e transformação neoplásica. Por sua vez, o complexo SCFFBXW7 induz
a degradação de reguladores positivos do ciclo celular incluindo as proteínas ciclina E, MYC, c-Jun e Notch. Em
neoplasias gástricas, a expressão da proteína MYC pode se tornar alta pela diminuição da expressão da subunidade
protéica FBXW7. Assim, a quantificação relativa da expressão do gene FBXW7 pode ser utilizada para esclarecer
alterações da expressão do gene MYC. A caracterização de linhagens celulares é importante para a compreensão da
biologia das células neoplásicas e para o desenvolvimento de novas estratégias contra a progressão de neoplasias.
Alterações encontradas na linhagem ACP01 corroboraram com achados do nosso grupo de pesquisa em amostras
de tumores gástricos primários, nos quais todas as amostras apresentavam trissomia do cromossomo 8 e
amplificação do gene MYC. Dessa forma, para o desenvolvimento de uma possível terapia, o estudo do perfil da
expressão deste gene em linhagens obtidas de tumores gástricos, pode ser de grande valia. Assim, tivemos como
objetivo analisar a expressão do gene MYC em linhagens de câncer gástrico, utilizando o método de RT-PCR em
tempo real, enfocando a relação entre as proteínas MYC, FBXW7 e o câncer gástrico. Para esta análise foi feita
a extração e purificação de RNA, posteriormente utilizou-se o termociclador em tempo real (AB 7500, Applied
Biosystems®, USA), com o monitoramento contínuo através do sistema Taqman, o nível de amplificação gênica
foi calculado segundo Bièche et al. (1998). Foram analisadas três linhagens celulares neoplásicas desenvolvidas
pelo nosso grupo de pesquisa (ACP02, ACP03 e AGP01) e a linhagem celular PG100 adquirida no Banco de
células do Rio de Janeiro. Como parâmetro de comparação, utilizamos uma linhagem de células de mucosa
gástrica normal (MNP01). O gene MYC apresentou-se amplificado nas quatro linhagens celulares tumorais em
comparação à linhagem MNP01. Em ordem decrescente de amplificação gênica encontramos as linhagens:
ACP02, PG100, ACP03 e AGP01. A linhagem ACP02 apresentou o mais alto índice de expressão do gene MYC,
revelando menor quantidade de RNAm expresso pelo gene FBXW7. Por outro lado a linhagem de células normais
MNP01 foi a que apresentou menor quantidade de RNAm de MYC e a que mais expressou o gene FBXW7.Nossos
resultados reforçam a hipótese de que a proteína oncogênica MYC é regulada negativamente pelo gene FBXW7.
Apoio financeiro: CNPq, processo 550885/2007-2
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Sequenciamento e Análise de Mutações no gene
MYLK4 em linhagens de carcinoma da mama
Henrique, BVM1,2; Almeida, RSS1; Andrade, RV3; Pittella Silva, F.1,2
Laboratório de Farmacologia Molecular, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília
Faculdade de Ceilândia, Universidade de Brasília
3
Universidade Católica de Brasília. Brasília, Distrito Federal, Brasil.
1
2
Palavras-chave: câncer de mama; mutação; seqüenciamento; MYLK4.
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Mutações
em genes envolvidos na proliferação e diferenciação celular, reparo de DNA, controle do ciclo celular e apoptose
estão diretamente relacionados com o surgimento e a progressão de diversos tipos de tumores. Essas mutações
podem alterar a função do gene, inativando-o ou conferindo à célula tumoral um crescimento desordenado. Isso
evidencia a importância na identificação de novas mutações gênicas potencialmente envolvidas no surgimento e
na progressão do câncer. O gene MYLK4 (Myosin Light Chain Kinase member 4 – RefSeq. NM_001012418) localizado
no cromossomo 6 (6p25.2) ocupa uma região de aproximadamente 87,284 pares de bases e possui 11 regiões
exônicas. O mRNA de aproximadamente 1477 bases codifica uma proteína de 388 aminoácidos, aproximadamente
44kDa, que constitui uma quinase putativa com um domínio catalítico de quinase serina/treonina. Em trabalho
recente, Wood, et al. identificaram, através do seqüenciamento genômico de linhagens cancerígenas, genes com
alta probabilidade de mutação em câncer de mama e colo-retal. Essa análise gerou uma classificação denominada
CaMP (Cancer Mutation Prevalence) score, que reflete a probabilidade de um número de mutações observadas em
um gene ser maior do que o esperado, considerando os efeitos dessas mutações na proteína codificada pelo gene e
a participação desse gene em vias de sinalização e processos regulatórios. No ranking dos 280 genes classificados
no CaMP score o MYLK4 foi o 7º mais relevante, ficando a frente de alguns genes conhecidos como o BRCA1.
Por convenção, genes com CaMP score maior que 1 foram considerados CAN genes. Bardelli, et al. identificaram
mutações em possíveis CAN genes em glioblastoma, melanoma e em câncer de pâncreas, incluindo o gene MYLK4,
mas nenhuma mutação foi encontrada nesse. Tais resultados sugerem que o MYLK4 tem uma frequência de mutação
maior em câncer de mama do que em outros tipos de tumores. Além disso, foram descritas seis mutações em outro
gene da família do MYLK4, o MYLK2 (Myosin Light Chain Kinase member 2) em linhagens de câncer colo-retal, sendo
que dessas seis mutações, duas foram encontradas no domínio serina/treonina quinase da proteína. Nesse trabalho
seqüenciamos as 11 regiões exônicas do gene MYLK4 em 8 linhagens de carcinoma mamário e 1 linhagem normal
e identificamos mutações em regiões já descritas e novas mutações em linhagens não descritas. Nosso resultado
corrobora o trabalho de Wood, et al. confirmando a prevalência de mutações no gene MYLK4 em carcinoma mamário.
Este resultado indica a necessidade futura de caracterização funcional do gene e correlação entre as mutações
identificadas com as alterações funcionais geradas na proteína MYLK4 e o seu papel na carcinogênese da mama.
Apoio financeiro: CNPq, UnB, FINATEC.
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Avaliação do Índice de Divisão Celular e da frequência
de micronúcleos em sangue periférico de mulheres
com câncer de mama não submetidas ao tratamento
quimioterápico
Carvalho, FP1; Santos, RA1; Carrara, HHA2; Andrade, JM2; Takahashi, CS1,3
Laboratório de Citogenética e Mutagênese, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: citogenética, dano basal, índice de divisão celular, micronúcleo, câncer de mama.
Introdução: Apesar de o histórico familiar constituir o fator de risco mais importante para o câncer de mama
(CM), a maioria dos casos desse tipo de câncer é esporádica estando relacionada aos fatores endógenos e/ou
exógenos que podem danificar a molécula de DNA alterando o conteúdo de informações da mesma e promovendo
a perda da estabilidade celular caso o sistema de reparo no DNA não seja suficientemente eficiente para
eliminar essas lesões no material genético. Sabe-se que os micronúcleos (MN) são um biomarcador de danos
cromossômicos e instabilidade genômica bastante utilizado na epidemiologia molecular. Seu surgimento ocorre
durante a divisão celular decorrentes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros que
não se aderem às fibras do fuso durante a divisão mitótica. Objetivo: Comparar o Índice de Divisão Celular e
a quantidade de micronúcleos entre pacientes com carcinoma de mama ductal invasivo ainda não submetidas
ao tratamento quimioterápico e mulheres controles. Métodos: Foram recrutadas 10 pacientes e 12 controles
com idades entre 35 a 60 anos atendidas no Ambulatório de Mastologia do Departamento de Ginecologia e
Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). Foram feitas
culturas temporárias de linfócitos mantidas por um tempo total de 72hs em estufa a 37ºC, sendo adicionada
citocalasina B após 44hs de cultivo. Ao final foram preparadas lâminas coradas com Giemsa. Na análise foram
contabilizadas 1000 células binucleadas por indivíduo com citoplasma íntegro e núcleos principais nitidamente
delimitados. Foram considerados como micronúcleos as formações com tamanho entre 1/16 e 1/3 dos núcleos
principais. Para a obtenção do Índice de Divisão Nuclear (IDN) foi considerada a freqüência de células com 1,
2, 3 ou 4 núcleos numa população de 1000 células analisadas. Resultados: A análise dos dados feita pelo Teste t
student (α=0,05) (Microsoft Excel 2007®) demonstrou que ambas as médias de IDN e contagem de micronúcleos
para pacientes e controles não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. Em média, o IDN para
pacientes foi 1,3271, e para controles foi 1,3336 (P= 0,8805). Além disso, as médias do número de micronúcleos
para pacientes e controles foram 3,0 e 1,8333, respectivamente (P= 0,1622). Conclusões: O número de micronúcleos
em média para pacientes foi maior que em controles, mas apesar de não ter confirmação estatística, esse
dado pode colaborar posteriormente, com ampliação do número amostral durante o seguimento do estudo.
Apoio financeiro: CNPq, FAEPA e CAPES.
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Cytotoxic effects of the compound
cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on
K562 human erythroleukemia cells
Pereira, FC1; Lima, AP1; Vilanova-Costa, CAST1; Ribeiro, ASBB1; Pereira, LCG1; Silveira-Lacerda, EP1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia,
Goiás, Brazil;
[email protected]
1
Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity; Antitumor activity; K562, Ruthenium(III) compounds;
immunomodulatory activity, Apoptosis.
Leukemia is a major type of cancer affecting a significant segment of the population, and especially children. The
American Cancer Society (ACS) estimated that 35,070 new cases of leukemia would be diagnosed in the United
States in 2009, whereas about 22,280 adults and children would die of leukemia during 2009. Chemotherapy is
a common treatment for leukemia. Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and
photodynamic therapy. The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in the
treatment of leukemia. Ruthenium complexes generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed
to their specific accumulation in cancer tissues. Based on these evidences, in the present work we studied the
citotoxicity activity of the Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate
{cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human erythroleukemia (K562) tumor cell line. The antiproliferative
and cytotoxic activity revealed that K562 cells cultured with concentrations 40 and 150 mM of Ruthenium(III)
compound showed significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging from
88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7% when treated with 150 µM for 24
and 72h. The Ruthenium(III) compound induced low 22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h)
for concentrations 10 and 40 µM, respectively to moderate 44% (24h) and 53% (48h) for concentration 150 µM of
cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value was 18.28 µM. Compared to the cell cycle
profiles of untreated cells, flow cytometric analysis indicated a sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound
on K562 cells, inducing a 1.7-fold, 2.2-fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for 24, 48 and 72 h,
respectively, when compared to control. The compound also caused a significant increase in tailed cells in any of the
concentrations tested compared with negative control, which can be associated cytotoxicity with direct effect on
K562 cells DNA. Additional studies are needed to determine the molecular mechanisms of the active components
and to evaluate the potential in vivo anticancer activity of the cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.
Financial support: FINEP, CNPq, FAPEG and UFG.
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Estudo do potencial citotóxico de compostos a base de
Rutênio em células leucêmicas K-562
Porto, HKP1; Nunes, PR1; Lima, AP1; Silveira-Lacerda, EP1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
[email protected]
[email protected]
1
Palavras-chave: Complexo Rutênio, atividade antitumoral, viabilidade celular.
Atualmente drogas inorgânicas como cisplatina são amplamente utilizados no tratamento do câncer, no entanto
a aplicação dessas drogas é limitada devido a sua alta toxicidade e resistência. Estas limitações proporcionam
o desenvolvimento de novos agentes antitumorais baseados em metais que sejam mais eficazes e menos
prejudiciais ao organismo. Dentre esses complexos, compostos a base de Rutênio (Ru) mostram-se bastante
promissores. No presente trabalho, foi realizado um estudo de citotoxicidade in vitro de três compostos a base
de Rutênio (MPA1, MPA5 e MPA10) frente às células leucêmicas K-562. A avaliação da viabilidade celular foi
realizada através do ensaio colorimétrico de MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazolium),
descrito por Mosman (1983). O principio desse ensaio é medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade
enzimática mitocondrial de células vivas. Os resultados obtidos pelo ensaio de redução do MTT sobre células
leucêmicas de K-562 demonstraram que os compostos MPA1 e MPA5 reduziu significativamente a viabilidade
celular (IC50 aproximadamente de 7µM e 38µM respectivamente). Por outro lado, os resultados obtidos pelo
ensaio de MTT para o composto MPA10 demonstrou que o composto em questão não foi eficiente frente às
células K-562 (IC50 > 200µM). Os três compostos a base de Rutênio apresentam diferença estrutural apenas na
composição de seus ligantes (parte orgânica). Esse fato nos permite inferir que a parte orgânica dos complexos
de rutênio seja responsável pela atividade destes sobre as células leucêmicas. Sendo assim, sugere-se que essa
diferença estrutural entre os complexos de Rutênio é um dos principais fatores responsável pela diferente
resposta encontrada neste estudo. Com esse estudo preliminar podemos concluir que os complexos a base de
Rutênio MPA1 e MPA3 apresentaram eficiente atividade citotóxica frente à linhagem K-562, em contrapartida,
o complexo a base de Rutênio MPA5 não apresentou redução da viabilidade celular frente à linhagem K-562.
Apoio Financeiro: UFG, CNPQ, FINEP
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Estudo Genético Retrospectivo de Mutações
Germinativas em Loci STR de indivíduos
potencialmente expostos à radiação ionizante
Silva, DM1,2,3; Costa, EOA1,3; Melo, AV3; Godoy, FR3; Melo, COA1,3; Nunes, HF1,3; Rodovalho, RG4;
da Silva, CC1,2,3; da Cruz, AD1,2,3
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu, Mestrado em Genética, Universidade Católica de Goiás
LaGene - Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, SuLeide – Laboratório de Citogenética Humana e Genética
Molecular (LaGene), Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovanni Cysneiros, Secretaria da Saúde do Estado de Goiás, Goiânia-GO.
3
Núcleo de Pesquisas Replicon, Departamento de Biologia, Universidade Católica de Goiás
4
Laboratório Biocroma, Laboratório de Análise de DNA, Goiânia, Goiás, Brazil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Acidente radiológico, Césio-137, radiação ionizante, mutação, locos STR.
O acidente radiológico de Goiânia em 1987 foi um grave episódio de contaminação por radioatividade ocorrido
no Brasil. Como conseqüência foram contaminadas centenas de pessoas através das radiações emitidas pelo césio
137. Recentemente, vários estudos têm mostrado que instabilidade no genoma, como por exemplo, mutações,
aberrações cromossômicas, formação de micronúcleos, instabilidade de microssatélites e atraso na morte celular
são comumente relatadas em células de mamíferos expostos à radiação ionizante, sendo consideradas como o
principal fator de risco em humanos. As mutações podem ser espontâneas, sendo a freqüência de ocorrência
dependente do organismo, ou ainda, induzida, podendo ser ocasionadas pela exposição a agentes mutagênicos.
As radiações ionizantes são exemplos de agentes físicos e mutagênicos que podem levar ao comprometimento
dos mecanismos de reparo celular e ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer. Avaliar os efeitos biológicos
da radiação ionizante, em células somáticas e germinativas, com conseqüente determinação da taxa de mutações
radio-induzidas, é extremamente importante para a estimativa de riscos genéticos, principalmente em populações
expostas à radiação. Análises de seqüências repetitivas de DNA têm demonstrado que estas seqüências são sujeitas a
altas taxas de mutações espontâneas. As seqüências minissatélites e microssatélites têm sido usadas para demonstrar
satisfatoriamente a indução de mutação germinativa em camundongos, humanos, dentre outros organismos. O
objetivo do presente estudo foi analisar a freqüência de alterações em microssatélites para determimar a taxa de
mutações ocorridas em células de linhagem germinativa dos progenitores expostos à radiação ionizante do Césio-137.
O grupo exposto foi constituído por 10 famílias do grupo 2 e o grupo controle por 645 indivíduos provenientes de
exames de vínculo genético realizados em 2010. Foi encontrada um mutação de origem paterna no locus D8S1179.
No grupo controle, foram encontradas 01 mutação no loci D16S539 e no loci D3S1358; 02 mutações no locus Penta
E; 04 mutações no locus D21S11 e 03 mutações no locus FGA, compreendendo um total de 11 mutações e uma taxa
de mutação de 0,008. Nesse contexto, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (p= 0,15)
indicando o efeito da exposição e taxa de mutação em locos STR no grupo acidentalmente exposto ao Césio-137.
Apoio financeiro: CNEN, FAPEG, CAPES e PUC-GO.
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Micronúcleo e anormalidades nucleares de células
esfoliadas da mucosa bucal de indivíduos idosos
expostos aos raios-x durante a radiografia panorâmica
Gonçalves, A1; Ramos, JCD1; Ataíde, AP1; Ervolino, E1; Salzedas, LMP2; Silveira, ZV3
Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista
Departamento de Patologia e propedêutica Clínica Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista
3
Departamento de Odontologia e Nutrição, Faculdades Adamantinenses Integradas.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Micronúcleo, mucosa bucal, raios X, Mutagenese, Envelhecimento.
A análise da freqüência de micronúcleo em células que se dividem é um procedimento técnico simples para
detecção de dano cromossômico. A associação dessa técnica com a análise da freqüência de anormalidades
nucleares como brotos nucleares, broken eggs, cariorrex, células binucleadas e cariólise, permite avaliar o grau de
genotoxicidade e citotoxicidade celulares. Por meio destes métodos de estudo, verificou-se em células esfoliadas
de mucosa bucal de idosos os efeitos genotóxicos e citotóxicos dos raios X emitidos pelo exame de radiografias
panorâmicas dentais humanas. Células da mucosa jugal de 26 indivíduos (14 homens com média de idade 64,50
± 8,51 e 12 mulheres com média de idade 61,58 ± 6,14) que freqüentaram a clínica de Radiologia da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba (UNESP) foram coletadas com abaixador de língua de madeira, antes e 12 dias após o
exame radiográfico (aparelho com exposição regulada em 70 - 80 KV, 12 mA por 16 segundos). As células foram
estendidas em lâminas histológicas e coradas pelo método de Feulgen-Fast Green para a contagem de 2000 células
por indivíduo. A análise comparativa da freqüência de micronúcleo antes e depois da exposição aos raios X não
mostraram diferenças estatisticamente significante (ρ= 0,626). Observou-se que somente o grupo de células
binucleadas mostrou diferenças significantes pela análise do teste t emparelhado (ρ= 0,0275). A presença de células
binucleadas em quantidade aumentada mostrou que houve atraso ou falha da célula em completar a citocinese.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Aberrações cromossômicas em linfócitos periféricos
de trabalhadores expostos à radiação ionizante em
hospitais de Belém, Pará, Brasil
Cunha JR, LRCS1; Burbano, RR1; Cardoso, PCS1
Laboratório de Citogenética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará.
1
Palavras-chave: radiação ionizante, exposição ocupacional, linfócitos, aberrações cromossômicas, raios-X
Agentes genotóxicos, químicos, físicos (p. ex. raios-x) ou biológicos podem induzir danos genéticos por exposição
acidental, ocupacional ou ambiental. Estes agentes podem interferir no correto desenvolvimento celular conferindo
grande risco ao desenvolvimento da carcinogênese. Apesar da atuação dos sistema de reparo, muitos danos causados
por estes agentes podem levar à formação de aberrações cromossômicas (AC). As aberrações induzidas podem ser:
[i] estáveis (referem-se a pequenos danos, translocações recíprocas e algumas aneuploidias, que não impedem a
divisão e proliferação celular) e [ii] não-estáveis (referem-se a cromossomos dicêntricos e em anel, grandes deleções
e fragmentos). Os últimos, normalmente, são letais à célula. Profissionais que trabalham manuseando aparelhos que
produzem radiação X, como ampolas de raios-x, tomógrafos e cintilógrafos pertencem ao grupo de trabalhadores
que se expõem à radiação ionizante diariamente. Colheu-se 10 ml de sangue periférico de cada indivíduo por
punção venosa utilizando agulhas e seringas descartáveis previamente heparinizadas com Liquemine (Lab.
Roche 5.000 UI/ml). Após a coleta, transferiu-se o sangue para tubos de ensaio estéreis, que foram mantidos em
repouso por algumas horas à temperatura ambiente, para a sedimentação das hemácias e separação do plasma.Foi
realizada a análise de linfócitos do sangue periférico, através de técnicas de cultura temporária de linfócito, segundo
Moorhead et al. de 20 trabalhadores (4 mulheres e 16 homens) que lidam com radiação ionizante diariamente, com
pelo menos 2 anos de experiência profissional, com intuito de investigar a presença de aberrações cromossômicas
nestas células, fazendo uso desta ferramenta citogenética para avaliar e elucidar as consequências da convivência
profissional com índices considerados baixos de radiação ionizante. A frequencia de AC avaliada no grupo de
trabalhadores foi maior que no grupo controle (P = 0,008 e P=0,001, respectivamente). Estes resultados sugerem uma
avaliação mais profunda no impacto da saude destes trabalhadores, utilizando de ferramentas moleculares mais
específicas, bem como a conscientização dos mesmos para um cotidiano de proteção radiológica mais eficiente.
Apoio Financeiro: FAPESPA e UFPA
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Avaliação do potencial genotóxico do Prevyol
(Levonorgestrel) em células somáticas de Drosophila
melanogaster: teste SMART/asa
Silva, EM1; Ferreira, AKS1,3; Felício, LP1; Vale, CR1; Duarte, SR1; Silva, NF1; Miranda, CT2; Carvalho, S1
Laboratório de Mutagênese com Drosophila, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Goiás
²Faculdade de Tecnologia, Universidade de Brasília.
[email protected]
1
Palavras-chave: farmáco, levonorgestrel, genotoxicidade, Drosophila melanogaster, SMART/asa
A eficácia do anticoncepcional de emergência é conhecida há mais de 30 anos, é uma opção ainda pouco utilizada
para redução da gravidez não esperada e da morbimortalidade relacionada ao abortamento inseguro, principalmente
em países da América Latina. Os métodos anticoncepcionais de emergência são utilizados como um método
hormonal indicado para evitar gravidez após uma relação sexual desprotegida no meio do ciclo mestrual ou quando
ocorrer falha no uso de outro método anticoncepcional. Tendo o princípio ativo conhecido como levonorgestrel
e seu mecanismo de ação contraceptiva envolve inibição da ovulação, alteração da fase lútea, modificação do
muco cervical, interferência com a penetração do espermatozóide no ovócito, alteração da maturação do ovócito.
Perante isso, o presente trabalho buscou avaliar o efeito genotóxico do fármaco Prevyol (Levonorgestrel 0,75 mg)
em células somáticas de Drosophila melanogaster, pelo teste SMART/asa (Somatic Mutation And Recombination
Test). Foram utilizadas três linhagens de Drosophila: flr3, ORR e mwh; para realização dos cruzamentos padrão
(ST) e aprimorado (HB), mantidas em uma câmara a 25ºC em meio banana-ágar. As larvas de terceiro estágio
provenientes dos cruzamentos ST e HB foram tratadas com 0,75mg/mL; 1,5mg/mL e 3,0mg/mL de levonorgestrel,
tendo água destilada como controle negativo e Doxorrubicina (0,125 mg/mL) como controle positivo. Após a
eclosão, as asas dos adultos foram utilizados para montagem das lâminas. Para análise estatística dos resultados
foi aplicado o teste X2 para proporções, que compara o número de manchas do controle negativo (água destilada)
com o número de manchas encontradas nas doses. O controle positivo (DXR) foi utilizado para validação do teste,
que nos resultados comprovou o seu efeito genotóxico. Os dados das doses não apresentaram efeito genotóxico,
sendo o diagnóstico estatístico negativo para o número total de manchas tanto no cruzamento HB e ST; mas
no cruzamento HB o diagnóstico foi inconclusivo para manchas simples pequenas e grandes devido aos valores
estarem iguais ou próximos ao controle negativo, não havendo diferença estatisticamente significativa. Como não
houve diferença estatística podemos concluir que, o Prevyol não apresenta efeito genotóxico nas células somáticas
de Drosophila melanogaster, mas em termos de saúde pública pode ser considerado um resultado positivo.
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50
Avaliação da atividade mutagênica do Norfloxacino em
células meristemáticas radiculares de Allium cepa L.
(Liliaceae)
Portis, IG1; Hanusch, AL1; Machado, RC1; de Abreu, JB1; da Silva, CC1,2; da Cruz, AD1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – LACEN/SES/GO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mutagênese, bactericida, alterações cromossômicas, fármacos, toxicidade.
Atualmente, medicamentos produzidos por indústrias farmacêuticas são utilizados para o tratamento de
doenças no mundo todo. O uso destes medicamentos, sem prescrição médica, pode acarretar danos à saúde.
Norfloxacino é um agente bactericida indicado no tratamento de infecções no trato urinário alto ou baixo,
agudas ou crônicas, gastroenterites provocadas por germes sensíveis, uretrites, dentre outros. O presente estudo
teve por objetivo analisar o potencial mutagênico do Norfloxacino em diferentes concentrações utilizando
o teste Allium cepa. A solução de uso foi preparada a partir de 400mg do medicamento Norfloxacino diluído
primeiramente em 8mL de DMSO (dimetilsulfóxido), e posteriormente completou-se o volume de 1L com água
deionizada. Foram estabelecidos quatro concentrações do medicamento a serem testadas: 8,21g.L-1, 6,6g.L-1,
4,1g.L-1, e 2,05g.L-1. O grupo amostral foi constituído de três bulbos de Allium cepa para cada concentração, que
ficaram em crescimento radicular no período de 48 horas em água deionizada. Após a exposição dos bulbos, foram
utilizadas três raízes de cada um para constituir o grupo controle. Para o grupo exposto (GE) foram colocados
os bulbos de Allium cepa em diferentes concentrações das soluções referentes ao fármaco, compreendendo um
período de mais 48 horas, sendo posteriormente coletadas 3 radículas, as quais foram transferidas para tubos
do tipo eppendorf contendo a solução fixadora de Carnoy. As lâminas foram obtidas segundo o protocolo
de Fiskëjo (1985). Para a análise das lâminas foi utilizado microscopia de luz branca com objetiva de 100x,
possibilitando a identificação de erros de migração (aderências, atrasos, adiantamentos e pontes cromossômicas)
nas fases de metáfase e anáfase da divisão celular. Após a análise das lâminas foi realizado o teste ANOVA para
a comparação entre as médias do GE e do GC. Os resultados mostraram que não houve diferenças entre as
amostras, sugerindo que o medicamento Norfloxacino não possui atividade mutagênica detectável pelo teste
Allium cepa, quando consideradas as concentrações avaliadas. No entanto, se faz necessária, a realização de outros
ensaios de mutagenicidade, para que se compreenda melhor a relação dose-efeito genotóxica do Norfloxacino.
Apoio financeiro: PROPE/PUC-Goiás.
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Protective Effect of an Aqueous Extract of Propolis and
its Fractions on Chemically-Induced DNA Damage
Almeida, DC1; Alves de Lima, RO1; Marcucci, MC2; Salvadori, DMF1
1 – Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu – Universidade Estadual Paulista - UNESP.
2 –Departamento de Farmacologia, Universidade Bandeirantes de São Paulo – UNIBAN.
[email protected]
Palavras-chave: Antigenotoxicity, chemoprevention, DNA damage, propolis, comet assay
Propolis is a complex mixture of plant resin, bee wax, essential oils and pollen, with a highly complex and variable
chemical composition, which is intimately related to the region visited by the honeybees. This resin has been
used in folk medicine because of its antimicrobial, antiparasitic, antiviral, antiinflamatory, and antioxidant
properties. This study was designed to evaluate the antigenotoxic effect of an aqueous extract of propolis (AEP
– at concentrations: 12,5, 25, 50, 100 and 200 µg/ml) and its fractions (F1, F2, F3, F4 and F5 – at concentration:
25, 50 and 100 µg/ml) on Chinese Hamster Ovary (CHO) cell line. The comet assay was used to evaluate
primary DNA damage and chemicals with different mechanisms of mutagenicity (H2O2, 4NQO and MMS) were
used in 3 different treatment protocols (pre-, simultaneous and post-), in order to better understand propolis
chemopreventive action. Our data showed that both the aqueous extract of propolis (AEP) and its fractions (F1
to F5) were capable of reducing DNA damage induced by the 3 mutagens in CHO cell line. The antigenotoxic
activity was more effective when the mutagens H2O2 and 4NQO were used, however when MMS was used
simultaneously with the AEP, and with F1, F2 and F3 in the three protocols, the level of damage increased. In
conclusion, our findings confirmed the preventive effect of propolis components against chemically-induced DNA
damage, but before establishing chemopreventive strategies using this bee product, more studies are necessary
to better understand under which conditions propolis may prevent genetic instability and promotes health.
Apoio Financeiro: CNPq and FAPESP
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Genotoxicidade da ipriflavona in vitro
Belcavello, L; Dutra, JCV; Freitas, JV; Melo, FS; Luz, AC; Batitucci, MCP
Laboratório de Genética Vegetal e Toxicológica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: Ipriflavona, Linfócitos Humanos, Micronúcleo, Citotoxicidade, Genotoxicidade
A Ipriflavona (7-isopropóxi-isoflavona) é uma isoflavona semissintética derivada da daidzeína e utilizada
como alternativa terapêutica na prevenção e tratamento de osteoporose em mulheres pós-menopausadas.
Não há relato na literatura acerca do potencial genotóxico da ipriflavona (Ipr), apesar desse medicamento ser
prescrito desde 1989 para mulheres no climatério. No presente estudo, a ipriflavona foi investigada quanto
aos seus efeitos citotóxico e genotóxico empregando-se o ensaio do micronúcleo (MN) com bloqueio da
citocinese pela citocalasina-B, em linfócitos de sangue periférico humano. As amostras de sangue foram
obtidas de cinco doadores (3 mulheres e 2 homens), com idades entre 20 e 25 anos, saudáveis, não-fumantes e
sem históricos recentes de doenças, exposição à radiação ou uso de medicamentos. Ipriflavona, dissolvida em
DMSO (dimetilsulfóxido), foi adicionada 24h após o início da cultura às concentrações finais de 5 ou 10 µg.mL-1
de meio. Cisplatina à concentração final de 0.05 µg.mL-1 de meio, para induzir a formação de MN, serviu como
controle positivo. Uma cultura não tratada (controle negativo – CN) e uma cultura tratada com DMSO 0.4% v/v
(controle do solvente – CS) também foram realizadas. As culturas foram incubadas por 72h a 37°C. As células
foram coletadas por centrifugação, hipotonização e fixação, seguindo-se de coloração com Giemsa e análise
citológica em microscopia de luz. Duas mil células binucleadas (BN) com citoplasma bem preservado foram
computadas, para cada doador, para calcular a frequência de MN. Como parâmetro de citotoxicidade, foi calculado
o Índice de Divisão Nuclear (IDN), a partir da contagem de 2000 células por tratamento. A análise estatística foi
realizada por ANOVA a um critério e pelo teste de Tukey a posteriori, a 5% de probabilidade. Apenas as culturas
tratadas com Ipr à concentração de 10 µg.mL-1 apresentaram diminuição significativa da proliferação celular dos
linfócitos (redução do IDN) bem como a indução da formação de MN nas células BN, em relação aos grupos
CN e CS, demonstrando-se citotóxica e genotóxica para essa concentração, o que pode estar relacionado a um
potencial pró-oxidante dessa substância. Conclusão: O uso de Ipr deve ser realizado com cautela, uma vez que
essa isoflavona demonstrou-se citotóxica e genotóxica para linfócitos humanos cultivados e sua segurança
como medicamento ainda não foi completamente elucidada, necessitando-se de estudos mais abrangentes.
