MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA Ana Mendes
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MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA Ana Mendes Ferreira, António Inês, Maria José Saavedra, Arlete Mendes Faia Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro 2009 Manual de aulas práticas de Microbiologia 1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas práticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratório de Microbiologia. Nessas aulas serão utilizados vários grupos de microrganismos, bactérias e fungos, alguns dos quais poderão ser patogénicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras de modo a evitar qualquer tipo de contaminações. 1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ; 2- Não fumar nem comer no laboratório. Não levar à boca qualquer objecto nomeadamente lápis, canetas, etc. Não humedecer etiquetas com a boca; 3 - Manter a superfície da bancada livre de todo o material que não for utilizar durante a experiência; 4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao terminá-lo lavar e desinfectar as mãos; 5 - Desinfectar a superfície da bancada que irá utilizar com álcool a 70%, antes e após a execução do trabalho; 6 - Evitar que objectos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama; 7 - Todo o material usado (pipetas, lâminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri serão colocadas dentro do balde para posterior inactivação; 8 - O estudante com cabelos longos deve apanhá-los, sobretudo quando o trabalho exige a utilização do bico de Bunsen, de forma a não os queimar. 9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspirações indevidas ; 10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do género corte, queimadura, etc. 11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte. 12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilização; 13 - O microscópio deve ser manuseado com cuidado : a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a colocá-la no final; b) As lâminas já observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que está em cima da bancada para o efeito; c) Só deverá remover a lâmina da platina, depois deslocação da objectiva; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 2 Manual de aulas práticas de Microbiologia d) Nunca deixar a lente de imersão suja de óleo, limpando-a com o lenço de papel seco, depois com o lenço embebido em xilol e novamente com o lenço seco. 14 - Não misturar material conspurcado com o material esterilizado. 15 - Durante os trabalhos práticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente. 16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa. 2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA Microscópio- amplifica e ilumina objectos tal como bactérias e outros microrganismos que de outro modo seriam invisíveis; Autoclave - equipamento destinado à esterilização de materiais e meios de cultura utilizados em Microbiologia, por vapor de água sob pressão; Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas máximas até 180-200°C; para incubações, 5°C acima da temperatura ambiente, com temperaturas máximas de 70-100°C; Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50°C) para cultivo de microrganismos; Jarra de anaerobiose- câmara que permite remover o oxigénio do ar, substituindo-o por outro gás, para crescimento de microrganismos anaeróbios; Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura sólidos (Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos; Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios líquidos e sólidos; Tubos Durham- tubos de vidro de dimensões reduzidas utilizados para o aprisionamento do gás produzido pelos microrganismos, em meios líquidos; Pipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, etc. Devem ter um tampão de algodão na extremidade superior; Micropipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, quando se pretendem volumes muito reduzidos; Lâminas e lamelas- para observações ao microscópio; Câmaras de contagem- lâminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem de microrganismos totais numa suspensão; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 3 Manual de aulas práticas de Microbiologia Ansas e agulhas – instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizável à chama antes e após utilização, usado para transferir culturas de microrganismos; Para além deste material, há outro tipo de equipamento que é necessário ter num laboratório de Microbiologia nomeadamente – frigorífico, balança, aparelho de destilação e desionização de água, banho-maria, centrífuga, agitadores magnéticos, filtros de esterilização. 3- LIMPEZA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL Num laboratório de Microbiologia devem ser mantidas condições de higiene apropriadas na medida em que se trabalha com uma grande variedade de microrganismos, alguns dos quais poderão ser patogénicos. O chão deve ser lavado e desinfectado diariamente; As bancadas e todas as superfícies devem ser convenientemente desinfectadas com álcool a 70%; As placas de Petri com culturas devem ser previamente esterilizadas (121°C durante 20-25 min.) para inactivação das culturas. Após a esterilização o meio de cultura é escorrido e as caixas são lavadas com água e detergente e posteriormente mantidas algumas horas nesta solução. Depois são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água destilada. As caixas são embrulhadas em papel e esterilizadas a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur; Os tubos com culturas são submetidos ao procedimento descrito anteriormente. São esterilizados a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur. Quando contêm meios de cultura são esterilizados em autoclave a 121°C durante 15 min. As pipetas são lavadas com água corrente e posteriormente mantidas algumas horas numa solução com detergente. Depois são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água destilada. Depois de secas, coloca-se um tampão de algodão na parte superior. São colocadas em caixas apropriadas ou embrulhadas em papel antes da esterilização a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur; As lâminas e lamelas utilizadas nas observações ao microscópio são colocadas numa solução com detergente. Depois de lavadas devem ser colocadas numa mistura cromo-sulfúrica durante a noite e posteriormente lavadas. Notas importantes: Flamejar as ansas antes e depois do contacto com as culturas. Deixar arrefecer a ansa antes de tocar na colónia da cultura; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 4 Manual de aulas práticas de Microbiologia Flamejar as aberturas dos tubos de ensaio, após a abertura e antes da colocação da tampa. Manter a tampa na mão por pressão do dedo mínimo; A abertura da tampa da placa de Petri deve ser cuidadosa, devendo ser manuseada junto à chama. 4 - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA O crescimento microbiano está dependente da presença de água e de nutrientes indispensáveis à biossíntese de material celular e à obtenção de energia. As exigências nutritivas e as condições ambientais que asseguram o crescimento são dependentes do tipo de microrganismo. No cultivo de microrganismos são utilizadas soluções de substâncias que funcionam como nutrientes necessários ao seu crescimento e multiplicação celular. Estas soluções designadas por meios de cultura têm uma composição variável com as exigências nutricionais de cada espécie. Os meios de cultura podem ser líquidos (caldo), semi-sólidos ou sólidos (1,5 a 2% de agar). O agar é um agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extraído de algas marinhas, que se liquefaz a 100°C e solidifica a 40°C. Quanto à composição química, são designados por meios sintéticos – quando quimicamente definidos; e complexos - com composição química desconhecida (com extracto de levedura, extracto de carne, extracto de malte, peptona, ou triptona, por exemplo). Quanto à função, os meios de cultura podem ser: meios de enriquecimento – formulados para permitirem o crescimento de microrganismos mais exigentes; meios selectivos – formulados para o crescimento de uns em detrimento de outros; e meios diferenciais – formulados para distinguir microrganismos que possuam determinada característica bioquímica. Material necessário: Erlenmeyer; Balança; Água destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos de ensaio Preparação de agar nutritivo (Como exemplo) 1- Pesar individualmente 5 g de peptona e 3 g de extracto de carne (usar espátulas bem limpas e limpar entre pesagens). Não voltar a introduzir o excesso no frasco. 2- Adicionar os ingredientes a 500 ml de água destilada colocada num Erlenmeyer de 2000 ml. 3- Homogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura até que se verifique a dissolução completa dos ingredientes. 