Dissertação de Maisa Moreira Sant`Ana

OCORRÊNCIA DO BANANA STREAK
VIRUS (BSV) E DO CUCUMBER MOSAIC VIRUS (CMV)
EM CULTIVO CONVENCIONAL E ORGÂNICO
DE BANANEIRAS (Musa spp.) NO VALE DO RIBEIRA
MAISA MOREIRA SANT’ ANA
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico, da Agência Paulista de Tecnologia
dos Agronegócios, para obtenção do título
de Mestre em Sanidade, Segurança
Alimentar e Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal
Orientador(a): Dra. Addolorata Colariccio
São Paulo
2013
INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
OCORRÊNCIA DO BANANA STREAK
VIRUS (BSV) E DO CUCUMBER MOSAIC VIRUS (CMV)
EM CULTIVO CONVENCIONAL E ORGÂNICO
DE BANANEIRAS (Musa spp.) NO VALE DO RIBEIRA
MAISA MOREIRA SANT’ ANA
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico, da Agência Paulista de Tecnologia
dos Agronegócios, para obtenção do título
de Mestre em Sanidade, Segurança
Alimentar e Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal
Orientador(a): Dra. Addolorata Colariccio
São Paulo
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Núcleo de Informação e Documentação – IB
Sant’Ana, Maisa Moreira.
Ocorrência do Banana streak vírus (BSV) e do Cucumber mosaic vurus (CMV)
em cultivo convencional e orgânico de Musa spp no Vale do Ribeira. / Maisa Mo reira Sant’Ana. -- São Paulo, 2013.
77 p.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de PósGraduação.
Área de concentração: Sanidade Animal, Segurança Alimentar e Ambiental
no Agronegócio
Linha de pesquisa: Biodiversidade: caracterização, interações, interações eco–
lógicas em agroecossistemas.
Orientador: Addolorata Colariccio.
Versão do título para o inglês: Occurence of Banana streak vírus (BSV) and Cucumber mosaic vírus (CMV) in conventional and organic farming of Musa spp in Vale do Ribeira.
1. Cucumber mosaic vírus 2. Banana streak virus 3. Bananeiras 4. Vale do
Ribeira I. Sant’Ana, Maisa Moreira II. Colariccio, Addolorata III. Instituto Biológico
(São Paulo). IV. Título
IB/Bibl./2013/008
FOLHA DE APROVAÇÃO
Maisa Moreira Sant’ Ana
Título: Ocorrência do Banana streak virus (BSV) e do Cucumber mosaic
virus (CMV) em cultivo convenciona e orgânico de bananeira (Musa spp.)
no Vale do Ribeira
Orientador(a): Addolorata Colariccio
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico da Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios para
obtenção do título de Mestre em
Sanidade,
Segurança
Alimentar
e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração:Sanidade Vegetal
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
*Prof. (a) Dr.(a):
*Instituição:
Assinatura:
*Prof. (a) Dr.(a):
*Instituição:
Assinatura:
*Prof. (a) Dr.(a):
*Instituição:
i
Dedico a todos os meus familiares e amigos que sempre acreditaram no meu potencial e
nunca me deixaram desistir de trilhar os meus sonhos e objetivos. Muito obrigada.
ii
AGRADECIMENTOS
 A Dra. Addolorata Colariccio, pela consideração e orientação da presente dissertação, pelo
aprendizado, carinho e pela confiança em mim depositada;
 Ao Dr. Wilson da Silva Moraes, Pesquisador da Agência Paulista de Tecnologia dos
Agronegócios, no Laboratório de Sanidade Animal e Vegetal de Registro, SP, sempre
presente na minha vida acadêmica e pelo importante auxílio prestado na execução deste
trabalho, principalmente no experimento de campo;
 Ao Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia do Instituto Biológico, por tornar possível a
realização deste trabalho;
 A coordenação da Pós-graduação em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental do
Agronegócio, do Instituto Biológico, pela oportunidade, pelos conhecimentos adquiridos e
pela colaboração nos procedimentos administrativos;
 Ao Sr. Alberto José dos Santos, funcionário na Agência Paulista de Tecnologia dos
Agronegócios, no Laboratório de Sanidade Animal e Vegetal de Registro, SP pela ajuda
prestada em todas as coletas de campo;
 Ao Sr. José Carlos de Mendonça, engenheiro agrônomo da empresa Comtécnica
Agropecuária de Registro, pela ajuda prestada junto aos bananicultores;
 Aos pesquisadores do Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia: Marcelo Eiras, Alexandre
Rodrigues Levi Chaves, Marcos Gonsalves, Lígia Maria Lembo Duarte, Maria Amélia Vaz
Alexandre, Eliana Borges Rivas, pela receptividade que tive no laboratório, pelo carinho e boa
vontade em ajudar;
 As técnicas de laboratório do Instituto Biológico, Alyne Ramos e Renata Vaz Lobo Spinelli,
pela atenção e disponibilidade em ajudar, sempre no que foi preciso;
 Aos colegas da pós-graduação do Instituto Biológico, em especial aos alunos: Danielle
Gobatto, pela amizade, pela ajuda prestada, bom humor, carinho e amizade; ao Toshikatsu
Tomomitsu, pela amizade, consideração e pelas caronas para as aulas em Campinas; e à
Karen Wolf Maciel, pelo carinho, amizade e por me receber em sua casa em Capinas sempre
que necessário e com um grande sorriso no rosto;
 Agradeço também, a todos os bananicultores da região do Vale do Ribeira que possibilitaram
a montagem do experimento e a coleta de material necessário para a realização do presente
trabalho, em particular ao Sr. Geraldo Xavier de Oliveira, do bairro Guapiruvu em Sete
Barras, ao Sr. José Luiz Correia, do bairro Guaraú em Jacupiranga e o Sr. José de Paula
Teixeira em Registro, SP;
 A minha amiga Juliana Peres, pela hospedagem a cada coleta de material em Registro;
 As minhas amigas Ana Laura Pillon e Flavia Barbosa, pela ajuda prestada, conselhos, carinho
e amizade;
 Aos meus familiares: minha mãe Gildete, meus irmãos Wilson e Marcelo, e as minhas
queridas sobrinhas, que são a base do que sou hoje e que estiveram sempre presentes e
dispostos a me ajudar;
iii
Como não é possível citar o nome de todos, meus profundos agradecimentos vão para aqueles
que colaboraram direta ou indiretamente e que tornaram possível a conclusão desta dissertação de
mestrado.
Muito obrigada.
“Quanto mais nos elevamos, menores parecemos aos olhos daqueles que não sabem voar.”
Friedrich Nietzsche
iv
SANT’ ANA, M. M. OCORRÊNCIA DO BANANA STREAK VIRUS (BSV) E DO CUCUMBER MOSAIC
VIRUS (CMV) EM CULTIVO CONVENCIONAL E ORGÂNICO DE BANANEIRA (MUSA SPP) NO
VALE DO RIBEIRA. São Paulo. 2012. Dissertação (Mestrado em Sanidade Vegetal, Segurança
Alimentar e Ambiental no agronegócio) - Instituto Biológico
RESUMO
O Brasil é o quarto maior produtor mundial de banana e São Paulo é o maior estado produtor,
destacando-se o Vale do Ribeira como principal região produtora. Entre os problemas fitossanitários
que podem causar grandes perdas para a cultura da banana, estão as viroses. Além das limitações
na produção, os vírus tem sido um dos principais entraves para a livre movimentação de
germoplasma dessa espécie em várias regiões do mundo. No Brasil, o Cucumber mosaic virus (CMV)
e o Banana streak vírus (BSV) são as únicas espécies de vírus descritas na cultura. O CMV pertence
ao gênero Cucumovirus é transmitido na natureza por afídeos, ferramentas e material propagativo. O
BSV pertence ao gênero Badnavirus é transmitido na natureza por cochonilhas ou por material
propagativo infectado, não sendo eliminado pela cultura de ápices meristemáticos, uma vez que o
DNA do vírus pode estar incorporado ao genoma da planta. O presente trabalho teve como objetivo
estudar a incidência do BSV e CMV em bananais de duas propriedades rurais, uma de cultivo
convencional e outra de cultivo orgânico no Vale do Ribeira, bem como de realizar um levantamento
da ocorrência destes vírus nos principais municípios produtores de banana da região. As bananeiras
foram avaliadas pelos sintomas, pela presença dos vírus, e pelo crescimento vegetativo, em uma
propriedade de cultivo convencional no município de Registro (SP) e outra de cultivo orgânico no
município de Sete Barras (SP). O levantamento para ocorrência do BSV e do CMV em bananeiras
adultas foi realizado em bananais comerciais de cultivo convencional nos municípios de Sete Barras,
Pariquera-acú, Jacupiranga e Cajati, no Vale do Ribeira, SP. Os sintomas do CMV e do BSV podem
ser confundidos, por isso é importante à detecção e identificação precoce dos vírus. Por este estudo
verificou-se que o BSV e o CMV ocorrem com alta incidência nos municípios do Vale do Ribeira nas
principais cultivares comerciais e foram detectados nas bananeiras antes da manifestação dos
sintomas. No cultivo orgânico, o CMV foi detectado em 58,7% das bananeiras ‘Prata’ e 31,8% das
mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, enquanto no cultivo convencional em 44,7% das
bananeiras ‘Nanica’, e em 42,8% das bananeiras ‘Prata’ e 20,9% das mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas. O BSV foi detectado no cultivo orgânico, em 87,5% bananeiras ‘Prata’ e 77% das mudas
de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas e, no cultivo convencional, em 50% das bananeiras ‘Nanica’,
57,1% das bananeiras ‘Prata’ e 66,6% das mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas. Nos cultivos
convencional e orgânico houve diminuição no crescimento vegetativo de todas as bananeiras ‘Nanica’
e ‘Prata’ jovens e das mudas de bananeiras ‘Galil7’ introduzidas. Nas bananeiras avaliadas nos
diferentes municípios, o BSV foi detectado em 100% das plantas nas diferentes cultivares, enquanto
o CMV foi detectado em 90% das bananeiras ‘Nanica’, em 60% das bananeiras Naniquinha’, em
62,5% das bananeiras ‘Prata’, em 5% das bananeiras ‘Grand Naine’ e não foi detectado nas mudas
de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas.
Palavras-chave: Cucumber mosaic virus, Banana streak virus, bananeiras, Vale do Ribeira.
v
SANT 'ANA, M. M. OCCURRENCE OF BANANA STREAK VIRUS (BSV) AND CUCUMBER MOSAIC
VIRUS (CMV) IN CONVENTIONAL AND ORGANIC FARMING OF MUSA spp IN VALE DO RIBEIRA,
BR. São Paulo. 2012. Dissertation (Mestrado em Sanidade Vegetal) – Instituto Biológico.
ABSTRACT
Brazil is the fourth largest banana producer and São Paulo is the largest producer state, high
lighting Vale do Ribeira as the main region in the state. Viroses are one of the phitosanitary problems
that can cause considerable losses on banana crop. In addition to the production limitations, the virus
has been one of the main obstacle for the germoplasm free movement of these species in several
regions of the world. Cucumber mosaic virus (CMV) and Banana streak virus (BSV) are the only
described species of virus related to this crop in Brazil. CMV belongs to the genus Cucumovirus and is
transmitted in the nature by aphids, tools and propagative material. The BSV belongs to the genus
Badnavirus and is transmitted in nature by mealybugs or infected propagative material, not being
removed by the apical meristem culture, once the virus DNA may be incorporated into the plant
genome. The main objective of this work was to study the CMV and BSV occurrence in banana
plantations under two different cultivations, conventional and organic, in Vale do Ribeira and to
conduct a survey of the virus incidence in the principal production region of banana crop. Banana
trees were assessed by their symptoms, the virus presence and by the vegetative growth, it was done
in a conventional farm in Registro, SP city and another one in a organic farm in Sete Barras, SP city.
The occurrence of BSV and CMV in mature mother plants was assessed in commercial banana,
cultivated in conventional cultivation in Sete Barras, Pariquera- acú, Jacupiranga and Cajati cities-Vale
do Ribeira. Symptoms of CMV and BSV can be confounded, so it is important to have early detection
and identification of the viruses. In this study was verified that the BSV and CMV occur with high
incidence in cities around Ribeira Valley, in the main commercial cultivars, to detected them in
banana’s trees before the symptoms manifestation. In the organic cultivation the CMV was detected in
58.7% of all banana 'Prata' trees and 31.8% of the banana 'Galil 7' trees, and conventional cultivation
in 44.7% of the banana 'Nanica' trees, 42.8% of the banana 'Prata' trees and 20.9% of the banana
'Galil 7' trees. The BSV was detected, in organic cultivation, in 87.5% of the banana 'Prata' trees and
75% of the banana 'Galil 7' trees, and conventional cultivation, in 50% of the banana 'Nanica' trees,
57.1% of the banana 'Prata' trees and 62.5% of the banana 'Galil 7' trees.In the conventional and
organic cultivation, there were a decrease in the vegetative growth of all young banana 'Nanica' and
'Prata' trees and also in the assessed introduced 'Galil7' seedlings.In all banana’s trees assessed in
different cities, BSV was detected in 100% of the plants and cultivars, while CMV was detected in 90%
of the banana 'Nanica' trees, in 60% of the banana ‘Naniquinha’ trees, in 62,5% of the banana ‘Prata’
trees, in 5% of the banana ‘Grand Naine’ trees and not detected in banana' Galil 7' tree.
Keywords: Cucumber mosaic virus, Banana streak virus, survey, Vale of Ribeira.
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados dos locais e cultivares de bananeiras coletadas em quatro municípios produtores de
banana no Vale do Ribeira, SP.............................................................................................................39
Tabela 2- Resultados positivos e negativos obtidos em PTA- ELISA para o CMV em baneiras do
cultivo orgânico e convencional no Vale do Ribeira, SP.......................................................................43
Tabela 3. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras
jovens ‘Prata’ em cultivo orgânico.........................................................................................................44
Tabela 4. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras ‘Galil
7’ introduzidas em cultivo orgânico.......................................................................................................45
Tabela 5. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras
jovens ‘Nanica’ (1AC a 5 AC) e ‘Prata’(6 AC a 10AC) em cultivo convencional...................................46
Tabela 6. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras
introduzidas
‘Galil
7’
em
cultivo
convencional..........................................................................................................................................46
Tabela 7. Detecção do Banana streak virus (BSV) em subamostras de folhas de bananeiras ‘Prata’,
‘Nanica’ e ‘Galil 7’ em cultivo convencional e orgânico no Vale do Ribeira...........................................55
Tabela 8. Médias da taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens,
em cultivo orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP...............................................56
Tabela 9. Médias da taxa relativa de crescimento em diâmetro do pseudocaule (DAP), de bananeiras
‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens em cultivo orgânico (CO) e convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP.........57
Tabela 10. Médias da taxa relativa de emissão foliar, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens em
cultivo convencional (CC) e cultivo orgânico (CO), do Vale do Ribeira, SP..........................................58
Tabela 11. Médias da taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, em
cultivo orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP.....................................................59
Tabela 12. Médias da taxa relativa de emissão foliar, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo
convencional (CC) e cultivo orgânico (CO), do Vale do Ribeira, SP.....................................................60
Tabela 13- Informações das propriedades, da cultura e do manejo realizado pelos produtores de
quatro municípios produtores de banana do Vale do Ribeira, SP.........................................................62
Tabela 14. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras de
cultivo convencional, provenientes de dez propriedades comerciais em quatro municípios produtores
de banana no Vale do Ribeira...............................................................................................................63
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Bananeiras jovens e mudas de bananeiras introduzidas nos cultivos convencional e
orgânico: bananeira jovem em cultivo convencional (A); bananeira jovem em cultivo orgânico (B);
muda introduzida em cultivo convencional (C); muda introduzida em cultivo orgânico (D)..................31
Figura 2. Procedimento de coleta da folha de bananeira. Adaptação da figura “procedimento de
amostragem para a análise foliar” (BORGES e OLIVEIRA, 1995)........................................................32
Figura 3. Esquema representativo do RNA 3 do genoma do CMV, as setas verdes indicam o local
onde os iniciadores CMV 1 e CMV 2 anelam na região capa proteíca do RNA 3 (que codifica a
proteína de movimento e a proteína da capa) originando um fragmento de 486 pb...........................35
Figura 4. Esquema da organização genômica do Banana streak virus (BSV). O círculo completo
representa o genoma de DNA dupla fita. As setas cinza indicam a posição das três ORFs. As duas
setas pretas indicam a posição dos iniciadores degenerados utilizados para a amplificação da região
conservada entre a transcriptase reversa e a replicase viral (HARPER, et al., 2002)..........................37
Figura 5. Esquema dos meses e estações do ano no período de avaliação do experimento, em verde
os meses em que ocorreram as coletas................................................................................................40
Figura 6. Médias de temperatura (A) e precipitação (B) observados no período de realização do
experimento para o Vale do Ribeira, SP...............................................................................................41
Figura 7a. Muda de bananeira ‘Galil 7’ introduzida em cultivo orgânico, vista geral da muda (A) com
sintomas de pontos cloróticos (B e C) e nervuras espessas (C) ..........................................................42
Figura 7b. Muda de bananeira ‘Galil 7’ introduzida em cultivo orgânico, vista geral da muda (A) com
sintomas de pontos cloróticos (B) e mosaico (C)..................................................................................42
Figura 7c. Muda da bananeira ‘Galil 7’ introduzida em cultivo convencional, vista geral da muda (A)
com sintomas de estrias cloróticas (B) e pontos cloróticos (C)............................................................42
Figura 8. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ CMV 1 e CMV 2 com
fragmentos esperados de cerca de 500 pb; 1- Controle positivo: isolado ‘Gladíolo’; 2, 3, 8 e 9subamostra de bananeiras ‘Prata’ do cultivo orgânico da sétima avaliação (2 e 3) e da oitava
avaliação (8 e 9); 4 e 10- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ do cultivo convencional da sétima
avaliação (4) e da oitava avaliação (10); 5 e 11- subamostra de bananeiras ‘Prata’ do cultivo
convencional da sétima avaliação (5) e da oitava avaliação (11) ; 6 e 12 - subamostra de bananeiras
‘Galil 7’ introduzidas do cultivo orgânico da sétima avaliação (6) e da oitava avaliação (12) ; 7 e 13
subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas do cultivo convencional da sétima avaliação (7) e da
oitava avaliação (13), M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’, C- Controle negativo...............49
Figura 9. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’: BADNA1A e BADNA4
com o fragmento esperado de 600 pb; 1- bananeira ‘Mysore’, 2- Terra anã e 3- bananeira ‘FHIA 17’;
M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’; A: proporção 1:1 ‘primer’/DNA, B: proporção 2:1
‘primer’/DNA, C: proporção 2:2 ‘primer’/DNA, D: proporção 1:2 ‘primer’/DNA......................................50
Figura 10. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com o fragmento de 600 pb; 1, 2 e 3 - Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’, ‘Galil 7’; 4 e 5-
viii
subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na primeira avaliação; 6- subamostra de
bananeiras ‘Nanica’ jovens em cultivo convencional na primeira avaliação; 7-subamostra de
bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo convencional na primeira avaliação; 8 e 9: subamostra de mudas
de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo convencional (8) e orgânico (9) na segunda avaliação;
M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’......................................................................................50
Figura 11. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2, 3 e 4- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’,
‘Galil 7’ e ‘Terra anã’; 5, 6, 9 e 10- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na
segunda (5 e 6) e terceira avaliação (9 e 10); 7 e 8- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (7) e ‘Prata’
(8) jovens em cultivo convencional na segunda avaliação; 11 e 12- subamostra de bananeiras
‘Nanica’ (11) e ‘Prata’ (12) jovens em cultivo convencional na terceira avaliação; 13 e 14- subamostra
de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo convencional (13) e orgânico (14) da
terceira avaliação 15- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo
convencional na quinta avaliação; M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’...............................51
Figura 12. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2, 3 e 4- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’,
‘Galil 7’ e ‘Terra anã’; 5 e 6-subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na quarta
avaliação; 7 e 8- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (7) e ‘Prata’ (8) jovens em cultivo convencional
na quarta avaliação; 9 e 12- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo
orgânico (9) e convencional (12) na quarta avaliação; 13 e 14- subamostra de bananeiras ‘Prata’
jovens em cultivo orgânico na quinta avaliação; 15 e 16- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (15) e
‘Prata’ (16) jovens em cultivo convencional na quinta avaliação; e 17- mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas em cultivo orgânico na quinta avaliação; 10 e 11- obstrução dos pocinhos no gel, M:
marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’...........................................................................................52
Figura 13. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2 e 3- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e
‘Galil 7’; 4 e 5- bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na sexta avaliação; 6 e 7- subamostra de
bananeiras ‘Nanica’ e ‘Prata’ jovens em cultivo convencional na sexta avaliação; 8 e 9- subamostra
