FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA Núcleo de Ciências e Tecnologia Programa de Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente CALOGÊNESE EM Annona glabra L. ANNONACEAE ANDRINA GUIMARÃES SILVA BRAGA Porto Velho (RO) 2012 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA Núcleo de Ciências e Tecnologia CALOGÊNESE EM Annona glabra L. ANNONACEAE ANDRINA GUIMARÃES SILVA BRAGA Orientador: Prof. Dr. Maurício Reginaldo Alves dos Santos Dissertação de Mestrado apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente, Área de Concentração em Ambiente, Saúde e Sustentabilidade, para obtenção do título de Mestre em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente. Porto Velho (RO) 2012 ANDRINA GUIMARÃES SILVA BRAGA CALOGÊNESE EM Annona glabra L. ANNONACEAE Comissão Examinadora _______________________________________ Dr. Maurício Reginaldo Alves dos Santos Orientador Fundação Universidade Federal de Rondônia/Embrapa Rondônia ________________________________________ Dra. Maria das Graças Rodrigues Ferreira Titular Embrapa Rondônia __________________________________________ Dr. Alexandre Martins Abdão dos Passos Titular Fundação Universidade Federal de Rondônia/Embrapa Rondônia ____________________________________________ Dra. Carolina Rodrigues da Costa Doria Suplente Fundação Universidade Federal de Rondônia Porto Velho, 27 de Agosto de 2012. Resultado: Aprovada. DEDICATÓRIA Dedico a Deus, presença divina em minha vida, e ao meu querido e amado esposo Paulo Leandro Braga. AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pela vida, grandes conquistas e oportunidades concedidas; À minha família, base da minha vida; Ao meu orientador Dr. Maurício Reginaldo Alves dos Santos, por ter aceitado me orientar no Programa de Pós-Graduação da Universidade, por seus ensinamentos, paciência dispensada e seu exemplo como professor e pesquisador; À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) pela oportunidade de estágio e pelo suporte físico e material no desenvolvimento desta pesquisa; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro durante o mestrado; À coordenação, corpo docente e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente da Fundação Universidade Federal de Rondônia; Aos meus queridos pais, Sebastião e Alcilene, presença especial em minha vida; À minha maninha, Adriele, pelo apoio e amizade; Ao meu grande amigo M. Renato Abreu Lima pela solidariedade, respeito, apoio e amizade verdadeira; Às minhas queridas sogra e cunhada, Adelina e Ana Paula Braga, pelo respeito, companheirismo, risadas e conselhos; Ao Técnico do Laboratório de Biotecnologia Vegetal Tiego, pela ajuda prestada em todo o desenvolvimento do trabalho. Às meninas do laboratório de Biotecnologia Vegetal, Daniele, Eloisa, Jaqueline, Josilene, Laiza, Milene, Sandra e Sâmela, obrigada pelas conversas, risadas, diversão e conselhos. Ao Engenheiro Florestal Francisco Airton dos Santos pela disponibilização de tempo e ajuda ao manusear o GPS. E aqueles que contribuíram direta ou indiretamente com este trabalho, sou muito grata!. B813c Braga, Andrina Guimarães Silva. Calogênese em Annona glabra L. Annonaceae / Andrina Guimarães Silva Braga. -- 201. 46f. : il. Orientadora: Maurício Reginaldo Alves dos Santos. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente) – Área de Concentração em Ambiente, Saúde e Sustentabilidade, Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho. Banca: Dra. Maria das Graças Rodrigues Ferreira, Dr. Alexandre Martins Abdão dos Passos, Dra. Carolina Rodrigues da Costa Doria 1. Desenvolvimento Rural. 2. Sistemas Agroflorestais. 3. Agroecologia. 4. Solo – Indicadores de qualidade. 5. Rondônia. I. Título. CDD (21.ed.) 571.538 Ficha catalográfica elaborada por: Daniela Maciel CRB 638/11 EPÍGRAFE “Sucesso é uma questão de não desistir, e fracasso é uma questão de desistir cedo demais.” (Walter Burke). LISTA DE TABELAS Tabela 1. Análise de variância referente aos tratamentos de desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012. 30 Tabela 2. Análise de variância referente aos efeitos dos reguladores de crescimento TDZ e 2,4-D na calogênese em explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012. 33 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Planta da espécie A. glabra, no campo experimental da Embrapa-RO. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. 18 Figura 2. Flor de A. glabra, (A) uma fechada e duas que sofreram aborto. (B) Flor iniciando a sua abertura. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. 19 Figura 3. Folhas de A. glabra. (A) Adaxial. (B) Abaxial. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. . Figura 4. Fruto verde de A. glabra. Foto: Laiza Nunes Limana. 20 Figura 5. Efeito das combinações de tempo de imersão e concentração de hipoclorito de cálcio na desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa Rondônia, 2012. 31 Figura 6. Desenvolvimento dos segmentos foliares, quanto à indução de calos. Avaliação em sete dias (A); avaliação em 14 dias (B); explante com 21 dias (C) e com 28 dias de inoculação (D) e calo com mais de 28 dias (E). Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. 37 19 RESUMO BRAGA, A.G.S. Calogênese em Annona glabra L. Annonaceae. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente). 2012. 46f. Porto Velho. Fundação Universidade Federal de Rondônia. 2012. Annona glabra L. é uma espécie nativa da América Tropical, muito utilizada como porta enxerto, devido à tolerância do sistema radicular a condições de excesso de umidade no solo e à indução de nanismo, possuindo potencial fitofarmacológico, apresentando propriedades antibactericidas, antifúngicas, inseticidas e citotóxicas. A propagação tradicional desta espécie é limitada devido à transmissão de doenças no método de estaquia e à variabilidade genética da propagação por sementes. O objetivo deste trabalho foi realizar o estabelecimento in vitro de explantes de A. glabra L. e promover a indução e formação de calos friáveis em explantes foliares com a utilização de combinações de reguladores de crescimento, visando contribuir com o futuro estabelecimento de um protocolo de completo micropropagação da espécie. Foram coletadas folhas jovens, no campo experimental da Embrapa-Rondônia, os quais foram submetidos a teste de desinfestação com imersão em hipoclorito de cálcio a 5 e 10% (p/v), por 15 e 30 minutos. Após a desinfestação, as folhas foram segmentados em fragmentos de 1 cm2, os quais foram inoculados em meio Murashige & Skoog modificado com metade das concentrações de nutrientes e sem regulador de crescimento. Sete dias após, foi avaliada a porcentagem de contaminação dos explantes. Para a indução de calos foi empregada a mesma metodologia, sendo que os fragmentos foliares foram inoculados em meio MS contendo uma combinação fatorial de 2,4-D (0, 2, 4 e 8 mg.L-1) e TDZ (0, 2, 4 e 8 mg.L-1). Os cultivos foram mantidos no escuro, em sala de crescimento, a 24 ± 2ºC. Aos 28 dias foi realizada a avaliação quanto à indução de calos. A desinfestação mais eficiente foi a imersão em hipoclorito de cálcio a 10% por 30 minutos, resultando em 90% de desinfestação dos explantes. A maior porcentagem de indução de calos foi de 100% nos tratamentos com 4 e 8 mg.L-1 de TDZ, na ausência de 2,4-D. Assim, recomenda-se o TDZ a 4mg.L-1 para a indução de calos em explantes foliares da espécie A. glabra. Palavras-chave: Micropropagação; Reguladores de Crescimento Vegetal; Cultura de Tecidos Vegetais. ABSTRACT BRAGA, A.G.S. Calogenesis in Annona glabra L. Annonaceae. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente). 2012. 46f. Porto Velho. Fundação Universidade Federal de Rondônia. 2012. Annona glabra L. is popularly known as araticunzeiro-do-brejo and is an Amazonian species native of Tropical America with wide geographic distribution. The traditional propagation of this species is limited by transmission of diseases in cuttings and genetic variability in seed propagation. The objective of this study was the in vitro establishment of A. glabra L. and to promote the induction and formation of friable callus in leaf explants aiming the achievement of a micropropagation protocol of this species. Young leaves were collected from trees at the experimental field of Embrapa Rondonia and submitted to disinfection tests using immersion in calcium hypochlorite solution at 5 and 10% (w/v) during 15 and 30 minutes. After disinfection, leaves were cut in 1 cm2 fragments which were inoculated in Murashige & Skoog medium modified with half the concentration of nutrients and without growth regulators. Seven days after, the percentage of contamination was evaluated. For callus induction the same methodology was used and the leaf explants were inoculated in MS medium with factorial combination of 2,4-D (0, 2, 4, and 8 mg.L-1) and TDZ (0, 2, 4, and 8 mg.L-1). All the cultures were incubated in a growth chamber at 24 ± 2ºC in the dark. Forty-nine days after the induction of callus was evaluated. The most efficient disinfection was obtained with immersion in calcium hypochlorite solution at 10% for 30 minutes, which resulted in 90% of disinfected explants. The highest percentage of callus induction was 100% in the media supplemented with TDZ at 4.0 and 8.0 mg.L-1, without 2,4-D. Key words: Micropropagation; Growth Regulators; Plant Tissue Culture. