Esquiva Inibitória-Naturalística - pibic

Parâmetros Comportamentais Do Danio Rerio Nos Testes De Preferência Claro-Escuro
E Esquiva Inibitória Naturalística Em Aquário Claro-Escuro Trilateral
Aline Macedo Tavares
Amauri Gouveia Jr.
Universidade Federal do Pará
RESUMO
A Preferência Claro-escuro e a Esquiva Inibitória Naturalística são experimentos
baseados na aversão ao ambiente claro e utilizados como modelos de ansiedade, entretanto, os
aparatos impossibilitam a mensuração de comportamentos no ambiente escuro e
comportamentos observados através da lateral deste, e a automatização da análise de dados.
Objetivo: Verificar se a modificação do aquário claro-escuro tradicional para o aquário claroescuro trilateral altera o comportamento de preferência claro-escuro e esquiva inibitória
naturalística em Danio rerio. Método: Foram utilizados 47 peixes adultos da espécie Danio
rerio separados em Grupo Controle e Grupo Experimental, para os testes de Preferência
Claro-Escuro e Esquiva Inibitória Naturalística. Resultados: Não foi encontrada diferença
significativa dos comportamentos entre grupos Controles e Experimentais de ambos os
aparatos. No teste de preferência de claro-escuro foi possível observar os comportamentos de:
avaliação de risco, nado errático, tigmotaxia e congelamento, no ambiente escuro e a emissão
foi semelhante a emissão no ambiente claro, também foi possível notar que os sujeitos
despendiam mais tempo na parte inferior do aquário. No teste de Esquiva Inibitória
Naturalística, foi verificada diferença entre as latências da Tentativa 1 e tentativa 5 em ambos
os aparatos, neste experimento os sujeitos também permaneceram mais tempo no lado inferior
do aquário. Discussão: Os aquários modificados se mostraram aptos a serem utilizados nos
respectivos testes com resultados estatisticamente semelhantes, possibilitando a parametria de
dados que antes não eram observados.
O Zebrafish é um modelo emergente em psicopatologia, farmacologia e neurociências,
etc apresentando homologia fisiológica e morfológica com humanos (Kalluef et al, 2014),
além de fácil reprodução e armazenamento. Modelos animais são representações em
laboratório com animais infra-humanos de fenômenos percebidos em humanos. O Zebrafish
apresenta alterações no nível de cortisol em conjunto a alterações comportamentais de
ansiedade, sendo assim um modelo válido e confiável de estresse e ansiedade (Egan et al,
2010)
Modelos de ansiedade podem utilizar respostas incondicionadas, utilizando-se de
estímulos naturais, ou respostas condicionadas. Alguns modelos animais que tradicionalmente
utilizam ratos estão sendo adaptados para peixes. A preferência pela escuridão é um
comportamento encontrado em diversas espécies, incluindo o Danio rerio, por ser um
comportamento natural que sugere um padrão de defesa no qual a preferência pelo ambiente
escuro corresponde a um indício de ansiedade baseado no conflito decorrente da tendência
natural de exploração do ambiente (Maximino et al, 2010a). O teste de claro-escuro já passou
por validação farmacológica com drogas ansiolíticas e ansiogências (Maximino et al, 2010c).
A esquiva inibitória naturalística é um teste no qual uma resposta terá sua emissão
diminuída, suprimida ou com a latência aumentada a fim de evitar a estimulação aversiva, no
qual o ambiente claro também funciona como aversivo natural. Há validação farmacológica
com drogas ansiolíticas, antidepressivas e estimulantes (Santos, 2013)
Entretanto, os aparatos impossibilitam a mensuração de comportamentos no ambiente
escuro e de comportamentos observados através da lateral do aquário como o nado acima ou
abaixo da linha média da água, e também impedem a automatização da análise de dados, logo
o aquário trilateral forneceria dados novos e importantes acerca da parametria do Danio rerio
em ambos os experimentos.