de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico (8) e convencional (9) na sexta
avaliação; 10 e 11- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na sétima avaliação;
e 12- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo convencional na sétima avaliação. M:
marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’............................................................................................52
Figura 14. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2 e 3- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e
‘Galil 7’; 4 - subamostra de bananeiras ‘Nanica’ jovens em cultivo convencional na sétima avaliação; 5
e 6- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico (5) e convencional
na (6) sétima avaliação; 7 e 8- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na oitava
avaliação; 9 e 10- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (9) e ‘Prata’ (10) jovens em cultivo
convencional na oitava avaliação; 11 e 12- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas
em cultivo orgânico (11) e convencional (12) na oitava avaliação; e M: marcador molecular de 100 pb
‘NORGEN’.............................................................................................................................................53
Figura 15. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1 e 2- Controles positivos: isolados ‘Mysore’ e ‘Terra anã’; 3 e
4- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na nona avaliação; 5- subamostra de
bananeiras ‘Nanica’ jovens em cultivo convencional na nona avaliação; 6 e 7- subamostra de mudas
de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico e convencional na oitava avaliação; e M:
marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’...........................................................................................53
ix
Figura 16. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2 e 3 - Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e
‘Galil 7’; 4- subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzida em cultivo orgânico na décima avaliação;5subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzida em cultivo convencional na décima avaliação............54
Figura 17. Taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens no cultivo
orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP................................................................56
Figura 18. Taxa relativa de crescimento em diâmetro do pseudocaule (DAP) de bananeiras ‘Prata’ e
‘Nanica’ jovens em cultivo orgânico (CO) e cultivo convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP............57
Figura 19. Taxa relativa da emissão foliar, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens no cultivo orgânico
(CO) e convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP................................................................................58
Figura 20. Taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas no cultivo
orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP................................................................59
Figura 21. Taxa relativa de emissão foliar, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas no cultivo orgânico
(CO) e convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP................................................................................60
Figura 22. Perfil eletroforético do produto da reação de PCR utilizando o par de primers BADNA1A e
BADNA4 com fragmentos esperados de 600 pb para o BSV; 1, 2 e 3- Controles positivos: isolado
‘Mysore’, isolado ‘FHIA 17’ e isolado ‘Galil7’, 4- subamostra de bananeiras ‘Naniquinha’ (Sete Barras),
5- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (Sete Barras), 6- subamostra de bananeiras ‘Prata’ (Pariqueraaçú), 7, 8 e 9- subamostras de bananeiras ‘Prata’ Cajati, 10- subamostra de bananeiras ‘Galil 7’
(Jacupiranga), 11, 12, 13 e 14- subamostras de bananeira ‘Grande Naine’ (Jacupiranga), M: marcador
molecular de 100pb ‘NORGEN’.............................................................................................................64
Figura 23. Perfil eletroforético do produto da reação de PCR utilizando o par de primers BADNA1A e
BADNA4 com fragmentos esperados de 600 pb para o BSV; 1 e 2- Controles positivos: isolado
‘Mysore’, isolado ‘FHIA 17’, 3- subamostra de bananeiras ‘Naniquinha’ (Sete Barras), 4- subamostra
de bananeiras ‘Nanica’ (Sete Barras), 5- subamostra de bananeiras ‘Prata’ (Pariquera-açú), 6, 7 e 8subamostras de bananeiras ‘Prata’ Cajati, 9- subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ (Jacupiranga), 10,
11, 12 e 13- subamostras de bananeira ‘Grande Naine’ (Jacupiranga), M: marcador molecular de
100pb ‘NORGEN’..................................................................................................................................64
x
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................. iv
ABSTRACT .............................................................................................................................. v
LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. vi
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 12
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................... 15
2.1 HISTÓRICO E CLASSIFICAÇÃO DA BANANEIRA ......................................................... 15
2.2 ASPECTOS ECONÔMICOS E SOCIAIS DA BANANICULTURA ..................................... 16
2.3 PROBLEMAS FITOSSANITÁRIOS .................................................................................. 18
2.4 BANANA STREAK VIRUS- BSV ................................................................................... ...19
2.4.1 Histórico ......................................................................................................................... 19
2.4.2 Etiologia ......................................................................................................................... 19
2.4.3 Epidemiologia................................................................................................................. 21
2.4.4 Sintomatologia ............................................................................................................... 22
2.5 CUCUMBER MOSAIC VIRUS- CMV................................................................................. 22
2.5.1 Histórico ......................................................................................................................... 22
2.5.2 Etiologia ......................................................................................................................... 23
2.5.3 Epidemiologia................................................................................................................. 26
2.5.4 Sintomatologia ............................................................................................................... 27
2.5.5 Controle ......................................................................................................................... 27
2.6 IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO DO BSV E CMV ....................................................... 27
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 30
3.1 AVALIAÇÃO DA INCIDÊNCIA DO CMV E BSV EM BANANEIRAS NO CULTIVO ORGÂNICO E
NO CULTIVO CONVENCIONAL ............................................................................................ 30
3.1.1 Local e período de realização do experimento ................................................................ 30
3.1.2 Material Vegetal
.......................................................................................................... 30
3.1.3 Avaliação do crescimento vegetativo das bananeiras ..................................................... 31
3.2 DETECÇÃO SOROLÓGICA DO CMV POR PTA-ELISA .................................................. 32
3.3 DETECÇÃO MOLECULAR DO CMV POR RT-PCR ......................................................... 33
3.3.1 Extração do RNA total .................................................................................................... 33
3.3.2 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) .................. 34
3.4 DETECÇÃO MOLECULAR DO BSV POR PCR................................................................ 35
3.4.1 Extração de DNA total .................................................................................................... 35
3.4.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................................ 36
3.5 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETATIVO EM BANANEIRAS DO CULTIVO
ORGÂNICO ECONVENCIONAL.............................................................. ................................38
xi
3.6 LEVANTAMENTO DA OCORRÊNCIA DO CMV E BSV EM BANANAIS COMERCIAIS NA
REGIÃO DO VALE DO RIBEIRA................................................................. ............................38
3.2.1 Local e período do experimento...................................................................................... 38
3.2.2 Material Vegetal ............................................................................................................. 39
3.2.3 Avaliação das bananeiras ............................................................................................... 39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 40
4.1 MONITORAMENTO DE BANANEIRAS EM CULTIVO CONVENCIONAL E ORGÂNICO EM
DOIS BANANAIS COMERCIAIS NO VALE DO RIBEIRA ... .....................................................40
4.1.1 Período das avaliações e condições climáticas............................................................... 40
4.2 AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS DE BANANEIRAS EM CULTIVO CONVENCIONAL E
ORGÂNICO ................................................................................................. ............................41
4.3 DETECÇÃO SOROLÓGICA DO CMV POR PTA-ELISA EM BANANEIRAS ‘PRATA’, ‘NANICA’
JOVENS E MUDAS DE ‘GALIL7’ ................................................................ ............................43
4.4 DETECÇÃO MOLECULAR DO CMV POR RT-PCR EM BANANEIRAS ‘PRATA’,‘NANICA’
JOVENS E MUDAS DE ‘GALIL7’ ................................................................ ............................48
4.5 DETECÇÃO MOLECULAR DO BSV POR PCR EM BANANEIRAS ‘PRATA’, ‘NANICA’
JOVENS E MUDAS DE ‘GALIL7’ ................................................................ ............................49
4.6 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETATIVO ................................. ............................56
4.6.1 Taxa relativa de crescimento de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens .. ............................56
4.6.2 Taxa relativa de crescimento de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ ........... ............................56
4.7 OCORRÊNCIA DO CMV E BSV EM ONZE PROPRIEDADES COMERCIAIS EM QUATRO
MUNICÍPIOS PRODUTORES DO VALE DO RIBEIRA ................................ ............................61
4.7.1 Dados e informações das propriedades avaliadas ............................... ............................61
4.7.2 Avaliação dos sintomas ....................................................................... ............................62
4.7.3 Detecção sorológica do CMV por PTA-ELISA em amostras de bananeiras de dez propriedades
comerciais ................................................................................................... ............................62
4.7.4 Detecção molecular do BSV por PCR em amostras de bananeiras de dez propriedades
comerciais ................................................................................................... ............................63
5. CONCLUSÕES........................................................................................ ............................66
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ ............................67
7. ANEXOS.................................................................................................. ............................78
1
1. INTRODUÇÃO
A bananeira é uma planta herbácea, monocotiledônea, pertencente ao gênero Musa
(Família Musaceae). É originária do continente asiático, e existem indícios do seu cultivo
desde 5000 AC ou até mesmo 8000 AC (CARVALHO et al., 2011). Na Índia, a banana é
popularmente conhecida como planta para todos os usos, sendo esta uma afirmação
verdadeira, pois todas as partes da planta podem ser usadas para alguma finalidade. Dentre
elas podemos citar o uso na alimentação humana e de animais, na produção de álcool, de
fibras, de medicamentos e de artesanato, entre outros (COLARICCIO, 2005). A banana,
proveniente de uma cultura perene, é cultivada e colhida durante o ano todo (CEAGESP,
2010).
A banana é uma fruta de grande importância mundial, sendo o quarto produto
alimentar mais produzido no planeta, precedido pelo arroz, trigo e milho, e em muitos países
é a principal fonte de arrecadação e geradora de emprego e renda para uma parte
expressiva da população (EPAGRI, 2009).
No Brasil a área cultivada em 2012 foi de 476,744 mil hectares. A cultura da banana
ocupa o segundo lugar em volume de frutas produzidas (6.846,611 milhões de toneladas),
perdendo somente para a cultura da laranja (IBGE, 2013). Diversas camadas da população
brasileira consomem a banana como fonte de sais minerais, vitaminas e, também, como
uma fonte adicional de complementação calórica na dieta alimentar (IBGE, 2009).
O cultivo da bananeira está distribuído por todo o território nacional, sendo a região
Nordeste a maior produtora. São Paulo é o maior estado produtor de banana e a região do
Vale do Ribeira se destaca como principal produtora, dentro do estado (CATI, 2007).
Os maiores problemas fitossanitários que ameaçam a bananicultura mundial são: o
mal do Panamá (Fusarium oxysporum pv. Cubense), o moko (Pseudomonas solanacearum),
as viroses: Banana bunchy top virus (BBTV), Banana streak virus (BSV), Cucumber mosaic
virus (CMV), Banana bract mosaic virus (BBrMV), Banana die-back virus (BDBV) e Banana
mild mosaic virus (BanMMV), os nematóides (Radopholus similis, Helicotylenchus
multicinctus, Pratylenchus coffeae e Meloidogyne spp.) que podem ser disseminadas por
mudas contaminadas, e as pragas como a broca-da-bananeira (Cosmopolites sordidus).
(SILVA NETO, 2001).
As viroses podem causar grandes perdas para a cultura da banana. Além das
limitações na produção, tem sido um dos principais entraves para a livre movimentação de
germoplasma dessa planta em várias regiões do mundo. Dentre estas viroses, o CMV e
BSV estão oficialmente presentes no território brasileiro (CORDEIRO, MATOS &74
MEISSNER, 2004), embora o serviço de quarentena tenha detectado vírus quarentenário
2
em lotes de mudas importadas (MARINHO & BATISTA, 2005), indicando o iminente risco de
introdução de novas doenças. Silva Neto e Silva (2009) ainda ressaltam que os vírus
recebem atenção especial dos órgãos de defesa vegetal por serem de difícil controle, muitas
vezes requerendo a erradicação da planta e/ou da cultura.
O Cucumber mosaic virus “vírus do mosaico do pepino” pertence ao gênero
Cucumovirus, apresenta distribuição cosmopolita e diferentes graus de virulência. As
partículas virais são isométricas, com 28 a 30 nm de diâmetro, contendo ssRNA tripartido
(VAN REGENMORTEL, 2000). O vírus foi descrito pela primeira vez na Austrália em 1930
(COLARICCIO, 2005). O vírus pode ser transmitido na natureza por várias espécies de
afídeos (CORDEIRO, MATOS & MEISSNER, 2004), segundo Silva Neto e Silva (2009) os
principais vetores de CMV são Aphis gossypii, Mysus persicae e Rhopalosiphum spp. As
plantas de bananeiras enfermas podem apresentar sintomas de necrose vascular,
espessamento intermitente da nervura, separação da bainha foliar externa do pseudocaule,
clorose, mosaico, nanismo, má formação dos frutos e, às vezes, morte do vegetal. O
sintoma de mosaico pode ser mais bem visualizado na estação fria (BRIOSO et al., 1986).
Em vista dos problemas fitossanitários causados por este vírus, um crescente comércio de
plântulas de bananeiras micropropagadas tem se estabelecido, visando à limpeza clonal das
cultivares de maior interesse econômico (SILVA NETO, 2003). Para o caso de limpeza
clonal de material infectado, a cultura de meristema simplesmente não se mostra eficiente
(SILVA NETO & SILVA, 2009), e devem ser aliadas à quimioterapia, termoterapia e
crioterapia na tentativa de eliminar o vírus.
O Banana streak virus pertence ao gênero Badnavirus, as partículas virais são
baciliformes, sem envelope, medindo de 120 a 150 nm de comprimento por 30 nm de
diâmetro, contendo uma molécula de DNA circular dupla fita (FAUQUET et al., 2005; VAN
REGENMORTEL et al., 2000). A doença foi observada pela primeira vez na Costa do
Marfim em 1968. É transmitida na natureza pelas cochonilhas Planococcus citri e
Saccharicocus sachari e propagação vegetativa (BRIOSO et al., 2000).
Bananeiras infectadas por este vírus podem apresentar sintomas de estrias foliares,
lesões foliares cloróticas, mosaico, má formação dos frutos e diminuição do cacho
(DANIELLS et al., 2001). Os sintomas de estria e de mosaico ocorrem esporadicamente
durante o ano, dificultando sua identificação visual. Segundo Colariccio (2005), além da
cochonilha e da propagação vegetativa o vírus transmite-se por semente, sendo que o vírus
não é eliminado pela cultura de ápices meristemáticos, uma vez que o DNA viral pode ser
incorporado ao genoma da planta. Foi comprovada a presença do DNA completo do BSV
dentro do genoma B da bananeira Musa balbasiana (PLOETZ et al., 2003).
As bananeiras podem ser infectadas por mais de um vírus ao mesmo tempo
(BRIOSO et al., 2000; COLARICCIO et al., 2006). Estudos demonstraram que bananeiras
3
infectadas com o BSV apresentam sintomas que podem ser muitas vezes confundidos com
aqueles causados pelo CMV, sendo de difícil distinção quando causados pela dupla
infecção destes vírus (BRIOSO et al., 2000).
Souza (2005) destaca que, mesmo para viroses já presentes no país, é importante o
seu monitoramento, uma vez que em diferentes regiões podem estar presentes estirpes com
diferentes virulência e epidemiologia.
O presente trabalho teve como objetivo estudar a ocorrência do BSV e CMV em
bananais das cultivares ‘Prata’ e ‘Nanica’ em duas propriedades rurais, sendo uma com o
plantio convencional e outra com o cultivo orgânico, no Vale do Ribeira e fazer um
levantamento da ocorrência desses dois vírus em propriedades comerciais de alguns
munícipios produtores de banana no Vale do Ribeira.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 HISTÓRICO E CLASSIFICAÇÃO DA BANANEIRA
Como no caso de vários outros frutos, também a história cultural global da banana
tem sido marcada pela antiguidade e internacionalidade de elos, por complexos caminhos
de difusão entre as mais distantes regiões do mundo. A sua remota origem é vista no
Oriente, por alguns autores, no arquipélago malaio. Já era conhecida pelos antigos egípcios
e assírios, como registrada em monumentos, e afirma-se que os soldados de Alexandre
Magno a encontraram na Índia (BISPO, 2009).
A banana surge na história cultural, sobretudo pela sua importância, na África
Ocidental. As ilhas atlânticas teriam representado a principal ponte da banana entre a África
e a Europa em fins da Idade Média, e desde então a banana insular passou a ser
consumida na Europa. Na época dos descobrimentos, a bananeira foi trazida para as
Américas pelo Padre Tomás de Berlengas, que teria levado a bananeira à ilha de São
Domingos, em 1516. Das Ilhas Ocidentais, a bananeira teria se difundido e alcançado o
Brasil. Porém, a banana já teria sido, há séculos, conhecida pelos indígenas, ela teria
atingido o continente pela costa do Pacífico, vinda da Ásia (BISPO, 2009).
Segundo Moreira (1985), a bananicultura como atividade agrícola de grande valor
comercial teve início no século XIX, por volta de 1820 e os plantios se desenvolveram e se
expandiram desde as frias encostas rio-grandenses até a foz do Amazonas.
As bananeiras pertencem ao gênero Musa, é uma planta herbácea monocotiledônea.
Possui tronco curto e subterrâneo, denominado de rizoma, que constitui um órgão de
reserva onde se inserem as raízes adventícias e fibrosas. O pseudocaule, resultante da
união das bainhas foliares, termina com uma copa de folhas longas e largas, com nervura
central desenvolvida. Do centro da copa emerge a inflorescência com brácteas ovaladas de
coloração normalmente roxo-avermelhada, em cujas axilas nascem as flores. Cada grupo de
flores reunidas forma uma penca com um número variável de pseudofrutos, originados por
partenocarpia. Os pseudofrutos inicialmente são verdes, tornando-se amarelos com a
maturação. Durante o seu desenvolvimento há a formação de novos rebentos (filhos) que
surgem na base da planta, possibilitando a constante renovação do bananal (ALVES, 1999).
Segundo este mesmo autor, apesar do grande número de cultivares no Brasil,
quando se leva em consideração algumas características como preferência dos
consumidores, produtividade, tolerância a pragas e doenças, resistência a seca e ao frio e
porte, restam poucas com o potencial de serem produzidas comercialmente. Os cultivares
5
mais utilizados são do grupo AAB: ‘Prata’, ‘Pacovan’, ‘Prata-anã’, ‘Maçã’, ‘Mysore’, ‘Terra’ e
do grupo AAA: ‘Nanica’, ‘Nanicão’ e ‘Grande Naine’. Os grupos ‘Prata’ e ‘Pacovan’ são
responsáveis por aproximadamente 60% da área cultivada do Brasil.
As bananas comestíveis são o resultado do cruzamento entre duas espécies
diploides selvagens: M. acuminata Colla e M. balbisiana Colla. Cada cultivar pode conter
combinações variadas de genoma completo dessas espécies. Esses genomas são
denominados pelas letras A (M. acuminata) e B (M. balbisiana), cujas combinações resultam
em grupos diploides (AA, AB e BB), triploides (AAA, AAB e ABB) e tetraploides (AAAA,
AABB e ABBB) (ALVES, 1999).
2.2 ASPECTOS ECONÔMICOS E SOCIAIS DA BANANICULTURA
O cultivo de banana está entre os mais importantes nas regiões tropicais e
subtropicais do mundo. São cultivadas em uma área de cerca de 4,8 milhões de hectares,
com uma produtividade média de 19 t/ha/ano e produção de 95,6 milhões de toneladas em
2009 (FAO, 2010). Segundo Vieira (2011) o cultivo da banana é desenvolvido em
aproximadamente 115 países. A atividade está presente em todos os continentes, sendo
que o asiático contribui com 58%, o americano com 27% (América do Sul com 19% e a
América Central com 8%) e o africano com 13% do volume produzido.
