ANTENOR AGUIAR SANTOS ESTRUTURA DO RIM CEFÁLICO
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ANTENOR AGUIAR SANTOS ESTRUTURA DO RIM CEFÁLICO, HEMATOLOGIA E ATIVIDADE FAGOCÍTICA DE MACRÓFAGO DO ROBALO Centropomus parallelus DE CATIVEIRO E DE VIDA LIVRE Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências. SÃO PAULO 2009 ANTENOR AGUIAR SANTOS ESTRUTURA DO RIM CEFÁLICO, HEMATOLOGIA E ATIVIDADE FAGOCÍTICA DE MACRÓFAGO DO ROBALO Centropomus parallelus DE CATIVEIRO E DE VIDA LIVRE Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Mizue Imoto Egami SÃO PAULO 2009 Santos, Antenor Aguiar Estrutura do rim cefálico, hematologia e atividade fagocítica de macrófago do robalo Centropomus parallelus de cativeiro e de vida livre. /Antenor Aguiar Santos. - - São Paulo, 2009. xii, 160f. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Morfologia e Genética. structure of the head kidney, hematology and phagocytic activity of macrophages of fat snook Centropomus parallelus, from the natural environment and raised in captivity. .1. Rim cefálico 2. Morfologia 3. Citoquímica 4. Ultra-estrutura 5. Hematatologia 6. Fagocitose 7. Centropomus parallelus. Copyright© 2009 by Antenor Aguiar Santos iii UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E GENÉTICA Chefe do Departamento: Profa. Dra. Marília de Arruda Cardoso Smith Coordenadora do Curso de Pós – Graduação em Morfologia: Profa. Dra. Janete Maria Cerutti iv ANTENOR AGUIAR SANTOS ESTRUTURA DO RIM CEFÁLICO, HEMATOLOGIA E ATIVIDADE FAGOCÍTICA DE MACRÓFAGO DO ROBALO Centropomus parallelus DE CATIVEIRO E DE VIDA LIVRE Presidente da banca: Profa. Dra. Mizue Imoto Egami BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Maria José Tavares Ranzani de Paiva Profa. Dra. Marta Maria Antoniazzi Prof. Dr. Edson de Lara Rodrigues Profa. Dra. Helena Regina Comodo Segreto Profa. Dra. Celina Tizuko Fujiyama Oshima Prof. Dr. Fábio Juliano Pacheco v “A esperança adiada faz o coração ficar doente, mas o desejo realizado enche o coração de vida.” Provérbios 13:12 vi DEDICO ESTA TESE... vii Aos meus pais Antônio (in memorian) e Matildes, que com muito amor e sabedoria me proporcionou uma educação para a eternidade. À minha esposa Renata Cristina e à minha filha Larissa pela motivação, apoio, carinho e compreensão demonstrados durante todo o período de dedicação na realização deste trabalho. viii AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. MIZUE IMOTO EGAMI, pela dedicação, paciência e plena formação acadêmica dispensada na orientação desta tese, proporcionando-me através de seu modelo de pessoa, amiga e professora o mais nobre e elevado nível de aprendizado ao longo deste convívio, o meu reconhecimento. À Dra. MARIA JOSÉ TAVARES RANZANNI DE PAIVA, do Instituto de Pesca, coorientadora desta tese, pela imensa colaboração em todas as atividades relacionadas ao processamento e análise dos parâmetros hematológicos deste trabalho e pelo apoio e estímulo pessoal, sempre constante e presente. Ao Centro Universitário Adventista de São Paulo – UNASP/SP na pessoa do Diretor de Campus Prof. Dr. Hélio Carnassale que possibilitou a conclusão deste trabalho, promovendo tempo livre e contribuindo com encargo financeiro para o desenvolvimento e conclusão deste trabalho. Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Smith, coordenador do curso de Pós-Graduação em Morfologia, pela oportunidade, estímulo científico e apoio logístico. Ao Prof. Dr. Edson de Lara Rodrigues, do Instituto Brasileiro de Pós Graduação e Educação Continuada, grande amigo, que desde muitos anos, tem me incentivado a trilhar por este caminho apaixonante que é a ciência. À Profa. Dra. Marta Maria Antoniazzi, chefe do Laboratório de Biologia Celular do Instituto Butantan, pela dedicação e constante orientação no processamento e manuseio do Microscópio Eletrônico. Aos colegas e amigos da Pós-Graduação, Marcelo, Fábio e Sandaly pela amizade e oportunidade de convívio, em especial Robson e Wémeson pela colaboração na realização deste trabalho. ix Aos professores da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural da UNIFESPEPM, pelo apoio concedido. Aos técnicos e funcionários das Disciplinas de Histologia e Biologia Estrutural e Anatomia Patológica, pela boa vontade com que colaboraram quando solicitados. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro no desenvolvimento deste estudo. “Que o Senhor os abençoe e os guarde; que o Senhor os trate com bondade e misericórdia; que o Senhor olhe para vocês com amor e lhes dê a paz.” Números 6: 24-26 x Sumário Dedicatória ..................................................................................................................... vi Agradecimentos .............................................................................................................viii Resumo .......................................................................................................................... xi Prefácio ........................................................................................................................... 1 1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 3 1.1 Objetivos .................................................................................................................... 6 2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 7 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 18 4 ARTIGOS ................................................................................................................... 40 4.1 Caracterização morfo-citoquímica, imunohistoquímica e ultra-estrutural do rim cefálico do robalo peva Centropomus parallelus............................................................ 41 4.2 Parâmetros hematológicos e atividade fagocítica em robalo (Centropomus parallelus): variação sazonal, sexo e maturação gonadal.............................................. 77 4.3 Parâmetros hematológicos e atividade fagocítica em robalo (Centropomus parallelus) criados em cativeiro............................................................ ........................ 129 5 CONCLUSÃO ........................................................................................................... 153 6 ANEXOS ................................................................................................................... 155 Abstract Bibliografia Consultada xi Resumo Objetivos: Caracterizar os aspectos gerais do rim cefálico (RC) e estabelecer valores hematológicos e da atividade fagocítica de macrófagos peritoneais do robalo peva, de ambiente natural e em cativeiro relacionando sexo, estádio de maturação gonadal e ciclo sazonal. Métodos: Foram utilizados 119 animais de ambiente natural e 135 mantidos em tanques-rede para as determinações de: número de eritrócitos (Er), hematócrito (Ht), hemoglobina (Hb), volume corpuscular médio (VCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), contagens total e diferencial de leucócitos (Lc) e de trombócitos (Tr). A capacidade fagocítica (CF) e o índice fagocítico (IF) foram determinados após inoculação de S. cerevisiae na cavidade peritoneal. Do total de animais utilizados, dez foram sacrificados e fragmentos de RC foram utilizados para: a realização de decalques, coloração pelo Rosenfeld e citoquímica. Secções do RC foram submetidas aos métodos: HE, Tricrômio N.M.C, Gomori, PAS e imunohistoquímica. Seis amostras de RC foram processadas para ultra-estrutura. Resultados: O RC apresenta uma delgada cápsula de onde partem trabéculas que se dirigem para o interior do órgão. No parênquima, é possível evidenciar agregados de células linfóides com linfócitos imunopositivos e negativos para CDRO45, respectivamente linfócitos T e B. Entre as células que constituem esses agregados foram observados macrófagos, monócitos e seus precursores imunopositivos para CD68, células da linhagem granulocítica positivas para lisozima e PAS. Ultraestruturalmente o RC apresenta um estroma retículo-endotelial constituído por células endoteliais, reticulares e um parênquima constituído por células das séries eritrocítica, granulocítica, linfocítica, monocítica e trombocítica. A análise hematológica e da atividade fagocítica de animais de vida livre mostrou as seguintes diferenças significantes: a) valores de Er, em fêmeas, elevados no estádio em maturação e diminuídos no esgotado; b) em machos Ht e Hb elevados na primavera e baixos no inverno; c) em ambos