Apoio financeiro: CNPq, Fapes e UFES
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Ausência de citotoxicidade do Prevyol (Levonorgestrel)
em células somáticas de Drosophila melanogaster
Ferreira, AKS1,2; Silva, EM2; Vieira, ILBF2; Felício, LP2; Vale, CR2; Rezende, RDF2; Silva, NF2; Carvalho, S2
Universidade Estadual de Goiás-Morrinhos
Laboratório de Mutagênese com Drosophila, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de
Goiás.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: fármaco, levonorgestrel, citotoxicidade, Drosophila melanogaster, SMART/asa
Os métodos anticoncepcionais de emergência são utilizados em casos onde ocorre a relação sexual, sem prévia
proteção, no meio do ciclo menstrual. Por volta de 1979 diversos países liberaram o uso da pílula do dia seguinte,
mas só em 1994 ocorreram estudos clínicos confirmando sua eficiência e liberação pela OMS. Uma dessas drogas
é o Levonorgestrel, cujo mecanismo de ação contraceptiva envolve a inibição da ovulação, através de alterações
na fase lútea, modificação do muco cervical, interferência com a penetração do espermatozóide no ovócito, bem
como alteração na maturação do ovócito. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar o efeito citotóxico
do fármaco Prevyol-2 (levonorgestrel 0,75 mg) em células somáticas de Drosophila melanogaster, pelo SMART/
asa (Somatic Mutation And Recombination Test). As linhagens flr3, ORR e mwh utilizadas, foram mantidas em
meio banana-ágar, em temperatura de 25° C e umidade relativa de 60%. Para os experimentos foram usadas
larvas provenientes do cruzamento padrão (ST), sem ativação metabólica, e do cruzamento aprimorado (HB),
com ativação metabólica. Larvas ST e HB de terceiro estágio (72 ± 4 horas) foram tratadas com 10 diferentes
concentrações do Prevyol 0,75 mg (0,004; 0,009; 0,019; 0,038; 0,05; 0,075; 0,1; 0,15; 0,2; e 0,3 mg/mL). Foram colocadas
100 larvas/dose. Após a emergência, os indivíduos foram contados e descartados. Os resultados foram comparados
com o controle negativo (água destilada) e não evidenciaram nenhum efeito citotóxico do Prevyol, pois em todas
as doses o número de sobreviventes foi superior ou igual quando comparado com o controle negativo, tanto em ST
como em HB. Pode-se concluir que, o fármaco Prevyol 0,75 mg não afetou o desenvolvimento das células somáticas
de Drosophila melanogaster, durante a embriologia.
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Avaliação genotóxica em células esfoliadas da
mucosa oral de usuários de esteróides anabolizantes
androgênicos
Souza, JP1; Cerqueira, EMM1; Meireles, JRC1
Laboratório de Genética Toxicológica – Departamento de Ciências Biológicas – Universidade Estadual de Feira de Santana.
[email protected]
1
Palavras-chave: esteróides anabolizantes, genotoxicidade, micronúcleo, apoptose
Dentre os diversos efeitos indesejados associados ao uso de esteróides anabolizantes androgênicos (EAA),
o risco de ocorrência de câncer entre usuários tem sido relatado por alguns pesquisadores. Entretanto a ação
destas substâncias na iniciação e desenvolvimento da doença não é clara, uma vez que estudos com objetivo de
avaliar a genotoxicidade e/ou carcinogenicidade dos EAA são poucos e os resultados controversos. Assim, estudos
visando esclarecer o potencial dos EAA em danificar o DNA são de significativa relevância, uma vez que o câncer
é uma doença genética decorrente do acúmulo de alterações genéticas em genes envolvidos com o controle da
proliferação e diferenciação celular, reparo ao DNA e mecanismos de apoptose. Neste contexto, esta pesquisa
objetivou avaliar a possível genotoxicidade/citotoxicidade dos esteróides anabolizantes androgênicos Durateston®,
Deca-durabolin® e Deposteron® com uso do Teste de Micronúcleo em células esfoliadas da mucosa oral de usuários
no município de Feira de Santana – BA. A população de estudo foi composta por quarenta indivíduos do sexo
masculino distribuídos em dois grupos de vinte, pareados por idade: G1 (usuários de Durateston®, Deca-durabolin®,
e Deposteron® isolado ou simultaneamente) e G2 (não usuários de esteróides anabolizantes androgênicos).
Após aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Feira de Santana, foi
aplicado um questionário de entrevista. Células da mucosa oral foram coletadas com uso de escova endocervical
e processadas para análise de micronúcleo e alterações nucleares indicativas de apoptose. A análise estatística foi
realizada com o uso do teste condicional para comparação de proporções em situações de eventos raros e revelou
que não houve diferença significativa na ocorrência de micronúcleo entre os grupos (p>0,90). A ocorrência de
apoptose, inferida pelo somatório de cariorréxis, cromatina condensada e picnose, foi significativamente mais
frequente em células de indivíduos do G2 (p<0,001). Estes resultados sugerem que os EAA analisados não têm
efeito clastogênico e/ou aneugênico e que utilização destes produtos promove inibição da apoptose, indicando
que o uso prolongado pode prejudicar processos celulares responsáveis pela eliminação de células danificadas e
assim contribuir para o desenvolvimento neoplásico.
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Análise genotóxica dos antidepressivos Nortriptilina e
Paroxetina através da técnica de ensaio cometa
Sousa, AP1; da Silva, CC1,2; Cunha, DMC1; de Oliveira, JSP1 da Cruz,AD1,2 , Dinis, LS1;Manso, JAX1
1-Laboratório Replicon – Departamento de Biologia - Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
2-LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – Vinculado ao Lacen – Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovanni
Cysneiros – Secretaria de Saúde do Estado de Goiás.
[email protected]
Palavras-chave: Danos, depressão, tricíclicos, serotonina, monoaminas
Introdução: A depressão é um distúrbio afetivo que possui como forma de tratamento o uso de antidepressivos,
que são classificados conforme mecanismo de ação. Os antidepressivos tricíclicos atuam de modo pré-sináptico
no bloqueio da recaptura de monoaminas, e pós-sinapticamente de forma variada. Os antidepressivos inibidores
seletivos de recaptação da serotonina inibem a recaptação da serotonina. Objetivos: Procurou-se neste trabalho
fazer uma análise genotóxica desses medicamentos através da técnica de ensaio cometa. Métodos: foram coletadas
amostras de sangue periférico obtidas por punção venosa de voluntários que não fazia o uso de nenhum tipo de
medicamento em seguida estas amostras foram centrifugadas para obtenção do anel leucocitário, em seguida
acrescenta a este sangue o meio de cultura para nutrir a célula e acrescenta as concentrações do medicamento
a ser estudado que são os seguintes: Nortriptilina 25, 50 e100 mg e Paroxetina 5, 10 e 20 mg em seguida este
material vai para a estufa por uma hora e depois são feitas as lâminas para o ensaio cometa e depois é feita uma
corrida eletroforetica para obtenção dos cometas. Resultados: Os resultados obtidos demonstram que em ambos
antidepressivos o índice de dano genotóxico foi maior nas concentrações mais elevadas, e que a frequência de
danos da Nortriptilina e Paroxetina não atingiram 50 %. A Nortriptilina 100mg apresentou dano máximo não sendo
possível sua classificação nos “Scores”. Conclusão: De acordo com os resultados obtidos é possível concluir que
a Nortriptilina e Paroxetina apresentam efeito genotóxico, porém novos testes devem ser realizados para uma
confirmação mais precisa.
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56
Avaliação in vitro dos efeitos genotóxicos do
antimalárico artesunato em linfócitos humanos
Mota, TC*; Cardoso, PCS; Gomes, LM; Vieira, PCM; Cunha, LA; Bahia, MO
Laboratório de Citogenética Humana (LCH), Instituto de Ciências Biológicas (ICB), Universidade Federal do Pará (UFPA)/ Belém-PA, Brasil.
E-mail: [email protected]
Palavras-chave: artesunato, artemisininas, linfócitos, genotoxicidade, mutagenicidade
Introdução: O artesunato é uma das principais drogas usadas como antimaláricos em diversos países. É um
composto semi-sintético derivado da artemisinina, substância extraída da planta chinesa Artemisia annua L.
Apesar da ampla utilização desta droga na terapêutica antimalárica, ainda hoje são quase inexistentes os trabalhos
que demonstrem os efeitos genotóxicos do artesunato em linfócitos humanos. Portanto, no presente trabalho,
pretendemos avaliar os efeitos genotóxicos do artesunato utilizando como modelo experimental cultura de
linfócitos humanos. Métodos e Resultados: Para a preparação das culturas foi coletado sangue de três indivíduos
(duas mulheres e um homem). A colheita foi realizada com o auxílio de seringas descartáveis sendo o sangue, em
seguida, submetido ao processo de isolamento de linfócitos de acordo com Fenech (2000). Foram cultivadas 1x106/
mL de células em 5 mL de RPMI 1640 completo. A cultura foi incubada em estufa contendo 5 % de CO2 e 95 % de
O2 a 37°C. Após 20 h em cultura, os linfócitos foram tratados com diferentes concentrações de artesunato (0,5; 1 e
2 µg/mL). Após 3 h de incubação com a droga, foram coletadas amostras para a realização do ensaio do cometa e
24 h após o início do tratamento foi adicionado 3 µg/mL de citocalasina-B para a obtenção de células binucleadas
e realização do teste do micronúcleo (MN). Após 72 h de cultivo, as células foram centrifugadas, hipotonizadas
(KCl 0,075 M) e fixadas. As lâminas então foram confeccionadas e coradas com Giemsa 3 % por 4 min. Parâmetros
como PNP (pontes nucleoplasmáticas) e IDN (índice de divisão nuclear) também foram analisados. Nossos
resultados demonstraram um aumento significativo (p<0,05) no índice de dano avaliado pelo teste do cometa,
bem como na freqüência de micronúcleos em todas as concentrações testadas em relação ao controle. Conclusões:
Demonstramos, portanto que o artesunato é uma droga extremamente genotóxica e potencialmente mutagênica
em cultura de linfócitos humanos, uma vez que em poucas horas de tratamento foi observado um efeito
genotóxico estatisticamente significativo, tanto pelo ensaio do cometa quanto a longo prazo pelo teste do MN.
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Efeito da cloroquina sobre cromossomos de
camundongos in vivo: teste do micronúcleo
Aranha, IP1; Cabral, TS2
1-. Inst. de Biologia Roberto Alcântara Gomes. 2-Instituto de Nutrição. Univ. do Estado do Rio de Janeiro.
Palavras-chave: Cloroquina, cromossomos, camundongos, in vivo, micronúcleo
A cloroquina pertence a uma série de 4 aminoquinolina sintética e é usada como difosfato em pacientes por
via oral. Inicialmente esta droga era utilizada somente no tratamento de pacientes com malária mas, devido
a suas características antiinflamatórias, vem sendo utilizada também para o tratamento de doenças como a
artrite e o lupus eritematoso sistêmico. O presente estudo teve como objetivo observar o efeito da cloroquina
sobre cromossomos in vivo pelo método do micronúcleo. Para isso foram usados eritrócitos policromáticos de
medula óssea de camundongos ICR. Seis animais foram inoculados intraperitonealmente com cloroquina numa
concentração de 25% da LD50. A administração da droga foi feita durante cinco dias consecutivos. No sexto dia os
animais foram sacrificados , seus fêmures retirados, suas medulas ósseas coletadas e os esfregaços foram feitos para
a preparação das lâminas. Após 24 h as células foram coradas com Giemsa Gurr (2%). Como controle positivo seis
animais foram inoculados com ciclofosfamida (50mg/mL) uma única vez. Seis animais não expostos a qualquer
droga serviram de controle negativo do experimento. No grupo teste foram observadas 12080 células sendo
encontradas 93 micronucleadas. No grupo exposto à ciclofosfamida, em 12535 células analisadas 173 apresentavam
micronúcleos. No grupo que serviu de controle negativo para os trabalhos 12697 células foram estudadas e 9
apresentavam micronúcleos. O teste do qui-quadrado para independência mostrou que nossos resultados eram
extremamente significantes (P < 0,0001) sugerindo ser a cloroquina responsável pelos micronúcleos observados.
Apoio Financeiro: UERJ
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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58
Avaliação dos efeitos citotóxico e genotóxico de uma
nova arilaminonaftoquinona por meio do ensaio do
micronúcleo
Freitas, JV1,2; Belcavello, L1,2; Cazelli, JVC1; Oliveira, AS3; Greco, SJ3; Batitucci, MCP1,2,4
Laboratório de Genética Vegetal e Toxicológica, Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais,
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ES
2
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Núcleo de Biotecnologia, Centro de Ciências da Saúde, UFES, Vitória, ES
3
Laboratório de Pesquisas em Química Orgânica, Departamento de Química, UFES, Vitória, ES
4
Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, Centro de Ciências Humanas e Naturais, UFES, Vitória, ES.
[email protected]
1
Palavras-chave: Arilaminonaftoquinona, Ensaio do Micronúcleo, Camundongos, Citotoxicidade, Genotoxicidade
O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, por ter se tornado um estigma de mortalidade
e dor. A procura por novos agentes antitumorais tem se tornado cada vez mais necessária, com vistas à uma maior
eficácia e menor efeito citotóxico em tecidos normais. Nesta perspectiva, as quinonas vêm sendo exaustivamente
estudadas nas últimas décadas devido às suas propriedades biorredutivas e participação no estresse oxidativo.
Os estudos toxicológicos para a verificação da citotoxicidade, genotoxicidade e antigenotoxicidade de diversas
substâncias, principalmente quando visam à produção de novos medicamentos, são realizados através de
bioensaios que avaliam os efeitos do agente testado sobre a célula e o material genético. Este trabalho avaliou
as atividades citotóxica e genotóxica de uma nova arilaminonaftoquinona sintética utilizando o ensaio de
micronúcleo em medula óssea de camundongos albinos Swiss (Mus musculus) in vivo. Foram determinados
seis grupos experimentais (N = 3 animais/sexo/grupo), aos quais foram administrados, intraperitonealmente:
Ciclofosfamida 50 mg.kg-1 p.c. (controle positivo); Solução fisiológica (controle negativo), DMSO (dimetilsulfóxido,
controle do solvente, 0,05 mL.g-1 p.c.) e arilaminonaftoquinona dissolvida em DMSO nas concentrações finais de
50, 100 e 200 mg.kg-1 p.c. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 24 h após a administração
da droga e dos controles, para coleta da medula óssea e confecção das lâminas. Para a análise citológica foi
computada a frequência de eritrócitos policromáticos (PCEs) portadores de micronúcleos em 2000 PCEs por
animal. Como parâmetro de citotoxicidade foi calculada a razão entre o número de eritrócitos policromáticos e
normocromáticos (NCEs) em 200 eritrócitos totais por animal. A análise estatística dos dados foi realizada por
ANOVA seguida pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Os resultados preliminares obtidos demonstraram
que as três concentrações testadas de arilaminonaftoquinona não induziram citotoxicidade nem genotoxicidade
para as células de medula óssea de camundongos. Tais resultados incentivam a continuidade dos estudos
com essa droga e estimulam investigações posteriores quanto às suas propriedades antimutagênicas.
Apoio financeiro: PPSUS, FAPES, CNPq
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59
Mutagenicidade do gluconato de clorexidina em
células esfoliadas da mucosa oral
Dantas, SMMM1; Brito, ACR2; Ribeiro, RC2; Leite, AS3; Sousa, JMC4; Melo-Cavalcante, AAC5.
Laboratório de citogenética e genética toxicológica - Universidade Federal do Piauí
Cirurgiões dentistas especialistas em genética e evolução
3
Aluna de doutorado da UFPI
4
Universidade Federal do Piauí
5
Laboratório Central –LACEN
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gluconato de clorexidina 0,12%; mutagenicidade; teste de micronúcleo; mucosa oral; enxaguantes bucais
O gluconato de clorexidina a 12% é o princípio ativo de enxaguantes bucais vendidos normalmente no comércio e
amplamente usado na prática dental para controle de placa, gengivite e desinfecção de canais radiculares, entretanto,
seu potencial genotóxico ainda não foi esclarecido. Visando a saúde de pacientes submetidos a tratamentos
odontológicos que usam de forma prolongada colutórios à base desta substância e mesmo da população em geral
que o faz, o presente estudo tem como objetivo estudar os possíveis efeitos genotóxicos da exposição contínua
em células epiteliais da mucosa bucal desses indivíduos, investigando a frequência de micronúcleos, que podem
causar instabilidade no material genético, podendo levar ao aparecimento de neoplasias malignas. A amostra
inicial constou de 20 indivíduos, sendo que 10 deles fizeram uso da substância em estudo (Grupo exposto), duas
vezes ao dia por sete dias consecutivos e por 10 indivíduos (Grupo não exposto) que não usaram o colutório. Os
indivíduos da amostra foram voluntários em tratamento dentário, selecionados após explicação dos procedimentos
realizados no teste. Todos os participantes preencheram o questionário de saúde pessoal, recomendado pela
International Comission for Protection against Environment Mutagens and Carcinogens (ICPEMC) Mutation
Research, 204:379-406. (1998), contendo dados de identificação, ocupação e história médica e indagações a respeito
de idade, sexo e hábitos de fumar e ingerir bebidas alcoólicas (os fumantes e aqueles que faziam uso de álcool com
freqüência foram excluídos). A proposta do estudo foi aprovada pelo CEP-UFPI com CAAE nº 0089.0.045.000-09.
Foram analisadas mil células por indivíduo em microscópio óptico, utilizando-se aumento de 100 vezes. A análise
estatística foi realizada através do teste T com nível de significância < 0,01 pelo programa PRISMA versão 5.0, para
determinar a freqüência de micronúcleos em células mononucleadas no grupo de expostos e de controle, bem
como verificar se haviam diferenças entre eles. Os resultados obtidos revelaram um aumento estatisticamente
significativo da presença de micronúcleos no grupo dos indivíduos expostos (2,60 ± 0,60) para p < 0,01, em relação
ao grupo de indivíduos não expostos (0,40 ± 0,22), indicando que algum componente do colutório em análise tem
efeito mutagênico. Baseados nestes resultados preliminares, a amostra foi ampliada em mais 40 indivíduos nas
mesmas condições dos 20 indivíduos deste estudo.
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60
Avaliação do potencial genotóxico do ácido betulínico
em células CHO (chinese hamster ovary)
Silva, MB1; Fontes, CJ2; Bassi, CL3.
Instituto de Biociências de Mato Grosso (IB-UFMT)
Depto. Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas (FCM-UFMT)
3
Depto. de Ciências Básicas em Saúde (DCBS-FCM/UFMT).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: malária, ácido betulínico, micronúcleo, CHO
A malária é a doença parasitária mais importante atingindo o homem, sendo que o surgimento de parasitas
resistentes à ação da cloroquina e de outras drogas usadas no tratamento da doença tem impulsionando a busca
por novas drogas. O ácido betulínico (AB) é um triterpeno que tem apresentado atividade anti-plasmodial in
vitro e in vivo, mas seus efeitos mutagênicos ainda não foram investigados. O objetivo desse estudo foi avaliar a
freqüência de micronúcleos (MN) em células CHO após o tratamento com o AB. Após o teste de citotoxicidade
(population doubling) para a escolha das concentrações a serem testadas, as células foram tratadas por 3 (+ 17
horas de recuperação) ou 20 horas, com 5, 10 e 15 mM de AB, juntamente com os controles negativo (CN), de
solvente (CS, DMSO 0,09%) e positivo (CP, doxorrubicina 0,1 mg/ml). Para determinar o número de células
binucleadas (CBN) com MNs e/ou pontes nucleoplasmáticas (PNPs), bem como o total de MNs ou PNPs e o
índice de divisão nuclear (IDN), foram analisadas 1000 células binucleadas em microscópio ótico. Os resultados
obtidos submetidos à avaliação estatística pelo teste One Way ANOVA. Não houve aumento significativo na
freqüência de nenhum dos parâmetros analisados nas concentrações de AB testadas em comparação com o CS,
ou quando o CS foi comparado ao CN, nos dois protocolos de tratamento utilizados (p>0,05). Houve aumento
estatisticamente significativo de CBN-MN e do número total de MNs, bem como uma redução significativa
do IDN quando o CP foi comparado ao CS (p<0,05). Estes resultados sugerem que o AB não apresenta efeitos
mutagênicos em células CHO, embora existam evidências que essa substância possa inibir alguns processos
celulares que resultam em quebras no DNA. No entanto, é necessário investigar os efeitos da droga após
metabolização para que dados mais conclusivos sobre o seu potencial mutagênico possam ser obtidos.
Apoio: CNPq, FAPEMAT
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61
Evaluation of micronucleus frequency in peripheral
blood of normal rats and in persistent estrus
Rodrigues-Junior, DM¹; Lopes-Costa, PV¹; Melo, AAC²; Aguiar, ARN¹; Ribeiro dos Santos, A¹; Da Silva, BB¹
¹Departamento de Ginecologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Piauí
² Departamento de Biomedicina, NOVAFAPI
[email protected]
Keywords: estrogen, persistent estrus, micronuclei, genotoxicity, breast cancer
Estrogens affect the rate of cell division and thus manifest their effect on the risk of breast cancer by causing
proliferation of breast epithelial cells. The cumulative exposure of this hormone can result in combinations of
genotoxic and epigenetic mechanisms in the formation of micronuclei (MN), with subsequent chromosomal
damage. The MN frequency in Peripheral Blood Lymphocyte (PBL) is a predictive biomarker of cancer risk
and data has suggests that elevated MN frequency may be linked with breast cancer risk. In this study we
evaluate the frequency of MN in PBL of normal rats and in standing estrus. Twenty Winstar-Hannover
rats were divided into Group I (n = 10, normal rats) and Group II (n = 10; in estrus induced by continuous
administration of 1.25 mg of testosterone propionate sc on the second day of life). For data analysis was used
ANOVA test and Tukey post-test for two independent samples (p < 0.05). The mean percentage of MN, in a
thousand cells, in Group I was 1.82 ± 0.13 and in Group II was of 5.20 ± 0.23 (p<0.01). The percentage of MN
was significantly higher in PBL of rats in persistent estrus in comparison with the normal group, suggesting an
genotoxic effect of estrogen cumulative exposure in PBL of rats subjected to high levels of circulating estrogen.
Financial support: CNPq
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62
Avaliação in vitro dos efeitos citotóxicos e genotóxicos
da droga antimalárica Artemeter em linhagem celular
de neoplasia gástrica (pg100)
Alcântara, DFA1; Ribeiro, HF1; Correa, RMS1; Rocha, CAM1; Burbano, RR1; Bahia, MO1
Laboratório de Citogenética Humana,Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Antimalárico, Artemisininas, Genotoxicidade, Ensaio Cometa, MTT
Introdução: A artemisinina é uma lactona sesquiterpênica com um grupo endoperóxido, extraída de Artemisia
annua L., e extensivamente utilizada como droga antimalárica. Alguns estudos na literatura mostram um efeito
genotóxico das artemisininas, incluindo o seu derivado, artemeter, tanto em células normais quanto em células
alteradas, sendo este efeito desejável no tratamento de células neoplásicas na tentativa de impedir sua proliferação
e induzir apoptose. O câncer gástrico é a 4ª malignidade mais freqüente e responsável por 9% da incidência
mundial de câncer, sendo o segundo maior causador de morte por neoplasias, perdendo apenas para o câncer de
pulmão, sendo também relacionado às porcentagens que variam de 3 a 10% no total de mortes relacionadas às
neoplasias. Pretende-se, desta forma, compreender com este estudo as alterações celulares e genéticas provocadas
por essa droga, colaborando, assim, na geração de informações que contribuam no tratamento do câncer gástrico
Objetivo: Este trabalho visa avaliar in vitro os possíveis efeitos genotóxicos e citotóxicos do Artemeter, em cultura
de linhagem celular de neoplasia gástrica (PG100). Métodos: Para os testes de sobrevivência celular, as células
foram expostas a diferentes concentrações do Artemeter (14,92; 29,85; 59,7; 119,4; 238,8; 477,6; 955,2 µg/ml) por
24 horas. Após 48 horas do tratamento foi realizado o teste bioquímico MTT, sendo os resultados obtidos por
espectrofotometria. Para avaliação da genotoxicidade foi realizado o ensaio cometa versão alcalina. As células
foram tratadas por 4 horas com as concentrações de 29,85; 119,4 e 238,8 µg/ml de Artemeter. Ao término do
tratamento as lâminas foram confeccionadas e a corrida por eletroforese foi realizada para migração dos cometas
e posteriormente foi feita análise e contagem por microscopia de fluorescência. Resultados: O teste MTT mostrou
uma diminuição nas porcentagens de sobrevivência a partir da concentração de 14,92 µg/ml de Artemeter, sendo
esta redução estatisticamente significativa a partir da concentração de 477,6 µg/ml (22,2%), quando comparada
ao controle. O índice de dano (ID) ocasionado pelo Artemeter, avaliado pelo ensaio cometa, foi estatisticamente
significativo nas concentrações de 119,4 µg/ml (ID=1,14) e 238,8 µg/ml (ID=1,35) em relação ao controle negativo
(ID=0,5) Conclusão: O Artemeter demonstrou um efeito citotóxico e genotóxico na linhagem celular PG100, em
nossas condições experimentais, tornando-se assim um possível candidato no tratamento do câncer gástrico.
Entretanto, são necessários novos estudos que elucidem melhor a morte celular induzida por este agente.
Apoio Financeiro: UFPa/CNPq/CAPES
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63
Avaliação de potencial citotóxico do Ácido
Acetilsalicílico (AAS) em células somáticas de
Drosophila melanogaster pelo teste SMART/asa
Duarte, SR1,2; Vale, CR2; Silva, EM2; Felício, LP2; Ferreira, AKS2; Miranda, CT3; Rezende, RDF1; Macedo, VS1;
Carvalho, S2
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Iporá.
Laboratório de Mutagênese com Drosophila, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de
Goiás.
3
Faculdade de Tecnologia, Universidade de Brasília.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Ácido Acetilsalicílico, SMART, Drosophila melanogaster, citotoxicidade
O ácido acetilsalicílico (AAS) é o princípio ativo de vários fármacos, estando entre os mais utilizados por toda a
população em escala global, além de ser também utilizado de forma indireta para o tratamento de hipertensão.
Isso devido à propriedade peculiar de ser um ótimo anti-agregante plaquetário, qualidade essa só possível através
da inibição de prostaciclinas do ciclo de ciclogenase. Devido a essa ampla utilização, buscou-se analisar seu efeito
citotóxico em células somáticas de Drosophila melanogaster pelo teste SMART/asa. Foram utilizadas três linhagens:
multiple wing hair (mwh), Flare e ORR, e empregados a dois tipos de cruzamentos: o Padrão (ST) onde são cruzadas
fêmeas Flare com machos mwh; e o de alta bioativação (HB) fêmeas ORR com machos mwh. As lavras de terceiro
estágio provenientes desses dois cruzamentos foram contadas (100 larvas/tubo) e submetidas a dois tratamentos
para avaliação da citotoxicidade dos compostos empregados. Comparou-se o fármaco Aspirina, vendido livremente
nas farmácias e drogarias, com o principio ativo. As concentrações utilizadas com o fármaco aspirina foram
homólogas com a dosagem que compreendem os comprimidos, sendo a menor concentração igual ao comprimido
consumido por crianças (125; 250; 375; 500; 625; 750; 875; 1000; 1120 e 1250mg), utilizou-se como controle negativo
água destilada. As concentrações utilizadas com o princípio ativo foram: 1; 0,5; 0,33; 0,25; 0,20; 0,16; 0,14; 0,12; 0,11 e
0,1mg/ml. Nesse experimento foram empregados dois controles, um com água destilada isolada e outro com água
destilada+ Tween+etanol+sacarose a 3%, respectivamente. A curva de sobrevivência resultante do tratamento
com o extrato bruto permitiu concluir que o efeito citotóxico é evidenciado no cruzamento ST, mostrando que
possui efeito direto, e ausente no HB nas diferentes concentrações testadas. A ausência de citotoxicidade no
cruzamento HB pode ser devido às genotoxinas que foram metabolizadas antes de causarem algum efeito. Já na
curva de sobrevivência com princípio ativo não foi evidenciado citotoxicidade do ASS em relação aos solventes
Tween e etanol, apenas as doses de 1; 0,5 e 0,33 mg/ml apresentaram efeito citotóxico se comparado com a água
destilada isolada. No entanto todos os dados de sobrevivência tanto do cruzamento ST como HB foram superiores
ao encontrado na água, portanto verificando que não houve efeito citotóxico do princípio ativo.
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Influência da variação da temperatura sobre a
formação de micronúcleos em células-mãe de pólen
em Tradescantia pallida cv. purpurea utilizada como
bioindicadora
Barbosa, MD1; Endres, DJ1; Sasamori, MH1; Schmitt, JL2; Droste, A1
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental, Universidade Feevale
Laboratório de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental, Universidade Feevale.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: temperatura, bioindicação, Tradescantia pallida cv purpurea, Trad-MCN e genotoxicidade
Tradescantia é uma planta bioindicadora de qualidade ambiental por meio da detecção de efeitos genotóxicos
em células-mãe de pólen. O teste de micronúcleos em Tradescantia (Trad-MCN) é considerado uma valiosa
ferramenta pela simplicidade da metodologia e sensibilidade desta planta aos agentes genotóxicos. Fatores
abióticos, como condições climáticas às quais as plantas são expostas durante as amostragens, podem influenciar
na resposta e alterar a frequência de micronúcleos. Por outro lado, a maioria dos estudos não leva tais fatores
em consideração. O objetivo do presente trabalho foi verificar se há influência de variações da temperatura
sobre a frequência de micronúcleos em Tradescantia pallida cv. purpurea. Plantas da espécie foram cultivadas
em vasos em ambiente externo com intensa circulação de ar. Talos com inflorescências jovens foram coletados
e colocados em vidros contendo água destilada, conforme metodologia usada rotineiramente para amostragem
da genotoxicidade do ambiente. Os talos foram mantidos em câmaras de germinação do tipo BOD em simulação
às variações de temperatura de um dia de cada uma das quatro estações do ano do local de estudo. A simulação
das variações de temperatura de um dia de primavera (12°C - 28oC, fotoperíodo de 12h luz) e um dia de verão
(27°C - 38°C, fotoperíodo de 14h luz) foram realizadas em março de 2010. A simulação de um dia de outono
(12°C - 20°C, fotoperíodo de 12h luz) e um dia de inverno (6°C - 14°C; fotoperíodo de 11h luz) ocorreu em maio de
2010. Foi realizado ainda um experimento com temperatura constante de 26°C e fotoperíodo de 12h, condições
normalmente utilizadas para os experimentos em laboratório. A frequência de micronúcleos (MCN/100 tétrades)
foi estimada a partir da contagem de micronúcleos em 300 tétrades em um total de 10 lâminas por simulação.