Nos últimos trinta anos, a produção de banana praticamente triplicou em volume,
passando de 34,5 milhões de toneladas na safra 1978 para 95,6 milhões de toneladas na
safra 2009 (FAO, 2010).
Em alguns países, essa fruta se destaca como uma das principais fontes de
arrecadação e geradora de emprego e renda. Além de prover alimento básico para milhões
de pessoas, as bananas têm um excelente valor nutricional, sendo um dos alimentos mais
facilmente digeríveis (SILVA NETO & GUIMARÃES, 2011). Sendo, assim, a segunda fruta
mais consumida no mundo, com 10,38 kg/hab/ano, atrás da laranja com 12,83 kg/hab/ano.
(FAO, 2011).
A banana é a segunda fruta mais produzida no Brasil, atrás apenas da laranja e a
primeira mais consumida com 30,7% em volumes vendidos (SILVA, 2011).
No Brasil, a maioria dos bananicultores é composta de pequenos produtores da
agricultura familiar, que utilizam a banana, quase sempre como única fonte de renda.
Portanto, a bananicultura é considerada uma das atividades agrícolas de grande importância
para o agronegócio brasileiro, sendo que quase a totalidade da sua produção é
comercializada no mercado interno (MORAES, 2012).
6
Gasparotto (2006) enfatiza que a bananicultura desempenha papel altamente
relevante no agronegócio brasileiro, além de atuar como elemento de fixação de populações
no meio rural dos inúmeros municípios produtores e produzir durante todo o ano.
Para a safra nacional de banana, em 2012, foi estimada uma área colhida de
476,744 mil hectares. Foi produzido um total de 6.846, 611 milhões de toneladas e um
rendimento médio de 14,4 toneladas por hectare (IBGE/LSPA, 2013). A produção nacional,
além de atender o consumo interno, gera um excedente que é comercializado para alguns
países do Mercosul e da Europa.
O cultivo da bananeira está distribuído por todo o território nacional, sendo a região
Nordeste a maior produtora, com 37% da produção nacional. São Paulo é o maior estado
produtor de banana, com 1.193,242 milhões de toneladas, seguido da Bahia (1.081,126
toneladas), Santa Catarina (689,836 mil toneladas) e Minas Gerais (687,293 mil toneladas)
(IBGE/LSPA, 2013).
A principal região produtora de banana do estado de São Paulo, é o Vale do Ribeira,
com destaque as cidades de Eldorado, Cajati, Miracatu, Sete Barras, Jacupiranga, Itariri,
Registro, Juquiá, Pedro de Toledo, Iguape, Pariquera-açú e Tapiraí, que estão em ordem
decrescente das maiores áreas de plantio e unidades produtivas (CATI, 2007). Estima-se
que o município de Registro possui cerca de 3500 produtores, e segundo dados do IBGE
(2009), há uma área cultivada de 27.136 mil hectares e uma produção de 819.780 mil
toneladas.
No Vale do Ribeira a produção de banana ocorre tanto em grandes propriedades
rurais como em pequenas propriedades da agricultura familiar, a maior parte é cultivada de
forma convencional, porém há propriedades que realizam o cultivo orgânico da fruta. No
cultivo convencional a bananeira recebe uma carga de insumos, como adubos químicos e
possui um grande enfoque no manejo fitossanitário, principalmente com a aplicação de
fungicidas e inseticidas. No cultivo orgânico, se prioriza a utilização da matéria orgânica,
somente alguns adubos comprovadamente orgânicos são permitidos e não se utiliza
nenhum tipo de defensivo químico. O agricultor orgânico, quase sempre, possui
produtividade menor que o agricultor convencional, porém a banana recebe melhor preço de
mercado (EMBRAPA, 2003).
7
2.3 PROBLEMAS FITOSSANITÁRIOS
Os problemas fitossanitários na cultura da banana têm provocado danos na
produção e prejuízos econômicos aos bananicultores brasileiros das mais diferentes regiões
e pólos de produção, como no Vale do Ribeira (23 municípios), Norte de Minas Gerais
(Janaúba, Jaíba, Pirapora, Montes Claros e Itacarambi), Norte de Santa Catarina (Corupá,
Massaranduba, Jaraguá do Sul, Guaramirim, Praia Grande, Luis Alves e Schroeder), no
Nordeste (Petrolina, Juazeiro, Bom Jesus da Lapa e Formoso) e no Espírito Santo
(MATTHIESEN & BOTEON, 2002).
As bananeiras são afetadas, durante todo o ciclo vegetativo e produtivo por diversas
pragas e doenças.
Entre as principais pragas destacam-se a broca-do-rizoma (Cosmopolites sordidus),
também chamada de moleque ou bicudo, que pode causar sérios prejuízos às bananeiras
das variedades ‘Cavendish’ e ‘Prata’, podendo inviabilizar o cultivo de bananeiras ‘Terra’.
Outras pragas que podem causar danos significativos são os tripes da erupção
(Frankliniella spp.)
e
da
ferrugem
dos
frutos
(Chaetanaphothrips spp., Caliothrips
bicinctus, Tryphactothrips lineatus) (VIEIRA NETO & SOUZA, 2003).
Entre os diversos microrganismos causadores de doenças, destacam-se: o mal do
Panamá (Fusarium oxysporum pv. Cubense), o moko (Pseudomonas solanacearum), as
viroses (BBTV, BSV, CMV, BBrMV e BDBV) e os nematóides (Radopholus similis,
Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae,
Meloidogyne spp.) que podem ser
disseminados por mudas infectadas. (SILVA NETO, 2003).
Os microrganismos fitopatogênicos interferem em diferentes processos fisiológicos
vitais à planta, como a fotossíntese, absorção e transporte de água e nutrientes e a
utilização dos produtos da fotossíntese pelas raízes, caules, folhas e inflorescências
(MORAES, 2012). Dentre as doenças que limitam a produção das bananeiras destacam-se
as manchas foliares, que comprometem a fotossíntese; as murchas vasculares, que
interferem na absorção e no transporte de água e nutrientes para a parte aérea da planta; as
nematoses e as viroses, que impedem a distribuição dos produtos da fotossíntese para as
demais partes da planta, além, daquelas que ocorrem em pós-colheita, que consomem as
reservas dos frutos (MORAES, 2012).
As viroses tem sido um dos principais entraves para a livre movimentação de
germoplasma de bananeiras em várias regiões do mundo. Segundo Ploetz et al. (2003),
mundialmente a bananeira é acometida por diversos vírus, dentre estes o BBTV gênero
Babuvirus, família Nanoviridae; o CMV gênero Cucumovirus, família Bromoviridae; o BSV
gênero Badnavirus, família Caulimoviridae, o BBrMV gênero Potyvirus, família Potyviridae, o
8
BanMMV família Flexiviridae; o Abaca mosaic virus (AbaMV) gênero Potyvirus, família
Potyviridae e BDBV, espécie não reconhecida pelo ICTV, todos podendo comprometer de
forma significativa a produtividade e a viabilidade econômica da cultura. Dentre estes CMV e
BSV estão oficialmente presentes no território brasileiro (CORDEIRO et al., 2004).
2.4 BANANA STREAK VIRUS – BSV
2.4.1 Histórico
O BSV, conhecido como estrias-da-bananeira, foi observado pela primeira
vez em bananeiras na Costa do Marfim em 1968 por Lassoudiere (1974) e o agente
causal foi identificado no Marrocos em 1985 (LOCKHART, 1986). Atualmente, está
registrado a ocorrência do BSV em 43 países da África, Europa, Oceânia e América
Tropical (DAHAL et al., 2000). No Brasil foi descrito pela primeira vez em associação
com o CMV por Brioso et al. (2000). Foi relatado também em diferentes cultivares de
bananeiras em infecções simples ou associadas ao CMV nos estados da Bahia,
Ceará, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo e Santa
Catarina
(BRIOSO,
2004).
Posteriormente,
foi
encontrado
em
mudas
micropropagadas por cultura de meristemas, importadas de Israel e Costa Rica
(MARINHO & BATISTA, 2005; COLARICCIO et al., 2006).
2.4.2 Etiologia
O BSV apresenta partículas baciliformes com 30nm de diâmetro e
comprimento que varia de 120 a 150 nm (HULL et al., 2005). Possui o genoma
composto por DNA circular, dupla fita com o tamanho aproximado de 7,4 Kpb e três
ORFs (‘Open Reading Frames’). As ORF I e ORF II codificam, potencialmente, para
duas pequenas proteínas (22,8 kDa e 14,5 kDa) com funções desconhecidas. A ORF
III codifica para uma poliproteína de 208 kDa com prováveis funções de movimento
célula-a-célula, proteína capsidial, protease aspártica e uma replicase viral, que
possui funções de transcriptase reversa e ribonuclease H. Esta poliproteína é clivada
pela protease aspártica em suas unidades funcionais (HARPER & HULL, 1998).
9
O BSV é um pararetrovírus, após a infecção na célula vegetal, o DNA circular
do BSV é liberado no núcleo da célula onde se torna enovelado. O DNA viral é então
transcrito em RNA mensageiro, como um RNA pré-genômico, que é utilizado na
replicação do DNA, no citoplasma, via transcrição reversa. Em contraste aos
retrovírus, a integração no genoma do hospedeiro não é necessária para replicação
viral nos pararetrovírus. No entanto, elas ocorrem e tais integrantes são chamadas
‘Endogenous Pararetroviral Sequence’ (EPRVs) (GAYRAL et al., 2008).
As EPRVs são desde pequenos fragmentos incompletos à sequências
completas do DNA viral, integradas ao genoma da planta e, posteriormente, tornamse fixo na população de plantas pelas forças evolutivas de seleção natural e/ou
deriva genética (GAYRAL et al., 2008). Até o momento, todas as EPRVs descritas
possuem um padrão de arranjo similar, com repetições em “tandem”, duplicações
internas, fragmentações e inversão do genoma viral. A maioria das EPRVs resulta
em genomas virais parciais e não funcionais, porém várias integrações contém toda
a extensão do genoma viral, com quadros de leitura abertos (ORFs) funcionais. Tais
sequências podem então ser ativadas resultando na liberação do genoma viral
funcional infectivo no citoplasma da célula vegetal (GAYRAL & ISKRA-CARUANA,
2009).
Algumas EPRVs são infecciosas porque têm o potencial de reconstituir o
genoma viral funcional e o stress contribui para infecção viral. Este é o caso de
sequências de BSV, chamadas de eBSV, integradas no genoma da Musa balbisiana
(STAGINNUS et al., 2009). Infeccão de eBSV pode ser ativada por estresses
abióticos, como o processo de micropropagação por cultura de tecido ‘in vitro’
(DALLOT et al., 2001), diferenças de temperatura (DAHAL et al., 1998, 2000) ou
estresse hídrico, e depois hibridização genética (LHEUREUX et al., 2003), levando a
infecção por virions.
Já foi descrito para o BSV um tipo de EPRV que está associado ao genoma B
de Musa, esta EPRV carrega o genoma inteiro do vírus, intercalado com sequências
invertidas, não contínuas, capazes de excisão e recombinação para produzir a forma
infectiva do vírus (HARPER, 2006). A maioria das bananas cultivadas (triplóides e
tetraplóides) é proveniente de cruzamentos interespecíficos e intraespecíficos entre
duas espécies diplóides selvagens, Musa acuminata (genoma A) e M. balbisiana
(genoma B). O genoma B é o genoma de muitas cultivares importantes (COTÊ et al.,
2010).
A
hipótese
para
o
surgimento
de
infecção
de
BSV
em
muitos
micropropagados triploides (AAB) e híbridos interespecíficos tetraploides (AAAB) em
Musa, observado nos últimos 15 anos, muito provavelmente, resultam do
10
desencadeamento de sequências virais do BSV, integradas ao DNA da célula
vegetal que foram ativadas pelo processo de micropropagação (FAUQUET et al.,
2005; HULL et al., 2000).
Quatro espécies de BSV têm sido identificadas: Banana streak Obino l'Ewai
virus (BSOLV), Banana streak Imové virus (BSImV), Banana streak Mysore virus e
Banana streak Goldfinger virus (BSGFV) (GAYRAL et al., 2008; GEERING et al,
2005; HARPER et al, 1999; ISKRA-CARUANA et al., 2003; NDOWORA et al., 1999).
DALLOT et al. (2001), evidenciou que a propagação ‘in vitro’ é determinante
na expressão do BSV integrado no genoma de ‘FHIA 21’ (genótipo AAAB),
monitorado por testes de imunocaptura seguidos da reação em cadeia da polimerase
(IC-PCR) para cada estágio da cultura de tecidos. Em um trabalho semelhante,
COTÊ et al. (2010) demonstrou que a micropropagação por cultura de tecido
desencandeou a expressão de eBSOLV em musas triploides, Kelong Mekintu (AAB)
e Black Penkelon (ABB) e na tetraploide CRPB 39 e que desencadeou a expressão
de eBSGFV apenas na híbrida tetraploide CRPB 39, que foram monitoradas por
testes de imunocaptura seguidos da reação em cadeia da polimerase multiplex (MIC-PCR).
2.4.3 Epidemiologia
O BSV não é transmitido mecanicamente, portanto, não é transmitido pelas
ferramentas empregadas nos tratos culturais. Na natureza, pode ser transmitido de
forma semi-persistente pelas cochonilhas, por semente e material propagativo
infectado, não sendo eliminado pela cultura de ápices meristemáticos, uma vez que o
DNA do vírus pode ser incorporado ao genoma da planta (COLARICCIO, 2005).
As cochonilhas são vetores muito eficazes, e as taxas de transmissão foram
superiores a 90% quando utilizado insetos individuais em laboratório (AYLANAVARRETE, 1993). Embora sejam bem sedentárias, os estádios iniciais são
altamente móveis, portanto, é possível assumir que a transmissão de BSV no campo
pode ser facilmente realizada por instares iniciais da cochonilha, quando elas estão
rastejando entre as plantas adjacentes, ou são levadas pelo vento para plantas
vizinhas (LOCKHART, 1995).
Como a maioria dos badnavírus, o BSV ocorre na cultura clonalmente
propagada. Portanto, a propagação vegetativa é o principal método de propagação
do vírus, uma vez que todas as plantas descendentes provenientes de uma planta-
11
mãe infectada com o BSV, eventualmente, irão exibir os sintomas virais de estrias
nas folhas (LOCKHART, 1995). Segundo Le Provost et al. (2006) isso tem causado
grande preocupação nas linhagens de bananeira e híbridos micropropagados, pois,
este vírus tem a capacidade de se integrar no DNA da planta e por mecanismos
ainda desconhecidos, uma vez que nenhum fitovírus descrito até agora exige um
passo de integração como parte de sua replicação (STAGINNUS & RICHERTPÖGGELER, 2006).
2.4.4 Sintomatologia
As bananeiras infectadas podem apresentar os sintomas de estrias foliares
cloróticas, mosaico, má formação dos frutos, diminuição do cacho, atrasos na
colheita dos frutos e redução da produção anual (DANIELLS et al., 2001).
Segundo Lockhart (1995), a importância da doença pode-se dar devido a três
fatores: seu efeito sobre o crescimento das plantas, rendimento e qualidade dos
frutos; por ser um obstáculo ao intercâmbio de germoplasma e pela necessidade de
certificação de mudas ‘in vitro’ para o comércio internacional. Com isso, surge a
necessidade de métodos de diagnósticos precisos para evitar a disseminação e a
circulação do BSV.
2.5 CUCUMBER MOSAIC VIRUS (CMV)
2.5.1
Histórico
As primeiras descrições da incidência do CMV foram feitas por Doolittle
(1916) e Jagger (1916), que demonstraram a natureza viral da doença quando
relataram sua incidência em pepino. Depois, a doença foi descrita nas Filipinas,
Índia, Porto Rico, Colômbia e Estados Unidos (PALUKAITIS et al., 1992). Desde
então, sua disseminação tem sido ampla, alcançando praticamente todas as regiões
do mundo ao atingir indiscriminadamente o cultivo de frutíferas, olerícolas e
ornamentais (VARVERI & BOUTSIKA, 1999). O CMV apresenta uma ampla
distribuição mundial sendo encontrado em diversos países tanto nas zonas
12
temperadas como tropicais (GIBBS & HARRISON, 1970; PALUKAITIS et al., 1992).
Dentre os fitovírus, é um dos que possui o maior círculo de hospedeiras, superando
800 espécies, 365 gêneros em 85 famílias botânicas (PALUKAITIS et al., 1992).
No Brasil, a primeira ocorrência do CMV foi descrita em São Paulo,
ocasionando mosaico, necrose e morte de bananeira (SILBERSCHIMDT &
NOBREGA, 1941). Posteriormente, outros autores caracterizaram isolados de CMV
tanto em bananeiras como em outras espécies vegetais (ARAÚJO et al., 2001;
COLARICCIO et al., 1996; DUARTE et al., 1994; EIRAS et al., 2001; FRANGIONI et
al., 2001). A ocorrência do CMV em bananeira foi relatada nos estados de
Pernambuco (MEDEIROS, 1963), Rio de Janeiro (RIBEIRO et al., 1975), Ceará
(LIMA & GONÇALVES, 1988), Minas Gerais (MACIEL-ZAMBOLIM et al., 1994), São
Paulo (COLARICCIO et al., 1996), e Pará (TRINDADE et al., 1998).
A incidência e a importância do CMV em bananais, tanto no Brasil como nas
demais partes do mundo, tem aumentado, sendo registradas perdas na produção de
até 80% (TRINDADE et al., 1998). Além disso, o transporte e a comercialização de
mudas de propagação vegetativa, principalmente de clones provenientes de culturas
‘in vitro’, vêm permitindo a disseminação do vírus, que por apresentar ampla gama
de hospedeiras e diversas espécies de afídeos vetores, é facilmente disseminado
para novas regiões produtoras (EIRAS et al., 2001).
2.5.2
Etiologia
O CMV é classificado taxonomicamente como uma espécie da família
Bromoviridae, gênero Cucumovirus. Suas partículas são isométricas com diâmetro
em torno de 28 a 30nm, o genoma é constituído por três moléculas de RNA de fita
simples, senso positivo (GIBB & HARRISON, 1970; FRANKI et al., 1980;
PALUKAITIS et al., 1992). A proteína capdial é sintetizada a partir de um RNA subgenômico (FRANKI et al., 1979). O capsídeo é formado por 180 subunidades
proteicas idênticas e sua massa molecular é de cerca de 24.500 Da (GIBBS &
HARRISON, 1970; KING et al., 2012).
O genoma do CMV está dividido em três segmentos de RNAs genômicos
(RNA 1, RNA 2 e RNA 3) e um quarto RNA subgenômico (RNA 4), derivado do RNA
3. O RNA 4 não é necessário para a infecção, mas é imprescindível para a formação
da proteína capsidial (KAPLAN et al., 1997). Os quatro RNAs atuam como RNAs
mensageiros e possuem cerca de 200 nucleotídeos, na região terminal 3’ não
13
traduzível (PALUKAITIS et al., 1992). O RNA 1 e o RNA 2 são encapsidados em
partículas separadas, enquanto que os RNAs 3 e 4 fazem parte de uma terceira
partícula (KAPLAN et al., 1997).
O RNA 1, com aproximadamente 3357 nucleotídeos, possui um única ORF
que codifica para uma proteína denominada 1a ou 111K, cuja massa molecular é de
cerca de 111 kDa (PALUKAITIS et al., 1992). Essa proteína está associada
principalmente com a replicação viral, porém há estudos como o feito por Gal-On
(1994) que sugerem a sua associação a proteínas de movimento e, com isso,
interferindo na translocação do vírus nas plantas hospedeiras.
