Efeitos do déficit hídrico no crescimento - NBCGIB

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
MARTIELLY SANTANA DOS SANTOS
EFEITOS DO DÉFICIT HÍDRICO NO CRESCIMENTO, MORFOANATOMIA,
ULTRAESTRUTURA FOLIAR E PRODUÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE
Ocimum africanum Lour. (LAMIACEAE)
ILHÉUS/BAHIA
2013
ii
MARTIELLY SANTANA DOS SANTOS
EFEITOS DO DÉFICIT HÍDRICO NO CRESCIMENTO, MORFOANATOMIA,
ULTRAESTRUTURA FOLIAR E PRODUÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE
Ocimum africanum Lour. (LAMIACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Produção Vegetal, da Universidade
Estadual de Santa Cruz – UESC,
como parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Produção Vegetal.
Linha de Pesquisa:
Cultivos em Ambiente Tropical Úmido.
Orientador: Delmira da Costa Silva
Co-orientadores: Fábio Pinto Gomes
Larissa Corrêa do Bomfim Costa
ILHÉUS/BAHIA
2013
iii
MARTIELLY SANTANA DOS SANTOS
EFEITOS DO DÉFICIT HÍDRICO NO CRESCIMENTO, MORFOANTOMIA,
ULTRAESTRUTURA FOLIAR E PRODUÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE
Ocimum africanum Lour. (LAMIACEAE)
Ilhéus, BA, 25/ 02 /2013
______________________________________
Prof. Dr. Delmira da Costa Silva
UESC/DCB
(Orientadora)
______________________________________
Prof. Dr. André Dias de Azevedo Neto
UFRB/ CETEC
________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Schramm Mielke
UESC/DCB
iv
DEDICATÓRIA
A luz do meu caminho e da minha vida, Mãe
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus pela vida maravilhosa e cheia de oportunidades que me
concedeu.
Aos meus pais, Maria das Graças e José Roberto, que são os responsáveis
pela minha educação. Vocês são meus exemplos de honestidade, persistência
e vontade de vencer.
À minha irmã Francielly, pelo carinho e pelas brigas tão importantes na
construção desse amor! Te amo muitão e faço tudo pensando em você e no
que ainda poderei lhe proporcionar!!!
À vovó Maria da Glória, por toda a ajuda que me deu. Sem a senhora eu não
conseguiria ir tão longe.
Ao Tiago, que me incentivou, apoiou e com muito amor ajudou-me a colocar
esse projeto em prática. Te amo muito!!
Á dona Therezinha e Sr° Reginaldo pelo carinho e preocupação!
À minha cunhada, Rívia por todo carinho, apoio e preocupação. Obrigada por
ajudar nas coletas e nas contagem dos milhares de folhas de minha plantinha!
(risos).
À profª Delmira da Costa Silva, por ter me iniciado na carreira científica (2007),
pelos conselhos, orientações e incentivo dados na construção e andamento do
trabalho!
À minha co-orientadora, professora Larissa Corrêa do Bomfim Costa, que foi
um anjo em minha vida pessoal e acadêmica, que com carinho ensinou-me a
ser uma pesquisadora que ama o que faz.
Ao meu co-orientador, professor Fábio Pinto Gomes, agradeço pelo carinho,
atenção e orientações na vida acadêmica e pessoal. Obrigada por acreditar no
meu trabalho e por incentivar a continuar com humildade e amor a profissão
escolhida.
Ao professor Marcelo Mielke que colaborou para realização deste trabalho e
sem saber, desde a graduação, vem motivando a minha escolha profissional.
Além de ser um ser humano espetacular.
Ao professor Carlos Ledo por tirar as minhas dúvidas nas análises estatísticas.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), em especial ao Programa de
Pós-Graduação em Produção Vegetal, pela oportunidade de realizar o curso.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Centro de Microscopia Eletrônica (CME) da Universidade Estadual de Santa
Cruz em nome dos professores Pedro Mangabeira e Eduardo Gross por ceder
não só a infraestrutura, mas por confiar no meu trabalho e incentivar sempre
minha trajetória com palavras positivas e animadoras. Obrigada!
vi
À FIOCRUZ da Bahia e ao Centro de Pesquisa do Cacau (CEPLAC) por ceder
a infraestrutura e os funcionários para auxiliares nas análises de dados da
pesquisa.
Ao laboratório de Produtos Naturais da Universidade Estadual de Santa Cruz
em nome da Professora Rosilene Aparecida por auxiliar nas análises químicas
do óleo essencial.
À secretária da Produção Vegetal Caroline Tavares pela competência e
atenção dada a cada aluno desse programa.
Aos meus amigos da equipe Jatropha: Léo o visionário; Priscila o centro do
nosso grupo; Alayana a doce cantora; Téssio o oráculo e Ilana a risonha. Foi
muito bons os momentos vividos com vocês. Valeu!!!
As minhas tias Luci, Telma e Lia por todo o carinho.
À tia Danuza pelas oportunidades dadas no início de minha trajetória de
estudo.
A toda família Mendes, em especial os meus padrinhos Márcia e Jorge.
Aos meus amigos Lu e Augusto pela parceria durante todo o projeto,
principalmente pela ajuda na parte mais pesada do trabalho... as pesagens
diárias dos vasos. Não sei o que faria sem vocês. Sou grata por todo carinho e
dedicação ao projeto!! Então, como diz Augusto: “Acabou o milho, acabou a
pipoca” (risos).
À Patrícia Casaes, que foi mais que uma amiga, sempre segurando-me no
colo quando tive vontade de chorar. Você ilumina a vida de todos que estão ao
seu redor.
Aos meus queridos amigos do Centro de Microscopia Eletrônica, Valéria, Mari,
Alberto, Lane, Tielle, Dona Jaci, Thaise, Diego. Valeu Galera!!
Ao meu amigo, José Pereira que dividiu comigo muitos momentos divertidos no
laboratório. Obrigada por todos os questionamentos feitos ao longo do meu
trabalho. Eles foram essenciais para o meu crescimento enquanto
pesquisadora. Afinal, são as perguntas que movem o mundo.
Aos amigos que fiz na Pós-Graduação de Produção Vegetal, em especial,
Viviane Barazetti, Flávia Pinto, Jordany, Verônica, Natalia.
Ao laboratorista, Gerson (Cegonha) pelo apoio, carinho e amizade que foi
construída junto com o experimento e que irá durar para sempre!!
À Jú que dividiu comigo não só o apt°, mas todos os momentos de estresse
adquiridos depois de um dia de muito trabalho e muitas gargalhadas durante
nossas hipóteses quase científicas para entender nossos namorados! (risos).
À Fernanda pelas altas gargalhadas nos finais de semana durante nossas
ideias mirabolantes de conquistar o mundo! (risos)
Aos funcionários de campo, Sr. Roberto, Marcelo, Alan e em especial a Manoel
Delino pela grande amizade, carinho e apoio nos momentos mais complicados
da montagem do experimento.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento da
pesquisa e para a minha vitória. OBRIGADA!!
vii
EFEITOS DO DÉFICIT HÍDRICO NO CRESCIMENTO, MORFOANATOMIA
FOLIAR E PRODUÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Ocimum africanum Lour.
(LAMIACEAE)
RESUMO
O uso de plantas medicinais tem estimulado interesse devido à sua facilidade
de cultivo e obtenção de fitoterápicos. Quando submetidas ao estresse hídrico
algumas espécies medicinais apresentam alterações no crescimento,
anatomia, produção e composição química do óleo essencial comprometendo
assim o produto final da cadeia produtiva. No intuito de verificar os efeitos do
estresse hídrico na espécie Ocimum africanum, mudas foram cultivados em
vasos de 10L contendo substrato e submetidas ao estresse de 100, 80, 70,
60% da capacidade de campo, que foram referentes aos potenciais hídricos do
ramo, medidos antes do amanhecer, de, respectivamente -0,5 ; -0,9; -1,6 e -1,9
MPa. As plantas foram coletadas em três épocas, e a biomassa seca foi obtida
por meio da secagem em estufa de circulação forçada à 70ºC. Os parâmetros
fisiológicos foram avaliados através da produção de biomassa, potencial hídrico
de antemanhã do ramo, trocas gasosas foliares e eficiência de uso da água
com base na produção de óleo essencial. O óleo foi extraído por
hidrodestilação utilizando aparelho de Clevenger, e analisado por cromatografia
gasosa acoplada a um espectrômetro de massa. As modificações
morfoanatômicas e ultraestruturais foram observadas utilizando as técnicas
convencionais de anatomia vegetal, microscopia eletrônica de varredura e
transmissão. As plantas de O. africanum, sob déficit hídrico, apresentaram
reduções nas trocas gasosas foliares e do teor de pigmentos cloroplastídicos
ao longo do tempo. O consumo hídrico também foi reduzido e a produção de
biomassa foi afetada negativamente, acarretando menor rendimento do óleo
essencial e menor eficiência do uso da água para a produção de biomassa
(EUAbm). Contudo, um aumento no teor e na eficiência de produção de óleo
essencial (óleo produzido/ água consumida) foram constatados entre os
potenciais de -0,9 e -1,6 MPa. Além disso, não foram verificadas grandes
alterações na composição química do óleo essencial em relação ao potencial
de -0,5 MPa, que apresentou isoeugenol como constituinte majoritário nas
folhas e inflorescências nos diferentes potenciais hídrico do ramo. Para a
anatomia verificou-se um acréscimo da densidade de tricomas glandulares e
tectores, sendo a maior densidade desses tricomas observada na epiderme da
face abaxial. Nas análises ultraestruturais observou-se degradações na
membrana nuclear, do cloroplasto e do vacúolo, desorganização dos tilacóides
e a presença de plastoglóbulos nas células de tecidos foliares de plantas
submetidas aos potenciais hídricos do ramo de -1,6 e -1,9MPa. Para O.
africanum o potencial de -0,9 MPa, ou seja 80% da capacidade de campo,
mostrou-se como a melhor condição para o crescimento e produção de óleo
essencial para essa espécie. Considerando-se a produção e a qualidade do
óleo essencial, o cultivo torna-se economicamente viável nessa condição.
Palavras-chave: Irrigação, Manjericão, Morfofisiologia, Terpenos.
viii
EFFECTS OF WATER DEFICIT ON GROWTH , LEAF MORPHOANATOMY
AND Ocimum africanum Lour. (LAMIACEAE) ESSENTIAL OIL
PRODUCTION
ABSTRACT
The use of medicinal plants has stimulated interest because of its ease of
cultivation and phytoterapics obtainment. When submitted to water stress some
medicinal species present changes on growth, anatomy, production and the
essential oil chemical composition, thus compromising the production chain final
product. In order to investigate the effects of water stress on the Ocimum
africanum species, seedlings were grown in 10L pots containing substrate and
submitted to the stress of 100, 80, 70 and 60% of field capacity, which were
related to the branch water potential of -0.5, -0.9, -1.6 and -1.9 MPa,
respectively, measured before dawn. The plants were collected in three periods,
and the dry biomass was obtained by drying in a forced circulation kiln at 70 °C.
The physiological parameters were evaluated through the biomass production,
branch pre-dawn water potential, leaf gas exchange and water use efficiency
based on the essential oil production. The oil was extracted by hydrodistillation
using the Clevenger apparatus and analyzed by gas chromatography coupled
to a mass spectrometer. The morphoanatomic and ultrastructural changes were
observed using the conventional techniques of plant anatomy, scanning
electronic microscopy and transmission. O. africanum plants under water deficit
showed reductions in leaf gas exchange and chloroplastid pigment content over
time. The water consumption was also reduced and the biomass production
was negatively affected, resulting in lower yields of the essential oil and less
water use efficiency for biomass production (EUAbm). However, an increase in
the essential oil content and production efficiency (oil produced / consumed
water) were observed between the -0.9 and -1.6 MPa potentials. Furthermore,
there were no major changes in the essential oil chemical composition in
relation to the -0.5 MPa potential, which presented isoeugenol as the main
constituent on leaves and inflorescences at different branch water potentials.
For the anatomy, there was an increase in the density of glandular and tector
trichomes, and the highest density of these trichomes was observed in the
abaxial epidermis. In ultrastructural analysis, degradations in the chloroplasts
and vacuoles nuclear membrane, thylakoids disorganization and the presence
of plastoglobules in leaf tissues cells of plants submitted to the branch water
potentials of -1.6 and -1.9 MPa were observed. For O. africanum, the -0.9 MPa
potential, which corresponds to 80% of field capacity, was proved as the best
condition for the essential oil growth and production for this species. And
considering the essential oil production and quality, the cultivation becomes
economically viable in this condition.
Keywords: Irrigation, Basil, Morphophysiology, Terpenes
ix
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 1.
Curva de retenção de água do substrato utilizado no experimento.
25
Figura 2.
Produção de mudas; B- transplante para os vasos com o 26
substrato. C- Vista geral do experimento montado com as
condições climáticas sendo monitoradas pela estação
meteorológica (seta)
Figura 3.
A- Variação da radiação fotossinteticamente ativa (RFA); BVariação da temperatura e da umidade relativa do ar (UR),
dentro da casa de vegetação durante o período experimental.
27
Figura 4.
Determinação do tempo de extração do óleo essencial das
folhas
ŷ= 0,068 + 0,0657x - 0,0003x2 + R2= 0,98 e das
inflorescências ŷ= -0,708 +0,0369x - 0,0002x2 R2= 0,94
29
Figura 5.
Consumo hídrico diário das plantas de Ocimum africanum
durante os 60 dias após aplicação dos tratamentos (DAAT) de
déficit hídrico.
31
Figura 6.
Variação do potencial hídrico de antemanhã do ramo (Ψw) em
plantas de Ocimum africanum sob diferentes capacidades de
campo durante o período experimental.
32
Figura 7.
A- Fotossíntese liquida; B- Condutância estomática e C- Taxa
transpiratória de Ocimum africanum aos 20 (círculos vazios), 40
(quadrados cheios) e 60 (triângulos vazios) dias após aplicação
dos tratamentos de déficit hídrico.
34
Figura 8.
A- Taxa fotossintética líquida em função da condutância
estomática. B- Taxa de transpiração em função da condutância
estomática em plantas de Ocimum africanum submetidas ao
déficit hídrico.
35
Figura 9.
A- Eficiência intrínseca de uso da água (A/gs) B- Eficiência
instantânea de uso da água (A/E) em Ocimum africanum
submetida ao déficit hídrico..
37
Figura 10.
A- Concentração de clorofila a B- Clorofila b C- Carotenóides e
D- Razão da clorofila a/b em plantas de Ocimum africanum aos
20 (círculos vazios), 40 (quadrados cheios) e 60 dias triângulos
vazios) após aplicação dos tratamentos de déficit hídrico.