As frequências médias foram comparadas por análise de variância (ANOVA) ao nível de significância de 5%, por
meio do programa SPSS versão 15.0. As simulações de um dia de primavera, de verão, de outono e de inverno,
apresentaram, respectivamente, frequências médias de 1,16, 0,73, 0,70 e 1,00 micronúcleos. Em temperatura
constante de 26°C, foi obtida uma frequência média de 0,96 micronúcleos. Não houve efeito de variações de
temperatura sobre os resultados do bioensaio, uma vez que as frequências médias de micronúcleos das cinco
simulações não apresentaram diferenças significativas (F= 0.65; p= 0.62) o que corrobora a confiabilidade do
teste Trad-MCN como indicador da genotoxicidade do ambiente, independente da temperatura de exposição.
Apoio financeiro: Feevale.
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Teste de Micronúcleo aplicado ao biomonitoramento
dos efeitos genotóxicos do larvicida Diflubenzuron em
Poecilia vivipara
Costa, DAX; Moreira-Neto, JF; Brandeburgo, MAM
Laboratório de Genética e Biomonitoramento, Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
Palavras-chave: Diflubenzuron, Poecilia vivipara, Micronúcleo, Biomonitoramento, Larvicida
Introdução: Várias populações de Aedes aegypti, vetor da dengue e da febre amarela urbana, apresentam
resistência aos inseticidas clássicos utilizados em seu controle, tornando necessária a aplicação de novos agentes
químicos para evitar epidemias nos centros urbanos. O diflubenzuron é um novo inseticida recomendado
recentemente pela OMS para o controle de larvas do vetor em água potável. Trata-se de um larvicida regulador,
que inibe a formação da cutícula das larvas, impedindo seu desenvolvimento. Ao atingir os ambientes aquáticos,
os larvicidas atingem os peixes, predadores naturais das larvas de A. aegypti, que são particularmente sensíveis
a esse tipo de composto. Métodos: Os efeitos foram avaliados por meio do Teste de Micronúcleo em peixes da
espécie Poecilia vivipara nos tratamentos de curta (96 h) e de longa (28 dias) duração expostos ao larvicida
Diflubenzuron. Resultados: O Teste de Micronúcleo revelou não haver diferenças entre as taxas de micronúcleos
dos grupos controle (não expostos ao Diflubenzuron) e Tratados (expostos ao Diflubenzuron) tanto nos
tratamentos de curta, quanto nos de longa duração (para o tratamento de curta duração, F= 0.8756, P= 0,53;
para o tratamento de longa duração, F= 0.6718, P= 0.69). Conclusão: Os resultados do Teste de Micronúcleo
revelaram que o Diflubenzuron não apresentou efeito clastogênico nas condições utilizadas no experimento.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq e UFU.
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Efeito da exposição ao herbicida atrazina sobre
a expressão de genes de conexinas em modelo
experimental
Spatti, EF1; Pereira, FDC1; Severi-Aguiar, GDC1; Pigoso, AA2; Silva-Zacarin, ECM4; Barbieri, RA3; Oliveira, CA1
Programa de Pós-graduação em Ciências Biomédicas, Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS, Araras, SP
Laboratório de Bioquímica, Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS, Araras, SP
3
Laboratório de Micromorfologia, Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS, Araras, SP
4
Universidade Estadual de São Carlos - UFSCAR, Sorocaba, SP.
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: atrazina, conexinas, expressão gênica, RT-PCR semi quantitativa
A atrazina é um herbicida utilizado para controlar o crescimento de ervas daninhas em uma grande variedade de
culturas, podendo persistir no ambiente e ser frequentemente encontrado em águas superficiais e subterrâneas.
Organismos multicelulares apresentam diferentes mecanismos de comunicação intercelular. As conexinas
pertencem a uma família de proteínas transmembrânicas que mediam a transferência direta de metabólitos entre
células adjacentes. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão dos genes das conexinas 26 (GJB2), 32 (GJB1)
e 43 (GJA1) sob o efeito da atrazina, em doses subletais, em fígado de ratos Wistar machos. Foram utilizados
10 animais – 5 controles, que receberam apenas água e 5 experimentais, que receberam solução aquosa de
atrazina (400mg/kg/dia), por um período de 14 dias. Ao fim deste período, os animais foram anestesiados e
tiveram seus fígados removidos. O RNA total foi extraído do tecido utilizando-se o reagente TRIZOL®, a partir
do qual sintetizou-se cDNA, o qual foi utilizado para o estudo da expressão gênica por RT-PCR na presença de
primers específicos. Após a análise densitométrica pelo Software Scion Image, nossos resultados demostraram
que os níveis de expressão dos genes GJB2, GJB1 e GJA1, quando normalizados com o gene da β-actina, nos
animais tratados com atrazina foram significativamente maiores (média GJB2= 2,18 ± 0,017; GJB1= 2,47 ± 0,039;
GJA1= 2,19 ± 0,028), quando comparados com os animais do grupo controle (média GJB2= 0,94 ±0,545; GJB1=
1,28 ±0,612; GJA1= 0,99 ±0,546), com p<0,05. Essa expressão aumentada provavelmente reflete uma resposta das
membranas dos hepatócitos à injúria provocada pela ingestão do herbicida que induz modificações nas mesmas.
Possivelmente, tal aumento se deva a um mecanismo compensatório, uma vez que as conexinas são as principais
reguladoras de homeostase na comunicação celular. Contudo, os canais quando estimulados, por exemplo, por
hormônios, respondem com sucessivas ondas de Ca+2 que se propagam pelo tecido, o que nos leva a relacionar as
conexinas com o sinalizador cálcio. No caso do tratamento realizado, dois mecanismos poderiam ser responsáveis
por desencadear a abertura dos canais de Ca+2: o peróxido de hidrogênio (H2O2), que é capaz de aumentar as
concentrações de Ca+2 intracelular e o fato da atrazina ter grande capacidade de bioacumulação, o que impede
sua excreção e favorece sua interação com as biomembranas. Esses dois eventos foram verificados observandose níveis aumentados de catalase nos animais tratados com esse herbicida sugerindo aumento na produção de
H2O2 e MDA (malondialdeído), o que reflete peroxidação lipídica e alterações nas membranas dos hepatócitos.
Assim concluiu-se que o aumento dos níveis de expressão das conexinas hepáticas estudadas, provavelmente está
correlacionado a elevação nos níveis de cálcio intracelular, induzido pelo estresse oxidativo provocado pela atrazina,
que gera uma resposta de degeneração tecidual e morte celular, comprovando a hepatotoxicidade desse herbicida.
Apoio financeiro: PIBIC/CNPq e UNIARARAS.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Avaliação dos efeitos genotóxicos em Poecilia vivípara
após exposição ao inseticida Cipermetrina
Moreira-Neto, JF; Costa, DAX; Luiz, DP; Amaral, IMR; Faria, RCB; Jacob, GCORP; Kerr, WE; Brandeburgo, MAM
Laboratório de Genética e Biomonitoramento, Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
Palavras-chave: Cipermetrina, Poecilia vivipara, Teste do Cometa, Biomonitoramento, Efeito Genotóxico
Introdução: As estratégias de controle do principal vetor da dengue, Aedes aegypti estão baseadas na utilização
de produtos químicos e biológicos integrados com programas de manejo ambiental. Os programas públicos que
visam controlar o mosquito e baseiam-se no uso de inseticidas industrializados, onde se destaca o piretróide
cipermetrina utilizado no controle de adultos de Aedes. Ao atingir os ambientes aquáticos, os inseticidas afetam
os organismos alvo e não alvo, alterando a estrutura dos ecossistemas, matando, inclusive, os predadores naturais
das larvas de A. aegypti. Os piretróides são compostos que atuam como neurotóxicos, causando hiperestimulação
do sistema nervoso devido ao bloqueio que exerce nos canais de sódio. O desenvolvimento de Biomarcadores
baseados em respostas biológicas de organismos tratados com poluentes vem sendo amplamente utilizado para
monitorar os efeitos da exposição a contaminantes. O Teste do Cometa detecta graus de degradação do ácido
desoxirribonucléico e é uma técnica simples e freqüentemente utilizada para monitorar os efeitos causados
no ADN, revelando ser uma importante técnica para determinar o potencial genotóxico de agentes químicos
poluidores. Métodos: Os efeitos foram avaliados por meio do Teste do Cometa em peixes da espécie Poecilia
vivipara expostos ao inseticida nos intervalos de 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias. Resultados: O Teste do Cometa revelou
diferenças significativas (p<0,0001) entre os scores dos grupos controle e tratado. Conclusão: Os resultados do Teste
do Cometa revelaram que a Cipermetrina apresentou efeito genotóxico nas condições utilizadas no experimento.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq e UFU.
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Avaliação mutagênica de trabalhadores expostos a
agrotóxicos em municípios do Piauí
Gomes, DCV1; Souza, APC1; Carvalho, RM1; Leite, AS2; Júnior, DMR3; Rodrigues, VRCB4; Berrêdo, RHG5;
Moraes, MEA6; Cavalcante, AACM1,3,5; Chaves, TVS1,4,7
Faculdade de Saúde Ciências Humanas e Tecnológicas do Piauí - NOVAFAPI
Faculdade CET
3
Universidade Federal do Piauí – UFPI
4
Secretaria Estadual de Saúde - Centro de Referência em Saúde do Trabalhador, Teresina-PI
5
Secretaria Estadual de Saúde - Laboratório Central do Piauí (LANCEN)
6
Universidade Federal do Ceará-UFC
7
Secretaria Estadual de Saúde - Diretoria de Vigilância Sanitária do Piauí.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pesticidas, mutagenicidade, aberrações cromossômicas, micronúcleo, instabilidade genética
Os agrotóxicos constituem uma mistura complexa de substâncias químicas, que são utilizadas no controle de pragas
que atacam plantações e contra vetores de doenças. O objetivo deste estudo foi a avaliação de riscos ocupacionais
de agricultores expostos às misturas complexas de pesticidas com o uso dos testes de micronúcleos e aberrações
cromossômicas, como biomarcadores citogenéticos. O grupo teste foi formado por 67 agricultores expostos às
misturas complexas de pesticidas no Piauí, enquanto o grupo controle foi formado por 55 indivíduos não expostos.
O teste de micronúcleo foi realizado em células esfoliadas da mucosa oral. As células foram colocadas em solução
tampão para centrifugação. As lâminas foram preparadas com cerca de 100 μl da suspensão de células. Após secas,
realizou-se a fixação com metanol:ácido acético (3:1) e a coloração com Giemsa a 10%. Foram contadas cerca de
2.000 células para cada indivíduo. O teste de aberrações cromossômicas foi realizado através de punção venosa
de 5 mL de sangue periférico. Foram adicionadas 18 gotas do sangue em culturas de meio RPMI, para estimular a
divisão celular. As culturas foram incubadas em estufa a 37 ºC por 72 horas. Adicionou-se colchicina 2 horas antes
de completar 48 horas de incubação para obtenção de células em metáfase. Após as 72 horas de incubação, a
cultura de linfócitos foi transferida para tubos falcon e centrifugada a 800 rpm por 5 minutos, fazendo uma lavagem
com solução hipotônica para rompimento das membranas celulares. A lâminas foram preparadas e fixadas em
metanol: ácido acético (3:1) e coradas com Giemsa 10%. Os resultados mostraram um aumento significativo
(P<0,0001) no número de micronúcleos (5,11 ± 3,11 X 0,85 ± 0,01) e de aberrações cromossômicas (3,23 ± X 0,72
± 0,10) nos indivíduos expostos, em relação aos não expostos. Anormalidades nucleares tais como cariorrexe,
cariólise e células binucleadas também foram significantemente (P<0, 0001) aumentadas no grupo exposto aos
pesticidas. Não houve correlações positivas entre fumo e etilismo com os biomarcadores citogenéticos. Os tipos
de aberrações cromossômicas mais encontradas no grupo exposto foram cromossomos dicêntricos, tricêntricos,
deleções terminais e anéis cromossômicos. Esses dados sugerem que os trabalhadores expostos aos pesticidas
apresentam instabilidade genética, sendo os testes citogenéticos em foco, excelentes para o biomonitoramento
ocupacional, visando a prevenção de doenças genéticas, incluindo o câncer.
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69
Teste do Cometa como biomarcador dos efeitos
genotóxicos do larvicida Temefós
Giannecchini, FF; Moreira-Neto, JF; Costa, DAX; Brandeburgo, MAM
Laboratório de Genética e Biomonitoramento, Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
Palavras-chave: Temefós, Poecilia vivipara, Teste do Cometa, Biomonitoramento, Efeito Genotóxico
Introdução: O controle do Aedes aegypti, principal vetor da dengue, se baseia na utilização de produtos químicos
e biológicos integrados com programas de manejo ambiental. Os programas públicos que visam controlar o
mosquito e baseiam-se no uso de inseticidas industrializados, onde se destaca o organofosforado Temefós,
utilizado no controle de larvas de Aedes. Ao atingir os ambientes aquáticos, os inseticidas afetam os organismos
alvo e não alvo, alterando a estrutura dos ecossistemas, matando, inclusive, os predadores naturais das larvas
de A. aegypti. Os principais efeitos causados pelos organofosforados estão relacionados, primeiramente, à
inibição da acetilcolinesterase, uma importante enzima do sistema nervoso que, quando inibida, provoca
acúmulo de acetilcolina nas sinapses com consequente colapso do sistema nervoso, resultando na morte do
organismo contaminado. Os efeitos secundários, porém muito relevantes, são resultantes da genotoxicidade dos
organofosforados. O efeito genotóxico é causado por lesões no ADN, incluindo quebras, bases modificadas e eventos
de perdas de cromossomos durante a divisão celular. O desenvolvimento de Biomarcadores baseados em respostas
biológicas de organismos tratados com poluentes vem sendo amplamente utilizado para monitorar os efeitos
da exposição a contaminantes. O Teste do Cometa detecta graus de degradação do ácido desoxirribonucléico
e é uma técnica simples e freqüentemente utilizada para monitorar os efeitos causados no ADN, revelando ser
uma importante técnica para determinar o potencial genotóxico de agentes químicos poluidores. Métodos: Os
efeitos foram avaliados por meio do Teste do Cometa em peixes da espécie Poecilia vivipara expostos ao larvicida
nos intervalos de 24, 48,72 E 96 horas. Resultados: Com a analise dos scores encontrados no Teste do Cometa
não se observou diferença significativa entre os tempos de exposição no controle negativo (P=0,47), já entre
os tempos do tratado com Temfós uma diferença significativa foi observada (P<0,0001), devido ao aumento
progressivo nos danos ao ADN dos peixes analisados. Na comparação dos resultados obtidos com o conrole
negativo e tratado também se observou uma diferença significativa (P<0,0001). Conclusão: Os resultados do Teste
do Cometa revelaram que o Temefós apresentou efeito genotóxico nas condições utilizadas no experimento.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq e UFU.
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70
Biomonitoramento da genotoxicidade da ciflutrina,
Lambda-Cialotrina e Malathion por meio de teste de
micronúcleo com Tradescantia
De Campos Júnior, EO; Pereira, BB; Luiz, DP; Moreira-Neto, JF; Morelli, S; Kerr, WE
Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
Palavras-chave: Tradescantia, biomonitoramento, piretróide, micronúcleo
O controle do mosquito Aedes aegypti, vetor da Dengue, realizado pelos programas governamentais, baseiam-se no
uso de inseticidas industrializados, dos quais se destacam os organofosforados e piretróides. Por meio da crescente
substituição dos organofosforados e organoclorados por inseticidas piretróides para controle de larvas, devido
à menor toxicidade destes substituintes, ocorre menores implicações ecológicas, associadas principalmente a
ambientes aquáticos, ou mesmo evidenciadas em bioindicadores, como a tradescantia. Já para controle de formas
adultas é utilizado continuamente o organofosforado Malathion. Ao atingir o ambiente, os inseticidas afetam
os organismos alvo e não alvo, alterando a estrutura dos ecossistemas. Biomarcadores baseados em respostas
biológicas de organismos tratados com poluentes vem sendo amplamente aplicados para monitorar os efeitos de
contaminantes (GARCIA et al., 2000). Este estudo objetivou avaliar o potencial genotóxico dos piretróides Ciflutrina
e Lambda- Cialotrina e do organofosforado Malathion, por meio do Teste de Micronúcleos com Tradescantia. As
plantas foram expostas a oito concentrações diferentes de cada inseticida separadamente durante um período
de 48 horas. Grupos não expostos aos inseticidas (não Controle) também foram avaliados. Vinte inflorescências
jovens de Tradescantia pallida de cada grupo foram coletadas, e um total de 300 tétrades por lâmina foi analisado
(Ma, et al., 1995). As freqüências de micronúcleos foram expressas como o número de micronúcleos por cem
tétrades. Foram considerados como micronúcleos, fragmentos circulares com cerca de um quinto do tamanho
do núcleo principal, mesma coloração e isolados deste. Não houve diferença significativa entre controle e tratados
com Lambda-Cialotrina (ANOVA, Tukey; p= 22,83), também não houve diferença significativa no entre controle e
tratados com Ciflutrina (ANOVA, Tukey; p= 23,91). Os resultados implicaram que houve incremento significativo
na taxa de micronúcleos após a exposição das plantas ao Malathion (ANOVA, Tukey; p< 0, 001). Foi constatada
uma correlação positiva entre a frequência média de micronúcleos e a concentração de Malathion (r = 0,9881; p<
0, 001). O efeito genotóxico do Malathion pode ser explicado pela ocorrência de lesões no DNA, incluindo quebras,
bases modificadas e eventos de perdas de cromossomos durante a divisão celular (KIRSCH-VOLDERS et al., 2003).
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG e UFU.
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71
Avaliação do efeito citotóxico do defensivo agrícola
glifosato em células somáticas de Drosophila
melanogaster pelo teste SMART/asa
Felício, LP1; Miranda, CT2; Silva, EM1; Ferreira, AKS3; Duarte, SR3; Vale, CR1; Souza-Filho, J4; SabóiaMorais, SMT4; Silva, CC5; Carvalho, S1
Laboratório de mutagênese com Drosophila, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Goiânia-GO
2
Faculdade de Tecnologia, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil
3
Universidade Estadual de Goiás
4
Laboratório de comportamento celular, Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia-GO
5
REPLICON, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia-GO.
[email protected]
1
Palavras-chave: Citotoxicidade, glifosato, herbicida, Drosophila melanogaster, SMART/asa
Os glifosatos [N-( fosfonometil) glicina] são os defensivos agrícolas mais utilizados no mundo para o controle
de plantas indesejadas em grandes monoculturas. Pertencentes ao grupo químico das glicinas substituídas, age
impedindo a síntese da enzima 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPs), bloqueando assim, a produção
de aminoácidos aromáticos, o que leva à morte do vegetal-alvo. A preocupação com o uso excessivo dos glifosatos
não se deve apenas ao fato do grande avanço que estes herbicidas, de forma indireta, causam sobre o aumento na
utilização de vegetais transgênicos, mas também pelos efeitos que estes defensivos agrícolas podem trazer aos
demais seres vivos do ecossistema. Tendo em vista que os produtos químicos existentes nos herbicidas podem
ser os responsáveis por inúmeras alterações no funcionamento do organismo, bem como desencadear doenças
ou desordens múltiplas, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial citotóxico do glifosato, em oito diferentes
concentrações (1,41; 2,82; 4,23; 5,65; 7,06; 8,47, 9,88; 11,3 µL/L). Para este propósito, foi empregado o teste de mutação
somática e recombinação (SMART/asa), utilizando-se como organismo modelo a Drosophila melanogaster. Foram
utilizados o cruzamento padrão (ST) e o de alta bioativação metabólica (HB), nos quais exatamente 100 larvas de
terceiro estágio/dose/cruzamento foram tratadas com o glifosato isoladamente. Após sete dias da exposição, os
indivíduos adultos emergentes foram sacrificados e contados para o estabelecimento de uma DL50. Um controle
negativo (água destilada) foi incluído em ambos experimentos. As doses utilizadas, foram estabelecidas mediante
uma correlação de massa entre os valores determinados pela própria empresa fabricante para a toxicidade aguda
em ratos (5000 mg/kg) e a massa da Drosophila melanogaster. Comparando-se os valores encontrados no número
de sobreviventes em todas as doses testada com o respectivo controle negativo, não se observou grandes alterações
no número de indivíduos emergentes em todas as doses analisadas, tanto para ST quanto para HB, evidenciando,
nestas condições experimentais, a inexistência de efeito citotóxico por parte do defensivo agrícola para as células
somáticas de Drosophila melanogaster, mesmo quando administrado em concentrações maiores, determinada pela
correlação de massa, do que a dose que gera toxicidade aguda encontrada para ratos. Entretanto, novos estudos
são necessários para determinar se o uso dos glifosatos não acarreta riscos à saúde humana e demais seres vivos
do ecossistema.
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Toxicidade de temefós sobre o crescimento e esterase
de Scenedesmus quadricauda
Luiz, DP; Pereira, BB; de Campos, EO; Amaral, IMR; Moreira-Neto, JF; Almeida FC; Faria, RCB; Silva, RP;
Brandeburgo, MAM
Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: Temefós, Esterase, Scenedesmus, Alga, Organofosforado
O aumento de técnicas de combate a praga da agricultura, tem se intensificado o uso de pesticidas, inclusive os
de compostos organofosforados, estes agrotóxicos lançados em ambientes aquáticos provocam um significativo
impacto ambiental. Neste estudo, o potencial toxicológico destes pesticidas foram testados em algas da espécie
Scendesmus quadricauda, espécie de alga facilmente encontrada no ambiente aquática Brasileiro, utilizandose o Teste de Esterase e o cálculo de crescimento populacional. Um total de 260 algas foram analisadas em
concentrações diferentes de organofosforados. A atividade esterásica foi quantificada e comparada com o
grupo controle de algas, A taxa de crescimento populacional foi calculado após 1 e 2 semanas de recuperação
para as culturas de algas testadas, assim podendo ser observada uma significativa baixa na taxa de crescimento
populacional entre estes grupos. Uma significante diferença de atividade esterásica entre o grupo teste e o controle
foi encontrado (p< 0,05). Os testes revelaram a alga Scenedesmus quadricauda como um importante biomarcador.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG
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73
Avaliação do Potencial Genotóxico do herbicida
dimetilamina em linfócitos T humanos
Silva, LR1; Machado, LR1; Alvarenga, MV1; de Abreu, JB1; Silva, CC1,2; da cruz, AD1,2
Núcleo de pesquisas Replicon do departamento de biologia da Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Lagene- laboratório de citogenética humana e genética molecular-vinculado ao Lacen- laboratório de Saúde Publica Dr.Giovanni
Cysneiros- Secretaria de saúde do estado de Goiás.
[email protected] [email protected]
1
2
Palavras-chave: Carcinogênese,mutagênese,agrotóxicos,agricultura,teste cometa
O homem desde o início da civilização tem se esforçado em modificar o ambiente para aumentar sua produtividade,
mas foi a partir da mecanização que a evolução da agricultura começou a se tornar realidade através da introdução
de fertilizantes, defensivos agrícolas e outros insumos. O uso indiscriminado de agrotóxicos trouxe uma série de
problemas ambientais e humanos, onde as populações expostas apresentam um maior risco de carcinogênese
devido à exposição a estes agentes químicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ação mutagênica
do herbicida dimetilamina (DMA® BR) em linfócitos T humanos, utilizando o ensaio cometa. Foram analisadas,
100 células por tratamento e classificadas visualmente, sob microscopia de epifluorescência, em quatro classes:
sem danos – classe 0; até dano máximo – classe 3. O ensaio cometa mostrou-se um teste rápido e sensível na
quantificação de lesões e detecção de defeitos no sistema de reparo no DNA. O tratamento revelou atividade
mutagênica com aumento crescente no índice de dano genômico, à medida que as concentrações do herbicida
vão aumentando. Nas concentrações 1476x104µg/L, 1476x102µg/L e 1476µg/L foi encontrada significância
estatística pelo teste t caracterizando um aumento nos danos genômicos de linfócitos T expostos ao herbicida
testado. Enquanto que nas concentrações 738µg/L, 70µg/L e 30µ/L não foram observados danos genômicos com
significância estatística, quando comparadas com o grupo controle. No entanto, é importante que outros testes
capazes de avaliar a mutagenicidade sejam realizados, utilizando concentrações diferentes, a fim de comprovar os
danos genômicos em células expostas ao herbicida testado.
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74
Estudos genotóxicos, bioquímicos e hematológicos em
agricultores envolvidos com manejo de pesticidas no
Piauí, Brasil
Carvalho, RM1; Gomes, DCV1; Souza, APC1; Leite, AS2; Júnior, DMR3; Rodrigues,VRCB4; Berrêdo, RHG5;
Moraes, MEA6; Cavalcante, AACM1,3,5; Chaves, TVS1,4,7
Faculdade de Saúde Ciências Humanas e Tecnológicas do Piauí – NOVAFAPI
Faculdade CET
3
Universidade Federal do Piauí – UFPI
4
Secretaria Estadual de Saúde - Centro de Referência em Saúde do Trabalhador, Teresina-PI
5
Secretaria Estadual de Saúde - Laboratório Central do Piauí (LANCEN)
6
Universidade Federal do Ceará-UFC
7
Secretaria Estadual de Saúde - Diretoria de Vigilância Sanitária do Piauí
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Genotoxicidade, pesticidas, risco ocupacional, câncer, marcadores bioquímicos
No Brasil, a cada ano, aumenta o uso de defensivos agrícolas em suas lavouras. Estes carregam consigo potencial
de gerar danos de natureza aguda ou crônica ao ser humano. Os pólos agrícolas no estado do Piauí também
aderiram ao uso de pesticidas, destarte é inerente a preocupação com possíveis intoxicações ou aparição de casos
mais grave como câncer. No monitoramento das populações agrícolas envolvidas com pesticidas a avaliação
genotóxica foi realizada em células esfoliadas de mucosa bucal, pelo ensaio cometa na versão alcalina. Marcadores
bioquímicos e hematológicos também foram empregados para avaliação do estado de intoxicação. Foram testados
dois grupos: 67 expostos e 55 não expostos a pesticidas. Para todos os indivíduos foram avaliadas 100 células
quando ao índice de danos (0-400), freqüência (0-100 %) e as classes de danos (0-4). Aumentos significantes
(p<0,0001) foram evidenciados no índice de danos (54,24 ± 4,02 X 12,51 ± 1,03) e na freqüência de danos (33,33 ±
2,04 X 9,98 ± 0,63) dos grupos expostos, quando comparado com o controle. Dentre os marcadores bioquímicos
diferenças significantes (p<0,001 e p<0,05) foram evidenciadas para uréia, fosfatase alcalina, butirilcolinesterase,
transaminase glutâmica oxalacética. Significantes (p < 0,05) correlações positivas entre os danos ao DNA com
idade e biomarcadores hematológicos e bioquímicos (uréia, leucócitos) foram evidenciadas. Significante (p<0,01)
correlação negativa foi encontrada entre danos ao DNA e consumo de vegetais. Nenhuma correlação foi percebida
entre os marcadores de genotoxidade e tabagismo ou etilismo. Os agricultores do Piauí apresentam intoxicações
por agentes anticolinesterásicos. A genotoxicidade observada pode ainda ser alterada, devido aos mecanismos
de reparo. Assim sugere-se o biomonitoramento das dosagens de enzimas e análises da genotoxicidade, com os
biomarcadores usados, pela sua sensibilidade e eficácia, visando à saúde ocupacional de agricultores rurais do
Piauí, incluindo a avaliação de riscos para o desenvolvimento de neoplasias.
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Biomonitoramento ocupacional de trabalhadores de
curtume expostos substâncias químicas contendo
cromo III pela avaliação de danos ao DNA através do
teste cometa em linfócitos
Lemos, SIA2, 6; Santos, RVSG 2, 6; Amaral, EJLS1,3,5; Chaves, TVS1; Rodrigues, VRCB 1,4 ; Leite, AS4; Berredo,
RHG1,2; Melo-Cavalcante, AC1,2; Moraes, MEA5; Moraes, MO 5; Amaral, FPM1,2,3,5
Secretaria de Saúde do Estado do Piauí/Vigilância Sanitária do Piauí/Centro de Referência em Saúde do Trabalhador
Labaratório de Genética Toxicológica do Laboratório Central de Saúde do Piauí
3
Faculdade Integral Diferencial FACID
4
Programa de Pós-graduação da Rede de Biotecnologia do Nordeste (RENORBIO)
5
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará
6
Faculdade Aliança.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Biomonitoramento, Danos ao DNA, Teste cometa, Cromo III, Curtume
O biomonitoramento de populações expostas a químicos é importante para a avaliação de riscos ao câncer. Os
metais induzem efeitos na saúde humana tais como intoxicações, alterações no sistema imunológico, nervoso,
endócrino, reprodutivo e danos ao DNA. O presente estudo avaliou, através do teste cometa, danos ao DNA em
linfócitos de sangue periférico de trabalhadores de curtume do município de Teresina - Piauí, expostos a misturas
complexas contendo cromo III. Um total de 46 trabalhadores de curtume e 46 trabalhadores administrativos (grupo
controle) foram avaliados quanto aos danos ao DNA. As células foram obtidas após coletada de sangue periférico,
sendo em seguida embebidas em gel de agarose e depois lisadas e submetidas à eletroforese, neutralização, fixação
e coloração, com nitrato de prata. Para cada sujeito foram analisadas 100 células quanto ao índice de danos (0 –
400), freqüência de danos (%) e classes de danos enumerados de 0 (nenhum dano observado) a 4 (danos severos). O
teste cometa em células sangüíneas mostraram aumentos significantes (P< 0,0001) no índice de danos em células
dos trabalhadores de curtume expostos a misturas complexas contendo cromo III em relação ao grupo controle
(49,13 ± 2,278 X 10,98 ± 0,568). De forma similar, aumentos significativos (P< 0,0001) também foram observados
para a freqüência de danos em células dos trabalhadores expostos em relação aos não expostos (52,60 ± 2,285 X
9,80 ± 0,05). Na análise dos possíveis fatores de influência nos danos observados foram verificadas correlações
positivas entre idade, uso de EPIs, tempo de exposição e carga horária semanal, mas em relação hábito de fumar
e consumo de bebidas alcoólicas não foram observadas correlações com os danos decorrentes da exposição a
misturas complexas contendo cromo III. Os resultados sugerem que os trabalhadores de curtume possuem danos
no seu material genético, sendo um importante indicativo de maior suscetibilidade ao câncer e de danos que
podem ainda ser reparados. Além disso, o teste cometa demonstrou ser uma importante e confiável ferramenta
para biomonitoramento de populações expostas ocupacionalmente a agentes mutagênicos.