O RNA 2 do CMV possui cerca de 3050 nucleotídeos e uma ORF que codifica
para uma proteína de massa molecular entre 94 e 97 kDa, chamada de proteína 2a,
envolvida na replicação do vírus (PALUKAITIS et al., 1992; GAL-ON et al., 1994).
Segundo Kaplan et al. (1997) o RNA 2, ainda possui um segundo gene, denominado
2b, responsável pela codificação da proteína 2b, com massa molecular de 11,3 kDa.
A sequência codificadora dessa proteína se sobrepõe aos 69 códons terminais da
ORF do gene 2a. A proteína 2b atua na translocação sistêmica do vírus na planta
hospedeira, além de ser um fator que pode estar envolvido em uma interação de
especificidade entre o vírus e a planta hospedeira, como supressor do silenciamento
gênico.
O RNA 3 do CMV possui cerca de 2116 nucleotídeos e duas ORFs. A ORF
próxima a extremidade 5’ é responsável por codificar a proteína 30K ou 3a
(PALUKAITIS et al., 1992). Proteínas 3a e capsídial (24K) são necessárias para que
ocorra o movimento do vírus em todos os hospedeiros (SUZUKI et al., 1991; CANTO
et al., 1997).
Por fim, o RNA 4 possui aproximadamente 1031 nucleotídeos, é considerado
subgenômico porque é sintetizado a partir do RNA 3 e carrega o gene da capa
protéica (HAQ et al., 1996).
O CMV pode ter associado às suas partículas um pequeno segmento de
RNA, denominado RNA satélite com uma fita entre 334 e 368 nucleotídeos
(FRANCKI, 1985). Este RNA, não é necessário para a infecção ou a replicação do
vírus, porém é absolutamente dependente do CMV para sua replicação e
encapsidação (MONTASSER et al., 1991). A presença do RNA satélite pode afetar o
nível de replicação do CMV e, consequentemente, sua patogenicidade (PALUKAITIS
et al., 1992). Este RNA, também chamado de RNA 5 foi relatado pela primeira vez na
França em 1974, como agente causal de necrose em tomate (GALLITELLI et al.,
1991). O efeito mais observado é a regulação da expressão dos sintomas, em muitas
espécies hospedeiras atenua a doença, mas ocasionalmente, uma nova doença é
14
induzida e esta pode ser letal em certos hospedeiros (WATERWORT et al., 1979;
TAKANAMI, 1981; GONSALVES et al., 1982).
As estirpes do CMV apresentam grande variabilidade e são classificadas em
dois subgrupos, CMV-I e CMV-II (OWEN & PALUKAITIS, 1988). A identificação do
subgrupo a que pertence um isolado é de suma importância para a realização de
estudos que culminem em medidas de controle (FRANGIONI et al., 2001). A
variabilidade das estirpes é um fator que interfere na eficiência da transmissão pelo
afídeo (GERA et al., 1979). Influencia na resposta das plantas à infecção,
determinando seu comportamento junto às plantas cultivadas e da vegetação
espontânea, que são reservatórios naturais do vírus (EDWARDS & GONSALVES,
1983; LAPIDOT et al., 1997). Daniels & Campbell (1992) ainda sugerem a divisão do
subgrupo I em “a” e “b” de acordo com a sensibilidade à temperatura, sintomas em
plantas indicadoras e o padrão de dsRNA.
Em bananais no Brasil, até o momento, esta descrita à ocorrência do CMV
subgrupo I, porém não se descarta a possibilidade de ocorrência do subgrupo II,
como relatado por Singh et al. (1995) em bananais na Austrália. No estado de São
Paulo, foram descritos isolados de CMV em diferentes cultivares de banana (grupos
genômicos: AA, AAA, AAB, ABB, AAAB, AABB) provenientes de diferentes regiões
produtoras do estado. Sendo que, um dos isolados de CMV em banana Nanica
(AAA), descrito em São Paulo, proveniente do município de Miracatu, foi
caracterizado biológica, sorológica e molecularmente como a espécie CMV subgrupo
Ia, tendo apresentado uma homologia de 98% com os isolados de Porto Rico, Havaí,
Colômbia e Austrália, sugerindo um ancestral comum para estes isolados (EIRAS et
al., 2001).
Muitos métodos têm sido utilizados para diferenciar esses subgrupos, como o
sorológico, a hibridização do ácido nucléico (OWEN & PALUKAITIS, 1988;
PIAZZOLA et al., 1979), mapeamento peptídico da capa proteica (EDWARDS &
GONSALVES, 1983) e a RT-PCR (transcrição reversa e reação em cadeia da
polimerase) combinada com a análise da restrição do produto amplificado (RFLP)
(RIZOS et al., 1992; WYLIE et al., 1993; SINGH et al., 1995; VARVERI & BOUTSIKA,
1999; EIRAS et al., 2001).
A semelhança entre as estirpes do CMV dentro de cada subgrupo é grande,
diminuindo entre os dois subgrupos (PALUKAITIS et al., 1992). A sequência de
aminoácidos da capa protéica de estirpes do mesmo subgrupo apresenta 94-99 % de
homologia e, entre os subgrupos a homologia é de 80-83 % (QUEMADA et al.,
1989).
15
2.5.3
Epidemiologia
O CMV, em condições naturais, normalmente é transmitido por afídeos
(pulgões) de maneira não persistente e não-circulativa, ou seja, o afídeo-vetor
adquire e transmite o vetor durante a picada de prova, ficando com o vírus no estilete
por um período de tempo inferior a um minuto (NG et al., 2000).
O vírus é
transmitido para outras plantas logo a seguir, nas picadas subsequentes sem o
período latente. A perda da capacidade de transmissão é rápida, pois o período de
retenção do vírus é extremamente curto (NG et al., 2000).
O CMV pode ser transmitido por mais de 80 espécies de afídeos, agrupadas
em 33 gêneros. As espécies mais comuns de afídeos responsáveis pela
disseminação do CMV são Aphis gossypii e o Myzus persicae. Além dessas duas
espécies, podemos citar A. spiraecola (A. citricola), A. craccivora, Lipaphis erysimi,
Rhopalosiphum padi, R. maidis e Schizaphis graminum (HOBBS et al., 2000).
As espécies M. persicae e A. gossypii, também, são as mais usadas para a
transmissão experimental deste vírus. A eficiência de transmissão varia de acordo
com a estirpe do vírus, a espécie de afídeo, as hospedeiras infectadas, das espécies
hospedeiras utilizadas para manter a colônia pulgão (PALUKAITIS & GARCIAARENAL, 1992), e do número de transferência do CMV para as plantas–testes (NG
et al, 1999). A maioria das estirpes de CMV pode ser transmitida por estes pulgões
porque a especificidade de transmissão do vírus é muito baixa. Muitas espécies de
afídeos podem transmitir múltiplas estirpes do CMV (PALUKAITIS & GARCIAARENAL, 2003).
Segundo Frangioni et al. (2001), apesar de ser transmitido por várias
espécies de afídeos, para diversas espécies de plantas de gêneros e famílias
botânicas diferentes, aparentemente com ausência de especificidade, há diferenças
na capacidade de transmissão das estirpes do CMV. Essa capacidade não está
associada à planta hospedeira e à concentração do vírus no tecido vegetal, mas com
propriedades intrínsecas da capa proteica do vírus (FRANGIONI et al., 2001).
O CMV pode ser também transmitido por sementes de algumas espécies de
plantas. A porcentagem de transmissão pela semente é bastante variável, inclusive
dentro de uma mesma espécie. Além disso, aspectos como cultivar, condições
ambientais e a ação de diferentes estirpes, aumentam essa variabilidade
(PALUKAITIS et al., 1992). A ocorrência de transmissão do vírus pela semente em
algumas espécies da vegetação espontânea possui um impacto epidemiológico
16
considerável, e varia de acordo com as condições ambientais (YANG et al., 1997). O
vírus também pode ser transmitido mecanicamente, tanto experimentalmente quanto
através dos tratos culturais.
2.5.4
Sintomatologia
Nos últimos 84 anos o CMV tem sido identificado como o agente causal de
mais de 100 doenças de plantas, que causam desde um mosaico discreto até
necrose severa e morte da planta (FRANGIONI et al., 2001).
2.5.5
Controle
Dentre as diversas medidas recomendadas para o controle do CMV,
destacam-se a utilização de material propagativo sadio, erradicação das plantas com
sintomas de mosaico, inspeções periódicas, controle químico dos afídeos vetores ou
a eliminação das plantas colonizadoras dos afídeos vetores, eliminação de
hospedeiras silvestres como Commelina spp.; Physalis spp.; Ricinus communis;
Cucumis spp. e Crotalaria spp. hospedeiras do CMV (CORDEIRO & MATOS, 2003).
2.6 IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO DO BSV E CMV
A Instrução Normativa Nº 46, de 27 de dezembro de 2010, do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), estabeleceu os critérios e procedimentos de
prevenção e controle das pragas Banana streak virus - BSV e Cucumber mosaic virus CMV em mudas de bananeira, visando à certificação fitossanitária com vistas à sua
comercialização.
Estes
vírus
são
considerados
“Pragas
Não
Quarentenárias
Regulamentadas” (pragas A2), cuja presença em plantas ou partes destas, para plantio,
influi no seu uso proposto com impactos econômicos inaceitáveis. As pessoas físicas e
jurídicas que exerçam as atividades de produção, comércio, armazenamento, importação e
exportação de mudas de bananeira (Musa spp.) deverão estar inscritas no Registro Nacional
de Sementes e Muda (RENASEM).
17
Com o objetivo de evitar a disseminação desses vírus e a introdução de vírus
exóticos ao Brasil, na cultura de banana, todo germoplasma deve ser submetido aos
procedimentos de indexação, que envolvem um grande número de testes sorológicos para o
diagnóstico da maior parte do vírus descritos até o momento em Musa. O teste mais
empregado é o “Enzyme immmunosorbent assay” (ELISA), mas podem ser empregados o
“Dot-Blot”, o “Western blot” e o “Lateral Flow”. Embora, este último necessite ser adequado
para os principais vírus que ocorrem em Musa, pode ser indicado para programas de
indexação de matrizes, em virtude da facilidade e rapidez na sua execução (COLARICCIO,
2005). No Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia do Instituto Biológico, o teste foi
empregado com sucesso, para diagnosticar o CMV em amostras de folhas de bananeira.
Além dos testes sorológicos, podem ser usados os testes moleculares de “Reverse
Transcriptase–Polymerase Chain Reaction” (RT-PCR), RAPD e “Imuno-Captura” (IC-PCR),
para a identificação de vírus em bananeira (COLARICCIO, 2005).
Para o CMV todos estes testes são utilizados sem maiores problemas para o
diagnóstico e a caracterização do vírus, inclusive testes de inoculação mecânica podem ser
utilizados para distinguir CMV dos subgrupos I e II.
Para a detecção do BSV, algumas dificuldades são encontradas na utilização desses
métodos. As técnicas ELISA e ISEM, que tem como alvo a detecção de proteínas da capa
proteica, podem ser empregadas na detecção do BSV epissomal em bananeiras (HARPER
et al., 1999b). Porém, estes testes necessitam de antissoros específicos contra o BSV e
estes são obtidos com dificuldade, devido à baixa concentração viral, falta de hospedeiras
experimentais e dificuldade para a purificação do vírus (AGINDOTAN et al., 2003). Com
isso, inviabilizam métodos que combinam uma etapa de captura imunológica das partículas
do vírus com um antissoro policlonal específico para BSV com a subsequente amplificação
de sequências do DNA viral por IC-PCR. Esta técnica teria a vantagem sobre a PCR
convencional, pois os vírus infectivos seriam diagnosticados, eliminando o diagnóstico dos
vírus integrados ao DNA da planta. A PCR tem sido utilizada em numerosos estudos para a
detecção de badnavírus, porém como citado anteriormente, a presença de EPRV’s no
genoma da bananeira dificulta a detecção da infecção epissomal do BSV por PCR, visto que
a técnica pode amplificar tanto o DNA viral encapsidado quanto as sequências virais
integradas (LE-PROVOST et al., 2006).
Outro método que vem sendo empregado é o ‘Rolling Circle Amplification’ (RCA). A
técnica de RCA tem sido utilizada para amplificar e caracterizar as moléculas de DNA
circular, incluindo plasmídeos (DEAN et al, 2001;. REAGIN et al., 2003) e vários gêneros de
vírus
de DNA que infectam humanos, animais e plantas (JOHNE et al., 2009). Até o
momento, a aplicação de RCA para vírus infectando plantas tem sido limitada a pequenos
genomas de DNA fita simples, nas famílias Geminiviridae e Nanoviridae (JAMES et al.,
18
2010). No trabalho realizado por James e colaboradores (2010) foi descrita a utilização de
RCA como um método eficiente para a detecção de isolados de BSV infectando banana, e a
capacidade desta técnica diferenciar entre sequências genômicas virais epissomal e
integradas ao DNA da planta. Esta técnica utiliza a “phy 29 DNA polymerase”, sintetizada
pelo bacteriófago “phy 29” e primers aleatórios, a reação ocorre a uma temperatura
isotérmica de 30°C e os produtos da amplificação são digeridas por enzimas de restrição.
Possui a vantagem de amplificar uma pequena quantidade de DNA de até 1ng, e de apenas
detectar o BSV epissomal (infectivo). Porém, necessita de técnicas adicionais de clonagem
e sequenciamento aumentando o custo do diagnóstico. O ‘KIT’ de RCA ‘Templi Phi’ para
100 reações tem o custo atual de R$ 888,00 (GE LIFE SCIENCES, 2012).
A instrução normativa n° 29/2012, ainda em discussão, irá substituir a atual instrução
normativa n° 46/2010. No seu artigo 6° estabelece que as plantas matrizes de bananeiras e
as gemas oriundas das plantas selecionadas no campo deverão ser indexadas utilizando- se
as técnicas “Rolling-Circle Amplification” (RCA) para a detecção de BSV e “Reverse
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction” (RT-PCR) para o CMV.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 AVALIAÇÂO DA INCIDÊNCIA DO CMV E BSV EM BANANEIRAS NO CULTIVO
ORGÃNICO E NO CULTIVO CONVENCINAL
3.1.1 Local e Período da realização do experimento
O experimento foi conduzido em bananais comerciais localizados nos município de
Registro, latitude 24°41’16’’ S e longitude 47°50’37’’ W e Sete Barras, latitude 24°23’16’’ S e
longitude 47°55’32’’ W, no estado de São Paulo, no período de outubro de 2011 a janeiro de
2013. A propriedade, Sítio Boa Vista, localizada no município de Sete Barras, SP, produz
banana em cultivo orgânico. Não utiliza qualquer produto químico para o controle de pragas
e doenças, e nem na adubação. A adubação é realizada com matéria orgânica proveniente
de restos vegetais de outras culturas como da palmeira pupunha. Não há controle químico
das plantas espontâneas, só a capinação manual quando necessário, a mão de obra é
familiar e não um técnico responsável pela produção. A fazenda Jandaia, propriedade
localizada no município de Registro, SP, tem o cultivo convencional, com a utilização de
produtos químicos para o controle de pragas, doenças e plantas espontâneas, e faz
pulverização aérea. A correção do solo e adubação química é realizada conforme
necessidades apontadas por análises de solo. A propriedade possui funcionários e técnico
responsável pela produção.
3.1.2 Material Vegetal
Para a instalação do experimento, vinte mudas de bananeiras do grupo Cavendish,
cv. Galil 7, foram coletadas em uma propriedade comercial no bairro do Guaraú, município
de Jacupiranga, Vale do Ribeira, SP. Na propriedade, as touceiras de onde as mudas foram
retiradas, apresentavam elevada incidência e severidade da estria da bananeira causada
pelo BSV e diagnosticada anos antes, pelo laboratório de Fisiopatologia e Fitovirologia
Vegetal do Instituto Biológico, SP. As mudas coletadas, em forma de rizomas e chifres foram
transplantadas para dois bananais, um de cultivo convencional localizada no município de
Registro e outra de cultivo orgânico, no bairro Guapiruvu, Sete-Barras, dez mudas por
propriedade. As mudas foram distribuídas aleatoriamente dentro do bananal, devidamente
identificadas com fitas coloridas e estacas (Figura 1). Nas mesmas propriedades, dez
20
bananeiras jovens e sadias da cultivar Prata, do cultivo orgânico, e dez bananeiras jovens e
sadias das cultivares Prata e Nanica do cultivo convencional, foram selecionadas
aleatoriamente e identificadas, para serem a avaliadas.
Figura 1. Bananeiras jovens e mudas de bananeiras introduzidas nos cultivos convencional e
orgânico: bananeira jovem em cultivo convencional (A); bananeira jovem em cultivo orgânico (B);
muda introduzida em cultivo convencional (C); muda introduzida em cultivo orgânico (D)
3.1.3 Avaliação das bananeiras
As dez bananeiras ‘Prata’ do cultivo orgânico, cinco ‘Prata’ e cinco ‘Nanica’ do
cultivo convencional e dez mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cada um
dos cultivos foram avaliadas quanto à presença de sintomas, a incidência do BSV e
CMV, e coleta dos dados relativos ao crescimento vegetativo. As plantas foram
avaliadas durante um ano, em cada avaliação foram coletadas amostras da parte
central (direita e esquerda) da segunda folha mais jovem da planta (folha 2),
conforme a Figura 2, que foram empregadas para o diagnóstico sorológico e
molecular do BSV e CMV, detalhados nos itens 3.2, 3.3 e 3.4
21
Figura 2. Procedimento de coleta da folha de bananeira. Adaptação da figura “procedimento de
amostragem para a análise foliar” (BORGES e OLIVEIRA, 1995)
3.2 DETECÇÃO SOROLÓGICA DO CMV POR PTA-ELISA
A avaliação do CMV nas amostras de bananeira foi feita por PTA-ELISA ‘Plate
Trapped Antibody- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay’. Amostras foliares de Musa sp.
‘Nanica’, ‘Prata’, ‘Galil 7’, ‘Naniquinha’ e ‘Grand Naine’ foram utilizadas. As amostras (0,20 g)
foram trituradas em nitrogênio líquido e adicionou-se 2 mL do tampão ‘PBS-TPo’ (PVP 0,05
M e pH 7,4). O extrato foi diluído na proporção 1:1 (v/v) em tampão de cobertura (carbonato
de sódio, pH 9,6). Os extratos foram homogeneizados por inversão e aplicados em placa de
polipropileno, 100 µl em cada poço e mantidas em estufa a 37°C por 2 horas. A seguir a
placa foi lavada 3 vezes com ‘PBS-Tween’ (0,5 M, pH 7,4), e acrescentou-se uma solução
de leite desnatado diluído em ‘PBS-TPo’ 1%, em cada poço, sendo novamente, levada a
estufa a 37°C por 1 hora. Após esse período a placa foi novamente lavada e adicionou-se o
As-CMV diluído na proporção 1:4000 em ‘PBS-TPo’ mantendo-se a placa em estufa a 37°C
por 2 horas. A placa foi novamente lavada e foi adicionado o ‘Anti-rabbit’ conjugado a
enzima fosfatase alcalina diluído na proporção 1:30.000 em ‘PBS-TPo’ mantendo-se a placa
em estufa a 37°C por 2 horas. Após esse período a placa foi lavada e acrescentou-se então,
o substrato ‘p-nitrofenilfosfato’ diluído em tampão substrato (dietanolamina 0,5 mM, pH 9,8),
na proporção 1 mg/mL. Após, aproximadamente, 30 minutos foi realizada a leitura da placa
em leitor de ELISA modelo 3550 - UV (Bio-Rad) no comprimento de onda de 405 nm. Foram
consideradas positivas as amostras cujos valores da média de absorbância da amostra
avaliada sobre a média de absorbância da amostra sadia foi superior ou igual a 3,0.
22
3.3 DETECÇÃO MOLECULAR DE CMV POR RT-PCR
3.3.1 Extração do RNA total
A extração de RNA foi realizada diretamente de folhas de bananeiras empregando a
extração com Trizol (Invitrogen Life Technologies) de acordo com o fabricante, a extração
com o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), de acordo com o fabricante, e a extração com fenol:
clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) (Wylie et al., 1993).