MÉTODO
Sujeitos: 47 peixes da espécie Danio rerio, de ambos os sexos, adultos, ingênuos e
adquiridos em pet shops locais. O armazenamento foi feito agrupando-os em grupos de no
máximo 10 sujeitos em aquários com capacidade de 3,5l (Sistema Aquático Autonomo/
ZEBTEC) com areação constante, ph e temperatura controlados (8,75 / 27,9 ºC), alimentados
uma vez ao dia com ração Tetra Color.
Material:
1 aquário claro / escuro tradicional (15 x 10 x 45 cm) dividido em dois compartimentos
de mesmo tamanho, um com lados e fundo branco e o outro com lados e fundo preto, com
uma área central de 5 cm delimitada por portas corrediças.
Figura 1. Aquário tradicional para teste de claro/escuro
1 aquário claro / escuro trilateral com mesmas dimensões e características do anterior,
porém com uma das lateriais de 15 cm transparente.
Figura 2. Aquário trilateral para teste de claro/escuro
1 aquário de esquiva naturalística tradicional (45 x 15 x 10 cm), em que a metade escura
terá 10 cm e a metade clara 35 cm de comprimento, sendo elas divididas por uma porta
guilhotina
Figura 3. Aquário Tradicional para Teste de Esquiva Naturalística Inibitória
1 aquário de esquiva naturalística trilateral que possui as mesmas dimensões e
características do aquário anterior, porém com uma das laterais de 15 cm transparente.
2 Filmadoras
Procedimento:
Experimento I: Preferência Claro-Escuro
Os sujeitos foram separados em Grupo Controle (n=12), exposto ao aquário tradicional,
e Grupo Experimental (n=11), exposto ao aquário trilateral, o teste originalmente utilizaria 12
sujeitos em ambos os grupos, porém o Sujeito 12 do aquário trilateral não se expôs à
contingência, permanecendo os 900 segundos no ambiente escuro, provavelmente a alto nível
de estresse ou dificuldade motora. O teste consistiu em colocar os sujeitos individualmente na
área central do aquário correspondente ao seu grupo por 300 segundos, e após este período as
portas corrediças foram retiradas, deixando os animais para livre exploração de 900 segundos.
Para evitar a influência de lateralidade, os aquários foram girados 180º para cada novo sujeito.
Registrou-se os 900 segundos de livre exploração, a fim de observar-se:
(1) Tempo no compartimento branco: Tempo total de permanência na porção branca
por mais de 1 segundo.
(2) Número de entradas no compartimento branco
(3) Duração das entradas no compartimento branco: média do tempo de permanência no
compartimento branco pela quantidade de entradas
(4) Avaliação de risco: número de eventos de avaliação de risco, sendo estes as entradas
rápidas (menores que 1 segundo), no compartimento branco, seguidas de retorno à
porção preta, ou como entradas parciais no compartimento branco.
(5) Tigmotaxia: duração de eventos de tigmotaxia, definidos como o nado a uma
distância de no máximo 2 cm das paredes do compartimento branco, e registrada em
segundos.
(6) Congelamento: A duração proporcional de eventos de congelamento, sendo estes a
cessação completa de movimentos, com exceção de operáculos e olhos.
(7) Nado Errático: duração de eventos de tigmotaxia, definidos como o nado a uma
distância de no máximo 2 cm das paredes do compartimento branco, e registrada em
segundos
(8) Nado na linha média Superior e Inferior: Observa-se a posição do sujeito em
comparação a linha média do nível da água, podendo ele estar na porção superior ou
inferior.
Sendo que no aquário tradicional, as medidas 4, 5, 6, 7 e 8 foram feitas quando o animal
esteve no compartimento claro, já no aquário trilateral, essas medidas também foram feitas no
compartimento escuro. Os dados foram transcritos pelo programa X-plo-rat.