38
x
Figura 11.
Plantas de Ocimum africanum com 60 dias após a aplicação
dos tratamentos de deficiência hídrica evidenciando a diferença
no crescimento (T1= -0,5 MPa; T2=-0,9 MPa ;T3= -1,6 MPa e
T4= -1,9 MPa).
40
Figura 12.
Teor do óleo essencial: A- Folhas; B- Inflorescências de
Ocimum africanum após 60 dias da imposição do déficit hídrico.
44
Figura 13.
A- Rendimento do óleo essencial das folhas B- inflorescências
de Ocimum africanum após 60 dias da imposição do déficit
hídrico.
45
Figura 14.
A- Eficiência de uso da água para a produção de biomassa BEficiência de uso da água para a produção de óleo essencial
das folhas de O. africanum aos 60 dias após aplicação dos
tratamentos.
46
Figura 1.
A) Hábito de Ocimum africanum; B) Detalhe da flor; C)
Sementes mostrando a formação da mucilagem quando irrigada
(seta) e sementes enegrecidas..
63
Figura 2.
Eletromicrografia de microscopia eletrônica de varredura da
superfície foliar de Ocimumafricanum; (A) Vista geral da
epiderme, face abaxial; (B) Tricoma tector; (C) Tricoma
glandular peltado.
63
Figura 3.
Seção transversal da folha de Ocimum africanum submetida a
diferentes regimes hídricos: - 0,5 MPa (A) ; -0,9 MPa (B); -1,6
MPa (C); -1,9 MPa (D) . Barra = 50µm.
64
Figura 4.
Espessura da epiderme, face adaxial (círculos cheios), face
abaxial (círculos vazios), de Ocimum africanum submetido aos
diferentes potenciais hídricos.
65
Figura 5.
Espessura do parênquimas paliçádico (círculos cheios) e
parênquima esponjoso (círculos vazios) de Ocimum africanum
submetido aos diferentes potenciais hídricos.
66
Figura 6.
Espessura do mesofilo (círculos vazios) e do limbo foliar
(círculos cheios) de Ocimum africanum submetido aos
diferentes potenciais hídricos (-MPa).
67
CAPÍTULO II
xi
Figura 7.
Eletromicrografias de microscopia eletrônica de varredura das
superfícies adaxial (A, B, C, D) e abaxial (E, F, G, H) da folha de
Ocimum africanum submetido aos potenciais hídricos de -0,5
MPa (A e E); -0,9 MPa (B e F); -1,6 MPa ( C e G) e -1,9 MPa (D
e H).
69
Figura 8.
A- Densidade de tricomas glandulares peltados e B- tricomas
tectores (B) nas faces adaxial e abaxial de Ocimum. africanum
nos diferentes potenciais hídricos (-MPa). Os pontos
representam média de cinco repetições e as barras o erro
padrão da média
71
Figura 9.
Eletromicrografia de microscopia eletrônica de transmissão das
células do mesofilo foliar de plantas de Ocimum africanum
submetidas a diferentes potenciais hídrico do ramo. A-B:
Aspecto geral da célula do parênquima paliçádico evidenciando
a ruptura da membrana nuclear (seta) no potencial hídrico de 1,9 MPa; C- Detalhe do plastoglóbulos no potencial de -0,9
MPa. D- Presença de vesículas, devido ao rompimento do
tonoplasto (seta). E-F- contração da membrana plasmática
(seta). Cl: cloroplasto; nu: núcleo; ga: grão de amido;va:
vacúolo; pc: parede celular; pg: plastoglóbulos
72
Figura 10.
Eletromicrografia de transmissão de células do mesofilo foliar de
plantas de Ocimum africanum submetidas a diferentes
potenciais hídricos do ramo. A-B Aspecto ultraestrutural normal
dos cloroplastos e do grana no potencial hídrico do ramo de -0,5
MPa. C-D Cloroplastos do tratamento de -0,9 MPa evidenciando
alterações na forma da organela. E- F Tratamento de -1,6 MPa,
evidenciando a presença de plastoglóbulos (seta) e
desorganização de tilacóides no cloroplasto com estrutura
eletrodensa na periferia (estrela). G-H Potencial de -1,9 MPa
evidenciando o rompimento da membrana do cloroplasto
(cabeça de seta) e a desorganização no empilhamento do grana
(seta). Cl: cloroplasto; nu: núcleo; ga: grão de amido; va:
vacúolo; pg: plastoglóbulos
Figura 11.
Eletromicrografia de microscopia eletrônica de transmissão de
células do mesofilo foliar em plantas de Ocimum africanum
submetidas ao potencial hídrico de -1,9 MPa. A-B Vista geral de
célula do parênquima esponjoso evidenciando cloroplasto
rompido e a formação de vesículas (setas). C-D Vista geral da
célula do parênquima paliçádico com cloroplastos degradados e
grãos de amido expostos no citoplasma (seta), além da
presença de plastoglóbulos (estrelas). Cl: cloroplasto; ga: grão
de amido.
73
74
xii
Figura 12.
Eletromicrografia de microscopia eletrônica de transmissão de
células do mesofilo foliar de Ocimum africanum submetidas a
diferentes potenciais hídricos do ramo. A- Potencial hídrico do
ramo de -0,5 MPa evidenciando aspecto ultraestrutural normal
dos cloroplastos com grão de amido (ga) e pequenos
plastoglóbulos (seta). B-C Tratamento de -1,9 MPa,
evidenciando a desorganização de tilacóides no cloroplasto e a
ocorrência de pequenos aglomerados de plastoglóbulos . Cl:
cloroplasto; ga: grão de amido; mi: mitocôndria.
75
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Fertilizantes químicos utilizados durante o experimento na
adubação de plantio e de cobertura
24
Tabela 2
Análise físico-química do substrato experimental.
24
Tabela 3.
Níveis de significância da ANOVA comparando os efeitos do
déficit hídrico (DH) e o tempo em dias (T) e a interação entre o
déficit hídrico e o tempo (DH x T) para as variáveis de trocas 33
gasosas (A, gs, E, A/gs e A/E) em plantas de Ocimum
africanum durante 20, 40 e 60 dias após a aplicação do
tratamento (DAAT).
Tabela 4.
Tabela 5.
Tabela 6.
Valores médios (± erro padrão) das variáveis de crescimento
de Ocimum africanum após 60 dias da imposição dos 43
tratamentos de déficit hídrico nos potenciais hídricos do ramo
de -0,5; -0,9; -1,6 e -1,9 MPa.
Concentração relativa (%) dos constituintes químicos do óleo
essencial obtido da biomassa seca de folhas de Ocimum 49
africanum submetidos aos tratamentos de déficit hídrico, tendo
os potenciais hídricos do ramo os valores de -0,5 ; -0,9 ; -1,6
e -1,9 MPa.
Concentração relativa (%) dos constituintes químicos do óleo
essencial obtido da biomassa seca das inflorescências de 50
Ocimum africanum submetidos aos tratamentos de déficit
hídrico, tendo os potenciais hídricos do ramo os valores de 0,5; -0,9; -1,6 e -1,9 MPa.
xiv
LISTA DE VARIÁVEIS, SÍMBOLOS E UNIDADES
A
Taxa fotossintética líquida (μmol CO2 m-2 s-1)
A/gs
Eficiência intrínseca de uso da água (μmol CO2 mol H2O-1)
A/E
Eficiência instantânea de uso da água (μmol CO2 mol H2O-1)
AF
Área foliar (cm2)
Ci
Concentração de CO2 nos espaços intercelulares
DAAT
Dias após aplicação dos tratamentos
DPV
Déficit de pressão de vapor entre o ar e a folha (kPa)
E
Taxa transpiratória (mmol H2O m-2 s-1)
EUA óleo
Eficiência no uso da água (g L-1)
H2O m-2 s-1)
Eficiência no uso da água para a produção de óleo essencial (g L-1)
gs
Condutância estomática ao vapor de água (mol H2O m-2 s-1)
ga
Grão de amido
Ψw
Potencial Hídrico do ramo (-MPa)
MSR
Massa seca da raiz (g)
MSC
Massa seca do caule (g)
MSF
Massa seca da folha (g)
MSI
Massa seca da inflorescência (g)
MFE
Massa foliar especifica ( g m-2 )
NF
Razão massa de caule (g g-1)
NI
Número de inflorescências
Pc
Parede celular
Pg
Plastoglóbulos
RMC
Razão massa de caule (g g-1)
RMF
Razão massa de folha (g g-1)
RMI
Razão massa de Inflorescência (g g-1)
RMR
Razão massa de raiz (g g-1)
R:PA
Razão raiz/parte aérea (g g-1)
RFA
Radiação Fotossinteticamente ativa (µmol fótons m-2 s-1)
EUA
xv
SUMÁRIO
RESUMO..........................................................................................
vii
ABSCTRAT......................................................................................
viii
1.
INTRODUÇÃO GERAL....................................................................
1
2
REFERENCIAL TEÓRICO...............................................................
5
2.1
Família Lamiaceae e o gênero Ocimum L. .....................................
5
2.2
Plantas medicinais e os fatores ambientais que afetam a produção
e a composição química do óleo essencial......................................
7
2.3
Déficit hídrico: efeitos e respostas na morfofisiologia de plantas.....
10
2.4
REFERENCIAS................................................................................
13
3
CAPÍTULO I- Crescimento, assimilação de carbono e eficiência no
uso da água na produção e composição química do óleo essencial
de Ocimum africanum Lour. (Lamiaceae) sob déficit hídrico.
3.1
INTRODUÇÃO.................................................................................. 20
3.2
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................ 23
3.2.1
Material botânico e as condições de cultivo.....................................
23
3.2.2
Potencial hídrico do ramo (ψw)........................................................
26
3.2.3
Trocas gasosas foliares....................................................................
26
3.2.4
Eficiência de uso da água (EUA)....................................................
27
3.2.5
Avaliação do crescimento.................................................................
27
3.2.6
Extração e quantificação química do óleo essencial........................
28
3.2.7
Teor de pigmentos............................................................................
29
3.2.8
Delineamento experimental..............................................................
29
3.3
RESULTADO E DISCUSSÃO.......................................................... 30
3.4
CONCLUSÃO..................................................................................
50
REFERÊNCIAS................................................................................
51
3.5
xvi
4
CAPÍTULO II – Anatomia, micromorfologia e ultraestrutura foliar de
O. africanum Lour. (Lamiaceae) submetidas a déficit hídrico.
4.1
INTRODUÇÃO...................................................................................
57
4.2
MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................
59
4.2.2 Cultivo da espécie..............................................................................
59
4.2.3 Análise anatômica..............................................................................
60
4.2.4 Análise ultraestrutural.........................................................................
60
4.2.5 Delineamento experimental................................................................
61
4.3
RESULTADO E DISCUSSÃO............................................................
61
4.4
CONCLUSÃO.....................................................................................
75
5
CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................ 76
6
REFERÊNCIAS................................................................................... 77
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
As plantas medicinais vêm ganhando destaque no mercado nacional e
internacional, pela produção e venda dos óleos essenciais, que são matérias
primas para as indústrias de cosméticos, farmacêutica, alimentícia e de
perfumaria, normalmente, comercializada na sua forma bruta ou beneficiada.
Entre as espécies medicinais, deste mercado destacam-se as da família
Lamiaceae.
A família Lamiaceae está representada por cerca de 264 gêneros e
6.990 espécies de ampla distribuição, ocorrendo principalmente nas regiões
tropicais e subtropicais da Ásia, África, América Central e do Sul, mas tendo
como principal centro de diversidade o continente africano. São ervas anuais
ou perenes, subarbustos ou arbustos, e só raramente mencionadas como
árvores de pequeno porte (BARROSO, 1991).
Na
família
Lamiaceae,
o
gênero
Ocimum
L.
tem
destaque.
Compreendendo aproximadamente 60 espécies, que são popularmente
conhecidas como alfavaca e/ou manjericão (ALBUQUERQUE; ANDRADE,
1998; BLANK et al., 2004). São espécies ricas em óleos essenciais que
apresentam
um
elevado
valor
agregado
nos mercados
nacionais e
internacionais, devido aos componentes majoritários presentes neste óleo, com
destaque para o eugenol e linalol.
Segundo Blank et al., (2004) o preço do óleo essencial de manjericão
doce (Ocimum basilicum) no mercado internacional atingiu valores próximos a
US$ 110,00/litro. Esse preço dá-se principalmente pelo interesse das indústrias
de perfumes finos. Além disso, muitas espécies do gênero apresentam
destaque pela ação farmacológica e inseticida comprovadas. Pesquisas
realizadas
com
Ocimum
gratissimum
relevaram
ação
antibactericida,
2
antifúngica (NAKAMURA et al.,1999; DUBEY et al., 2000; LEMOS et al., 2005)
e antioxidante (PEREIRA; MAIA, 2007), sendo sua atividade atribuída ao
eugenol, componente majoritário do óleo essencial. De Paula at al. (2004;
2003) estudando o óleo essencial de duas variedades de Ocimum selloi
(eugenol e estragol) verificaram atividade repelente contra o mosquito
Anopheles braziliensis Chagas.
Contudo, apesar da importância do gênero nos aspectos medicinais e
econômicos, ainda são escassos estudos botânicos e agronômicos com a
espécie O. africanum. Tal escassez de estudo está intimamente relacionada à
elevada variabilidade morfológica e química existente nas espécies do gênero,
que ocorre devido à hibridização interespecífica e poliploidia, por isso vêm
sendo realizados estudos com marcados moleculares (ALBUQUERQUE et al.,
1998; BLANK et al., 2007; VANI et al., 2009; CAROVIC–STANKO, et al.,
2010a). Segundo Carovic –Stanko, et al., (2010b) há dois clados separados
dentro do gênero, sendo que a espécie O. africanum esta presente no clado da
espécie O. americanum. Ainda segundo este autor a espécie O. africanum tem
como sinonímia Ocimum X citriodorum. Considerando esta sinonímia, foi
relatado que o óleo essencial desta espécie apresentou ação antioxidante
(HAKKIM et al., 2008) e antibacteriana (CAROVIC´-STANKO et al., 2010a).
