Avaliação da morfologia espermática de cães submetidos

Trabalho de Pequisa
Avaliação da morfologia espermática de cães
submetidos à administração de cisplatina
Spermatic morphology analysis in dogs submitted to cisplatin administration
João Humberto Teotônio de Castro – Mestre em Cirurgia Veterinária pelo Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
E-mail: [email protected]
Carlos Roberto Daleck – Professor Adjunto Doutor do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Andrigo Barboza De Nardi – Professor Assistente Doutor do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Michele Garcia Medeiros – Mestre em Cirurgia Veterinária pelo Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Carlos Alfredo Calpa - Mestre em Cirurgia Veterinária pelo Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Sabrina Gouveia Calazans – Doutora em Cirurgia Veterinária pelo Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Simone Crestoni Fernandes – Mestre em Cirurgia Veterinária pelo Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Paulo Henrique Franceschini – Professor Adjunto Doutor do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UNESP –Jaboticabal, SP, Brasil.
Castro JHT, Daleck CR, De Nardi AB, Medeiros MG, Calpa CA, Calazans SG, Fernandes SC, Franceschini PH. Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação; 2011; 9(31); 624-628.
Resumo
A cisplatina, quimioterápico antineoplásico selecionado para o estudo em questão, é um fármaco utilizado em Medicina Veterinária como adjuvante ao tratamento de osteossarcomas, linfomas e alguns
carcinomas. O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos deste quimioterápico sobre a morfologia
espermática de cães através do método de lâmina corada, mensurando os defeitos maiores, menores e
totais. Em Medicina Veterinária são escassos os estudos sobre a atuação dos fármacos antineoplásicos
no sistema reprodutivo, sendo mais raras ainda as pesquisas específicas com a cisplatina. A dose utilizada foi de 70 mg/m² (dose terapêutica), intravenosa, em intervalos de 21 dias, totalizando 4 sessões.
Os cães foram divididos em dois grupos de 4 animais cada, sendo que um dos grupos recebeu a quimioterapia e o protocolo de diurese para proteção renal, já o grupo controle não recebeu a cisplatina,
estando sujeito apenas aos fatores ambientais. Os resultados obtidos demonstraram que a cisplatina
influenciou na qualidade espermática de cães, pois elevou as patologias maiores e totais acima do
aceitável para cães aptos a reprodução.
Palavras-chave: Sêmen, espermograma, cisplatina, cão.
Abstract
The chemotherapy agent cisplatin used in the present study is a common drug used as an adjuvant in
veterinary medicine for the management of osteossarcomas and some carcinomas. The present study
aimed to evaluate the effects of cisplatin upon spermatic morphology of dogs through the karra`s
modified method (Karras stained smears). Researches concerning about how antineoplastic agents act
in the reproductive tract are sparse in veterinary medicine; yet more rare are specific studies about cisplatin in this field. 70 mg/m2, with 21 days interval totalizing 4 infusions were given intravenously.
Two groups were formed with four dogs in each, and one group received the chemotherapy and the
diuresis protocol, while the controls did not receive cisplatin and were exposed only to environmental
factors. Results showed that cisplatin play a role in the spermatic quality of dogs, as major and total
defects were above the level of acceptance for dogs used in breeding programs.
Keywords: Semen, sperm analysis, cisplatin, dog.
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Avaliação da morfologia espermática de cães submetidos à administração de cisplatina
Introdução
Em Medicina Veterinária, até alguns anos atrás, o tratamento do câncer restringia-se basicamente na utilização da
cirurgia. Com a evolução da oncologia clínica, o tratamento
cirúrgico deixou de ser a única opção para os pacientes portadores de neoplasias. A cisplatina, quimioterápico antineoplásico selecionado para o estudo em questão, é um fármaco
utilizado em Medicina Veterinária como adjuvante ao tratamento de osteossarcomas e alguns carcinomas(1). Em seres
humanos, a utilização deste fármaco provoca diminuição da
espermatogênese, azoospermia e muitas vezes infertilidade
permanente (2). Além de comprometer a função gonadal e
a fertilidade, a cisplatina é fetotóxica e teratogênica (3,4). No
entanto, as alterações reprodutivas provocadas por este quimioterápico não são bem esclarecidas. Já na Medicina Veterinária são escassos os estudos sobre a atuação dos fármacos
antineoplásicos no sistema reprodutivo, mais raro ainda são
as pesquisas específicas com a cisplatina (5,6,7).