4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar. 5- Adicionar água destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml. 6- Acertar a pH 7.0 com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico 1N, a uma temperatura de 60 °C. Lavar rapidamente os eléctrodos do potenciómetro. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 5 Manual de aulas práticas de Microbiologia 7- Repartir o meio por 3 balões de 500 ml, previamente esterilizados. Rolhar e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Composição do agar nutritivo: • Extracto de carne ................................ 3g • Peptona .............................................. 5g • Agar ................................................... 15 g • H2O destilada ................................... 1000 ml Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos Notas importantes: A adição do agar aos meios deve ser sempre feita no final, depois de todos os ingredientes estarem dissolvidos; O meio de cultura deve ser esterilizado logo após a sua preparação; Os fracos não devem conter mais de metade do seu volume; Os frascos não devem ter as rolhas completamente apertadas durante a esterilização; 5 - TÉCNICAS UTILIZADAS NA CULTURA DE MICRORGANISMOS O estudo de microrganismos no laboratório envolve o seu crescimento e manutenção em meios de cultura. Há um conjunto de técnicas básicas de repicagens e sementeiras de modo a preservar o organismo. Para isso é necessário obter em primeiro lugar uma cultura pura do isolado (colónia obtida a partir de uma única célula). A principal fonte de contaminação externa é a atmosfera por isso a manipulação dos organismos terá que ser efectuada em condições de assepsia. Material necessário -Culturas de microrganismos -Placas de Petri com agar nutritivo -Tubos com caldo nutritivo -Tubos com agar nutritivo inclinado -Tubos com agar nutritivo -Ansas e agulhas -Pipetas -Estufa Procedimento 1- Isolamento de colónias em meio sólido Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 6 Manual de aulas práticas de Microbiologia Por espalhamento- Retirar 0,1 ml de uma cultura líquida para a superfície da placa de Petri. Espalhar uniformemente com auxílio de um semeador (vareta de vidro dobrada) ou com pérolas de vidro esterilizadas de modo a que as células fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colónias individualizadas. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. Sementeira por esgotamento (streak plate) – isolamento e obtenção de cultura pura Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma porção de colónia que pretende isolar e espalhe à superfície da placa de Petri de modo a que as células fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colónias individualizadas. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. 2- Repicagem de colónias Para agar inclinado- Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma porção de colónia que pretende guardar e ou fazer crescer e espalhe à superfície do agar inclinado. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. Para agar em tubo- Com auxílio de uma agulha previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma porção de colónia que pretende guardar e/ou fazer crescer e introduza por picada dentro do agar. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 7 Manual de aulas práticas de Microbiologia Figura 1- Sementeira à superfície da gelose inclinada Nota: Após a obtenção de uma cultura pura de um isolado, a cultura deve ser mantida em laboratório de modo a que as células permaneçam viáveis e sem contaminações. Podem ser refrigeradas a 4°C ou congeladas (-18°C) por períodos curtos ou por períodos mais longos a -70°C ou liofilizadas. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 8 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 1 Diversidade e ubiquidade dos microrganismos Os microrganismos existem no ar, na água e principalmente no solo. Do solo podem ser arrastados pelo vento através das partículas de poeira. Desenvolvem-se logo que as condições ambientais (nutrientes, humidade e temperatura) sejam favoráveis ao seu crescimento. Cada organismo aparece pelo menos num habitat natural específico no qual pode ser normalmente encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado. Objectivos: Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos Material necessário -Placas de Petri com meio de agar nutritivo -Pipetas -Estufa -Zaragatoas Procedimento 1- Pesquisa de microrganismos do ar Retirar a tampa de várias placas de Petri com agar nutritivo e manter abertas durante 5, 10 e 15 minutos. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. 2- Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas Passar um cotonete estéril sobre uma superfície da bancada antes e após a sua desinfecção com álcool a 70%. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. 3- Pesquisa de microrganismos de outros ambientes Passar um cotonete estéril entre os dedos, antes e após a lavagem das mãos. Passar o cotonete sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 37°C durante 3 dias. 4- Pesquisa de microrganismos do solo Pipetar 100ul da solução de solo e colocar numa placa de Petri com o meio de cultura. Espalhar a solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 9 Manual de aulas práticas de Microbiologia Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. Resultados: -Examinar as placas e contar o número de colónias totais e o número de colónias diferentes em cada placa; -Descrever o tipo de colónias com base na descrição apresentada na Fig.1. -Registar os resultados. Quadro – Caracterização das colónias observadas Características das colónias Dimensão Cor Forma Elevação Margem Representação (mm) Escolher 2 ou 3 colónias que considere mais interessantes. Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. Desenhe cada uma das suas observações no Quadro: Observação das células retiradas da Observação das células retiradas da Observação das células retiradas da colónia 1 colónia 2 Colónia 3 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 10 Manual de aulas práticas de Microbiologia Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 11 Manual de aulas práticas de Microbiologia FORMA Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Pevide ELEVAÇÃO Plana Convexa Elevada Em abóbada Mamilonada MARGEM Inteira Ondulada Lobada Irregularmente crenada Filamentosa Figura 2- Descrição de vários tipos de colónias Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 12 Frisada Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 2 Morfologia bacteriana e métodos de coloração As bactérias são organismos unicelulares que podem apresentar formas esféricas (cocos), cilíndricas (bacilos) e espirais (espirilos e espiroquetas). Reproduzem-se por cisão binária. Após o alongamento da célula, forma-se um septo que vai gradualmente progredindo até à formação de duas células. Estas podem separar-se ou não umas das outras. Com base no número e no plano de divisão celular, as células podem apresentar-se sob as seguintes formas: Diplococcos (cocos aos pares); Streptococcus (cocos em cadeia); Staphylococcus (cocos em cacho); tétradas (agrupamentos de quatro cocos); sarcinas (agrupamentos de oito cocos em cubo). Os bacilos também podem aparecer isolados, aos pares e em cadeia. O tamanho das células é variável. O exame das bactérias pode ser feito directamente da suspensão, através de preparações a fresco em gota pendente. As preparações coradas permitem observar características morfológicas e evidenciar diferenças entre espécies (Bactérias Gram positivo e Gram negativo). Figura 3- Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos Objectivos: Observar células vivas e mobilidade, distinguir microrganismos por coloração do meio envolvente e distinguir microrganismos Gram positivo e Gram negativo. Material necessário -Culturas de microrganismos Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 13 Manual de aulas práticas de Microbiologia -Microscópio -Ansas -Lâminas e lamelas -Azul de metileno -Tinta da China -Reagentes para a coloração de Gram Procedimento Retirar as lâminas limpas do contentor que se encontra em cima da bancada. Limpar com papel absorvente. Manipular tocando apenas nos bordos das lâminas. Identificar a lâmina numa extremidade. Observação a fresco- Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. Observação de mobilidade (preparação de gota pendente) - Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lamela. Colocar nos cantos da lamela um bocado de vaselina. Cobrir com uma lâmina de modo a que a gota fique no centro da zona escavada. Observar ao microscópio. Coloração simples- Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lâmina, adicionar uma gota de