Para garantir a eficácia do óleo essencial é necessário avaliar a sua
qualidade, que inicia nos aspectos relacionados a adaptabilidade e ao cultivo
da espécie. Entre os principais fatores que afetam a produção e composição
química do óleo essencial destacam-se o estádio de desenvolvimento da
planta, sazonalidade, disponibilidade de radiação luminosa, temperatura,
nutrientes e água (SIMÕES; SPITZER, 2004; MORAIS, 2009). Este último fator
vem ganhando destaque, pois a agricultura irrigada pode ser considerada como
um dos setores que mais desperdiça água quando comparado ao setor
industrial e doméstico. Para a agricultura irrigada manter-se sustentável, em
termos ambientais, é necessário o uso eficiente da água. O uso eficaz da água
para a irrigação pode ser alcançado através de avaliações dos tipos de
cultivos, sistemas de irrigação e gestão de uso da água, baseando-se em
métodos de manejo e técnicas que permitem aumentar a eficiência de uso da
água, tais como: método do turno de rega, déficit hídrico regulado e secagem
parcial da zona radicular (COELHO et al., 2005).
3
Em plantas medicinais e aromáticas as alterações no metabolismo
secundário, em decorrência do estresse, podem estimular e ativar a produção
de óleos essenciais (MORAIS, 2009). O teor e a composição química do óleo
essencial podem ser afetados quando essas espécies são submetidas ao
estresse hídrico. Em pesquisa realizada com espécies do gênero Cymbopogon
foram observados aumentos no rendimento do óleo essencial, bem como dos
componentes majoritários geraniol e citral sob condições de estresse hídrico
moderado (SANGWAN et al., 2001). Resultados semelhantes para o
rendimento do óleo essencial foram obtidos para espécies do gênero
Petroselinum (PETROPOULOS et al., 2008) e Ocimum (KHALID, 2006). Sendo
que este último apresentou também, um aumento no conteúdo de prolina e
carboidratos, componentes responsáveis pelo ajuste osmótico (KHALID, 2006).
Apesar dos resultados favoráveis para o aumento no rendimento do
óleo, estudos têm relatado que quando submetidas ao estresse hídrico,
espécies medicinais reduzem o crescimento e diminuem a produção de
biomassa fresca e seca da parte aérea, como verificado em Cymbopogon
nardus e C. pendulus (SANGWAN et al., 2001) em Ocimum basilicum e O.
americanum (KHALID, 2006),
Tanacetum parthenium (CARVALHO et al.,
2003) e Salvia officinalis (BETTAIEB et al., 2009).
O estresse hídrico provoca diversas alterações em vários fatores
fisiológicos e bioquímicos, tais como: fechamento estomático, aumento na
síntese de ácido abscísico, de solutos compatíveis, alterações no conteúdo e
elasticidade da parede celular, diminuição da emissão de folhas e redução da
área foliar (JOLY; ZAERR, 1987; KOZLOWSKI; PALLARDY, 2002). Enquanto
no caule, ocorre aumento na resistência ao fluxo hídrico nos tecidos vasculares
e nas raízes (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Em nível tissular, Melo et al., (2007) estudando a anatomia de Setaria
anceps e Paspalum paniculatum sob condições de estresse hídrico,
observaram reduções no diâmetro do metaxilema, córtex radicular, feixe
vascular,
espessura do limbo foliar e
aumento no tamanho de células
buliformes. Além disso, no trabalho desenvolvido por Bosabalidis e Kofidis
(2002) com duas cultivares de oliva, submetidas aos potenciais hídricos foliares
4
de -0,03 MPa e -1,5 MPa foi observadoaumentos significativos na densidade
estomática, espessura da cutícula, número e alongamento de esclereides.
Batista et al., (2010)
e Chartzoulakis et al., (2002)
estudando
cultivares de café (Bourbon amarelo e B. catimor) e abacate (Persea
americana) respectivamente, submetidas as estresse hídrico, observaram
alterações na espessura dos parênquimas paliçádicos e esponjosos, do limbo
e da cutícula foliar. Mudanças nos aspectos anatômicos de espécies em
condições de estresse hídricos podem ser consideradas mecanismos de
aclimatação, pois alteram a difusão de dióxido de carbono nos espaços
intercelulares do mesofilo podendo contribuir para a manutenção da taxa
fotossintética, apesar da baixa condutância estomática.
Considerando que o estresse hídrico pode ocasionar alterações nos
aspectos anatômicos e fisiológicos, bem como na relação entre as rotas do
metabolismo primário e secundário, podendo favorecer o aumento na produção
de óleos essenciais em espécies medicinais aromáticas. O estudo dos
impactos da disponibilidade de água no solo sobre o crescimento das plantas,
bem como a compreensão dos aspectos botânicos e agronômicos da espécie
podem ajudar na obtenção de subsídios para o seu cultivo em condições de
déficit hídrico. Dessa forma, o objetivo do estudo foi avaliar os efeitos do
estresse hídrico no crescimento, trocas gasosas foliares, morfoanatomia,
ultraestrutura foliar, rendimento e composição química do óleo essencial de
Ocimum
africanum.
5
2.
REFERENCIAL TEÓRICO
2.1
Família Lamiaceae e o gênero Ocimum
Representada por cerca de 264 gêneros e 6.990 espécies, a família
Lamiaceae, antigamente conhecida como Labiate, é constituídas por ervas
anuais ou perenes, subarbustos ou arbustos, e raramente mencionadas como
árvores de pequeno porte. A família apresenta ampla distribuição, ocorrendo
principalmente nas regiões tropical e subtropical da Ásia, África, América
Central e do Sul (BARROSO, 1991). Devido à produção de óleos essenciais
muitas espécies desta família são importantes pelo uso medicinal, aromático,
cosmético, condimentar e alimentício.
As espécies do gênero Ocimum são cultivadas na Europa e na América
devido suas propriedades medicinais. No Brasil encontram-se espécies
naturalizadas e cultivadas, tais como: O. basilicum L., O. americanum L., O.
gratissimum L., O. minimum L. e O. tenuiflorum L. Sendo a África o possível
centro de origem e diversificação do gênero (ALBURQUERQUE et al., 1998).
As plantas podem ser consideradas com verdadeiras fábricas químicas, pelo
seu potencial em sintetizar substâncias altamente complexas, tais como
hidrocarbonetos terpênicos, álcoois, aldeídos, cetonas, fenóis e ácidos
orgânicos (SIMÕES; SPITZER, 2004).
No gênero Ocimum a diversidade
química entre as espécies é grande em termos qualitativos e quantitativos para
o óleo (VANI et al., 2009) e flavonóides (GRAYER et al., 2004;VIEIRA et al.,
2003).
São constituintes majoritários das espécies do gênero Ocimum estragol,
eugenol, metil-eugenol, citral, linalol, geraniol e timol (SIMON et al.,1990;
BLANK et al., 2004; KHALID et al., 2006; VANI et al., 2009). Esses compostos
são responsáveis pelas ações antimicrobiana (FARAGO et al., 2004), inseticida
(DE PAULA et al., 2003, DE PAULA et al., 2004) e antioxidante (PEREIRA;
6
MAIA, 2007). Além disso, no mercado internacional as espécies do gênero
Ocimum que apresentam altos teores do componente majoritário como o linalol
tem elevados preços, por ser este componente muito utilizado como
aromatizante pelas indústrias alimentícias e como fixador da fragrância
mundialmente conhecida como perfume Chanel n° 5 (ERENO, 2006).
Entretanto, o linalol também é sintetizado pelas indústrias químicas e vendido
para algumas indústrias de perfumes. A diferença está nos preços de mercado
e, segundo o Instituto Agronômico de Campinas (IAC, 2005), o litro do linalol
sintético foi cotado entre US$ 18,00 a US$ 22,00, enquanto o produto natural
chega a ser cotado a US$ 50,00 o litro.
Devido à elevada cotação no mercado internacional, a obtenção do óleo era
feita no século passado por meio do extrativismo da espécie arbórea da
Amazônia Aniba roseadora D. conhecida popularmente como pau-rosa
(PRAVUSCHI, et al., 2010). Essa obtenção insustentável da matéria-prima a
partir do corte dos troncos das árvores levou A. roseadora à lista de espécies
em extinção do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA), na categoria de perigo. Diante desse quadro várias
espécies vêm sendo pesquisadas como fonte alternativa de obtenção dessa
matéria-prima, sendo o manjericão a que apresenta maior potencial
agronômico para a extração do linalol por produzir elevado teor de óleo e
possuir ciclo de vida curto.
No Brasil o cultivo do manjericão (Ocimum basilicum) já é uma realidade.
Na cidade de Votuporanga, em São Paulo, foi instalada em 2005 uma pequena
empresa que exportou o primeiro lote comercial do óleo para uma empresa
canadense do setor de perfumaria. Segundo o pesquisador do Instituto
Agronômico de Campinas (IAC) no início à expectativa era de uma produção
de 15 toneladas por hectare, colhida duas vezes por ano, mas devido à
adaptação da espécie as condições climáticas em vez de duas colheitas ao
ano foram feitas quatro, uma a cada 90 dias, tendo uma produção estimada de
60 toneladas por hectares (ERENO, 2006; IAC, 2005).
Outro constituinte majoritário do óleo essencial das espécies do gênero
Ocimum que merece destaque é o eugenol. Assim como o linalol o eugenol é
uma fonte importante para as indústrias de perfumaria (OLIVEIRA et al., 2009).
7
Além disso, é matéria-prima para a obtenção de vanilina, usada na
aromatização de doces e cigarros perfumados (COSTA, 2000).
Apesar da importância das espécies do gênero nos aspectos medicinais e
econômicos, ainda são escassos estudos botânicos e agronômicos da espécie
O. africanum. Em geral, existe uma grande dificuldade na classificação das
espécies do gênero Ocimum devido ao grande número de subespécies e
variedades ocorrentes.
Entre as principais características utilizadas na diferenciação destas
espécies, considera-se o tamanho e a cor das folhas, flores e inflorescência,
assim como a composição química de seus óleos. Tal diversidade morfológica
e química provavelmente é originada pela polinização cruzada, comum entre as
espécies do gênero, facilitando assim a hibridização interespecífica e a
poliploidia (BLANK et al., 2004; VANI et al.,2009). Segundo Cárovic-Stanko, et
al., (2010a) há dois clados separados dentro do gênero, sendo que a espécie
O. africanum esta presente no clado da espécie O. americanum. Ainda
segundo este autor, a espécie O. africanum tem como sinonímia Ocimum X
citriodorum. Considerando está sinonímia, foi relatado que o óleo essencial
desta espécie (Ocimum X citriodorum) apresentou ação antibacteriana
(CAROVIC´- STANKO et al.,, 2010 b) e antioxidante (HAKKIM et al.,, 2008).
2.2
Plantas medicinais: Fatores ambientais que afetam a produção e
composição química do óleo essencial.
Os óleos essenciais são substâncias voláteis extraídas de plantas
aromáticas, constituindo matéria-prima de grande importância para as
indústrias cosmética, farmacêutica e alimentícia. Produzidas em diferentes
órgãos da planta (folhas, flores, madeiras, ramos, caules e frutos), são
compostos formados por várias substâncias químicas, como álcoois, aldeídos,
ésteres, fenóis e hidrocarbonetos, havendo sempre a prevalência de uma ou
duas delas, que assim irão caracterizar os aromas. São sintetizados e
armazenados em diferentes estruturas secretoras especializadas, tais como:
tricomas glandulares, células idioblastos, canais oleíferos (SIMÕES; SPITZER,
2004).
8
A síntese dos óleos essenciais ocorre através de rotas específicas do
metabolismo secundário que possui estreita relação com o metabolismo
primário. O processo sintético primário é a fotossíntese, por meio da qual as
plantas utilizam a energia solar para a produção de compostos orgânicos.
(CASTRO et al., 2004).
Os metabólitos secundários podem ser divididos em três grupos
quimicamente
distintos:
terpenos,
compostos
fenólicos
e
compostos
nitrogenados. Os terpenos, ou terpenóides, constituem a maior classe de
produtos secundários, formados por unidades de isoprenos. As substâncias
desta classe são, em geral, insolúveis em água e sintetizados a partir de acetil
CoA ou de intermediários glicolíticos ( TAIZ; ZEIGER, 2004).
A rota do ácido mevalônico envolve a condensação de três moléculas
de acetil CoA. Esse intermediário de seis carbonos sofre uma série de reações
culminando na produção do isopentenil difosfato (IPP 2), que é a unidade básica
na formação dos terpenos. O IPP pode ser sintetizado também a partir de
intermediários da glicólise (Piruvato) ou do ciclo de Calvin (Gliceraldeído-3fosfato), através da rota do metileritritol fosfato (MEP) que ocorre nos
cloroplastos e outros plastídios (CROTEAU et al., 2000; CASTRO et al., 2004;
TAIZ E ZEIGER, 2004).
A classificação da composição química dos óleos essenciais dá-se pelo
número de unidades de isoprenos (também conhecidas como unidades C5). Os
terpenos com duas unidades C5 (10 carbonos) são classificados como
monoterpenos; os com três unidades de C5 (15 carbonos) são os
sesquiterpenos e os de quatro unidades de C5 (20 carbonos) são classificados
como diterpenos. Os maiores terpenos são os triterpenos (30 carbonos),
tetraterpenos (40 carbonos) e politerpenóides ([C5]n carbonos, onde n>8) (TAIZ;
ZEIGER, 2004; CASTRO et al.,, 2004).
Do
ponto
de
vista
ecológico
muitas espécies
vegetais
secretam
determinadas substâncias aromáticas para atração de insetos, pássaros e
mamíferos nas épocas mais favoráveis para a floração e frutificação.
Frequentemente essa emissão está sincronizada com as horas de atividade do
polinizador ou do frugívero (LACHER, 2000).
O estudo de plantas medicinais vem aumentando consideravelmente nos
últimos anos, principalmente nos aspectos relacionados à adaptabilidade e ao
9
cultivo destas plantas em substituição ao extrativismo que ainda impera com
inúmeras espécies vegetais. A quantidade e a composição química do óleo
essencial de uma planta medicinal podem variar em função do estádio de
desenvolvimento da planta, dos tratos culturais adotados, das condições de
cultivo e do próprio ambiente (MORAIS, 2009).
Para a produção de plantas medicinais, é necessário o estabelecimento de
práticas agronômicas pouco agressivas, que estimulem o crescimento e o vigor
das mesmas, sem comprometimento da qualidade do produto fitoterápico a ser
comercializado. Em outras palavras, as plantas precisam crescer bem, possuir
resistência aos estresses bióticos e abióticos e produzir a maior quantidade
possível de biomassa ou de substâncias com atividade medicinal inerente a
cada espécie. E nesse sentido, os esforços são para maximizar a produção dos
constituintes ativos dessas espécies utilizando informações sobre o efeito das
condições ambientais, tais como: luz, temperatura, adubação e a escassez de
água.