Em seres humanos não são somente as alterações orgânicas como oligo e azoospermia que influenciam na fertilidade,
mas também a diminuição da libido ocasionada por múltiplos
fatores; como a fadiga, ansiedade relacionada com a doença e
o tratamento, além das alterações da auto-imagem (8).
O presente trabalho objetivou avaliar a morfologia espermática de cães utilizando o método de lâmina corada de
cães submetidos à quimioterapia antiblástica com o uso de
cisplatina e realizando análise sequencial dos ejaculados.
Com isso, mensurando a possível elevação das porcentagens
patológicas seminais (defeito maior, menor e total), discriminando qualitativamente e quantitativamente cada patologia
aumentada.
Revisão de Literatura
A cisplatina é um sal metálico que possui uma molécula
de platina, e apesar de não ser um agente alquilante verdadeiro, o seu mecanismo de ação é similar a outros fármacos
deste grupo, ou seja, provoca inibição competitiva da síntese
de DNA (9). Tem a capacidade de se intercalar no interior e
entre as fitas do DNA causando a ionização de átomos de
cloro, inibindo a replicação, transcrição, tradução e reparação
do DNA, consequentemente inativando-o. O mecanismo de
ação deste quimioterápico nas células somáticas do testículo
(Leydig e Sertoli) tem sido estudado, porém ainda permanece sem explicação. A destruição da barreira hemato-testicular
e o decréscimo da secreção de inibina-B e transferrina pelas
células de Sertoli após os efeitos citotóxicos da cisplatina, tem
sido relatada. Porém, estes estudos, têm sido realizados após
recente exposição à cisplatina e não evidenciam uma insuficiência funcional em longo prazo (1,5). Os efeitos colaterais
associados à administração de cisplatina são representados
principalmente pela nefrotoxicidade (10,11), possuindo também citotoxicidade hematológica, gastrintestinal, pulmonar
(nos felídeos) e além destas, são relatadas outras alterações
como anafilaxia, neuropatia periférica, ototoxicidade, neurite ótica e diminuição de magnésio, sódio, fósforo e cálcio
(8,12,13).
Este fármaco pode ser usado com grande aplicabilidade
na terapia antiblástica, comumente utilizado no tratamento
de osteossarcomas, mostrando também atividade contra alguns carcinomas. E ainda, pode ser empregado mais especificamente no tratamento de carcinomas de células escamosas
da cavidade oral e da derme, carcinomas de células de transição da bexiga urinária e próstata, adenocarcinoma nasal,
carcinoma pulmonar e nos mesoteliomas (1,8).
A quimioterapia antiblástica adjuvante, com a cisplatina,
é utilizada para combater as micrometástases em potencial
associadas aos osteossarcomas de cães proporcionando aumento da sobrevida (13,14,15).
Em medicina, a cisplatina é usada largamente na terapêutica do câncer testicular, mesmo sendo constatados seus efeitos colaterais como azoospermia (16,2), além de ser fetotóxica, teratogênica e gonadotóxica (3,4).
Em homens, a quimioterapia com cisplatina, em altas doses (400-500 mg/m²) induziu azoospermia com danos permanentes no epitélio seminífero. Para a oncologia humana
é muito importante que os pacientes submetidos a altas doses com este quimioterápico sejam informados que poderão
apresentar infertilidade permanentemente (16,17,18).
Anormalidades testiculares, ocasionadas pela quimioterapia com cisplatina e carboplatina foi observado em 170
homens com câncer testicular. Sessenta e quatro por cento
dos pacientes que eram normospérmicos antes do tratamento retornaram a esta condição 30 meses após o término das
quimioterapias, e que os pacientes tratados com carboplatina
retornaram mais rapidamente a normospermia (2).
Estudos em ratos (C57/BI/6J) realizados por Seaman,
Sawnhey e Zhang (5,6,7) indicaram que a cisplatina induziu
elevadas taxas de apoptose nas células germinativas, causando degeneração do epitélio seminífero. Pode-se observar que
a dose de 1 mg/kg causou apenas depleção temporária das
células germinativas. Com aumento de cinco vezes à dose
inicial, observou-se atrofia generalizada do epitélio, bem
como vacuolização citoplasmática e perda da diferenciação
das células germinativas, ocasionando uma diminuição da
espermatogênese. Adler eTarras (19) relataram que a cisplatina ocasionou efeitos clastogênicos na meiose das células espermáticas de ratos F1 (101/E1 x C3H/E1). Segundo Cherry
et al. (20) o tratamento com o mesmo fármaco nesta espécie,
ocasionou diminuição no tamanho e parênquima dos testículos.