os sexos VCM altos na primavera e verão e baixos no outono; d) em fêmeas, Tr elevados no outono e baixos nas demais estações; e) em ambos os sexos CF e IF elevados no verão e baixos no inverno. Estes mesmos parâmetros analisados em robalos criados em cativeiro mostraram diferenças significantes: a) os valores hematológicos em machos superiores àqueles em fêmeas; b) os valores de Er, Ht e Hb elevados em machos no estádio maduro e diminuídos no estádio repouso; c) ambos os sexos mostraram Ht e Hb baixos no inverno e altos nas demais estações; VCM altos no verão e baixos no inverno e outono; Lc e Tr baixos na primavera e elevados no outono; linfócitos baixos no inverno e verão e elevados na primavera; d) CF e IF elevados no verão e baixos no inverno e outono. Conclusões: O RC é um órgão fundamentalmente hematopoiético semelhante à medula óssea de mamíferos; a primavera e verão correspondem às estações de melhor resposta hematológica e fagocítica para a sobrevivência do robalo em seu habitat natural; os valores eritrocitários em machos aumentam com o avanço da maturação gonadal e que o inverno corresponde à estação do ano menos favorável à resposta hematológica e fagocítica para a sobrevivência do robalo criado em cativeiro. xii 1 PREFÁCIO 2 PREFÁCIO Esta tese está sendo apresentada sob forma de três artigos intitulados: "Hematological parameters and phagocytic activity in fat snook (Centropomus parallelus): seasonal variation, sex and gonadal maturation”, aceito para publicação na revista “Aquaculture” em maio de 2009 - no prelo. “Morpho-cytochemical, immunohistochemical and ultrastructural characterization of the head kidney of fat snook, Centropomus parallelus” e “Hematological parameters and phagocytic activity in fat snook (Centropomus parallelus) bred in captivity”, ambos submetidos à apreciação pela revista “Journal of Fish Biology” em junho de 2009. As versões originais dos artigos acima referidos em inglês e português foram incorporadas na íntegra no corpo desta tese. Precedendo esses artigos foi introduzida uma revisão da literatura específica que irá justificar os principais tópicos escolhidos como objetivos, ressaltando a importância desta pesquisa. 3 INTRODUÇÃO 4 1 INTRODUÇÃO A crescente demanda de proteína animal de qualidade para consumo alimentar determina a necessidade da utilização de fontes alternativas de produção, destacandose a aqüicultura como atividade promissora para este fim. A piscicultura, neste contexto, contribui com praticamente metade da produção global da aqüicultura (FAO 1999). No Brasil, a maioria dos estudos referentes à piscicultura estão voltados para peixes de água doce, o que permitiu a crescente importância da piscicultura continental. Entretanto o mesmo não ocorre em relação à piscicultura marinha, sendo relativamente recente o esforço para obtenção de dados que permitam a adequada orientação na produção comercial. Dentre as inúmeras espécies de peixes marinhos nativos existentes no Brasil, uma das que se destaca é o robalo peva, Centropomus parallelus, por apresentar potencial elevado para o cultivo, em razão de fatores, como a boa qualidade de sua carne, pelo seu elevado potencial comercial e altíssimo consumo como fonte alimentar. Além do mais, essa espécie apresenta muitos aspectos biológicos favoráveis à aqüicultura: é um peixe eurihalino, estuarino-dependente, tem hábitos gregários, é tolerante a altas densidades, resistente a água eutrofizada, apresenta crescimento rápido, eficiente na conversão alimentar em biomassa e resistente a doenças (Tucker 1998, Cerqueira & Tsuzuki 2009). No Brasil, o C. parallelus é uma das poucas espécies de peixes marinhos que já se detém maiores informações sobre sua tecnologia produtiva. Estudos relacionados à biologia reprodutiva e ao desenvolvimento ou cultivo desse animal, vem sendo conduzido em várias regiões do país desde a década de 90 (Cerqueira & Bernardini 1991, Temple et al. 2004, Alves et al. 2006, Tsuzuki et al. 2007, Cerqueira & Tsuzuki 2009). No entanto, ainda faltam dados que aportem os conhecimentos biológicos básicos necessários ao seu cultivo ideal, como por exemplo, não foram encontrados estudos relacionados aos aspectos morfo-funcionais do rim cefálico e também aos aspectos hematológicos e aos mecanismos de resistência natural bem como do sistema imune deste animal. O estudo quantitativo dos componentes sanguíneos, bem como dos aspectos funcionais das células envolvidas nos mecanismos de defesa, se 5 torna extremamente integrado quando em conjunto se analisam também as células dos órgãos hematopoiéticos. Neste contexto, fornecer informações detalhadas sobre os aspectos anteriormente mencionados pode contribuir na avaliação da resistência contra doenças infecciosas, principalmente em épocas em que o animal se encontra imunocomprometido (épocas frias do ano, período de pós-desova, estresse, etc.) e com isso possibilitar, provavelmente, o aumento da taxa de sobrevivência, diminuir o período e o custo necessário para o cultivo e também auxiliar no controle da manutenção desta espécie em seu habitat natural (Larsson et al. 1976, Folmar 1993, Lusková 1998). Considerando-se, portanto, a relevância econômica e comercial do Centropomus parallelus, bem como a ausência de qualquer parâmetro que pudesse ser utilizado para avaliar seu estado de higidez, buscou-se estudar os aspectos gerais do rim cefálico, os parâmetros hematológicos e de defesa pela avaliação da atividade fagocítica de macrófagos peritoneais desse animal, proveniente do ambiente natural e em cativeiro, subsidiar futuros trabalhos de criação ou preservação desta espécie na natureza e em tanques experimentais e/ou viveiros de produção e contribuir com o estudo da Hematologia Comparada de Vertebrados Brasileiros, uma das linhas de pesquisas do atual Curso de Pós-Graduação em Morfologia da UNIFESP/EPM. Dentro dessa linha já foram estudadas células sangüíneas de algumas espécies de vertebrados incluindo as das Classes Pisce (Pacheco et al. 2002, Veiga et al. 2000 e 2002, Ueda et al. 1997, Carvalho 2003); Amphibia (Sasso & Egami 1986, Gutierre et al. 2008); Reptilia (Egami et al. 1997, Oliveira et al. 1998 (a), Oliveira et al.1998 (b), Moura et al. 1999, Moura et al. 2005, Carvalho et al. 2006); ave (Santos 2003a,b) e Mammalia (Heijden 2000). 6 1.1 OBJETIVOS Face ao exposto, propomo-nos: 1. Caracterizar a localização anatômica, alguns aspectos estruturais, histoquímicos, imuno-histoquímicos e ultra-estruturais do rim cefálico do robalo peva Centropomus parallelus. 2. Estabelecer valores hematológicos e determinar a atividade fagocítica de macrófagos peritoneais de C. parallelus proveniente de vida livre e em cativeiro. 3. Analisar a possível influência do sexo, estádio de maturação gonadal e sazonalidade sobre os parâmetros hematológicos e atividade fagocítica de macrófagos peritoneais de C. parallelus de vida livre e em cativeiro. 7 REVISÃO DA LITERATURA 8 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Robalo A família Centropomidae engloba espécies de grande valor comercial que vivem em águas tropicais e subtropicais, costeira, estuarina, lagunar e até doce. Nos oceanos Pacífico, Índico e no mar Mediterrâneo encontram-se as espécies da subfamília Latinae. Dentro dessa subfamília, a perca-do-Nilo, Lates niloticus, e o barramundi, Lates calcacifer, têm grande importância na pesca comercial e recreativa e são hoje intensamente cultivados e exportados da Ásia e da África para outros países (Tucker Jr. 1998). Nas Américas, a subfamília Centropominae é representada por doze espécies do gênero Centropomus. Seis espécies estão distribuídas na costa pacíficoamericana (C. medius, C. nigrescens, C. viridis, C. unionensis, C. robalito e C. armatus) e seis na costa atlântico-americana (C. undecimalis, C. parallelus, C. mexicanus, C. ensiferus, C. pectinatus e C. poeyi) (Rivas 1986). A distribuição da subfamília Centropominae coincide, aproximadamente, com a dos ecossistemas de manguezal, seu principal habitat (Marshall, 1958; Gilmore et al. 1983). As espécies são simpátricas, podendo ocorrer juntas numa mesma localidade, mas em proporções variáveis (Rivas 1962). O limite sul de distribuição dos robalos é o litoral sul do Brasil, sendo registrada a ocorrência de apenas duas espécies nesta região, a saber, C. undecimalis e C. parallelus (Figura 1) (Figueiredo & Meneses 1980). O gênero Centropomus é encontrado na plataforma continental das Zonas Tropical e Subtropical do Atlântico e do Pacífico, em ambos os lados do continente americano. Tendo em vista o propósito de padronizar sua nomenclatura, as espécies componentes desse gênero são conhecidas como robalo ou camorim em português, snook em inglês, robalo em espanhol e brochet ou loubine em francês. Das seis espécies de robalo encontradas no Oceano Atlântico, quatro são capturadas no litoral do Brasil, dentre as quais se destaca o robalo-peva, C. parallelus, que ocorre desde a Flórida (EUA) até Florianópolis – Brasil, segundo Gilmore et al. (1983) e Rivas (1986). O robalo-peva se caracteriza por apresentar dorso cinzaesverdeado e flancos prateados (Carvalho-Filho 1992). 