Experimento II; Esquiva Inibitória-Naturalística
Os sujeitos também foram separados em Grupo Controle (n=12) e Grupo Experimental
(n=12). Cada sujeito é colocado no compartimento preto fechado pela porta corrediça durante
300 segundos, então a porta é retirada e inicia-se uma tentativa que s encerra com a passagem
completa do animal para o lado branco ou com a permanência dele no lado preto por 300
segundos, após isso o animal é retirado do aparato e recolocado no ambiente escuro para o
início de uma nova tentativa, sendo 5 tentativas no total. Os comportamentos analisados
serão:
(1) Tempo de permanência no compartimento preto
(2) Avaliação de risco: as entradas rápidas (menores que 1 segundo), no compartimento
branco, seguidas de retorno à porção preta, ou como entradas parciais no compartimento
branco
(3) Nado errático: eventos nos quais os sujeitos apresentam múltiplos surtos de alta
aceleração com variações na direção do movimento de modo aparentemente aleatório
(4) Tigmotaxia: duração de eventos de tigmotaxia, definidos como o nado a uma
distância de no máximo 2 cm das paredes do compartimento branco, e registrada em segundos
(5) Congelamento: a cessação completa de movimentos, com exceção de operáculos e
olhos
(6) Nado na linha média Superior e Inferior: Observa-se a posição do sujeito em
comparação a linha média do nível da água, podendo ele estar na porção superior ou inferior.
Sendo que no aquário tradicional apenas as medidas 1 e 2 foram analisadas e no aquário
trilateral todas as medidas foram realizadas. A filmagem dos Grupos Controles foi superior e
dos Grupos Experimentais foi superior e lateral. Os dados foram transcritos pelo programa Xplo-rat.
Análise estatística
Anova (one-way) para comparação entre grupo experimental e grupo controle.
RESULTADOS
900
20
800
18
700
16
Frequência de Entradas no
Compartimento Branco
Tempo de Permanência no
Compartimento Branco
Experimento I: Preferência Claro-Escuro
600
500
400
300
200
100
14
12
10
8
6
4
2
0
0
Controle
Experimental
Controle
Experimental
Figura 4. Tempo médio em segundos no compartimento branco [1] e Frequência ( numero) de
entrada no compartimento branco [1] (, para os Grupos testados nos aparatos clássicos e modificado
A analise estatística não indicou diferenças.
Não houve diferença significativa entre os comportamentos de permanência e entradas no
ambiente branco, a média da duração das entradas também não apresentou valor significativo
(H = 0,307; p = 0,580).
10
9
9
Frequência do Comportamento de
Avaliação de Risco
Frequência do Comportamento de Nado
ERrático
10
8
7
6
5
4
3
2
1
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
Controle
Controle
Experimental
Experimental
Figura 5. Comportamentos de Nado Errático (H = 1,885; p = 0,170) e Avaliação de Risco (F =
1,216; p = 0,283)
15
13
200
Duração do Comportamento de
Congelamento (s)
Duração do Comportamento de
Tigmotaxia (s)
250
150
100
50
11
9
7
5
3
1
0
Controle
Experimental
-1
Controle
Experimental
Figura 6. Duração dos Comportamentos de Tigmotaxia e Congelamento (H = 1,466; p = 0,226) e a
Duração Média de Congelamento (F = 0,391, p = 0,538).
No aquário modoficado podemos observar o comportamento em ambos os laods, no Claro e no
Escuro, como se segue, algumas diferenças nos comportamentos de Nado errático, Avaliação de
Risco, Tigmotaxia e Congelamento foram observadas no aquário modificado, porém nenhuma com
valor estatisticamente significativo.
Tabela 1. Médias dos Comportamentos de Avaliação de risco, Tigmotaxia (%), Nado Errático e
Congelamento para os ambientes claro e escuro
Avaliação
de Risco
Tigmotaxia
%
Tigmotaxia
Nado Errático
Congelamento
Ambiente Claro
Média
4,455
Desvio
1,9164360
86
0,5532274
45
Erro
179,82
56,054
5,27
8,55
138,202
10,18
6,4
19,41
39,9
2,94
1,85
5,6
Ambiente Escuro
Média
0
330,64
57,83
5,18
78
Desvio
0
153,35
20,14
5,69
124,82
Erro
0
44,27
5,81
1,64
36,03
A emissão de comportamentos no ambiente escuro foi semelhante à emissão no ambiente
claro, sem diferença estatística ente as médias
Duração Média no Ambiente Escuro
(s)
Duração Média no Ambiente Claro
(s)
300
250
200
150
100
50
700
600
500
400
300
200
100
0
0
Linha Média
Superior
Linha Média
Inferior
Linha Média
Superior
Linha Média
Inferior
Figura 7. Duração Média no ambiente claro (F = 5.6382; p = 0.0262) e escuro (F = 30.0023;
p = < 0.0001) de acordo com a posição em relação a linha média do nível de água.