Para a extração com Trizol foram utilizadas 100 mg de tecido foliar das bananeiras
avaliadas, esse material foi triturado em nitrogênio líquido. Antes de descongelar o
macerado recebeu 700 µL do reagente Trizol e 300 µL de NaCl (0,85%) sendo então
transferido para tubos (1,5 mL) e incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. A esta
solução adicionou-se clorofórmio (200 µL) sob agitação intensa por 15 segundos e em
seguida, foi centrifugada (10.000g a 4°C por 15 minutos). A fase aquosa foi cuidadosamente
transferida para novos tubos e adicionou-se 500 µL do álcool isopropílico a cada tubo. A
solução foi agitada por inversão, incubada por 10 minutos e depois centrifugada (10.000g a
4°C por 15 minutos). O sobrenadante foi removido de cada tubo e o pellet de RNA foi lavado
com 1 mL etanol (75%) sob agitação no vortex e centrifugado (7500g a 4ºC por 5 minutos).
Os sobrenadantes foram descartados, e os precipitados foram colocados para secar a
temperatura ambiente por 20 minutos e depois ressuspendido em H2O RNAse free. Os
RNA’s foram mantidos em freezer a -80°C.
Na extração com RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) foram empregadas 100 mg de
tecido foliar das bananeiras avaliadas, triturado em nitrogênio líquido. Os tecidos triturados
foram transferidos para tubos (1,5 mL) acrescentando-se 450 µL da solução ‘RLT’ antes de
evaporar completamente o nitrogênio líquido. Os tubos foram incubados a 56ºC por 3
minutos e agitado por inversão. O conteúdo dos tubos foi transferido para novos tubos e
centrifugado (10.000g a 4ºC por 2 minutos). A solução foi transferida para novos tubos e
acrescentou-se 0,5 volume de etanol 100%. Os lisados foram transferidos para as colunas e
foram centrifugados (10.000g a 4ºC por 15 segundos). O eluido foi descartado e as colunas
foram lavadas com 700 µL da solução ‘RW1’ e centrifugadas (10.000g a 4ºC por 15
segundos) descartando-se, mais uma vez, o conteúdo que passou pelas colunas. As
colunas foram lavadas com 500 µL da solução ‘RPE’ e centrifugadas (10.000g a 4ºC por 15
segundos). Novamente, o conteúdo que passou pelas colunas foi descartado junto com o
tubo coletor. As colunas foram depositadas em novos tubos (1,5 mL) adicionando-se 50 µL
23
de H2O RNAse free no centro da membrana e centrifugadas (10.000g a 4ºC por 1 minuto),
obtendo-se o RNA no tubo.
De acordo com a metodologia de Wylie et al. (1993) foram utilizados 100 mg de
tecido vegetal triturado em nitrogênio líquido transferidos para microtubos (1,5mL) antes de
todo o nitrogênio evaporar. Aos tubos adicionou-se 500 µL do tampão de extração (50mM
Tris-HCL pH 8,5, 10 mM EDTA, 200 mM NaCl) e 500 µL de fenol: clorofórmio: álcool
isoamílico (25: 24: 1). A solução foi agitada em vortex por um minuto e centrifugada
(13.000g a 4°C por 15 minutos). A fase aquosa foi transferida para novos tubos,
adicionando-se 500 µL da solução clorofórmio:álcool isoamílico (50: 1), os tubos foram
agitados no vortex por 1 minuto e centrifugados (13.000g a 4°C por 1 minuto). A fase
aquosa foi transferida para novos tubos adicionando-se 500 µL de isopropanol gelado e
agitando-os por inversão, sendo a seguir, resfriados a -80°C por 15 minutos. Os tubos foram
centrifugados (13.000g a 4°C por 3 minutos), descartando-se o sobrenadante. Os
precipitados foram secos a temperatura ambiente por 15 minutos e ressuspendidos em 100
µL de TE, 4 µL de NaCL e 250 µL de etanol gelado. Em seguida, os tubos foram incubados
no gelo por 20 minutos e centrifugados (13.000g a 4°C por 3 minutos) descartando-se o
sobrenadante. Ao final os precipitados foram secos a temperatura ambiente por 15 minutos
e ressuspendidos em solução TE.
3.3.2 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT- PCR)
Para a amplificação do RNA total extraído, das subamostras de folhas de bananeira
avaliadas, inicialmente foram obtidos os cDNAs. Para a obtenção do cDNA foram utilizados:
1 µL do primer CMV 1 (antisense), 0,4 µL de dNTP (10 mM), 3 µL de H2O RNase free e 2 µL
do RNA extraído. As soluções foram colocadas em tubos (0,5 mL) e levados ao
termociclador PTC-100 (MJ RESEARCH) a 95°C por 5 minutos. Os tubos foram retirados e
acondicionados em gelo, adicionando-se a seguir 4 µL do tampão RT 5X, 1 µL da enzima
RT (Go Script, PROMEGA) e 8,6 µL de H2O RNase free a cada tubo, que foram colocados
no termociclador a 32ºC por 1 hora. Para a PCR, 2,8 µL dos cDNAs obtidos, foram
utilizados, 0,1 µL dos primers CMV1 e CMV 2, que anelam na região do gene da capa
proteica (Figura 3) e, o Kit Go Taq ® DNA Polymerase da PROMEGA (0,13 µL da enzima
Go Taq DNA Polimerase, 0,5 µL de dNTP (10 mM), 5,0 µL do tampão 5X Green Go Taq
Buffer e 14,57 µL de H2O RNase free para uma solução final de 25 µL), conforme às
recomendações do fabricante. A RT-PCR foi realizada em termociclador nas condições:
24
94ºC por 2 minutos, 35 ciclos de 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e
30 segundos e por fim 72°C por 7 minutos. Os amplicons obtidos foram mantidos a -15°C.
Os produtos da RT-PCR foram analisados em eletroforese em gel de agarose 1,5%
em tampão TAE, contendo brometo de etídeo (1µg/L). Após a corrida de, aproximadamente,
1 hora a 100 V, a visualização do produto foi feita em fotodocumentador Alphalmager TM
1220 sob luz ultravioleta. Foi utilizado o marcador molecular da ‘NORGEN’ de 100 pb. O
tamanho do fragmento esperado, para os primers utilizados, é de 486 pb.
Sequências dos primers utilizados:

CMV 1 (antisense): 5’ GCCGTAAGCTGGATGGACAA 3’

CMV 2 (sense): 5’ TATGATAAGAAGCTTGTTTCGCG 3’
Figura 3. Esquema representativo do RNA 3 do genoma do CMV, as setas verdes indicam o local
onde os primers CMV 1 e CMV 2 anelam na região da capa protéica do RNA 3 (que codifica para
proteínas de movimento e da capa) originando um fragmento de 486 pb
3.4 DETECCÃO MOLECULAR DO BSV POR PCR
3.4.1 Extração do DNA total
A extração de DNA total das amostras foliares foi feita de acordo com o método de
Dellaporta et al., (1983). As extrações foram realizadas em ‘pool’, com uma mistura de cinco
amostras de folhas de bananeiras compondo uma subamostra, totalizando 49 subamostras
de folhas das bananeiras monitoradas: 8 subamostras provenientes de bananeiras jovens
‘Nanica’ em cultivo convencional, 7 subamostras provenientes de bananeiras jovens ‘Prata’
em cultivo convencional, 9 subamostras provenientes de mudas de bananeiras introduzidas
‘Galil 7’ em cultivo convencional, 16 subamostras provenientes de bananeiras jovens ‘Prata’
em cultivo orgânico e 9 subamostras provenientes de mudas de bananeiras introduzidas
25
‘Galil 7’ em cultivo orgânico, num total de nove avaliações. As amostras foliares coletadas
nas dez propriedades avaliadas constituíram 22 subamostras de cinco plantas cada: 2
subamostras de bananeiras ‘Naniquinha’, 2 subamostras de bananeiras ‘Nanica’, 2
subamostras de bananeiras ‘Galil 7’, 8 subamostras de bananeiras ‘Prata’ e 8 subamostras
de bananeiras ‘Grand Naine’. Todas as subamostras foram constituídas de bananeiras da
mesma cultivar.
Para a extração de DNA, 0,10g de tecido vegetal foram triturados com nitrogênio
líquido e adicionados 600µL de solução de extração CTAB (Anexo 1). A mistura foi
homogeneizada e aquecida a 65°C por 30 minutos, a cada 10 minutos as amostras eram
agitadas
por
inversão.
Em
seguida
adicionou-se
600µL
da
solução
álcool
isoamílico/clorofórmio na proporção 1mL/29mL, aos tubos que foram agitados por inversão e
centrifugados a 7500g a 4°C por 5 minutos. Transferiu-se 400µL do sobrenadante para
tubos novos e adicionou-se 40µL da solução CTAB/NaCl (Anexo 1). Os tubos foram
agitados por inversão, acrescentados 500µL da solução álcool isoamílico/clorofórmio,
agitados novamente e centrifugados a 7500g a 4°C por 5 minutos. Novamente, o
sobrenadante foi transferido para novos tubos e adicionou-se 400µL de solução de
precipitação CTAB (Anexo 1). Os tubos foram agitados por inversão e aquecidos a 65°C por
30 minutos. A seguir os tubos foram centrifugados a 7500g a 4°C por 5 minutos e descartouse o sobrenadante. Aos tubos foram acrescentados 300µL de isopropanol, agitados por
inversão e centrifugados a 7500g a 4°C por 10 minutos. O sobrenadante de cada tubo foi
descartado e acrescentou-se 500µL de álcool 70%. Novamente os tubos foram
centrifugados a 10000g a 4°C por 10 minutos. Descartou-se o álcool e os tubos foram
postos para secar a temperatura ambiente. Após, aproximadamente, 30 minutos o DNA foi
ressuspendido em 40µL de água deionizada.
3.4.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a amplificação dos fragmentos de DNA obtidos foram utilizadas as amostras de
DNA total extraído de folhas de bananeira ‘Nanica’, ‘Prata’, ‘Galil 7’, ‘Naniquinha’ e ‘Grande
Naine’, o par de primers BADNA 1A e BADNA 4 (HARPER et al., 2002) e o Kit Go Taq ®
DNA Polymerase (PROMEGA), obedecendo às recomendações do fabricante. A posição
relativa dos ‘primers’ no genoma de BSV encontra-se demonstrado na Figura 4. Na reação
foi utilizado 2,0 µL de DNA, 1 µL de cada um dos primers, 0,13 µL da enzima ‘go Taq DNA
Polimerase’, 05 µL de dNTP (10 mM), 5,0 µL do tampão 5X ‘green go taq buffer’ e 15,37 µL
de H2O RNase free, para uma solução final de 25 µL. A reação foi conduzida em
26
termociclador ‘PTC-100’ ou ‘PTC-200’ (MJ RESEARCH), nas seguintes condições: 95ºC por
2 minutos e 40 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 1 minuto, 72°C por 4 minutos. Os
amplicons obtidos foram mantidos a 15°C.
Os ‘primers’ degenerados utilizados anelam na região da replicase viral (Figura 4), cuja
sequências de nucleotídeos são:

Primer BADNA 1A: F 5’CTNTAYGARTGGYTNGTNATGCCTTYGG3’

Primer BADNA 4: R- 5’TCCAYTTRCANAYNSCNCCCCANCC3’
Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese, em gel de agarose 1,5% em
tampão TAE, contendo brometo de etídeo (1µg/L). Após a corrida de, aproximadamente, 1
hora a 80 volts, a visualização do produto foi feita em fotodocumentador ‘Alphalmager TM
1220’ sob luz ultravioleta. Foi utilizado o marcador molecular da ‘NORGEN’ de 100 pb. O
tamanho do fragmento esperado, para os primers utilizados, é de 600 pb.
Figura 4. Esquema da organização genômica do Banana streak virus (BSV). O círculo completo
representa o genoma de DNA dupla fita. As setas cinza indicam a posição das três ORFs. As duas
setas pretas indicam a posição dos primers degenerados utilizados para a amplificação da região
conservada entre a transcriptase reversa e a replicase viral (HARPER, et al., 2002)
Para a PCR, foram testadas quatro diferentes proporções de ‘primers’ e DNA: A - 1:1
(1 µL DNA: 1 µL de cada ‘primer’); B - 1:2 (1 µL DNA: 2 µL de cada ‘primer’); C - 2:2 (2 µL
DNA: 2 µL de cada ‘primer’) e D- 2:1 (2 µL DNA: 1 µL de cada ‘primer’).
Três isolados de bananeiras ‘FHIA 17’, ‘Mysore’ e ‘Galil 7’, com resultado positivo
para o BSV, foram avaliadas para serem empregadas como controle.
27
3.5 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETATIVO EM BANANEIRAS NO CULTIVO
ORGÂNICO E CONVENCIONAL
Com base nos dados relativos à altura da planta, diâmetro do pseudocaule a altura
do peito (DAP) e número de folhas, determinou-se a taxa relativa de crescimento em altura
(TxAlt), taxa relativa de crescimento do diâmetro do pseudocaule (TxDp) e a taxa relativa de
emissão foliar (TxEF) a cada intervalo de avaliação, ou seja, sete semanas. As taxas de
crescimento foram determinadas pela equação: lnY2 – lnY1/ t2 – t1 , onde ‘Y’ é a variável
inicial e final e ‘t’ é o tempo inicial e final a cada intervalo de avaliação. As taxas obtidas
foram submetidas ao teste Tukey a 5% de probabilidade pelo programa estatístico ‘Sisvar’.
Os dados de crescimento para as bananeiras ‘Prata’ jovens do cultivo orgânico, e
‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens do cultivo convencional foram coletados da primeira a quinta
avaliação, ou seja, até a floração destas bananeiras. Para as mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas em ambos os cultivos, os dados foram coletados a partir da quinta avaliação,
quando as plantas estavam bem estabelecidas no campo, até a décima avaliação.
3.6 LEVANTAMENTO DA OCORRÊNCIA DO CMV E BSV EM BANANAIS COMERCIAIS
NA REGIÃO DO VALE DO RIBEIRA
3.6.1 Local e Período do Experimento
O levantamento da incidência do BSV e do CMV foi realizado em bananais
comerciais de cultivo convencional em quatro municípios produtores de banana no Vale do
Ribeira, SP, no mês de julho de 2012, conforme Tabela 1. Um questionário para coletar
dados sobre as propriedades e sobre o manejo com a cultura foi dado aos agricultores.
28
Tabela 1. Dados dos locais e cultivares de bananeiras coletadas em quatro municípios produtores de
banana no Vale do Ribeira, SP
Produtores
Propriedades
Municípios
Coordenadas
Grupo
Cultivares
Luis Carlos S. Costa
Fazenda Jaguaruna
Sete Barras
latitude 24° 23'16'' S
Cavendish
Nanica
Carlos R. Rossetti
Fazenda Jaguaruna
Sete Barras
longitude 47°52'52'' W
Cavendish
Naniquinha
Hélio S. Rossetti
Sítio Boa Vista
Pariquera-açu
Prata
Prata
Paulo Ohya
Sítio Granada
Cajati
Prata
Prata
Eizo Kawagoe
Sítio Turvo
Cajati
latitude 24°44'10'' S
Prata
Prata
Luiz H. Koga
Sítio Pedrinhas
Cajati
longitude 48°07'22'' W
Prata
Prata
Eliza A. Untem
Sítio Itapavuçu
Jacupiranga
Cavendish
Galil 7
Orivaldo Dan
Jacupiranga
Cavendish
Grand Naine
José Luiz Correa
Fazenda Santa Maria
Fazenda Salto do
Berrador
Jacupiranga
latitude 24°41'33'' S
Cavendish
Grand Naine
José dos Santos Cugler
Sítio Cugler e Jr.
Jacupiranga
longitude 48°00'08'' W
Cavendish
Grand Naine
João Marcos Moreira
Sítio Nhotinga
Jacupiranga
Cavendish
Grand Naine
latitude 24° 42'54'' S
longitude 47°52'52'' W
3.6.2 Material Vegetal
Em cada propriedade foi selecionada uma área com 5000 m², onde foram
escolhidas, aleatoriamente, dez plantas, sendo o delineamento inteiramente casualizado. O
caminhamento foi em zigue-zague em dez pontos na área experimental. Foi realizada a
coleta da folha 2 (Figura 2) como citado no item 3.1.4 de cada cultivar de bananeira (Tabela
1), com ou sem suspeita de sintomas provocados por vírus.
3.6.3 Avaliação das bananeiras
As amostras de dez bananeiras de cada propriedade (Tabela 1) devidamente
identificadas foram levadas ao Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia do Instituto
Biológico de São Paulo e, posteriormente, submetidas aos testes sorológico e molecular,
conforme descritos nos itens 3.2, 3.3 e 3.4.
29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 MONITORAMENTO DE BANANEIRAS EM CULTIVO CONVENCIONAL E ORGÂNICO
EM DOIS BANANAIS COMERCIAIS NO VALE DO RIBEIRA
Na primeira coleta foram avaliadas dez bananeiras ‘Prata’ jovens no cultivo orgânico
e cinco bananeiras ‘Nanica’ e cinco ‘Prata’ jovens no cultivo convencional, uma vez que as
mudas recém-introduzidas, a partir de rizomas e chifre, ainda não apresentavam folhas. Da
terceira avaliação em diante foram coletadas as folhas das bananeiras jovens e das mudas
de bananeiras introduzidas. Na décima avaliação só foram coletadas folhas das bananeiras
introduzidas em ambos os cultivos, pois as bananeiras jovens avaliadas desde o início do
experimento já haviam completado o seu ciclo.
Durante as avaliações foi constatada a mortalidade de 50% das mudas introduzidas
nos cultivos convencional e orgânico, na maioria das vezes, devido à debilidade das mudas
e principalmente, ao ataque da broca da bananeira (Cosmopolites sordidus), restando
apenas cinco mudas de bananeiras introduzidas em cada propriedade.
4.1.1 Período de avaliação e condições climáticas
Foram realizadas 10 avaliações nos dois bananais para analisar a presença do CMV
e BSV, totalizando 15 meses e três semanas de experimento. A primeira e segunda
avaliação ocorreu na primavera (out e dez, 2011), a terceira e quarta no verão (jan e mar,
2012), a quinta e sexta no outono (abr e jun, 2012), a sétima e oitava no inverno (jul e set
2012), nona, novamente na primavera (nov, 2012) e a décima avaliação no verão (jan, 2013)
(Figura 5).
Figura 5. Esquema dos meses e estações do ano no período de avaliação do experimento, em verde
os meses em que ocorreram as coletas.
30
As informações climáticas de temperatura e precipitação, durante o período avaliado
podem ser observados na Figura 6.
Figura 6. Médias de temperatura (A) e precipitação (B) observadas no período de realização do
experimento para o Vale do Ribeira, SP
4.2 AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS DE BANANEIRAS EM CULTIVO ORGÂNICO E
CONVENCIONAL
Das 10 mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas nos cultivos orgânico e
convencional, três manifestaram sintomas de mosaico e amarelecimento, duas do cultivo
orgânico e uma do cultivo convencional (Figura 7). Enquanto as 20 bananeiras jovens
monitoradas (10 ‘Prata’ em cultivo orgânico, 5 ‘Nanica’ e 5 ‘Prata’ em cultivo convencional)
não manifestaram sintomas de doença.
Segundo Colariccio (2005), os sintomas causados por vírus em bananeiras ocorrem
esporadicamente durante o ano, dificultando a sua identificação visual. Brioso et al. (1986)
cita que o sintoma de mosaico pode ser mais bem visualizado na estação fria do ano.
Conforme Brioso et al. (2000) e Silva Neto & Silva (2009) as bananeiras podem ser
infectadas por mais de um vírus ao mesmo tempo, e os sintomas causados pela infecção
com BSV podem ser muitas vezes confundidos com aqueles causados pelo CMV.