9 Figura 1 – Foto do robalo peva Centropomus parallelus. As diferentes espécies de robalo são muito semelhantes, podendo-se basear em duas ou três características para distinguí-las (Nichols 1922, Menezes 1976, Cervigón, 1966). No caso de C. parallelus o segundo espinho da nadadeira anal ultrapassa o terceiro espinho, mas não ultrapassa em outros Centropomídeos; (b) o comprimento padrão de outros Centropomídeos é de 3,6 vezes maior do que a altura máxima do corpo em C. parallelus; (c) a parte dorsal do corpo de outros Centropomideos é menos escura, a linha lateral é menos pigmentada e apresenta menor contraste em relação ao colorido geral do corpo em C. parallelus. O Brasil é um dos maiores produtores de centropomídeos, seguido pelo México, sendo que os dois países juntos representam mais de 70% das capturas. Quanto ao total capturado nos últimos 10 anos, ocorreu um incremento significativo em 2002, mas, a partir daí ocorreram pequenas oscilações nas capturas, chegando a 19.405 t em 2005. No Brasil, a captura do robalo se manteve relativamente estável entre 1997 e 2007, atingindo cerca de 5.000 t em 2003, sendo que a maior parte das capturas provém da pesca artesanal (FAO 2007). Sobre os centropomídeos encontramos na literatura trabalhos relacionados a caracterização genética ou sistemática (Rivas 1986, Tringali & Bert 1996, Wilson et al. 1997, Tringali et al. 1999); determinação de idade (Blake & Blake 1981); infestações por parasitas (Bravo-Hollis 1985, Kraxberger-Beatty et al. 1990, Landsberg 1993, Landsberg 1994); fisiologia (Peterson & Gilmore Jr. 1988, Pérez-Pinzón & Lutz 1991, Peterson & Gilmore Jr. 1991, Ramirez & Cerqueira 1994; Bórquez & Cerqueira 1998, Tolley & Peebles 1998); aspectos relacionados à sua reprodução, hábito alimentar e desenvolvimento ou cultivo (Brugger & Freutas 1993, Luczkovich et al. 1995, Nonell 1995, Grier & Taylor 1998, Peters et al. 1998, Taylor et al. 1998, Roberts et al. 1999) e 10 sua ocorrência e abundância populacional (Couto & Guedes 1981, Balart et al. 1992, Graça-Lopes et al. 1993, Teixeira 1997, Johnson et al. 1999). Apesar da importância e do grande interesse voltado para esta espécie, dado ao número e enfoque dos trabalhos acima, ainda não foram encontrados trabalhos tratando dos aspectos morfo-funcionais do rim cefálico, órgão relacionado às defesas celulares e imuno-celulares. 2.2 Rim cefálico O rim em peixes ocupa uma posição dorsal retroperitoneal ao longo de todo o comprimento da cavidade peritoneal, relacionando-se posteriormente às vértebras, lateralmente às costelas e ventralmente a bexiga natatória (Anderson et al. 1975). O rim em peixes teleósteos consiste de três segmentos com características morfofuncionais distintas: o rim cefálico, cranial, anterior ou pronefro, o rim médio, posterior ou mesonefro e o rim caudal ou metanefro. O rim cefálico e médio possuem capacidade hematopoiética, porém o rim cefálico representa o compartimento de maior atividade. Em alguns peixes são observados no rim cefálico a presença de néfrons e ductos, estruturas responsáveis pela filtração (Safer et al. 1982, Prodocimo & Freire 2003), enquanto em outros estas estruturas estão restritas somente ao rim médio e caudal (Weinreb 1963, Cannon et al. 1980, Zuasti & Ferrer, 1988). A forma do rim cefálico varia entre os teleósteos – na maioria dos peixes este órgão apresenta duas porções separadas, isto é bilobulado, enquanto em salmonídeos o rim cefálico se apresenta como um órgão não lobulado (Fange 1986, Press & Even 1999). O rim cefálico apresenta uma arquitetura que sugere sua função como órgão gerador de células sanguíneas e provedor de unidades formadoras de colônia (Bielek 1981, Fanger 1982, Petrie-Hanson e Ainswortho 2000), chegando a ser considerado análogo à medula óssea de mamíferos (Meseguer et al. 1991, 1995). Além do mais, o rim cefálico é considerado também como o principal órgão linfóide (Sailendri & Muthukkaruppan 1975, Romano et al. 1997, Press & Evensen 1999), portanto, responsável pela produção de linfócitos B (Romano et al. 1997), de macrófagos (Braun- 11 Nesje et al. 1981, Meseguer et al. 1991), atuando como sítio de captura e processamento de substâncias e partículas estranhas (Lamaers & Haas 1985, Press & Evensen 1999) e também de produção de imunoglobulinas (Chiller et al. 1969, Smith et al. 1970, Press & Evensen 1999). Estruturalmente o rim cefálico tem sido descrito como um órgão revestido por tecido conjuntivo, com parênquima constituído principalmente por tecido linfóide disperso entre extensa rede de capilares sinusóides e grandes vasos e sustentado por rede citofibrilar estromal (MacArthur et al. 1983, Smith et al. 1970, Zapata 1983, Tatner & Manning 1985, Mesenguer et al. 1991, Mesenguer et al. 1995, Petrie-Hanson & Peterman 2005). Em diferentes espécies de peixes o estroma é também chamado de estroma retículo-endotelial sendo composto por células endoteliais que constituem os capilares sinusóides, células adventiciais que recobrem a superfície abluminal das células endoteliais e células reticulares que sintetizam fibras reticulares e realizam fagocitose (Meseguer et al. 1991, 1995, Press & Evensen 1999, Romano et al. 2002). O estroma, constituído por células e fibras, além de sustentar as células hematopoiéticas, também participa na imunidade inespecífica e na remoção de debris e restos celulares (Dannevig et al. 1994, Brattgjerd & Evensen 1996). No rim cefálico alguns autores observaram a existência de aglomerados de células contendo grânulos de melanina, os quais foram chamados centros melanomacrófagos (Ellis et al. 1976, Rowley et al. 1988). Segundo Zuasti et al. (1998) os melano-macrófagos se diferenciam de macrófagos por apresentar conteúdo pigmentar intracelular e por possuir capacidade melanogênica. Geralmente os centros melanomacrofágicos apresentam arranjo nodular envolvidos por uma delicada cápsula constituída por fibras colágenas e se localizam próximos aos vasos sanguíneos (Agius & Roberts 2003). O tamanho, número e grau de pigmentação destes centros sofrem grande variação que está relacionada a diferentes fatores ou processo tais como idade, estado nutricional, regeneração tecidual, metabolização da hemoglobina e ferro, processos patológicos, condições imunológicas, incluíndo captura de antígeno (Agius & Roberts 1981, Agius 1983, Agius & Agbede 1984, Fulop & McMillan 1984, Vogelbein et al. 1987, Kranz & Gercken 1987). Estes aspectos têm despertado interesse em estudar esses centros visto que os mesmos constituem bons bioindicadores de contaminação e atuam em inúmeras funções de resposta imunológica, em especial a fagocitose (Agius & Roberts 2003). 