Entre os fatores abióticos a luz e a disponibilidade hídrica são os que mais
afetam a produção de biomassa, pois tem um efeito negativo no crescimento e
no desenvolvimento vegetal. Nas plantas medicinais a deficiência hídrica pode
afetar o teor, rendimento e composição química dos óleos essenciais variando
com o tipo, a intensidade e a duração do estresse. Estudo realizado com as
espécies Cymbopogon pendulus (Steud) e C. nardus (L.) Rendle var
confertiflorus mostrou variação na fração de monoterpenos de acordo com a
intensidade e a duração da deficiência hídrica, sendo que aos 45 dias após a
imposição do estresse moderado, houve aumento significativo de geraniol e a
diminuição de citral para a espécie C. nardus L. (SINGH-SANGWAN, et
al.,1994). Resultados semelhantes foram observados por Simon et al., (1990)
que ao avaliarem os efeitos do déficit hídrico em Ocimum basilicum
encontraram aumento no conteúdo do óleo essencial e alteração na
composição do mesmo sob estresse hídrico leve (- 0,68 MPa) e moderado (1,12 MPa). Sob déficit hídrico moderado, o conteúdo de óleo passou de 3,1
para 6,2 µL g-1 de massa seca.
Silva et al., (2002) estudando o efeito de diferentes níveis de estresse
hídrico sobre as características de crescimento e a produção de óleo essencial
de Melaleuca alternifolia Chell, verificaram que a deficiência hídrica foi
10
responsável pelo incremento na biomassa, porém sem diferenças significativas
no teor
e na composição química dos principais componentes do óleo
essencial. Enquanto, Marchese et al., (2010) avaliando a espécie Tanacetum
parthenium L, conhecida popularmente como artemísia, após 14, 38, 62 e 86
horas da suspensão da irrigação, com os potencias hídricos correspondente a 0,54; -1,34; -2,51 e -3,97 MPa respectivamente, verificaram aumento no teor
de
artemisinina
comprometimento
após
da
as
38
produção
horas
de
do
corte
biomassa
da
irrigação,
fresca
nesta
sem
o
condição,
considerada pelos autores como déficit hídrico moderado.
Em plantas medicinais a relação estresse hídrico, produção de biomassa e
de óleo essencial, algumas vezes comporta-se como via de mão dupla, pois
em condições de estresse leve a produção de compostos terpênicos tende a
aumentar, porém com o estresse severo há uma redução no crescimento, ou
seja, menor biomassa e consequentemente menor rendimento de óleo
essencial. A relação contraditória observada pode estar relacionada com a
alocação diferencial de recursos (partição de fotoassimilados) dentro da planta.
Essa relação é conhecida como fonte/dreno, na qual as fontes são folhas e
caules verdes, enquanto o dreno são os meristemas, idioblastos que acumulam
alcaloides e taninos e tricomas glandulares que acumulam os óleos essenciais
(LEONARDO 2007; CUTTER, 1986).
Entender como os possíveis fatores abióticos interferem na fisiologia,
crescimento e na constituição química do óleo essencial é fundamental para a
determinação de novas técnicas agronômicas. No caso das plantas medicinais,
estes estudos visam o aumento da produção de biomassa e o rendimento do
óleo essencial, sem alterar a composição química e sem comprometer o seu
valor terapêutico, atendendo assim as exigências do mercado consumidor
(CASTRO et al., 2004; COSTA et al., 2010).
2.4
Déficit hídrico: efeitos e respostas na morfofisiologia de plantas.
No ambiente são observadas várias condições adversas que podem limitar
o desenvolvimento e reduzir as chances de sobrevivência dos vegetais.
Quando ocorrem, tanto permanentemente ou eventualmente no ambiente,
podem ocasionar o estresse. O estresse é frequentemente definido como o
11
desvio significativo das condições ótimas para a vida, induzindo mudanças e
respostas em todos os níveis funcionais do organismo, as quais são
reversíveis, no início, mas podem se tornar permanentes, ocasionando até a
morte (LARCHER, 2000).
O estresse hídrico é causado principalmente pela falta de água, devido à
seca ou alta salinidade no solo. Em caso de solos salinos e outras condições,
como inundações e baixas temperaturas no solo, a água está na solução do
solo, mas as plantas não conseguem absorver, situação conhecida como “seca
fisiológica” (LISAR et al., 2012). Apesar das primeiras respostas aos estresses
por déficit hídrico e salino serem idênticas, sob o estresse salino prolongado as
plantas respondem, além da desidratação, à toxicidade de íons. Essa resposta
pode ser dada através da prevenção à entrada de sal (exclusão em toda a
planta ou em nível celular) ou redução da concentração de sais no citoplasma
(por compartimentalizar sal nos vacúolos) (MUNNS et al., 2006; CHAVES et al.,
2009).
O déficit hídrico é um dos principais fatores de estresse que afetam quase
todos os organismos, incluindo o homem em termos de saúde e alimentação.
As plantas terrestres, na sua maioria, estão ou serão expostas ao estresse
hídrico por um período curto ou longo, em algum momento do seu ciclo de vida,
e tendem a desenvolver alguns mecanismos de aclimatação às mudanças das
condições ambientais (AKINCI; LOSEL, 2012). Segundo Larcher (2000) a seca
ocorre quando há um período de baixa precipitação, na qual o conteúdo de
água no solo é reduzido, de forma a tornar-se indisponível para as plantas.
Normalmente, o estado de dessecação do solo é acompanhado por alta
demanda evaporativa e altos níveis de radiação e temperatura, ou seja, nas
plantas que estão sob estresse hídrico à disponibilidade de água nas suas
raízes torna-se limitante ou a taxa de transpiração é intensa.
A resistência da planta ao estresse está dividida em duas categorias:
tolerar e evitar o estresse. No caso do déficit hídrico, evitar à seca é a
capacidade da planta em manter o potencial hídrico alto nos tecidos mesmo
sob condições de seca, enquanto tolerar a seca é a capacidade da planta para
manter as suas funções normais, mesmo com o valor de potencial hídrico
reduzido (LISAR et al., 2012).
12
Em condições de déficit hídrico o crescimento e desenvolvimento dos
vegetais são afetados através da redução da turgescência celular, da taxa
fotossintética, transpiração, processos de abertura e fechamentos dos
estômatos, divisão e expansão celular, assim como o fornecimento de
compostos orgânicos e inorgânicos para a síntese de novo protoplasma e
paredes celulares (AKINCI; LÖSEL, 2012). Além disso, algumas respostas
morfofisiológicas ao estresse são bem evidentes, tais como aumento da
respiração, inibição da fotossíntese, redução da produção de biomassa, baixa
fertilidade, senescência prematura, clorose foliar, alterações anatômicas e
aumento no consumo de energia para os processos de reparação
(BOSABALIDIS et al., 2002; PETROPOULOS et al., 2008; BAGHALIAN et
al.,2011; REHEM et al.,2012; BAHREININEJAD et al.,2013).
A deficiência hídrica pode ainda ser caracterizada por modificações
anatômicas e ultraestruturais, tais como reduções no tamanho das células dos
tecidos clorofilianos, condensação da cromatina, alterações dos cloroplastos,
distorção dos tilacóides, redução na quantidade e tamanho dos grãos de
amido, aumento no número de plastoglóbulos e formação de vesículas (GILES
et al., 1974; OLMOS et al., 2007; WANG et al., 2012). Investigações
anatômicas feitas com a espécie medicinal Rosmarinus officinalis (OLMOS et
al., 2007) mostraram que a espessura do mesofilo, o tamanho das células
epidérmicas e dos espaços intercelulares foram significativamente reduzidos
nas condições de maior deficiência e, em nível ultraestrutural, foram ainda
observadas, nesta espécie alterações nos cloroplastos e acúmulos de
plastoglóbulos.
Dessa forma, o efeito do déficit hídrico na assimilação de CO2, crescimento
e produção de óleo essencial pode ter sua compreensão mais explorada com o
estudo das características anatômicas, ultraestruturais e bioquímicas. Apesar
de haver diversas pesquisas na literatura que apontem os efeitos do estresse
por seca em espécies medicinais, ainda são escassos estudos que considerem
os aspectos anatômicos e fisiológicos, como por exemplo, a eficiência no uso
da água na produção do óleo essencial.
13
REFERÊNCIAS
ALBUQUERQUE, U.P.; ANDRADE, L. H. de. El género Ocimum L.
(Lamiaceae) en el nordeste del Brasil. Anales Jardim Botanico Madrid. v.
56,p.43-64, 1998.
AKINCI, S. LÖSEL, D.M . Plant water-stress response mechanisms. In;
RAHMAN, I. M.. M. & HASEGAWA, H. Water Stress. (Ed.) Agricultural and
Biological Sciences: Hard cover, pg.300. 2012
BARROSO, G.M. Sistemática de angiospermas do Brasil. Viçosa, UFV,
Impr.Univ. v.3. p 326. 1991
BATISTA, L.A.; GUIMARÃES, R. J.; PEREIRA, F.J.; CARVALHO,G.R.;
CASTRO, E.M. Anatomia foliar e potencial hídrico na tolerância de cultivares de
café ao estresse hídrico. Revista Ciência Agronômica, v. 41, n. 3, p. 475-481,
jul./set., 2010.
BAGHALIAN,K; ABDOSHAH,SH; SIGAROODI-KHALIGHI,F; PAKNEJAD,F.
Physiological and phytochemical response to drought street of German
chamomile (Matricaria recrutita L.). Plant physiology and Biochemistry, v. 49,
p.201-207,2011.
BAHREININEJAD, A. B.; RAZMJOO. J.; MIRZA, M. Influence of water stress on
morpho-physiological and phytochemical traits in Thymus daenensis.
International Journal of Plant Production v.7, n.1, p.151-166, 2013.
BLANK, A.F; SOUZA,E.M; ARRIGONI-BLANK,M.F; PAULA,J.W.A; ALVES,P.B.
Novas Cultivares Maria Bonita: cultivar de manjericão tipo linalol. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v.42, p.1811-1813, 2007.
BLANK, A.F.; CARVALHO FILHO, J.L.S.; SANTOS NETO, A.L.; ALVES, P.B.;
ARRIGONI-BLANK, M.F.; SILVA-MANN, R.; MENDONÇA, M.C. Caracterização
morfológica e agronômica de acessos de manjericão e alfavaca. Horticultura
Brasileira, Brasília, v.22, p. 113-116, 2004.
BETTAIEB, I; ZAKHAMA,N; AIDI WANNES, W; KCHOUK M.E; MARZOUK, B.
Water deficit effects on Salvia officinalis fatty acids and essential oils
composition. Scientia Horticulturae. v. 120 p. 271–275, 2009
BOSABALIDIS,A.M; KOFIDIS G. Comparative effects of drought stress on leaf
anatomy of two olive cultivars. Plant Science. v.163, p. 375- 379, 2002.
CASTRO, H.G; FERREIRA, F.A; SILVA, D.J.H; MOSQUIM,P.R. Contribuições
ao estudo das plantas medicinais: metabólitos secundários. 2ed. Visconde
do Rio Branco, 2004, p.113.
14
CARVALHO, L.M.; CASALI, V.W.D.; SOUZA, M.A.; CECON, P.R.
Disponibilidade de água no solo e crescimento de artemísia. Horticultura
Brasileira, Brasília, v. 21, p. 726-730, 2003.
CAROVIC´-STANKO, K;LIBER,Z; BESENDORFER, V; JAVORNIK, B;
BOHANEC,B;KOLAK, I; SATIVIC, Z. Genetic relations among basil taxa
(Ocimum L.) based on molecular markers,nuclear DNA content, and
chromosome number. Plant System Evolution v. 285, p.13-22, 2010a.
CAROVIC´-STANKO, K; ORLIC,S; POLITEO,O; STRIKIC,F; KOLAK,I;
MILOS,M; SATOVIC,Z. Composition and antibacterial activities of essential oils
of seven Ocimum taxa. Food Chemistry v.119, p.196-201, 2010b.
CHAVES, M. M.; FLEXAS J.; PINHEIRO, C. Photosynthesis under drought and
salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany
v.103, p.551-560, 2009.
CHARTZOULAKI, S. K; PATAKAS, A; KOFIDIS, G; BOSABALIDIS,A;
NASTOU,A. Water stress affects leaf anatomy, gas exchange, water relations
and growth of two avocado cultivars. Scientia Horticulturae. v.95 p.39-50,
2002.
COELHO, E.F; FILHO, M.A.C; OLIVEIRA, S.L. Agricultura irrigada: eficiência
de irrigação e de uso da água. Bahia Agrícola, v.7, p. 57-60,2005
COSTA P.R.R. Safrol e eugenol: estudo da reatividade química e uso em
síntese de produtos naturais biologicamente ativos e seus derivados. Química
Nova v.23, p.357-369, 2000.
COSTA,L. C. B. ; PINTO, J. E. B. P. ; BERTOLUCCI,S.K.V.; GUIMARÃES,
R.M. Qualidade fisiológica de sementes de Ocimum selloi benth. Sob
condições de luz, temperatura e tempo de armazenamento. Ciências Agro
técnica, v. 34, p. 675-680, 2010.
CUTTER, E. Anatomia vegetal: Parte I Células e tecidos. 2a ed. Roca, São
Paulo, p. 304, 1986.
CROTEAU R, KUTCHAN, TM, LEWIS NG. Natural products:secondary
metabolites. In Buchanan B, Gruissem W, Jones R (Eds.), Biochemistry and
Molecular Biology of Plants. Rockville, MD: American Society of Plant
Physiologists. p. 1250-1318. 2000
DE PAULA, J.P.; GOMES-CARNEIRO, M.R.; PAUMGARTTEN, F.J.R.
Chemical composition, toxicity and mosquito repelency of Ocimum selloi oil.
Journal of Ethnopharmacology, v. 88, p. 253-260, 2003.
DE PAULA, J.P.; FARAGO, P.V.; CHECCHIA, L. E. M; HIROSE, K. M.; RIBAS
J. L.C. Atividade Repelente do Óleo Essencial de Ocimum selloi Benth.
(variedade eugenol) contra o Anopheles braziliensis Chagas. Acta Farm.
Bonaerense. v. 23, p.376-388, 2004.
15
DUBEY,N. K.; TIWARI,T.N. A, MANDIN,D.; ANDRIAMBOAVONJY, H.;
CHAUMONT, J.P. Antifungal properties of Ocimum gratissimum essential oil
(ethyl cinnamate chemotype). Fitoterapia. v.71, p.567- 569, 2000
ERENO, D. Perfume de manjericão. Revista FAPESB v.12, n.120, p 25-28,
São Paulo, fevereiro 2006.
FARAGO, P. V.; BITTENCOURT, J. M.; DE PAULA, J. P.; ZARPELLON, V.;
CHECCHIA, L. E. M. Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Ocimum
selloi Benth. (LAMIACEAE) Ciências Biológicas Saúde, v.10, p. 59-63, 2004.