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Avaliação do efeito da exposição a hidrocarbonetos em
Atendentes de Postos de Gasolina em postos na cidade
de Porto Alegre/RS
da Rosa, JCF1; Fiegenbaum, M1,2; Cardoso, VV1
1-Laboratório de Genotoxicidade, Toxicologia e Biologia Molecular - Centro Universitário Metodista do IPA, Porto Alegre - RS.
2-Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre - RS.
Palavras-chave: micronúcleos, alterações nucleares, células da mucosa oral, BTEX
O acúmulo de alterações no material genético celular depende de vários fatores endógenos, sexo, idade e
constituição genética, e exógenos, como hábitos de consumo, alimentação, uso de medicamentos, exposição a
agentes químicos, etc. Estudos demonstram que os derivados de petróleo como a gasolina, através da volatilização
do hidrocarbonetos aromáticos, em particular benzeno, tolueno, etilbenzeno e os isômeros do xileno (BTEX),
são capazes de induzir alterações genéticas e morte celular. Vários marcadores biológicos têm sido utilizados
para ajudar no diagnóstico de doenças bem como avaliar os riscos ocupacionais. Para constatar e quantificar
estas alterações, este trabalho avalia o potencial mutagênico através de marcadores (teste de micronúcleos
(MN) e alterações morfológicas nucleares como cariorrexes, buds, broken-eggs e células binucleadas) nas células
esfoliadas da mucosa oral de 34 atendentes de postos de gasolina da cidade de Porto Alegre comparando estes
resultados com um grupo controle de indivíduos não expostos (n=34). As lâminas obtidas a partir da raspagem
foram coradas pela técnica de Feulgen e as análises foram realizadas em microscópio binocular sendo analisadas 2000
células em cada lâmina. Os resultados demonstram um aumento em relação ao número de MN das alterações
nucleares principalmente o aparecimento de celulas binucleadas nos atendentes dos postos em relação ao
grupo controle, demonstrando o efeito da exposição ao BTEX em atendentes em relação aos parametros
analisados. Como próximo passo experiemental estamos realizando a genotipagem da população amostrada dos
atendentes e indivíduos controles para o polimorfismo do gene CYP1A1 para investigar a possível associação
entre o polimorfismo deste gene e o aumento da suscetibilidade a agentes xenobióticos como o BTEX.
Apoio: Centro Universitário Metodista do IPA, CNPq.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Avaliação genotóxica em trabalhadores da área de
redução de alumínio, em São Luís, Maranhão
Sousa, AC1; Silva, D de A1; Moreira, VR1; Lima, MIS1; Pereira, SRF1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - Universidade Federal do Maranhão.
[email protected]
1
Palavras-chave: Genotoxicidade, Exposição ocupacional, Teste do cometa, Alumínio, Câncer
Introdução: O acúmulo de alterações no material genético da célula depende de vários fatores endógenos como
sexo, idade e constituição genética, assim como de fatores externos como hábitos de consumo, alimentação, uso de
medicamentos, exposição a químicos, entre outros. Nesse sentido, as exposições ocupacionais podem atuar como
agentes silenciosos na indução de danos no DNA, sendo crescente, por exemplo, o número de processos produtivos
que são considerados potencialmente cancerígenos. Trabalhadores da Indústria de Alumínio estão normalmente
expostos a poeiras minerais, alumina, fluoretos, fumos de soldagem e aos campos elétricos e magnéticos e não é
possível, com a tecnologia atual, isolar as substâncias presentes em misturas nas várias fases de produção ou geradas
em alguma etapa específica do processo produtivo. Assim, é considerado haver exposição a misturas químicas
complexas. Mais recentemente, o teste do Cometa, que avalia lesões no DNA de células únicas que são passíveis
de reparo, tem sido incorporado na avaliação de populações ocupacionalmente expostas. Objetivos: Investigar
a ocorrência de danos ao DNA de trabalhadores ocupacionalmente expostos a área de redução do alumínio em
indústria localizada na cidade de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Métodos: Os trabalhadores responderam
a um questionário sobre os hábitos de vida e tempo de trabalho na área de redução. Relacionou-se o tempo de
exposição e a ocorrência de danos genéticos. Pelo teste do cometa foram analisados 100 nucleóides por indivíduo,
sendo calculado o escore de danos a partir da distribuição das suas diferentes classes (0 a 4) de acordo com o
grau de dano. Resultados: Os resultados revelaram diferença altamente significativa entre os grupos expostos e o
controle negativo. Por outro lado, não houve diferença significativa entre os escores de danos dos grupos expostos
de acordo com o tempo de exposição. Conclusões: Este trabalho mostra que, apesar do uso do equipamento de
proteção individual mencionado pelos trabalhadores da área de redução de alumínio, há uma maior ocorrência de
danos ao material genético nesses trabalhadores, o que pode elevar o risco de desenvolvimento de câncer.
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78
Análises mutagênicas de anfíbios anuros em áreas de
mineração de níquel no bioma Cerrado do estado de Goiás
Gonçalves, MW1 ; Sousa, CCN1; Carvalho, WF1 ; Oliveira, HHP1; Aguiar, RCS1; Ferreira, INM1; Silva, DM1;
Bastos, RP2; Da Cruz, AD1.
Núcleo de Pesquisas Replicon – Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Universidade Federal de Goiás.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: micronúcleo, mutagenicidade, bioindicadores, anfíbios anuros
O estado de Goiás possui 74% das reservas de níquel brasileiras, constituindo em um dos pilares do desenvolvimento
industrial extrativista mineral e da siderurgia nacional. A maior parte desta reserva se encontra no pólo mínerometalúrgico de Niquelândia-Barro Alto, cujas extrações iniciaram-se a partir de 1980. A exposição ao metal níquel
e seus compostos solúveis não deve superar aos 0,05 mg/cm³, medidos em níveis de níquel equivalente para uma
exposição laboral de 8 horas diárias e 40 horas semanais. O níquel tetracarbonilo (Ni(CO)4), gerado durante o
processo de obtenção do metal, é um gás extremamente tóxico. Para se avaliar os efeitos de agentes genotóxicos
em diversas espécies animais, análises citogenéticas têm sido realizadas visando avaliar a mutagenicidade e
genotoxicidade desses compostos químicos. Dentre os ensaios mutagênicos, o teste do micronúcleo é um dos
mais utilizados, devido à simplicidade, rapidez, confiabilidade e sensibilidade. No entanto, este estudo teve como
objetivo principal o de avaliar o potencial genotóxico do ambiente no pólo mínero-metalúrgico de NiquelândiaBarro Alto, utilizando anfíbios anuros como bioindicadores, pelo teste do micronúcleo e outras alterações nucleares
eritrocitárias. Para tanto, foram coletados 26 indivíduos de anfíbios anuros, sendo: Leptodactylus ocellatus (1),
Scinax similis (2), Proceratophrys goyana (2), Dendropsophus soaresi (3), Phylomedusa azurea (2), Chiasmocleis
albopunctata (1), Trachycephalus venulosus (1), Physalaemus centralis (2), Scinax fuscovarius (6), Elachistocleis ovalis
(1), Leptodactylus sp (1), Adenomera sp. (1) e Dendropsophus cruzi (3), nos municípios de Niquelândia (20) e Barro Alto
(6). Os animais foram anestesiados por aproximadamente 2 minutos em solução de benzocaína a 5% e amostras de
sangue foram obtidas por punções cardíacas. Para os animais de pequeno porte foram obtidas suspensões celulares
pelo rompimento do fígado em solução tampão de PBS (pH 7,4). Dois esfregaços de sangue e/ou suspensão, para
cada animal, foram preparados, procedendo à fixação em etanol absoluto por 15 minutos. As lâminas foram secas
ao ar livre e em seguida coradas com Giemsa a 10% por 10 min. A freqüência de micronúcleos e outras alterações
nucleares foram determinadas em 1000 eritrócitos para cada indivíduo com a objetiva de 100X. A partir da análise das
lâminas, foram observadas quatro tipos de alterações eritrocitárias: células segmentadas (n=1), células binucleadas
(n=1), células reniformes (n=1) e 7 micronúcleos. Esta análise indica a sensibilidade desses organismos frente a
agentes genotóxicos dissolvidos no meio ambiente, os quais são bioindicadores em testes de mutagenicidade.
Apoio financeiro: Fapeg
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Genotoxicidade em tainhas como ferramenta de
diagnóstico ambiental no litoral de Pernambuco. II.
Praias de Olinda e Recife
Adam, ML1; Oliveira, RG2; Barbosa, RF2; Chagas, CA2; Freitas, EMS2; Torres, RA1
1
2
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco – CAV
Palavras-chave: Toxicidade, Micronucleo, Mugil SP, Olinda, Recife
O estado de Pernambuco (PE) apresenta a maior densidade populacional costeira (>900 hab/km2) deste país,
disposta em uma faixa de 187 km de extensão, com 21 municípios, na qual se concentram 44% da população do
estado. Os municípios de Olinda e Recife estão entre os mais populosos e as conseqüências das intervenções desta
grande concentração urbana são as constantes inadequações à utilização da área costeira para fins turísticos,
balneáveis e de pesca de subsistência. Objetivou-se testar a qualidade ambiental de duas praias de cada município
por parâmetros de genotoxicidade. Foram analisadas células de sangue periférico de espécimes de Mugil sp
quanto à presença de células micronucleadas. Foram analisadas cerca de 3000 células sanguíneas por espécime
e as médias de células micronucleadas obtidas foram comparadas com estudos similares recentes. As médias de
células micronucleadas aqui obtidas foram consideravelmente maiores daquelas observadas em outros estudos
com a mesma espécie. Os valores médios obtidos foram de 61,11 em 9 espécimes coletados na Praia Bairro Novo
(Olinda), 26,33 em 6 espécimes na Praia Rio Doce (Olinda), 30,25 em 8 espécimes na Praia de Boa Viagem (Recife) e
45,37 em 8 espécimes na Praia do Pina (Recife). Comparando-se com as médias obtidas dos estudos anteriores de
1,26 células sanguíneas para região não impactada e 3,86 células sanguíneas para região impactada e em região sob
efeito de antropização, as médias obtidas em todas as praias avaliadas sugerem um forte efeito genotóxico, uma
vez que a comparação estatística pelo Qui-Quadrado apresentou diferença significativa (p<0,05). A ANOVA e o
teste a posteriori de Tukey demonstraram diferenças significativas entre as freqüências de células micronucleadas
de cada localidade, sugerindo a praia de Bairro Novo como a mais impactada. Tais evidências indicam uma
grande influência antrópica nas praias avaliadas. Isto sugere a necessidade de ações emergenciais de manejo
dos ambientes e das populações humanas, para fins de minimização dos efeitos ambientais decorrentes desta
proeminente intervenção antrópica. Tais efeitos causam comprovadamente depleção das condições ambientais,
redução drástica da biota nativa, cujos efeitos atingem diretamente a saúde humana.
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80
Avaliação da genotoxicidade pelo ensaio cometa em
anfíbios anuros de áreas de Cerrado no estado de Goiás
Sousa, CCN1; Gonçalves, MW1 ; Carvalho, WF1 ; Oliveira, HHP1; De Miranda, CT 1; Ribeiro, CL 1; Silva, DM1;
Bastos, RP2; Da Cruz, AD1.
Núcleo de Pesquisas Replicon – Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Universidade Federal de Goiás.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Teste do cometa, genotoxicidade, bioindicadores, anfíbios anuros
Os anfíbios apresentam características sedentárias como pele permeável, ovos sem casca, ciclo de vida com
duas fases (uma terrestre e a outra aquática), além de serem importantes componentes de muitas comunidades
ecológicas, sejam consumindo uma infinidade de insetos ou servindo de presas para outros animais. Assim, por
causa de suas características ecológicas e fisiológicas, os efeitos acumulativos de agentes genotóxicos, a princípio,
devem ser mais intensos. Podendo, ser mais susceptíveis às atividades de impacto e, portanto seriam melhores
indicadores de qualidade ambiental. Entretanto, anfíbios são freqüentemente ignorados ou recebem pouca atenção
em tais programas. Este estudo teve como objetivo avaliar o potencial genotóxico do ambiente em diferentes
áreas do estado de Goiás, utilizando o teste do cometa. Para tanto, foram coletados 21 espécimes de anfíbios
anuros, sendo: Leptodactylus sp. (1), Leptodactylus ocellatus (1), Leptodactylus leptodactyloides (2), Phylomedusa
azurea (2), Hypsiboas raniceps (1), Hypsiboas albopunctatus (3), Dendropsophus minutus (4), Pseudopaludicola
sp. (2), Elachistocleis ovalis (1), Odontophrynus salvatori (1), Scinax fuscovarius (2) e Proceratophrys sp. (1), nos
municípios de Niquelândia, Barro Alto, Rio Verde, Mineiros e Jataí. Para o teste do cometa, 10 μL de sangue de cada
espécime coletado foi diluído em 1ml de tampão PBS (pH 7,4). A partir desta suspensão se retirou 10 μL que foram
embebidos em 120 μL de agarose Low Melting Point (0,5%). Essa mistura foi colocada em lâmina de microscopia
contendo uma pré-cobertura de agarose normal a 1%. Depois da solidificação em geladeira, as lâminas foram
colocadas em tampão de lise, por 24 horas. As lâminas foram então incubadas em tampão alcalino, por 30 minutos.
Procedeu-se a eletroforese por 25 minutos, a 25 volts e 300 Amps, e a alcalinidade foi neutralizada com tampão de
neutralização (pH 7,5). Finalmente, o DNA foi corado com 25 μL brometo de etídeo (10 ng/ul). Foram analisadas
duas lâminas por indivíduo, com 50 células em cada, totalizando 100 células por indivíduo. Obteve-se a classificação
visual em quatro classes, de acordo com o tamanho da cauda: sem danos – (classe 0) até danos máximos (classe
3). Foram também realizadas análises utilizando o software Comet Score v. 1.5. Dois indivíduos sendo um de
Hypsiboas albopunctatus e o outro de Hypsiboas raniceps, coletadas em áreas de lavoura nos municípios de Jataí e
Rio Verde, respectivamente, apresentaram os maiores índices de danos e freqüência de danos dentre os indivíduos
avaliados, quando comparados com outro indivíduo de Hypsiboas albopunctatus, coletado em área natural, no
município de Jataí e com um individuo de Elachistocleis ovalis, coletado no município de Niquelândia. Esta análise
nos permitiu avaliar o uso de anfíbios anuros como bioindicadores em testes de mutagenicidade ambiental.
Apoio financeiro: fapeg
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Avaliação citogenética de eritrócitos de Rana
catesbeiana sob exposição ao sulfato de cobre
Cunha, LA1; Pinheiro, RHS2; Monteiro, JAN3; Bahia, MO1; Rocha, CAM1,2
1. Laboratório de Citogenética Humana e Toxicologia Ambiental da Universidade Federal do Pará – UFPA, Belém, PA.
2. Coordenação de Recursos Pesqueiros e Agronegócio do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará – IFPA, Belém, PA.
3. Coordenação de Biologia do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará – IFPA, Belém, PA.
[email protected]
Palavras-chave: Bioensaio, Mutagênese, Rana catesbeiana, Sulfato de cobre, Teste do micronúcleo
Nas décadas recentes muitos estudos, com diferentes organismos, como moluscos bivalves, peixes e anfíbios
têm sido usados para a detecção e possível prevenção de impactos em ecossistemas aquáticos. Pesquisas sobre
biomonitoramento ambiental apontam para produção e padronização de técnicas que apresentem rapidez
e reprodutibilidade. Entre estas, destaca-se o bioensaio para detecção de micronúcleos (MN) e anormalidades
nucleares (AN) em eritrócitos. Os micronúcleos representam danos clastogênicos ou aneugênicos durante a
divisão celular. Neste trabalho, investigamos a freqüência de micronúcleos e outras anormalidades nucleares em
eritrócitos de girinos da rã-touro Rana catesbeiana, com o objetivo de avaliar os efeitos mutagênicos do CuSO4. Os
girinos, com comprimento médio de 61,98 ± 7,71 mm e peso médio de 1,66 ± 0,63 g, foram cedidos pelo ranário
Rãmazon, em Belém (PA). O ensaio foi realizado no Laboratório de Biologia Aquática do IFPA após uma semana
de aclimatação, em aquários de 15 L, com os girinos distribuídos em quatro grupos: controle negativo, não tratado;
tratado com CuSO4 1,25 x 10-6 M; tratado com CuSO4 2,5 x 10-6 M; controle positivo, exposto à ciclofosfamida 5 mg/L.
Após 48 horas de exposição, os girinos foram anestesiados com gelo por três minutos e as amostras de sangue
obtidas por punção cardíaca. Foram preparados esfregaços sanguíneos, fixados em solução de etanol absoluto e
corados com Giemsa (10%), sendo analisadas 1000 células por animal sob ampliação de 1000X. A identificação dos
micronúcleos e das alterações nucleares seguiu critérios da literatura e a análise estatística foi realizada pelo teste
One Way ANOVA seguido do teste de Bonferroni, através do software BioEstat 5.0, sendo significativos os valores
com p < 0,05. As freqüências de micronúcleos típicos foram baixas nos quatro grupos, mas as anormalidades
morfonucleares apareceram com freqüência um pouco maior. Ao serem comparadas com o controle negativo,
as freqüências de células alteradas nos tratamentos apresentaram aumento significativo. Por outro lado, não
houve diferença significativa entre os tratamentos com CuSO4, nem entre estes e o controle positivo. Conclui-se
pela confirmação do poder mutagênico do CuSO4, importância do teste do micronúcleo na avaliação de efeitos
mutagênicos e a indicação de que Rana catesbeiana é um modelo experimental adequado para o monitoramento
da poluição de ecossistemas aquáticos.
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Análise da mutagenicidade ambiental em anfíbios
anuros na região sul do estado de Goiás
Carvalho, WF1; Sousa, CCN1; Gonçalves, MW1; Oliveira, HHP1; Aguiar, RCS1; Ferreira, INM1; Silva, DM1;
Bastos, RP2; Da Cruz, AD1.
Núcleo de Pesquisas Replicon – Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Universidade Federal de Goiás.
1
2
Palavras-chave: micronúcleo, genotoxicidade, bioindicadores, anfíbios anuros
Para se avaliar os efeitos de agentes genotóxicos em diversas espécies animais, inclusive no homem, análises
citogenéticas têm sido realizadas visando avaliar a mutagenicidade e genotoxicidade desses compostos químicos.
Dentre os ensaios mutagênicos, o teste do micronúcleo é um dos mais utilizados, devido à simplicidade, rapidez,
confiabilidade e sensibilidade. O teste do micronúcleo tem se demonstrado promissor em investigações de mutagênese
ambiental, apesar de ainda ser pouco utilizado em análises de anfíbios anuros. Contudo este estudo teve como
objetivo avaliar o potencial genotóxico ambiental em diferentes áreas (natural, lavoura e pasto) na região sul do estado
de Goiás, utilizando o teste do micronúcleo e a análise de outras alterações nucleares. Para tanto, foram coletados
32 indivíduos de anfíbios anuros, sendo Rhinella scheneideri (1), Leptodactylus ocellatus (4), Pseudopaludicola saltica
(1), Scinax fuscovarius (4), Leptodactylus leptotadactyloides (2), Hypsiboas raniceps (2), Hypsiboas albopunctatus
(12), Odontophrynus salvatori (1), Dendropsophus minutus (1), Physalaeus marmoratus (1), Elachistocleis ovalis (1),
Chiasmocleis sp. (1), Pseudis bolbodactyla (1), nos municípios de Rio Verde, Mineiros, Jataí, Aporé e Seranópolis.
Em cinco municípios da região sul de Goiás. Os animais foram anestesiados por aproximadamente 2 minutos em
solução de benzocaína a 5% e amostras de sangue foram obtidas por punções cardíacas. Em anuros de pequeno
porte foram obtidas suspensões celulares pelo rompimento do fígado, em solução tampão de PBS (pH 7,4). Dois
esfregaços de sangue e/ou suspensão, para cada animal, foram preparados, procedendo à fixação em etanol absoluto
por 15 minutos. As lâminas foram secas ao ar livre e em seguida coradas com Giemsa a 10% por 10 min. A freqüência
de micronúcleos e outras alterações nucleares foram determinadas em 1000 eritrócitos para cada indivíduo com a
objetiva de 100X. A partir da análise das lâminas, foram observados três tipos de alterações eritrocitárias: células
segmentadas (n= 4), células binucleadas (n=3) e uma célula micronucleada. O número de alterações nucleares e
micronúcleos nos anfíbios da região sul de Goiás foram relativamente baixos, mas pode-se inferir que os anfíbios
anuros são importantes bioindicadores em testes de mutagenicidade, devido à alta sensibilidade de tais organismos.
Apoio financeiro: fapeg
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Avaliação do potencial mutagênico de toxinas
produzidas por Cylindrospermopsis raciborskii e
Microcystis aeruginosa isoladas nas águas do altomédio Paraíba
Diniz, DM; 1Silva, MJBA; 1Queiroga, AS; 2Barbosa, JEL; 2França, JC; 1Silva, RAC; 1Lira, WM
1
Núcleo de Mutagenêses - Laboratório de Genética - Departamento de Biologia da Universidade Estadual da Paraíba
LEAq - Laboratório de Ecologia Aquática.- Departamento de Biologia da Universidade Estadual da Paraíba
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Micronúcleo, Saxitoxina, Microcistina, Oreochromis niloticus, contaminação
A contaminação dos ecossistemas aquáticos tem acarretado diversos prejuízos ao meio ambiente e aos que
fazem uso do mesmo, por outro lado essa contaminação o torna um meio ideal para o crescimento desordenado
de microrganismos que em sua maioria produzem compostos que são tóxicos aos demais organismos. Em
diversos estados brasileiros já foi registrada a presença de cepas produtoras de toxinas em reservatórios de
abastecimento, no estado da Paraíba foi detectado a presença de algas nos reservatórios da bacia do Rio Paraíba,
especificamente cepas de Cylindrospermopsis raciborskii e Microcystis aeruginosa produtoras da saxitoxina e
microcistina, respectivamente, ambas estão associadas a intoxicações severas em humanos devido à alta afinidade
pelos hepatócitos e por constituintes do sistema nervoso central. Este estudo verificou as possíveis atividades
mutagênicas dessas toxinas através do teste de micronúcleo em tilápias (Oreochromis niloticus) oriundos de
reservatórios utilizados no abastecimento de água no estado da Paraíba. Para a realização deste trabalho foram
analisados exemplares de O. niloticus, oriundas de três reservatórios utilizados no abastecimento da população:
Acauã localizado no município de Itatuba; Camalaú e Cordeiro localizado no município do Congo, todos no estado
da Paraíba. Tratamos o grupo controle positivo com ciclofosfamida na concentração de 5mg/L e utilizamos como
controle negativo animais oriundos de criadouros ausentes de toxinas, produzimos lâminas com esfregaços do
sangue coletado e coramos com Giemsa. Em seguida analisamos 2000 eritrócitos por lâmina. Verificou-se que
os peixes apresentaram um ligeiro aumento no número de células micronucleadas, no entanto esse aumento foi
estatisticamente significativo apenas paraos exemplares provenientes do reservatório Acauã, que abastece cerca
de 20.000 pessoas no estado da Paraíba sendo de grande importância sócio-econômico Estudos mais abrangentes
estão sendo desenvolvidos para determinar as concentrações destas toxinas capazes de causar alterações no DNA.
Apoio financeiro: CNPq, UEPB
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Monitorização Citogenética no rio São Francisco (PR)
utilizando o teste do micronúcleo em Astyanax paranae
Ribeiro, DL¹; d’Arce, LPG¹
¹ Laboratório de Genética, Colegiado de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual do Oeste
do Paraná - Cascavel – PR, Brasil;
[email protected]
Palavras-chave: micronúcleo, monitoramento, Astyanax paranae;
O estado do Paraná hoje é o principal produtor agrícola do Brasil, e a sua região oeste é conhecida por sua
atividade econômica essencialmente voltada para a agricultura, sendo uma das maiores produtoras nacionais. Na
área localizada entre as cidades de Cascavel e Toledo, localiza-se uma parte do rio São Francisco, observando-se
predomínio de plantações à sua volta, as quais utilizam inúmeros defensivos agrícolas para controle de pragas. O
rio São Francisco é, regionalmente, um dos mais importantes, sendo muito utilizado no abastecimento das cidades,
na irrigação para alimentação e nas práticas de lazer da população. Considerando a importância do rio para a
população do oeste do PR, este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial mutagênico no rio São Francisco (PR),
a partir da análise da frequência de micronúcleos (MN) em eritrócitos de Astyanax paranae. Foram realizadas 4
coletas sazonais (inverno 2009, primavera 2009, verão 2010 e outono 2010) em 3 pontos diferentes ao longo do
rio entre Cascavel e Toledo. O Ponto 1 em Cascavel (24º54’05.38” S – 53º32’00.42” O), o Ponto 2 entre Cascavel e
Toledo (24º50’26.75” S – 53º40’39.30” O) e o Ponto 3 em Toledo (24º47’11.73” S – 53º43’01.53” O). De cada ponto
de coleta foram obtidos 8 peixes. Os grupos controle-negativo e controle-positivo foram compostos, também,
de 8 peixes, porém estes foram obtidos em tanques de piscicultura, livres de estresse e de qualquer exposição
a agentes mutagênicos. O grupo positivo recebeu injeção intra-abdominal de ciclofosfamida. Foram analisados
3000 eritrócitos por peixe, e os dados foram estatisticamente avaliados por análise de variância (Anova One Way),
seguida do teste de Tukey. Os resultados obtidos mostraram que nos 3 pontos de coleta em todas as estações, as
frequências de micronúcleos por 3000 células foram estatisticamente significativas (p<0,05), comparando-se estes
grupos expostos com o controle negativo. No ponto 1, esse resultado deve-se provavelmente pela contaminação
do rio por esgotos e agrotóxicos, pois o rio nasce em uma região que necessita de melhor sistema de saneamento
básico em Cascavel e depois passa por lavouras. Já nos pontos 2 e 3, foram verificadas as mais altas freqüências,
principalmente durante o Inverno e Primavera, isso se deve provavelmente as cultura de trigo e soja que ocorreram
nessas estações e que exigiram alta quantidade de pesticidas para manejo. Nas estações Verão e Outono a freqüência
de MN, apesar de significativa, foi mais baixa, provavelmente , devido aos períodos de colheita, onde se usa menos
pesticidas. Outro fator é a ausência da mata ciliar ao longo do percurso do rio, que deveria protegê-lo. Por fim, esses
resultados demonstraram que o rio São Francisco, no trecho estudado, apresenta potencial mutagênico que pode
afetar tanto o ecossistema quanto aos seres humanos que se beneficiam do rio de alguma maneira.
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Análise do potencial mutagênico do rio Caripetuba,
Barcarena – PA utilizando Rhamphichthys sp.
(Gymnotiformes) como bioindicador
Alves, IR¹; Nagamachi, CY¹; Pieczarka, JC¹; Cordeiro, APB¹; Melo, KM¹; David, JAO²
¹Laboratório de Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
²Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras chave: Teste de micronúcleo, Gymnotiformes, Sedimento, Citoxicidade, Mutagenicidade
O rio Caripetuba, pertencente à bacia Amazônica, é importante por fornecer pescados para a população da
região e pelo constante tráfego de embarcações dos moradores que estão associados às suas margens. Assim, o
monitoramento desse corpo d’água torna-se necessário devido a sua localização, por se tratar de um rio pertencente
a uma ilha fluvial do rio Pará. Este último recebe efluentes de mineradoras do pólo industrial de Barcarena, sendo
que o rio Caripetuba localiza-se à montante do pólo industrial e em frente à cidade de Abaetetuba. Além disso,
devido ao ciclo de marés, despejos industriais do rio Pará, urbanos e portuários de Abaetetuba, podem influenciar
na qualidade das águas e sedimentos da região. Os peixes elétricos do gênero Rhamphichtys (Gymnotiformes)
são de hábito filtrador e vivem associados ao sedimento, podendo fornecer dados sobre a poluição presente no
substrato. Este trabalho objetiva comparar os peixes coletados no rio Caripetuba (n=19) com os da Reserva de
Desenvolvimento Sustentável de Mamirauá (RDSM) (n=8), usados como controle negativo. Indivíduos do gênero
Rhamphichtys tiveram amostras de sangue retiradas por punção caudal, com as quais esfregaços sangüíneos
foram realizados, fixados e corados com Giemsa (33%). Foram analisadas 3000 células por indivíduo (teste cego)
e observadas as freqüências de células micronucleadas (MN) e portadoras de anormalidades nucleares (AN). Os
indivíduos coletados no rio Caripetuba mostraram valores de MN (0,04%) estatisticamente maiores do que os
encontrados para o controle negativo (0,0%), assim como para AN (0,33% em Caripetuba e 0,09% no controle
negativo), indicando a presença de agentes mutagênicos e citotóxicos na região. Esses resultados alertam para
duas possibilidades: 1) os poluentes lançados pelas indústrias, mesmo localizadas a jusante no rio Pará, alcançam
regiões à montante devido ao regime de marés; ou 2) as embarcações dos próprios ribeirinhos pode afetar
negativamente o ambiente aquático necessitando de um melhor controle da emissão de poluentes como o óleo
combustível. A análise química das águas e sedimentos dessa localidade podem auxiliar a identificar se o efeito
apresentado neste trabalho, foi originado devido a uma das hipóteses levantadas ou se é uma combinação das duas.