12 Além destes tipos celulares, mencionados anteriomente, o rim cefálico apresenta grande quantidade de células precursoras das séries eritrocítica, granulocítica, linfocítica, monocítica e trombocítica, agregados de células linfóides, com presença de monócitos/macrófagos e granulócitos, concentrados ao redor dos vasos sangüíneos e também células endócrinas (células interrenais e cromafins) localizadas próximas à parede da veia portal cardinal (Agius 1980, Press et al. 1994, Romano et al. 1997). Há um consenso entre os pesquisadores em afirmar que o rim cefálico é, sobretudo, fundamentalmente um órgão hematopoiético (Zuasti & Ferrer 1988, Zuasti & Ferrer 1989, Esteban et al. 1989, Meseguer et al. 1990, Sayed & Safer 1992, Fijan 2002, Petrie-Hanson & Peterman 2005). Sendo assim, o rim cefálico mostra elevada celularidade, onde as células arranjadas compactadamente dificultam o estudo de cada tipo celular isoladamente. Nesse sentido, alguns pesquisadores estudaram o rim cefálico na tentativa de classificar os diferentes tipos e estágios de maturação dos eritrócitos, granulócitos, linfócitos, monócitos e trombócitos, além de caracterizar a localização topografia dos leucócitos do parênquima deste órgão. Desta forma, Fijan (2002a) analisou a morfogênese das células sanguíneas do bagre de canal Ictalurus punctatus, utilizando métodos morfo-citoquímicos em decalques de rim cefálico para classificar os tipos e as fases de maturação dos eritrócitos e leucócitos. No mesmo ano, Fijan (2002b) observou que em decalques do rim cefálico de Ictalurus punctatus, as células linfóides representam mais de 90% da população total das células contadas, seguidas pelas células das séries granulocítica, trombocítica, eritrocítica e monocítica. Sorensen et al. (1997) afirmaram não ser possível distinguir com segurança os tipos de leucócitos do rim cefálico em Gadus morhua à luz da microscopia utilizando-se os métodos histoquímicos enzimáticos como a mieloperoxidase, fosfatase alcalina e esterase não-específica. Petrie-Hanson & Peterman (2005) verificaram que mesmo estudando os leucócitos através de métodos histoquímicos enzimáticos associados aos métodos histológicos não seria possível caracterizar a morfologia e a distribuição topográfica dos leucócitos neste órgão. No entanto, o estudo destes aspectos é fundamental para a compreensão do significado funcional destas células na resposta imune em peixes. Contudo, os recursos disponíveis para a caracterização de moléculas de superfície celular imunologicamente relevantes neste tecido são limitados. A utilização de marcadores específicos de superfície celular que reagem com anticorpos monoclonais na identificação de leucócitos seria um dos poucos recursos 13 que melhor identificaria e localizaria estas células nos tecidos linfomielóides em peixes. No entanto existem poucos anticorpos monoclonais disponíveis que permitem reconhecer subpopulações de leucócitos (granulócitos, linfócitos, células NK e monócitos) e trombócitos no sangue periférico e nos tecidos hematopoiéticos dos peixes (Miller et al. 1987, Abelli et al. 1996, Kuroda et al. 2000, Köllner et al. 2002, Köllner et al. 2004, Fischer et al. 2006, Fischer & Koellner 2007, Romano et al. 2007). Por exemplo, Brodersen et al (1998) e Fischer & Koellner (2007) testaram respectivamente, 213 e 382 anticorpos monoclonais anti-humano em truta Onchorhynchus mykiss, na tentativa de identificar novos anticorpos monoclonais que pudessem reagir com antígenos (CD) de superfície de leucócitos do sangue periférico em peixes. Os autores constataram que somente os anticorpos monoclonais antiCD14, anti-CD60, anti-CD20, CDRO45 e anti-IgG2a reagiram claramente com os antígenos (CD) de superfície de leucócitos em truta. No entanto, considerando-se o elevado custo para produzir novos anticorpos monoclonais específicos para antígenos de superfície de leucócitos em peixes e levando-se em conta os escassos recursos disponíveis na imunologia veterinária, o estudo da reação cruzada utilizando-se anticorpos monoclonais anti-humano representa, portanto, um excelente método alternativo para a caracterização de leucócitos em espécies menos caracterizadas (Saalmüller & Aasted 2007). Considerando-se agora os estudos vinculados aos aspectos ultra-estruturais do rim cefálico devem ser destacados os trabalhos de Sekhon & Beams (1969) que estudaram o desenvolvimento dos eritrócitos e trombócitos em truta Onchorhynchus mykiss. Smith et al. (1970) estudaram a linfopoiése, plasmocitopoiése e eritropoiése em Cyprinus carpio; Zapata (1979), caracterizou o estroma hematopoiético em peixes teleósteos, Daimon et al. (1979) estudaram o aspecto tridimensional do sistema canalicular conectado a superfície de trombócitos em carpa Cyprinus carpio; Zapata (1981) caracterizou o tecido linfóide renal em Rutilus rutilus and Gobio gobio; Zapata et al. (1984) identificaram pela primeira vez a presença de plasmócito em Myxine glutinosa; Daimon et al. (1985) detectaram o local e a distribuição da atividade da peroxidase dos trombócitos em carpa Cyprinus carpio e lampreia Entosphenus japonicus; Zuasti & Ferrer (1988) estudaram especialmente a granulopoiése em Sparus auratus; Esteban et al. (1989) estudaram a eritropoiése e trombopoiése em Dicentrarchus labrax L.; Meseguer et al. (1991) e (1995) que estudaram o estroma reticulo-endotelial, macrófagos e células linfóides em Dicentrarchus labrax L.; 14 Meseguer et al. (1994) estudaram os centros melano-macrofágicos em dois teleósteos marinhos Sparus aurata e Dicentrarchus labrax. Considerando-se ainda que Ribeiro (1978), Jeney & Jeney (1982) e RanzaniPaiva (1995) observaram frequentemente a presença de eritroblastos e granuloblastos no sangue periférico em peixes teleósteos, o conhecimento dos aspectos morfocitoquímicos e ultra-estruturais dos diferentes tipos e estágios de maturação dos eritrócitos, leucócitos e trombócitos se torna fundamental para a correta análise qualitativa e quantitativa das células sanguíneas nesses peixes. 2.3 Hematologia Para se conhecer a biologia e fisiologia de uma espécie de peixe é necessária à análise com frequência do sangue através de seus valores de referência (número de eritrócitos, hematócrito, concentração de hemoglobina, cálculo do VCM, HCM e CHCM, contagem total e diferencial de leucócitos e contagem de trombócitos), pois estes podem sofrer variações frente a condições endógenas, tais como, sexo, estádio de maturação gonadal, idade, peso e comprimento, estado nutricional, doenças e atividade muscular; ou frente a condições exógenas, como, temperatura, concentração de O2 e CO2 dissolvidos, ciclo sazonal, fotoperíodo, salinidade, estresse e poluentes (Enomoto 1969, Mahajan et al. 1979, Ranzani-Paiva & Godinho 1983, Ranzani-Paiva 1987, 1988, 1989, 1991, 1995a,b; Ranzani-Paiva et al. 2001, 2003, Cazenave at al. 2005; Velenzuela et al. 2006, Velenzuela et al. 2007). Essa variação dos valores hematológicos é observada tanto entre espécies de peixes diferentes quanto entre peixes da mesma espécie (Ranzani-Paiva 1995). Esse fato pode se tornar ainda mais grave, quando considerado os procedimentos laboratoriais empregados na obtenção do sangue tais como a forma e o local de colheita de sangue, o uso de anticoagulante, o uso ou não de anestésico e o tempo decorrido entre a colheita do sangue e as análises (Korcock et al. 1988, Allen 1993, Hogasen 1995, Coffigny & Pérez 2003). Nesse sentido, torna-se de grande importância a determinação dos parâmetros hematológicos das espécies de peixes levando-se em consideração os diferentes fatores que podem influenciar quantitativa e qualitativamente nos elementos figurados do sangue. 15 Dentre os diversos fatores acima mencionados a variação sazonal da temparatura, talvez seja um dos fatores que exerce maior influência nas atividades metabólicas e fisiológicas em peixes. Além do mais, as variações térmicas desafiam os mecanismos próprios de sobrevivência ou de aclimatação principalmente no inverno, quando a resposta imune específica destes animais sofre supressão e como conseqüência esses animais se tornam amplamente susceptíveis a patógenos oportunistas (Hrubec et al. 1997 e 2001, Mann & Huang 2000). Sabe-se que os parâmetros hematológicos relacionados aos fatores referidos anteriormente estão bem determinados para espécies de peixes economicamente importantes, tais como, truta arco-íris (Forero 1995), carpa (Imagawa et al. 1989) e tilápia (Doggett et al. 1987, Ueda et al. 1997). Entretanto, para espécies silvestres a literatura é ainda bastante escassa. Neste contexto, as pesquisas do quadro sanguíneo em peixes marinhos brasileiros são escassas. Dentre os poucos estudos disponíveis na literatura consultada destacam-se aqueles de Soares (1965) que estabeleceu alguns parâmetros hematológicos em Mugil curema; Bastos (1966) que caracterizou valores da série eritrocítica em Scomberomorus maculatus; Pitombeiras et al. (1968, 1969, 1970, 1976) que determinaram um perfil hematológico respectivamente em Opisthonema oglinum, M. curema, Mugil incilis e Scomberomorus cavalla; Pitombeira & Martins (1971) que investigaram a fragilidade osmótica dos eritrócitos sanguíneos em S. maculatus; Facchini (1987) que realizou um estudo comparativo dos aspectos hematológicos entre Mugil liza e M. curema; Lopes et al. (1995) que estudaram a morfologia de eritrócitos e eritroblastos policromatófilos em Phaeroides testudineus; Ranzani-Paiva (1995) que analisou os parâmetros hematológicos separadamente por sexo e estádio de maturação gonadal em Mugil platanus; Ranzani-Paiva & Ishikawa (1996) que estudaram os aspectos hematológicos em M. platanus criados em água doce e provenientes do ambiente natural; Ranzani-Paiva et al. (1997) que relacionaram as características hematológicas com parasitismos em M. platanus; Ranzani-Paiva & Tavares-Dias (2002) que estudaram o eritrograma, a relação viscerosomática, hepatosomática, esplenosomática e viscerohepatossomática em Mugil platanus; Pacheco et al. (2002) que estudaram os aspectos estruturais e ultra-estruturais de granulócitos do órgão epigonal e de granulócitos e trombócitos do sangue periférico em Rhizoprionodon lalandii e Napoleão (2007) fque analisou os parâmetros hematológicos, bioquímicos e hormonais em Ginglymostoma cirratum. 