IAC. Pesquisa do IAC leva óleo de manjericão para o Canadá. O
Agronômico, Campinas, v.57, p. 32-33, 2005.
GILES,K.L.; BEARDSELL,M.F.; COHEN,D. Cellular and Ultrastructural
Changes in Mesophyll and Bundle Sheath Cells of Maize in Response to Water
Stress. Plant Physiology v.54, p. 208-212, 1974.
GRAYER, R.; VIEIRA, R.F.;PRICE, AM.; KITE,G.C.; SIMON,J.E.; PATON,A.J
Characterization of cultivars within species of Ocimum by exudate flavonoid
profiles. Biochemical Systematics and Ecology, v.32, p. 901-913, 2004.
HAKKIM,F.L; ARIVAZHAGAN,G; BOOPATHY,R. Antioxidant property of
selected Ocimum species and their secondary metabolite content . Journal of
Medicinal Plants Research. v. 2, p. 250-257,2008.
JOLY.R.J; ZAERR,J.B. Alteration of cell-wall water content and elasticity in
Douglas-fir during periods of water deficit. Plant Physiology. v.83, p.418-422,
1987.
KHALID, K. H. A. Influence of water stress on growth, essential oil, and
chemical composition of herbs (Ocimum sp.). International Agrophysics, v.20,
p. 289-296, 2006.
KOZLOWSKI T. T; PALLARDY,S.G. Acclimation and Adaptive Responses of
Woody Plants to Environmental Stresses. The Botanical Review v.68, p. 270334, 2002.
LARCHER, W. Ecofisiologia Vegetal. São Carlos, Rima, 2000. 531p.
LEMOS, J. A; PASSOS, X.S; FERNANDES,O.F.L; DE PAULA, J.R;
FERRI,P.H; HASIMOTO,L.K; LEMOS, A.A;SILVA, M.R.R. Antifungal activity
from Ocimum gratissimum L. towards Cryptococcus neoformans. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz, v.100, n.1, p. 55- 68, 2005.
LEONARDO, M. Produção de óleo essencial associado à deficiência
hídrica em plantas de Ocimmum basilicum L.cv. genovese. 2007. 132 f.
16
Tese (Doutotado em Agronomia )- Universidade Estadual Paulista, Faculdade
de Ciências Agronômicas, Botucatu,2007
LISAR, S. Y. S.; MOTAFAKKERAZAD, R.; HOSSAIN, M. M.; RAHMAN, I. M.
M. Water Stress in Plants: Causes, Effects and Responses, In: RAHMAN, I.
M.M.; HASEGAWA, H. Water Stress. (Ed) Agricultural and Biological Sciences:
Hard cover, p. 300, 2012.
MERCHESE, J.A.; FERREIRA,J.F.S.; REHDER,V.L.G.; RODRIGUES,O. Water
deficit effect on the accumulation of biomass and artemisinin in annual
wormwood (Artemisia annua L., Asteraceae). Brazilian Society of Plant
Physiology. v.22, p.1-9, 2010
MELO, H. C. et al., Alterações anatômicas e fisiológicas em Setaria anceps
Stapf ex Massey e Paspalum paniculatum L. sob condições de déficit hídrico.
Hoehnea, v. 34, p. 145-153, 2007.
MORAIS, L. A. S.. Influência dos fatores abióticos na composição química dos
óleos essenciais. Horticultura Brasileira v. 27, p.4050-4063, (Suplemento CDROOM), 2009.
MUNNS R, JAMES RA, LAUCHLI A. Approaches to increasing the salt
tolerance of wheat and other cereals. Journal of Experimental Botany v. 57,
p.1025–1043, 2006
NAKAMURA, C.V.; UEDA-NAKAMURA, T.; BANDO,E.; MELO, A.F.N.;
CORTEZ, D.A.G.; FILHO, B.P.D.Antibacterial Activity of Ocimum gratissimum
L. Essential Oil. Memórias do Instituto Osvaldo Cruz. v. 94, p. 675-678,
1999.
OLMOS, E.; SÁNCHEZ-BLANCO, M. J.; FERRÁNDEZ,T.; ALARCÓN,J.J.
Subcellular Effects of Drought Stress in Rosmarinus officinalis. Plant Biology.
V.9 , p.77-84, 2007.
OLIVEIRA, R. A.; REIS, T.V.; DUARTE, L.P.; SACRAMENTO, C.K.; OLIVEIRA,
F.F. Constituintes químicos voláteis de especiarias ricas em eugenol. Revista
Brasileira de Farmacognosia. v. 19, p. 771-775, 2009.
PETROPOULOS, S.A.; DAFERERA D; POLISSIOU M.G.; PASSAM H.C. The
effect of water deficit stress on the growth, yield and composition of essential
oils of parsley. Scientia Horticulturae. v.115, p.393-397, 2008.
PEREIRA, C. A. M.; MAIA, J. F. Estudo da atividade antioxidante do extrato e
do óleo essencial obtidos das folhas de alfavaca (Ocimum gratissimum L.).
Ciência Tecnologia Alimentos. v.27, p. 624-632, 2007.
PRAVUSCHI, P.R., MARQUES,P.A.A., RIGOLIN,B.H.M., SANTOS,A.C.P.
Efeito de diferentes lâminas de irrigação na produção de óleo essencial de
17
manjericão (Ocimum basilicum L.). Acta Scientiarum Agronomy. Maringá,
v.32, p.687-693, 2010.
REHEM, B. C.; BERTOLDE, F. Z.; ALMEIDA, A.A. F. Regulation of Gene
Expression in Response to Abiotic Stress in Plants. In: PAULA BUBULYA. Cell
Metabolism - Cell Homeostasis and Stress Response Biochemistry,
Genetics and Molecular Biology, Hard cover, 208 pages, 2012.
SANGWAN, N. S; FAROOQI, A.H.A; SHABIH,F; SAGWAN, R.S. Regulation of
essential oil production in plants. Plant Growth regulation, v. 34, p. 3-21,
2001.
SINGH-SANGWAN, N.; FAROOQI, A. H.A.; SANGWAN R. S. Effect of drought
stress on growth and essential oil metabolism in lemongrasses. New
phypatology v.128, 173-179, 1994.
SIMÕES, C. M. O.; SPITZER, V. Óleos Voláteis. In: SIMÕES, C. M. O.;
SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. (Org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed.
Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, cap. 18, p.
475, 2004.
SIMON, J.E. J.Q.; MURRAY, R.G. Basil: A source of essential oils. p. 484489. In: J. Janick and J.E. Simon (eds.), Advances in new crops. Timber Press,
Portland, OR. 1990.
SILVA R. S. S, DEMUNER, A. J ; BARBOSA, L. C DE A; CASALI,V.W.D;
NASCIMENTO,E.A; PINHEIRO,A.L. Efeito do estresse hídrico sobre
características de crescimento e a produção de óleo essencial de Melaleuca
alternifolia Cheel. Maringá, v. 24, p. 1363-1368, 2002.
TAIZ. L.; ZEIGER. E. Fisiologia vegetal. 3ed. Porto Alegre: Artmed, 2004,
719p.
VANI, S.B; CHENG,S.F;CHUAH,C.H. Comparative Study of Volatile
Compounds from Genus Ocimum. American Journal of Applied Sciences
v.6, p.5, 23-528, 2009.
WANG, S.; LIANG, D.; CHAO LI.; HAO Y.; FENGWANG MA.; SHU H. Influence
of drought stress on the cellular ultrastructure and antioxidant system in leaves
of drought-tolerant and drought-sensitive apple rootstocks. Plant Physiology
and Biochemistry, v.51, p. 81- 89, 2012.
18
CAPÍTULO I – CRESCIMENTO, ASSIMILAÇÃO DE CARBONO E
EFICIÊNCIA DE USO DA ÁGUA NA PRODUÇÃO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DO ÓLEO ESSENCIAL DE Ocimum africanum Lour. (Lamiaceae) SOB
DÉFICIT HÍDRICO.
RESUMO
A disponibilidade de água é um fator de grande importância para as plantas,
por atuar no crescimento, na sustentação, processos fisiológicos e bioquímicos
do vegetal. Quando há ocorrência de déficit hídrico, as plantas podem
desenvolver habilidades para se aclimatarem ao novo ambiente, no entanto
esses mecanismos podem afetar o desenvolvimento e, no caso das plantas
medicinais a síntese de óleo essencial. Para avaliar os efeitos do déficit hídrico
na espécie medicinal Ocimum africanum mudas foram propagadas via seminal
e submetidas a 100, 80, 70, 60% da capacidade de campo referentes aos
potenciais hídricos do ramo, medidos antes do amanhecer, de -0,5; -0,9; -1,6 e
-1,9 MPa, respectivamente. Os parâmetros avaliados foram: produção de
biomassa seca, potencial hídrico antemanhã do ramo, trocas gasosas foliares e
eficiência de uso da água com base na produção de óleo essencial. O óleo das
plantas dos diferentes tratamentos foi extraído pelo processo de
hidrodestilação utilizando o aparelho de Clevenger e analisado por
cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de massa. As plantas de
O. africanum, sob déficit hídrico, apresentaram reduções nas trocas gasosas
foliares e do teor de pigmentos cloroplastídicos ao longo do tempo. O consumo
hídrico também foi reduzido e a produção de biomassa foi afetada
negativamente, acarretando menor rendimento do óleo essencial e menor
eficiência do uso da água para a produção de biomassa (EUAbm). Contudo, um
aumento no teor e na eficiência de produção de óleo essencial (óleo produzido/
água consumida) foram constatados entre os potenciais de -0,9 e -1,6 MPa.
Além disso, não foram verificadas grandes alterações na composição química
do óleo essencial em relação ao potencial de -0,5 MPa, que apresentou
isoeugenol como constituinte majoritário nas folhas e inflorescências nos
diferentes potenciais hídrico do ramo. Para O. africanum o potencial hídrico de
-0,9 MPa, ou seja 80% da capacidade de campo, mostrou-se como e a melhor
condição para o crescimento e produção de óleo essencial espécie. E
considerando a produção e qualidade do óleo essencial, o cultivo torna-se
economicamente viável nessa condição.
Palavras-chave: Irrigação, Manjericão, Fotossíntese, Terpenos.
19
CHAPTER I - GROWTH, CARBON ASSIMILATION AND WATER USE
EFFICIENCY IN THE PRODUCTION AND CHEMICAL COMPOSITION OF
THE Ocimum africanum Lour. (Lamiaceae) ESSENTIAL OIL UNDER
WATER DEFICIT
ABSTRACT
Water availability is a factor of great importance for plants, by acting on their
growth, support and physiological and biochemical processes. When there is
water deficit, plants can develop skills to adapt themselves to the new
environment, however these mechanisms can affect their development and, in
the case of medicinal plants, the synthesis of essential oil. To evaluate the
effects of water deficit in the medicinal species Ocimum africanum, seedlings
were propagated via semen and submitted to the field capacity of 100, 80, 70
and 60% related to the branch water potentials of -0,5, -0.9, -1.6 and -1.9 MPa,
respectively, measured before dawn. The evaluated parameters were: dry
biomass production, branch pre-dawn water potential, leaf gas exchange and
water use efficiency based on essential oil production. The oil of the plants of
the different treatments was extracted by the hydrodistillation process using the
Clevenger apparatus and analyzed by gas chromatography coupled to a mass
spectrometer. O. africanum plants under water deficit showed reductions in leaf
gas exchange and chloroplastid pigment content over time. The water
consumption was also reduced and the biomass production was negatively
affected, resulting in lower yields of essential oil and less water use efficiency
for biomass production (EUAbm). However, an increase in the essential oil
content and production efficiency (oil produced/ consumed water) were
observed between the -0.9 and -1.6 MPa potentials. Furthermore, there were no
major changes in the essential oil chemical composition in relation to the -0.5
MPa potential, which presented isoeugenol as the main constituent on leaves
and inflorescences at different branch water potentials. For O. africanum, the 0.9 MPa potential, which corresponds to 80% of field capacity, was proved as
the best condition for the essential oil growth and production for this species.
And considering the essential oil production and quality, the cultivation becomes
economically viable in this condition.
Keywords: Irrigation, Basil, Photosynthesis, Terpenes.
20
INTRODUÇÃO
Nas plantas medicinais, aromáticas e condimentares, a produção e
concentração de princípios ativos dependem não só dos fatores genéticos, mas
das interações genótipo e ambiente que acarretam uma série de alterações
morfofisiológicas, bioquímicas e moleculares, que podem afetar negativamente
o crescimento e a produtividade (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; MORAIS,
2009).
O estresse hídrico por escassez de água, em geral, decorre de dois
fatores preponderantes: baixa disponibilidade de água no solo e as altas taxas
de transpiração, condições comuns nos climas árido e semi-árido. Acredita-se
que em algum momento do ciclo de vida, muitas plantas passarão por períodos
de deficiência hídrica (AKINCI E LÖSEL, 2012). Assim, a adaptabilidade das
plantas a essas condições é influenciada pela duração e magnitude do
estresse, além da variabilidade genética (LARCHER, 2000).
O déficit hídrico resulta em várias respostas fisiológicas, tais como
fechamento dos estômatos, reduções do potencial hídrico, da condutância
estomática, da taxa fotossintética e da transpiração, bem como inibição do
crescimento, aumento no acúmulo de ácido abscísico (ABA) e de solutos
compatíveis como prolina, trealose, manitol, glicina betaína (LISAR et al., 2012;
REHEM et al., 2012). Dentre estas repostas, a fotossíntese é particularmente
sensível aos efeitos da falta de água e diretamente relacionada com o
crescimento. Sob condição de seca a redução da taxa fotossintética é atribuída
à eventos sequenciais tais como: limitação estomática, baixa eficiência de
carboxilação, comprometimento metabólico e estrutural nos cloroplastos,
alteração na atividade das enzimas fotossintéticas (TEZARA et al.,1999;
LAWLOR, 2002; PARRY et al.,2002).
O fechamento parcial dos estômatos durante os estádios iniciais da seca
é essencial para o controle na taxa de transpiração, podendo ser importante
ferramenta biológica para aumentar a eficiência no uso da água (EUA), pois
mais CO2 pode ser absorvido por unidade de água transpirada nesses
períodos. Para tirar proveito deste tipo de resposta das plantas, técnicas de
irrigação foram desenvolvidas com objetivo de melhorar a EUA como a
21
“secagem parcial da zona radicular” e “déficit hídrico regulado”. Esta última
técnica vem sendo analisada em várias espécies medicinais Amaranthus spp
(LIU E STÜTZEL 2004) Catharanthus roseus (JALEEL et al.,2008), Ocimum
basilicum e O. americanum L. (KHALID, 2006), visando aumentar a produção
de óleo essencial.