Apoio: CNPq, FAPESPA, PRONEX-FAPESPA, UFPA, Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá-IDSM,
IBAMA.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Avaliação do potencial mutagênico em duas áreas na
Ilha do Marajó/PA usando peixes elétricos da Ordem
Gymnotiformes como organismo teste
Melo, KM1,3; Bastos, CEMC1; Nagamachi, CY1, ²; Pieczarka, JC1, ²; Alves, IR1,3; David, JAO1,4
Laboratório Citogenética UFPA.
²Pesquisador CNPQ.
3
Graduação em Ciências Biológicas da UFPA; Bolsista PIBIC/UFPA.
4
Professor da Universidade Federal do Espírito Santo.
[email protected]
1
Palavras-chave: Gymnotiformes, micronúcleos, Ilha do Marajó
Considerada a maior ilha fluviomarinha do mundo, a Ilha do Marajó é caracterizada por sua paisagem exuberante
e biodiversidade. A grande quantidade de rios faz da pesca uma das principais fontes de renda local. A água para
consumo e higiene pessoal é, muitas vezes, retirada diretamente dos rios sem tratamento algum. Apesar de não
ser intensamente povoada, existem controvérsias quanto ao grau de contaminação dos rios da região por conta
de efluentes domésticos e falta de saneamento. Este trabalho objetiva avaliar o potencial mutagênico em duas
regiões da Ilha do Marajó (Muaná e Curralinho), através do teste do micronúcleo e anormalidades nucleares.
Para isso, foram coletados peixes dos gêneros Gymnotus (n=6) e Sternopygus (n=4) em Muaná e Sternopygus (n=9)
em Curralinho. Peixes da Reserva de Desenvolvimento Sustentável de Mamirauá/AM (RDSM) (10 Gymnotus e 3
Sternopygus) foram utilizados como controle negativo. Com o sangue de cada peixe foram preparados esfregaços
sanguíneos corados com Giemsa (33%). Foram contadas 3000 células por indivíduo em teste cego e quantificadas
as células micronucleadas (MN) e portadoras de anormalidades nucleares (AN). Na RDSM o gênero Sternopygus
não apresentou formação de MN e apresentou média de freqüência de 0,019 para AN, enquanto que as médias de
MN e AN para o mesmo gênero foram, respectivamente, de 0,017 e 0,049 em Muaná; e 0,013 e 0,179 em Curralinho.
Para o gênero Gymnotus observou-se as médias de 0,022 para MN e de 0,189 nas AN em Muaná; enquanto que
na RDSM os valores foram de 0,034 para MN e 0,282 para AN. A única diferença significativa ocorreu para as AN
de Sternopygus coletados em Curralinho em relação aos indivíduos da RDSM; não foi evidenciado um potencial
mutagênico pela formação de MN nos locais estudados. As duas regiões estudadas apresentam características
semelhantes quanto ao número de habitantes e atividades econômicas o que justifica a não ocorrência de danos
mutagênicos. O desenvolvimento industrial na região não é grande e é pouco provável a presença de despejos do
setor industrial. Além disso, o grande volume d’água desses rios é um fator importante na dinâmica de dispersão dos
poluentes. As AN encontradas em Curralinho podem estar relacionadas com efeitos de um grande derramamento
de óleo diesel ocorrido em 2003 ou outros derramamentos de menor volume na região. Esta deposição e
disponibilização contínua de óleo podem ser responsáveis pela formação das AN. Podemos concluir que o histórico
das áreas é de extrema importância para análises ambientais e que os baixos níveis de danos mutagênicos podem
indicar uma possível área controle para estudos no sudeste do Pará, apesar de estudos terem evidenciado a
presença de dejetos fecais nas águas da região prejudicando o consumo da água sem tratamento pela população.
Apoio: CNPq, FAPESPA, PRONEX-FAPESPA, UFPA, Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá-IDSM,
IBAMA.
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Avaliação da atividade mutagênica de poluentes
atmosféricos in vitro
Bizarro, CR¹; Pezda, AM¹; Baumgardt, P¹; Lehmann, M¹; Dihl, RR¹
¹Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada (PPGGTA), Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), Canoas, RS, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: Mutagênese, NHAPs, CBMN, CHO, poluição atmosférica
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos nitrados (NHAPs) são uma classe de poluentes ambientais formados
a partir de produtos da combustão incompleta de HAPs e óxidos de nitrogênio. Devido a sua ampla distribuição
nos ecossistemas e atividade mutagênica, muitos dos NHAPs impõem sérios riscos genéticos à saúde humana.
Em função destas peculiaridades, a utilização de bioensaios capazes de detectar simultaneamente uma gama
de lesões, poderá fornecer um diagnóstico mais completo da toxicidade genética associada aos nitrocompostos,
principalmente considerando que existem poucas informações relacionadas aos mecanismos genotóxicos destes
poluentes. Neste estudo foi utilizado o Teste de Micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) em células de
ovário de hamster Chinês (CHO), para avaliar a atividade tóxico-genética associada a quatro NHAPs: 2-nitrofluoreno
(2NF); 9-nitroantraceno (9NA); 1,5- dinitronaftaleno (1,5DNN) e 1-nitronaftaleno (1NN). Foram utilizadas quatro
concentrações de cada composto, determinadas a partir de ensaios preliminares de viabilidade celular através
da técnica de exclusão do azul de tripan. Apenas as concentrações que apresentaram viabilidade acima de
70% foram utilizadas para o ensaio de toxicidade genética. Os resultados preliminares obtidos até o momento
demonstraram que o 1NN não apresentou atividade mutagênica, entretanto, o 1,5DNN induziu aumentos na
frequência de MNs quando comparado ao controle negativo (DMSO 1%), indicando que este nitrocomposto é
indutor de mutações cromossômicas em células de mamíferos. O 9NA apenas induziu aumentos significativos
na frequência de pontes nucleoplasmáticas. Conclusões: Estes resultados corroboram com dados da literatura
que apontam esta classe de poluentes como indutores de quebras de fita simples e dupla do DNA. A análise das
lâminas referente ao 2NF está sendo realizada. Desta maneira, os dados obtidos através do ensaio CBMN podem
servir como um alerta quanto ao risco imposto pelos NHAPs – o que compromete o equilíbrio do meio ambiente.
Órgãos Financiadores: CNPq e ULBRA.
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Análises mutagênica e genotóxica de anfíbios anuros
em áreas no bioma Cerrado do estado de Goiás
Ribeiro, NC1; Sousa, CCN1; Gonçalves, MW1; Carvalho, WF1 ; Oliveira, HHP1; Ribeiro, CL1; Silva, DM1;
Bastos, RP2; Da Cruz, AD1
1
2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
Universidade Federal de Goiás.
Palavras-chave: Teste do micronúcleo, Teste cometa, genotoxicidade, mutagenicidade, bioindicadores, anfíbios anuros
Nas últimas duas décadas, a inclusão de espécies silvestres em programas de monitoramento ambiental tem sido
bastante comum. No entanto, este estudo teve como objetivo avaliar o potencial mutagênico e genotóxico do
ambiente em áreas de Cerrado no estado de Goiás, utilizando anfíbios anuros como bioindicadores, pelo teste do
micronúcleo e teste cometa. Para tanto, foram coletados 63 espécimes de anfíbios anuros nos municípios de Rio
Verde, Mineiros, Jataí, Aporé, Serranópolis, Niquelândia, Barro Alto, Bela Vista de Goiás e Silvânia. Foram obtidas
amostras de sangue por punções cardíacas e para os animais de pequeno porte foram obtidas suspensões celulares
pelo rompimento do fígado em solução tampão de PBS (pH 7,4). No teste do micronúcleo foram preparados
dois esfregaços de sangue e/ou suspensão, para cada animal, procedendo à fixação em etanol absoluto por 15
minutos, secas ao ar livre e em seguida, as lâminas foram coradas com Giemsa a 10% por 10 min. A freqüência
de micronúcleos e outras alterações nucleares foram determinadas em 1000 eritrócitos para cada indivíduo
com a objetiva de 100X. O teste cometa foi realizado conforme descrito por Silva et al. (2000) e Hartmann et al.
(2003), com algumas modificações. 10 μL de sangue de cada indivíduo coletado foi diluído em 1ml de tampão
PBS (pH 7,4). A partir desta suspensão, foram retirados 10 μL, os quais foram embebidos em 120 μL de agarose
Low Melting Point (0,5%). Essa mistura foi colocada em lâminas contendo uma pré-cobertura de agarose normal
a 1%. Depois da solidificação em geladeira, as lâminas foram colocadas em tampão de lise, por 24 horas. As
lâminas foram então incubadas em tampão alcalino por 30 minutos, em seguida iniciou-se a corrida eletroforética
por 25 minutos, a 25 volts e 300 mAps. A alcalinidade foi neutralizada com solução de neutralização (pH 7,5).
Finalmente, o DNA foi corado com 25 μL de brometo de etídeo (10 ng/ul). Quanto à observação ao microscópio,
foram analisadas 2 lâminas por indivíduo com 50 células em cada, totalizando 100 células por indivíduo. As células
foram classificadas visualmente, em quatro classes, de acordo com o tamanho da cauda: sem danos (classe 0)
até danos máximos (classe 3). A partir da análise das lâminas observaram-se 4 tipos de alterações eritrocitárias:
células segmentadas (n= 5), células binucleadas (n=4), células reniformes (n=1) e células micronucleadas (n=8).
No teste cometa um indivíduo de Hypsiboas albopunctatus coletado em áreas de lavoura nos municípios de Jataí,
apresentou os maiores índices de danos e freqüência de danos dentre os indivíduos avaliados, quando comparado
com outro indivíduo de Hypsiboas albopunctatus, coletado em área natural, no mesmo município. Esta análise nos
permitiu avaliar a eficácia do uso de anfíbios anuros como bioindicadores em testes de mutagenicidade ambiental.
Apoio financeiro: fapeg
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Biomonitoramento da poluição atmosférica em
dois ambientes - rural e urbano - com o uso de
Tradescantia
Da Costa, GM1; Junior, DE1; Droste, A1
Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental, Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Universidade Feevale, RS, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: teste Trad-MCN, genotoxicidade, qualidade ambiental, Bacia do Rio dos Sinos,micronúcleo
A poluição atmosférica é responsável por efeitos prejudiciais nos ecossistemas e na saúde humana. O monitoramento
da poluição atmosférica é um importante procedimento para adoção de medidas de controle para a melhoria da
qualidade ambiental. O biomonitoramento é um método que permite avaliar o efeito da poluição sobre organismos
vivos, oferecendo vantagens, como custos reduzidos e eficiência para o monitoramento de áreas amplas, com
rapidez e praticidade. Dentre as espécies vegetais utilizadas para monitar contaminantes atmosféricos, podemos
citar Tradescantia pallida var. purpurea. O teste de micronúcleos em Tradescantia (teste Trad-MCN), tem sido
extensivamente utilizado por sua eficácia na detecção de danos cromossômicos em células-mães de grãos de
pólen, causados por agentes genotóxicos. O objetivo do presente estudo foi fazer o monitoramento sazonal da
genotoxicidade ambiental atmosférica de dois ambientes, um rural e outro urbano, por meio do bioensaio TradMCN. O ambiente rural compreende a zona rural de Lomba Grande, bairro com 148,3 km2 e quatro mil habitantes,
no município de Novo Hamburgo. O ambiente urbano, no munícipio de Estância Velha, possui aproximadamente
40 mil habitantes e uma área de 21,60 km2, com intensa atividade industrial. Ambos os ambientes localizam-se no
terço inferior da Bacia Hidrográfica do Rio dos Sinos, Rio Grande do Sul. Plantas da espécie T. pallida var. purpurea
foram expostas aos dois ambientes em estudo, nos meses de junho e novembro de 2009 e fevereiro de 2010. Após
24h de exposição, foram coletadas inflorescências jovens cujas células-mãe dos grãos de pólen estavam em fase de
tétrade. Lâminas microscópicas foram preparadas com esmagamento de anteras em carmim acético a 1%, para
visualização das tétrades. Foram analisadas 10 lâminas para cada ambiente, em cada estação do ano avaliada. Por
lâmina, foram analisadas 300 tétrades. A frequência de micronúcleos foi expressa pelo número de micronúcleos em
100 tétrades. Os dados obtidos foram submetidos ao teste T de Student, em nível de significância de 5%. A frequência
de micronúcleos no ambiente urbano foi significativamente superior à encontrada no ambiente rural (F=60,30,
p<0,001), sem considerar as estações do ano. Quando foram analisados os dados por estação do ano, também foram
registradas diferenças significativas. No inverno, as frequências de micronúcleos nos ambientes urbano e rural foram
de 3,53 e 1,16, respectivamente (p<0,001). Na primavera, foram encontrados 8,10 e 1,20 (p<0,001) micronúcleos em
100 tétrades nos ambientes urbano e rural, respectivamente. Por sua vez, no verão, as frequências de micronúcleos
foram de 7,60 (ambiente urbano) e 1,13 (ambiente rural) (p<0,001). Os resultados apontam para a eficiência do teste
Trad-MCN e indicam o potencial risco mutagênico das substâncias presentes no ar atmosférico urbano estudado.
Apoio financeiro: Feevale.
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Efeitos do Extrato Bruto de Erythroxylum em
Sarcoma 180
Costa, WL¹; Ribeiro, ASBB¹; Souza, CS¹; Menezes, ACS²; Silveira-Lacerda, EP¹
¹ Laboratório Genética Molecular e Citogenética -Universidade Federal de Goiás
² Universidade Estadual de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: Gênero Erythroxylum, MTT, Câncer Ascistico, S-180, Citoxicidade
O gênero Erythroxylum, é formado por 250 espécies, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo,
sendo que para o Brasil é descrita a ocorrência de 130 espécies, em ambientes florestais e de Cerrado. Como
exemplos têm o Erythroxylum coca de onde é extraída a substância primária da cocaína. Alguns animais após
a ingestão do fruto do Erythroxylum decidum adoeceram e foram levados a óbito. Isso nos dá indícios de uma
atividade citotóxica desse gênero. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica de frações do
extrato metanólico de Erythroxylum campestre frente à células tumorais. Na avaliação citotóxica foi utilizado o
ensaio de MTT. Para este ensaio células de Sarcoma-180 foram semeadas e tratadas com Erythroxylum campestre
nas concentrações 0,1, 0,2, 0,5 e 1 mg.mL-1 por 48 h. Foi realizada a leitura em espectrofotômetro utilizando
filtro de interferência de 550 nm . O extrato bruto do erythroxylum campestre mostrou atividade citotóxica
nas concentrações estudadas e reduziu significativamente a viabilidade das células S-180 para 59,2%, 35,4%,
25,6% e 20,1% nas concentrações 0,1, 0,2, 0,5 e 1 mg/mL-1 respectivamente e o valor para IC50 foi de 0,01mg/ml1
. O extrato do Erythroxylum campestre mostrou atividade citotóxica para células S-180 tratadas com 48 hs em
todas as concentrações dando destaque para as concentrações 0,2, 0,5 e 1 mg/mL-1 que apresentaram uma maior
atividade citotóxica quando comparadas com o controle negativo(p<0,05). Uma espécie diferente do gênero
Erythroxylum, o Erythroxylum cuneatum apresentou atividade citotóxica e antitumoral frente às células Vero e
HepG2 respectivamente em estudos realizados. Estudos recentes com folhas do Erythroxylum campestre também
demonstraram atividade antitumoral frente à linhagem de células K562. Os componentes do extrato Erythroxylum
campestres ainda não foram isolados. mas apresentam grande potencial como antitumoral devido a componentes
alcalóides que possam estar presentes e que já foram confirmados em estudados em outras espécies desse gênero.
Apoio financeiro: UFG
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O efeito protetivo do ácido rosmarínico em relação a
ação genotóxica ocasionada pelo etanol - avaliação
através do ensaio cometa in vivo
Oliveira, NCD1; Sarmento, MS1; Porto, CRM1; Picada, JN1; Pereira, P1; Silva, J1
Laboratório de Genética Toxicológica - Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada – Universidade Luterana do
Brasil, Canoas – RS.
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: ácido rosmarínico, ensaio cometa, etanol
O ácido rosmarínico (RA) é um composto polifenólico hidroxilado encontrado naturalmente em muitas famílias
do reino vegetal. Diversas atividades biológicas são atribuídas ao RA, como efeito antioxidante, antiinflamatório,
antiviral, antimutagênico, entre outros. Este trabalho tem por objetivo avaliar o efeito protetivo do ácido rosmarínico
em relação à ação genotóxica do etanol, utilizando o ensaio cometa (EC) versão alcalina. No teste foram utilizados
34 camundongos jovens, ambos os sexos, da espécie Mus musculus (CF1). Os grupos foram separados segundo
os tratamentos: Controle negativo (C-, água destilada), Controle positivo (C+, etanol, 5g/kg), RA (100mg/kg), Prétratamento (RA 1h antes do etanol), Pós-tratamento (RA após 1h de etanol) e Co-tratamento (RA+etanol). Após
24 horas de exposição, amostras de sangue foram coletadas para confecção das lâminas do EC, que foram coradas
com nitrato de prata, sendo analisadas 100 células/indivíduo. Para análise estatística foi utilizado teste Tukey, OneWay ANOVA. Os resultados de índice de danos e percentagem de danos indicam que a dose de etanol foi genotóxica
quando comparada com o C- (P<0,001) e também em relação ao RA administrado sozinho (P<0,001). Quanto aos
três tratamentos, todos apresentaram efeito protetivo de forma significativa em relação a dose de etanol testada
(P<0,001). Diferentes trabalhos relacionam a atividade protetiva do ácido rosmarínico na formação de radicais
livres, assim como o efeito oxidante do etanol. Um maior número de indivíduos por grupo de tratamento está sendo
avaliado, a fim de possibilitar o melhor entendimento do papel protetivo do RA sobre o efeito oxidativo do etanol.
Apoio: ULBRA/ Canoas
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Avaliação da genotoxicidade de nanocápsulas
poliméricas com óleo de arroz, através do teste vegetal
de Allium cepa
Frescura, VD¹; Rigo, LA²; Dalla Nora, G3; Beck, RCR4; Tedesco, SB1,3.
¹ PPG Agrobiologia, Universidade Federal de Santa Maria
² PPG em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Maria
³ PPG Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria
4
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: Genotoxicidade, citotoxicidade, nanocápsulas poliméricas, óleo de arroz, Allium cepa
Introdução: As nanopartículas poliméricas (nanoesferas e nanocápsulas) são sistemas submicrométricos, e têm
sido estudadas para aplicações terapêuticas como a vetorização de fármacos e desenvolvimento de sistemas de
liberação modificada. Estudos de toxicidade e mutagenicidade contribuem para a utilização segura e eficaz destes
sistemas. Os índices mitóticos e de replicação são usados como indicadores de proliferação celular e podem ser
medidos pelo sistema teste de Allium cepa. Óleos vegetais estão sendo empregados na preparação de nanocápsulas
poliméricas. Objetivos: Avaliar a genotoxicidade e citotoxicidade de suspensões de nanocápsulas poliméricas
contendo óleo de arroz, sobre a divisão celular de A. cepa. Métodos: Os experimentos foram desenvolvidos em
laboratórios da Universidade Federal de Santa Maria. As nanocápsulas poliméricas foram preparadas pelo método
de deposição interfacial do polímero pré-formado, empregando-se um polímero biodegradável (poli-ε-caprolactona)
na concentração de 3% (p/v) de óleo de arroz. Para a avaliação da genotoxicidade e citotoxicidade foram utilizados
3 grupos de 3 bulbos de A. cepa, para enraizar em água destilada. Após, um grupo de bulbos foi transferido para a
suspensão de nanocápsulas poliméricas com óleo de arroz, o segundo grupo foi transferido para o glifosato, utilizado
como controle positivo permanecendo por 24h e o terceiro grupo permaneceu em água destilada, empregada como
controle negativo. A seguir, foram coletadas as radículas de A. cepa e fixadas em etanol-ácido acético (3:1) por 24h,
após, foram colocadas em álcool 70% sob refrigeração. Foram preparadas lâminas pela técnica de esmagamento
das radículas, as quais foram coradas com orceína acética 2%. As lâminas foram analisadas diferenciando-se as
células em interfase, fases mitóticas do ciclo celular e aparecimento de irregularidades cromossômicas. Através
de microscopia óptica foram contadas 1500 células por grupo de bulbos, determinando-se o índice mitótico (IM).
A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste χ² a 5% de probabilidade, utilizando o programa estatístico
BioEstat 3.0. Resultados: Os valores dos índices mitóticos encontrados foram 5,13% para nanocápsulas com óleo de
arroz, 3,93% para o controle negativo e 5,46% para o controle positivo. Os resultados diferiram significativamente
entre o controle negativo e nanocápsulas poliméricas com óleo de arroz (χ² = 2,49), bem como ocorreu diferença
significativa entre o controle positivo e o negativo (χ² = 3,937). Foram observadas 0,4% de alterações cromossômicas
nas células de A. cepa submetidas ao tratamento com nanocápsulas poliméricas contendo óleo de arroz.
Conclusões: As nanocápsulas poliméricas com óleo de arroz apresentaram aumento na atividade proliferativa
que pode estar relacionada aos componentes da formulação. Por outro lado, as formulações apresentam baixa
atividade genotóxica através do teste de A. cepa, demonstrando preliminarmente a segurança da sua administração.
Apoio financeiro: FIPE, CAPES, PPG Agrobiologia.
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Avaliação dos potenciais citotóxicos e mutagênicos da
tintura de camomila (Matricaria chamomilla) in vivo
Delarmelina, JM1,2; Perdigão, TL1,3; Belcavello, L1,2; Luz, AC1,3; Batitucci, MCP1,2,3.
Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ES
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia, Núcleo de Biotecnologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do
Espírito Santo – UFES, Vitória, ES
3
Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal, Centro de Ciências Humanas e Naturais, Universidade Federal do Espírito Santo –
UFES, Vitória, ES.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: tintura vegetal, Matricaria chamomilla, mutagenicidade, citotoxicidade, teste in vivo, micronúcleo
Introdução: A Matricaria chamomilla é uma planta pertencente à família Asteraceae cujo nome popular é camomila
branca. Suas flores possuem diversas substâncias com propriedades terapêuticas para cura e prevenção de
diversos males, dentre eles, desconforto gastrointestinal, inflamações, estresse e hipertensão. Entre as diferentes
formas de preparo e ingestão, a camomila pode ser consumida sob forma de tintura vegetal, que apesar de ter
sua ação antioxidante comprovada, não possui os estudos toxicológicos necessários, exigidos pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária, para a orientação da população quanto seu uso. Objetivos: Observar os efeitos
citotóxico e mutagênico in vivo da tintura vegetal de M. chamomilla. Métodos: Avaliou-se a atividade citotóxica e
mutagênica in vivo da tintura vegetal de M. chamomilla utilizando o ensaio de micronúcleo em medula óssea de
roedores (camundongo Swiss), n=6/grupo (3 machos/3 fêmeas). Foram determinados seis grupos experimentais,
aos quais foram administrados: cisplatina (controle positivo - CP); solução salina 0,9% (controle negativo - CN);
álcool etílico 65% (controle solvente da droga - CS); tintura de M. chamomilla 0,02 µL/g/dia e 0,1 µL/g/dia,
proporcionais as doses clínicas de 20 e 100 gotas diárias, respectivamente, considerando-se um indivíduo adulto;
e também uma dose supra-clínica. Os animais foram expostos a cinco dias de tratamento, e sacrificados no sexto,
com exceção do CP, em que foram sacrificados 24 horas após a administração da droga. A análise estatística
utilizou o método de Análise de Variância (ANOVA) e o teste a posteriori de Tukey, com P<0,05 (5%) para as
diferenças estatísticas significativas. Resultados: Os resultados obtidos demonstraram que a tintura vegetal de
M. chamomilla não apresenta efeito citotóxico e mutagênico quando administrada nas dosagens de 0,02 µL/g/
dia e 0,1 µL/g/dia e que a dosagem supra-clínica apesar de não promover um efeito citotóxico, apresenta um
efeito mutagênico quando comparado ao controle negativo, sem, no entanto, alcançar os níveis de mutagenicidade
apresentados pela ação da cisplatina (CP). O CS não foi utilizado para análises estatísticas, uma vez que as
fêmeas não sobreviveram ao tratamento de 5 dias. Conclusão: Considerando-se o uso potencial da tintura de
M. chamomilla como fitoterápico, o presente estudo contribuiu para um melhor entendimento de sua ação,
podendo ser usada de maneira mais segura, uma vez que não demonstrou mutagenicidade e citotoxicidade nas
dosagens proporcionais às preconizadas para humanos, chamando atenção para seu uso em elevada quantidade.
Apoio Financeiro: PPSUS/FAPES/CNPq
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Efeito citotóxico e genotóxico do óleo essencial de
Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae) sobre o
meristema radicial de alface
Pawlowski, A1; Zini, CA2; Soares, GLG1; Kaltchuk-Santos, E3
Programa de Pós-Graduação em Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Química Analítica Ambiental e Oleoquímica, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Laboratório de Citogenética Vegetal, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: atividade mitodepressiva, clastogênese, aneugênese, óleo essencial, Schinus
Óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas,
constituídas de uma variedade de substâncias de baixo peso molecular, das quais se destacam os mono- e
sesquiterpenoides. O conhecimento acerca do modo de ação dos produtos naturais sobre o desenvolvimento
de outras espécies vegetais é bastante incipiente, destacando-se efeitos observados sobre o crescimento inicial
de plântulas; os eventos celulares correlacionados a tais efeitos raramente são abordados. Resultados anteriores
com medidas biométricas mostraram que as raízes de alface apresentaram redução significativa no comprimento
quando expostas ao óleo volátil de Schinus terebinthifolius. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi
verificar o efeito citotóxico do óleo essencial de S. terebinthifolius (aroeira-vermelha) sobre o meristema radicial
de alface (Lactuca sativa L.) através da avaliação do processo de divisão celular. O óleo essencial foi obtido através
da hidrodestilação das folhas de S. terebinthifolius em aparelho do tipo Clevenger. Diásporos de alface foram
distribuídos em placas de Petri sobre papel filtro embebido com 5ml de água destilada. O óleo (0,1 ml) foi aplicado
sobre algodão fixado na tampa da placa de Petri, evitando o seu contato direto com os diásporos. Água destilada
foi usada como controle negativo (CN) e paracetamol 0,5mg/ml como controle positivo (CP). Cada tratamento foi
realizado em quatro repetições. Transcorridas 48 horas, quatro raízes de cada repetição foram fixadas em fixador
Farmer, sendo coradas pelo método de Feulgen. Foram analisadas 500 células por raiz, totalizando 8.000 células
por tratamento. Os parâmetros avaliados foram os índices mitótico (IM) e metafásico (IMet), e a ocorrência de
alterações mitóticas. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística por ANOVA seguido de Tukey a 0,05
de significância. O óleo essencial de S. terebinthifolius afetou drasticamente a atividade mitótica do meristema
radicial da alface. Comparado com o CN, o tratamento com o óleo apresentou uma redução de 77% no IM (CN:
16,43 ± 0,36; CP: 12,08 ± 0,97; óleo: 3,81 ± 1,88) e 62% no IMet (CN: 2,90 ± 0,21, CP: 2,09 ± 0,21; óleo: 1,09 ± 0,60).
A genotoxicidez também foi expressiva (CN: 0,05 ± 0,04; CP: 1,59 ± 0,60; óleo: 2,55 ± 0,97), sendo observados
fragmentos, pontes, cromossomos não orientados em metáfase, cromossomos retardatários, aderências, c-mitose,
entre outras anormalidades. No tratamento com óleo, a ocorrência de efeitos aneugênicos (0,88%) foi maior que
os clastogênicos (0,10%), observando-se também micronúcleos (0,08%), anormalidades de núcleo (0,70%) e células
binucleadas (0,17%). Os resultados demonstram uma acentuada atividade mitodepressiva e genotóxica do óleo
essencial de S. terebinthifolius e sugerem que as substâncias presentes no óleo possivelmente tenham ação sobre
os microtúbulos, na organização do fuso mitótico, tendo em vista a maior ocorrência de efeitos aneugênicos.
Apoio financeiro: CAPES.
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Estudo da genotoxicidade do extrato aquoso de
Petiveria alliacea em DNA plasmidial: análise de
quebras e eficiência de transformação
Santos, SE1; Meirelles, PG1; Lima, PVS1; Oliveira, MBNO1; De Mattos, JCP1; Dantas, FJS1; Soares B.O.2;
Gagliardi, RF2 Caldeira-de-Araujo, A1
Laboratório de Radiobiologia e Fotobiologia, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
.Núcleo de Biotecnologia Vegetal , Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: genotoxicidade, extrato vegetal, Petiveria alliacea
Petiveria alliacea L. (guiné, erva-de-alho, erva-tipi ou amansa-senhor) é uma dicotiledônea herbácea, pertencente
à família Phytolaccaceae, nativa da região Amazônica. Atualmente é cultivada em muitas regiões tropicais, com
propósitos medicinais ou alucinógenos. Pesquisas científicas realizadas nas últimas décadas têm confirmado os
efeitos farmacológicos observados na medicina popular, como narcótico, abortivo e analgésico. Este trabalho
objetivou investigar o potencial genotóxico de extratos aquosos de plantas in natura, através da alteração da
topologia do plasmídeo pUC 9.1 e da eficiência de transformação do mesmo na cepa de Escherichia coli AB
1157 (selvagem para mecanismos de reparo de lesões em DNA). Folhas de plantas coletadas em Niterói, Rio
de Janeiro, Brasil, foram utilizadas para a preparação do extrato aquoso. Os plasmídeos (pUC 9.1), obtidos
através do kit de extração Invisorb, foram tratados com diferentes concentrações do extrato de Petiveria, por
40 min, à temperatura ambiente. Após os tratamentos, foram realizadas, simultâneamente, a transformação
da bactéria E. coli AB1157, tornada competente pela incubação com Cloreto de Cálcio (Sambrook et al., 1989),
com o plasmideo e a eletroforese em gel de agarose, onde as alíquotas de cada amostra foram misturadas com
tampão de carregamento (0,25% xileno cianol, 0,25% azul de bromofenol e glicerol em água), aplicadas no gel
de agarose 0,8% em cuba de eletroforese horizontal, na presença de tampão Tris-acetato-EDTA ( pH 8,0)
e corrido a 7V / cm. O procedimento de eletroforese foi realizado para separar as diferentes conformações do
plasmideo. O gel foi incubado em solução de brometo de etídio para visualização do DNA, por fluorescência,
sob um sistema de transiluminação ultravioleta. Os dados mostraram que o tratamento com DNA plasmidial
pUC 9.1 levou à conversão de plasmídeo superhelicoidizado à circulo aberto e, finalmente, à forma linear em
um padrão dose-dependente. Embora o uso do extrato bruto tenha causado alterações na topologia plasmidial,
conforme visualizado em eletroforese, quando as alíquotas do plasmideo foram incubadas com a bactéria
competente (AB1157), não foram detectadas diferenças significativas (p>0.05) nas eficiências de transformação.