16 2.4 Fagocitose Considerando-se particularmente os aspectos relativos ao sistema imunológico dos peixes, pode-se afirmar que o mesmo é bem desenvolvido e, em vários aspectos, comparável ao do ser humano. Assim, como nos mamíferos superiores pode-se observar ambas as respostas imunes, específica e não-específica. Porém a mais importante diferença entre os vertebrados superiores e os peixes é a ausência de linfonodos e a presença do rim cefálico ou pronéfrico análogo à medula óssea (Catton 1951, Bielek 1981). Em peixes, dentre as células sangüíneas, os monócitos-macrófagos apresentam importância fundamental na defesa, pois participam em praticamente todas as reações imunes contra doenças e agressões (Zelikoff et al. 1991). Participam também de uma ampla variedade de funções atuando como células efetoras, auxiliadoras e supressoras, tais como no processo inflamatório, tanto na fase aguda quanto na crônica (Rowley & Ratcliff 1998). Vários autores observaram a migração de monócitos para as áreas de inflamação aguda e sua participação ativa fagocitando invasores (Finn & Nielsen 1971a,b, MacArthur et al. 1984, Rowley & Ratcliff 1998). A fagocitose por monócitos-macrófagos nos peixes foi evidenciada tanto por estudos “in vivo” (Ellis 1977, Morrow & Pulsford 1980, Bodammer 1986, Rowley & Ratcliff 1998) quanto “in vitro” (Oliver et al. 1986, Secombes 1986, Rowley & Ratcliff 1998). Além do mais os macrófagos atuam decisivamente como célula acessória da resposta imune específica, especialmente no reconhecimento, processamento e aprasentação de antígenos (Che et al. 1998). Por esta ampla diversidade de funções os macrófagos têm sido considerados, nos peixes, como o tipo celular mais eficiente na fagocitose de patógenos e restos celulares resultantes do processo inflamatório e de outros tipos de processos degenerativos (Bodamer & Robohm 1996, Silva et al. 2002). Muitos dos trabalhos tratando de fagocitose em peixes têm sido dedicados aos fagócitos macrófagos da cavidade peritoneal, o que se constituiu em um importante modelo experimental para compreensão dos fenômenos imunológicos (Afonson et al. 1997, Silva et al. 2002, Veiga 2005). A aplicação deste conhecimento contribui para a formulação no tratamento de infecções que afetam planteis de criação de peixes, 17 porém se faz necessário o prévio conhecimento detalhado das características e capacidade fagocítica dos macrófagos da cavidade peritoneal não infectada. Dentre as inúmeras formas que podem ser utilizadas para a avaliação do mecanismo de fagocitose, as variáveis mais diretas, simples e amplamente utilizadas são a contagem do número de macrófagos que realizaram fagocitose e a determinação do número de agentes estranhos fagocitados por cada macrófago. A primeira destas variáveis, chamada de Capacidade Fagocítica, foi avaliada por Suzuki 1986, Chilmonczyk & Monge 1999, Polônio et al. 2000, Langston et al. 2002, Veiga 2005. A segunda de Índice Fagocítico, que foi estudado por Thuvander et al. 1987, Ortno et al. 2000, Langston et al. 2002, Veiga 2005. O padrão da Capacidade e do Índice fagocíticos dos macrófagos em uma determinada espécie de peixe pode ser utilizado como um indicador da higidez ou pode expressar o grau de alteração sofrida pelos animais (Pulsford et al. 1984, Blazer et al. 1987, Blazer 1991). Desta forma, vários trabalhos foram conduzidos buscando avaliar os diferentes fatores e substâncias diversas que alteram a capacidade fagocítica, tais como hidrocarbonetos (Walczark et al. 1987), temperatura (Ainsworth et al. 1991, Collazos et al. 1995a, Le Morvan et al. 1998, Langston et al 2002, Nikoskelainen et al. 2004), salinidade (Narnaware et al. 2000), sazonalidade (Collazos et al. 1995b, Bowden et al. 2007), beta-endorfina (Watanuki et al. 1999), infecção viral e bacteríana (Ellis 2001), infecção parasitária (Jones 2001), imunoestimulantes (Mulero et al. 1998, Sealey & Gatlin 2002, Peddie et al. 2002), medicamentos (Lundén et al. 2002). Além do estudo do processo inflamatório de ocorrência natural ou induzido, diversos ensaios in vitro foram realizados em diferentes espécies de peixes, para verificar a atividade fagocítica de macrófagos (Oliver et al. 1986, Bennani et al. 1995). Um dos modelos utilizados com sucesso é a estimulação da atividade fagocítica pela injeção de leveduras, o que acarreta aumento da fagocitose por macrófagos. Estudos indicam que este aumento ocorre via receptor específico, graças à presença de glucan, que é um antígeno fraco para vertebrados, porém é um potente estimulador das defesas não especificas em peixes (Iwama et al. 1986). As leveduras Saccharomyces sp., em geral, também são utilizadas em diferentes ensaios de atividade fagocítica em mamíferos (Mariano & Spector 1973). 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abelli L, Picchietti S, Romano N, Mastrolia L, Scapigliati G. 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Zuasti A, Ferrer C. Granulopoiesis in the head kidney of Sparus auratus. Arch Histol Cytol. 1988; 51, 425-531. Zuasti A, Ferrer C. Haematopoiesis in the head kidney of Sparus auratus. Arch Histol Cytol. 1989; 52, 249-255. Zuasti A, Jiménez-Cervantes C, Garcia-Boron JC, Ferrer C. The melanogenics system of Xenopus laevis. Archiv Histol Cytol. 1998; 61: 305-316. 39 ARTIGOS 40 4. ARTIGOS 4.1 Versão original do Artigo “Caracterização morfo-citoquímica, imunohistoquímica e ultra-estrutural do rim cefálico do robalo peva Centropomus parallelus” submetido à revista “Journal of Fish Biology (vide anexo 2). Morpho-cytochemical, immunohistochemical and ultrastructural characterization of the head kidney of fat snook, Centropomus parallelus Santos, A.A 1,2,1; Gutierre, R.C. 1; Antoniazzi, M. M 5; Ranzani-Paiva, M.J.T 4; Silva, M.R.R3; Oshima, C.T.F 3 & Egami, M.I 1 1 Department of Morphology and Genetics, Federal University of São Paulo State, São Paulo, Brazil 2 Department of Morphology, Adventist University Center of São Paulo, Brazil 3 Departament of Pathology, Federal University of São Paulo State, São Paulo, SP, Brasil 4 Fishery Institute, São Paulo, SP, Brazil 5 Laboratory of Cell Biology, Instituto Butantan, São Paulo, Brazil 1 Autor to whom correspondence should be present address: Rua Sócrates Abrahão, 16 C 15 – Pq Munhoz, Cep 05782-470, São Paulo, SP, Brazil. Tel.: +55-11-58165630, Fax: +55-11-55764268; E-mail address: [email protected] Running Title: characterization of the head kidney of fat snook 41 4.1.1 Resumo Busca-se neste estudo caracterizar a estrutura e os aspectos morfo-citoquímicos, imunohistoquímicos e ultra-estruturais do RC de C. parallelus. Para tanto, amostras de RC foram utilizadas para a realização de decalques, processamento histológico e ultraestrutural. Estruturalmente, o RC apresenta uma delgada cápsula de conjuntivo, de onde partem finas trabéculas que se ramificam e se dirigem para o interior do órgão. No parênquima, é possível evidenciar agregados de células linfóides contendo populações de linfócitos imunopositivos e negativos para CDRO45, respectivamente linfócitos T e B, em disposição nodular, ao redor de vasos sanguíneos e centros melano-macrofágicos. Entre as células que constituem esses agregados e que circundam os mesmos, foram observados macrófagos, monócitos e seus precursores com forte imunopositividade para CD68, células da linhagem granulocítica em diversas fases de maturação positivas para lisozima e PAS. Os macrófagos, as células cromafins e interrenais também estavam presentes. Ultra-estruturalmente o RC apresenta um estroma retículo-endotelial constituído por células endoteliais, reticulares do tipo fibroblasto e do tipo macrófago e um parênquima mostrando elevada celularidade, principalmente células sanguíneas das séries eritrocítica, granulocítica, linfocítica, monocítica e trombocítica. Os resultados mostram que o RC de C. parallelus é um órgão fundamentalmente hematopoiético, com características morfo-citoquímicas e ultra-estruturais semelhantes àquelas observadas na medula óssea de mamíferos e que as reações imunohistoquímicas podem ser utilizadas para caracterizar a distribuição topográfica dos diferentes tipos de células do tecido hematopoiético em peixes. 