Figueiredo & Brioso (2007) detectaram tanto o CMV quanto o BSV em bananeiras
propagadas por cultura de tecido, empregando a PCR multiplex.
31
Figura 7a. Muda de bananeira ‘Galil 7’ introduzida em cultivo orgânico, vista geral da muda (A) com
sintomas de pontos cloróticos (B e C) e nervuras espessas (C)
Figura 7b. Muda de bananeira ‘Galil 7’ introduzida em cultivo orgânico, vista geral da muda (A), com
sintomas de pontos cloróticos (B) e mosaico (C)
Figura 7c. Muda da bananeira ‘Galil 7’ introduzida em cultivo convencional, vista geral da muda (A)
com sintomas de estrias cloróticas (B) e pontos cloróticos (C)
32
4.3 DETECÇÃO SOROLÓGICA DO CMV POR PTA-ELISA EM BANANEIRAS ‘PRATA’,
‘NANICA’ JOVENS E MUDAS ‘GALIL 7’
O CMV foi detectado por PTA-ELISA, diretamente de folhas de bananeiras, mesmo
na ausência de sintomas, no cultivo orgânico e convencional.
Com base nos resultados obtidos em PTA- ELISA para o CMV pode-se observar que
as 10 bananeiras ‘Prata’ jovens do cultivo orgânico, 5 ‘Nanica’ e 5 ‘Prata’ do cultivo
convencional, mesmo previamente positivas em algumas avaliações apresentaram
resultados negativos em outras. O mesmo comportamento foi observado nas mudas de
bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico e convencional (Tabela 2).
Tabela 2- Resultados positivos e negativos obtidos em PTA- ELISA para o CMV em baneiras
do cultivo orgânico e convencional no Vale do Ribeira, SP
Resultado do PTA- ELISA
Bananeiras jovens
Avaliações
1ª avaliação
3ª avaliação
4ª avaliação
5ª avaliação
6ª avaliação
7ª avaliação
8ª avaliação
Total +
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Prata
CO
+
-
+
+
-
-
+
-
+
-
5
CC
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
0
CO
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
CC
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
CO
-
-
-
-
+
-
+
+
-
-
3
CC
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
2
CO
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
CC
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
CO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10
CC
+
+
+
-
-
+
+
-
-
+
3
CO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10
CC
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
5
CO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10
Nanica
2
0
2
0
3
4
CC
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
4
CO
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
9
CC
MT
+
-
MT
MT
MT
MT
0
Avaliações
1 MO
2MO
3MO
5 MO
1ª avaliação
3ª avaliação
-
-
-
-
-
SF
+
+
SF
+
CO
0
CC
3
+
SF
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
0
0
0
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
0
1
0
0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4
5
0
5
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
4
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0
0
9ª avaliação
4ª avaliação
5ª avaliação
6ª avaliação
7ª avaliação
8ª avaliação
9ª avaliação
10ª avaliação
MT
MT
Mudas introduzidas
6MO 2MC 3MC 4MC 5MC 6MC
5
0
Total +
1 a 10 CO- bananeiras ‘Prata’ em cultivo orgânico, 1 a 10 CC- bananeiras ‘Nanica’ (1 a 5) e
bananeiras ‘Prata’ (6 a 10) em cultivo convencional, MO- mudas ‘Galil 7’ introduzidas em
cultivo orgânico, MC- mudas ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo convencional, SF- planta sem
folha e MT- planta morta
33
No cultivo orgânico, cinco e três bananeiras ‘Prata’ jovens foram positivas para o
CMV na primeira e terceira avaliação, respectivamente. A partir da sexta avaliação todas as
dez bananeiras ‘Prata’ jovens obtiveram resultado positivo para o CMV, exceto uma
bananeira na nona avaliação, resultando em 43 amostras positivas das 80 avaliadas
(58,70%). Não houve resultados positivos para o CMV na terceira e quinta avaliação (Tabela
3). Para as mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, os resultados foram positivos para
uma, uma, três, cinco e quatro plantas na terceira, sexta, sétima, oitava e nona avaliação,
respectivamente, resultando em 14 amostras positivas das 44 avaliadas (31,80%). Não
houve resultados positivos na segunda, quarta, quinta e décima avaliação (Tabela 4).
Tabela 3. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras jovens
‘Prata’ em cultivo orgânico
Média de leituras de absorbância a 405 nm e resultado do ELISA
Bananeiras 'Prata' jovens
Avaliações
1ª avaliação
3ª avaliação
4ª avaliação
5ª avaliação
6ª avaliação
7ª avaliação
8ª avaliação
9ª avaliação
1 AO
2 AO
3 AO
4 AO
5 AO
0,883 1,253
1,418
1,033 0,989
Σ ( M repetições)
1,141
M amostras/MC-
3,1
Σ ( M repetições)
0,716
M amostras/MC-
2,2
Σ ( M repetições)
0,331
M amostras/MC-
1,2
Σ ( M repetições)
0,839
M amostras/MC-
2,0
Σ ( M repetições)
0,598
M amostras/MC-
4,8
Σ ( M repetições)
0,771
M amostras/MC-
5,8
Σ ( M repetições)
0,78
M amostras/MC-
4,8
Σ ( M repetições)
1,344
M amostras/MC-
6,1
2,4
3,4
0,524 0,725
1,6
2,2
0,625 0,669
2,3
2,5
0,963 0,926
2,3
2,2
0,584 0,614
4,7
4,9
0,502 0,789
3,8
5,9
0,724 0,639
4,5
3,9
0,703 0,772
3,2
3,5
3,9
0,738
2,3
0,668
2,5
0,998
2,4
0,481
3,9
0,612
4,6
0,561
2,8
6AO
2,7
0,595 0,472
1,8
1,4
0,808 0,729
3,0
2,7
1,152 0,885
2,8
2,1
0,624 0,531
5,0
4,3
0,645 0,739
4,8
5,6
0,872 0,766
7A0
1,109
3,0
0,576
1,8
0,848
8AO
9A0
1,028 1,595
2,8
4,4
0,525 0,823
1,6
2,5
0,901 0,753
10 A0
1,021
2,8
0,721
2,2
0,599
3,2
3,4
2,8
2,2
0,751
0,94
0,864
0,721
1,8
2,2
2,1
1,7
0,524
4,2
0,783
0,509 0,528
4,1
4,2
0,609 0,512
0,455
3,6
0,656
5,9
4,6
3,8
4,9
0,729
0,89
0,483
1,052
3,5
5,4
4,8
4,5
5,5
3,0
6,5
0,608
1,18
1,15
1,09
1,19
0,792
1,39
2,7
5,4
5,4
5,0
5,4
3,6
6,3
Controles
MC+ MC-
Total
Qtde
Positivas
%
0,36
5
50%
0,605 0,318
0
0%
1,371 0,262
3
30%
0,745 0,411
0
0%
0,564 0,123
10
100%
0,585 0,132
10
100%
0,577 0,160
10
100%
1,237 0,219
9
47
90%
58,70%
0,914
M: média das amostras, AO: bananeiras jovens monitoradas, MC+: média do controle positivo, MC-:
média do controle negativo. M amostras/MC- com valores ≥ 3 são considerados positivos
34
Tabela 4. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras ‘Galil
7’ introduzidas em cultivo orgânico
Médias de leituras de absorbância a 405 nm e resultado do ELISA
Bananeiras 'Galil 7' introduzidas
Avaliações
2ª avaliação
3ª avaliação
4ª avaliação
5ª avaliação
6ª avaliação
7ª avaliação
8ª avaliação
9ª avaliação
10ª avaliação
1 MO
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
0,9
Σ ( M repetições)
SF
M amostras/MC-
SF
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MC-
Controles
5 MO
6MO
1,3
1,1
1,4
1,0
1,025 0,602 0,797 0,474 0,608
3,2
Σ ( M repetições)
3MO
0,410 0,557 0,463 0,590 0,445
M amostras/MC-
M amostras/MC-
2MO
1,8
2,5
1,4
1,8
0,222 0,299 0,284 0,209
0,8
1,1
1,0
0,7
0,542 0,752 0,840 0,488 0,932
1,3
1,8
2,0
1,1
2,2
0,218 0,153 0,285 0,244 0,698
1,8
1,2
2,3
2,0
5,8
0,391 0,234 0,385 0,397 0,196
3,2
2,0
3,2
3,3
1,300 1,140 0,816 1,270
6,8
6,0
4,3
6,7
1,6
1,46
7,7
0,962 0,915 0,766 0,537 0,722
5,0
4,8
4,0
2,8
3,8
0,349 0,335 0,304 0,294 0,246
2,5
2,4
2,2
2,1
1,8
Total
Positivas
Qtde
%
0,745 0,411
0
0%
0,605 0,318
1
20%
1,371 0,262
0
0%
0,745 0,411
0
0%
1,026 0,120
1
20%
1,026 0,120
3
60%
0,677 0,190
5
100%
0,677 0,190
4
80%
0,637 0,135
0
14
0%
31,80%
MC+
MC-
M: média das amostras, SF: sem folha, MT: morta, MO: muda de bananeira introduzida, MC+:
média do controle positivo, C-: média do controle negativo. M amostras/MC- com valores ≥ 3
são considerados positivos
No cultivo convencional, das cinco bananeiras ‘Nanica’ jovens, duas plantas foram
positivas na primeira e quarta avaliação; três, quatro, cinco e uma na sexta, sétima, oitava e
nona avaliação, respectivamente, resultando em 17 amostras de bananeiras positivas das
38 avaliadas (44%). Não houve resultados positivos na terceira e quinta avaliação (Tabela
5). Das cinco bananeiras ‘Prata’ jovens, três foram positivas, para o CMV, na quarta e sexta
avaliação, cinco e quatro na sétima e oitava avaliação, respectivamente, resultando em 15
amostras de bananeiras positivas das 35 avaliadas (42%). Não houve resultado positivo na
primeira, terceira e quinta avaliação (Tabela 5). Três mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas foram positivas para o CMV na segunda avaliação, cinco na oitava e uma na
nona, resultando em 9 amostras de bananeiras positivas das 43 avaliadas (20,9%). Não
houve resultados positivos na terceira, sétima e décima avaliação (Tabela 6).
35
Tabela 5. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras jovens
‘Nanica’ (1AC a 5 AC) e ‘Prata’(6 AC a 10AC) em cultivo convencional
Média de leituras de absorbância a 405 nm e resultado do ELISA
Avaliações
1ª
3ª
4ª
5ª
6ª
7ª
8ª
9ª
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
Bananeiras 'Nanica' jovens
Total Positiva
Bananeiras 'Prata' jovens
1 AC 2 AC 3 AC 4 AC 5 AC Qtde
%
6 AC 7 AC 8 AC 9 AC 10 AC
1,018 1,347 1,129 0,898 1,035
0,935 0,604 0,82 0,582 0,764
2,8
3,7
3,1
0,573 0,661 0,451
1,8
2,0
1,4
1,073 1,137 0,893
2,8
3,0
2,3
0,566 0,705 0,848
1,5
1,8
2,2
2,4
28
0,57
0,48
1,7
1,5
1,0
1,193
2,6
3,1
0,62
0,69
1,6
1,8
0,484 0,489 0,513 0,354 0,327
3,9
3,9
4,1
2,8
0,446 0,508 0,266 0,483
2,0
3,6
2,6
0,54
4,0
2
40%
0
0%
2
40%
0
0%
3
60%
4
80%
5
100%
2,5
1,6
2,2
1,6
2,1
0,497 0,482 0,454 0,449 0,429
1,5
1,5
1,4
0,998 1,594 1,329
2,6
4,2
3,5
1,4
1,3
1,06
1,562
2,8
4,1
0,717 0,831 0,943 0,581 0,873
1,8
2,2
2,5
1,5
2,3
0,549 0,406 0,316 0,326 0,566
4,4
3,3
2,5
2,6
4,6
0,664
0,62
5,0
4,7
0,392
0,66
2,4
4,1
4,0
3,6
6,1
0,933 0,804 0,429
M amostras/MC-
3,3
3,8
Σ ( M repetições)
0,703
0,73
M amostras/MC-
4,3
4,5
3,6
5,1
3,4
Σ ( M repetições)
SC
1,23
0,438
SC
0,573
1
20%
SC
SC
SC
SC
SC
M amostras/MC-
SC
5,6
2,0
SC
2,6
17
44 %
SC
SC
SC
SC
SC
0,583 0,818 0,542
7,0
6,0
3,2
0,649 0,583 0,984
Controles
MC+ MC-
Total Positiva
Qtde
%
0,914 0,360
0
0%
0,605 0,318
0
0%
0,959 0,375
3
60%
0,959 0,375
0
0%
0,564 0,123
3
60%
0,585 0,132
5
100%
0,577
4
80%
SC
0%
15
42%
0,16
1,237 0,219
M: média das amostras, AC: bananeiras jovens monitoradas, MC+: média do controle positivo, MC-média do
controle negativo. M amostras/MC- com valores ≥ 3 são considerados positivos
Tabela 6. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras
introduzidas ‘Galil 7’ em cultivo convencional
Médias de leituras de absorbância a 405 nm e resultado do ELISA
Bananeiras 'Galil 7' introduzidas
Avaliações
2ª avaliação
3ª avaliação
4ª avaliação
5ª avaliação
6ª avaliação
7ª avaliação
8ª avaliação
9ª avaliação
10ª avaliação
2MC
Σ ( M repetições)
SF
M amostras/MC-
SF
3MC
4MC
0,802 0,859
Controles
5MC
6MC
SF
0,896
SF
4,3
MC+
Total
MC-
Positivas
%
0,745 0,411
3
60%
Σ ( M repetições)
M amostras/MC-
0,393 0,354 0,324 0,298 0,353
0,605 0,318
1,2
1,1
1,0
0,9
1,1
0
0%
Σ ( M repetições)
0,56
M amostras/MC-
2,1
1,371 0,262
0
0%
0,745 0,411
0
0%
1,026 0,120
0
0%
1,026 0,120
0
0%
0,677 0,190
5
100%
0,677 0,190
1
20%
0,637 0,135
0
9
0%
20,93%
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MC-
3,9
4,2
0,349 0,494 0,439 0,361
1,3
1,8
1,009 0,976 0,964
2,6
2,6
2,5
1,6
1,3
0,96
0,658
2,5
1,7
0,319 0,331 0,219 0,288 0,243
2,6
2,7
2,0
2,4
2,0
0,127 0,098 0,079 0,143 0,156
1,0
0,8
0,6
1,2
1,3
1,020 1,130 1,210 1,160 0,902
5,4
6,0
6,4
6,1
4,7
0,700 0,471 0,384 0,540 0,533
3,6
2,4
2,0
2,8
2,8
0,323 0,244 0,277 0,273 0,241
2,4
1,8
2,0
2,0
1,8
M: média das amostras, SF: sem folha, MC: muda de bananeira introduzida, MC+: média do
controle positivo, MC-: média do controle negativo. M amostras/MC- com valores ≥ 3 são
considerados positivos
36
A detecção errática do CMV nas bananeiras, nos diferentes períodos da avaliação,
pode ser devido ao fato da bananeira emitir constantemente folhas novas e perder as folhas
mais velhas, e como as folhas novas vão se dispondo em forma de espiral, no intervalo de
sete a dez semanas a planta produz um ciclo inteiro de folhas novas, ou seja, a folha
avaliada em uma coleta já se tornou a folha mais velha, na coleta seguinte, portanto, já não
será a folha a ser avaliada. Considerando que a folha coletada para ser avaliada foi a
segunda folha abaixo da folha vela, portanto a mais nova, pode ser que o tempo para a
emergência das folhas não seja acompanhado por aquele necessário para a multiplicação
do vírus, dificultando que este atinja os tecidos mais novos. Por outro lado, como as plantas
foram avaliadas sob diferentes condições climáticas, a temperatura pode ter influenciado
tanto a concentração do CMV e do BSV nas bananeiras avaliadas (Dahal et al., 1998), como
na translocação destes para as folhas jovens.
A partir da sexta avaliação todas as bananeiras jovens em ambos os cultivos já
haviam florido e algumas iniciavam a formação do cacho, neste estádio de desenvolvimento
a planta para de emitir folhas e de aumentar o diâmetro do pseudocaule. Este período
coincidiu com as estações de outono-inverno, onde observaram-se as menores
temperaturas e índices pluviométricos (Figura 6, item 4.1.2). Considerando que a
emergência de folhas novas na bananeira é maior no verão, cerca de duas folhas por
semana, do que no inverno, cerca de duas folhas por mês. Talvez, estes fatores tenham
contribuído para que a detecção do CMV tenha sido maior nas avaliações que ocorreram no
outono e inverno, período no qual foram obtidos os maiores números de plantas com
resultados positivos para o CMV.
Gioria et al. (2002) verificaram a recuperação de maracujazeiro amarelo,
diagnosticado positivamente para CMV, por teste biológico, western-blot, dot-blot e RT-PCR.
Não há explicação para o fenômeno de recuperação, mas pode ser que sobre determinadas
condições o vírus pode perder a capacidade de se replicar e/ou translocar para o ápice da
planta; pode induzir a resistência da planta inibindo a sua replicação ou também devido a
um mecanismo de resistência da planta.
O CMV pôde ser detectado por PTA- ELISA, diretamente das folhas das bananeiras.
O mesmo resultado foi obtido por Colariccio et al. (1996; 2006) que detectaram o CMV por
PTA-ELISA empregando o extrato de folhas de bananeiras infectadas. Enquanto, Hu et al.
(1995) obtiveram resultado negativo para a detecção do CMV, por ELISA, utilizando o
extrato proveniente diretamente de folhas de bananeiras com sintomas severos, entretanto,
obtiveram resultados positivos empregando as técnicas de DOT-BLOT e RT-PCR. SUN et
al. (2001) utilizaram o DAS-ELISA eletroquímico para a detecção de CMV através do
substrato o-fenilenodiamina. A detecção eletroquímica mostrou-se mais sensível que o
37
ELISA colorimétrico, com o limite de detecção de 0,5 ng/mL. Sendo este método bastante
indicado para condições de concentrações extremamente baixas de vírus ou de pequenos
volumes de amostra. Yu et al. (2005) obtiveram resultados positivos na detecção do CMV
subgrupos I e II empregando antissoros monoclonais em “Triple Antibody Sandwich”, TASELISA. EIRAS et al. (2001) identificaram um isolado de CMV subgrupo I proveniente do Vale
do Ribeira, por DAS-ELISA e RT-PCR com enzimas de restrição. No Brasil, ainda não foi
identificada a presença do CMV subgrupo II, porém essa possibilidade não está descartada,
uma vez que, este subgrupo já foi identificado em bananais na Austrália (SING et al., 1995).
4.4 DETECÇÃO MOLECULAR DO CMV POR RT-PCR EM BANANEIRAS ‘PRATA’,
‘NANICA’ JOVENS E MUDAS DE ‘GALIL 7’
A extração de RNA total diretamente de folhas de bananeiras foi um processo difícil,
pois houve a oxidação do extrato, com a obtenção de um precipitado de coloração castanha,
com as três metodologias utilizadas. Destes procedimentos o que apresentou os melhores
resultados foi o método de Wylie et al. (1993). Por este procedimento, das subamostras
avaliadas somente as mudas de bananeiras ‘Galil 7’ foram positivas para o CMV, obtendose um fragmento de cerca de 500 pb. (Figura 8). A extração a partir de folhas de bananeiras,
tem imposto, durante as extrações, sérias limitações para a obtenção de RNA de boa
qualidade devido à presença de compostos secundários em grande quantidade (Geuna et
al.,1998; Salzman et al.,1999; Azevedo et al., 2003). Estes compostos, tais como os
polissacarídeos, polifenois, pectina e xilano podem ser extraídos junto com o RNA e inibir a
PCR (Demeke e Adams, 1992, e Malvick & Grunden, 2005 e Wilson, 1997). O mecanismo
de inibição é considerado como sendo a quelação do cofator Mg+2 que é importante para a
atividade da Taq polimerase, para a ligação ao DNA alvo ou à polimerase (Wilson, 1997).