Ao longo do tempo os efeitos causados pela seca são facilmente
notados na produção de biomassa das plantas, uma vez que o crescimento em
extensão nessa condição depende da pressão de turgor, do módulo de
elasticidade da parede e do alongamento celular (JOLY E ZAERR, 1987;
LAMBERS et al.,, 2008).
Normalmente, há o aumento na razão raiz/parte
aérea, devido alteração na relação fonte/dreno, ou seja, o aumento dessa
razão ocorre devido ao menor investimento na produção de biomassa da parte
aérea (TAIZ; ZEIGER, 2004).
No que se refere à exploração de recursos do metabolismo secundário
o estudo de plantas medicinais vem aumentando consideravelmente nos
últimos anos, principalmente nos aspectos relacionados à adaptabilidade e ao
cultivo destas plantas visando à substituição do extrativismo que ainda impera
no uso de inúmeras espécies vegetais. A quantidade e a composição química
do óleo essencial de uma planta medicinal podem variar em função das
condições de cultivo e do próprio ambiente (SIMÕES; SPITZER, 2004).
No cenário atual de mudanças globais que ameaçam principalmente a
disponibilidade dos recursos naturais, dentre estes a água necessária e
imprescindível para o cultivo de inúmeras espécies vegetais, o estabelecimento
de metodologias de cultivos adequadas à baixa disponibilidade hídrica é uma
demanda, cada vez mais crescente. Dessa forma, o conhecimento do nível de
reposição de água pelos vegetais pode contribuir para a melhoria na produção
e na qualidade da matéria-prima, permitindo uma maior competitividade no
mercado.
Neste contexto, espécies do gênero Ocimum podem ser consideradas
como fortes candidatas ao cultivo em regiões com baixas precipitações. De
acordo com Blank et al., (2004) a implantação da cultura do manjericão doce
(O. basilicum) para a obtenção do óleo essencial pode ser uma atividade
alternativa promissora para os produtores do Nordeste do Brasil, devido à
cotação desse óleo no mercado internacional, que atinge o valor próximo de
22
US$ 110,00/litro, e sua adaptabilidade as condições ambientais dessa região.
Apesar da grande importância econômica das espécies desse gênero, ainda
são escassos estudos botânicos e agronômicos para a espécie Ocimum
africanum.
A espécie O. africanum é um subarbusto que apresenta um ciclo de vida
curto em torno de 90 dias. O caule é ereto, ramificado com aproximadamente
60 cm de altura, formato quadrangular em seção transversal, apresentando
tricomas ao longo de sua extensão. Suas folhas são simples, ovadas, pilosa e
estão distribuídas no caule de forma oposta e cruzada. As inflorescências são
apicais, com flores alvas e pequenas possuindo muitos tricomas glandulares e
tectores.
Assim, o conhecimento do nível de reposição de água pode contribuir
para a melhoria na produção e na qualidade da matéria-prima, permitindo uma
maior competitividade no mercado. Diante disso, o presente trabalho teve como
objetivos (i) verificar os efeitos do déficit hídrico nas trocas gasosas e teor de
pigmentos na espécie O. africanum, ao longo do tempo de imposição do
estresse; (ii) Avaliar a influência da deficiência hídrica na partição e acúmulo de
biomassa; (iii) avaliar o teor, rendimento e composição química do
óleo
essencial; (iv) quantificar a eficiência no uso da água como base na produção
de biomassa e de óleo essencial nas folhas e inflorescências da espécie.
23
MATERIAIS E MÉTODOS
Material botânico e as condições de cultivo
O experimento foi conduzido em condições de casa de vegetação no
Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz, localizada próxima à região
urbana do município Ilhéus, BA (14°47'00" S, 39°02'00" W), no período de 07
de janeiro a 17 de abril de 2012. As mudas de Ocimum africanum Lour. foram
propagadas por sementes em recipientes de 200 mL e após 15 dias, ao
atingirem 10 a 15 cm de altura foram transplantadas para vasos de 10 L (Figura
1 a-b), contendo substrato previamente adubado (Tabela 1) conforme a análise
da composição físico-química do substrato e as exigências da cultura (Tabela
2). A adubação de cobertura foi realizada a cada 15 dias, a partir do 10° dia.
Tabela 1. Fertilizantes químicos utilizados durante o experimento na adubação
de plantio e de cobertura.
Tabela 2. Análise físico-química do substrato experimental.
24
Para o controle do balanço hídrico os vasos foram pesados inicialmente
para obtenção da massa seca do solo. Após o transplante as plantas foram
irrigadas até a capacidade de campo (1,3 L de água), obtida previamente em
ensaio preliminar, onde foram utilizados vasos e substrato experimental, sendo
este irrigado até a saturação e os vasos cobertos com papel alumínio para
evitar a evaporação. O peso dos vasos foi monitorado através do método
gravimétrico até peso constante. Depois de 20 dias de aclimatação, a irrigação
foi suspensa e os vasos foram cobertos com papel alumínio para o controle da
água transpirada. Cinco dias depois da interrupção da irrigação foram iniciados
os tratamentos. O controle da irrigação foi feita com pesagem dos vasos em
dias alternados e o controle da quantidade de água a ser aplicada foi feita pela
diferença entre o peso atual e aquele correspondente à capacidade de campo
100, 80, 70 e 60%.
Além disso, ao longo do período experimental foram feitas coletas do
solo para a determinação do teor de água no solo e do potencial mátrico. Os
valores do potencial mátrico (Ψm) do substrato, para cada tratamento durante o
período experimental, foram estimados a partir de equação derivada da curva
de retenção de água no solo, realizada no laboratório de solo da Universidade
Federal de Viçosa (Figura 1).
Potencial mátrico (Kpa)
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0,284
0,223
0,176
0,147
0,136
Amostra de solo ( Kg/Kg)
0,124
0,098
Figura 1- Curva de retenção de água do substrato utilizado no experimento.
25
Com os valores da curva de retenção foi ajustada a equação e os
valores obtidos a partir do teor de água no solo, coletados durante o
experimento, foram aplicados nesta equação para estimar o potencial mátrico
(Ψm) experimental que foram de -147,4; -283,8; -587,8 e -1090,7 kPa
correspondente aos teores de água no solo de 16,3; 14,5; 12,5 e 10,8%,
respectivamente.
As condições climáticas foram monitoradas utilizando-se uma estação
meteorológica
Hobo
Micro
Station
Data
Logger
(Onset
Coputer,
Massachusetts, EUA) (Figura 2c). A radiação fotossinteticamente ativa (RFA)
foi monitorada por meio de sensores quânticos S-LIA-M003, enquanto a
temperatura (T°C) e umidade relativa do ar (UR%) foram registradas utilizando
os sensores Hobo H8 Pro Series (Onset, Coputer, Massachusetts USA). Os
sensores de RFA (Radiação Fotossinteticamente Ativa), temperatura e
umidade relativa do ar foram programados para realizarem leituras em
intervalos de 5 minutos.
B
A
C
Figura 2. A- Produção de mudas; B- transplante para os vasos com o substrato.
C- Vista geral do experimento montado com as condições climáticas sendo
monitoradas pela estação meteorológica (seta)
As variáveis ambientais foram medidas durante todo o período
experimental, sempre das 06:00 às 18:00h. Sendo que a média diária da
radiação fotossinteticamente ativa (RFA), dentro da casa de vegetação, esteve
entre 8,6 a 23,2 mol fótons m-2 dia-1, a temperatura entre 24°C a 30,7 °C e a
umidade relativa do ar (UR) entre 64,26% e 93,9% (Figura 3).
26
A
B
Figura 3. – A- Variação da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) e BVariação da temperatura e da umidade relativa do ar (UR), dentro da casa de
vegetação durante o período experimental.
Potencial hídrico antemanhã do ramo (Ψw)
Devido à reduzida espessura do pecíolo das folhas, a medição do
potencial hídrico foi realizada com ramo da planta contendo cerca de 20 a 30
folhas. O potencial hídrico do ramo foi avaliado após aplicação dos tratamentos
em cinco repetições, utilizando uma câmara de pressão 1000 (PMS Instrument
Company, EUA) segundo a metodologia descrita por Scholander (1965). As
medições foram realizadas in situ a cada oito dias durante todo o período
experimental, totalizando sete medições. Essas medições foram feitas sempre
nos horários de 2:00 às 4:00h da manhã.
Trocas gasosas foliares
Após 20, 40 e 60 dias da aplicação dos tratamentos de deficiência
hídrica, avaliou-se as trocas gasosas em folhas maduras e expandida do
terceiro ou quarto nó a partir da extremidade basal da inflorescência, utilizandose um sistema portátil de medição de fotossíntese Li-Cor LI-6400 XT (USA). As
medições foram realizadas sempre das 08:30 às 12:00 h. Foram avaliadas a
taxa fotossintética líquida (A), a condutância estomática (gs), a transpiração (E)
27
e a razão entre as concentrações interna e externa de CO2 (Ci/Ca), sob luz
saturante artificial de 1000 μmol fótons m -2 s-1 e a concentração atmosférica de
CO2 (Ca) de 380 μmol mol-1. As eficiências instantânea (A/E) e intrínseca
(A/gs) de uso da água foram calculadas a partir dos valores obtidos.
Eficiência de uso da água (EUA)
A eficiência no uso da água no experimento foi expressa de quatro
formas: Eficiência instantânea de uso da água (A/E), que foi calculada pela
razão entre a taxa fotossintética líquida (A) e a taxa de transpiração (E);
Eficiência intrínseca de uso da água (A/gs), que foi calculada pela razão entre a
taxa fotossintética líquida (A) e a condutância estomática (gs). Além disso, foi
avaliada a eficiência no uso da água com base na produção de biomassa total
(g/L), calculada pela razão entre a biomassa produzida e água consumida e de
óleo essencial (g/L), calculada pela razão entre o rendimento do óleo essencial
das folhas e inflorescências produzido e a água total consumida (transpirada).
Avaliação do crescimento
Após 60 dias da aplicação dos tratamentos foram determinadas a
biomassa seca das raízes (MSR), caules (MSC), folhas (MSF) e total (MST) por
meio de secagem em estufa de circulação forçada de ar a 70º C, até atingir
peso constante. Além disso, foram realizadas medidas da altura das plantas
(ALT) e a da área foliar (AF) utilizando-se um medidor eletrônico de área foliar,
modelo LI-3100 (Li-Cor, inc. Lincoln, Nebraska, USA). A partir dos dados de
massa seca e área foliar foram calculadas: a massa foliar específica (MFE=
MSF/AF), a razão de massa de raízes (RMR = MSR/MST), a razão de massa
de caules (RMC= MSC/MST), a razão de massa da folha (RMF=MSF/MST), a
razão de massa de folhas (RMF=MSF/MST), a razão de área foliar
(RAF=AF/MST), a taxa de crescimento relativo (TCR= lnMST2 - lnMST1 / T2 T1) e a taxa assimilatória líquida TAL=[ (lnMST2- lnMST1 / T2 - T1) x (lnAF2lnAF1) / (AF2 - AF1)], segundo Hunt (1990).
28
Extração, quantificação e composição química do óleo essencial.
Para a determinação do tempo máximo de extração do óleo das folhas e
inflorescências, no intuito de evitar gasto de tempo e recursos foi realizado um
ensaio preliminar com plantas de Ocimum africanum coletadas do Horto de
Plantas Medicinais da UESC. Foram feitas cinco baterias de extrações no
processo de hidrodestilação, com três repetições, aos 30, 60, 90, 120 e 150
minutos (Figura 4).
Figura 4. Determinação do tempo de extração do óleo essencial das folhas
ŷ= 0,068 + 0,0657x - 0,0003x2 + R2= 0,98 e das inflorescências ŷ= -0,708
+0,0369x - 0,0002x2 R2= 0,94. Cada ponto representa a média de três
repetições e as barras o erro padrão da média.
O tempo de extração do óleo das folhas e inflorescências determinado
no ensaio foi de aproximadamente 90 minutos. Para o experimento, o óleo
essencial das folhas e inflorescências foi extraído pelo processo de
hidrodestilação em aparelho de Clevenger, utilizando-se 100 g de matéria seca,
em 1,5L de água destilada, por 90 minutos, em quadruplicata. O hidrolato, ou
seja, o óleo e a água foram separados utilizando o solvente diclorometano e o
sulfato de sódio anidro (em excesso) e concentrado. Após a separação o óleo
foi quantificado (determinação da porcentagem m/m e m/v). O rendimento de
óleo foi calculado por meio do teor multiplicado pelo valor médio de biomassa
seca da folha e da inflorescência da planta (g planta-1).
29
Os óleos foram caracterizados pelo índice de refração (IR), e
posteriormente, por cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de
massa de alta resolução (CGAR), utilizando o Cromatógrafo a Gás. A fim de
conhecer a constituição química foi realizada a análise de CG-EM
(Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas). Os diversos
constituintes químicos dos óleos essenciais foram identificados através da
comparação computadorizada com a biblioteca do aparelho, literatura e índice
de retenção de Kovats (Adams, 1995). Os índices de retenção de Kovats (IK)
foram calculados através da injeção de uma série de padrões de n-alcanos
(C8-C26) injetados nas mesmas condições cromatográficas das amostras.
Teor de Pigmentos cloroplastídicos
O teor de pigmentos cloroplastídicos foi determinado por meio do
medidor portátil de clorofilas SPAD-502 (Konica, Minolta,Japan), aos 20, 40 e
60 dias após a aplicação dos tratamentos (DAAT) em folhas completamente
maduras, localizadas no terceiro nó. A partir dos valores de índice SPAD
calculou-se o teor de clorofilas a e b e de carotenóides usando-se as equações
propostas por Santos et al., (2012) específicas para a espécie O. africanum.
Delineamento experimental
O
experimento foi montado
segundo o modelo estatístico
do
delineamento inteiramente casualizado (DIC) no esquema de parcela
subdividida no tempo, com quatro regimes hídricos, quatro coletas (0, 20 40 e
60 dias) e 10 repetições com um total de 160 plantas. Os dados foram
submetidos ao teste F da análise de variância. Para as médias dos tratamentos
foram ajustados modelos de regressão polinomial pelo programa estatístico
SISVAR 5.3 (FERREIRA, 2010). E para as médias dos dias dentro de cada
tratamento foram realizados o teste de Tukey a 5%. Os gráficos foram feitos no
software Prism GraphPad 6.01 (SALES, 2012).