42 4.1.2 Introdução Dentre as inúmeras espécies de peixes marinhos nativos existentes no Brasil, uma das que se destaca é o robalo peva Centropomus parallelus, pelo seu elevado potencial comercial e altíssimo consumo como fonte alimentar. O mesmo pertence à família Centropomidae, sendo encontrado desde a Flórida até a Argentina, nas Américas Tropical e Subtropical, incluindo o Leste da América Central, ou seja, Caribe, Cuba e Porto Rico (Patrona, 1984; Rivas, 1986). Os peixes teleósteos não possuem medula óssea sendo que a formação das células sanguíneas ocorre em tecido hematopoiético fora do esqueleto (Mccumber et al. 1982), constituindo órgãos como baço, timo e rim cefálico ou pronefro (Sailendri & Muthukkaruppan, 1975; Zapata, 1981; Fanger & Nilsson 1985; Romano et al. 1997; Mohammad et al. 2007). O rim cefálico exibe uma arquitetura que sugere sua função como órgão gerador de células sanguíneas e provedor de unidades formadoras de colônia (Bielek, 1981; Fanger, 1982; Petrie-Hanson e Ainswortho 2000), chegando a ser considerado análogo à medula óssea de mamíferos (Meseguer et al. 1991). No entanto, existem poucos estudos que descrevem os aspectos morfo-citoquímicos e ultra-estruturais dos diferentes grupos de células hematopoiéticas (Zuasti & Ferrer, 1988; Zuasti & Ferrer, 1989; Esteban et al. 1989; Meseguer et al. 1990; Sayed & Safer, 1992; Fijan, 2002; Petrie-Hanson & Peterman, 2005) e dos componentes celulares e extracelulares que constituem a rede citofibrilar estromal do rim cefálico em peixes (Smith et al. 1970; Zapata, 1983; Tatner & Manning, 1985; Mesenguer et al. 1991; Mesenguer et al. 1995). A caracterização ultra-estrutural da cápsula e a descrição de sua inter-relação com os constituintes da região subcapsular do rim cefálico não foram encontradas descritas em peixes. Por outro lado, o rim cefálico é considerado também como o principal órgão linfóide em peixes teleósteos (Sailendri & Muthukkaruppan, 1975; Romano et al. 1997, Press & Evensen 1999), de proliferação de linfócitos B (Romano et al., 1997), de produção de macrófagos (Braun-Nesje et al. 1981; Meseguer et al. 1991), como sítio de captura e processamento de substâncias e partículas estranhas (Lamaers & Haas 1985; Press & Evensen 1999) e de produção de anticorpos (Chiller et al., 1969; Smith et al. 1970; Press & Evensen 1999). Além disso, a caracterização morfológica e topográfica dos leucócitos do parênquima do rim cefálico é fundamental para a 43 compreensão do significado funcional destas células na resposta imune em peixes. Contudo, os recursos disponíveis para a caracterização de moléculas de superfície celular imunologicamente relevantes neste tecido são limitados. A utilização de marcadores específicos de superfície celular que reagem com anticorpos monoclonais na identificação de leucócitos é um dos poucos recursos que melhor caracteriza e localiza estas células nos tecidos linfomielóides em peixe (Fischer & Koellner 2007). No entanto, existem poucos anticorpos monoclonais disponíveis que permitem reconhecer subpopulações de leucócitos (granulócitos, linfócitos, células NK e monócitos) e trombócitos no sangue periférico e nos tecidos hematopoiéticos deste animal (Miller et al. 1987; Abelli et al. 1996; Kuroda et al. 2000; Köllner et al. 2002; Köllner et al. 2004; Fischer et al., 2006; Fischer & Koellner 2007). Considerando-se os dados da literatura pertinente descritos acima, busca-se neste estudo caracterizar a localização anatômica, alguns aspectos estruturais, histoquímicos, imunohistoquímicos e ultra-estruturais do rim cefálico do robalo peva Centropomus parallelus. 4.1.3 Materiais e Métodos Animal Em julho de 2005, 20 exemplares de robalo Centropomus parallelus de 14 meses de idade foram capturados de um tanque-rede de (5 x 5 x 2,5) m de profundidade, localizado na região estuarino-lagunar de Cananéia, Estado de São Paulo, Brasil. Os peixes foram arraçoados 3 vezes ao dia, com ração contendo 45% de proteína bruta. Obtenção e preparação do rim cefálico para descrição anatômica e histológica, realização de decalques, coloração e aplicação de métodos citoquímicos: Após a captura, os animais foram imediatamente anestesiados com benzocaína a 3%, medidos (TL = comprimento total em cm) e pesados (Wt = peso em g). Destes, quatro exemplares foram perfundidos com solução de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2, dissecados e fotografados para a descrição anatômica do rim cefálico. Dez animais foram sacrificados e fragmentos de rim cefálico de (5 x 5 x 5) mm foram utilizados para a realização de decalques. Os decalques foram submetidos aos métodos de Rosenfeld e Laür para análise morfológica e aos seguintes métodos citoquímicos: a) PAS para detecção de glicogênio (Mc Manus, 1946), b) Sudan Black B 44 para detecção de fosfolipídeos (Lison, 1960), c) Naftol AS-MX-fosfato para detecção de fosfatase alcalina (Ackerman, 1962), Naftol AS-BI-fosfato para detecção de fosfatase ácida (Barka & Anderson 1962), alfa-Naftil-acetato para detecção de esterase (Pearse, 1968) e o-toluidina-H2O2 para detecção de mieloperoxidase (Jacobs, 1958). Após a realização de decalques esses mesmos fragmentos foram fixados em solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2, processados segundo técnica histológica convencional e incluídos em parafina. Secções de 3µm foram submetidas aos métodos de coloração por HE, Tricrômio de Castro & Camargo, impregnação argêntica por Gomori, PAS e aos métodos imunohistoquímicos para análise ao microscópio de luz. Anticorpos e Imunohistoquímica Os anticorpos primários utilizados foram: anticorpo monoclonal de camundongo anti-humano para CD45RO (clone UCHL1) e CD68 (clone KP1) e anticorpo policlonal de coelho anti-humano para lisozima (EC 3.2.1.17) (Dako Corporation, Carpinteria, CA, U.S.A). Para a detecção da expressão de antígenos de superfície CDRO45 para células T, CD68 para macrófagos, monócitos e seus precursores e lisozima para granulócitos, foi aplicado o método imuno-enzimático indireto, em três etapas, utilizando-se o complexo biotina-estreptoavidina-peroxidase. Para tanto, cortes com 3µm de espessura foram colocados em lâminas silanizadas e secados a 37 oC. Os mesmos foram desparafinizados, hidratados, tratados em solução tampão citrato 0,3 M pH 6,0 colocados em microondas potência máxima por 30 minutos e incubados em solução aquosa de H2O2 (Merck) por 15’ para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Após a lavagem em H2O destilada, os cortes foram tratados em PBS 0,1M pH 7,4 por 10 minutos e incubados com anticorpo primário diluído em BSA (Soro Albumina Bovina) a 1%, “overnight”, a 3oC em câmara úmida. Os cortes foram lavados em PBS e incubados com anticorpo secundário biotinilado (kit LSAB/Plus – Dako/K0690), por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram lavados em PBS por 5 minutos e incubados em estreptoavidina conjugada com peroxidase (estreptoavidina HRP – LSAB), por 30 minutos em temperatura ambiente. Os cortes foram lavados em PBS por 5 minutos e revelados com solução substrato-cromógeno recém preparado, contendo H2O2 (Merck) a 5%, BSA (Sigma) a 1% e cromógeno diamino-benzidina (Sigma), diluídos em solução tampão tris 0,05M pH 7,8, por 5 minutos. Após a lavagem em fluxo contínuo de água destilada por 3 minutos, os cortes foram contracorados com 45 Hematoxilina de Harris por 2 minutos, lavados, desidratados, diafanizados em xilol e montados em Entellan. Microscopia Eletrônica de Transmissão Fragmentos de 1mm3 do rim cefálico de seis animais foram fixados em solução de Karnovsky (1965) por 24 horas a 4oC, lavados em tampão cacodilato 0,1 M pH 7,2, overnignt, a 4oC, pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2, acrescido de sacarose (96,1 mg/mL), por 1 hora, a 4 oC, contrastados em acetado de uranila 0,5% acrescido de sacarose (10,1 mg/mL), por 12 horas, a 4oC, desidratados em série crescente de etanol seguido de óxido de propileno e incluídos em resina de araldite (CIBA-FCY-205). Os blocos foram seccionados com navalha de diamante. Os cortes ultra-finos (90nm) foram contrastados em solução aquosa de acetato de uranila a 2% (Watson, 1958) e em solução de citrato de chumbo a 3,0% (Reynolds, 1963) e analisados em Microscópio Eletrônico de Transmissão LEO 906 (Carl Zeiss, Germany). 