Apoio: FAPERJ, CAPES, CNPq, UERJ.
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Jurubina: Moduladora de genotoxicidade e
citotoxicidade induzida por mitomicina C
Vieira, PM ¹; Chen Chen, L1
Departamento de Biologia Geral / Instituto de Ciências Biológicas / Universidade Federal de Goiás Campus II Goiânia-GO 74001-970 Brasil.
[email protected]
Palavras-chaves: Solanum paniculatum, teste do micronúcleo, camundongos, antimutagenicidade, alcalóide
Solanum paniculatum L., vulgarmente conhecida como jurubeba, é uma planta popularmente utilizada na medicina
tradicional, culinária e preparações de vinhos. Diversos produtos químicos naturais têm sido investigados quanto ao
potencial antimutagênico, citotóxico e anticarcinogênico devido ao interesse por compostos de origem vegetal que
possam ser utilizados como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos. Nesse contexto, experimentos
realizados anteriormente demonstraram que o extrato bruto dos frutos da S. paniculatum apresentou elevada
citotoxicidade e antimutagenicidade em procariotos e eucariotos. No intuito de detectar as substâncias responsáveis
por essas ações, o componente jurubina foi isolado dos frutos de S. paniculatum e posteriormente identificado e
avaliado quanto às ações antimutagênica e anticitotóxica, utilizando o teste do micronúcleo em medula óssea
de camundongos. O procedimento experimental foi realizado de acordo com SCHIMID (1975). Os animais foram
tratados com três diferentes concentrações, (25, 50 e 100 mg/kg) de jurubina concomitantemente com uma dose única
de mitomicina C. Para a avaliação da antimutagenicidade foi analisada a freqüência de eritrócitos policromáticos
micronucleados (EPCMN), enquanto a anticitotoxicidade foi avaliada pela relação entre EPC/ENC. Os resultados
demonstraram que a jurubina isolada dos frutos de S. paniculatum apresenta elevada capacidade de modular as
ações genotóxicas e citotóxicas induzidas por mitomicina C em medula óssea de camundongos. Dessa maneira,
pode-se inferir que o composto jurubina pode atenuar a genotoxicidade e a citotoxicidade de substâncias com
ações similares à mitomicina C e que são encontradas em nosso ambiente como produto natural ou antropogênico.
Apoio financeiro: UFG
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Avaliação de mutagênicidade mostra que o chimarrão
é capaz de potencializar efeitos mutagênicos do MMS
em Allium cepa
Grezsiuk, JD1; D’Arce, LPG1
1
Laboratório de genética, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE).
Palavras-chave: erva-mate, chimarrão, Allium cepa, micronúcleo, aberração cromossômica
O consumo do chimarrão, bebida feita a partir da infusão de erva-mate (Ilex paraguariensis), é um hábito antigo
e muito comum principalmente na região sul do Brasil e em outros países sul americanos como Argentina,
Paraguai e Uruguai. Embora muitas substâncias presentes na erva-mate sugiram propriedades benéficas a ela,
como estimulante, diurética, anti-obesidade, antioxidante e anticarcinogênica, não se sabe ao certo seu efeito
sobre o DNA. Nesta pesquisa, avaliou-se a atividade mutagênica e antimutagênica da infusão de erva-mate através
do ensaio de Allium cepa, analisando-se a freqüência de micronúcleos (MN), aberrações cromossômicas (AC) e
o índice mitótico (IM). Para a avaliação de mutagenicidade da erva-mate, as sementes foram expostas por 24
horas à infusão, preparada de forma semelhante ao processo de preparo do chimarrão, em três concentrações,
correspondentes a primeira, terceira e quinta cuia da bebida. Os controles positivos e negativos foram tratados,
respectivamente, com metilmetanosulfonato (MMS, 4.10-4M, por 72h) e água destilada (por 24h, 72h e 96h). A
antimutagenicidade foi avaliada em protocolos de tratamento prévio, simultâneo e posterior de MMS e erva-mate.
Para o preparo das lâminas, as raízes foram inicialmente fixadas em etanol:ácido acético (3:1), hidrolisadas em
HCl e coradas com reativo de Schiff. Em seguida, as lâminas foram confeccionadas com a região meristemática, na
presença de Carmim Acético. Analisou-se 5.000 células por tratamento em microscopia de luz (400X). Os resultados
obtidos foram negativos para o aumento das freqüências de MN e AC nos tratamentos só com erva-mate, o que
indica que, nas condições estudadas, suas substâncias não sejam mutagênicas e carcinogênicas por si só, ou não
estejam em quantidade suficiente para exercerem tais efeitos. Nos tratamentos prévios com MMS também não
foi observado nem aumento, tampouco diminuição significativa de alterações genéticas, o que sugere que não
houve influência, nem positiva nem negativa, da erva-mate na forma de chimarrão sobre a reversão de danos
no DNA das células meristemáticas das raízes de cebola tratadas com MMS, mostrando que a erva-mate não
teve propriedades bioantimutagênicas. Nos protocolos simultâneos e posteriores com MMS, porém, a erva-mate
potencializou os efeitos mutagênicos do MMS, ao invés de amenizá-los, talvez ao fragilizar as barreiras celulares à
este mutágeno. Conclusão: verificou-se que a erva-mate, na forma de chimarrão e em concentrações semelhantes
ao uso cotidiano, interferiu de forma a potencializar a ação do agente mutagênico presente (MMS). Por ser a ervamate um complexo composto por diversas substâncias, o resultado obtido neste trabalho não exclui a hipótese de
que ela atue também como potente seqüestrador de radicais livres na presença de outros tipos de mutágenos. Para
esclarecimentos sobre qual efeito prepondera sobre os sistemas, mais estudos laboratoriais e epidemiológicos são
necessários.
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Avaliação Mutagênica do Equisetum arvense L.
(Equisetaceae) em Células Meristemáticas Radiculares
de Allium cepa L. (Liliaceae)
da Mota, PR1; Machado, RC1; Hanusch, AL1; Portis, IG1; da Silva, CC1,2; da Cruz, AD1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – LACEN/SES/GO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Potencial mutagênico, clastogenicidade, aneugenicidade, divisão celular, alteração cromossômica
As plantas medicinais são utilizadas pelo homem para diversas finalidades, e gradativamente vem aumentando
sua utilização, a fim de se conseguir, por meio natural, ações terapêuticas e profiláticas. E. arvense é muito utilizada,
por possuir um elevado conteúdo em silício, oligoelemento mineral que participa nos processos de regeneração
dos tecidos. Desta forma há uma importância em serem realizados estudos que possam caracterizar seu potencial
mutagênico. Neste estudo foi realizado o teste A. cepa, por ser este ser um método clássico de avaliação do potencial
mutagênico de produtos químicos, apresentando resultados rápidos e satisfatórios no âmbito da mutagenicidade.
Tem-se por escopo avaliar o potencial mutagênico do produto fitoterápico de E. arvense, sobre as células do tecido
meristemático radicular de A. cepa. Foram utilizados bulbos expostos a concentrações de 50g.L-1, 37,5g.L-1, 25g.L-1,
12,5g.L-1 do material vegetal triturado, sendo após o período de exposição, as radículas dos bulbos submetidas a
fixação em solução álcool ácida e hidrolisadas em ácido clorídrico a 1N. Logo após, adicionou-se o corante orceína
acética à 2%, sendo a radícula recoberta com lamínula seguindo de uma leve pressão visando o espalhamento das
células. Para a determinação do índice mitótico, durante a contagem das células em divisão celular, adotou-se o
método de varredura, partindo do canto inferior da lâmina, da esquerda para a direita. Para a análise de alterações
cromossômicas (AC), nas fases de metáfase e anáfase foram consideradas várias aberrações relacionadas com
potencial clastogênico e/ou aneugênico. Todas as alterações foram reunidas em uma só categoria para possibilitar
a avaliação estatística. O grupo exposto (GE) quando comparado com o grupo controle (GC) não apresentou
alterações nas freqüências de AC (p=0,22), indicando que as diferentes concentrações do produto testado não
interferem na dinâmica da estrutura dos cromossomos. Na avaliação do índice mitótico, usando ANOVA e teste
de Tukey, pode-se perceber que nas concentrações de 50g.L-1 (1,11±0,19), 37,5g.L-1 (1,5±0,37) e 25g.L-1 (1,85±0,61),
houve diferença (p<0,05) no número de células em divisão quando comparado ao grupo controle negativo
(2,96±0,1). Uma vez que algumas células meristemáticas não possuem uma rota de diferenciação, mantendo a sua
capacidade e fluxo de divisão celular, observa-se que o produto fitoterápico estudado apresenta atividade antimitogênica sobre células meristemáticas radiculares de A. cepa. Tem-se a necessidade de se realizar outras análises
para a detecção do potencial clastogênico e/ou aneugênico do fitoterápico estudado, uma vez que devido a sua
atividade inibitória de divisão celular pode ter interferido no número amostral de células avaliadas em divisão
para a determinação da freqüência das alterações cromossômicas nas diferentes concentrações do produto.
Apoio financeiro: PROPE/PUC-Goiás.
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Avaliação mutagênica e recombinogênica da
(-)-cubebina, extraída de sementes de Piper cubeba,
em células somáticas de Drosophila melanogaster
Rezende, AAA1; Silva, MLA2; Tavares, DC3; Spanó, MA1
Laboratório de Mutagênese, Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia.
Laboratório de Produtos Naturais, Núcleo de Pesquisa em Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade de Franca.
3
Universidade de Franca.
*[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lignana, produtos naturais, SMART, teste da mancha da asa
No presente trabalho foram avaliados os efeitos tóxicos, mutagênicos e recombinogênicos da (-)-cubebina, uma
lignana isolada de sementes de Piper cubeba, conhecida popularmente como pimenta de Java. Entre os efeitos
biológicos da (-)-cubebina destacam-se os efeitos analgésicos, antiinflamatórios e tripanocida. O teste para
detecção de mutação e recombinação somática (Somatic Mutation and Recombination Test – SMART) em células
de asas de Drosophila melanogaster tem sido amplamente utilizado na detecção de efeitos mutagênicos e/ou
recombinogênicos de produtos naturais. Diferentes concentrações de (-)-cubebina (0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mM)
foram avaliadas por meio do SMART. Água ultra pura e cloridrato de doxorrubicina (0,2 mM) foram utilizados,
respectivamente, como controles negativo e positivo. Para tanto, foram utilizadas larvas de terceiro estágio (72 ± 4
horas) de D. melanogaster, obtidas dos cruzamentos padrão (ST – fêmeas flr3 cruzadas com machos mwh) e de alta
capacidade de bioativação metabólica (HB – fêmeas ORR; flr3 cruzadas com machos mwh). Os resultados observados
foram similares em ambos os cruzamentos e demonstraram que a (-)-cubebina não possui efeito tóxico, uma vez
que não houve diferença no número de imagos obtido nos diferentes grupos tratados quando comparados com o
grupo controle negativo. Os resultados observados permitem ainda concluir que a (-)-cubebina não possui efeitos
mutagênico e/ou recombinogênico, uma vez que as freqüências de manchas mutantes observadas nos grupos
tratados foram estatisticamente não significativas quando comparadas com as observadas no controle negativo.
Apoio financeiro: FAPESP; FAPEMIG; CAPES; UFU; UNIFRAN.
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Análise de mutagenicidade e toxicidade tecidual do
extrato hidroalcoolico de Ageratum conyzoides em
camundongos
Paiva, WJM1; Lassance, FP2; Machado, CR3; Assis, ACP3; Ozawa, PMM4; Costa, DTM4;Takemura, OS5
1 – Departamento de Biologia Geral – UEL
2 – Departamento de Histologia – UEL
3 – Alunas de Farmácia – UEL
3 – Alunas de Biomedicina – UEL
5 – Professor UNIPAR
[email protected]
Palavras-chave: Ageratum conyzoides, Mutagenicidade, Toxicidade Tecidual
O Ageratum conyzoides é um fitoterápico ao qual se atribui várias propriedades farmacológicas. Este trabalho tem
como objetivo avaliar o potencial mutagênico do extrato hidro-alcoólico de Ageratum conyzoides através do teste
do micronúcleo em eritrócitos policromáticos de medula óssea de camundongos (Mus musculus) e a avaliação
de alterações histológicas em fígado e rim. Para a avaliação da mutageniciade foram utilizados 2 fêmeas e 2
machos para cada grupo de tratamento nas concentrações de 1,5, 0,15 e 0,015 g/Kg de cada animal. O tratamento
ocorreu por gavagem e após 48 horas os animais foram sacrificados por deslocamento cervical para retirada da
medula óssea e os tecidos indicados. A lâminas preparadas foram coradas com Giemsa (1:20) e a análise das
lâminas feita ao microscópio óptico através da contagem de 2000 eritrócitos policromáticos contabilizando-se as
células micronucleadas por animal. A média de células micronucleadas encontrada em cada tratamento foram
respectivamente 217, 187 e 85. Para o controle positivo, a média encontrada foi de 262; e para o controle negativo, foi
de 49. Os resultados obtidos através do teste do micronúcleo indicam provavelmente um grau de clastogenicidade,
o que é um indicativo de mutagenicidade. O fígado e rim dos animais foram processados para exames histológicos
de rotina, incluídos em Paraplast® e corados com Hematoxilina e Eosina. Os exames histopatológicos mostraram
alterações de tecido hepático, indicativo de processo tóxico, com alteração de atividade metabólica de forma
evidente. O citoplasma dos hepatócitos apresentou-se vacuolizado, indicando presença de glicogênio. Os animais
nos quais observamos estas alterações foram machos e tratados na concentração de 0,015 g/Kg.
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Análise do potencial mutagênico de Equisetum arvense
L. (Equisetaceae) na dinâmica celular e na ativação
apoptótica de células meristemáticas de Allium cepa L.
(Liliaceae)
Machado, RC1; Hanusch, AL1; Portis, IG1; de Abreu, JB1; da Silva, CC1,2; da Cruz, AD1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – LACEN/SES/GO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pteridófita, planta medicinal, fitoterapia, mutagênese, decocto
A pteridófita herbácea E.arvense é uma planta medicinal utilizada para fins fitoterápicos sendo pouco conhecidas
as suas propriedades genotóxicas e citotóxicas. A avaliação da genotoxidade por meio da ativação apoptótica é
considerada relevante pela morte celular programada induzir sinais específicos, tais como erros na replicação
do DNA durante a divisão, envolvendo a expressão de um conjunto de genes característicos. O presente estudo
tem por objetivo avaliar o potencial mutagênico de diferentes concentrações do decocto de E. arvense utilizando
o sistema teste Allium cepa. A espécime vegetal foi obtida em comércio local, sendo lavada e triturada. O decocto
foi obtido a partir de 50g do material triturado em 1000mL de água destilada, resultando em uma solução a 5x10² g.L-1. Esta solução foi utilizada para obtenção das concentrações 100%, 75%, 50% e 25%. Doze bulbos de Allium
cepa foram submetidos a crescimento radicular em água destilada por um período de 48 horas. Posteriormente,
três raízes foram retiradas para compor o grupo controle negativo. Após 24 horas de exposição nas diferentes
concentrações, as amostras radiculares foram coletadas, e fixadas em Carnoy. As lâminas foram obtidas pelo
método de squash segundo o protocolo de Fiskëjo (1985). Foram consideradas as células que se encontravam em
apoptose, divisão mitótica e em intérfase, compreendendo um total de 3000 células, sendo 2000 avaliadas para
determinação do índice apoptótico e 1000 para a obtenção da dinâmica das diferentes fases da divisão celular.
Foram consideradas em apoptose as células que possuíam como características morfológicas a formação de
vesículas e fragmentação da membrana nuclear, encolhimento e diminuição do contato entre células vizinhas
e condensação cromatídica. A análise estatística por ANOVA e pelo teste de Tukey possibilitou resultados que
mostram que apenas as soluções de 75% e 100% do decocto vegetal apresentaram potencial de indução apoptótica,
quando comparadas com o grupo controle negativo (p<0,05). Na avaliação da dinâmica das fases mitóticas, o grupo
controle negativo apresentou células em prófase (6,13±0,63), metáfase (4,13±0,25), anáfase (3,28±0,79) e telófase
(5,17±0,71). Para todas as concentrações do decocto fitoterápico foram observadas alterações na dinâmica das
fases da divisão celular, quando comparadas com grupo controle negativo (p<0,05). A morte celular programada
em plantas é um mecanismo de proteção contra a ação de organismos e substâncias, de modo que na presença
destes, as células vegetais acumulam altas concentrações de compostos fenólicos indutores de morte celular.
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Efeito protetor do yacon (Smallanthus sonchifolius)
sobre a genotoxicidade induzida pela ciclofosfamida
Silva, PMG1; Hyodo, SAT1
Laboratório de Mutagênese, Universidade Braz Cubas.
[email protected]
1
Palavras-chave: yacon, micronúcleo, genotoxicidade
Vários estudos indicam que através de uma alimentação adequada pode-se adquirir a energia e os nutrientes
necessários para que o organismo desempenhe suas funções metabólicas corretamente, atuando tanto na
prevenção quanto no tratamento de certas doenças como a obesidade, diabetes e o câncer. Tais benefícios são
atribuídos a certos compostos encontrados em determinados alimentos. Smallanthus sonchifolius, conhecida
popularmente como yacon ou batata diet, possui um sabor adocicado devido à presença de grandes quantidades
de frutooligossacarídeos (FOS), além de compostos fenólicos. Esta raiz é utilizada como alimento por povos
andinos, além de ser empregada para fins medicinais como medicamento para o tratamento de hiperglicemia,
sendo que nos últimos anos, o seu uso tem se intensificado, tornando-se popular como suplemento dietético para
pessoas que sofrem de diabetes. Assim, este trabalho avaliou os efeitos mutagênicos e/ou antimutagênicos das
raízes de yacon em células de medula óssea ratos Wistars, através do Teste do Micronúcleo. As raízes de yacon
foram preparadas por três metodologias: infusão, decocção e extrato fresco. Cada grupo de animais recebeu 1ml
da solução por 15 dias consecutivos e, no penúltimo dia, foram tratados com a ciclofosfamida (50 mg/kg). Os
resultados obtidos mostraram um elevado efeito protetor do yacon com relação a genotoxicidade induzida pela
ciclofosfamida, uma vez que verificou-se que os animais tratados com yacon apresentaram uma redução na ordem
de 54 a 76% na freqüência de micronúcleos. Além disso, o yacon também causou uma citoproteção com relação à
ação da ciclofosfamida. Este efeito protetor provavelmente deve-se à presença da atividade antioxidante dos FOS e
dos compostos fenólicos. Assim, sugere-se que o yacon possa ser utilizado por pessoas que tratam de enfermidades
crônicas, como o câncer, a fim de amenizar os danos causados pelos agentes quimioterápicos.
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Avaliação tóxica e citotóxica dos extratos aquoso e
metanólico de Alternanthera brasiliana
De Carvalho, DF1; Costa, DAF2; Leite, AS2; Melo Cavalcante, AAC2; Amaral, FPM2; Chaves, TVS2; Dantas, AF2;
Lemos, SIA2
Universida Federal do Piauí. 2Laboratório de Toxicologia e Genética Molecular do Piauí (LABTOX-GEN/PI)
[email protected]
1
Palavras-chave: Alternanthera brasiliana; Allium cepa; Terramicina; toxicidade; citotoxicidade
Alternanthera brasiliana é popularmente conhecida como “terramicina” ou “penicilina” com propriedades
antimicrobiana, antiinflamatória, antiviral e antidiarréica. O presente estudo teve como objetivo avaliar as atividades
tóxica e citotóxica dos extratos aquoso e metanólico das folhas de A. brasiliana utilizando como biomarcador o
Allium cepa. Utilizando-se folhas secas e trituradas (50 g) de A. brasiliana foram obtidos por infusão em água
destilada (500 mL) a 80 ºC por 30 minutos e maceração com metanol (500 mL) por 72 horas, respectivamente,
os extratos aquoso e metanólico brutos. Esses extratos foram filtrados e concentrados em evaporador rotativo a
30-40°C e obtiveram-se os extratos aquoso (EA) e metanólico concentrados (EM). Soluções com o EA e EM nas
concentrações de 100 e 500 µg/mL foram preparadas diluídas em água destilada. . Utilizaram-se grupos de 5 bulbos
de cebola para cada concentração dos extratos de A. brasiliana, para água desclorificada (Controle Negativo), CuSO4
(Controle Positivo = 0,0002 mg/mL) e Controle Negativo água e metanol. Após 48 h de exposição das cebolas aos
extratos de A. brasiliana e aos controles, as raízes foram medidas e fixadas em Solução Carnoy (24 h), e em seguida,
foram estocadas em etanol 70% na geladeira até o preparo das lâminas. As raízes foram lavadas 3 vezes com água
destilada por 5 minutos, colocadas em solução de ácido clorídrico 1N por 11 minutos e posteriormente lavadas
com água destilada. Após foram transferidas para o Reagente de Schiff (2 h). Para o preparo da lâmina, a região
meristemática da raiz foi retirada e adicionou-se uma gota de orceína acética 2%. Foi analisado o comprimento
de raiz (toxicidade) e o índice mitótico (citoxicidade) em 1.000 células por controle. Os EA e EM de 100 µg/mL não
induziram toxicidade nem citotoxicidade significante (P>0,05), porém na concentração de 500 µg/mL, os extratos
foram capazes de induzir toxicidade e citotoxicidade. Os resultados revelam riscos e benefícios desse extrato
vegetal para uso terapêutico e seus efeitos sobre a integridade ao material genético. Assim, verifica-se que o teste
A. cepa é eficiente na detecção da toxicidade e citotoxicidade causada por infusões de plantas medicinais, sendo
necessários mais estudos para estabelecer a utilização segura de plantas medicinais pela população.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Teste de micronúcleos em eritrócitos de Poecilia reticulata
(Poecilidae) na avaliação do potencial mutagênico do
extrativo de Croton urucurana (Euphorbiaceae)
Hanusch, AL1; Machado, RC1; Portis, IG1; de Abreu, JB1; da Silva, CC1,2; da Cruz, AD1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, GO
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – LACEN/SES/GO.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Citotoxicidade, fitoterapia, sangra d’água, cicatrizante, látex.
Dentre as muitas espécies vegetais que fornecem novos princípios ativos às indústrias farmacêuticas, destacamos
as da família das Euforbiáceas. C. urucurana, comumente conhecida como “sangra d’água”, é uma árvore do sudeste
brasileiro, cujo extrativo caulinar é utilizado como cicatrizante e antiinflamatório. O presente estudo tem por objetivo
avaliar o potencial mutagênico de diferentes concentrações do extrativo de C. urucurana por meio do teste de
micronúcleos em eritrócitos de P. reticulata. O material de estudo foi constituído do extrativo da parte aérea do caule,
sendo este desidratado e armazenado sob refrigeração. A partir da CL50/96h, foram estabelecidas as concentrações de
37,5mg.L-1, 75mg.L-1, 112,5mg.L-1 e 150mg.L-1. Para cada concentração, além do grupo controle, foram expostos três
espécimes, por um período de 48 horas, em aquários padronizados, com aeração e sem alimentação. Após o período
de exposição, preparou-se uma suspensão de células sangüíneas em soro fetal bovino a partir das brânquias. A
suspensão celular foi utilizada para a confecção dos esfregaços sanguíneos. Para a análise de alterações eritrocíticas
nucleares (AENs) foram considerados núcleos lobados, segmentados, em forma de rim, células binucleadas e
células micronucleadas. Foram contadas 2000 células para cada espécime avaliada, totalizando 6000 células por
concentração. Para análise estatística foi usado o teste de ANOVA. Os resultados observados indicaram que não
houveram diferenças entre o número de AENs obtido no grupo controle e nos grupos expostos (p=0,49). Conclui-se
que o extrativo de C. urucurana, nas concentrações avaliadas, não induz a formação de AENs quando considerada a
espécie P. reticulata como organismo teste. Tem-se a necessidade de que sejam realizados mais estudos que assegure
a utilização deste extrativo fitoterápico e a determinação de doses que não sejam prejudiciais a saúde humana.
Apoio financeiro: PROPE/PUC-Goiás.
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Efeitos antiproliferativo e genotóxico de Eugenia
uniflora pelo teste de Allium cepa
Kuhn, AW1; Tedesco, M¹; Canto-Dorow, TS²; Tedesco, SB²
Acadêmicas em Ciências Biológicas, UFSM, RS
Professores do Departamento de Biologia, CCNE, UFSM, RS.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: pitangueira, genotoxicidade, teste de Allium cepa, antiproliferativo, mutagênico
A espécie Eugenia uniflora L. pertence à família Myrtaceae. Essa espécie é nativa da Mata Atlântica brasileira,
sendo encontrada desde o Brasil central até o Rio Grande do Sul, em áreas de clima subtropical. A pitangueira,
como é popularmente conhecida, possui frutos que podem ser consumidos “in natura” ou utilizados na indústria
alimentícia, de cosméticos ou perfumaria. Suas folhas são utilizadas para preparação de infusões pela população
em geral, tendo em vista o tratamento de febre, doenças estomacais, hipertensão, obesidade, reumatismo,
bronquite, doenças cardiovasculares e reidratação nos casos de diarréia. Tem ação antioxidante, calmante,
antiinflamatória e diurética. Devido ao seu uso medicinal, realizou-se esse estudo com o objetivo de avaliar a
capacidade antiproliferativa e genotóxica de extrato aquoso das folhas de pitangueira em uma concentração
de 24 g/L, através do sistema teste “in vivo” de Allium cepa. Foram coletadas as folhas de 01 população de
pitangueira no município de Santa Maria, RS, identificadas e colocadas para secagem a temperatura ambiente.
O extrato aquoso foi preparado por infusão na concentração de 24 g/L e comparado com o controle em água.
Para montagem do experimento foram utilizados 2 grupos de 3 bulbos de cebola para enraizar em água. Após
a emissão de raízes, um grupo permaneceu como controle e o outro foi transferido para o extrato aquoso de
pitangueira por 24 horas. Então, coletadas as radículas que permaneceram em etanol:ácido acético (3:1) por
24 horas e mantidas em etanol 70% sob refrigeração, até o preparo das lâminas. As lâminas foram feitas pela
técnica de esmagamento e coradas com orceína 2%. Foi realizada a contagem de 1500 células por grupo de
bulbos, observando-se a ocorrência de aberrações cromossômicas estruturais, bem como a inibição ou aumento
da divisão celular. Os valores do índice mitótico (IM) foram calculados e analisados estatisticamente pelo
Teste c2 (p=0.05). Os resultados obtidos pela análise das células exibiram diferença significativa entre o extrato
aquoso de pitangueira (IM=7,4%) e o controle em água (0,6%), demonstrando atividade antiproliferativa. Foram
também encontradas células em metáfases com quebras cromossômicas, indicando atividade genotóxica.
Apoio: FIPE.
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Avaliação do potencial citotóxico e genotóxico do
extrato hidroalcoólico de inflorescência de Helenium
amarum em sistema-teste Allium cepa
Carmo, LD1; Pretti, IR1,2; Luz, AC1,2; Freitas, JV1,3; Batitucci, MCP1,2,3
Laboratório de Genética Vegetal e Toxicológica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
3
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Helenium amarum, camomila amarela, inflorescência, mutagênese, Teste Allium cepa
A prática do uso de plantas medicinais na cura de enfermidades vem crescendo notadamente e, na maioria das vezes,
de forma indiscriminada. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária vem elaborando normas, como Definição nº17
de fevereiro de 2000, para a regulamentação dos fitoterápicos, preocupada com a eficácia, qualificação e segurança do
uso desses medicamentos pela população, fundamentando a importância de rigoroso controle de qualidade desde
o cultivo até a elaboração do produto terapêutico final. Torna-se necessário avaliação dos possíveis efeitos tóxicos,
citotóxicos e genotóxicos para a validação do uso medicinal de plantas. A família de plantas Asteraceae possui
grande importância por conter óleos e por apresentar muitas espécies de valor medicinal como Helenium amarum,
conhecida como camomila amarela. Esta é utilizada na forma de infusão como calmante, digestivo, tratamento
de náuseas, inflamações das vias urinárias, combate a febres e afecções de pele. A análise fitoquímica aponta a
presença de alcalóides, ácidos orgânicos, saponinas, esteróides, terpenos, flavonóides, taninos, aminoácidos, além
de lactonas sesquiterpênicas, que podem ser responsáveis por eventuais ações tóxicas. O presente estudo objetivou
avaliar possíveis efeitos nocivos ao DNA provocados pelo uso de inflorescências de H. amarum, utilizando-se o
bioensaio com sementes de Allium cepa, as quais foram submetidas aos tratamentos contínuo e descontínuo (20
e 72 h), com água destilada (controle negativo - CN) e três diferentes concentrações (0,5mg/mL, 1,0 mg/mL e 2,0
mg/mL) de extrato hidroalcoólico bruto das inflorescências de H. amarum. Em todas as concentrações testadas,
tanto para tratamento contínuo e descontínuo, os valores dos índices mitótico, aneugênico e clastogênico não
apresentaram variação significativa, segundo o Teste do Qui-Quadrado (χ2) com nível de significância ρ<0,05. A partir
destes índices pode-se inferir que o extrato da flor de H. amarum não apresenta efeito citotóxico nem genotóxico.
Apoio financeiro: FAPES e UFES.
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Utilização de sementes de alface como bioensaio para
avaliação do efeito citotóxico de extratos aquosos da
tulase (Ocimum sanctum L.)
Costa, AG1; Martins, ECD1; Silva, RC1; Neves, DA1; Almeida, OS2; Amaral, CLF3; Maffei, EMD4
Graduandos do curso de Licenciatura em Ciências Biológicas, Universidade do Estado da Bahia, campus VI, Caetité – BA
Departamento de Estudos básicos e Instrumentais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Campus de Itapetinga-BA
3
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Campus de Jequié-BA
4
Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Campus de Vitória da Conquista-BA.
E-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chaves: divisão celular, micronúcleo, bronken eggs, efeito citotóxico, Ocimum Sactum L
A tulase (Ocimum sanctum) apresenta diversos aleloquímicos que conferem a esta planta propriedades medicinais.