30
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A reposição de água perdida durante todo o período experimental foi
maior no tratamento de 100% da capacidade de campo apresentando
variações nos valores médios entre 0,24 a 0,35 litros por dia. Já nos
tratamentos de 80, 70 e 60% da capacidade de campo, o consumo hídrico
diário foi de 0,12; 0,10 e 0,08 L dia
-1
(Figura 5). Tal fato está relacionado à
maior taxa transpiratória das plantas controle (100% capacidade de campo)
quando comparadas aos demais tratamentos.
100%
Consumo diário de água ( Ldia -1)
0,40
80%
70%
60%
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
Dias após aplicação dos tratamentos
Figura 5. Consumo hídrico diário das plantas de Ocimum africanum durante os
60 dias após aplicação dos tratamentos (DAAT) de déficit hídrico. Os pontos
representam média de 15 repetições por tratamento
A redução da irrigação ocasionou queda gradual no potencial hídrico do
ramo (antemanhã) ao longo do período experimental. Foram observados
valores médios de -0,3 a -0,5 MPa para as plantas bem irrigadas e variações
de -1,5 MPa até -2,2 MPa para a condição de maior déficit hídrico. Os valores
médios do potencial hídrico do ramo obtidos nos tratamentos foram -0,5; -0,9; 1,6 e -1,9 MPa para as capacidades de campo de 100, 80, 70 e 60%,
31
respectivamente. Aos quinze dias após aplicação dos tratamentos foi possível
constatar que as diferenças no potencial hídrico do ramo entre os tratamentos
já estavam estabelecidas (Figura 6).
Figura 6. Variação do potencial hídrico de antemanhã do ramo (Ψw) em
plantas de Ocimum africanum sob diferentes capacidades de campo durante o
período experimental. Os pontos representam a média de quatro a cinco
repetições e as barras o erro padrão da média.
Leonardo (2007) e Vargas (2007) ao estudarem variedades de Ocimum
basilicum observaram reduções significativas do potencial hídrico foliar ao
longo de tempo de imposição do estresse. De acordo com Nascimento (2009)
em condições naturais de campo o desenvolvimento do déficit hídrico no solo
ocorre de maneira gradual e mais lenta, enquanto que com experimentos em
vasos a resposta à exposição ao estresse é mais rápida em razão do espaço
radicular restrito. O tempo de chegada ao potencial hídrico dos tratamentos de
O. africanum quando comparado aos demais relatados (LEONARDO, 2007;
VARGAS, 2007) pode está associado
às variações ambientais, diferenças
granulométricas do solo e o tamanho dos recipientes usados para os cultivos
das espécies.
A
redução
gradativa
da
disponibilidade
de
água
no
solo
e
consequentemente, a queda do Ψw nas plantas de O. africanum, afetaram as
trocas gasosas foliares, o teor de pigmentos cloroplastídicos, o acúmulo de
32
biomassa e a produção de óleo essencial. Ocorreu interação significativa entre
o tempo e o déficit hídrico para a taxa fotossintética, condutância estomática e
transpiração e não significativa para a eficiência intrínseca e instantânea do
uso da água (Tabela 3).
Tabela 3. Níveis de significância da ANOVA comparando os efeitos do déficit
hídrico (DH) e o tempo em dias (T) e a interação entre o déficit hídrico e o
tempo (DH x T) para as variáveis de trocas gasosas (A, gs, E, A/gs e A/E) em
plantas de Ocimum africanum durante 20, 40 e 60 dias após a aplicação do
tratamento (DAAT).
Fonte de variação
Déficit Hídrico (DH)
Dias (T)
DH * T
p > 0,05
(ns)
p < 0,05
(*)
A
***
***
**
p < 0,01
(**)
gs
***
***
**
p < 0,001
Variável
E
***
***
**
A/gs
**
*
ns
A/E
***
*
ns
(***)
Com a deficiência hídrica os valores da taxa fotossintética, condutância
estomática e taxa transpiratória foram reduzidos e apresentaram ajustes
lineares nos diferentes dias após a aplicação dos tratamentos de deficiência
hídrica (Figura 7). A taxa fotossintética aos 20 dias apresentou valores
estimados de 10,3 e 5,1 µmol CO2 m-2 s-1, enquanto aos 60 dias os valores
foram de 9,7 e 2,1 µmol CO2 m-2 s-1 nos potenciais de -0,5 e -1,9 MPa,
respectivamente. De modo geral, para essa variável, houve uma queda de 50%
aos 20 dias, de 61% aos 40 e 78% os 60 dias para o potencial hídrico de -1,9
MPa quando comparado a -0,5 MPa (Figura 7a).
Para a condutância estomática, aos 20 dias de imposição dos
tratamentos, os potenciais hídricos de -0,5, -1,6 e -1,9 MPa proporcionaram
valores de 0,07; 0,04 e 0,03 µmol H2O m-2 s-1 , enquanto que aos 60 dias
nesses mesmos potencias hídricos os valores foram de 0,06, 0,02 e 0,01 µmol
H2O m-2 s-1, respectivamente (Figura 7b). Para a transpiração, aos 20 dias os
valores estimados para os potenciais de -0,5, -1,6 e -1,9 MPa foram de 0,90,
0,54 e 0,44 mmol H2O m-2 s-1 e ao final do período experimental (60 dias), os
valores foram 0,84, 0,3 e 0,15 mmol H2O m-2 s-1, respectivamente (figura 7c).
33
A
B
C
Figura 7. A- Fotossíntese liquida; B- Condutância estomática e C- Taxa
transpiratória de Ocimum africanum aos 20 (círculos vazios), 40 (quadrados
cheios) e 60 (triângulos vazios) dias após aplicação dos tratamentos de déficit
hídrico. Os pontos representam média de cinco repetições e as barras o erro
padrão da média.
34
O padrão similar de resposta entre A e gs sugere que a taxa
fotossintética esteja relacionada ao fechamento parcial dos estômatos, que
afeta a etapa difusiva da fotossíntese. Os decréscimos em gs foram
acompanhados pela queda das taxas de transpiração nos menores potenciais
hídricos ao longo do tempo de imposição do estresse. Esta observação é
corroborada pelas relações lineares da fotossíntese e transpiração em função
da condutância estomática (Figura 8a-b). Segundo Vargas (2007) se A e gs
variam proporcionalmente numa relação linear, pode haver redução da
concentração interna de CO2 (Ci) e baixos potenciais hídricos implicam em
decréscimo da eficiência de carboxilação.
16
ŷ = 127,62**x + 1,135** (R² = 0,92)
A (µmol CO2 m-2 s-1)
14
12
10
8
-0,5 MPa
6
-0,9 MPa
4
-1,6 MPa
2
-1,9 MPa
0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
gs (mol H 2O m-2 s-1)
1,8
ŷ = 14,461**x + 0,023** (R² = 0,85)
E ( mmol H2O m-2 s-1)
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
-0,47 MPa
0,6
-0,92 MPa
-1,58 MPa
0,4
-1,88 MPa
0,2
0,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
gs ( mol H 2O m-2 s-1)
Figura 8. A- Taxa fotossintética líquida em função da condutância estomática.
B- Taxa de transpiração em função da condutância estomática em plantas de
Ocimum africanum submetidas ao déficit hídrico. Os pontos representam
médias de três repetições.
35
Assim, como no presente estudo, as espécies Mentha spicata L.,
Rosmarinus officinalis L. (DELFINE et al.,, 2005) e Vigna unguiculata ( SOUZA
et al.,, 2004) sob deficiência hídrica apresentaram reduções em A, gs e E
seguidos de reduções do potencial hídrico foliar e das concentrações de CO 2
intercelular, com o aumento da deficiência hídrica. Resultado semelhante foi
verificado por Vargas (2007) ao avaliar três cultivares de manjericão, Ocimum
basilicum L.(‘Maria Bonita’, ‘Mara’ e ‘Genovese’). Considerando, que a primeira
e mais sensível resposta das plantas ao déficit hídrico é o fechamento dos
estômatos (TAIZ E ZEIGER, 2004). Na espécie O. africanum o fechamento
estomático observado nos menores potenciais hídrico foi o responsável pela
redução na assimilação de carbono e na perda de água por transpiração,
sendo assim um importante mecanismo de proteção contra a desidratação
foliar.
De maneira geral, ao longo do tempo as maiores oscilações dos valores
médios observados para as variáveis A, gs e E foram obtidas para os menores
potenciais hídricos do ramo (-1,6 e -1,9 MPa) quando comparado a condição
de controle (-0,5 MPa). Isso indica que a intensidade do déficit hídrico foi
acentuada pelo o efeito do tempo de estresse imposto. No entanto, a
compreensão dos efeitos do tempo sob uma condição de estresse é muito
complexa,
principalmente
porque
envolve
diversos
fatores
ambientais
associados tais como altos valores de temperatura, de radiação luminosa e de
déficit de pressão de vapor.
Para os resultados de eficiências intrínseca (A/gs) e instantânea (A/E)
de uso da água não foram observadas interações significativas entre o déficit
hídrico e o tempo de imposição do estresse. No entanto, o tratamento
apresentou significância de p < 0,01 para A/gs e de p < 0,001 para A/E (Tabela
3). Assim, considerando o apenas o efeito do déficit hídrico sobre as eficiências
de uso da água foram ajustados modelos lineares, sendo que os valores
estimados foram 152,1; 171,1 e 176,2 µmol CO2 mol
11,7; 12,1 e 13,1 µmol CO2 mol
-1
-1
H2O para a A/gs e de
H2O para A/E nos potenciais de -0,5, -1,6 e -
1,9 MPa, respectivamente (Figura 9 a-b).
36
A
B
Figura 9. A- Eficiência intrínseca de uso da água (A/gs) B- Eficiência
instantânea de uso da água (A/E) em Ocimum africanum submetida ao déficit
hídrico. Os pontos representam média de cinco repetições e as barras o erro
padrão da média
Em condições de déficit hídrico moderado as reduções na condutância
estomática e na taxa transpiratória podem favorecer o aumento da eficiência
intrínseca e instantânea de uso da água, maximizando a relação entre
consumo de água e assimilação de carbono. E na espécie O. africanum, o
fechamento estomático, em função da seca, indica um comportamento
conservativo de água quando submetida ao déficit hídrico, independente do
tempo de imposição ao estresse.
Para os pigmentos cloroplastídicos, verificou-se que as concentrações
de clorofila em função dos tratamentos, aos 20 e 60 DAAT foram explicadas
por modelos quadráticos, enquanto que aos 40 DAAT a resposta apresentou
ajuste linear (Figura 10).
Aos 20 DAAT foi observado um aumento nas concentrações de
pigmentos, sendo que o potencial hídrico estimado de -1,6 MPa proporcionou
as concentrações de 6,6 ; 2,4; 1,2 e 2,7 mg dm-3 de clorofila a, b, carotenóides
e razão clorofila a/b, respectivamente.
Resultados semelhantes foram
observados por Azhar et al., (2011) ao avaliarem os feitos de déficit hídrico em
mudas de Trachyspermum ammi sob 60% da capacidade de campo após 20
dias da suspensão da irrigação, Costa (2009) ao estudar andiroba (Carapa
guianensis Aubl.) após 15 dias (Ψw = -1,35 MPa ) e Leonardo (2007) ao
37
pesquisar a espécie Ocimum basilicum após 10 dias da suspensão da irrigação
(Ψw = - 2,4 MPa). O aumento inicial nas concentrações dos pigmentos no
protoplasto na espécie O. africanum pode ter ocorrido em virtude da redução
do teor de água na folha ocasionado pela desidratação do tecido. Além disso, a
aumento da concentração desses pigmentos pode estar relacionada à redução
da área foliar.
A
C
B
D
Figura 10. A- Concentração de clorofila a B- Clorofila b C- Carotenóides e DRazão da clorofila a/b em plantas de Ocimum africanum aos 20 (círculos
vazios), 40 (quadrados cheios) e 60 dias ( triângulos vazios) após aplicação
dos tratamentos de déficit hídrico. Os pontos representam média de quatro
repetições e as barras o erro padrão da média.
38
Aos 40 DAAT houve acréscimo nas concentrações de clorofila a, b,
carotenóides e para os Ψw de -0,5 e -0,9 MPa e uma redução acentuada nos
Ψw de -1,5 e -1,9 (Figura 10). Segundo Leonardo (2007) decréscimos nos
teores de pigmentos cloroplastídicos e/ou de proteína podem ser sintomas
característicos de estresse oxidativo em plantas sob seca. A razão clorofila a/b
foi maior nas plantas cultivadas no Ψw de -0,5 MPa, quando comparado com
os Ψw de -1,5 e -1,9 MPa (Figura 10d). Ainda segundo o autor, isso ocorre
devido à degradação das moléculas de clorofila a, por danos oxidativos, ser
mais rápida quando comparado à degradação da clorofila b. Além disso,
Bahreininejad et al., (2013) verificaram que a redução no teor de pigmentos
podem ser, pelo menos em parte, explicada pelo o aumento do teor de prolina,
uma vez que esta e os pigmentos fotossintéticos são sintetizados a partir do
mesmo substrato.
Com 60 DAAT verificou-se a redução nas concentrações dos
pigmentos fotossintéticos para todos os tratamentos, quando comparado às
concentrações obtidas aos 20 e 40 DAAT (Figura 10). Este comportamento
indica o início da senescência foliar e ao estádio final do desenvolvimento da
planta, que apresenta o ciclo de aproximadamente 90 dias.
O estresse causado pela seca se desenvolve de maneira gradual. A
relativa sensibilidade das funções afetadas por este tipo de estresse é revelada
por uma sequência de eventos bioquímicos e fisiológicos que são refletidas no
crescimento e desenvolvimento do vegetal (LARCHER, 2000). Portanto, a
deficiência hídrica em O. africanum atuou na redução dos pigmentos
cloroplastídicos de maneira progressiva ao longo do tempo e da intensidade do
estresse,
afetando
negativamente
as
trocas
gasosas
foliares
e,
consequentemente alterando a produção de biomassa.
As plantas de O. africanum cultivadas nas condições de maior déficit
hídrico tiveram o crescimento afetado, podendo sua resposta ser verificada
visualmente pela redução acentuada dos órgãos vegetativos e reprodutivos
(Figura 11).
39
Figura 11 - Plantas de Ocimum africanum com 60 dias após a aplicação dos
tratamentos de deficiência hídrica evidenciando a diferença no crescimento
(T1= -0,5 MPa; T2=-0,9 MPa ;T3= -1,6 MPa e T4= -1,9 MPa).
A massa seca de raiz, caule, folha, inflorescência e total apresentaram
ajustes lineares crescentes com o aumento da disponibilidade de (Tabela 4).
Para o acúmulo de massa seca total as variáveis que mais contribuíram foram
o caule e a inflorescência, com aumento de 32 e 42%, respectivamente para o
potencial hídrico do ramo de -0,5 MPa (Tabela 4). Assim, como o caule
recebeu um investimento expressivo da produção de biomassa, sendo
importante para o balanço de carbono na planta.