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 11 2. OBJETIVOS 14 2.1. GERAL 14 2.2. ESPECÍFICOS 14 3. REVISÃO DE LITERATURA 15 3.1. A FRUTICULTURA NO BRASIL 15 3.2. ASPECTOS BOTÂNICOS 16 3.3. DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE Annona glabra 17 3.4. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 21 3.4.1. Micropropagação 22 3.4.2. Hormônios e Reguladores de Crescimento 24 3.5. SUBSÍDIOS PARA O DESENVOLVIMENTO REGIONAL E MEIO AMBIENTE 26 4. MATERIAL E MÉTODOS 28 4.1. ESTABELECIMENTO IN VITRO 28 4.2. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES 28 4.3. INDUÇÃO DE CALOS 29 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 30 5.1. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES 30 5.2. INDUÇÃO DE CALOS 33 6. CONCLUSÕES 38 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39 1. INTRODUÇÃO O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo (estimado em 43,01 milhões de toneladas), depois da China e Índia (ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA, 2008). A produção brasileira está voltada para frutas tropicais, subtropicais e de clima temperado, graças a sua extensão territorial, posição geográfica, solo e condições climáticas. No país são exploradas 500 variedades de plantas produtoras de frutas comestíveis e 220 espécies de frutíferas nativas somente na Amazônia (ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA, 2008). Essas frutíferas nativas brasileiras podem constituir uma alternativa em nichos de mercado que buscam novidades e com uma renda adicional para os pequenos produtores. Entretanto, pouco se conhece sobre a grande maioria das espécies (LATTUADA, 2010). A Amazônia possui uma grande diversidade de fruteiras nativas, na qual estão incluídas espécies vegetais com grande potencial econômico ainda não domesticadas, como é o caso do araticum, árvore de pequeno porte, encontrada às margens inundáveis dos rios e lagos da Bacia Amazônica (VILLACHICA, 1996). A família Annonaceae, de distribuição pantropical, caracterizada por árvores e arbustos, tem cerca de 130 gêneros e aproximadamente 2.300 espécies identificadas (MABBERLEY, 1997; PIRES & TRESENS, 2001). No Brasil, foram registrados 26 gêneros, compreendendo cerca de 260 espécies (MAAS et al., 2001). Dentre essas, situa-se a Annona glabra L., comumente conhecida no Brasil como Araticum-do-brejo ou Araticum-bravo (CHRISTIAN, 2007). O araticunzeiro-do-brejo (Annona glabra L.) é uma espécie nativa da América Tropical, com ampla distribuição geográfica. No Brasil ocorre espontaneamente, desde a Amazônia até o estado de Santa de Catarina (BRAGA, 1976), ocupando, com maior frequência, áreas periodicamente inundadas (PAULA & ALVES, 1997). O método de propagação mais utilizado para esta espécie é através de sementes, resultando em grande variabilidade genética, devido à recombinação genética. Em decorrência da utilização desse tipo de muda, os pomares formados resultam em plantas desuniformes, de baixa produtividade e dando origem a frutos de má qualidade. Outra forma de propagação seria por estaquia. A propagação vegetativa de plantas frutíferas é a mais recomendada, pois possibilita a manutenção das boas características da planta. A multiplicação de plantas frutíferas por via vegetativa pode ser feita de várias maneiras, sendo que cada espécie se adapta a cada uma delas (RIBEIRO, 2007). Porém nesta espécie a estaquia resultaria na transmissão de doenças para as novas plantas. Tradicionalmente, muitas espécies de frutíferas são propagadas vegetativamente e um grande interesse tem sido manifestado na utilização da cultura de tecidos como método de propagação em várias espécies de pequenas frutas e frutos nativas. Tal método permite propagar espécies de difícil multiplicação pelos métodos clássicos, tais como estaquia, e ainda obter mudas sadias, livres de vírus e outros patógenos, produzindo assim um material de alta qualidade genética e sanitária o ano todo. Um aspecto fundamental para realizar a micropropagação de uma planta frutífera é o domínio da tecnologia de propagação em laboratório, chamada de protocolo, o qual consiste nos resultados obtidos em relação aos fatores que afetam o crescimento e o desenvolvimento das plantas in vitro (RIBEIRO, 2007). O desenvolvimento de uma planta depende da interação de fatores internos, como as substâncias orgânicas, os hormônios, que desempenham importante função na regulação do crescimento, e externos como a luz, a temperatura e o fotoperíodo. Na cultura de tecidos vegetais, as correlações existentes entre os diversos órgãos de uma planta intacta são rompidas, sendo necessário o fornecimento dos fatores que regulem o crescimento e o desenvolvimento (SCHUCH & ERIG, 2005). O emprego destas técnicas, especialmente no processo da propagação in vitro (micropropagação), tem sido amplamente utilizado, principalmente quando a propagação generativa é insatisfatória, quando a progênie obtida é muito heterogênea ou em casos em que a propagação por sementes não ocorre naturalmente. Por outro lado, é muito importante ressaltar sua grande utilidade em programas de conservação e melhoramento, dada a economia de tempo na multiplicação de variedades, assim como produção de clones promissores e livres de patógenos. Entretanto, a multiplicação in vitro e em larga escala de anonáceas ainda tem se confrontado com algumas limitações. A contaminação endógena dos explantes (SANTANA et al., 2003), a alta concentração de compostos fenólicos em seus tecidos e, principalmente, a abscisão foliar precoce (LEMOS, 2000), ocasionada pelo acúmulo de etileno nos tecidos confinados no ambiente in vitro, prejudicando o vigor e o crescimento das brotações, são os principais exemplos. Para Lemos (2000), solucionar essa dificuldade representa o grande desafio na obtenção de um protocolo consistente para a micropropagação de anonáceas. O objetivo deste trabalho foi realizar o estabelecimento in vitro de A. glabra L. e promover a indução e formação de calos friáveis em explantes foliares, visando a uma posterior regeneração de plantas para a propagação em larga escala desta espécie. 2. OBJETIVOS 2.1. GERAL: Desenvolver um protocolo para a indução de calos em segmentos foliares de Annona glabra L., visando contribuir com estabelecimento de um sistema de micropropagação da espécie. 2.2. ESPECÍFICOS: Estabelecer culturas assépticas in vitro de segmentos foliares de Annona glabra L.; Avaliar o efeito de combinações de reguladores de crescimento na calogênese em explantes foliares. 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. A FRUTICULTURA NO BRASIL A fruticultura pode ser conceituada como sendo um conjunto de técnicas e práticas aplicadas adequadamente com o objetivo de explorar a produção de frutas comestíveis comercialmente (FACHINELLO et al., 1996). O Brasil é uns dos maiores produtores mundiais de frutas in natura ou frescas. Pela diversidade de clima e solos, apresenta condições ecológicas para produzir frutas de ótima qualidade e com uma variedade de espécies que passam pelas frutas tropicais, subtropicais e temperadas (FACHINELLO et al., 1996). As plantas frutíferas englobam grande quantidade de espécies, com considerável diversidade quanto ao modo de reprodução, período juvenil, ciclo da planta e aos métodos de propagação (BRUCKNER, 2002). O comércio internacional de frutas (frescas e processadas) está entre os de maior dinamismo e perspectivas futuras, com boas possibilidades dos agricultores familiares se integrarem aos mercados de frutas frescas, polpa e sucos. O grande consumo de frutas tropicais nos estratos inferiores permite concluir que existe grande potencial de crescimento do mercado doméstico de frutas, principalmente em conjunturas econômicas mais favoráveis em termos de trabalho e renda (MALUF, 2000). Segundo o MAPA (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2008), o Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, com produção superando 38 milhões de toneladas anuais, cultivadas em 3,4 milhões de hectares. Em 2007, as exportações brasileiras de frutas frescas atingiram cerca de 920 mil toneladas, com valor de US$ 643 milhões (preço FOB), aproximadamente. Os maiores volumes exportados foram de melões, bananas, manga, maçãs e uvas. No mesmo ano, foram importados 280 mil toneladas de fruta fresca, principalmente peras com aproximadamente 49% do volume total importado (IBRAF – INSTITUTO BRASILEIRO DE FRUTAS, 2008). Essas frutíferas nativas brasileiras podem constituir uma alternativa em nichos de mercado que buscam novidades e uma renda adicional para os pequenos produtores. Entretanto, muito pouco se conhece sobre a grande maioria destas espécies (LATTUADA, 2010). 