4.1.4 Resultados Descrição Anatômica O pronefro corresponde à região do rim situada na extremidade anterior. Devido, portanto a esta localização no organismo, é também denominado de rim cefálico (RC). O mesmo caracteriza-se por estruturas semelhantes às pirâmides de base triangular, bilaterais com ápices voltados para região inferior. Relacionam-se superiormente às vértebras torácicas e medialmente à aorta dorsal e veia cardinal. O pericárdio também está relacionado à porção anterior do RC. Nervos espinais, que partem da região anterior da coluna torácica e se dirigem à cavidade peritoneal anterior, envolvem lateralmente o RC. Tanto os nervos espinais quanto o RC são recobertas por uma lâmina de tecido conjuntivo contínuo ao pericárdio e às paredes laterais da bexiga natatória. O RC é contínuo ao mesonefro ou rim médio (Fig. 1a,b,c,d). Descrição histológica Estruturalmente o RC apresenta-se revestido por uma delgada cápsula de tecido conjuntivo, de onde partem finas trabéculas que se ramificam e se dirigem para o interior do órgão, formando septos contínuos à túnica adventícia dos vasos sanguíneos. Sobre a cápsula encontram-se células mesoteliais. Logo abaixo da cápsula, observa-se uma rede de sinusóides que se conectam com grandes vasos de 46 luz ampla, dispostos em regiões mais profundas (Fig. 2a,b). Constituindo o parênquima encontram-se agregados de células linfóides pequenas, concentradas ao redor dos vasos sangüíneos e dos centros melano-macrofágicos (CMMs) (Fig. 2a). Ao redor destes CMMs e entre estes agregados linfóides nota-se a presença de células com núcleos grandes, cromatina fina, nucléolo evidente e citoplasma claro basófilo, que se assemelham a células blásticas e reticulares (Fig. 2c). Ao redor de um vaso conhecido como veia portal-cardinal foi evidenciada a presença de células interrenais e de células cromafins. As células interrenais são cúbicas, com núcleo esférico central e citoplasma acidófilo de aspecto esponjoso, organizadas em cordões celulares anastomosadas localizadas ao redor de sinusóides. Entre as células interrenais e próximas à parede da veia portal cardinal encontram-se as células cromafins alongadas, com citoplasma forte e uniformemente acidófilo e núcleo deslocado para um dos pólos (Fig. 2d). A presença de fibras de colágeno tipo I na cápsula, nas trabéculas, ao redor dos vasos, dos CMMs e do tecido interrenal foi evidenciada com nitidez pela aplicação do método do Tricrômio de Castro & Camargo através do qual essas fibras se coram intensamente em azul (Fig. 3a). A riqueza, a distribuição e a organização das fibras reticulares, isto é, colágeno tipo III foram demonstradas através da impregnação argêntica pelo método de Gomori. As fibras reticulares, evidenciadas em preto, distribuem-se em forma de uma delicada rede frouxa, promovendo a sustentação das células do parênquima. Esta trama apresentou-se mais compacta e adensada na região cortical e mais esparsa e delgada na região medular do órgão (Fig. 3b). Histoquímica Após a aplicação do método do PAS, em secções do RC observa-se reação positiva em magenta no citoplasma das células da linhagem granulocítica que se localizam ao redor dos agregados linfóides e dos CMMs (Fig. 4a,b). Imunohistoquímica A imunopositividade para o antígeno CDRO45 em secções do RC, que identifica receptores de membrana em células T, foi revelada em marrom na população de linfócitos T que constituem os agregados linfóides, concentrados ao redor dos vasos sanguíneos e dos CMMs como pode ser observado na figura 5a,b, que mostra uma visão topográfica desses agregados em disposição nodular. Observa-se ainda nestes agregados uma população imunonegativa de linfócitos, indicando possivelmente a presença de linfócitos B. Entre as células que constituem esses agregados linfóides e ao seu redor, foram observados macrófagos, monócitos e seus precursores com forte 47 imunopositividade para CD68 (Fig. 5c) e também células da linhagem granulocítica em diversas fases de maturação, positivas para lisozima (Fig. 5d). Decalques Os decalques do RC corados pela mistura Romanovsky e pelo corante vital azul brilhante de cresila permitiram caracterizar células das séries eritrocítica, granulocítica, linfocítica, monocítica e trombocítica. Em relação à série eritrocítica foram identificados morfologicamente seis estágios diferentes ao longo do processo de maturação: proeritroblasto esférico, com núcleo central, eucromático, nucléolo proeminente e citoplasma basofílico; eritroblasto basófilo caracterizado pela ausência de nucléolo, cromatina condensada em grumos e citoplasma basofílico; eritroblasto policromático esférico, com núcleo esférico, heterocromático e citoplasma acinzentado; eritroblasto ortocromático esférico e citoplasma levemente acidófilo; reticulócito por apresentar uma acidofilia citoplasmática mais acentuada; eritrócito maduro elíptico, com núcleo fortemente heterocromático elíptico de contorno regular, com citoplasma acidófilo (Fig. 6a,b). Quando aplicado o método de coloração vital pelo Laür nos decalques, as células da série eritrocítica, principalmente nas fases mais jovens, mostraram no citoplasma um precipitado de cor azul de aspecto em rede, que a partir do eritroblasto ortocromático, foi sofrendo uma diminuição gradual, durante o processo de maturação celular (Fig. 6c). Em relação à série granulocítica foi possível reconhecer apenas células da linhagem neutrofílica. Dentre as células desta linhagem a mais jovem, denominada de granuloblasto, mostra forma esférica, com citoplasma fracamente basófilo, núcleo claro de elevada relação núcleo citoplasma, ligeiramente excêntrico e nucléolos visíveis, seguindo-se o progranulócito com núcleo esférico, levemente excêntrico, de cromatina frouxa e citoplasma apresentando uma região justanuclear clara; metagranulócito neutrófilo com núcleo excêntrico levemente chanfrado, de cromatina condensada em grumos e citoplasma fracamente basófilo. O neutrófilo maduro foi caracterizado como célula que apresenta citoplasma claro, com núcleo discretamente chanfrado, pequeno de cromatina condensado em grumos e citoplasma mostrando às vezes presença de corpos basófilos (Fig. 6d,e,f). Fazendo parte da série linfóide foram observados linfoblasto, prolinfócito e linfócito. O tamanho das células linfóides, a basofilia citoplasmática e o número de nucléolos visíveis diminuem durante o processo de maturação celular (Fig. 6f,g). Na série monocitíca foi possível reconhecer duas fases de desenvolvimento celular: monoblasto, grande, com tamanho que supera todas as 48 outras células blásticas, citoplasma basofílico e núcleo de formato variável; a chanfradura do núcleo tende a se tornar mais pronunciada à medida que a célula amadurece. Dois ou mais nucléolos podem ser visíveis. Na fase madura, o monócito apresenta núcleo chanfrado ou reniforme, cromatina frouxa e citoplasma uniformemente basófilo, porém mais intenso na periferia da célula, contendo grânulos azurófilos muito finos em toda sua extensão e vacúolos (Fig. 6h,i,j). Na série trombocítica foram identificadas duas fases: tromboblasto elíptico, com núcleo elíptico e citoplasma basófilo; tombócito elíptico, com núcleo elíptico e citoplasma hialino (Fig. 6l,m,n). Após a aplicação do PAS, Sudan Black B e o-toluidina-H2O2 muitas células, principalmente granulócitos jovens e maduros da linhagem granulocítica mostram presença de glicogênio no citoplasma, acentuada sudanofilia citoplasmática e mieloperoxidade positiva (Fig. 7a,b,c). No que se refere à detecção da fosfatase ácida e da esterase, os linfócitos, os monócitos jovens e maduros e muitas células possivelmente da linhagem granulocítica apresentaram reação positiva (Fig. 7d,e). Observou-se que a atividade da esterase em células da linhagem trombocítica é resistente ao fluoreto (Fig. 7f). Microscopia Eletrônica de Transmissão Ao MET, o RC, que se trata de um órgão fundamentalmente hematopoiético, mostrou-se constituído por uma cápsula de tecido conjuntivo, uma rede de células estromais (células reticulares