Em Medicina Veterinária,Rosenthal (21) descreveu que a
administração de sulfato de vincristina, em cães com tumor
venéreo transmissível, suprimiu temporariamente a espermatogênese.Já nos experimentos realizados por Daleck et al.
(22) foi observado que a aplicação do mesmo fármaco indu-
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ziu degeneração testicular de grau leve a moderada.
Material e Métodos
Foram utilizados oito cães machos, fornecidos pelo Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de Jaboticabal, considerados inicialmente hígidos, com idade variando entre um e
três anos, peso médio de 15 kg, sem raça definida. Os animais
foram vacinados, vermifugados, banhados e alojados em canis individuais sob condições adequadas de higiene. Estes
receberam um único tipo de ração industrializada e água ad
libitum, além disto foram adaptados ao local de estadia e experimento por um período de dois meses antes do início do
mesmo.
Os animais foram submetidos a exame físico, hemograma, provas bioquímicas (alanina aminotransferase, creatinina e proteína total) e urinálise. Após a realização de análise
criteriosa de todos os resultados obtidos nas avaliações citadas anteriormente, os animais foram submetidos à avaliação
seminal antes de iniciar o experimento, através de análises
macroscópicas (volume, aspecto e odor) e microscópicas (motilidade espermática, vigor, concentração e morfologia espermática).Os animais foram submetidos a pesagens da massa
corpórea, sempre antes das quimioterapias. Os cães foram
distribuídos aleatoriamente em dois grupos experimentais de
quatro animais cada. O primeiro grupo denominado de G1
recebeu o protocolo de diurese salina e a infusão de cisplatina
na dose de 70 mg/m², metoclopramida (2 mg/Kg pela via intravenosa, 20 minutos antes da quimioterapia) e furosemida
(2 mg/Kg, pela via intravenosa, 5 minutos após a administração de metoclopramida). O segundo grupo denominado
de G2 (grupo controle) recebeu o mesmo tratamento que o
grupo G1, porém sem a cisplatina. Os animais foram treinados para colheita de sêmen em ambiente tranquilo, pelo
método da estimulação digital (mão enluvada), frente a uma
fêmea em estro. Para a colheita utilizou-se um funil adaptado
ao tubo de Falcon graduado em 15 mL previamente aquecido
em banho Maria a 37 ºC. A primeira fração foi descartada,
sendo que a segunda e terceira frações espermáticas foram
colhidas conjuntamente. As colheitas foram realizadas a cada
21 dias, em 7 momentos diferentes, perfazendo um total de
56 colheitas de sêmen durante todo o experimento.As alterações morfológicas foram classificadas em defeitos maiores e
menores, segundo o Manual para Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal do Colégio Brasileiro de Reprodução
Animal (23). As patologias foram classificadas de acordo com
a seguinte distribuição:
• Defeitos maiores: acrossomo; patologia de cabeça
(subdesenvolvida, isolada patológica, estreita na base,
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piriforme, pequena anormal, contorno anormal, “pouch formation” e “knobbed”); gota citoplasmática proximal; formas teratológicas; defeitos de peça intermediária; patologia de cauda (fortemente dobrada, dobrada
com gota e enrolada na cabeça) e formas duplas.
• Defeitos menores: patologia da cabeça (delgada, gigante, curta, larga, pequena normal e isolada normal);
patologia da cauda e implantação (retro e abaxial,
oblíquo, dobrada ou enrolada) e gota citoplasmática
distal.
Os resultados obtidos para as diferentes características
foram analisados segundo o esquema de análise de variância com medidas repetidas no tempo. A comparação entre as
médias foi realizada pelo Teste Scott-Knott (1974), ao nível de
5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas, utilizando-se o programa computacional GENES CRUZ
(24). Os dados foram transformados em
Resultados e Discussão
Os exames como a avaliação física, hemograma, urinálise
e provas bioquímicas (alanina aminotransferase, creatinina e
proteína total) permaneceram dentro dos parâmetros de normalidade durante a execução do experimento. Com relação à
pesagem da massa corpórea, ocorreu diminuição deste valor
no grupo tratado com cisplatina G1 (media de 1,1 Kg) ao longo de todo o estudo proposto.