3.2. ASPECTOS BOTÂNICOS DA FAMÍLIA ANNONACEAE A família Annonaceae é importante tanto evolutiva, ecológica, como economicamente. Em número de espécies, Annonaceae é de longe a mais sobressalente dentro da ordem das Magnoliales, as quais se encontram entre as angiospermas mais primitivas. Geralmente estão distribuídas entre as áreas tropicais da América, África e Ásia (CHATROU, 1999). A família Annonaceae possui 132 gêneros e 2.300 espécies de acordo com Pires & Tresens (2007). A maioria das plantas é de origem tropical, com exceção daquelas do gênero Asimira, nativas de clima temperado e que ocorrem na América do Norte; e a espécie Annona cherimola Mill., de origem dos altiplanos andinos, cultivada em diversas regiões do mundo e considerada como a mais saborosa das frutas. Muitas das demais espécies são nativas do Brasil (KAVATI, 1992). No Brasil, a família Annonaceae compreende 26 gêneros e aproximadamente 260 espécies, desempenhando um importante papel na composição da vegetação (MAAS et al., 2001). Na fruticultura são importantes dois gêneros de anonáceas, sendo Rollinia e Annona. Mahddeen (1990), menciona mais de 100 espécies do gênero Annona e 65 em Rollinia. A família é constituída por árvores, arbustos, e raramente por arbustos escandentes, que se caracterizam por apresentar flores vistosas, andróginas, solitárias, ou em inflorescências, axilares ou terminais, opositifólias ou não; cálice de três sépalas, corola de seis pétalas bisseriadas, geralmente carnosas ou crassas, estames numerosos, gineceu dialicarpelar; fruto sincárpico ou apocárpico, muricado ou não; carpídios sésseis ou estipitados, secos ou carnosos, deiscentes ou indeiscentes; sementes com endosperma ruminado. O indumento das espécies é composto de tricomas simples, estrelados ou escamosos (PONTES et al., 2004). As flores das plantas da família Annonaceae apresentam uma clara dicogamia protogínica e também heterostilia. O fruto é um sincarpo procedente de uma única flor, formado pela fusão de muitos carpelos simples em torno de um receptáculo central, constituindo uma massa sólida. A maioria das espécies de Annonaceae encontra-se vegetando e produzindo frutos em clima tropical e subtropical, poucas são as espécies nativas de clima temperado (NAKASONE & PAULL, 1998; JANICK & PAULL, 2006.) Annona L., é o gênero mais importante já que, dentro de centenas de espécies no mundo, apenas sete e um híbrido são plantados comercialmente, abrangendo as espécies Annona cherimola Mill., Annona diversifolia Saff., Annona glabra L., Annona muricata L., Annona reticulata L., Annona senegalensis Pers., Annona squamosa L. e o híbrido Annona squamosa x Annona cherimola. Um gênero desta família que é muito próximo de Annona é Rollinia A.St.-Hil., cujas espécies também possuem frutos explorados comercialmente (NAKASONE & PAULL, 1998). 3.3. DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE Annona glabra L. Annona glabra L., comumente conhecida no Brasil como Araticum-do-brejo ou Araticum-bravo é uma árvore de pequeno porte, semidecídua, encontrada em todo o território brasileiro, principalmente nas áreas costeiras, e alcança aproximadamente 12 a 15 metros de altura. Um espécime possui normalmente tronco único, porém as sementes germinam em grupo, dando aparência de moitas com vários caules (Figura 1) (SIEBRA, 2007). Necessita de solo úmido para crescimento e beneficia-se de inundações regulares, porém não permanentes. Cresce naturalmente nas Américas do Norte, do Sul e Central, além do oeste Africano, em regiões alagadas, salobras ou não. Seu crescimento ocorre em habitats que estão periodicamente ou permanentemente inundados, ou seja, ao longo de rios, margens de lagos e em regiões salobras próximas ao litoral (CROAT, 1978). A adaptação a esses ambientes se deve às várias características estruturais da planta, como intumescimento da base de seu tronco, raízes adventícias, aerênquima nas raízes, tronco pequeno, frutos que bóiam e à dispersão das sementes na água (ZOTZ et al., 1997). Consegue sobreviver em períodos de seca, porém seu crescimento torna-se severamente comprometido. Figura 1. Planta da espécie A. glabra, no campo experimental da Embrapa-RO. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. As flores, raramente observadas, porém muito atrativas, geralmente possuem dois a três cm de diâmetro, variando de amarelo pálido a creme, com três pétalas maiores externas encouraçadas e três pétalas pequenas internas (figura 2) (SIEBRA, 2007). A B Figura 2. Flor de A. glabra, (A) uma fechada e duas que sofreram aborto. (B) Flor iniciando a sua abertura. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. As folhas possuem de sete a 12 cm de comprimento, pecíolo cilíndrico, lâmina oblonga, cartácea, base obtusa, ápice acuminado, margem plana, com nove a 13 pares de nervuras secundárias. A maturidade reprodutiva é atingida após aproximadamente dois anos, quando se inicia a floração e a produção de frutos (figura 3) (SIEBRA, 2007). A B Figura 3. Folhas de A. glabra. (A) Adaxial. (B) Abaxial. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. O fruto é esférico, com cerca de cinco a 15 cm de diâmetro, naturalmente verde. Após sua queda, torna-se amarelado, escurecendo em seguida. Contém pouco mais de 100 sementes, de aspecto semelhante aos da abóbora, com aproximadamente um centímetro de comprimento (Figura 4) (SIEBRA, 2007). No Brasil, os frutos caem nos meses de março e abril, permanecendo viáveis por alguns meses em água doce ou salobra. Para que ocorra a germinação, a semente necessita de ambiente alagadiço ou úmido. Uma vez estabelecida a germinação, a planta pode sobreviver em altos níveis de salinidade, possuindo, na fase adulta, considerável tolerância a ambientes salinos (SIEBRA, 2007). Figura 4. Fruto verde de A. glabra. Foto: Laiza Nunes Limana. O araticunzeiro-do-brejo tem recebido a atenção de pesquisadores, pois pode ser usado como porta-enxerto ananizante. No Brasil, a espécie tem sido indicada como porta-enxerto para a graviola (Annona muricata L), por apresentar excelente grau de compatibilidade (FERREIRA & CLEMENT, 1987; PINTO & SILVA, 1994; PINTO, 2005). O interesse por este material é devido à tolerância do sistema radicular a condições de excesso de umidade no solo e à indução de nanismo à copa enxertada. Além disso, possui potencial fitofarmacológico, apresentando propriedades antibactericidas, antifúngicas, inseticidas e citotóxicas. Desenvolve-se bem em regiões alagadas, salobras ou não (LEITE, 2011). 3.4. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS A biotecnologia vegetal tem contribuído de forma relevante para o setor produtivo a partir do impulso, na década de 1990, das pesquisas para a produção de plantas livres de vírus, para a propagação clonal e o desenvolvimento de genótipos resistentes a estresses bióticos e abióticos via engenharia genética (TORRES et al., 1998). A cultura de tecidos vegetais é uma técnica com grandes aplicações na agricultura. Nessa técnica, pequenos fragmentos de tecido vivo, chamados explantes, são isolados de um organismo vegetal, desinfestados e cultivados assepticamente, por períodos indefinidos em um meio de cultura apropriado. O objetivo é obter novas plantas idênticas à original, ou seja, realizar uma clonagem vegetal que é definida como uma propagação assexuada de células ou organismos de modo a obter novo indivíduo, mantendo-se o genótipo idêntico àquele do ancestral comum (TORRES et al., 2000). O cultivo in vitro é um método viável para propagação de diversas espécies frutíferas, podendo ser utilizada também com as espécies nativas proporcionando a formação de pomares com populações de plantas homogêneas além de acelerar os métodos de propagação convencional (SOUZA et al., 2007). Assim, é uma excelente ferramenta para clonar plantas em escala comercial, além de colaborar na realização de estudos de transformação genética e conservação de espécies vegetais. Permite ainda aperfeiçoar a interação entre fatores abióticos (nutricionais, luminosos, temperatura, etc.) e bióticos (hormonais e genéticos), resultando em plantas sadias, vigorosas e geneticamente superiores, que podem ser multiplicadas massivamente (ALVES et al., 2012). Essa técnica é considerada importante para a propagação de várias espécies lenhosas e vem sendo utilizada com sucesso (LANDA et al., 2000). A propagação por meio de cultura de tecidos pode ser feita por via direta ou indireta, esta última via formação de calos, que é considerada uma forma potencial de propagação