Os aleloquímicos produzidos podem desencadear o surgimento de alterações no processo de divisão celular do
organismo. Pelo fato de causarem lesões no material genético e potencialmente gerarem tumores em seres humanos,
esses agentes são normalmente conhecidos como genotóxicos e carcinogênicos. Para se identificar e monitorar
substâncias que podem vir a ser potencialmente tóxicas são realizados ensaios biológicos para o monitoramento
da bioatividade de extratos, frações e compostos químicos isolados, dentre os quais um dos organismos teste mais
utilizados é a alface. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico dos extratos aquosos da
tulase sobre sementes de alface. As investigações foram conduzidas no Laboratório de Genética da Universidade
Estadual do Sudoeste da Bahia/Vitória da Conquista. Os extratos aquosos foram obtidos a partir dos seguintes
parâmetros: 6, 12, 25, 50 e 110 folhas (tratamentos 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente). Como controle positivo (tratamento
6) foi utilizado a espinheira santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss.) na concentração de 40mg/mL, e como controle
negativo (tratamento 7) foi utilizada a água destilada. As sementes foram colocadas em placas de petri, com papel
filtro umedecido com 10mL dos extratos e água destilada (controle negativo), e em seguida foram levadas a câmara
de germinação, com temperatura controlada de 21°C. Foram utilizadas 10 repetições de 5 sementes, para cada
concentração dos extratos e do controle. Após a germinação, as pontas das raízes com aproximadamente um cm
foram coletadas e transferidas para o fixador Carnoy 3:1. Posteriormente foram preparadas lâminas que foram
coradas com a coloração de Feulgen, sendo que para sua análise a mesma foi dividida em dois campos os quais
tinham uma maior quantidade de células. Para constatar o efeito citotóxico da tulase foram adotados a presença e
número dos seguintes parâmetros: células binucleadas, micronúcleos, broken eggs, metáfase anormal, cariorréxis
e pontes anafásicas. A análise dos resultados foi feita utilizando o teste de Kruskal Wallis a 5%. A análise revelou
a presença de micronúcleos, pontes anafásicas e metáfase anormal nos tratamentos 1, 2, 3, 4 e 5 de tulase, broken
eggs e cariorréxis foi encontrado no controle positivo, porém não foram estatisticamente significativas pelo teste de
Kruskal Wallis a 5%. Assim, conclui-se que a tulase não apresenta potencial citotóxico nas concentrações utilizadas.
Apoio financeiro: FAPESB e CAPES.
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Investigação da citotoxicidade do infuso aquoso das
folhas de aroeira (Myracrodruon urundeuva Allemão.)
in vitro
Pontes, APC¹; Fernandez, DAC¹; Medeiros, RO¹; Almeida, RVM¹; Queiroz, JDF²; Lima, LFA²
¹Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande
do Norte
² Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande
do Norte
[email protected]
Palavras-chave: Aroeira, Myracrodruon urundeuva, Citotoxicidade, Procarioto, Eucarioto
Introdução: A aroeira do sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão.) planta pertecente a família Anacardiaceae, é
uma das espécies com maior número de indicações e usos terapêuticos. Neste trabalho, investigamos o potencial
citotóxico da infusão aquosa das folhas de M. urundeuva sobre sistemas procariotos e eucariotos in vitro, visando
obter dados quanto a segurança e benefícios do seu uso na medicina popular. Foram realizados ensaios de
viabilidade com células CHO-k1 e teste de citotoxicidade em Escherichia coli (AB1157) com análise da taxa de
crescimento e curva de sobrevivência. No teste de avaliação da citotoxicidade das células CHO-k1 observou-se que
nas concentrações de 10% e 15% de infuso a viabilidade foi de 79,7 % e 10%, respectivamente. Para os ensaios com
bactérias foi comprovada uma ação anti-microbiana pelo uso do infuso. Conclusão: Verificou-se que mesmo em
baixas concentrações, a infusão pode causar morte celular tanto nos sistemas procariotos quanto em eucariotos.
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Triagem citotóxica do extrato bruto de Erythroxylum
campestre A.ST.-HIL em células tumorais
Mello, FMS1; Lima, AP1; Pereira, FC1; Ribeiro, ASBB1; Vilanova-Costa, CAST1; Silveira-Lacerda, EP1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
[email protected]
1
Palavras-chave: E. campestre, leucemia aguda, adenocarcinoma de pulmão, MTT
A grande diversidade de espécies vegetais com potencial terapêutico presente nos ecossistemas brasileiros fornece
material para estudos especializados na procura de novas drogas para diferentes doenças, dentre elas o câncer.
O gênero Erythroxylum é formado por cerca de 250 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do
mundo, sendo que para o Brasil é descrita a ocorrência de aproximadamente 130 espécies, em ambientes florestais
e de Cerrado latu censu. Várias espécies do gênero possuem propriedades medicinais, sendo as populares cocas
(E. coca Lamk. e E. novogranatense (D.Morris) Hieron.) e suas variedades as mais conhecidas e estudadas devido à
presença de alcalóides em suas folhas. O screening citotóxico foi realizado por meio do teste colorimétrico do MTT
[3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazólio] in vitro utilizando-se células tumorais K562, associadas
a leucemia mielóide crônica, Sarcoma 180 (S180) e A549, adenocarcinoma de pulmão, mantidas em cultura segundo
estabelecido no protocolo da American Type Culture Collection (ATCC). O princípio desse método consiste em
medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Como controle
positivo utilizou-se cisplatina a 100µM. As células foram tratadas em microplacas de 96 poços com o extrato bruto
de acetato de etila das folhas de Erythroxylum campestre (ECFM-A) nas concentrações 0,001mg.mL-1; 0,01mg.mL-1;
0,1 mg.mL-1 e 1 mg.mL-1, e incubadas por 48 horas em estufa a 37°C e 5% CO2. Ao fim da incubação, foram adicionados
aos poços de cultivo celular, 10 μL de MTT na concentração de 5mg.mL-1. A placa foi novamente incubada e após
3 horas foram adicionados 50 μL SDS 10% / HCL 0,01 N. A quantificação da densidade óptica foi medida em
espectrofotômetro utilizando-se o filtro de interferência de 550 nm, após 48 horas do tratamento com SDS. Os testes
foram realizados em triplicatas. O screening citotóxico do ECFM-A apresentou resultados satisfatórios, revelandose ser eficaz no tratamento do câncer. Na presença das células de S180 o ECFM-A foi 100% citotóxico para todas as
concentrações, porém frente às células K562 e A549, apenas a concentração de 1 mg.mL-1 foi significativa quando
comparada com o controle positivo. Resultados obtidos com 24 horas de exposição do ECFM-A frente as células
K562 foram mais relevantes, demonstrando citotoxicidade em todas as concentrações de forma dose-dependente.
Os estudos com esse composto vão ser continuados para comprovar e elucidar sua atividade antitumoral.
Apoio financeiro: LGMC- UFG / FINEP / FAPEG / CNPq
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Toxicidade do extrato aquoso de folhas de Byrsonima
intermedia sobre o alongamento de raiz em bioteste
com Lactuca sativa L.
Rocha, LC1; Barbosa, S2; Orlandi, L1; Rodrigues, LCA1; Beijo, LA3; Silva, GA4; Santos, BR2
Laboratório de Biotecnologia e Genética Vegetal - Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL-MG)
Instituto de Ciências da Natureza (UNIFAL-MG)
3
Departamento de Ciências Exatas (UNIFAL-MG). 4Departamento de Farmácia (UNIFAL-MG).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Germinação, fitotoxicidade, Byrsonima intermedia
A espécie Byrsonima intermedia A. Juss., conhecida como Murici-pequeno, é um arbusto do Cerrado, pertencente
à família Malpighiaceae, que tem sido utilizada na medicina popular como agente adstringente, antimicrobiano
e antifúngico. Estas atividades se devem à presença de metabólitos secundários como os compostos fenólicos,
taninos, flavonóides, entre outros, que podem também exercer efeito tóxico sobre outras espécies vegetais,
modulando o crescimento e desenvolvimento da vegetação adjacente. O entendimento da atividade fitotóxica
auxilia o desenvolvimento de alternativas como herbicidas naturais para o controle de plantas invasoras,
sobretudo na agricultura orgânica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito biológico do extrato aquoso de
folhas de B. intermedia sobre a planta-alvo alface (Lactuca sativa L., cv Baba de verão) utilizando como parâmetro
o comprimento de raiz. Folhas de Murici-pequeno foram desidratadas por 48 horas em estufa a 40ºC, trituradas
em moinho mecânico e pulverizadas através de tamis abertura 0,84mm, tyler 20. A partir do extrato aquoso
liofilizado a 5% (m/v) foram obtidas as concentrações 5, 10, 25 e 50 mg mL-1, utilizando água destilada como
controle. O bioteste foi conduzido com sementes de alface em BOD a 25ºC sob fotoperíodo de 12 horas. Foram
utilizadas três repetições de 25 sementes com delineamento inteiramente casualizado. Para análise estatística foi
utilizou-se ANOVA sendo que as concentrações apresentaram efeito significativo (p<0,05) sobre o comprimento
das raízes. Ajustou-se um modelo de regressão polinomial do segundo grau (y=1,47 - 0,083x + 0,0011x2, com R2
=85,7%). O comportamento da curva indicou que com o aumento da concentração reduz-se o comprimento
das raízes, permitindo inferir que concentrações mais elevadas inibem o desenvolvimento radicular (menor que
0,5 cm). A presença de substâncias inibidoras da proliferação celular revela o potencial fitotóxico para o extrato
avaliado e indica a necessidade de ampliar os estudos sobre a ação aleloquímica dos extratos foliares dessa espécie.
Apoio: CAPES - FAPEMIG
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Proteção do alho-poró (Allium porrum L.) sobre
micronúcleos induzidos pela ciclofosfamida
Loureiro, NE ¹; Hyodo, SAT¹
¹ Laboratório de Mutagênese – Área de Saúde – Universidade Braz Cubas – Mogi das Cruzes, SP.
[email protected]
Palavras-chave: Allium porrum, micronúcleo, alimentação, câncer, quimioproteção.
A ingestão de alimentos constitui uma das principais vias de exposição do homem a diversos compostos. Alimentos
nutracêuticos e funcionais podem apresentar componentes com propriedades importantes ao organismo, entre
elas a melhoria do bem estar físico e fisiológico e a redução do risco de doenças como o câncer. Vegetais do
gênero Allium têm sido muito estudado devido as suas propriedades antimicrobianas e relacionadas à prevenção
de cânceres como de estômago e de mama. O alho-poró (Allium porrum L.) é um vegetal muito utilizado como
condimento, sendo a parte branca mais utilizada, além disso, possui vitaminas A, B e C, potássio, ferro, cobre, ácido
fólico e flavonóides como quercetina e canferol. O teste de micronúcleo é utilizado para avaliar a capacidade de
substâncias em induzir dano cromossômico estrutural e/ou numérico em células em estágio de divisão na medula
óssea. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do tratamento com extrato fresco de alho-poró utilizando
a técnica de micronúcleo em células de medula óssea de ratos Wistar. Para tal, 24 animais do sexo masculino,
pesando 100 ± 110 g, foram tratados com 1ml/dia do extrato fresco de alho-poró durante 16 dias. O extrato foi
preparado com o bulbo do alho-poró ralado e filtrado em gaze e logo em seguida administrado aos animais pelo
método de gavagem. No último dia de tratamento foi administrada CPA (50mg/kg) via intraperitoneal, sendo 24
horas depois realizada a eutanásia dos animais. A análise de micronúcleos foi realizada em células sangüíneas
e de medula óssea. Durante os tratamentos não houve variação significativa no ganho de peso entre animais
tratados e não tratados com o extrato (p>0,05). Também não foi verificado ação citotóxica do extrato fresco de
alho-poró. Além disso, animais que receberam o extrato apresentaram redução superior a 50% na freqüência de
micronúcleos (56% no sangue, 57% na medula óssea) quando comparados aos animais tratados apenas com CPA
(p<0,05). O efeito protetor atribuído à exposição ao extrato de alho-poró possivelmente se deve a presença de
compostos antioxidantes, como quercetina e canferol, comumente encontrados em vegetais do gênero Allium, que
são capazes de reduzir a ação de radicais livres. Mediante os resultados, o alho-poró pode ser recomendado em
dietas que visem minimizar os efeitos negativos de quimioterápicos.
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Citogenotoxidade do óleo essencial de espécies de
Lippia em células meristemáticas de Allium cepa
Evangelista, NAM1; Oliveira, EE¹; Gomes, SSL1; Oliveira, CE1; Zanette, RSS1; Viccini, LF1;
Raposo, NRB2;Coelho, CM1; Campos, JMS1
Laboratório de Genética e Biotecnologia, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de
Fora-MG.
2
NIQUA, Faculdade de Farmácia, UFJF
[email protected]
1
Palavras-chave: Lippia, citogenotoxidade, Allium cepa, ciclo celular, óleo essencial
Introdução: O gênero Lippia (Verbenaceae) é constituído de várias espécies com propriedades medicinais. Entre
elas, as espécies L. sidoides e L. alba são as mais conhecidas, com várias propriedades farmacológicas descritas. Na
maioria dos estudos disponíveis, é ressaltada a importância dos componentes do óleo essencial dessas espécies.
Entretanto, informações sobre atividades citogenotóxicas dos óleos essenciais de espécies de Lippia são quase
inexistentes. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade citogenotóxica do óleo essencial de L. sidoides
e L. alba em células meristemáticas de Allium cepa. Métodos: Soluções de 100 e 200 µg/ml (óleo essencial/acetona
2,5%) das espécies L. sidoides e L. alba foram testadas. Como controles negativos foram utilizados água destilada
(C1) e soluções de acetona 2,5% (C2). Sementes de Allium cepa pré-germinadas foram expostas às soluções teste
por um período de 24h. Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente ao acaso, composto
de 3 repetições. Para análise citogenética, as raízes foram fixadas em etanol:ácido acético (3:1) e posteriormente
hidrolisadas em HCl 5N por 15 minutos. As lâminas foram obtidas através de esmagamento e coradas com
solução de Giemsa. Parâmetros de ciclo celular e de alterações cromossômicas foram obtidos através da análise.
Resultados: Para L. sidoides, os resultados de análise citogenética evidenciaram um aumento significativo no
percentual de células em divisão (índice mitótico) após exposição à solução de 100 µg/ml de óleo essencial (Índice
mitótico: C1 – 7,86%; C2 – 7,45%; 100 µg/ml – 12,45%, Tukey p > 0,05). Este aumento é explicado por um aumento
no percentual de células na transição de G2 para mitose (acúmulo de células na fase inicial de prófase). Já a
solução de 200 µg/ml apresenta um efeito citotóxico, com diminuição no percentual de divisão e indução de morte
celular. Para a espécie L. alba não foram relatadas interferências sobre os parâmetros de ciclo celular. Entretanto,
anormalidas cromossômicas tais como pontes cromossômicas e cromossomos pegajosos foram observados. Tais
resultados evidenciam um efeito clastogênico do óleo essencial de L alba em contraposição a um efeito sobre
ciclo celular de L. sidoides. Conclusões: Ambas as espécies apresentam efeitos citogenotóxicos para os seus
óleos essenciais, constituindo-se em promissoras fontes para a prospecção de compostos biologicamente ativos.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG
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Potencial genotóxico dos extratos aquosos de
Artemisia verlotorum (Asteraceae) sobre o ciclo celular
de Allium cepa
Pastori, T1; Souza, LFB2; Laughinghouse IV, HD3,4; Tedesco, M1; Kuhn, AW1, Canto-Dorow, TS1; Tedesco, SB1
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Santa Maria, RS
Curso de Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria, RS
3
Department of Environmental Science and Technology, University of Maryland
4
Department of Botany, National Museum of Natural History, Smithsonian Institution.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: infalivina, genotoxicidade, Artemisia verlotorum, planta medicinal, Allium cepa, extrato aquoso.
O uso intenso de plantas medicinais pela população torna os estudos nessa área necessários para garantir
qualidade, segurança e eficácia das mesmas. O teste da Allium cepa tem sido utilizado como bioindicador da
ocorrência de genotoxicidade em chás medicinais. Dentre as espécies medicinais importantes, a espécie Artemisia
verlotorum, conhecida como infalivina, é muito utilizada na medicina alternativa para o tratamento de doenças
do aparelho geniturinário, respiratório, circulatório e digestivo. Baseando-se neste contexto, avaliou-se os
efeitos genotóxico e antiproliferativo de extratos de Artemisia verlotorum sobre o ciclo celular de Allium cepa. O
experimento foi desenvolvido no Laboratório de Citogenética Vegetal e Genotoxicidade da Universidade Federal
de Santa Maria (UFSM). As folhas de Artemisia verlotorum foram coletas no município de Santa Maria, RS. O
extrato aquoso de infalivina foi preparado por infusão em água destilada por 10 minutos na concentração usual
de 6g/L. Utilizou-se dois grupos de quatro bulbos, um para o tratamento com o extrato de 6g/L e um para o
controle negativo em água destilada. Após o enraizamento dos bulbos em água, os mesmos foram transferidos
para o extrato por 24 horas, permanecendo em água os bulbos do controle negativo. As radículas foram coletadas,
fixadas em etanol-ácido acético (3:1) e estocadas em etanol 70%. O preparo das lâminas foi feito pela técnica
de esmagamento, coloração com orceína acética 2%. Foram analisadas 2000 células por grupo de bulbos,
observando-se as células em interfase e divisão celular (mitose) para calcular os valores dos índices mitóticos
e registrar a ocorrência de alterações cromossômicas. A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste
c2 com nível de probabilidade <0,05. Os resultados mostraram que houve decréscimo dos valores dos índices
mitóticos de 9,65% em água destilada para 7,35% no extrato de 6g/L de A. verlotorum. Foram encontradas
células em divisão com alterações cromossômicas, tais como metáfases com cromossomos desorganizados,
anáfases irregulares com pontes anafásicas e quebras cromossômicas. Conclui-se que o extrato de Artemisia
verlotorum na concentração de 6g/L possui potencial antiproliferativo e genotóxico sobre o ciclo celular de A. cepa.
Apoio financeiro: FIPE, PET Biologia UFSM.
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Avaliação da atividade genotóxica do extrato etanólico
e aquoso de partes aéreas de Momordica charantia
Linn (Cucurbitaceae)
Senes, TFL1 ; Zanetti, TA1; Marques, MCS2; Garcez, WS2; Guterres, ZR1
Laboratório de Citogenética e Mutagênese, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul.
Departamento de Química, Laboratório de Produtos Naturais, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: genotóxico, Momordica charantia, fitoterápico, SMART.
Cucurbitaceae é uma das mais importantes famílias de plantas utilizadas para a produção de alimentos, fibras e
fitoterápicos. A Momordica charantia Linn (Cucurbitaceae) - popularmente conhecida como Melão de São Caetano
ou Melão Amargo, é uma planta trepadeira que cresce em áreas tropicais, incluindo partes da Amazônia, leste da
África, Ásia e Caribe, é cultivada em toda a América do Sul, sendo utilizada como alimento e medicamento. As folhas,
talos, raízes, frutos e sementes são utilizadas de diversas formas. De acordo com a medicina popular, apresenta
propriedades antidiabética, abortiva, anti-helmínticas, antiviral (incluindo a infecção pelo HIV), anticonceptiva e
antimalárica. Também é usada no tratamento da gota, dor abdominal, cálculos renais, anti-hanseníase, pneumonia,
psoríase, entre outros. Diante da ampla utilização desta planta para o tratamento de diversas doenças, bem como
a falta de informações sobre o potencial genotóxico e/ou antigenotóxico, esta pesquisa tem por objetivo avaliar a
atividade genotóxica de extrato aquoso e etanólico obtidos das partes aéreas de M. charantia L. por meio do teste
da mancha da asa de Drosophila melanogaster (SMART- Somatic Mutation And Recombination Test). No presente
estudo, diferentes concentrações dos extratos (2,5; 5,0; 10mg/mL) obtidos das partes aéreas da M. charantia L., foram
utilizados para tratar as larvas de D. melanogaster de terceiro estagio de desenvolvimento obtidas dos cruzamentos
padrão (ST) e cruzamento de alta bioativação (HB).Como controle negativo utilizou-se o solvente (1% Tween-80,
3% de etanol e água) e como controle positivo cloridrato de doxorrubicina – DXR (0,125 mg/mL) Comparandose os grupos tratados com o controle negativo, verificou-se que a frequência de manchas mutações não difere
significativamente das observadas no controle negativo. Estes dados sugerem que nas condições experimentais
descritas, o extrato aquoso e o extrato etanólico obtidos de M. charantia, não apresentam atividade genotóxica.
Apoio financeiro: CNPq, FUNDECT e UEMS.
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Efeitos genotóxicos e citotóxicos do extrato bruto
etanólico de Psychotria prunifolia em células da raiz
meristemática de Allium cepa
Pires, WC1; Batista, MP1; Pereira, FC1; Silveira-Lacerda, EP1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
[email protected]
1
Palavras-chave: Psychotria prunifolia; Allium cepa; genotoxicidade
Introdução: A fitoterapia é uma ciência que visa o tratamento de algumas doenças através das ervas e plantas que
apresentam propriedades curativas. O uso dos produtos naturais iniciou-se há milhares de anos por populações
de vários países com o intuito de tratar diversas patologias. Apesar dos grandes avanços observados na medicina
moderna, nas últimas décadas, elas continuam sendo utilizadas e, estima-se que, cerca de 25% a 30% de todas as
drogas avaliadas como agentes terapêuticos são derivados de produtos naturais. A planta Psychotria prunifolia
pertence ao grupo das dicotiledôneas, familia Rubiaceae, natural do cerrado e rica em alcalóides e iridóides, estes
com atividade terâpeutica já comprovada. Objetivo: O objetivo desse trabalho é avaliar o efeito genotóxico e
citotóxico do Extrato Bruto Etanolico (EBE) de Psychotria prunifolia. Métodos: O EBE de Psychotria prunifolia foi
testado em 50 bulbos de cebolas e para cada tratamento foram utilizados 5 bulbos. O extrato foi diluído em água
destilada nas seguintes concentrações: 1mg/mL; 0,1mg/mL e 0,01mg/mL por 24 e 48 horas de exposição, utilizando
como controle negativo água destilada e como controle positivo Nitrato de Cromo diluído em água destilada na
concentração de 0,5 mM. Foram coletados os meristemas das raízes, fixados em carnoy, hidrolisadas e coradas
por Carmim Acético seguido de esmagamento dos meristemas e montagem de lâminas permanentes. Foram
analisadas 5000 células/tratamento (1000 células/lâmina) em microscopia óptica (40x) e a análise estatística foi
realizado pelo teste Qui-quadrado (teste Dunnet) (p<0,05). Resultado: O índice mitótico (IM) da concentração 1mg/
mL foi de 1,1% e 1,7% nas 24 e 48 horas, respectivamente, valores esses estatisticamente significante (p<0,05) em
relação ao IM do controle negativo (15%), sendo que a mesma concentração apresenta resultados de IM inferiores
ao controle positivo (3,6%). Ao analisar as porcentagens de aberrações nas concentrações testadas, encontrou-se
diferenças significativas (p<0,05) na concentração 1mg/mL de 24 e 48 horas em relação ao controles negativo (1%
e 2,75%) assim como nas outras concentrações, alcançando aproximadamente 23% de aberrações em 24 horas
e 14% de aberrações em 48 horas. Conclusão: O extrato da planta P. Prunifolia inibe a divisão celular das células
meristemáticas da raiz de Allium cepa na concentração de 1mg/mL, apresentando aberrações cromossômicas nas
células tratadas.
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Avaliação da genotoxicidade de Tephrosia cinerea
(L.) Pers. (Fabaceae) in vitro pelo teste do Cometa e
Apoptose
Dias, ACS1; Moreira, VR1; Lima, MIS1; Pereira, SRF1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – Universidade Federal do Maranhão
[email protected]
1
Palavras-chave: Anil bravo, Antileishmanial, Glucantime®, Genotoxicidade, Morte Celular
O Brasil é considerado o país com a maior diversidade vegetal, abrigando 55 mil espécies vegetais usadas para fins
medicinais. As folhas de Tephrosia cinerea (L.) Pers., conhecida como anil bravo, são utilizadas pela população
para tratar infecções, inflamações, úlceras, afecções nervosas e diarréias. Recentemente foi observada a ação
antileishmanial de extratos hidroalcóolicos de Tephrosia cinerea, tendo estes um maior potencial leishmanicida
que o Glucantime® (antimoniato de N-metil-glucamina) - droga de primeira escolha recomendada pela Organização
Mundial de Saúde e pelo Ministério da Saúde do Brasil para tratamento das leishmanioses. Avaliar a genotoxicidade
do extrato de Tephrosia cinerea (L.) Pers. e sua capacidade de induzir morte celular por apoptose em culturas de
linfócitos humanos in vitro. As folhas de Tephrosia cinerea foram coletadas no Horto do Herbário Ático Seabra da
Universidade Federal do Maranhão (Bacanga/ São Luís-MA-Brasil) e armazenadas em exsicata Nº 1265. As folhas
foram secas, pulverizadas e extraídas com EtOH a 70%. As soluções extrativas foram filtradas e concentradas em
evaporador rotativo sob pressão reduzida, obtendo-se os extratos hidroalcoólicos. Utilizou-se o Teste do Cometa
in vitro e Apoptose em linfócitos obtidos a partir de sangue periférico de seis doadores voluntários. Estas células
foram expostas ao tratamento com extrato da planta por 3 e 24 horas nas concentrações de 22 µg/mL; 44µg/mL;
88µg/mL; 125µg/mL; 250µg/mL e 500µg/mL. Os controles negativo, positivo e controle de veículo foram meio
RPMI 1640, água oxigenada (10V) e DMSO (1%), respectivamente. Para análise estatística utilizou-se o teste de
Kruskal-Wallis, seguido pelo teste Student-Newman-Keuls para o ensaio do Cometa e, para apoptose, utilizouse qui-quadrado, considerados valores significativos aqueles com p<0,05. As maiores concentrações (125µg/
mL; 250µg/mL e 500µg/mL) utilizadas mostraram-se citotóxicas, apresentando viabilidade celular <70%. Para os
grupos tratados com 22 µg/mL; 44µg/mL e 88µg/mL não houve diferença estatisticamente significativa nos
escores de danos, sendo observada uma maior freqüência de classes com pouco dano no DNA (0 e 1). Para o
teste de Apoptose, as concentrações 22 µg/mL; 44µg/mL e 88µg/mL têm a capacidade de alterar as proporções
dos tipos de células (normal, apoptose e necrose). Conclusão: O extrato de Tephrosia cinerea não apresenta
efeito genotóxico e nem induz morte celular por apoptose nas concentrações 22µg/mL; 44µg/mL e 88µg/mL.
Apoio: CNPq e REUNI.
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Avaliação genotóxica e citotóxica dos extratos
hidroalcólicos de Cordia ecalyculata e Echinodorus
grandiflorus e dos anorexígenos sibutramina e
femproporex em linfócitos de indivíduos obesos
da Silva, CJa; dos Santos, JE b; Takahashi, CSa c
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo- Ribeirão Preto- SP - Brasil;
CRECIEM – Secretaria de Estado da Educação de Goiás – Goiás – Brasil e-mail: [email protected]
b
Departamento de Clinica Medica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, - Brasil. e-mail: [email protected]
c
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo- Ribeirão Preto-SP-Brasil. E-mail: [email protected]
a
Palavras-chave: obesidade, genotóxico, Cordia ecalyculata, Echinodorus grandiflorus, femproporex e sibutramina
A obesidade é uma doença crônica que certamente estimulará a sociedade atual a rever seus conceitos sobre
a modernidade técnico-científica. Além de todos os transtornos emocionais que a obesidade provoca no
acometido e em seus familiares, ela também está associada positivamente com várias doenças crônicas dentre
elas o diabete e o câncer. Está solidamente estabelecido que o aumento da massa corporal possua correlação
direta com o aumento de determinados tumores. Diante desta questão científica em nosso trabalho avaliamos
se os medicamentos anorexígenos sibutramina e femproporex e os extratos hidroalcólicos de Cordia ecalyculata e
Echinodorus grandiflorus provocam danos genotóxicos e/ou citotóxicos em linfócitos obtidos de indivíduos obesos,
visto que, os danos genéticos são os eventos iniciais da tumorigênese. Linfócitos do sangue periférico de 8 obesos
(3 homens e 5 mulheres, IMC: 40 - 62 kg/m2), com idade entre 30 - 45 anos, foram cultivados em meio RPMI e após
24h de cultivo retiramos alíquotas para o Ensaio Cometa (T0); acrescentamos as substâncias testes: sibutramina
ou femproporex (5, 10 e 20 µg/mL de meio de cultura) e C. ecalyculata ou E. grandiflorus (25, 50 e 80 µg/mL) após
24h de exposição retiramos novas alíquotas para Ensaio Cometa, trocamos o meio, acrescentamos citocalasina
B e após 28h retiramos as alíquotas para o teste do Micronúcleo. Nosso controle negativo foi meio RPMI e o
controle positivo (doxorrubicina 0,02 μg/mL). Na análise estatística utilizamos o Teste de t (α = 0.05). Sibutramina,
femproporex, C. ecalyculata e E. grandiflorus nas diferentes concentrações avaliadas não aumentaram (P>0.05)
os índices de linfócitos binucleados com micronúcleo, quando comparados com o tratamento controle negativo;
com exceção do tratamento com sibutramina na dose de 20 μg/mL de meio cujo índice foi significativamente
superior (P<0.05). Nenhuma de nossas substancias testes interferiu na divisão nuclear de linfócitos, inclusive
controles positivo (P>0.05). Quanto a danos genotóxicos em linfócitos expostos a sibutramina ou femproporex
verificamos escore de danos maiores (P<0.05) que o do tratamento controle negativo. Ao defrontarmos o
resultado de escore de danos nos linfócitos avaliados no tempo (T0) com os dos linfócitos do tratamento controle
negativo, não se detectamos diferença (P>0.05). Quanto C. ecalyculata, verificamos que os escores de danos, em
linfócitos, no tratamento de 50 μg/mL apresenta escore de danos superior ao do tratamento controle negativo.
Nos tratamentos dos linfócitos com o extrato de E. grandiflorus nas concentrações de 50 e 80 μg/mL os escores
de danos foram superiores (P<0.05) ao do controle negativo. Podemos concluir que nas condições e metodologia
deste estudo que tanto a sibutramina quanto o femproporex aumentam a freqüência de danos genéticos em
linfócitos de indivíduos obesos e os extratos de C. ecalyculata e E. grandiflorus induz fraca atividade genotóxica.
Apoio: CAPES, FAEPA, SEEGO, Departamento de Genética da FMRP.