azul-de-metileno e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. Preparação dos esfregaços -Marcar na parte inferior da lâmina uma pequena área onde se irá fazer a preparação; -Colocar uma gota de água na secção delimitada; -Esterilizar a ansa, colocando-a verticalmente à chama de um bico de Bunsen até ficar ao rubro. Deixar arrefecer; -Retirar com a ansa uma porção da colónia e misturar com a água colocada na lâmina; - Deixar secar ao ar; -Fixar passando a face inferior da lâmina 3 vezes através da chama. Deixar arrefecer; -Corar pelo método escolhido; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 14 Manual de aulas práticas de Microbiologia Coloração simples com fixação- Após fixar, deixar arrefecer e adicionar uma das soluções apresentadas de seguida, deixando actuar durante o tempo referido para cada uma delas. -Cristal de violeta (1 minuto) -Azul de metileno de Loeffler (5 minutos) -Fucsina (30 segundos). -Lavar cuidadosamente e deixar secar ao ar Coloração negativa- Após fixar, espalhar muito bem uma gota de nigrosina (10%) sobre a preparação. Deixar secar o corante e observar com a lente de imersão. Esta coloração poderá ser usada na observação de cápsulas. Neste caso a preparação é previamente corada com fucsina, lavada e seca antes de se adicionar a nigrosina. Coloração diferencial de Gram Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas na tina de lavagem, Colocar algumas gotas de cristal de violeta. Deixar actuar durante 1 minuto; Retirar o excesso do corante e passar por água; Colocar algumas gotas de Lugol (mordente que aumenta a reacção entre o cristal de violeta e as células). Deixar actuar durante 1 minuto; Passar por água e secar com papel de filtro; Descorar com álcool a 95% durante 10 a 20 segundos;Passar por água e secar; Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com água e secar com papel absorvente; Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão. Coloração de esporos Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas sobre o contentor com água em ebulição; Cobrir o esfregaço com um quadrado de papel de filtro; Colocar algumas gotas de verde malaquite (solução aquosa a 5%). Deixar actuar durante 5 minutos; Passar por água; Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com água e secar com papel absorvente; Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 15 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 3 Morfologia e estrutura dos fungos Os fungos são organismos não-fotossintéticos que podem apresentar uma forma filamentosa (fungos filamentosos) ou unicelular (leveduras). Alguns fungos podem ser dimórficos, apresentando uma estrutura micelial ou unicelular dependendo das condições do meio. Objectivos: Observação das estruturas de vários fungos – hifas, micélio, células e estruturas de reprodução. 1- Fungos filamentosos Os fungos são constituídos por uma massa de filamentos muito finos (micélio). Cada filamento (hifa) assemelha-se a um longo tubo cilíndrico em que as células se distinguem umas das outras devido à existência de septos (hifa septada) ou sem separação das células (hifas cenocíticas). Os fungos são constituídos por hifas vegetativas designadas por talo. Estas hifas penetram no substrato, tendo algumas funções semelhantes às raízes das plantas (rizoides). Reproduzem-se por esporos que podem ser formados sexuada ou assexuadamente. As hifas fertéis exibem normalmente as estruturas de reprodução que permitem classificar e identificar os fungos. Figura 4- Morfologia e estrutura de alguns fungos filamentosos Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 16 Manual de aulas práticas de Microbiologia Material necessário -Culturas de fungos -Microscópio -Ansas -Lâminas e lamelas -Lupa Procedimento Comparar macroscopicamente as colónias de diversas culturas de fungos que lhe são fornecidos; Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina, adicionar uma porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. Preparar lâminas com e sem adição de lactofenol. Resultados Descrever as características das colónias observadas, Descrever as estruturas reprodutivas dos vários fungos (fazer um desenho), hifas, etc. 2- Leveduras As leveduras são fungos unicelulares que se reproduzem assexuadamente por gemulação ou cisão. Por vezes, as gémulas não se separam da célula mãe formando longas cadeias de células que se designa por pseudomicélio. Outras, quando cultivadas em determinadas condições formam verdadeiro micélio (dimorfismo). A morfologia das leveduras é bastante variada. Apresentam células esféricas, ovais elípticas, cilíndricas, em forma de limão, triangular e até em forma de garrafa. Material necessário -Culturas de leveduras; -Microscópio; -ansas; -Lâminas e lamelas; Procedimento Examinar macroscopicamente as colónias de diversas leveduras; Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina, adicionar uma porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 17 Manual de aulas práticas de Microbiologia MORFOLOGIA DAS LEVEDURAS OVOIDE Dekkera bruxellensis ESFÉRICA CILÍNDRICA Pichia membranaefaciens Saccharomyces cerevisiae GARRAFA APICULADA Pitysporum ovale TRIANGULAR Trigonopsis variable Kloeckera apiculata Figura 5- Morfologia das leveduras Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 18 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático nº4 Titulação de uma suspensão de bacteriófagos líticos por contagem de placas fágicas Os vírus são entidades biológicas acelulares constituídos apenas por um ácido nucleico (DNA ou RNA) designado por nucleóide, envolvido por uma cápsula proteica, designada por cápside. O conjunto da cápside e nucleóide designa-se por nucleocápside. Alguns, podem ainda ser revestidos por um invólucro (envelope) constituído por proteínas e fosfolípidos, adquiridos da membrana da célula hospedeira, aquando do processo de libertação das partículas virais. Todos os vírus podem apresentar dois estados: extracelular ou intracelular. O estado extracelular, designado por partícula viral ou virião, corresponde à forma inerte do vírus, sob a qual é transmitido entre células hospedeiras. No estado intracelular ocorre a replicação do ácido nucleico viral e a produção de novas partículas virais. Deste modo, os vírus são considerados parasitas intracelulares obrigatórios uma vez que o processo de multiplicação viral é estritamente dependente da maquinaria da célula hospedeira. Existe uma enorme especificidade entre os vírus e as suas células hospedeiras compatíveis. Assim existem vírus que se replicam apenas no interior de células animais, outros em células vegetais, outros em fungos, outros em algas e outros em protozoários. Os bacteriófagos1, ou simplesmente fagos, são vírus que se replicam apenas no interior de bactérias. A replicação dos fagos está ainda restrita a certas espécies/estirpes bacterianas. O ciclo de multiplicação dos fagos envolve as seguintes fases: (1) adsorção a receptores específicos da superfície; (2) injecção do genoma do fago para o interior da bactéria; (3) replicação do genoma viral; (4) maturação em que após a formação de todos os componentes virais e consequente montagem dá origem à formação de novos fagos; (5) libertação dos novos fagos com ruptura da célula infectada. Este processo de multiplicação é designado por ciclo lítico e os bacteriófagos são designados por fagos líticos. Por vezes o genoma do fago não se replica mas integra-se no cromossoma bacteriano, sendo transmitido à descendência bacteriana como parte integrante do seu genoma. Este processo é designado por ciclo lisogénico e os bacteriófagos são designados por fagos temperados. As bactérias que transportam no seu cromossoma um genoma viral (profago) são designadas por lisogénicas. Em determinadas circunstâncias um profago pode ser activado, replicar-se e induzir o ciclo lítico dando origem à libertação de novos fagos. Os vírus líticos provocam a lise da célula bacteriana hospedeira aquando da sua libertação. Por isso podem ser detectados por diluição e espalhamento em superfícies de agar inoculadas com células hospedeiras para a formação de placas fágicas. Estas placas são zonas transparentes sobre uma camada de células hospedeiras, e representam o ponto sobre o qual uma partícula viral infecciosa foi depositada. Como resultado de ciclos líticos subsequentes, as células hospedeiras nessas zonas são destruídas. O tamanho das placas é dependente dos tempos de replicação quer dos vírus quer das bactérias hospedeiras. A contagem de placas fágicas é por isso análoga à contagem de colónias bacterianas em caixa de Petri, e deste 1 Os bacteriófagos (fago: do grego phagein: comer) “comedores de bactérias” foram descobertos por Frederick Twort e Felix d’Herelle na 2ª década do sec. XX Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 19 Manual de aulas práticas de Microbiologia modo, a contagem de placas fágicas pode ser usada para determinar o título, i.e. a concentração de partículas fágicas, na suspensão inicial. Objectivos: Contagem de placas fágicas Material necessário Por grupo: 8 eppendorfs com 0.9 ml de meio LB 8 tubos com 5 ml de meio LBss (mantidos em banho a 50 ºC) 8 tubos vazios esterilizados 1 erlenmeyer com 100 ml de meio LBs (mantido em banho a 50 ºC) 8 caixas de Petri esterilizadas 1 micropipeta 1 caixa com pontas amarelas esterilizadas 1 tubo com a cultura de células hospedeiras (Escherichia coli 5911) 1 eppendorf com a suspensão do fago T72 Procedimento No ínicio da aula, distribuir o meio de cultura LBs (sólido) pelas caixas de Petri formando uma camada fina no fundo. Deixar solidificar. Fundir o meio LBss (semi-sólido) e manter os tubos em banho a 50 ºC. (Consulte o fluxograma em anexo como um auxiliar durante o procedimento experimental) 1. Preparar diluições seriadas (10-1 até 10-8) da suspensão fágica, adicionando (0.1 ml) da suspensão inicial ao meio líquido estéril LB (0.9 ml/eppendorf). 