em massa (PIERIK, 1987; LANDA et al., 2000). Estudos com calos devem ser desenvolvidos para determinar as condições de cultura que os explantes requerem para sobreviver e crescer (SIQUEIRA & INOUE, 1992). O cultivo de calos pode ser utilizado para se estudar o desenvolvimento celular, explorar produtos provenientes do metabolismo primário e secundário, obter suspensão celular e propagação via formação de gemas ou embriões somáticos (LANDA et al., 2000). O uso de múltiplas brotações tem sido amplamente utilizado para a propagação em massa de diversas espécies, e estas técnicas de cultura de tecidos têm sido geralmente realizadas através da formação de brotos, via calos (TSURO et al., 2000). Estas técnicas, em muitas espécies lenhosas, têm permitido a obtenção de calos, através dos quais é possível obter embriões somáticos e/ou induzir respostas morfogênicas capazes de produzir plântulas com características agronômicas desejáveis. Espécies arbóreas nativas têm sido amplamente utilizadas em programas de revegetação de áreas degradadas de cerrados e matas ciliares, requerendo uma produção contínua de um grande número de mudas. No entanto, algumas destas espécies apresentam sementes com algum tipo de dormência, dificultando sua propagação, tornando importante a obtenção de mudas de forma assexuada. Várias espécies nativas têm problemas com o baixo poder de germinação, muitas vezes são dormentes ou sem reservas. Assim, técnicas alternativas de propagação assexuada, como a cultura de tecidos, devem ser estudadas para se obter um número expressivo de mudas de espécies ecológica e comercialmente importantes (SANTOS et al., 2005). 3.4.1 Micropropagação A micropropagação baseia-se no fenômeno da totipotência das células vegetais, ou seja, cada célula possui a capacidade de gerar uma nova planta, permitindo a manutenção plena das características da planta-mãe, de modo uniforme, rápido crescimento e matéria-prima homogênea, uma vez que é possível obter várias cópias geneticamente idênticas de um mesmo indivíduo, livre de contaminações (GAMBORG & SHYLUCK, 1981; CALDAS et al., 1990). Métodos de propagação vegetativa seriam uma alternativa para a produção de mudas com características idênticas à planta matriz, permitindo a formação de pomares homogêneos quanto à produtividade, qualidade do fruto, precocidade e tolerância às pragas e doenças, além da antecipação do início da produção comercial, a partir da redução da fase juvenil da planta (LIRA et al., 2007). Micropropagação é o desenvolvimento de novas plantas em um meio artificial sob condições assépticas, in vitro, a partir de pequenos propágulos (explantes) livres de microrganismos. Para a micropropagação de frutíferas, as partes mais empregadas são os ápices caulinares, micro-estacas, embriões, calos celulares, entre outros. A cultura de tecidos difere dos métodos tradicionais, principalmente nas condições sob as quais a propagação é efetuada, mas não difere destes quanto aos seus princípios. As diferenças óbvias referem-se ao fato de a micropropagação empregar propágulos pequenos, controle asséptico, controle do meio ambiente e rápida multiplicação das frutíferas, garantindo a manutenção das características agronômicas essenciais das cultivares (FACHINELLO et al., 1994; TREVISAN et al., 2004). Murashige (1974) propôs três diferentes estágios para a micropropagação: estágio I: seleção de explantes, desinfestação e cultivo destes em meio nutritivo, sob condições assépticas; estágio II: multiplicação dos propágulos por meio de sucessivos subcultivos, em meios de cultura apropriados e; estágio III: transferência das partes aéreas produzidas para meio de cultura com reguladores de crescimento indutores de raízes e o posterior transplantio das mudas produzidas para substrato ou solo. Um protocolo completo de propagação de plantas consiste em descrever esses três estágios do processo para uma determinada espécie. A produção industrial de plantas in vitro é uma prática bastante usada em agroindústrias de flores em países como Estados Unidos e Europa. É um método biotecnológico já consagrado, que pode produzir plantas (mudas) mais sadias e uniformes, com uma velocidade muito mais rápida do que os métodos convencionais. Esta tecnologia pode ser usada para produção de todas as plantas que normalmente propagam-se vegetativamente. Hoje a produção industrial de plantas in vitro, a biofabricação de plantas, já não se limita a flores e plantas ornamentais. Outras plantas de valor econômico, como café, batata, banana, abacaxi, eucalipto, pinus, cana-deaçúcar, entre outros, têm sido produzidas em biofábricas no mundo inteiro (RIBEIRO et al., 2010). Muitos são os fatores que influenciam o comportamento do explante no meio de cultura, incluindo o órgão que serve como fonte de tecido, a idade fisiológica e ontogenética do órgão, o tamanho do explante e, acima de tudo, a qualidade da planta doadora (THORPE & PATEL, 1984). O controle da qualidade do material vegetal em si e a manipulação deste antes de se isolar o explante são aspectos importantes na cultura de tecidos. Esta manipulação inclui o manejo cultural e ambiental da planta matriz, pois os estados nutricional, fisiológico e fitossanitário desta têm grande influência no posterior comportamento do explante e da cultura. Plantas nutridas sem sintomas de deficiência nutricional ou hídrica, em geral, fornecem explantes de melhor qualidade (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). 3.4.2. Hormônios e Reguladores de Crescimento De acordo com a maioria dos fisiologistas de plantas, o hormônio vegetal, também chamado de fitohormônio, é um composto orgânico sintetizado em uma parte da planta e translocado para outra parte, onde, em baixa concentração, causa uma resposta fisiológica (promoção ou inibição). O termo regulador de crescimento é normalmente empregado para compostos naturais (fitohormônio e substâncias naturais de crescimento) ou sintéticos (hormônio sintético e regulador sintético) que exibem atividade no controle do crescimento e desenvolvimento da planta. Para Lamas (2001), o termo regulador de crescimento define substâncias químicas sintéticas que têm efeito sobre o metabolismo vegetal. A composição e concentração de hormônios no meio são fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos (CALDAS et al.,1998). Reguladores de crescimento também podem ser utilizados em fases iniciais da cultura com objetivo de melhorar a germinação, emergência e o desenvolvimento inicial das plantas. Na fase de estabelecimento da lavoura, diversos fatores podem influenciar negativamente o desempenho das plantas, como: desuniformidade de germinação e lento desenvolvimento do sistema radicular. Existe alta correlação entre o desenvolvimento inicial das plântulas e a produtividade da lavoura, por isso é necessária a adoção de práticas que possam ajudar a superar os estresses existentes nas primeiras fases de seu desenvolvimento (BECKER et al., 1999). O uso de reguladores de crescimento nas diferentes fases do processo pode ser considerado como essencial para a realização dos trabalhos. De acordo com França (2001), a presença de reguladores de crescimento no meio de cultura propiciou amplo avanço das técnicas que constituem a biotecnologia atual. O uso de citocininas é muito favorável na fase de multiplicação in vitro, sendo o tipo e a concentração os principais fatores que influenciam no processo (SOUZA et al., 2003). As citocininas são reguladores de crescimento que desempenham um papel fundamental no crescimento e cultura de tecidos, estimulando a divisão celular, bem como a indução e a proliferação de gemas axilares, além de quebrarem a dominância apical (HU & WANG, 1983). O tipo de citocinina e sua concentração são os fatores que mais influenciam o sucesso da multiplicação in vitro (SCHUCH & ERIG, 2005). O thidiazuron (TDZ) tem sido usado na micropropagação, pois, segundo Huetteman & Preece (1993), é um excelente estimulante para formação de calos. As auxinas são substâncias quimicamente relacionadas com o ácido indol-3acético (AIA), que é a auxina principal de várias plantas. Essas substâncias têm em comum a capacidade de atuar na expansão e no alongamento celular, ajudando também na divisão celular em cultura de tecidos, principalmente no enraizamento (KRIKORIAN, 1991). Entre outras substâncias usadas para o enraizamento in vitro estão o ácido naftaleno acético (ANA), o ácido 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e o ácido indolbutírico (AIB) (ROSS, 1992). A auxina 2,4-D é bastante usada para a indução de calos e tem o efeito de supressão da morfogênese. As auxinas 2,4-D e ANA são sintéticas e têm efeitos semelhantes às auxinas de ocorrências naturais, sendo mais estáveis à degradação. 