Os resultados da morfologia espermática, método da lâmina corada, coloração de KARRAS modificado por PAPA et
al. (25), apresentaram como defeito maior, menor e total, as
seguintes alterações:
Os valores médios percentuais obtidos para patologia de
defeito maior entre os dois grupos (G1 e G2) nos diferentes
momentos de colheita e análise do sêmen, realizadas antes,
durante e após o tratamento com cisplatina no grupo G1, estão expressos na figura 01, sendo observado diferença significativa (P≤0,05) entre os grupos nos momentos 6 e 7.
Em cães, considerados aptos para a reprodução, às patologias maiores não devem ser superiores a 10 %, segundo
orientações do Manual para Exame Andrológico e Avaliação
de Sêmen Animal, do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (23). Observou-se aumento destas patologias no grupo
G1 a partir do momento 4 (Figura 1). Durante este período
(até 21 dias após o início da quimioterapia) essas patologias
encontravam-se dentro dos padrões aceitáveis (menor que
10%) para cães considerados férteis. A partir desse momento
as patologias maiores começaram a se elevar, atingindo patamares superiores a 30% na 7ª semana após início de tratamento. Esses dados sugerem que a cisplatina produz efeitos
adversos sobre a espermatogênese, em cães, e que as mesmas
são detectadas no espermograma após a 3ª semana do início
Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2011;9(31); 624-628.
Avaliação da morfologia espermática de cães submetidos à administração de cisplatina
G1, a partir do momento 5 chegando na sua porcentagem máxima no momento 6 e mantendo-se no momento 7 no método
de lâmina corada, demonstra que a porcentagem de defeitos
totais, que antes do início da quimioterapia era por volta de
5% nos dois grupos, elevou-se em mais de 30%, no grupo G1,
quando completou um ciclo espermático no momento 6 (63
dias após o início da quimioterapia). Isto demonstra que a
cisplatina influencia de forma significativa na qualidade espermática, podendo apresentar efeitos citotóxicos, tanto em
epitélio germinativo (espermatogênese) como no epitélio epididimário do cão (espermiogênese).
Figura 1 - Evolução dos valores médios percentuais de espermatozóide
com defeito maior nos diferentes momentos de colheita e análise de sêmen.
Observar o aumento desta patologia no método de lâmina corada no grupo
G1 a partir do momento 5.
do tratamento.
Os defeitos menores são aqueles defeitos morfológicos
que possuem baixos efeitos sobre a fertilidade (26). O aumento de defeito menor no método de lâmina corada (Figura 2),
no grupo G2 (grupo que não recebeu a quimioterapia) no momento 4 foi devido a um dos cães deste grupo que apresentou
35% de gota citoplasmática distal, sendo que após o momento
2, este cão sempre apresentou uma porcentagem maior deste
defeito quando comparado aos demais, evidenciando uma
Figura 3 - Evolução dos valores médios percentuais de espermatozóide
com defeito total nos diferentes momentos de colheita e análise de sêmen.
Observar o aumento desta patologia no método de lâmina corada no grupo
G1 a partir do momento 4.
Conclusão
Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que os parâmetros de contagem das alterações morfológicas dos espermatozóides de cães hígidos submetidos à
administração de cisplatina, em sete diferentes tempos, demonstraram que o fármaco aumentou o número de patologias no grupo tratado (G1) e que as patologias espermáticas
detectadas sugerem a ocorrência de alterações morfofuncionais nos túbulos seminíferos e no conduto epididimário de
cães tratados com cisplatina.
Figura 2 - Evolução dos valores médios percentuais de espermatozóide
com defeito menor nos diferentes momentos de colheita e análise de
sêmen. Observar o aumento desta patologia no método de lâmina corada
no grupo G2 a partir do momento 3 e subseqüente decréscimo a partir do
momento 4.
variabilidade individual.
Segundo o Manual para Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal, do Colégio Brasileiro de Reprodução
Animal (23), a proporção de defeitos maiores e menores no
sêmen de cão deve ser no máximo de 20%. O aumento de defeitos totais no método de lâmina corada (Figura 3), no grupo
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Recebido para publicação em: 19/07/2011.
Enviado para análise em: 01/09/2011.
Aceito para publicação em: 01/10/2011.
Medvep - Revista Científica de Medicina Veterinária - Pequenos Animais e Animais de Estimação 2011;9(31); 624-628.