Foi encontrada diferença entre o tempo o tempo despendido na linha média superior e na
linha média inferior, observando maior permanência na parte inferior tanto no ambiente claro
quanto no ambiente escuro, como observa-se na Figura 7.
Experimento II
Experimental
300
Duração Média das Latências de
Tentativas (s)
Duração Média das Latências de
Tentativas (s)
Controle
250
200
150
100
50
300
250
200
150
100
0
50
0
T1
T2
T3
T4
T5
T1
T2
Tentativas
T3
T4
T5
Tentativas
Figura 8. Duração média das Latências de Tentaticas para grupos Controle e Experimental (F
= 1,912; p = 0,115)
Não houve diferença entre grupos e ambos apresentaram um aumento na latência entre a
Tentativa 1 e Tentativa 5.
Experimental
6
5
4
3
2
1
0
T1
T2
T3
T4
Blocos de Tentativa
T5
Frequência Média do Comporttamento
de Avaliação de Risco
Frequência Média do Comportamento
de Avaliação de Risco
Controle
6
5
4
3
2
1
0
T1
T2
T3
T4
T5
Bloco de Tentativas
Figura 9. Frequência Média do Comportamento de Avaliação de Risco para grupos Controle e
Experimental (F = 1,033; p = 0,326).
DISCUSSÃO
Experimento I
A comparação entre os Grupo controle e experimental não apresentaram diferença
significativa em nenhuma das características analisadas (Figura 4, 5 e 6). Segundo Maximino
(2010c) os sujeitos permanecem em média 20% do tempo total de teste no ambiente claro, no
presente experimento (Figura 4), os sujeitos do grupo controle ficaram 35% e os do grupo
experimental 32%. Os comportamentos emitidos no ambiente escuro (Tabela 1) não foram
diferentes estatisticamente, a partir disso é possível a utilização dessas medidas como mais
um parâmetro para a avaliação de mudanças comportamentais neste teste de ansiedade.
Foi possível a análise dos comportamentos de nado acima e abaixo da linha média e os
resultados obtidos apontam a permanência na parte inferior por um maior tempo no ambiente
claro e escuro (Figura 7), demonstrando mais uma medida comportamental de ansiedade que
poderá ser considerada.
Portanto, os sujeitos expostos ao teste no aquário trilateral apresentaram
comportamentos com parametria semelhante aos do aquário tradicional, isto aponta para a
possibilidade deste aparato em pesquisas de claro-escuro. Entretanto, notou-se no teste em
aquário trilateral uma possível resposta dos sujeitos ao seu reflexo na lateral transparente,
logo para evitar problemas de experimentação como descrito em Maximino (2010a), sugerese uma troca por um material com menor probabilidade de reflexão.
Experimento II
As medidas de latência e avaliação de risco não se diferenciaram entre os grupos. A
duração das latências se mostra com um padrão de aprendizagem tendo um aumento
significativo entre a primeira e a última tentativa que é acompanhado de um aumento na
avaliação de risco, demonstrando um possível aumento na ansiedade dos sujeitos.
O aquário trilateral obteve resultados que permitem a sua utilização no teste de
Esquiva Inibitória Naturalística.
CONCLUSÃO:
Os aquários modificados se mostraram aptos a serem utilizados nos respectivos testes
com resultados estatisticamente semelhantes, possibilitando a parametria de dados que antes
não eram observados.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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