2. Identificar os tubos vazios esterilizados com as diluições realizadas. Retirar 0.1 ml de cada diluição e colocar nos respectivos tubos. 3. Adicionar 0.1 ml da cultura bacteriana hospedeira (DO600nm≈1.0) a cada um dos tubos anteriores. 4. Identificar as caixas de petri previamente preparadas com as diluições efectuadas (10-1 até 108 ). 5. Adicionar a cada um dos tubos (ponto 3.) 5 ml do meio LBss contido nos tubos mantidos em banho a 50 ºC. Misturar os conteúdos dos tubos por agitação suave (evitar a formação de bolhas) e em seguida derramar e espalhar uniformemente sobre a superfície da camada de LBs das caixas 2 O fago T7 é um dos vários colifagos que infecta estirpes de Escherichia coli. Possui uma molécula linear de DNA em cadeia dupla. Apresenta cabeça, cauda curta, não contráctil e pertence à família Podoviridae (Para mais informações consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/54010001.htm) Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 20 Manual de aulas práticas de Microbiologia de petri correspondentes. (Nota: deve preparar 1 tubo de cada vez para evitar que o meio solidifique). 6. Inocular 0.1 ml da cultura de células hospedeiras isoladamente como controlo. 7. Deixar que o agar solidifique e incubar as caixas a 37 ºC durante 24 horas. Resultados Observar as caixas e determinar o nº de placas fágicas (“plaque-forming units”-pfu), partículas fágicas infecciosas, por ml da suspensão original. Apenas as caixas contendo 30-300 placas fágicas devem ser consideradas. pfu/0.1 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição Como apenas foram plaqueados 0.1 ml deve multiplicar-se por 10 para obter pfu/ml pfu/1.0 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição x 10 placa fágica “camada” de E. coli Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 21 Manual de aulas práticas de Microbiologia Procedimento experimental Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 22 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 5 Avaliação do crescimento microbiano O perfil de crescimento de uma população microbiana pode ser avaliado através da determinação periódica do número de indivíduos, da massa celular ou através da actividade celular. O processo mais usual é o de contagem directa ao microscópio, utilizando câmaras de contagem que permitem determinar o número total de células. Para distinguir células viáveis (com capacidade para se multiplicar) de não viáveis é necessário cultivar as células num meio de cultura adequado ao crescimento da espécie em causa. Para o efeito, um volume conhecido de uma suspensão microbiana é espalhado uniformemente à superfície do meio de cultura (técnica de espalhamento) ou misturado com o meio ainda liquefeito (método de incorporação). Após alguns dias à temperatura adequada, as colónias são contadas (30 a 300) e os resultados são expressos em unidades formadoras de colónias (ufc). O número de células viáveis pode ser também estimado através de diluições sucessivas da suspensão em análise (3 a 5 tubos para cada diluição). Nas diluições mais elevadas não haverá crescimento em todos os tubos. O cálculo do número mais provável de microrganismos será efectuado com base no número de tubos positivos, recorrendo às Tabelas de MacGrady. A massa celular pode ser determinada directamente através do peso seco ou indirectamente por turbidimetria. Figura 6- Curva que representa o crescimento microbiano em sistema fechado, em batch (sistema descontínuo) Objectivos: Comparação de métodos de avaliação do crescimento microbiano Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 23 Manual de aulas práticas de Microbiologia 1- Avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem em câmara Material necessário -Culturas de microrganismos -Microscópio -Câmara de contagem Procedimento Colocar na câmara uma gota da suspensão de microrganismos; Cobrir com a lamela; Contar o número de células por quadrado (Na zona central estão gravadas duas grelhas que são constituídas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados, cada um com uma área de 1/400 mm2); Para que o valor seja mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e determinar a média; Resultados O número de microrganismos/ml = Nx 1 x1000 ; profundidadexáreadoquadrado N= valor médio de microrganismos por quadrado Numa câmara em que a profundidade seja de 0,1 mm e a área do quadrado de 1/400 = 0.0025 mm2, o número de microrganismos/ml será igual ao valor médio por quadrado x 4 x 106. Figura 7- Procedimento para avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem de células em câmara Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 24 Manual de aulas práticas de Microbiologia 2- Determinação do número de células viáveis - Contagem em placas Material necessário -Culturas de microrganismos -Tubos de ensaio com 9 ml de água estéril (solução salina) -Placas de Petri com meio apropriado à cultura -Agitador de tubos -Pipetas esterilizadas de 1 ml Figura 8 - Determinação do número de células viáveis – contagem em placa Procedimento Pipetar 1 ml da suspensão da cultura para um tubo com 9 ml de água estéril (diluição de 1:10); Homogeneizar muito bem num agitador; Transferir 1ml do tubo da diluição 1 para um segundo tubo 2 com 9 ml de água estéril (diluição de 1:100);Homogeneizar muito bem num agitador Fazer isto sucessivamente até obter a diluição desejada que permita contar as ufc; Espalhar uniformemente em placas de Petri 0,1 ml de cada uma das diluições (Identificar cada uma das placas com a diluição respectiva, data e nome do operador); Incubar as placas a 30°C durante 3 dias; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 25 Manual de aulas práticas de Microbiologia Resultados Escolher o número de placas que contenham 30 a 300 colónias e efectuar a contagem. Determinar o valor médio de colónias por placa e multiplicar pelo factor de diluição. O resultado será expresso em ufc/ml. 3- Avaliação do crescimento por turbidimetria Material necessário -Culturas de microrganismos -Tubos de ensaio com água estéril (solução salina) -Agitador de tubos -Pipetas esterilizadas de 1 ml -Espectrofotómetro Procedimento Ligar o espectrofotómetro e acertar o comprimento de onda a 640 nm; Transferir para a cuvete caldo não inoculado e acertar a absorvância a zero; Transferir as suspensões bacterianas para cuvetes do espectrofotómetro (pode ser necessário diluir as amostras); Proceder à leitura da absorvância (DO). Figura 8 – Avaliação do número de células por turbidimetria Resultados Relacionar os valores obtidos por contagem directa ao microscópio, por contagem em placa e por turbidimetria, para a mesma suspensão de células. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 26 Manual de aulas práticas de Microbiologia Tabelas de MacGrady para determinação do NMP de microrganismos - 3 tubos por diluição Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg. 000 0,0 120 1,1 221 3,0 311 7,5 001 0,3 121 1,5 222 3,5 312 11,5 010 0,3 130 1,6 223 4,0 313 16,0 011 0,6 200 0,9 230 3,0 320 9,5 020 0,6 201 1,4 231 3,5 321 15,0 100 0,4 202 2,0 232 4,0 322 20,0 101 0,7 210 1,5 300 2,5 323 30,0 102 1,1 211 2,0 301 4,0 330 25,0 110 0,7 212 3,0 302 6,5 331 45,0 111 1,1 220 2,0 310 4,5 332 110,0 333 140,0 - 5 tubos por diluição Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg. 000 0,0 203 1,2 400 1,3 513 8,5 001 0,2 210 0,7 401 1,7 520 5,0 002 0,4 211 0,9 402 2,0 521 7,0 010 0,2 212 1,2 403 2,5 522 9,5 011 0,4 220 0,9 410 1,7 523 12,0 012 0,6 221 1,2 411 2,0 524 15,0 020 0,4 222 1,4 412 2,5 525 17,5 021 0,6 230 1,2 420 2,0 530 8,0 030 0,6 231 1,4 421 2,5 531 11,0 100 0,2 240 1,4 422 3,0 532 14,0 101 0,4 300 0,8 430 2,5 533 17,5 102 0,6 301 1,1 431 3,0 534 20,0 103 0,8 302 1,4 432 4,0 535 25,0 110 0,4 310 1,1 440 3,5 540 13,0 111 0,6 311 1,4 441 4,0 541 17,0 112 0,8 312 1,7 450 4,0 542 25,0 120 0,6 313 2,0 451 5,0 543 30,0 121 0,8 320 1,4 500 2,5 544 35,0 122 1,0 321 1,7 501 3,0 545 45,0 130 0,8 322 2,0 502 4,0 550 25,0 131 1,0 330 1,7 503 6,0 551 35,0 140 1,1 331 2,0 504 7,5 552 60,0 200 0,5 340 2,0 510 3,5 553 90,0 201 0,7 341 2,5 511 4,5 554 160,0 202 0,9 350 2,5 512 6,0 555 180,0 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 27 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 6 Avaliação do efeito de alguns factores físicos no crescimento microbiano O crescimento de um microrganismo é afectado pela disponibilidade de nutrientes e por um conjunto de factores físicos como a temperatura, o pH, a pressão osmótica e o potencial de oxidação/redução do meio. A temperatura é um dos factores que mais afecta o crescimento e a sobrevivência dos microrganismos. Cada espécie, em condições experimentais bem definidas, é caracterizada por três temperaturas cardeais – temperatura mínima, máxima e óptima de crescimento. Estes valores permitem agrupar os microrganismos em psicrófilos, mesófilos e termófilos e hipertermófilos. O comportamento dos microrganismos relativamente ao oxigénio disponível é heterogéneo, existindo microrganismos aeróbios e anaeróbios estritos, aeróbios facultativos, aerotolerantes e micro-aerofílicos. Figura 9 – Classificação dos microrganismos com base na temperatura óptima Objectivos: Avaliar o efeito dos factores físicos (temperatura e pH) no crescimento microbiano. Material necessário -Culturas de microrganismos -Placas com meio de cultura -Tubos com meio de cultura com diferentes valores de pH – 3, 5, 7, 9 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 28 Manual de aulas práticas de Microbiologia Procedimento 1- Efeito do pH Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura a diferentes valores de pH, Incubar as placas a 30°C durante 3 dias; Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo. 2- Efeito da temperatura Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura; Incubar a 5, 25 e 55°C durante 3 a 7 dias; Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo. Resultados Verificar os efeitos do pH e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos. Figura 10 – Classificação dos microrganismos com base nos valores de pH óptimo de crescimento Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 29 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 7 Controlo do crescimento e morte dos microrganismos por métodos físicos A morte de microrganismos, isto é, a perda irreversível da viabilidade, é um aspecto fundamental no controlo de microrganismos no laboratório e na Indústria, Farmacêutica e Alimentar. A esterilização pode ser atingida por processos físicos e químicos. Entre os processos físicos pode utilizar-se o calor, a filtração e as radiações. Objectivos: Avaliar o efeito letal de alguns agentes físicos - temperatura e radiações UV. Material necessário -Culturas de microrganismos -Placas com meio de cultura - Tubos com meio de cultura líquido Procedimento 1- Efeito da temperatura Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura; Introduzir os tubos num banho-maria a 70 °C durante 5, 10 e 15 minutos; Após o tempo referido, semear 0,1 ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas diferentes para uma placa; Incubar as placas a 30°C durante 3 dias; Observar o crescimento do microrganismo nas três condições. 2- Efeito das radiações UV Semear 3 placas com o mesmo microrganismo; Retirar as tampas e colocar as placas sobre uma lâmpada UV, protegida com cartolina; Retirar uma placa ao fim de 10, 20 e 30 minutos; Incubar as placas 30°C durante 3 dias; Comparar o crescimento em cada placa. Resultados Verificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos microrganismos. Verificar o efeito das radiações no crescimento de cada um dos microrganismos. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 30 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 8 Actividade enzimática dos microrganismos As enzimas são proteínas promotoras de reacções químicas específicas na célula. Estes catalisadores permitem o transporte e utilização de nutrientes indispensáveis à síntese de material celular e à obtenção de energia. A utilização de um determinado substracto pode ser característica de uma dada espécie, permitindo a sua identificação. Algumas bactérias fermentam hidratos de carbono simples, produzindo ácidos, álcoois e gás como produtos finais. Outros utilizam moléculas mais complexas como a celulose e o amido. A capacidade de utilização de substratos específicos, pela análise dos metabolitos finais produzidos ou pela pesquisa de determinada enzima, associada à observação morfológica das células microbianas e às suas características culturais em meios de cultura sólidos e/ou líquidos, são alguns indicadores utilizados em Microbiologia na identificação de microrganismos. Objectivos: Avaliação de actividades enzimáticas em alguns microrganismos. Apresentação de alguns testes bioquímicos usados na detecção e ou identificação de alguns microrganismos 1- Hidrólise de polímeros Amilases Proteases 2- Reacções de fermentação Fermentação de açúcares Produção de sulfetos Reacções ImVic 3- Reacções respiratórias Catalase Citocromo oxidase 4- Outras reacções Urease 1- Pesquisa de amilase Alguns microrganismos hidrolizam moléculas orgânicas de elevado peso molecular, como por exemplo o amido, utilizando os seus componentes (glucose e maltose) nos diversos processos metabólicos. Ao juntar-se uma solução de iodo a um meio de cultura com amido forma-se um complexo com cor azul se não tiver sido hidrolizado. Caso contrário, não há reacção com o iodo. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 31 Manual de aulas práticas de Microbiologia Material necessário -Culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis -Solução de iodo -Placas de Petri com meio de agar de amido Procedimento Inverter uma placa de Petri e dividi-la em duas secções com um marcador. Semear uma das secções com E. Coli e a outra com Bacillus subtilis; Identificar as secções; Incubar as placas a 37ºC durante 24 a 48 horas; Resultados: Após o aparecimento das colónias, colocar algumas gotas de solução de iodo e verificar o aparecimento ou não da cor azul. 2- Fermentação de açúcares simples Os principais critérios fisiológicos de identificação de microrganismos assentam na fermentação e na assimilação de fontes de carbono. A fermentação de açúcares simples é avaliada em tubos com meio de cultura líquido, aos quais se adiciona o açúcar a testar. Para verificar a produção de gás é introduzido (antes da esterilização), um tubo Durham invertido. A produção de ácidos é confirmada pela alteração da cor do indicador. Material necessário -Culturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris; -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e glucose (Com tubos Durham); -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e lactose (Com tubos Durham); -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e sacarose (Com tubos Durham); Procedimento Inocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios; Identificar cada um dos tubos com a espécie inoculada e com açúcar adicionado; Incubar as placas a 37ºC durante 24 horas; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 32 Manual de aulas práticas de Microbiologia Resultados: Tomar nota das reacções obtidas no quadro com base nos seguintes símbolos: A- produção de ácido; B- alcalinização do meio G- produção de gás N- sem modificação de cor do indicador Espécie Modo de utilização dos açúcares Glucose Lactose Sacarose 3- Reacções respiratórias Pesquisa de Catalase Este teste bioquímico é utilizado para comprovar a presença de catalase, enzima que destrói o peróxido de hidrogénio, originando H2O e O2. A maioria dos seres vivos possui catalase. Material necessário -Lâminas; -Culturas de Bacillus sp; -Culturas de Lactobacillus sp.; -Água oxigenada (3%); Procedimento: Colocar numa lâmina uma porção de cultura; Adicionar uma gota de água oxigenada a 3%; Resultados: Verificar se há ou não desprendimento gasoso; Tomar nota dos resultados obtidos em cada uma das espécies. Pesquisa do Citocromo oxidase A citocromo oxidase é uma enzima que transfere electrões para o O2 no final da cadeia de transporte de electrões. A detecção desta enzima é particularmente útil para fazer a distinção entre algumas espécies Gram negativo. Pseudomonas aeruginosa de Escherichia coli, por exemplo. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 33 Manual de aulas práticas de Microbiologia A presença de citocromo oxidase é detectada pela oxidação de um receptor artificial de electrões (p-fenilenodiamina). Material necessário -Cultura microbiana a testar -Papel de filtro -Tetrametil-parafenildiamina.HCl (1% W/V em água). Procedimento Misturar a cultura em estudo com uma solução de tetrametil-parafenildiamina.HCl numa folha de papel de filtro. Resultados: Verificar a alteração da cor. Este indicador é incolor na forma reduzida e adquire uma cor púrpura na forma oxidada (resultado positivo) 4- Pesquisa de outras enzimas Pesquisa de Urease Alguns microrganismos utilizam a ureia como fonte de azoto. A sua hidrólise origina duas moléculas de amónia e a libertação de uma molécula de CO2. A enzima é detectada pela modificação da cor do indicador provocada pelo aumento de pH (vermelho de fenol, a pH 6,4 tem cor amarela e a pH 8,2 tem cor violácea). Material necessário -Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli; -Tubos com Agar de ureia; Procedimento Inocular um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli ; Incubar a 37 ˚C durante 24 horas. Resultados: Verificar a alteração da cor do meio e preencher o quadro: Espécie Cor inicial do meio Cor final do meio Urease Considera-se reacção positiva o aparecimento de uma cor rosa forte. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 34 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 9 Avaliação da contaminação fecal de águas A pesquisa periódica de microrganismos fecais numa rede de abastecimento de águas é essencial para se verificar a pureza da água. Escherichia coli é um bom indicador da contaminação fecal – é fácil de identificar, é hospedeiro habitual do intestino e não aparece normalmente na água. Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos nãoesporulados, Gram negativo, aneróbios facultativos que fermentam a lactose com produção de gás. Objectivos: Pesquisa de coliformes em águas e determinação do NMP de coliformes Pesquisa de Escherichia coli Material necessário: -Tubos com caldo de lactose -Placas com Agar Endo -Tubos com caldo MR-VP -Tubos com água peptonada -Tubos com Agar de Citrato-Simmons -Filtros de 0,45 1- Pesquisa de Coliformes: 1.1 Teste presuntivo: pesquisa de fermentadores de lactose Procedimento Pipetar 1 ml da amostra de água para cada um dos tubos com caldo de lactose, com tubo Durham invertido. Incubar a 35 ºC durante 24 a 48 horas. Resultados: Observação dos tubos ao fim de 24 a 48 horas. A presença de gás em pelo menos 1/4 do tubo Durham é indicativa da presença de coliformes. Neste caso fazer a determinação do NMP de coliformes por 100 ml de água com base nas tabelas de MacGrady. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 35 Manual de aulas práticas de Microbiologia 1.2 Pesquisa de Escherichia coli (membrana filtrante) Procedimento Filtrar 100 ml da amostra de água para placas de Agar Endo; Incubar a 44 ºC durante 24 a 48 horas. Resultados: O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de Escherichia coli. Deverão ser efectuados os testes IMViC. 2- Teste de confirmação de fermentadores de lactose Procedimento Semear 0,1 ml dos tubos positivos para placas com Agar Endo; Incubar a 35 ºC durante 24 horas; Resultados: O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de coliformes não ficando estabelecido contudo que seja Escherichia coli. Poderá ser Enterobacter aerogenes. 3- Testes IMViC A distinção entre as duas espécies, Escherichia coli e Enterobacter aerogenes pode ser feita efectuando um conjunto de testes designados por IMViC: o I de Indol, o M de Methyl-red, o V de Voges-Proskauer e o C de Citrato. Espécies Indol Methyl-red Voges-proskauer Citrato Escherichia coli + + - - E. aerogenes - - + + 3.1- Pesquisa da formação de indol a partir do triptofano Num meio de cultura contendo triptofano, algumas bactérias com triptofanase produzem indol. O indol é detectado pelo reagente de Kovacks. Este teste permite distinguir Escherichia coli, que tem reacção positiva, de Enterobacter que tem reacção negativa. Procedimento Pipetar 0, 1 ml da amostra de água para um tubo com água peptonada; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 36 Manual de aulas práticas de Microbiologia Incubar a 30 ºC durante 48 horas; Resultados: A reacção é positiva quando aparece um anel vermelho à superfície resultante da reacção do p-dimetil-aminobenzaldeído (reagente de Kovacs) com o indol; a reacção é negativa quando após a adição do reagente o anel se mantém amarelo/alaranjado. 3.2- Formação de ácidos por fermentação da glucose Num meio de cultura contendo glucose, as Enterobacteriaceae produzem ácidos a partir do piruvato, ácido acético, fórmico, láctico e etanol (fermentação ácido-mista), o que vai provocar uma acidificação do meio. A fermentação da glucose com produção de ácidos provoca a redução de pH e a alteração da cor do indicador de vermelho de metilo (MR - Methyl red). Procedimento Pipetar 0,1 ml de amostra de água para um tubo com caldo MR-VP; Incubar a 37ºC durante 5 dias. Resultados: Confirmar o crescimento no meio de cultura. Adicionar ao meio inoculado, algumas gotas de vermelho de metilo. Se houver produção de ácidos, há um abaixamento de pH para valores inferiores a 4,4. Quando se adiciona o indicador de pH (vermelho de metilo), a pH 4,4 fica vermelho e a pH 6,2 amarelo. 3.3- Fermentação da glucose e produção de acetoína a partir do piruvato (Teste Voges Proskauer) No mesmo meio de cultura contendo glucose, algumas espécies de Enterobacteriaceae produzem a partir do piruvato, para além dos ácidos referidos anteriormente, outros metabolitos como a acetoína. Se existir acetoína no meio, a adição de α-naftol e hidróxido de potássio (10%), tornam o meio avermelhado - teste Voges Proskauer (VP) positivo. Procedimento Pipetar 0,1 ml da amostra de água para um tubo com caldo MR-VP Incubar a 37 ºC durante 5 dias. Resultados: Confirmar o crescimento no meio. Adicionar ao meio, α-naftol a 6% e hidróxido de potássio (40%). Misturar bem. Se existir acetoína no meio, a adição de α-naftol e hidróxido de potássio, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 37 Manual de aulas práticas de Microbiologia tornam o meio avermelhado (reacção positiva). Se o meio de cultura mantiver a cor original a reacção é negativa. 3.4- Utilização do citrato como fonte de carbono e energia O meio de Citrato-Simmons contém citrato e azul de bromotimol como indicador de pH. Nas Enterobacteriaeceae o desprendimento de CO2, reagindo com os catiôes Na+ existentes no meio, vai provocar um aumento do pH visível pela modificação da cor do indicador. Procedimento Repicar a amostra para placa com Agar de Citrato-Simmons; Incubar a 37 ºC durante 5 dias; Resultados: A utilização de citrato provoca uma alcalinização do meio que é detectada pela modificação da cor do indicador (azul de bromotimol). Verificar se houve ou não modificação da cor do meio (verde para azul). Escherichia coli - reacção negativa; Enterobacter, Salmonella - reacção positiva Notas: A identificação de Enterobacteriaceae pode ser efectuada através de galerias API 20E que é uma versão miniaturizada dos testes convencionais. Este sistema utiliza uma estrutura plástica com 20 compartimentos separados que consistem em micro tubos contendo meios desidratados. A inoculação é efectuada por introdução da suspensão do organismo nos microtubos com uma pipeta de Pasteur. Para se obter anaerobiose colocam-se algumas gotas de óleo mineral em cada um dos tubos. Após 18 a 24 horas registam-se os resultados positivos, obtém-se um número com 7 a 9 dígitos a partir do qual, através de um programa informático, se determina o nome do microrganismo em causa. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 38 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 10 Avaliação da eficácia a antibacterianos: antibióticos Os antibióticos são compostos químicos que podem ser administrados em doses sub-terapêuticas ou de forma terapêutica em Medicina Humana e Animal. Uma vez que a célula bacteriana é uma célula procariota, os antibióticos usados na terapêutica devem explorar as diferenças bioquímicas entre as células bacterianas e as células hospedeiras. Os antimicrobianos são um grupo bastante heterogéneo, existindo antibióticos que actuam na parede celular e outros durante a síntese proteica, provocando a lise das células e, portanto, matando as bactérias (efeito bactericida) ou inibindo a sua multiplicação (efeito bacteriostático). Objectivos: Determinar o fenótipo a diferentes grupos de antibióticos Analisar o perfil de susceptibilidade segundo as normas do CLSI Material necessário: - Zaragatoas - Pinças estéreis - Ansas - Régua - Discos de antibióticos (Oxoid) - Meio de Cultura (Muller-Hinton agar) - Soro fisiológico - Para testar a eficácia aos antibióticos serão utilizadas três espécies bacterianas (E. coli, Pseudomonas spp. - Gram-negativo e Enterococcus faecalis - Gram-positivo). Procedimento Técnica de Kirby-Bauer Preparar uma suspensão bacteriana de cada uma das espécies em estudo, a partir de 3 – 4 colónias em soro fisiológico estéril (A suspensão deve ter uma turvação equivalente a 0,5 da escala de MacFarland) Mergulhar uma zaragatoa na suspensão bacteriana retirando o excesso; Semear placas de agar Mueller-Hinton; Aplicar os discos dos antibióticos a testar (utilizar o “dispenser” como se representa na Figura) sobre a superfície do meio de cultura, após a secagem do inóculo; Incubar a 37 °C, durante 24 horas. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 39 Manual de aulas práticas de Microbiologia Resultados: Com uma régua ou craveira medir os diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. Classificar de acordo com as normas do CLSI, 2006 (ex: NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards). Assim, a medida do halo de inibição será comparada com os valores da tabela, onde a bactéria é classificada, nas categorias de sensível (S), intermédia (I) ou resistente (R). Figura 11 – Representação da aplicação de discos de antibióticos num meio de cultivo inoculado com uma estirpe em análise (à esquerda). Resultados obtidos após crescimento bacteriano (à direita). Avaliação da susceptibilidade a antibióticos Amostra A (Gram -)_________________________________________________________ Antibiótico Diâmetro do halo Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Classificação Página 40 Manual de aulas práticas de Microbiologia Amostra B (Gram -)_________________________________________________________ Antibiótico Diâmetro do halo Classificação Amostra (Gram +)____________________________________________________________ Antibiótico Diâmetro do halo Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Classificação Página 41 Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 11 Simbiose de microrganismos com plantas A disponibilidade de azoto no solo é o maior factor limitante na Agricultura, apesar da atmosfera ser constituída por 80% de azoto. A molécula de azoto é quimicamente muito estável e apenas alguns procariotas têm capacidade de a reduzir a uma forma biologicamente assimilável. A associação Rhizobium x leguminosa é o mais eficiente sistema de fixação de azoto atmosférico. As espécies do género Rhizobium são bactérias do solo capazes de provocarem o aparecimento de órgãos especializados nas raízes das plantas, os nódulos, nos quais ocorre a redução do azoto (Figura 12). As espécies do género Rhizobium apresentam a forma de bacilos curtos, isolados ou aos pares, não esporulados, Gram negativo, móveis por flagelos polares ou peritriquiais, apresentando grânulos de poli-β-hidroxibutirato nas culturas mais envelhecidas. No interior do nódulo as células apresentam formas diversificadas designando-se por bacteróides. Mecanismo de infecção e formação do Legohemoglobina no nódulo nódulo Figura 12 – Mecanismo de formação do nódulo nas leguminosas Objectivos: Observação da nodulação em diferentes leguminosas. Observação dos bacteróides. Isolamento de Rhizobium a partir dos nódulos. Material necessário -Microscópio -Lâminas e lamelas -Caixas de Petri esterilizadas -Ansa, Pinça e tesoura -Álcool a 70% Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 42 Manual de aulas práticas de Microbiologia -Água esterilizada distribuída em tubos com 20ml -Solução de lixívia a 1% -Placas com Agar de Manitol-levedura 1- Observação da nodulação em diferentes leguminosas Identificar as plantas; Cortar a parte aérea da planta; Lavar o sistema radicular em água corrente; Colocar sobre uma folha de papel; Observar e tomar nota: Plantas Forma dos Disposição ao longo do Nódulos sistema radicular Constituição interna Observações 2- Observação dos bacteróides Cortar com uma tesoura várias secções da raiz de 1cm que contenham nódulos saudáveis (rosa); Mergulhar as secções dentro de uma caixa de Petri com lixívia a 1%, durante 15 min.; Retirar as secções da solução e mergulhar em 20 ml de etanol a 70% durante 1 min.; Retirar as secções do etanol e mergulhar em 20 ml de água estéril durante 1 min.; Repetir as lavagens com água estéril pelo menos 3 vezes; Transferir um dos nódulos para uma caixa de Petri estéril e esmagar com uma vareta de vidro; Observar o suco extraído ao microscópio; Semear por riscado à superfície de uma placa de Petri com meio de Manitol levedura; Incubar as placa de Petri a 25˚C durante 3 a 5 dias. Resultados: Tomar nota e desenhar as formas das células observadas ao microscópio directamente do nódulo; Registar as características das colónias formadas no meio de manitol levedura simples e com adição dos indicadores - vermelho do Congo e azul de Bromotimol; Retirar uma porção de uma colónia para uma lâmina e misturar com uma gota de água estéril; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 43 Manual de aulas práticas de Microbiologia Fazer o esfregaço e proceder à coloração de Gram; Observar as preparações ao microscópio; Registar a morfologia celular e a reacção à coloração; BIBLIOGRAFIA Benson, H. 1994. Microbiological applications. 6th ed. WCB Publishers, Dubuque, IA 52001. Martinko, J. Madigan, M. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Prentice-Hall Inc., New Jersey. Canas-Ferreira, W. e J.C.F. de Sousa, 1998. microbiologia. Vol 1. Lidel Editora, Lisboa. Schelegel, H. 1993. General Microbiology. 7th ed. Cambridge University Press, Cambridge Stanier, R., E. Adelberg,J. Ingraham e M. Wheelis 1979. Introduction to the microbial world. Prentice-Hall Inc., New Jersey. Wheelis, M. e W.Segel 1979. Introduction to the microbial world – Laboratory manual. PrenticeHall Inc., New Jersey. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 44 Manual de aulas práticas de Microbiologia ANEXO 1 - Meios de cultura Meio de agar nutritivo: • Extracto de carne ..................................... 3g • Peptona ................................................... 5g • Agar ........................................................ 15 g • Água destilada ....................................... 1000 ml Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos Caldo nutritivo: • Extracto de carne ..................................... 3g • Peptona ................................................... 5g • Água destilada ....................................... 1000 ml Acertar a pH final 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos Agar de dextrose Sabouraud • Peptona ................................................... 10 g • Dextrose .................................................. 40 g • Agar ........................................................ 15 g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 5,6. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Y Malte Agar • Extracto de malte ..................................... 3g • Extracto de levedura ................................. 3g • Peptona ................................................... 5g • Glucose ................................................... 10 g • Agar ......................................................... 20 g • Água destilada ....................................... 1000 ml Acertar a pH 5,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Y Malte Caldo • Extracto de malte ..................................... 3g • Extracto de levedura ................................. 3g • Peptona ................................................... 5g • Glucose ................................................... 10 g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 5,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Agar de amido • Extracto de carne ..................................... 3g • Amido solúvel ........................................... 10 g Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 45 Manual de aulas práticas de Microbiologia • Agar ........................................................ • Água destilada ..................................... 15 g 1000 ml Acertar a pH 7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Caldo com vermelho de fenol – meio base • Peptona ................................................... 10 g • Extracto de carne ..................................... 1g • Cloreto de sódio ....................................... 5g • Vermelho de fenol ..................................... 0,018 g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 7,2. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Nota: para avaliar a fermentação de açúcares adicionar, separadamente, 5 g/l de glucose, lactose ou sacarose. Agar de ureia • Peptona ................................................... 1g • Dextrose ................................................... 1g • Cloreto de sódio ....................................... 5g • Fosfato de potássio .................................... 2g • Ureia ....................................................... 