3.5. SUBSÍDIOS PARA O DESENVOLVIMENTO REGIONAL E MEIO AMBIENTE Na Amazônia, as categorias socioambientais de ocupação humana são distinguidas em termos de pressão de uso e do impacto que exercem sobre o ambiente, relacionados ao modo como ocupam, exploram e concebem sua relação com a natureza. O comportamento de uma dada categoria socioambiental em relação ao ambiente é influenciado por características de sua formação social, tais como a orientação de sua produção econômica, grau de envolvimento como o mercado e a posse de uma cultura ecológica (LIMA & POZZOBON, 2005). O desenvolvimento sustentável não é um estado permanente de harmonia, mas um processo de mudança no qual a exploração dos recursos, a orientação dos investimentos, os rumos do desenvolvimento tecnológico e a mudança institucional estão de acordo com as necessidades atuais e futuras. A maioria dos países em desenvolvimento necessita de sistemas de incentivo mais eficazes para estimular a produção, sobretudo de culturas alimentares. É necessário que as “relações de troca” passem a favorecer o pequeno agricultor, promovendo práticas agrícolas sensatas do ponto de vista ecológico (GUIMARÃES, 1996). As tecnologias emergentes prometem maior produtividade, mais eficiência e menos poluição, que beneficiem a natureza em altas proporções, a fim de atender as necessidades humanas básicas, pois um desenvolvimento agrícola rápido e sólido representa não só mais alimento, como também conservação dos recursos naturais (LIMA, 2011). Os avanços da biotecnologia, ocorridos nos últimos anos, certamente concorrerão para dinamização desse processo, criando entre todos os agricultores a expectativa de oferecer mudas de qualidade. Isso para que a fruticultura aumente sempre sua competitividade, respeitando os preceitos contemporâneos de sustentabilidade. Com isso, a disponibilização de mudas por esse sistema pode aumentar a competitividade do produtor, já que as mudas micropropagadas permitem a obtenção de plantas uniformes e isentas de doenças, além de possibilitar que o planejamento da produção seja cumprido durante todo o ano. Isso estabelece uma melhoria no padrão de rendimento da produção, implicando em uma maior competitividade na comercialização dos produtos agrícolas, o que colabora ainda com a geração de emprego, renda e fixação do homem no campo (LIMA, 2011). A busca de novas tecnologias é o caminho para promover melhoria de vida dos agricultores. Desse modo, a utilização de ferramentas biotecnológicas para a produção de mudas de algumas espécies vegetais em larga escala, com alta qualidade sanitária, fidelidade genética, vigor e uniformidade, tem contribuído para o desenvolvimento da agricultura em determinados setores, além de reduzir o impacto negativo em relação ao ambiente, à saúde dos trabalhadores rurais e do consumidor, devido à menor utilização de agrotóxicos. 4. MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Embrapa Rondônia, em Porto Velho, Rondônia (8º53’20’’ S 63º06’40’’ W), no período de novembro de 2010 a junho de 2012. As folhas de A. glabra L. utilizadas para o experimento foram coletadas no campo experimental da Embrapa-RO, localização de 8º48’50’’ Latitude e 63º50’48” Longitude. Foram separados quatro exemplares da espécie, e em seguida encaminhadas para o registro na forma de exsicata para o Herbário Dr. Ary Tupinambá Penna Pinheiro com número de registro 6847. De acordo com a classificação de Köppen, o clima da região é do tipo Aw’ caracterizado como tropical chuvoso com média climatológica da temperatura do ar, durante o mês mais frio, superiores a 18ºC, e um período seco bem definido durante a estação de inverno, quando ocorre na região um moderado déficit hídrico, com índices pluviométricos inferiores a 50 milímetros por mês. 4.1. ESTABELECIMENTO IN VITRO Foram utilizadas folhas jovens de A. glabra L. coletadas nos meses de novembro a março, quando só se observa crescimento vegetativo, sem a presença de flores ou frutos. As plantas são cultivadas no campo experimental da Embrapa Rondônia, no município de Porto Velho-RO. Todas as manipulações foram efetuadas em câmara de fluxo laminar. Os explantes inoculados foram mantidos em câmara de crescimento, com luminosidade de 2000 lux e fotoperíodo de 16 horas. O material com reguladores foi mantido no escuro sob temperatura de 24±2ºC. 4.2. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES As folhas foram coletadas no campo experimental e levadas para o laboratório, onde foram lavadas com água destilada corrente, com auxílio de esponja estéril, detergente comercial e sabão antisséptico. Em câmera de fluxo laminar, as folhas foram imersas em álcool 70% (v/v) por um minuto e logo após foram submersas em solução de hipoclorito de cálcio nas concentrações 5 e 10% (p/v), em períodos de 15 e 30 minutos, sendo mantidos em constante agitação, seguida de três enxagues com água destilada ionizada autoclavada. Com auxílio de pinça e de bisturi, foram segmentadas, a parte das folhas contendo nervuras principais e secundarias, em fragmentos de 1 cm2, e cultivadas em tubos contendo 10 ml de meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com a metade da concentração de nutrientes e suplementado com 30 g.L-1 de sacarose e solidificado com 8 g.L-1 ágar. O pH foi ajustado para 5,8±0,1 antes da autoclavagem a 121ºC e 1 atm, durante 20 minutos, sem a presença de reguladores de crescimento. Após a inoculação, os cultivos foram mantidos no claro, em sala de crescimento, a 25±1ºC, por um período de sete dias. 4.3. INDUÇÃO DE CALOS Para a indução de calos, as folhas jovens de A. glabra foram desinfestadas, segmentadas e inoculadas em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), com 30 g.L1 de sacarose e solidificado com 8 g.L-1 de ágar e combinações fatoriais dos reguladores de crescimento 2,4-D (0, 2, 4, 8 mg.L-1.) e TDZ (0, 2, 4, 8 mg.L-1). Após a inoculação, as amostras foram mantidas em sala de crescimento no escuro, sob temperatura de 24±2ºC. Os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando o software BioEstat 5.0 e as médias foram submetidas ao teste de Tukey a 5% de probabilidade. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES Na tabela 1 está representada a análise de variância referente aos tratamentos de desinfestação dos explantes foliares A. glabra. Pode-se observar que os tratamentos diferiram significativamente entre si e que houve interação entre as concentrações de hipoclorito de cálcio e os tempos de imersão neste desinfestante. Com o desdobramento dos fatores observa-se que as concentrações só diferiram entre si no período de imersão de 15 minutos, e que os tempos de imersão só diferiram entre si na concentração de 10% de hipoclorito de cálcio. Considerando a existência de interação, procedeu-se ao teste de Tukey, cujos resultados são apresentados posteriormente (Figura 5). Tabela 1. Análise de variância referente aos tratamentos de desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012. Causas de variação GL QM F Tratamentos (3) 19,31 91,97** Resíduo 12 0,21 Concentrações 1 22,57 107,45** Tempos 1 18,07 86,02** CxT 1 17,30 82,38** C (dentro de 15’) 1 0,13 0,59ns C (dentro de 30’) 1 40,50 192,86** T (dentro de 5%) 1 0,00 0,00ns T (dentro de 10%) 1 36,13 172,05** CV (%) 5,51 * Significativo a 5% de probabilidade; ** significativo a 1% de probabilidade. ns: não significativo. Aos sete dias de inoculação, o tratamento que mostrou maior eficiência quanto à desinfestação, além de ser menos agressivo aos tecidos foliares, foi o tratamento que combinou o período de 30 minutos de imersão com a concentração de hipoclorito de cálcio a 10%, resultando em 90% de explantes sem presença de micro-organismos (Figura 5). Já nos outros tratamentos foi observada uma porcentagem maior de contaminação, chegando a apresentar 100% no tratamento que combinou o período de 15 e 30 minutos com a concentração de 5% de hipoclorito de cálcio. *As letras diferentes indicam significância, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Figura 5. Efeito das combinações de tempo de imersão e concentração de hipoclorito de cálcio na desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa Rondônia, 2012. Mateo-Sagasta (1990), afirma que no início da desinfestação dos explantes, é utilizado etanol 70% durante alguns segundos, com a finalidade de se eliminar bolhas de ar e parte dos lipídios, aumentando assim o contato do desinfestante com o material vegetal. Juntamente com etanol, o cloro é o princípio ativo mais utilizado, em geral na forma de hipoclorito de sódio que é encontrado facilmente na forma de água sanitária. O hipoclorito de cálcio é encontrado em forma de pó, necessitando dissolver e filtrá-lo. A dificuldade maior nesta etapa reside na obtenção de tecidos descontaminados sem conduzi-los à morte, quando isolados. Sendo determinantes os pré-tratamentos aplicados na planta matriz para o sucesso desta etapa do trabalho (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Segundo