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Avaliação do potencial mutagênico e antimutagênico
do extrato etanólico de Terminalia actinophylla em
células somáticas de Drosophila melanogaster
Abreu, BRR; Pádua, PFMR; Lehmann, M; Dihl, RR; Andrade, HHR
Laboratório da Toxicidade Genética (TOXIGEN), PPG em Genética e Toxicologia Aplicada (PPGGTA), Universidade Luterana do Brasil
(ULBRA), Canoas, RS, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: Terminalia actinophylla, mutagênese, antimutagênese, teste SMART, Drosophila melanogaster
Introdução: Espécies do gênero Terminalia são amplamente disseminadas nas áreas tropicais, sendo ricas
em metabólitos secundários, tais como triterpenóides pentacíclicos e seus derivados glicosilados, assim como
flavonóides, taninos e outros compostos aromáticos. A espécie Terminalia actinophylla, popularmente conhecida
como chapada, é frequentemente utilizada na medicina popular para o tratamento de distúrbios intestinais e em
processos de cicatrização, sem estudos que comprovem sua eficiência farmacológica, assim como sem investigações
relativas à sua atividade genotóxica e antigenotóxica. Objetivos: O presente trabalho avaliou a atividade mutagênica e
recombinogênica, assim como a ação antimutagênica do extrato aquoso de T. actinophylla. Métodos: Foi empregado
o Teste para Detecção de Mutação e Recombinação (SMART) em Drosophila melanogaster através do cruzamento
padrão, que apresenta níveis normais de enzimas de metabolização do tipo citocromo P450. Resultados: Os dados
obtidos evidenciam que nas larvas trans-heterozigotas (mwh/flr3), oriundas dos cruzamentos padrão e aprimorado,
o extrato de Terminalia actinophylla (TAE) não induz aumentos estatisticamente significantes em nenhuma das
categorias de manchas mutantes avaliadas. As diferenças entre os dois cruzamentos estão relacionadas aos níveis
de enzimas do tipo citocromo P450. Dentro deste contexto, os nossos dados evidenciam a ausência de ação direta
e indireta do TAE no que tange a indução de mutação, pontual e/ou cromossômica, assim como de recombinação
mitótica no teste SMART. Quando foi avaliada a ação antigenotóxica do TAE, tanto as lesões induzidas pelo
etilmetanosulfonato (EMS) quanto pela mitomicina C (MMC) não foram modificadas pelo pós-tratamento
com este extrato. Conclusões: Estas respostas sugerem que o TAE não atua sobre os mecanismos envolvidos no
processamento das lesões induzidas por ambas as genotoxinas avaliadas. Por outro lado, no genótipo mwh/flr3, o
co-tratamento com TAE conduz a uma proteção estatisticamente significativa em relação à genotoxicidade da
MMC e a uma diminuição fraco-positiva sobre as lesões induzidas pelo EMS - na maior concentração do extrato. No
genótipo heterozigoto para o cromossomo balanceador TM3 (mwh/TM3), o TAE mostra uma ação antimutagênica
significativa em relação a MMC - embora não interfira na genotoxicidade do EMS. A somatória destes resultados leva
a sugestão de que o TAE esteja favorecendo a modulação dos danos genéticos induzidos, via atividade antioxidante.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS e ULBRA.
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Avaliação das atividades tóxicas, citotóxica e genotóxica
do líquido da castanha do caju (Anacardium occidentale)
técnico (LCCt) através do teste Allium cepa
Leite, AS1; Citó, AMGL2; Lopes, JAD2; Melo-Cavalcante, AAC3
Aluna do Programa de Pós-Graduação da RENORBIO-Universidade Federal do Piauí
Departamento de Química da UFPI; 3 Laboratório Central de Saúde do Piauí (LACEN).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Allium cepa, LCCt, tóxico, citotóxico e genotóxico
Anacardium occidentale pertence à família Anacardiaceae, uma planta nativa do Brasil que está presente
principalmente na região Nordeste do Brasil e o Piauí é um dos maiores produtores de castanha de caju. O
fruto verdadeiro é composto pela castanha de caju e um líquido viscoso e vesicante conhecido como Líquido
da castanha do caju (LCC). Estudos têm atraído a atenção de pesquisadores como atividade antioxidante,
inibição da atividade acetilcolinesterase, antimutagênica e antigenotóxica. O objetivo deste estudo foi avaliar
os possíveis efeitos tóxicos, citotóxico e genotóxico em meristemas de raízes de Allium cepa expostas ao LCCt,
pela análise do crescimento das raízes, índice mitótico (IM), freqüências de micronúcleos (%MN) e de aberrações
cromossômicas (% AC). O sistema teste A. cepa foi organizado com cinco grupos: Grupo 1 (controle negativo
(CN)), raízes emersas em água sem cloro; Grupo 2 (controle positivo, CuSO4 na concentração de 0,0006 mg/
mL); Grupo 3 (LCCt em 0,06 g/L); Grupo 4 (LCCt em 1,2 X 10-5g/L). Cerca de 1.000 células meristemáticas de
raízes de A. cepa foram analisadas ao microscópio óptico, 5.000 por tratamento. Nos LCCt1 e o LCCt2 não
foram observadas diferenças significativas (P>0,05) para atividade tóxica em relação ao CN. Também não
apresentou atividade citotóxica em relação ao IM do LCCt1 e do LCCt2 quando comparado com CN (P>0,05).
Assim como não foram observadas diferenças significativas (P>0,05) entre a freqüência de AC do LCCt1 e LCCt2,
em relação ao CN, indicando que os produtos não possuem efeitos aneugênicos e/ou clastogênicos. De forma
similar, a freqüência de MN observada em LCCt1 e do LCCt2 não foram estatisticamente significante (P>0,05).
Assim, sugerimos mais estudos sejam desenvolvidos com LCCt, pois este parece ter um potencial biológico
indicado para desenvolvimento de polímeros por não ser tóxico, citotóxico e genotóxico neste sistema-teste.
Apoio financeiro; CNPq-MCT/RENORBIO
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Investigação do potencial genotóxico in vitro do extrato
hidroalcoólico de Julocroton triqueter (euphorbiaceae)
Moreira, VR1; Dias, ACS1; Lima, MIS1, PEREIRA, SRF1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - Universidade Federal do Maranhão
[email protected]
1
Palavras-chave: Plantas medicinais, teste do cometa, anti-leishmaniais, genotoxicidade, apoptose
Introdução: A leishmaniose é uma doença transmitida pela picada de insetos conhecidos como flebotomíneos
e estima-se que em todo o mundo haja 1,5 a 2 milhões de casos por ano. A necessidade de identificar novos
compostos anti-leishmaniais mais eficazes e menos tóxicos em relação às drogas convencionais tem movido
pesquisas na busca de produtos naturais isolados de espécies vegetais. Para isso, são necessários estudos sobre
seus efeitos secundários, dentre os quais seu potencial genotóxico. Trabalhos recentes demonstraram que o
extrato hidroalcoólico de Julocroton triqueter var. triqueter apresenta uma expressiva atividade anti-leishmanial,
além de atividades antiinflamatória e analgésica (BEZERRA et al, 2006). Contudo, não há informações sobre a
genotoxicidade desse extrato vegetal sendo, portanto, necessário avaliar os seus efeitos sobre o material genético.
Objetivo: Avaliar o potencial genotóxico e mutagênico do extrato hidroalcoólico de folhas de Julocroton triqueter
var. triqueter em linfócitos de sangue periférico humano in vitro. Métodos: As folhas de Julocroton triqueter var.
triqueter foram secas e extraídas através do processo de maceração com EtOH a 70% . As soluções extrativas foram
filtradas e concentradas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, obtendo-se o extrato hidroalcoólico. Para
este estudo utilizou-se o Teste do Cometa in vitro e apoptose em linfócitos obtidos a partir de sangue periférico
de seis doadores voluntários. Foram testadas 4 concentrações (15 µg/ml, 30µg/ml, 60µg/ml, 120µg/ml) além do
controle de veículo (DMSO 1%), controle negativo (RPMI 1640) e positivo (água oxigenada 10V). Para o Teste
do cometa, as células foram expostas por 3 e 24 horas sendo avaliados 100 nucleóides por indivíduo em cada
uma das quatros concentrações e o escore de danos foi calculado a partir da distribuição das suas diferentes
classes (0 a 4) de acordo com o grau de dano. Para o ensaio de apoptose, foram observadas 500 células após serem
expostas por 48 horas as diferentes concentrações. A análise dos dados foi feita por ANOVA seguido pelo teste
Turkey e qui-quadrado, para o Teste do cometa e apoptose, respectivamente. Resultados: As classes de dano mais
freqüentes observadas pelo Teste do cometa foram classe 0 e classe 1 e não houve diferença estatística significante
nos diferentes escores de danos quando comparados em relação ao controle negativo e nem quando comparados
entre si. Em todas as concentrações testadas o extrato foi capaz de induzir necrose e diminuir a proporção de morte
celular por apoptose. Conclusões: O extrato de Julocroton triqueter var. triqueter não apresenta atividade genotóxica
e reduz a morte celular por apoptose in vitro nas concentrações em que apresenta atividade leishmanicida.
Apoio: CNPq e CAPES.
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Análise frequência de micronúcleos em Linfócitos T
expostos à paroxetina
Diniz, LS¹; da Silva, JF¹; Manso, JAX¹; de Oliveira, JSP¹; Hanusch, AL¹; Cunha, DMC¹; da Cruz, AD¹²
1 - Laboratório Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
2 - LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – Vinculado ao Lacen – Laboratório de Saúde Pública Dr.
Giovanni Cysneiros – Secretaria da Saúde do Estado de Goiás.
[email protected]
Palavras-chave: Clastogênese, Aneugênico, Binucleada, Medicamento, Mutagênese
A paroxetina é um potente inibidor seletivo da recaptação da serotonina. Além dos transtornos depressivos a
paroxetina tem sido empregada nos distúrbios em que, supostamente, há uma influência serotonérgica como no
transtorno obsessivo compulsivo e distúrbio do pânico. Com o aumento da incidência da depressão na sociedade
moderna, nota-se um aumento na utilização de antidepressivos, assim como a preocupação com os efeitos
adversos, inclusive efeitos mutagênicos, resultantes do uso abusivo de medicamentos. O objetivo deste estudo foi
investigar a ação mutagênica da paroxetina em Linfócitos T utilizando o teste de micronúcleos. As amostras de
sangue periférico foram coletadas por pulsão venosa em seringas descartáveis. Para o grupo teste foram utilizados
diferentes volumes da solução de 2,5g/L, resultando diferentes concentrações de Paroxetina. Para o controle positivo
foi utilizado mitomicina C na concentração de 0,1g/L. As amostras foram processadas logo após a coleta conforme
o protocolo para obtenção de células binucleadas segundo da Cruz et al.(1994). As lâminas foram coradas usando
o corante hematológico-rápido (panóptico) segundo as instruções do fabricante. Foram analisadas 500 células
binucleadas para cada caso exposto/controle sob microscopia óptica com objetiva 100x, com subsequente registro
dos micronúcleos observados. Os resultados observados indicam aumento significativo (P<0,05) na frequência
de micronúcleos em Linfócitos T do sangue periférico humano, de acordo com o aumento da concentração da
paroxetina, permitindo assim, identificar o potencial clastogênico e/ou aneugênico da paroxetina. As diversas
doses testadas da paroxetina apresentaram ação genotóxica, sendo capaz de induzir danos genômicos, os quais
são considerados importantes eventos na iniciação e promoção tumoral.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Avaliação in vitro dos efeitos genotóxicos do fármaco
antimalárico artemeter em cultura temporária de
linfócitos
Cardoso, P. C. S*; Mota, T. C.; Melazo, N. M. M; Gomes, L. M.; SANTOS, R. A.; Bahia, M. O.; Burbano, R. R
Laboratório de Citogenética Humana (LCH), Instituto de Ciências Biológicas (ICB), Universidade Federal do Pará (UFPA)/ Belém-PA, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: artemeter, malária, linfócitos, ensaio cometa, genotoxicidade
Introdução: A malária é uma patologia de natureza parasitária, que apresenta grande incidência no Brasil,
principalmente na Região Amazônica. Em 2002 foram registrados em torno de 358 mil casos, sendo que cerca de
40% destes ocorreram no estado do Pará. O artemeter é um dos principais compostos empregados no tratamento
de pacientes com malária. É uma droga derivada da planta chinesa Artemisia annua L. Apesar do amplo uso deste
composto no combate desta patologia, ainda hoje são poucos os registros que demonstram os efeitos genotóxicos
do artemeter em cultura temporária de linfócitos humanos. Assim, no presente trabalho, pretendemos avaliar os
efeitos genotóxicos do artemeter em cultura de linfócitos submetidos a diferentes concentrações desta droga através
do ensaio cometa. Métodos e Resultados: A partir de três voluntários saudáveis, foi obtido sangue para cultura de
linfócitos, que foi realizada com o auxílio de seringas descartáveis, sendo o sangue, em seguida, submetido ao
processo de isolamento de linfócitos de acordo com Fenech (2000). Foram cultivadas 1x106/mL de células em 5 mL
de RPMI 1640 completo. A cultura foi incubada em estufa contendo 5 % de CO2 e 95 % de O2 a 37°C. Após 20 h em
cultura, os linfócitos foram tratados com diferentes concentrações de artemeter (7,46; 14,92; 29,84 µg/mL) e após 3 h
de incubação com a droga, foram coletadas amostras para a realização do ensaio do cometa. Os resultados obtidos
demonstraram um aumento significativo (p<0,05) no índice de dano (ID) avaliado pelo teste do cometa em todas
as concentrações testadas (7,46µg/mL, ID=1,3; 14,92µg/mL, ID=1,6; 29,84µg/mL, ID=1,7), quando comparadas ao
controle negativo (ID=0,7). Conclusões: O artemeter mostrou um claro efeito genotóxico nas condições avaliadas.
Apoio Financeiro: UFPA, FAPESPA, CNPq
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Polimorfismo genético LEP G-2548A em adolescentes
do Ensino Médio de Joinville-SC
Debortoli G1; Mastroeni MF2
Curso de Ciências Biológicas. Laboratório de Saúde. Universidade da Região de Joinville – UNIVILLE
Curso de Ciências Biológicas. Programa de Mestrado em Saúde e Meio Ambiente. Laboratório de Saúde. UNIVILLE.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Leptina, G-2548A, Adolescentes, Obesidade, LEP
Nos últimos anos a obesidade tem crescido significativamente também entre crianças e adolescentes. Segundo o
Ministério da Saúde, em 2003 16,7% dos adolescentes entre 10 e 19 anos apresentaram excesso de peso e, destes,
2,3% obesidade. A principal causa é a mudança de hábitos alimentares, com aumento no consumo de alimentos
industrializados e um estilo de vida mais sedentário, aliados também, a fatores genéticos e metabólicos. O gene
LEP (OB) é responsável pela decodificação do hormônio da leptina. A leptina é uma das substâncias responsáveis
pelo controle da ingestão alimentar. Sua ação no sistema nervoso central de mamíferos promove a redução da
ingestão alimentar e o aumento do gasto energético, além de regular a função neuroendócrina e o metabolismo da
glicose e de gorduras. Alguns estudos indicam que uma mutação silenciosa no códon 25 CAA/CAG (Gln25Gln) do
gene LEP (OB), pode estar associada à obesidade mórbida. Alguns autores revelaram que indivíduos portadores
do alelo G possuem quatro vezes maior risco de desenvolverem obesidade em relação aos indivíduos portadores
do alelo A. Este estudo teve como objetivo estimar a prevalência do polimorfismo genético LEP G-2548A em
adolescentes da rede Estadual de Ensino de Joinville-SC. A amostra foi composta de 50 estudantes da rede estadual
de ensino médio com idade entre 15 a 17 anos residentes em Joinville em 2007, selecionados por amostragem
aleatória simples de um grupo de 218 voluntários. O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue venoso
armazenadas em cartão “clonesaver”, conforme instruções do fabricante. A amplificação do gene LEP G-2548A foi
realizada aplicando-se as técnicas PCR-RFLP. Em seguida os amplicons foram digeridos pela endonuclease Alw44I
e os produtos de PCR submetidos à eletroforese submersa em gel de agarose a 2%. Em relação às freqüências
genotípicas, o genótipo GG foi o mais prevalente (54,0%), e as prevalências dos genótipos GA e AA foram 38,0% e
8,0%, respectivamente. A freqüência alélica do alelo G foi de 0,73, e a do alelo A foi 0,27. Apesar da maior prevalência
do genótipo homozigoto GG encontrado neste estudo, a associação desse resultado com outras variáveis como
perfil bioquímico, prática de atividade física, entre outras, deve ser também analisada. A reeducação alimentar
em conjunto com a identificação gênica de possíveis mutações em hormônios relacionados à obesidade podem
melhorar o diagnóstico e tornar ainda mais eficaz as medidas preventivas para a enfermidade investigada.
Apoio financeiro: FAP Univille.
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Avaliação genotóxica in vitro de paroxetina em
linfócitos T em humanos
Manso, JAX1; Diniz, LS1; Carrera, ER1; da Mota, PR1; de Abreu, JB1; Cunha, DMC1, da Cruz, AD1,2
Laboratório Replicon – Departamento de Biologia - Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – Vinculado ao Lacen – Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovanni
Cysneiros – Secretaria de Saúde do Estado de Goiás.
[email protected], joã[email protected]
1
2
Palavras-chave: Citogenética, Clastogenicidade, Cromossomos, Antidepressivo, Mutagênese.
Nos últimos anos tem se percebido o aumento de diagnósticos de pessoas que sofrem de depressão e
conseqüentemente o aumento do consumo de medicamentos antidepressivos, os quais nem sempre são adquiridos
com prescrição médica (automedicação). Tendo conhecimento desses fatos, observamos a possibilidade da
realização de testes mutagênicos de quebra cromossômica, sendo que estes, ocorrem através da interação da
droga com o sangue periférico. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito mutagênico das diferentes concentrações
de paroxetina em cultura de linfócitos T, pela indução de danos clastogênicos e a aneugênicos. Foram coletadas
amostras de sangue periférico obtidas por punção venosa de voluntários que não faziam o uso de nenhum tipo
de medicamento, posteriormente este sangue foi adicionado ao meio de cultura RPMI1640, o qual também já
havia recebido os acréscimos de fitohemaglutinina, soro fetal bovino, L-Glutamina e as diferentes concentrações
de paroxetina. Em seguida as amostras foram incubadas em estufa a 37 ºC por 48 horas, logo após adicionouse colchicina a qual paralisa o ciclo celular possibilitando a obtenção de metáfases que poderão ser analisadas
após a preparação das lâminas. Para isso deve-se analisar os cromossomos na sua forma estrutural e numérica,
para tornar possível a determinação da freqüência das diferentes alterações observadas, e assim termos um
conhecimento do potencial mutagênico do remédio. A partir da análise estatística utilizando o teste qui-quadrado,
pôde-se perceber que os grupos expostos e os grupos controle diferiram estatisticamente entre si (P<0,05). O
grupo amostral demonstrou diferenças sendo que os casos de 25% e 100% apresentaram maior proximidade com o
controle negativo, concluindo que o medicamento promove alterações, mas não tanto quanto o controle positivo.
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Análise da Expressão de Enzimas Antioxidantes em
Corbicula fluminea em Resposta a Contaminação por
Metais Pesados
Morais, L G.¹;² Oliveira, MA.² & Abessa, DMS.¹
¹Núcleo de Estudos em Poluição e Ecotoxicologia Aquática, UNESP
²Laboratório de Biologia Molecular Estrutural. UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: Contaminação, Corbicula fluminea, enzimas antioxidantes
O Vale do rio Ribeira de Iguape apresenta um histórico de intensa atividade de mineração, com foco principal na
extração de chumbo (Pb). A participação da produção mineral de chumbo das minas situadas na região chegou a ser
responsável por 25 a 35% do total da produção nacional. Durante seu período de funcionamento foram lançadas na
Bacia Hidrográfica do rio Ribeira de Iguape aproximadamente 5,5 t/mês de elementos tóxicos (Arsênio – As, Cádmio
– Cd, Cobre – Cu, e Cromo – Cr, Chumbo - Pb e Zinco - Zn) sob a forma de rejeito do concentrado e/ou escória. Em
1991, a prática de despejo de material tóxico diretamente no rio foi interrompida, o que resultou na disposição desse
material diretamente sobre o solo, ainda permitindo que os contaminantes atingissem o rio, por arraste através
das águas superficiais e subterrâneas. Dados existentes demonstram a fragilidade ambiental da região justificando
a necessidade de pesquisas que avaliem os efeitos ecológicos da contaminação. A exposição dos organismos aos
metais produz, através de reações químicas como as de Fenton e Haber Weiss, espécies reativas de oxigênio (EROs),
como os radicais livres (radicais hidroxilas [HOl] e o ânion superóxido [O2l]) e espécies não radicalares [H2O2]. Uma
vez que essas substâncias são extremamente tóxicas à célula, os organismos necessitam se defender utilizando
enzimas como a metalotioneína (Met), superóxido dismutase (Sod), catalase (Cat) , glutationa peroxidase (Gpx)
e peroxirredoxinas (Prx). Desta forma, a exposição dos organismos a altas concentrações deve resultar em um
aumento nos níveis de expressão destas enzimas, que pode ser medido e assim constituir importante conjunto de
biomarcadores para o monitoramento ambiental. Tal análise é feita através do monitoramento dos níveis de RNA
mensageiro (RNAm) de enzimas antioxidantes. O presente trabalho visa objetivo padronizar metodologias para
avaliar os níveis de expressão das proteínas antioxidantes Met, Sod, Cat, Gpx e Prx, utilizando como organismo
modelo o bivalve Corbicula fluminea, muito abundante na área de estudo e frequentemente utilizada em avaliações
ambientais. Espécimes foram coletados em áreas do rio Ribeira, anteriormente caracterizadas como contaminadas
e não contaminadas por metais. Previamente, foram desenhados oligonucleotídeos utilizando sequencias gênicas
presentes em bancos de dados para utilização na metodologia RT-PCR. A análise de expressão foi inicialmente
padronizada para transcritos da enzima Met, responsável por quelar metais, evitando a produção de EROs. Foram
retiradas as brânquias dos animais, e os tecidos foram macerados para que se pudesse extrair o RNA total das
células; a partir disso foram realizadas transcrição reversa, amplificação do material por PCR 40 ciclos à 60ºC e o
material foi analisado por meio de eletroforese. Os resultados revelam diferenças nos níveis de expressão de áreas
contaminadas e não contaminadas por metais.
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Ação citotóxica da paroxetina em linfócitos T do
sangue periférico humano
da Silva, JF¹; Diniz, LS¹; Manso, JAX¹; Machado, RC¹; Hanusch, AL¹; Cunha, DMC¹; da Cruz, AD¹²
1 - Laboratório Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
2 - LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – Vinculado ao Lacen – Laboratório de Saúde Pública Dr.
Giovanni Cysneiros – Secretaria da Saúde do Estado de Goiás.
Palavras-chave: Apoptose, Citotoxidade, Mutagênese, Antidepressivos e Medicamento.
Os modernos estudos em biologia celular têm desenvolvido uma diversidade de métodos que permite identificar
os efeitos mutagênicos e citotóxicos de medicamentos nos diversos tipos celulares. Um destes testes consiste na
avaliação do índice de células apoptóticas. Um dos mecanismos indutores de apoptose está diretamente associado
ao aumento de danos genômicos, evidenciando ação mutagênica do produto avaliado. O Objetivo deste estudo foi
investigar o índice de células em apoptose de linfócitos T do sangue periférico humano. Os linfócitos foram expostos
em cultura às diferentes concentrações de paroxetina, antidepressivo inibidor seletivo de recaptação da serotonina.
As amostras de sangue periférico foram coletadas por punção venosa em seringas descartáveis. Para o grupo teste
foi utilizado diferentes volumes da solução de 2,5 g/L resultando diferentes concentrações de paroxetina. Para o
controle positivo foi utilizado mitomicina C na concentração de 0,1g/L. As amostras foram processadas logo após a
coleta conforme o protocolo para a obtenção de metáfases segundo da Cruz et al.(1994). As lâminas foram coradas
usando o corante hematológico-rápido (panóptico) segundo as recomendações do fabricante. Foram analisadas
25000 células interfásicas, distribuídas em 5000 células para cada caso exposto/controle sob microscopia óptica
com objetiva 40X, com subseqüente registro das células apoptóticas. Os resultados observados indicam aumento
significativo (p<0,05) na freqüência de células em apoptose em linfócitos T do sangue periférico humano, de acordo
com o aumento da concentração de paroxetina, permitindo assim, identificar a indução apoptótica da paroxetina,
o que pode ocasionar lesões proliferativas e/ou degenerativas.
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Investigação da Genotoxicidade do Metilfenidato (Ritalina®)
em Linfócitos T Humanos Utilizando o Teste Cometa
de Abreu, JB1; Machado, RC1; Hanusch, AL1; Portis, IG1; da Silva, CC1,2; da Cruz, AD1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, GO.
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular – LACEN/SES/GO.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mutagênese, Ritalina®, Metilfenidato, Oncogênese, Dano Genômico
Os estudos das diversas causas e mecanismos de mutação vêm sendo desenvolvidos desde o início do século
XX. Os resultados desses estudos levaram a questionamentos de quanto seriam essas mutações prejudiciais à
saúde humana e quais seriam os efeitos desses supostos prejuízos posteriormente. Os agentes mutagênicos são
responsáveis por alterações na seqüência do DNA, essas alterações dependendo de sua amplitude, podem gerar
diversos distúrbios e até mesmo, ser a causa de divisões descontroladas de células desencadeando a oncogênese.
O objetivo deste estudo foi avaliar a genotoxicidade induzida pelo composto medicinal metilfenidato em linfócitos T utilizando o ensaio cometa. Foram diluídos comprimidos do medicamento Ritalina® em água deionizada,
resultando nas diferentes concentrações de 20mg.mL-1, 30mg.mLl-1, 40mg.mL-1 e 50mg.mL-1. Para a realização do
ensaio cometa utilizou-se da suspensão de células sanguíneas coletadas de sangue periférico humano, que foram
expostas nas soluções do medicamento e incubadas em estufa por 2 horas, constituindo assim o grupo exposto
(GE). O teste cometa foi desenvolvido a partir do protocolo de Singh (1998). As lâminas foram analisadas sob microscopia de epifluorescência e os núcleos foram visualizados utilizando objetivas de 40x e 60x. A imagem foi capturada empregando o software ISIS®. Na determinação dos danos ao DNA os cometas foram analisados de acordo
com o comprimento da cauda, a porcentagem de DNA contido na cauda e a porcentagem de DNA contido na
cabeça utilizando o software CometScore™. Para análise estatística foi utilizado o teste ANOVA e o teste de Tukey
comparando a média das diferentes concentrações do grupo exposto e do grupo controle negativo. A média do
tamanho da cauda dos cometas do CN foi de 2,7±1,5 sendo a concentração de 20mg.mL-1 (2,19±1,6) e a de 40mg.
mL-1 (4,84±2,84) as que apresentaram um maior nível de dano genômico. Não houve diferença estatística entre o
dano causado pela exposição a concentração de 40mg.mL-1 (4,84±2,84) quando este foi comparado com o grupo
controle positivo (3,7±2,22), sugerindo que estes induzem a um mesmo nível de dano genômico. As doses de 20mg.
mL-1 e 40mg.mL-1 apresentam ação genotóxica, sendo capazes de influenciar no número e no aparecimento de
mutações, que são consideradas importantes eventos na iniciação e promoção tumoral.
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Avaliação dos níveis de danos no DNA pelo Ensaio
Cometa em culturas de linfócitos submetidas a
diferentes condições glicêmicas
Silva, F. S.1; Xavier, D. J.2; Sakamoto-Hojo, E. T.1,2
Departamento de Genética - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
[email protected]
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Palavras-chave: Diabetes Mellitus tipo 2, dano oxidativo, hiperglicemia, Ensaio Cometa
Introdução: O DM (Diabetes Mellitus) é uma das principais causas de morbidez e mortalidade no planeta, atingindo
em torno de 5% da população mundial. Em torno de 90% dos casos de diabetes tratam-se de DM tipo 2 (DM2). Essa
doença pode ser associada a um elevado nível de estresse oxidativo, provavelmente resultante da hiperglicemia,
estimulando um aumento na produção de ROS (Reactive Oxygen Species) por meio da oxidação da glicose e
fosforilação oxidativa. Evidências indicam que no DM2 o dano oxidativo é gerado como consequência da doença,
sendo uma resposta direta ao excesso de glicose e ácidos graxos na corrente sanguínea. Em um trabalho anterior,
realizado no presente laboratório, pacientes DM2 hiperglicêmicos apresentaram maiores níveis de dano no DNA do
que pacientes com níveis glicêmicos normais, apontando a hiperglicemia como o principal fator gerador de estresse
oxidativo. Objetivos: realizar estudos in vitro em culturas de linfócitos de indivíduos sadios, com a utilização do ensaio
cometa (Singh et al., 1988) para avaliar os danos no DNA induzidos por agentes oxidantes (glicose e água oxigenada).
Métodos: Foram coletadas amostras de sangue periférico de 3 indivíduos, sendo as células mononucleadas
separadas com Ficoll (GE healthcare). As culturas foram submetidas a um tratamento contínuo com diferentes
concentrações de glicose (zero, 10mM e 25mM), sendo que o manitol foi utilizado como controle osmótico (16,5
mM) e o peróxido de hidrogênio como controle positivo (80 µM). A análise de danos no DNA pelo ensaio cometa
foi realizada após 24 e 48 horas a partir do início do tratamento. Resultados: os resultados foram estatisticamente
avaliados pelo programa “Two way Anova Repeated Measures”; os linfócitos tratados com o peróxido de hidrogênio
apresentaram um nível de danos maior quando comparado aos demais tratamentos, 20,6% e 45,10% de DNA na
cauda, para 24h e 48h respectivamente, contra 11,64% e 17,08% observados para os respectivos controles negativos,
para um p<0,05. Contudo não houve diferença estatisticamente significativa entre os diferentes tratamentos de
glicose; para concentração de 10mM e 25mM, o tratamento de 24h apresentou 18,86% e 16,86%, respectivamente de
DNA na cauda, enquanto para o tratamento de 48h esses valores foram de 24,28% e 16,16% . Da mesma forma, não
houve diferença significativa nos níveis de dano no DNA entre os diferentes tempos de tratamento. Conclusão: os
resultados indicaram que a glicose 10mM causou a indução de danos no DNA avaliados pelo Ensaio Cometa, sendo
que experimentos adicionais com outros indivíduos e tempos maiores de tratamentos estão sendo analisados.
Apoio financeiro: FAPESP (2008/56594-8; 2010/01260-8)