20g • Vermelho de fenol ..................................... 0,012 g • Água destilada ..................................... 100 ml Acertar a pH 6,8. Esterilizar a mistura por filtração (A). Esterilizar a mistura de 15 g de agar com 900 ml de água a 121˚C durante 15 minutos (B). Deixar arrefecer B e adicionar os 100 ml de ª Distribuir em tubos e inclinar. Caldo de lactose • Extracto de carne ...................................... 3g • Peptona .................................................... 5g • D-lactose ................................................. 5g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 6,9. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Água peptonada • Peptona .................................................... 10 g • Cloreto de sódio ....................................... 5g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 7,2. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Nota: Para pesquisar a fermentação de açúcares adicionar 1,8 ml de vermelho de fenol. Agar Endo • Peptona ................................................... Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro 10 g Página 46 Manual de aulas práticas de Microbiologia • D-lactose .................................................. 10 g • Sulfito de sódio ........................................ 2,5 g • Fosfato de potássio .................................... 3,5 g • Agar ........................................................ 15 g • Fucsina básica ........................................... 0,5 g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 7,5. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Agar de Citrato- Simmons • Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g • Cloreto de sódio ........................................ 5g • Fosfato de amónio .................................... 1g • Fosfato de potássio .................................... 1g • Citrato de sódio ......................................... 2g • Agar ........................................................ 15 g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Caldo MR-VP • Peptona .................................................... 7g • Fosfato de potássio .................................... 5g • Dextrose ................................................... 5g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Agar de Manitol-levedura • Fosfato de potássio .................................... 0,5 g • Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g • Cloreto de sódio ........................................ 0,1 g • Manitol ..................................................... 10 g • Extracto de levedura ................................. 0,4 g • Agar ........................................................ 15 g • Água destilada ..................................... 1000 ml Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Nota: Poderão ser adicionados, separadamente, os seguintes corantes: Vermelho do Congo (1%) ou Azul de Bromotimol (0,5%). Meio de LB (Luria-Bertani Medium) • Triptona • Extracto de levedura • NaCl • Água destilada 10 g 5g 10 g 1000 ml Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 47 Manual de aulas práticas de Microbiologia Agitar até à completa dissolução. Ajustar o pH a 7,0 com 5N NaOH (~0.2ml). Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Meio de LBss (Luria-Bertani semi-sólido) • Triptona 10 g • Extracto de levedura 5g • NaCl 10 g • Agar 7g • Água destilada 1000 ml LBss = LB + 0.7% Agar Meio de LBs (Luria-Bertani sólido) • Triptona • Extracto de levedura • NaCl • Agar • Água destilada LBs = LB + 1.5% Agar 10 g 5g 10 g 15 g 1000 ml Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 48 Manual de aulas práticas de Microbiologia ANEXO 2 – Corantes e soluções Solução de azul de metileno • azul de metileno ....................................... 0,3 • Álcool etílico a 95 % ............................... 30 ml • Hidróxido de potássio 1% ........................ 1 ml Solução de Cristal de violeta • Cristal de violeta ....................................... • Água destilada ....................................... 0,5 g perfazer a 100 ml Soluto de Lugol • Cristais de iodo ......................................... 1,0 g • Iodeto de potássio .................................... 2,0 g • Água destilada ....................................... 300 ml Solução de Safranina • Safranina .................................................. • Álcool etílico a 95% ........................... 2,5 g 10 ml Dissolver a safranina em etanol. Perfazer a 100ml em água destilada. Solução de Fucsina • Fucsina básica ........................................... 1g • Etanol ..................................................... 10 ml • Fenol 5% (solução aquosa) ..................... 100 ml Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Solução de Nigrosina • Nigrosina ................................................. 10 g • Água destilada .................................. perfazer a 100 ml Filtrar. Solução de verde malaquite • Verde malaquite ....................................... 5g • Água destilada .................................. perfazer a 100 ml Filtrar. Solução de iodo • Cloreto de sódio ....................................... 2,25 g • Cloreto de cálcio ....................................... 0,12 g • Cloreto de potássio .................................... 0,105 g • Bicarbonato de sódio ................................ 0,05 g Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 49 Manual de aulas práticas de Microbiologia • Água destilada ....................................... perfazer a 1 L Solução de tetrametil-parafenildiamina.HCl • Tetrametil-parafenildiamina.HCl ............. • Água destilada ....................................... 0,1 g até 10 ml Solução de vermelho de metilo • Vermelho de metilo ................................... 0,1 g • etanol ....................................................... 300 ml • Água destilada ....................................... 200ml Reagente de Kovacs • Álcool amílico .......................................... 150 ml • p- dimetil-aminobenzaldeído ....................... 10 g • Ácido clorídrico ....................................... 50 ml Dissolver o aldeído no álcool, a 60 C, deixar arrefecer e adicionar o ácido gota a gota. Guardar no frigorífico. Solução de α-Naftol • α-Naftol .................................................... 5 ml • Álcool etílico a 95% ........................... perfazer a 100 ml Solução salina de Ringer • Cloreto de sódio ....................................... 2,25 g • Cloreto de cálcio ....................................... 0,12 g • Cloreto de potássio .................................... 0,105 g • Bicarbonato de sódio ................................ 0,05 g • Água destilada ....................................... perfazer a 1 L Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. Solução de lactofenol-azul de algodão lactofenol • Ácido láctico ............................................. 100 ml • fenol ....................................................... 100 g • glicerol ..................................................... 100 ml • Água destilada ....................................... 100 ml Dissolver o fenol em água, sem aquecer. Adicionar depois o ácido láctico e o glicerol. azul de algodão • sol. Saturada de azul de algodão ................ 10 ml • glicerol ..................................................... 10 ml • Água destilada ....................................... 80 ml Misturar em partes iguais o lactofenol e o azul de algodão. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 50 Manual de aulas práticas de Microbiologia Corantes (Coloração de Gram variante de Chan) A - Solução de cristal de violeta • Cristal de violeta ........................................... 10 g • Oxalato de amónio ......................................... 4g • Etanol ........................................................... 100 ml • Água destilada ............................................... 400 ml B - Solução de iodo • Iodo ............................................................ 1 g • Iodeto de potássio ........................................ 2 g • Etanol .......................................................... 25 ml • Água destilada .............................................. 100 ml C - Álcool iodado • Solução de iodo ............................................ 5 ml • Etanol .......................................................... 95 ml D - Safranina 2,5% de safranina em álcool .......................... 10 ml Água destilada .............................................. 100 ml Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 51 Manual de aulas práticas de Microbiologia Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 52