e endoteliais), macrófagos, melano-macrófagos (MMs), células do tecido interrenal e das linhagens eritrocítica, granulocítica, linfóide, monocítica e trombocítica. O RC é revestido por uma camada de células mesotelias associada a uma delgada cápsula de tecido conjuntivo. Em alguns lugares, a cápsula apresenta uma camada de tecido conjuntivo mais espessa e presença de nervos (Fig. 8a,b). As células mesotelias apresentam núcleo achatado alongado, eucromático; citoplasma alongado, fino, contendo retículo endoplasmático rugoso, ribossomos livres, vacúolos, vesículas pinocíticas elétron-lúcidas e elétron-densas (Fig. 8c). Na região subcapsular, observase uma camada celular constituída por células reticulares do tipo fibroblasto. Este tipo celular apresenta núcleo irregular ou com acentuada chanfradura com heterocromatina associada ao envoltório nuclear; citoplasma elétron-denso, processos citoplasmáticos longos e finos, contendo vesículas elétron-lúcidas, retículo endoplasmático rugoso, ribossomos livres e poucas mitocôndrias (Fig. 8a). Associado a célula reticular descrita anteriormente, formando uma rede de sustentação celular, observa-se um segundo tipo 49 de célula reticular, denominado de célula reticular do tipo macrófago. A célula reticular do tipo macrófago apresenta núcleo de aspecto piramidal, eucromático, com um ou dois nucléolos evidentes; citoplasma contendo muitas mitocôndrias, grânulos citoplasmáticos elétron-densos e vesículas de tamanhos e elétron-densidades variadas. Algumas vesículas contêm resíduos celulares (Fig. 9). Foram observadas ainda células endoteliais e adventiciais, constituindo a parede dos sinusóides. O macrófago caracteriza-se por apresentar núcleo chanfrado ou reniforme, excêntrico, com heterocromatina associada ao envoltório nuclear e mostrando ocasionalmente nucléolos evidentes; citoplasma contendo lisossomos de tamanhos e densidades diferentes e fagolisossomos (Fig. 10b). Os macrófagos foram observados associados as áreas de linfopoiése e eventualmente ligados intimamente aos linfócitos (Fig. 10a). Os MMs são células caracterizadas por apresentar citoplasma repleto de grânulos de tamanhos, formas e elétron-densidades diferentes. Este tipo celular pode ser encontrado isoladamente no parênquima do RC ou agregado formando CMMs. Circundando os CMMs observou-se a presença de uma delgada camada de tecido conjuntivo associada a uma camada de células semelhantes àquelas observadas associadas ao conjuntivo da cápsula (Fig. 10c). Não foram observados outros tipos celulares constituindo os CMMs. No parênquima hematopoiético foram identificados seis estágios ao longo do processo de maturação de células da série eritrocítica: proeritroblasto, eritroblasto basofílico, eritroblasto policromático, eritroblasto ortocromático, reticulócito e eritrócito maduro. Durante o processo de maturação celular o tamanho da célula e do núcleo diminuem e a condensação da cromatina e a concentração de hemoglobina aumentam progressivamente (Fig. 11a-g). Dentre as células da série granulocítica foi possível identificar as seguintes fases de maturação do neutrófilo: progranulócito neutrófilo, metagranulócito neutrófilo e neutrófilo maduro. O progranulócito neutrófilo mostra forma irregular, com núcleo central, esférico, eucromático e nucléolo evidente. O citoplasma apresenta poucos grânulos esféricos elétron-densos, ribossomos livres, perfis de REG e de mitocôndrias. O metagranulócito neutrófilo apresenta forma oval, núcleo levemente excêntrico com heterocromatina associada à parte interna do envelope nuclear e eucromatina central. O citoplasma apresenta dois tipos de grânulos: um deles de aspecto esférico, elétrondenso com a região central elétron-lúcida e o segundo tipo de granulo de aspecto 50 esférico, pequeno, comparativamente dezenas de vezes menor em relação ao descrito anteriormente. Observa-se ainda retículo endoplasmático rugoso e mitocôndrias. O neutrófilo maduro apresenta características morfológicas semelhantes àquelas do metagranulócito neutrófilo, diferindo apenas pela grande quantidade de grânulos diminutos no citoplasma e condensação nuclear que o neutrófilo maduro apresenta (Fig. 12a,b). Na série linfóide foi possível identificar as células linfoblasto e linfócito. O linfoblasto apresenta forma irregular, com núcleo chanfrado, excêntrico e eucromático. O citoplasma possui ribossomos, perfis de retículo endoplasmático rugoso, retículo endoplasmático liso e de mitocôndrias. O linfócito pode variar de em seu tamanho e morfologia do núcleo. Esta célula exibe forma irregular, com núcleo chanfrado e heterocromático. O citoplasma apresenta ribossomos livres e ocasionalmente são visualizados poucos grânulos elétron-densos e mitocôndrias (Fig. 12c). Observa-se ainda plasmócitos com núcleo apresentando heterocromatina em blocos associada a face interna do envoltório nuclear. O citoplasma apresenta complexo de Golgi desenvolvido, ribossomos livres e um retículo endoplasmático granular bem desenvolvido, com cisternas dilatadas contendo material elétron-lúcido (Fig. 13). Na série monocítica foi possível identificar dois tipos celulares: os monoblastos são células grandes de formato irregular, com núcleo levemente chanfrado e eucromático; citoplasma possui grande quantidade de mitocôndrias, ribossomos livres, retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi desenvolvido e grânulos elétrondensos, pequenos e de aspecto em bastão. Os monócitos são células grandes de formato arrendado, com núcleo de chanfradura acentuada, excêntrico e eucromático. A elétron-densidade citoplasmática dos monócitos é mais intensa quando comparada àquela dos monoblastos. O citoplasma possui uma quantidade pequena de polirribossomos livres, um retículo endoplasmático rugoso pouco desenvolvido, mitocôndrias pequenas, grânulos elétron-densos e vesículas vazias. Os monócitos apresentam características ultra-estruturais semelhantes aos macrófagos, exceto pela ausência de fagolisossomos (Fig. 14a,b). Na série trombocítica foram identificados os tipos celulares: tromboblastos e trombócitos. Os trombloblastos apresentam formato irregular, com núcleo chanfrado, eucromático e nucléolo evidente. O citoplasma apresenta ribossomos livres, mitocôndrias, cisternas de retículo endoplasmático liso, depósito de glicogênio, sistema canalicular e um vacúolo bem desenvolvido. Os trombócitos apresentam formato 51 elíptico, com núcleo mostrando sulcos profundos heterocromático e citoplasma caracterizado por apresentar vesículas de formatos e tamanhos diferentes, microtúbulos marginais e um sistema canalicular conectado à superfície (SCCS) (Figuras 15ª,b). A medida que a célula vai se tornando mais madura, o tamanho do vacúolo presente no pólo celular diminui. 52 N b a * d c Figura 1 – Fotografias do robalo peva e fotomicrografia do rim cefálico. Em a) vista lateral mostrando rim cefálico (círculo tracejado), nervo espinal (retângulo), b) fotomicrografia do nervo espinal (N) mostrando fibras mielínicas (seta) e amielínicas (ponta de seta) em corte transversal próximo à cápsula do rim cefálico - Tricrômio de N.M.C; c) vista anterior do rim cefálico (seta), rim médio (cabeça de seta) e rim caudal (*); d) vista lateral do rim cefálico (seta) e rim médio (cabeça de seta). p b VP C a c d Figura 2 - Fotomicrografias de cortes de rim cefálico mostrando: a) agregados de células linfóides (*) ao redor dos vasos sangüíneos (V) e centros melano-macrofágicos (seta); b) em maior aumento no canto superior esquerdo cápsula de tecido conjuntivo (Cp); c) no canto inferior direito uma população de células linfóides e duas células compatíveis com células reticulares (seta); d) células interrenais cúbicas, organizadas em cordões celulares (*) localizadas ao longo dos sinusóides (s). células cromafins (seta vazia) e interrenais próximas à parede da veia portalcardinal (VPC). Hematoxilina e Eosina. 53 Cp V b a Figura 3 - Fotomicrografias de cortes de rim cefálico mostrando em: a) colágeno em azul na cápsula (Cp), no tecido conjuntivo do estroma (seta) e ao redor dos vasos sanguíneos (v). Tricrômio de Castro & Camargo e Hematoxilina; b) presença de rede de fibras reticulares (seta). Gomori. * a bb Figura 4 - Fotomicrografias de cortes de rim cefálico mostrando células da linhagem granulocítica (seta) positivas circundando em a) agregados de células linfóides (*) e em b) o centro melano-macrofágico. PAS e Hematoxilina Carazzi.