Leifert et al. (1991), a condição fitossanitária da planta determina a eficiência no processo de desinfestação dos explantes. Por esta razão a escolha da planta doadora e do material vegetal é importante, ao escolher explantes de folhas para a realização deste trabalho, se fez necessário o retorno ao estado meristemático, para que em seguida se promova a rediferenciação. A desdiferenciação e indução de regeneração de plantas a partir de calos são, muitas vezes, um processo difícil de ser obtido e pode demandar algum tempo de experimentação, até se obter um protocolo de micropropagação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Várias substâncias com ação germicida são utilizadas, entre elas o hipoclorito de cálcio, cloreto de mercúrio, o ácido clorídrico, o cloreto de benzalcônico, o peróxido de hidrogênio e, os mais comumente utilizados, o hipoclorito de sódio, também pode ser utilizado para a desinfestação dos explantes (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Geralmente, um surfactante como Tween 20, ou outro detergente, é adicionado à solução de hipoclorito para facilitar a sua ação, aumentando o contato da solução com os tecidos (TORRES et al., 1998). Porém, a adição deste pode, além de diminuir a contaminação, aumentar a toxicidade do hipoclorito para o tecido vegetal (CORREA, 2010). Para Hartmann et al. (2002) a desinfestação do material juvenil geralmente não é difícil, entretanto, também são utilizados explantes de material adulto ou de plantas crescidas em condição de campo. Esta apresenta dificuldades, pois a percentagem de contaminação é frequentemente alta, quando comparadas com as de explantes juvenis ou retiradas de mudas mantidas em casa-de-vegetação. A contaminação pode ser reduzida por pulverizações com inseticidas e fungicidas, envolvendo os brotos das plantas em sacos plásticos ou mantendo-os em casa de vegetação. Esta dificuldade em desinfestar o material vegetal pode ser observada neste trabalho, ao comparar os dados de concentração de 5% de hipoclorito de cálcio a 15 e 30 minutos atingiram o ponto maximo de contaminação (100%), enquanto que a concentração de 10% por 15 minutos atingiu 90% de contaminação, e a imersão de 30 minutos resultou em um melhor potencial, ao atingir 90% de explantes desinfestados. Por isso é que as concentrações das soluções desinfestantes e a combinação dos princípios ativos podem variar muito em função da sensibilidade do tecido a ser desinfestado (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Santos et al. (2011), ao testar explantes foliares de insulina vegetal (Cissus verticillata) com hipoclorito de cálcio a 1,25; 2,5; 5,0 e 10,0% e hipoclorito de sódio a 0,50; 1,0; 1,5 e 2,0%, com tempo de imersão de 30 minutos, observou que o mais eficiente foi o hipoclorito de cálcio, na concentração de 5,0%, a qual resultou em 95% de desinfestação. Porém, os resultados diferiram bastante do presente trabalho, no qual o hipoclorito de cálcio na concentração de 5% com o tempo de 30 minutos obteve uma contaminação de 100% dos explantes. O cloro, principal componente do hipoclorito, quando liberado em meio aquoso atua na inibição enzimática via desnaturação proteica e inativação de ácidos nucleicos, o que de acordo com Pasqual et al. (2002), por inativar enzimas e agir como oxidante, tem ação bactericida, porém apresenta baixa eficiência contra esporos. 5.2. INDUÇÃO DE CALOS Na tabela 2, está apresentada a análise de variância referente ao efeito dos reguladores de crescimento TDZ e 2,4-D na indução de calos em explantes foliares de A. glabra. Quanto ao desdobramento do efeito das concentrações de 2,4-D em cada concentração de TDZ, observa-se que só houve efeito significativo do 2,4-D nas concentrações de 4 e 8 mg.L-1 de TDZ (Tabela 2). Tabela 2. Análise de variância referente aos efeitos dos reguladores de crescimento TDZ e 2,4-D na calogênese em explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012. Causas de GL QM F Variação Tratamentos (15) (12,25) 72,05 ** Resíduo 48 0,17 TDZ 3 0,42 2,47 ns 2,4-D 3 18,25 107,35** TDZ X 2,4-D 9 14,19 83,50** 2,4-D (0 TDZ) 3 4,5 0,56 ns 2,4-D (2 TDZ) 3 2 0,25 ns 2,4-D (4 TDZ) 3 43,56 5,45** 2,4-D (8 TDZ) 3 46,72 5,84** CV(%) 6,48 ns: Não significativo. ** Significativo (P<0,01) Nos segmentos foliares de A. glabra L. inoculados na ausência de reguladores de crescimento não foi observada calogênese. O processo de indução de calos teve início aos 14 dias após a inoculação (Figura 6 B), sendo que os explantes apresentaram intumescimento, indicando desta forma o início do processo. Na avaliação final aos 28 dias após a inoculação, o 2,4-D apenas apresentou efeito nas concentrações de 4 e 8 mg. L-1 de TDZ sendo que, nestas concentrações, apenas foi obtido 100% de calos na ausência de 2,4-D. Considerando que estas duas concentrações de TDZ foram equivalentes em relação ao efeito calogênico, o tratamento mais simples e econômico, 4 mg.L-1 de TDZ isoladamente, pode ser indicado para a indução de calos nesta espécie. Na calogênese, os reguladores de crescimento agem sobre a expressão gênica, de forma sinérgica ou não, fazendo com que, a partir de células de tecidos organizados e diferenciados, se forme uma massa de células com características meristemáticas cujo crescimento é, geralmente, muito rápido e irregular. Neste contexto, geralmente os níveis de citocininas e auxinas promovem um balanço hormonal que pode estimular o crescimento da planta (SANTOS, 1998). Para Kerbauy (1998) o comportamento de formação de calos oriundos da parte aérea é apresentado devido a expressão morfogenética diante do sinergismo auxina e citocinas. Porém este balanço hormonal não foi significativo neste experimento, já que o TDZ resultou em 100% de calogênese quando isolado. Neste contexto, geralmente os níveis de citocininas e auxinas promovem um balanço hormonal que pode estimular o crescimento da planta. Segundo Ammirato (1993), o balanço de auxina/citocinina em alta/baixa concentração favorece o enraizamento e o balanço inverso promove a formação da parte aérea e concentrações iguais promovem a produção de calos. Corroborando com este estudo Londe (2005) relata que auxina 2,4-D, testada em explantes de cajuí (Anacardium nanum), não teve efeito significativo. Paiva et al. (2012) ao testar o potencial de regeneração em folhas das espécies A. squamosa, A. bahiensis e A. glabra in vitro, utilizaram a combinação de BAP e ANA (0,0; 0,5 e 1,0 mg.L-1) observaram que ocorreu a organogênese direta sem formação de calos. Os reguladores que se destacam na indução de calos são o 2,4-D e TDZ (LU, 1993), no qual o 2,4-D tem sido amplamente utilizado para a indução de calos (PALÚ, 2004; SANTOS, 2001; NOGUEIRA et al., 2007). Torres et al. (1998), citam que o regulador vegetal 2,4-D apresenta caráter indutor para o intumescimento e calosidade. George (1996), em estudos com murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.) verificou que explantes foliares responderam positivamente a presença de 2,4-D. As auxinas são capazes de iniciar a divisão celular e controlar os processos de crescimento e alongação celular. O 2,4-D tem efeito no metabolismo do RNA, induzindo a transcrição de RNAs mensageiros capazes de decodificar proteínas para o crescimento e que podem induzir a proliferação celular desordenada. O crescimento de tecidos vegetais organizados in vitro geralmente não é inibido pela luz. Entretanto, divisões celulares iniciais do explante e o crescimento de calo podem ser inibidos pela presença de luz (GEORGE, 1996). A indução e formação de calos pode ter sido influenciada pela ausência de luz, fato também já proposto por Nascimento et al. (2003), que trabalharam com indução de calos em carqueja Baccharis trimera (Less) DC. Por esta razão após a inoculação dos explantes, os mesmos foram mantido em câmara de crescimento sem luminosidade sob temperatura de 24±2ºC. Por ser o TDZ mais potente que outras citocininas, as concentrações requeridas são menores que das demais citocininas para se obter resultados similares de multiplicação (HUETTEMAN & PREECE, 1993). Sankhla et al. (1996), verificaram que o TDZ, utilizado em baixas concentrações, 0,1 M, foi altamente eficiente em promover a multiplicação de brotações de Albizzia julibrissin, sendo necessárias altas concentrações de benziladenina e zeatina (ZEA) para produzir efeito similar. As citocininas têm profundo efeito sobre a síntese de proteínas e sobre os tipos de proteínas feitas pela planta. Em particular, a citocinina estimula a síntese de proteínas específicas do cloroplasto que são codificadas por genes nucleares. Cavalcante (2001) cita que ao combinar o TDZ com o 2,4-D não foi observado a iniciação de calos friáveis e que as concentrações de 2 e 3 µM de TDZ isoladamente induziram as maiores frequências de indução de calos em explantes foliares de cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Willd ex Spreng) Schum). Ahroni et al. (1997), testaram as citocininas BAP, CIN, ZEA e o TDZ, e obtiveram melhores resultados com TDZ. O TDZ geralmente é mencionado como um potente indutor de calos (MURTHY et al., 1998; HUETTEMAN & PREECE, 1993). Wilhelm (1999), mencionou que concentrações mais altas dessa citocinina proporcionaram a produção de calos mais volumosos. Entretanto, Nieuwkerk & Zimmerman (1986), observaram que altas concentrações de TDZ causaram necrose em tecidos de macieira, vitrificação e crescimento anormal da folha. Salman (2002), obteve 100% de calos desenvolvidos a partir de segmentos foliares em meio suplementado com 2,4-D e BAP. Em seu estudo, a maior taxa de calos foi obtida mantendo-se a relação auxina/citocinina igual a 0,2 mg.L-1. Resultado diferente foi encontrado neste trabalho, já que as combinações de reguladores não foram tão eficazes quanto aos seus efeitos isolados. Werner et al. (2007), observaram resultados positivos quanto à formação de calos, quando usadas altas concentrações da auxina 2,4-D (5, 10, 20, 50 e 100 mg L-1). Esses resultados apontam que concentrações maiores podem ser usadas para a indução da calogênese. As auxinas são capazes de iniciar a divisão celular e controlar os processos de crescimento e alongação celular. O 2,4-D tem efeito no metabolismo do RNA, induzindo a transcrição de RNAs mensageiros capazes de decodificar proteínas para o crescimento e que podem induzir a proliferação celular desordenada (GEORGE, 1996). O uso de 2,4-D isoladamente na concentração de 6,4 mg.L-1 induziu calogênese e rizogênese em explantes foliares de moreira (Chlorophora tinctoria), produzindo calos de aspecto friável e coloração amarelada, conforme relatou Paiva Neto (1996). Resultado semelhante foi encontrado no presente trabalho com emprego isolado de 2,4D apresentando eficiente indução de calos. Para Nogueira (2003) e Soares (2003), a concentração de 1 mg.L-1 de 2,4-D é eficiente na indução de calos. Para o tipo de explante testado de A. glabra L., o TDZ foi o fitorregulador mais eficiente na desdiferenciação celular. De acordo co os resultados obtidos no presente trabalho, a concentração de 4 mg.L-1 de TDZ foi eficiente na indução de calos mesmo em explantes cultivados em meio desprovido de 2,4-D. Não foram encontrados na literatura resultados similares para espécies pertencentes ao gênero Annona. A B C D E Figura 6. Desenvolvimento dos segmentos foliares, quanto à indução de calos. Avaliação em sete dias (A); avaliação em 14 dias (B); explante com 21 dias (C) e com 28 dias de inoculação (D) e calo com mais de 28 dias (E). Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. 6. CONCLUSÕES Com as análises dos resultados pode-se afirmar que: • Nas condições em que foi realizado este trabalho a desinfestação de 90% dos explantes foliares de A. glabra é obtida com imersão em álcool 70% (v/v) por um minuto, seguida de imersão em solução de hipoclorito de cálcio a 10% (p/v) por 30 minutos. • Recomenda-se a utilização de TDZ a 4 mg.L-1 para a indução de calos em explantes foliares de A. glabra. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AHRONI, A.; ZUKER, A.; ROZEN, Y; SHEJTMAN, H; VAINSTEIN, A. An efficient method for adventitions shoot regeneration from stem-segment explants of Gypsophila. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Rehovot, v. 49, n. 2, p. 101-106, 1997. ALVES, C.; OLIVEIRA, J.R; REIS, E.S.; CORREA, R. M.; SOUZA, J.; SILVA, J.C.O.; PAULA, J.C.R.; RODRIGUES, L.H.F.; SOUZA, M.A.; MENDONÇA, M.R. A Cultura de Tecidos na Agricultura. In: Jornada Científica 1., 2012, Bambuí-MG. Anais… Bambuí-MG: CEFET, 2012. 3 p. AMMIRATO, P.G.V. Embryogenesis. In: EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; AMMIRATO, P.G.V.; YAMADA, Y. Handbook of plant cell culture. New York: MacMilam, 1993. p. 83-88. ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA. Panorama. Gazeta, 2008. 136 p. BECKER, W.D.; HOPPER, N.W.; MCMICHAEL, B.L.; JIVIDEN, G.M. Seed applied plant growth regulators effects on cotton germination, emergence and growth. In: BELTWIDE COTTON CONFERENCE, 1999, Memphis. Proceedings… Memphis: National Cotton Council, 1999. p. 625-627. BRUCKNER, C.H. Melhoramento de fruteiras de clima temperado. Viçosa: UFV, 2002. 186 p. CALDAS, I.S.; HARIDASON, P.; FERREIRA, M.E. Meios Nutritivos. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. v. 2, p. 87-132. CAVALCANTE, A.S.L. Respostas morfogenéticas in vitro de açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) e de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum (Wild. ex Spreng.) Schum.). 2001. 124 f. Tese (Doutorado em Fitotecnia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2001. CHATROU, L.W. Las Annonaceae y el proyecto Annonaceae: una breve revisión de su estado actual. In: ACTA HORTICULTURAE 497. Proceedings… International Symposium on Cherimoya: Equador, 1999. p. 51-57. CROAT, T. Flora of Barro Colorado Island. Stanford University Press: California, 1978. 943 p. CORREA, A.O. Calogênese em ápices caulinares de Bactris gasepaes H.B.K. 2010. 54 f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente) – Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2010. FACHINELLO, J.C.; NACHTIGAL, J.C.; KERSTEN, E. Fruticultura: fundamentos e práticas. Pelotas: UFPEL, 1996. 311p. FEARNSIDE, P.M. O desflorestamento na Amazônia brasileira: os índices e as causas. The Ecologist, Manaus, v. 19, n. 2, p. 214-218, 1989. FERREIRA, S.A.N.; CLEMENT, C.R. Avaliação de diferentes porta-enxertos para a gravioleira na Amazônia central. I. métodos de enxertia. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 9., 1987, Campinas. Anais... Campinas: SBF, 1988. p. 475-479. FRANÇA, S.C. Abordagens biotecnológicas para a obtenção de substâncias ativas. In: SIMÕES, C.M.O. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre; Florianópolis: UFRGS; UFSC, 2001. p. 105-124. IBRAF – Instituto Brasileiro de Frutas. Estatísticas. Disponível em http://www.ibraf.org.br, (29 abril 2008). In: BETTIOL NETO, José Emílio. Conservação de pólen de Anonas comerciais. 2008. 78 f. Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) – Instituto Agronômico, Campinas. 2008. GAMBORG, O.L.; SHYLUCK, J.P. Nutrition, media, and characteristics of plant cell tissue cultures. In: THORPE, T.A. Plants tissue culture: methods applications in agriculture. New York: Academic Press, 1981. p. 21-44. GEORGE, E.F. Plant propagation by tissue culture. Basingstoke: Exegetics, 1996. 574 p. GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. p. 87-132. GUIMARÃES, R.P. Definindo uma agenda de pesquisa sobre desenvolvimento sustentável. Brasília: Fundação Alexandre de Gusmão, 1996. 237 p. HARTMANN, H.T.; KESTER, D.E.; DAVIES, F.T. GENEVE, R.L. Plant Propagation: Principles and Practices. New Jersey: Prentice Hall, 2002. 880 p. HU, C.Y.; WANG, P.J. Meristem, shoot tip, and bud cultures. In: EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; AMMIRATO, P.V.: YAMADA, Y. Handbook of plant cell culture. New York: Macmillan, 1983. p. 177-227. HUETTEMAN, C.A.; PREECE, J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hague, v. 33, n. 2, p. 105-119, 1993. JANICK, J.; PAULL, R.E. The encyclopedia of fruits and nuts. Cabi international, 2006. 160 p. JARAMILO, J.; SUMMER, W.L. Dark: light treatments influence induction of tomato anther culture. HortScience: Etats-Unis, v. 26, p. 915-916, 1991. KAVATI, R. Embalagem e Comercialização. In: SOUZA, I.V.B.; MORAIS, O.M.; REBOUÇAS, T.N.H. Annonaceaes, Produção e Mercado. Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia: Brasil, 1997. p. 257-262, KRIKORIAN, A.D. Propagación clonal in vitro. In: ROCA, W.M.; MRROGINSKI, L.A. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos e aplicaciones. Cali: CIAT, 1991. 970 p. LANDA, F.S.L.; PAIVA, R.; PAIVA, P.D.O.; BUENO, J.S.S. Indução in vitro de calos em explantes foliares de pequizeiros (Caryocar brasiliense Camb.). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, p. 56-63, 2000. LAMAS, F.M. Estudo comparativo entre cloreto de mepiquat e cloreto de chlormequat aplicados no algodoeiro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 36, p. 265272, 2001. LATTUADA, D.S. Micropropagação e miniestaquia de pitangueira (Eugenia uniflora L.) 2010.75 f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2010. LEE, M.; PHIILLIPS, R.L. The chromosomal basis of somaclonal variation. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 39, p. 413-437, 1988. In: GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. p. 87-132. LEIFERT, C.; RITCHIE, J.Y.; WAITES, W.M. Contaminants of plant tissue and cell cultures. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 7, p. 452-469, 1991. LEITE, G.A. Porta-enxertos e métodos de enxertia na produção de mudas de atemoieira (Annona squamosa L. x Annona cherimola Mill). 