Alternativamente, metabólitos secundários podem precipitar Taq polimerase resultando em
atividade reduzida. Polifenóis de plantas também inibem a Taq polimerase por formação de
estruturas secundárias através dos anéis fenólicos (Mayr et al., 2005) o que resulta na
inativação das enzimas e insuficiência da PCR (Wei et al., 2008).
38
Figura 8. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ CMV 1 e CMV 2 com
fragmentos esperados de cerca de 500 pb; 1- Controle positivo: isolado ‘Gladíolo’; 2, 3, 8 e 9subamostra de bananeiras ‘Prata’ do cultivo orgânico da sétima avaliação (2 e 3) e da oitava
avaliação (8 e 9); 4 e 10- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ do cultivo convencional da sétima
avaliação (4) e da oitava avaliação (10); 5 e 11- subamostra de bananeiras ‘Prata’ do cultivo
convencional da sétima avaliação (5) e da oitava avaliação (11) ; 6 e 12 - subamostra de bananeiras
‘Galil 7’ introduzidas do cultivo orgânico da sétima avaliação (6) e da oitava avaliação (12) ; 7 e 13
subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas do cultivo convencional da sétima avaliação (7) e da
oitava avaliação (13), M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’, C- Controle negativo
4.5 DETECCÃO MOLECULAR DO BSV POR PCR EM BANANEIRAS ‘PRATA’, ‘NANICA’
JOVENS E MUDAS DE ‘GALIL 7’
Após a eletroforese dos amplicons, utilizando o par de ‘primers’ degenerados
BADNA1A e BADNA4, foram obtidos fragmentos de aproximadamente 600pb (597pb).
A melhor condição para a PCR foi obtida empregando-se 2µL de DNA para 1 µL de
cada ‘primer’, avaliada para os isolados de ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e ‘FHIA 17’ (Figura 9). Esta
condição foi utilizada para a avaliação das folhas de bananeira coletadas, nos cultivos
convencional e orgânico, por PCR. Além destes isolados, o isolado de bananeira ‘Galil 7’
também foi empregado como controle positivo para as demais PCRs.
39
Figura 9. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’: BADNA1A e BADNA4
com o fragmento esperado de 600 pb; 1- bananeira ‘Mysore’, 2- Terra anã e 3- bananeira ‘FHIA 17’;
M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’; A: proporção 1:1 ‘primer’/DNA, B: proporção 2:1
‘primer’/DNA, C: proporção 2:2 ‘primer’/DNA, D: proporção 1:2 ‘primer’/DNA
O BSV foi detectado em uma subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo
orgânico coletadas na primeira avaliação e em uma das subamostras de bananeiras ‘GALIL
7’ introduzidas, em cultivo convencional, coletadas na segunda avaliação. Para as demais
subamostras o resultado foi negativo para o BSV (Figura 10).
Figura 10. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com o fragmento de 600 pb; 1, 2 e 3 - Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’, ‘Galil 7’; 4 e 5subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na primeira avaliação; 6- subamostra de
bananeiras ‘Nanica’ jovens em cultivo convencional na primeira avaliação; 7-subamostra de
bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo convencional na primeira avaliação; 8 e 9: subamostra de mudas
de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo convencional (8) e orgânico (9) na segunda avaliação;
M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’
40
As duas subamostras provenientes de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico
da terceira avaliação e uma subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, em cultivo
convencional, da quinta avaliação foram positivas para o BSV. Os resultados foram
negativos para as demais subamostras (Figura 11).
Figura 11. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2, 3 e 4- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’,
‘Galil 7’ e ‘Terra anã’; 5, 6, 9 e 10- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na
segunda (5 e 6) e terceira avaliação (9 e 10); 7 e 8- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (7) e ‘Prata’
(8) jovens em cultivo convencional na segunda avaliação; 11 e 12- subamostra de bananeiras
‘Nanica’ (11) e ‘Prata’ (12) jovens em cultivo convencional na terceira avaliação; 13 e 14- subamostra
de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo convencional (13) e orgânico (14) da
terceira avaliação 15- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo
convencional na quinta avaliação; M: marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’
Em cultivo orgânico o BSV foi detectado em três subamostras de bananeiras ‘Prata’
jovens, duas na quarta avaliação e uma na quinta avaliação e em uma subamostra de
mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, na quinta avaliação (Figura 12). Em cultivo
convencional o resultado foi positivo para uma subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens, na
quinta avaliação. O resultado foi negativo para as demais subamostras (Figura 12).
41
Figura 12. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2, 3 e 4- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’,
‘Galil 7’ e ‘Terra anã’; 5 e 6-subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na quarta
avaliação; 7 e 8- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (7) e ‘Prata’ (8) jovens em cultivo convencional
na quarta avaliação; 9 e 12- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo
orgânico (9) e convencional (12) na quarta avaliação; 13 e 14- subamostra de bananeiras ‘Prata’
jovens em cultivo orgânico na quinta avaliação; 15 e 16- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (15) e
‘Prata’ (16) jovens em cultivo convencional na quinta avaliação; e 17- mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas em cultivo orgânico na quinta avaliação; 10 e 11- obstrução dos pocinhos no gel, M:
marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’
Em cultivo orgânico as subamostras de bananeiras ‘Prata’ jovens da sexta, sétima,
oitava e nona avaliação e as mudas de bananeira ‘Galil 7’ introduzidas da sexta, sétima,
oitava e nona avaliação foram positivas para o BSV (Figura 13, 14 e 15). Em cultivo
convencional os resultados foram positivos, nas subamostras de bananeiras ‘Nanica’ e
‘Prata’ jovens, da sexta, sétima, oitava e nona avaliação (Figura 13,14 e 15).
Figura 13. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2 e 3- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e
‘Galil 7’; 4 e 5- bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na sexta avaliação; 6 e 7- subamostra de
bananeiras ‘Nanica’ e ‘Prata’ jovens em cultivo convencional na sexta avaliação; 8 e 9- subamostra
de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico (8) e convencional (9) na sexta
avaliação; 10 e 11- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na sétima avaliação;
e 12- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo convencional na sétima avaliação. M:
marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’
42
Figura 14. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2 e 3- Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e
‘Galil 7’; 4 - subamostra de bananeiras ‘Nanica’ jovens em cultivo convencional na sétima avaliação; 5
e 6- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico (5) e convencional
na (6) sétima avaliação; 7 e 8- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na oitava
avaliação; 9 e 10- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (9) e ‘Prata’ (10) jovens em cultivo
convencional na oitava avaliação; 11 e 12- subamostra de mudas de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas
em cultivo orgânico (11) e convencional (12) na oitava avaliação; e M: marcador molecular de 100 pb
‘NORGEN’
Figura 15. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1 e 2- Controles positivos: isolados ‘Mysore’ e ‘Terra anã’; 3 e
4- subamostra de bananeiras ‘Prata’ jovens em cultivo orgânico na nona avaliação; 5- subamostra de
bananeiras ‘Nanica’ jovens em cultivo convencional na nona avaliação; 6 e 7- subamostra de mudas
de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo orgânico e convencional na oitava avaliação; e M:
marcador molecular de 100 pb ‘NORGEN’
43
Na décima avaliação, na qual foram coletadas somente as mudas de bananeiras
‘Galil 7’ introduzidas em ambos os cultivos, o resultado foi positivo para o BSV tanto no
cultivo orgânico quanto no cultivo convencional (Figura 16).
Figura 16. Perfil eletroforético do produto da PCR utilizando o par de ‘primers’ BADNA1A e BADNA4
com fragmentos esperados de 600 pb; 1, 2 e 3 - Controles positivos: isolados ‘Mysore’, ‘Terra anã’ e
‘Galil 7’; 4- subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzida em cultivo orgânico na décima avaliação; 5subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ introduzida em cultivo convencional na décima avaliação
No cultivo orgânico e convencional o BSV foi detectado em 33 das 47 subamostras e
o CMV em 93 das 197 amostras avaliadas no Vale do Ribeira. O CMV e o BSV puderam ser
detectados em bananeiras antes da manifestação dos sintomas.
Figueiredo et al. (2006) verificaram que das 95 amostras de bananeiras coletadas em
diferentes regiões do país, 59 foram positivas para o BSV pela PCR. Entretanto, apenas 35
apresentavam sintomas foliares de infecção pelo BSV na época da coleta. Os dados
apresentados demonstraram que a ausência de sintomas não se correlaciona, por vezes,
com os resultados obtidos na reação de PCR. Isto pode ser explicado devido à
esporadicidade dos sintomas causados pelo BSV, sendo algumas vezes mais pronunciados
durante a estação fria do ano (DAHAL, 1998).
A ocorrência do BSV foi maior nas subamostras de bananeiras ‘Prata’ jovens, do
cultivo orgânico (87,50%) do que no cultivo convencional (57,1%) e nas subamostras de
bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, no cultivo orgânico (77%) do que no cultivo convencional
(66,6%). No cultivo convencional o BSV foi detectado em 50% das subamostras de
bananeiras ‘Nanica’ jovens (Tabela 7).
44
Tabela 7. Detecção do Banana streak virus (BSV) em subamostras de folhas de bananeiras ‘Prata’,
‘Nanica’ e ‘Galil 7’ em cultivo convencional e orgânico no Vale do Ribeira
Cultivo
Orgânico
Convencional
Orgânico
Convencional
Bananeiras jovens
Bananeiras jovens
'Prata'
'Prata'
'Nanica'
'Prata'
'Galil 7'
Galil 7'
Avaliações
Sub 1
Sub 2
Sub 3
Sub 4
Sub 5
Sub 6
1
+
-
-
-
+
-
2
+
+
-
-
-
-
3
+
+
-
-
-
-
4
-
+
-
+
+
+
5
+
+
+
+
+
+
6
+
+
+
+
+
+
7
+
+
+
+
+
+
8
+
+
+
*
+
+
9
*
*
*
*
+
+
50,00%
57,10%
77,00%
66,60%
Cultivar
% Positivas
87,50%
Mudas de bananeiras introduzidas
* plantas mortas, Sb- subamostra, + subamostras positivas, - subamostras negativas
A ocorrência do CMV foi maior nas bananeiras ‘Prata’ jovens no cultivo orgânico
(58,7%) do que no cultivo convencional (42,8%) (Tabela 3 e 5), e também nas mudas ‘Galil
7’ introduzidas no cultivo orgânico (31,8%) (Tabela 4 e 6) do que no cultivo convencional
(20,9%). No cultivo convencional o CMV foi detectado em 44,7% das amostras de
bananeiras ‘Nanica’ jovens avaliadas (Tabela 5).
A incidência do CMV (58,75%) e do BSV (87,5%) foi maior nas bananeiras ‘Prata’
jovens do cultivo orgânico.
Pelos resultados obtidos pode-se constatar que, tanto o BSV quanto o CMV ocorrem
nas bananeiras jovens e mudas introduzidas em ambos os cultivos, com alta incidência,
uma vez que a partir da sexta avaliação, os resultados foram positivos para o BSV em todas
as subamostras avaliadas, e as 30 bananeiras avaliadas foram positivas para o CMV nas
diferentes avaliações.
Das amostras e subamostras avaliadas houve a detecção de ambos os vírus na
mesma planta, em cultivo orgânico após a sexta avaliação nas dez bananeiras ‘Prata’ jovens
e na sétima avaliação para as cinco bananeiras ‘Galil’ introduzidas, e
em cultivo
convencional nas cinco bananeiras ‘Prata’ jovens na sexta avaliação, nas cinco bananeiras
‘Nanica’ jovens e nas cinco ‘Galil 7’ introduzidas na sétima avaliação, evidenciando a
ocorrência de infecção mista em todas as cultivares avaliadas. Brioso et al. (2000) e Silva
Neto & Silva (2009) também obtiveram resultados evidenciando a ocorrência da dupla
infecção pelo BSV e CMV em bananeiras.
45
4.6 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETATIVO
4.6.1 Taxa relativa de crescimento de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens
No cultivo convencional e orgânico, a taxa relativa de crescimento em altura das
bananeiras ‘Prata e ‘Nanica’ jovens, foi maior na primeira avaliação e diminuiu até a quinta
avaliação (Figura 17). No cultivo convencional, a diferença nas médias da taxa relativa de
crescimento em altura foi significativa pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, na
primeira, terceira e quarta avaliação e não houve diferença significativa entre as avaliações
no cultivo orgânico. O crescimento em altura das bananeiras avaliadas não apresentou
diferença significativa entre o cultivo orgânico e convencional, pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade (Tabela 8).
Taxa relativa de crescimento em
altura
Crescimento em altura de bananeira jovens
0,12
0,1
0,08
0,06
CO
0,04
CC
0,02
0
0
1
2
3
4
5
Época de avaliação
Figura 17. Taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens no cultivo
orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP
Tabela 8. Médias da taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens,
em cultivo orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP
Períodos de avaliação
Cultivo
1
2
3
4
Média
CO
0,10 Aa*
0,09 Aa*
0,06 Aa*
0,05 Aa*
0,08 A*
CC
0,11 Aa*
0,10 Aab*
0,04 Ac*
0,05 Abc*
0,08 A*
Média
0,11 Aa*
0,10 Aa*
0,05 Ab*
0,05 Ab*
CV %
2,14
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si,
0,5
pelo teste TuKey a 5% de probabilidade. Dados transformados por (x+1)
46
No cultivo orgânico e convencional houve diminuição da taxa relativa de crescimento
em diâmetro do pseudocaule (DAP) das bananeiras ‘Prata’ jovens, a cada avaliação (Figura
18). No cultivo convencional, houve diferença significativa pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade, nas médias da taxa relativa de crescimento em diâmetro do pseudocaule, na
primeira avaliação e no cultivo orgânico na primeira e quarta avaliação (Tabela 9). O
crescimento em diâmetro não diferiu entre o cultivo orgânico e convencional para as
bananeiras avaliadas, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade (Tabela 9).
Taxa relativa de crescimento em
diâmetro
Crescimento em diâmetro do pseudocaule de bananeiras jovens
0,3
0,25
0,2
0,15
CO
0,1
CC
0,05
0
0
1
2
3
4
5
Época de avaliação
Figura 18. Taxa relativa de crescimento em diâmetro do pseudocaule (DAP) de bananeiras ‘Prata’ e
‘Nanica’ jovens em cultivo orgânico (CO) e cultivo convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP
Tabela 9. Médias da taxa relativa de crescimento em diâmetro do pseudocaule (DAP), de bananeiras
‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens em cultivo orgânico (CO) e convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP
Períodos de Avaliação
Cultivo
1
2
3
4
Média
CO
0,23 Aa*
0,17 Aab*
0,17 Aab*
0,10 Ab*
0,17 A*
CC
0,24 Aa*
0,16 Ab*
0,14 Ab*
0,10 Ab*
0,16 A*
Média
0,23 Aa*
0,16 Ab*
0,16 Ab*
0,10 Ac*
CV %
2,75
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si,
0,5
pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Dados transformados por (x+1)
No cultivo orgânico e convencional as taxas relativas da emissão foliar das
bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens, diminuíram a cada avaliação, sendo as taxas negativas
47
na terceira e quarta avaliação, do cultivo orgânico (Figura 19). Houve uma redução
considerável na emissão foliar das bananeiras durante as avaliações.
No cultivo orgânico, houve diferença significativa pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade, nas médias da taxa relativa de emissão foliar na primeira e na quarta
avaliação. No cultivo convencional, as médias da taxa relativa de emissão foliar na terceira e
quarta avaliação diferiram significativamente da primeira e segunda avaliação (Tabela 10).
As médias da taxa relativa de emissão foliar diferiram entre o cultivo orgânico e
convencional, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, sendo que a emissão foliar foi
maior nas bananeiras ‘Prata’ jovens do cultivo orgânico (Tabela 10).
Emissão foliar de bananeiras jovens
Taxa relativa de emissão foliar
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
CO
0,05
CC
0
-0,05 0
1
2
3
4
5
-0,1
-0,15
Época de avaliação
Figura 19. Taxa relativa da emissão foliar, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens no cultivo orgânico
(CO) e convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP
Tabela 10. Médias da taxa relativa de emissão foliar, de bananeiras ‘Prata’ e ‘Nanica’ jovens em
cultivo convencional (CC) e cultivo orgânico (CO), do Vale do Ribeira, SP
Períodos de avaliação
Cultivo
1
2
3
4
Média
CO
0,13 Aa*
0,05 Aab*
- 0,05 Aab*
- 0,09 Ab*
0,11 A*
CC
0,24 Aa*
0,14 Aab*
0,00 Ab*
0,03 Ab*
0,014 B*
Média
0,18 Aa*
0,10 Aab*
- 0,02 Ab*
- 0,02 Ab*
CV %
7,90
* Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si
0,5
pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Dados transformados por (x+1)
48
4.6.2 Taxa relativa de crescimento de mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas
No cultivo orgânico, a taxa relativa de crescimento em altura para as mudas de
bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas diminui na segunda avaliação, seguida de um aumento até
a quinta avaliação, enquanto que no cultivo convencional a taxa diminuiu na segunda
avaliação e se manteve estável até a quinta avaliação (Figura 20). No cultivo convencional a
diminuição nas médias da taxa de crescimento em altura foi significativa na segunda
avaliação, enquanto no cultivo orgânico a diferença não foi significativa, pelo teste Tukey, a
5% de probabilidade (Tabela 11). Não houve diferença significativa entre o cultivo orgânico e
convencional para o crescimento em altura das mudas ‘Galil 7’ introduzidas.
Taxa relativa de crescimento em
altura
Crescimento em altura de mudas 'Galil 7' introduzidas
0,6
0,5
0,4
0,3
CO
0,2
CC
0,1
0
0
1
2
3
4
Época de avaliação
5
6
Figura 20. Taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas no cultivo
orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP
Tabela 11. Médias da taxa relativa de crescimento em altura, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, em
cultivo orgânico (CO) e convencional (CC), do Vale do Ribeira, SP
Períodos de Avaliação
Cultivo
1
2
3
4
5
Média
CO
0,35 Aa*
0,07 Aa*
0,09 Aa*
0,21 Aa*
0,35 Aa*
0,21 A*
CC
0,51 Aa*
0,09 Ab*
0,09 Ab*
0,09 Ab*
0,10 Bb*
0,18 A*
Média
0,43 Aa*
0,08 Ab*
0,09 Ab*
0,15 Ab*
0,23 Aab*
CV %
6,86
*Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si,
0,5
pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Dados transformados por (x+1)
49
No cultivo orgânico, a taxa de emissão foliar das mudas de bananeiras ‘Galil 7’
introduzidas, diminuiu na segunda, quarta e quinta avaliação e aumentou na terceira
avaliação. No cultivo convencional a taxa de emissão foliar diminuiu na segunda e quinta
avaliação e aumentou na terceira e quarta avaliação (Figura 21).
No cultivo convencional a diferença nas médias da taxa de emissão foliar foi
significativa, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, para na terceira avaliação e no
cultivo orgânico não houve diferença significativa. Não houve diferença na emissão foliar
das mudas bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas, entre o cultivo orgânico e convencional pelo
teste aplicado (Tabela 12).
Emissão foliar de mudas 'Galil 7' introduzidas
Taxa relativa de emissão foliar
0,5
0,4
0,3
0,2
CO
0,1
CC
0
-0,1
0
1
2
3
4
5
6
-0,2
-0,3
Época de avaliação
Figura 21. Taxa relativa de emissão foliar, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas no cultivo orgânico
(CO) e convencional (CC) do Vale do Ribeira, SP
Tabela 12. Médias da taxa relativa de emissão foliar, de bananeiras ‘Galil 7’ introduzidas em cultivo
convencional (CC) e cultivo orgânico (CO), do Vale do Ribeira, SP
Avaliações
Cultivo
1
2
3
4
5
Média
CO
0,12 Aa*
- 0,11 Aa*
0,19 Aa*
0,11 Aa*
- 0,02 Aa*
0,05 A*
CC
- 0,20 Aa*
- 0,06 Aa*
0,40 Ab*
0,16 Aab*
- 0,21 Aa*
0,01 A*
Média
-0,03 Aa*
-0,08 Aa*
0,30 Ab*
0,13 Aab*
-0,12 Aa*
CV %
16,08
* Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si
0,5
pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Dados foram transformados por (x+1)
50
As médias da taxa relativa de crescimento das bananeiras, avaliadas pela altura,
DAP e emissão foliar, quando foram inferiores as obtidas no início da avaliação, podem
representar uma desaceleração no desenvolvimento da planta, que embora não seja
perceptível visualmente, pôde ser constatada no decorrer das avaliações.