2011. 68 f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, 2011. LIMA, D.; POZZOBON, J. Amazônia socioambiental: sustentabilidade ecológica e diversidade social. Estudos avançados, São Paulo, v. 19, n. 54, p. 45-76, 2005. LIMA, R.A. Aclimatização de mudas micropropagadas de café Conilon (Coffea canephora Pierre ex. Froehner). 2011. 47 f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente) - Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2011. LIRA, J.S.; BEZERRA, J.E.F.; LEDERMAN, I.E.; SILVA, J.F. Pitangueira. Recife: Liceu, 2007. 87 p. LONDE, L.N. Indução morfogenética de Anacardium humile St. Hill e análise da divergência genética entre populações. 2005. 141 f. Dissertação (Mestrado em Genética) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2005. LU, C.Y. The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, Oxon, v. 29, p. 92-96, 1993. MAAS, P.J.M; KAMER, H.M.V.; JUNIKA, L.; MELLO, R.; RAINER, H. Annonaceae from Central-eastern Brazil, v. 52, n. 80, p. 61-94, 2001. Disponível em: <http://mx1.rarefruit.org/PDF_files/AnnonnaceaefromCentraleasternBrazil.pdf>. Acesso em: 11 set. 2012. MAHDDEEN, H. Best of Annonas. Tropical Fruit World, Duranbah, v. 1, n. 4, p. 110-114, 1990. MALUF, R.S. Liberalização Comercial e os Mercados de Produtos Agroalimentares para a Agricultura Familiar. Relatório de Pesquisa, Rio de Janeiro: CPDA/UFRRJ. 2000. 23 p. MAPA. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Estatísticas. Disponível em http://www.agricultura.gov.br, (29 abril 2008). In: BETTIOL, J.E. Conservação de pólen de Annonas comerciais. 2008. 78 f. Dissertação (Mestrado em Genética, Melhoramento Vegetal e Biotecnologia) – Instituto de Agronômia, Rio de Janeiro, 2008. MATEO-SAGASTA, L.A. Cultivo in vitro de las plantas superiors. Madrid: MundiPrensa, 1990. p. 89-94. MURASHIGE, T. Plant propagation trough tissue culture. Annual Review of Plant Physiology, Palo Alto, v. 25, p. 135-627, 1974. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Cepenhagen, v. 15, p. 473-497, 1962. MURTHY, B.N.S.; MURCH, S.J.; SAXENA, P.K. Thidiazuron: a potent regulator of in vitro plant morphogenesis: In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, Oxon, v. 34, p. 267-275, 1998. NAKASONE, H.Y.; PAULL, R.E. Tropical Fruits. Crop Production Science in Horticulture: CABI, 1998. p. 45-65. NASCIMENTO, V.E.; SILVA, F.G.; PINTO, J.E.B.P.; SALES, J.F.; BERTOLUCCI, S.K.V. Efeito do explante, luz e fitorreguladores na indução de calos de carqueja. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FLORICULTURA E PLANTAS ORNAMENTAIS, 14.; CONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS, 1., 2003, Lavras. Resumos... Lavras: SBPPO, 2003. 227 p. NIEUWKERK, J.P.V.; ZIMMERMAN, R.H. Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro. HortScience, Alexandria, v. 21, n. 3, p. 516-518, 1986. NOGUEIRA, R.C. Propagação in vitro, análises anatômicas e bioquímicas de murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.). 2003, 88 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2003. NOGUEIRA, R.C.; PAIVA, R.; OLIVEIRA, L.M.; SOARES, G.A.; SOARES, F.P.; CASTRO, A.H.F.; PAIVA, P.D.O. Indução de calos em explantes foliares de muricipequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.). Ciência e Agrotecnologia, v. 31, n. 2, p. 366-370, 2007. PAIVA, R.; SANTANA, J.R.F.; LEMOS, E.E.P.; LIMA, E.C.L.; SANTIAGO, E.J.A.; SANTOS, M.B. Organogênese Direta em Folhas de Annona glabra, Annona squamosa e Annona bahiensis. Disponivel em: <http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/406309/1/643.pdf > Acesso em: 30 jul. 2012. PAIVA, V.B. Comportamento in vitro de tecido foliar e segmento nodal de moreira (Chlorophora tinctoria (L.) Gaudichaud). 1996. 33 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 1996. PALÚ, E.G.; SILVA, A.B.; PASQUAL, M. Calogênese in vitro em anteras de Coffea arabica L. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 28, n. 4, p. 736-742, 2004. PASQUAL, M.; MACIEL, A.L.R.; CAMPOS, K.P.; SANTOS, E.C.; CAMPOS, R.J.C. Indução de calos em anteras de café (Coffea arabica L.) cultivadas in vitro. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 26, n. 1, p. 71-76, 2002. PIERIK, R.L. In vitro culture of higher plants. Boston: M.N.P. 1987. 747 p. KERBAUY, G.B. Cultura de Raízes e Regeneração de Plantas. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. p. 161-182. KINPARA, D.I. Annona species, Internacional Centre of Under Utilised Crops, University of Southampton, Southampton, UK, 2005. p. 71-126. PINTO, C.A.Q.; SILVA, E.M. Graviola para exportação: aspectos técnicos da produção. Brasília: EMBRAPA-SPI, 1994. 41 p. PIRES, S.M.; TRESENS, S.G. Morfologia polínica de las Annonaceaes Del Nodeste Argentino. In: CORREA, P.G.; CHAGAS, M.G.S.; PIMENTEL, R.M.M. Caracterização morfoanatômica foliar de Annona crassiflora Mart. Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, p. 816-818, 2007. PONTES, A.F.; BARBOSA, M.R.; MAAS, P.J. M. Flora Paraibana: Annonaceae. Acta Botânica Brasileira, v. 18, n. 2. 2004. RIBEIRO, J.M.; CASTRO, J.M.C.; RESENDE, G.M.; BASTOS, D.C.; NALI, L.R. Micropropagação e aclimatização de goiabeira ‘Paluma’, Petrolina: Embrapa Semiárido, 2010. 26 p. ROSS, C.W. Hormones and growth regulators: auxins and gibberellins. In: SALISBURY, F.B.; ROSS, C.W. Plant physiology, Wadsworth, p. 357- 377, 1992. SALMAN, M.N. Establishment of callus and suspension cultures from Gypsophila paniculata leaf segments and study of the attachment of host cells by Erwinia herbicola pv. Gypsophilae. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 69, p. 189-196, 2002. SANKHLA, D.; DAVIS, T.D.; SANKHLA, N. In vitro regeneration of silktree (Albizzia julibrissin) from excised roots. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hangue, v. 44, n. 1, p. 83-86, 1996. SANTOS, B.R. Propagação in vitro e abordagem fitoquímica em salix (Salix humbolditiana Willd.). 2001. 89 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2001. SANTOS, B.R.; PAIVA, R.; MARTINOTTO, C.; NOGUEIRA, R.C.; PAIVA, P.D.O. Indução de calos friáveis em explantes foliares de Salix (Salyx humboldtiana Willd). Ciência Rural, Santa Maria, v. 35, n. 3, p. 510-514, 2005. SANTOS, M.R.A.; FERREIRA, M.G.R.; ROCHA, J.F.; CARVALHO, S.M.S. PréTratamento para o Estabelecimento in vitro de Fragmentos Foliares de Cissus verticillata (L) Nicolson & C.E.Jarvis. Saber Científico, Porto Velho, v. 3, n. 1, p. 9198, 2011. SCHUCH, M.W.; ERIG, A.C. Micropropagação de Plantas Frutíferas. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 2005. p. 155-173. SIEBRA, C.A. Atividades Biológicas de Annona glabra Linn., Annonaceae. 2007. 96 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2007. SIQUEIRA, E.R.; INOUE, M.T. Propagação vegetativa do coqueiro através da cultura de tecidos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 27, n. 4, p. 639-646, 1992. SOARES, G.A. Aspectos do cultivo in vitro do ingazeiro (Inga vera Willd. Subsp. Affinis (DC) T. D. Penn). 2003. 107 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2003. SOUZA, A.V. Propagação in vitro e aspectos anatômicos de arnica (Lychnophora pinaster) Mart. 2003. 126 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2003. SOUZA, F.V.D.; CANTO, A.M.M.E.; CARVALHO, M.A.P.; SOUZA, C.A.S.; LEDO, C.A.S. Efeito de reguladores de crescimento na obtenção in vitro de segmentos nodais de um novo híbrido de abacaxi. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MELHORAMENTO DE PLANTAS, 4., 2007, São Lourenço. Anais... Lavras: UFLA, CD-ROM, 2007. THORPE, T.A.; PAPEL, K.R. Clonal propagation: adventitious buds. In: VASIL, I. Cell culture and somatic cell genetics of plants: laboratory procdures and their applications. Orlando: Academic Press, 1984. p. 49-60. TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília, Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. 864 p. TORRES, A.C.; FERREIRA, A.T.; SÁ, F.G.; BUSO, J.A.; CALDAS, L.S.; NASCIMENTO, A.S.; BRÍGIDO, M.M.; ROMANO, E. Glossário de biotecnologia vegetal, Brasília: Embrapa Hortaliças, 2000. 128 p. TREVISAN, R.; ANTUNES, L.E.C.; GONÇALVES, E.D. Propagação de plantas frutíferas nativas. In: ESPÉCIES FRUTÍFERAS NATIVAS DO SUL DO BRASIL, 1, Pelotas, Embrapa Clima Temperado, 2004. v. 1, p. 47-69. TSURO, M. Efficient plan regeneration from multiple shoots formed in the lear-derived callus of Lavandula vera, using the “open culture system”. Scientia Horticulturae, Holanda, v. 86, p. 81-88, 2000. WERNER, E.T.; PESSOTTI, K.V.; LOPES, F.P. CUZZUOL, G.R.F. Indução de Caesalpinia echinata Lam. (Pau-Brasil) in vitro. Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, p. 1053-1055, 2007. ZOTZ, G.; TYREE, M.T.; PATINO, S. Hydraulic architecture and water relations of a flood-tolerant tropical tree, Annona glabra. Tree Physiology, Canada, v. 17, p. 359365, 1997.