Quando as médias da taxa de crescimento foram negativas, provavelmente no
intervalo de tempo entre as avaliações, houve uma redução no desenvolvimento da planta.
Vários fatores podem influenciar este comportamento da planta, entre eles a
disponibilidade de água e nutrientes, pois a bananeira é uma planta que requer constante
disponibilidade de água no solo (BARRETO et al., 1983; SOTO, 1992; MOREIRA, 1999;
OLIVEIRA, 2000; SILVA et al., 2002). O déficit hídrico no início da fase de crescimento
vegetativo afeta o número de folhas, reduz o número de flores, pencas e produção do
cacho, reduzindo, portanto a produção (DOORENBOS e KASSAN, 1994; TURNER, 1994).
As doenças causadas por patógenos, entre eles os vírus também podem interferir com a
redução do crescimento das plantas. Embora, durante o experimento não houve
manifestação de sintomas característicos do CMV e BSV, estes vírus foram detectados em
nas amostras avaliadas por PTA-ELISA (Tabela 2) e PCR (Tabela 7). Portanto, estes vírus
também, podem ter interferido no crescimento vegetativo, das plantas avaliadas, uma vez
que as plantas foram avaliadas em campo, portanto submetidas às condições climáticas e
práticas culturais características para o desenvolvimento da cultura.
4.7. OCORRÊNCIA DO CMV E BSV EM ONZE BANANAIS COMERCIAS EM QUATRO
MUNICÍPIOS PRODUTORES DO VALE DO RIBEIRA, SP
4.7.1 Dados e informações das propriedades avaliadas
Através de um questionário respondido pelos produtores, foi possível obter algumas
informações sobre o cultivo de banana das propriedades avaliadas, que estão na Tabela 13.
As onze propriedades distribuídas nos municípios de Sete Barras, Pariquera-açu, Cajati e
Jacupiranga, cultivam as bananeiras em manejo convencional, citaram as mesmas pragas e
doenças atacando a cultura. Utilizam agrotóxicos para o controle das pragas e doenças
citadas (Tabela 13) e fazem a pulverização aérea que varia de seis a 12 vezes ao ano para
cada propriedade.
51
Tabela 13- Informações das propriedades, da cultura e do manejo realizado pelos produtores de
quatro municípios produtores de banana no Vale do Ribeira, SP
Produtividade
N°
Pulverização/
Pragas/
Agrotóxicos
Municípios
Cultivares
Área (ha)
(ton/ha)
Funcionários
Contrato
Qtde anual
Doenças
Nome comercial
Nanica
62,5
40
70
Fixo
Áerea/ 12x
Sete Barras
Naniquinha
25
40
66
Fixo
Áerea/ 12x
Pariquera-açu
Prata
75
15
15
Fixo
Áerea/ 8x
Sítio Granada
Prata
50
18
15
Fixo
Áerea/ 10x
Broca
Furadan
Eizo Kawagoe
Sítio Turvo
Prata
175
25
80
Fixo
Áerea/ 8x
Tripes
Provado
Luiz H. Koga
Sítio Pedrinhas
Prata
250
25
70
Fixo
Áerea/ 8x
Sigatoka Negra
Score
Eliza A. Untem
Sítio Itapavuçu
Galil 7
112,5
30
30
Fixo e Terc.
Áerea/ 10x
Sigatoka Amarela
Mancozeb
Orivaldo Dan
Fazenda Santa Maria
Grand Naine
175
32
20
Fixo e Terc.
Áerea/ 10x
Mal do Panamá
Tilt
José Luiz Correa
Fazenda Salto do Berrador
Grand Naine
318
35
90
Fixo e Terc.
Áerea/ 8x
José dos Santos Cugler
Sítio Cugler e Jr.
Grand Naine
93
30
30
Fixo
Áerea/ 8x
João Marcos Moreira
Sítio Nhotinga
Grand Naine
75
30
22
Fixo
Aérea/ 6x
Produtor
Propriedade
Luis Carlos S. Costa
Fazenda Jaguaruna
Carlos R. Rossetti
Fazenda Jaguaruna
Hélio S. Rossetti
Sítio Boa Vista
Paulo Ohya
Cajati
Jacupiranga
4.7.2 Avaliação dos sintomas
Na época em que foi realizada a coleta não foi observado sintomas característicos do
CMV e do BSV nas bananeiras das onze propriedades avaliadas, nos quatro municípios.
Bananeiras com ou sem suspeita de sintomas foram coletadas.
4.7.3 Detecção sorológica do CMV por PTA-ELISA em amostras de bananeiras
de dez propriedades comerciais
O CMV foi detectado em 42 amostras de bananeiras ‘Nanica’ e ‘Naniquinha’
coletadas do município de Sete Barras; ‘Prata’ em Pariquera-açú e Cajati; ‘Galil 7’ e ‘Grand
Naine’ em Jacupiranga, totalizando em 110 amostras avaliadas (Tabela 14). O CMV foi
detectado nos municípios de Sete Barras em seis bananeiras ‘Naniquinha’ (60%) e nove
bananeiras ‘Nanica’ (90%), Pariquera-açu em oito bananeiras ‘Prata’ (80%), Cajati em
dezessete bananeiras ‘Prata’ (56,6%) e Jacupiranga em duas bananeiras ‘Grand Naine’
(5%). Para as dez bananeiras ‘Galil 7’ do munícipio de Jacupiranga o resultado foi negativo
para o CMV(Tabela 14). Pelos resultados obtidos verificou-se que 38,20% das plantas
avaliadas no Vale do Ribeira estavam infectadas pelo CMV, com o maior número de
bananeiras infectadas para as cultivares Nanica, Prata e Naniquinha, nos municípios de
Sete Barras, Pariquera-açú e Cajati. A ocorrência maior para estas três cultivares pode estar
relacionada ao maior transito de mudas, já que estas cultivares são as mais comuns e
cultivadas, e com isso aumenta a possibilidade de disseminação do CMV.
52
Tabela 14. Detecção do Cucumber mosaic virus (CMV) por PTA-ELISA em folhas de bananeiras de cultivo
convencional, provenientes de dez propriedades comerciais em quatro municípios produtores de banana no
Vale do Ribeira
Médias de leituras de absorbância a 405 nm e resultado do ELISA
Municípios
Sete Barras
Sete Barras
Pariqueraacú
Cultivar
Naniquinha
Nanica
Prata
Cajati
Prata
Cajati
Prata
Cajati
Prata
Jacupiranga
Jacupiranga
Jacupiranga
Jacupiranga
Jacupiranga
Galil 7
Grand Naine
Grand Naine
Grand Naine
Grand Naine
1A
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
4,4
3,6
4,0
M amostras/MC-
4,7
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
M amostras/MC-
6A
7A
8A
3,0
2,3
3,7
3,4
2,8
3,3
3,1
3,3
4,0
2,2
1,9
0,67
3,3
3,1
4,2
4,4
3,0
2,7
3,0
2,3
Controles
9A
10A
3,6
3,7
3,1
2,7
2,7
2,8
3,4
3,6
0,721 0,665 0,718
3,6
0,55
2,7
0,749 0,718 0,743 0,615 0,553 0,548 0,556 0,710
1,11
M amostras/MC-
5A
0,794 0,617 0,842 0,887 0,597 0,554 0,602
Σ ( M repetições)
Σ ( M repetições)
M amostras/MCΣ ( M repetições)
4A
0,715 0,664 0,611 0,652 0,811 0,452
3,7
M amostras/MC-
3A
0,871 0,611 0,459 0,744 0,690 0,560 0,389 0,456 0,680 0,720
M amostras/MC-
Σ ( M repetições)
2A
3,5
3,3
3,6
0,595 0,615
3,0
3,1
0,69
0,52
3,4
2,6
0,908 0,750 0,632 0,807 0,772 0,654 0,930 0,705 0,648
3,8
3,1
2,6
3,4
3,2
2,7
3,9
3,0
2,7
0,428 0,505 0,432 0,417 0,508 0,705 0,520 0,732 0,801 0,752
1,8
2,1
1,8
1,7
2,1
3,0
2,2
3,1
3,4
3,2
MC+
MC-
0,779 0,198
0,779 0,198
1,7
1,7
2,1
1,6
2,5
2,7
2,6
3,0
1,8
1,5
0,453 0,515 0,550 0,428 0,592 0,660 0,690 0,510 0,689 0,470
2,0
2,1
2,3
1,8
2,5
2,8
2,9
2,1
2,9
2,0
0,403 0,430 0,478 0,412 0,425 0,428 0,450 0,502 0,560 0,708
1,7
1,8
2,0
1,7
1,8
1,8
1,9
2,1
2,3
3,0
0,400 0,339 0,473 0,475 0,420 0,434 0,510 0,602 0,425 0,402
1,7
1,4
2,0
2,0
1,7
1,8
2,1
2,5
1,8
1,7
%
6
60%
9
90%
8
80%
6
60%
7
70%
4
40%
0
0%
1
10%
0
1%
1
10%
0,779 0,198
0,779 0,198
0,859 0,235
0,859 0,235
0,409 0,343 0,427 0,428 0,395 0,365 0,430 0,396 0,500 0,395
0,859 0,235
1,7
1,4
1,8
1,8
1,8
1,5
1,8
1,6
2,1
1,6
0,418 0,412 0,506 0,398 0,600 0,635 0,618 0,722 0,435 0,372
Total Positiva
Qtde
0,859 0,235
0,859 0,235
0,859 0,235
0,859 0,235
0
0%
42
38,20%
M- média; MC+ média do controle positivo; MC- média controle negativo; 1A a 5A- bananeiras avaliadas por
PTA-ELISA. M amostras/MC- valores ≥ 3 são considerados positivos
4.7.4 Detecção molecular do BSV por PCR em amostras de bananeiras de dez
propriedades comerciais
O BSV foi detectado nas 22 subamostras de bananeiras, pertencentes às cultivares
‘Nanica’ e ‘Naniquinha’, coletada nos municípios de Sete Barras; ‘Prata’ em Pariquera-Açú e
Cajati; ’Galil 7’ e ‘Grand Naine’ em Jacupiranga. Em todas as subamostras constituídas de
cinco bananeiras da mesma variedade foi observada a formação de uma banda de 600 pb
característica para o ‘primer’ usado para detectar o BSV. A mesma banda de 600 pb pode
ser verificada nos controles positivos isolados ‘Mysore’, ‘FHIA 17’ e ‘Galil 7’. Pelos
resultados obtidos pode-se verificar alta incidência do BSV em todas as cultivares avaliadas
(Figuras 22 e 23). Pelos resultados foi possível verificar a detecção de ambos os vírus na
mesma planta, principalmente nas bananeiras ‘Nanica’ de Sete Barras e ‘Prata’ de
Pariquera-açú, pois as cinco plantas utilizadas em uma subamostra, para a detecção do
BSV, foram todas positivas também para o CMV por PTA-ELISA.
53
Figura 22. Perfil eletroforético do produto da reação de PCR utilizando o par de primers BADNA1A e
BADNA4 com fragmentos esperados de 600 pb para o BSV; 1, 2 e 3- Controles positivos: isolado
‘Mysore’, isolado ‘FHIA 17’ e isolado ‘Galil7’, 4- subamostra de bananeiras ‘Naniquinha’ (Sete Barras),
5- subamostra de bananeiras ‘Nanica’ (Sete Barras), 6- subamostra de bananeiras ‘Prata’ (Pariqueraaçú), 7, 8 e 9- subamostras de bananeiras ‘Prata’ Cajati, 10- subamostra de bananeiras ‘Galil 7’
(Jacupiranga), 11, 12, 13 e 14- subamostras de bananeira ‘Grande Naine’ (Jacupiranga), M: marcador
molecular de 100pb ‘NORGEN’
Figura 23. Perfil eletroforético do produto da reação de PCR utilizando o par de primers BADNA1A e
BADNA4 com fragmentos esperados de 600 pb para o BSV; 1 e 2- Controles positivos: isolado
‘Mysore’, isolado ‘FHIA 17’, 3- subamostra de bananeiras ‘Naniquinha’ (Sete Barras), 4- subamostra
de bananeiras ‘Nanica’ (Sete Barras), 5- subamostra de bananeiras ‘Prata’ (Pariquera-açú), 6, 7 e 8subamostras de bananeiras ‘Prata’ Cajati, 9- subamostra de bananeiras ‘Galil 7’ (Jacupiranga), 10,
11, 12 e 13- subamostras de bananeira ‘Grande Naine’ (Jacupiranga), M: marcador molecular de
100pb ‘NORGEN’
54
Pela PCR foi possível detectar a presença do BSV nas amostras avaliadas, porém
não foi possível saber se o vírus estava na forma infectiva ou integrado ao genoma da
planta na forma de EPRV’s. Segundo Harper et al. (1999) a PCR tem sido utilizada em
numerosos estudos para a detecção de badnavírus, porém a presença de EPRVs no
genoma da bananeira dificulta a detecção da infecção epissomal do BSV, pois esta técnica
pode amplificar tanto o DNA viral encapsidado quanto sequências virais integradas (LE
PROVOST et al., 2006). Pelo PTA-ELISA foi possível detectar o CMV em folhas de
bananeira, mas não foi possível saber se os isolados de CMV detectados nas amostras
pertenciam ao subgrupo I ou II.
Os resultados evidenciam que ambos os vírus puderam ser detectados diretamente
de folhas de bananeiras, antes do aparecimento dos sintomas, ou seja, antes do diagnóstico
da doença nestes bananais. Com a ocorrência desses dois vírus, verifica-se a importância
de um manejo correto no cultivo de bananeiras para evitar a disseminação destas viroses na
cultura e na principal região produtora do estado de São Paulo. Os produtores devem estar
cientes da ocorrência dos vírus em seus bananais e adotar algumas práticas como a
esterilização dos materiais empregados nos tratos culturais e na colheita dos cachos, como
a esterilização dos facões de poda, para evitar a transmissão dos vírus. Outra medida a ser
adotada é a eliminação ou diminuição da presença de plantas da vegetação espontânea,
que além de competir com a bananeira, também podem ser hospedeiras do CMV e dos
seus afídeos vetores. Considerando que, atualmente, os bananicultores empregam mudas
de bananeiras micropropagadas, para o controle da entrada de vírus na cultura, uma medida
importante é o uso dessas mudas indexadas para o BSV e para o CMV. Lembrando que a
indexação é importante, pois os vírus podem não ser eliminados pela cultura de ápices
meristemáticos. No caso do BSV o vírus pode ocorrer integrado ao DNA da planta e pode
ser ativado durante o processo de micropropagação (DALLOT et al.,2001; COTÊ et al.,
2010; FAUQUET et al., 2005; HULL et al., 2000; DAHAL et al., 1998, 2000; LHEUREUX et
al., 2003). No caso das mudas importadas, a preocupação e os cuidados devem ser
maiores, pois além do CMV e BSV podem ser importadas as pragas quarentenárias A1, que
ainda não existem na cultura da banana no país.
55
5. CONCLUSÕES
No Vale do Ribeira, foi possível detectar a presença do CMV e BSV tanto nas
bananeiras no cultivo orgânico como no cultivo convencional.
A detecção do BSV e do CMV ocorreu nas bananeiras antes da manifestação dos
sintomas e ambos os vírus foram detectados em uma mesma planta, evidenciando a
ocorrência de infecção mista.
O método de extração de DNA pela utilização do tampão Tris CTAB e emprego dos
‘primers’ BADNA 1A e BADNA 4 que amplificam a porção da replicase do genoma viral
foram eficientes para a detecção do BSV nas amostras foliares das diferentes cultivares de
bananeiras. Entretanto, não foi possível definir se o BSV encontrava-se na forma infectiva
ou integrado ao genoma da planta.
Os métodos utilizados para a extração do RNA diretamente das folhas de bananeiras
não foram eficientes, inviabilizando o resultado da detecção do CMV por RT-PCR. Porém,
os ‘primers’ CMV1 e CMV 2 foram eficientes, pois houve a amplificação do controle positivo.
A detecção do CMV por PTA-ELISA foi possível utilizando o extrato diretamente de
folhas de bananeiras. Não foi possível identificar se o CMV pertencia ao tipo I ou II, sendo
que o CMV tipo II ainda não foi descrito no Brasil.
Tanto no cultivo orgânico quanto no convencional houve diminuição do crescimento
vegetativo das bananeiras, que pode ser atribuído a ocorrência do CMV e do BSV nas
plantas avaliadas.
Pelo levantamento realizado nos municípios de Sete Barras, Pariquera-acú,
Jacupiranga e Cajati, o BSV foi detectado em 100% das bananeiras Nanica’, Naniquinha’,
‘Prata’, ‘Galil 7’ e ‘Grand Naine’, enquanto o CMV foi detectado em 60% das bananeiras
‘Nanica’ e 90% das Naniquinha’, em 62,5% das bananeiras ‘Prata’ e em 5%, das bananeiras
‘Grand Naine’. O CMV não foi detectado nas bananeiras ‘Galil 7’.
A ocorrência do CMV e do BSV em bananais do Vale do Ribeira aponta para a
necessidade da adoção de boas práticas de manejo para evitar a maior transmissão e
disseminação destas viroses na principal região produtora de banana do estado de São
Paulo.
56
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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67
ANEXO 1
PREPARO DE SOLUÇÕES E REAGENTES UTILIZADOS NESTE TRABALHO
Clorofórmio/ álcool isoamilico
- Misturar 10 mL de álcool isoamílico em 290mL de clorofórmio. Armazenar a 4°C.
Solução de extração CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)
2% de CTAB
100 mM Tris Cl, pH 8,0
20 mM EDTA, pH 8,0
1,4 M NaCl
Adicionar 2% de β-mercaptoetanol antes de utilizar
Solução CTAB/ NaCL
Dissolver 2,05 g de NaCl em 40mL de água destilada deionizada. Adicionar lentamente 5 g de
CTAB sob agitação. Se necessário aquecer a 65°C. Ajustar o volume para 50 mL.
Solução CTAB de precipitação
1% de CTAB
50 mM de Tris Cl, pH 8,0
10 mM de EDTA, pH 8,0
PBS- tampão fosfato de sódio e potássio (0,5 M, pH 7,4)
8,0 g NaCl
0,2 g KH2PO4
2,9 g Na2HPO4
0,2 g KCl
PBS-Tween
0,5 mL Tween
500 mL de PBS (0,01 M, pH 7,4)
Tampão de cobertura (pH 9,6)
Adicionar 1,59 g de Na2CO3 e 2,93 g de NaHCO3 e completar o volume para 500mL
de água destilada deionizada.
68
Solução de bloqueio (pH 7,4)
Solubilizar 0,2 g de leite em pó desnatado em 10 mL de PBS-TPo
Tampão de substrato (pH 9,8)
97 mL de dietanolamina
0,1 g MgCl
0,2 g NaN2
800 mL de água destilada
Tampão TAE (solução estoque 50X, pH~8,5)
242 g de Tris
57,1 mL de ácido acético glacial
37,2 g de Na2EDTA.2H2O
Água destilada deionizada para 1L.
Gel de Agarose 1,5%
30 mL de tampão TAE (1X)
0,45 g de agarose
Aquecer por 5 minutos ou até a agarose dissolver e formar uma solução homogênea,
aplicar 1µL de brometo de etídio, deixar esfriar e aplicar o conteúdo no suporte de gel, antes
da polimerização.