O crescimento das plantas normalmente diminui de acordo com a
duração e intensidade da seca. O decréscimo da produção de biomassa em
espécies medicinais submetidas a condições de deficiência hídrica vem sendo
observada, como em Matricaria recutita L. (BAGHALIAN, et al., 2011) Thymus
daenensis subsp daenensis, Celak (BAHREININEJAD et al., 2013) Artemisia
annua L. ( MARCHESE et al., 2010) e Salvia officinalis L.(BETTAIEB, et al.,
2009). Esses autores atribuem a redução do crescimento a vários aspectos,
tais como redução na massa seca de folhas, flores, caules, índice de área
foliar, teor de pigmentos, entre outros. Além desses fatores, a partir das
variáveis analisadas no presente estudo pôde-se afirmar que em O. africanum
a redução na produção de biomassa dos diferentes órgãos está relacionada a
diminuição da condutância estomática, da taxa fotossintética e do teor de
40
pigmentos cloroplastídicos ao longo do período experimental para as condições
de maior estresse.
No Ψw de -1,9 MPa, a partição da biomassa seca de caule, folha e
inflorescência apresentou-se mais homogênea, ou seja, com valores médios
de produção muito próximos. Essa resposta do vegetal a condição de seca é
melhor compreendida pela análise da razão de massa seca, que apresenta
uma visão geral mais completa, sobre o efeito do déficit hídrico sobre a partição
da biomassa entre diferentes órgãos da planta.
As razões massa de caule, folha e inflorescência apresentaram
respostas lineares (Tabela 4). No Ψw de -1,9 MPa quando comparado ao Ψw 0,5 MPa foi verificado o aumento de 6% para RMC, de 41% para RMF e uma
redução de 19% para RMI. Enquanto, a razão massa de raiz (RMR) apresentou
comportamento quadrático como o ponto de máxima estimado de 0,09 g g-1
para o potencial hídrico do ramo de -1,4 MPa, enquanto que,
a R:PA
apresentou resposta quadrática com o ponto de máxima de 0,10 g g-1 no
potencial de -1,2 MPa (Tabela 4).
Os resultados da razão massa de raiz e a relação raiz:parte aérea
evidenciam complexo sistema que envolve absorção de nutrientes e o
desenvolvimento vegetal. A parte aérea de uma planta crescer em função da
absorção de água pelas suas raízes, sendo que a água é o fator limitante de
crescimento. Acredita-se existir um balanço funcional entre absorção de água
pelas raízes e a fotossíntese. Em O. africanum verificou-se que o investimento
na produção de raiz nas plantas quando submetidas nas condições de déficit
ocorreu devido a redução na biomassa total. Já a redução na biomassa da
parte aérea está relacionada ao decréscimo na área foliar e no número
inflorescência e folhas.
As variáveis altura, área foliar, número de folhas,massa foliar específica,
taxa de crescimento relativo e taxa assimilatória líquida apresentaram ajustes
lineares, como os menores valores estimados obtidos nas plantas sob menor
disponibilidade hídrica. Enquanto, a área foliar individual apresentou um
tendência quadrática com o ponto de máxima estimado de 0,013 g m -2 para o
potencial de -0,8 MPa (Tabela 4).
41
Resultados semelhantes aos observados para O. africanum vêm sendo
reportado em muitas espécies medicinais e aromáticas (KHALID, 2006;
BETTAIEB, et al., 2009; BAGHALIAN et al.,2011; MARCHESE et al.,
2010;BAHREININEJAD et al., 2013). A redução da biomassa ocorre devido ao
efeito direto do déficit hídrico na redução da condutância estomática, da taxa
fotossintética e da transpiração. Além disso, atribui-se a redução nas trocas a
gasosas foliares de O. africanum às alterações ultraestruturais observadas nos
cloroplastos, tais como ruptura e desorganização das membranas dos
tilacóides (Capítulo II), afetando assim as funções fisiológicas.
42
Tabela 4. Valores médios (± erro padrão) das variáveis de crescimento de Ocimum africanum após 60 dias da imposição dos
tratamentos de déficit hídrico nos potenciais hídricos do ramo de -0,5; -0,9; -1,6 e -1,9 MPa.
R² = 0,908
Variável
MSR
MSC
MSF
MSI
MST
RMR
RMC
RMF
RMI
R:PA
ALT
MFE
NI
NF
AFI
AF
TCR
TAL
Potencial Hídrico de antemanhã do Ramo (-MPa)
0,5 MPa
0,9 MPa
1,6 MPa
1,9 MPa
3,14 ± 0,54
1,99 ± 0,13
1,47 ± 0,17
1,19 ± 0,12
11,86 ± 0,24
7,92 ± 0,92
5,34 ± 0,09
4,74 ± 0,31
6,33 ± 0,55
4,81 ± 0,49
3,67 ± 0,24
3,46 ± 0,31
15,66 ± 0,58
9,46 ± 0,90
5,25 ± 0,51
4,78 ± 0,48
36,99 ± 0,90
24,18± 2,26
15,73 ± 0,47
14,17± 1,04
0,08 ± 0,01
0,09 ± 0,01
0,09 ± 0,01
0,09 ± 0,01
0,32 ± 0,01
0,32 ± 0,01
0,34±0,01
0,34 ± 0,01
0,17 ± 0,01
0,20 ± 0,01
0,23 ± 0,02
0,24 ± 0,01
0,42 ± 0,01
0,36 ± 0,01
0,33± 0,03
0,33 ± 0,02
0,09 ± 0,02
0,10± 0,02
0,10 ± 0,01
0,09 ± 0,01
63,20 ± 2,65
59,20 ± 1,07
52,60 ± 0,68
53,20 ± 0,97
42,79 ± 1,90
45,03 ± 2,04
50,12 ± 3,31
55,20 ± 3,31
129,40 ±6,82
88,00 ± 9,10
62,20 ± 5,77
53,60 ± 6,76
1148,8 ± 96,15
852,80 ± 79,89
620,20 ± 29,91
557,80 ± 50,42
0,013 ± 0,0005
0,013 ± 0,0004
0,012 ± 0,001
0,010 ±0,001
1477,80 ±109,65 1065,45± 90,32
733,52 ± 23,25
644,14± 86,21
33,73 ± 0,26
29,06 ± 1,07
24,72 ± 0,30
23,53 ± 0,74
0,61 ± 0,02
0,47 ± 0,02
0,38 ± 0,01
0,37 ± 0,01
Equações
ŷ= -1,278**x + 3,513**
ŷ= - 4,864**x + 13,423**
ŷ= -1,988**x+7,003**
ŷ= -7,522**x + 18,001**
ŷ= -15,652**x+ 41,941**
ŷ= -0,014x*2 + 0,038*x + 0,065*
ŷ= 0,017*x + 0,309**
ŷ= 0,050**x + 0,150**
ŷ= -0,064**x + 0,459**
ŷ= -0,027* x2+ 0,065**x +0,064*
ŷ= -7,678** x + 66,412**
ŷ= 8,478**x + 37,909**
ŷ= -51,251**x + 146,08**
ŷ= - 407,87**x +1294,4**
ŷ = -0,003*x2 + 0,005x + 0,011
ŷ= -576,63**x + 1686,6**
ŷ= -7,125**x +36,488*
ŷ= -0,165**x + 0,659**
R2
0,90
0,92
0,93
0,91
0,92
0,91
0,90
0,99
0,95
0,98
0,94
0,95
0,93
0,94
0,96
0,95
0,97
0,90
Abreviações e unidades: MSR (massa seca de raízes, g); MSC (massa seca de caules, g); MSF (massa seca de folhas, g); MSI (massa seca de
inflorescência, g); (MST (massa seca total, g); RMR (razão de massa de raízes g g-1); RMC (razão de massa de caules g g-1); RMF (razão de massa de
folhas g g-1); RMI (razão de massa de inflorescência g g-1); ALT (altura cm); MFE (massa foliar especifica g m-2); NI ( número de inflorescência); NF
(número de folhas); AF (área foliar cm2 ); AFI ( área foliar individual dm-2); TCR (Taxa de crescimento relativo mg g-1 dia-1 );TAL (Taxa assimilatória
líquida mg cm-2 dia-1).
43
Os efeitos do déficit hídrico na produção de biomassa se refletem no teor
e rendimento do óleo essencial, podendo ser verificado, também, os efeitos na
eficiência do uso da água por litro de óleo essencial produzido. Em algumas
espécies medicinais, como no caso de espécies da família Lamiaceae, a
síntese e o armazenamento de óleos essenciais ocorrem nas folhas e
inflorescências (SINGH-SANGWAN et al., 1994; BETTAIEB et al., 2009;
KHALID, 2006; BAHREININEJAD et al., 2013). Dessa forma, a compreensão
dos efeitos da seca sobre a produção desses órgãos pode fornecer
informações úteis para obtenção da matéria-prima durante o processo de
colheita e pós-colheita.
Em O. africanum o teor do óleo essencial das folhas e inflorescências
apresentou ajustes lineares com elevados coeficientes de determinação,
ocorrendo os maiores valores médios obtidos nas condições de maior
deficiência, ou seja, nos menores potenciais hídricos do ramo, como os valores
estimados para a folha de 3,09% no Ψw -1,6 MPa e 3,20 % no Ψw -1,9 MPa.
Verificou-se também que o teor de óleo das folhas foi sempre maior que das
inflorescências (Figura 12 a-b).
A
B
Figura 12. A- Teor do óleo essencial das folhas B- das inflorescências de
Ocimum africanum após 60 dias da imposição do déficit hídrico. Os pontos
representam média de cinco repetições e as barras o erro padrão da média.
Os rendimentos do óleo essencial das folhas e inflorescências
diminuíram à medida que as plantas foram submetidas às condições de déficit,
tendo ajustes lineares. Para as folhas os valores médios estimados nos
44
potenciais de -0,5 MPa e -1,9 MPa foram de 3,18 % e 1,50 %, respectivamente.
Enquanto, que para as inflorescências nos mesmos potenciais foram
observados os valores de 13,68% e 4,99% (Figura 13 a-b).
A
B
Figura 13. A- Rendimento do óleo essencial das folhas B- inflorescências de
Ocimum africanum após 60 dias da imposição do déficit hídrico. Os pontos
representam média de cinco repetições e as barras o erro padrão da média
Os resultados verificados para o rendimento o óleo das folhas e
inflorescências são inversamente proporcionais aos observados para o teor.
Esses resultados estão relacionados à queda no número de folhas e
inflorescências nas plantas sob déficit hídrico, fato que influenciou diretamente
no decréscimo da massa seca (Tabela 4) e, consequentemente, no rendimento
de óleo (Figura 13 a-b). Para o teor do óleo essencial, o aumento verificado nas
condições de déficit está de acordo com os relatados na literatura para
espécies medicinais (SINGH-SANGWAN et al., 1994; PETROPOULOS et al.,
2008; BETTAIEB et al., 2009; KHALID,2006 ). Bahreininejad et al., (2013) ao
estudarem os efeitos do déficit hídrico em Thymus daenensis verificaram
aumento no teor de óleo essencial de 1,63 para 2,55 % no primeiro ano de
avaliação e de 2,19 para 3,22% no segundo ano para os tratamentos controle e
de estresse hídrico severo, respectivamente. Ainda, segundo estes autores,
resultado inverso foi observado para o rendimento do óleo essencial que foi
reduzido significativamente logo no primeiro ano de avaliação, tendo a
produtividade de 22,16 e 14,11 Kg ha-1 para as plantas bem irrigadas e sob
estresse hídrico severo. Já Simon et al., (1992), estudando a deficiência hídrica
45
em O.basilicum, encontraram aumento no rendimento do óleo essencial e
alteração na composição química sob déficit hídrico leve (-0,68 MPa) e
moderado (-1,12 MPa). Sendo ainda verificado que no déficit hídrico moderado,
o rendimento de óleo passou de 3,1 para 6,2 µL g-1.
Tem sido sugerido que o estresse por seca aumente a densidade de
tricomas glandulares com a redução da área foliar (SIMON et al., 1992). Além
disso, o aumento do teor de óleo sob estresse hídrico pode estar associado ao
fato das plantas produzirem altas concentrações de terpenos em detrimento da
alocação de carbono para crescimento, sugerindo uma relação entre
crescimento e defesa (TURTOLA et al., 2003).
A eficiência do uso da água com base na produtividade de biomassa
total (EUA
bm)
e óleo essencial (EUA
óleo)
apresentou respostas quadráticas
com o ponto do máxima estimado de 5,54 g/L no Ψw de -1,1MPa. Enquanto
que, para as folhas e inflorescências os pontos de máxima estimados foram de
0,75 e 2,7 g/L nos Ψw de -1,24 e -1,15 MPa, respectivamente (Figura 14).
Tais resultados sugerem que as plantas investiram proporcionalmente mais de
seus recursos fotossintéticos na produção de óleo essencial por unidade de
água consumida no Ψw de -0,9, principalmente para as inflorescências.
A
B
Figura 14. A- Eficiência de uso da água para a produção de biomassa BEficiência de uso da água para a produção de óleo essencial das folhas de O.
africanum aos 60 dias após aplicação dos tratamentos. Os pontos representam
média de cinco repetições e as barras o erro padrão da média.
46
Os estudos do déficit hídrico com plantas medicinais objetivando avaliar
a eficiência do uso da água para a produção do óleo essencial ainda são
escassos na literatura, mas recentemente, Bahreininejad et al., (2013)
pesquisando a espécies Thymus daenensis sob déficit hídrico
observaram
que, no que segundo ano de cultivo a EUA da biomassa foi de 0,222 e 0,216
Kg m-3, enquanto para EUA do óleo foi 0,0047 e 0,0069 Kg m-3 para as
condições controle e estresse hídrico severo, respectivamente.
Na composição química do óleo essencial das folhas e inflorescências
de O. africanum foram identificados um total de nove constituintes, sendo o
isoeugenol o constituinte majoritário desses órgãos. A diferença entre a
composição química do óleo das folhas e das inflorescências dá-se
principalmente pela presença de linalol nas folhas e do -curcumeno, óxido de
cariofileno, fenchol e (endo) fenchol nas inflorescências.
Apesar das alterações observadas no teor, rendimento e eficiência no
uso da água para a produção do óleo essencial das folhas e inflorescências,
após 60 dias da aplicação dos tratamentos, a composição química apresentou
pequenas variações na concentração relativa dos seus constituintes (Tabela 5
e 6). Nas folhas a concentração relativa do isoeugenol manteve-se estável nos
diferentes potenciais hídricos, enquanto nas inflorescências, houve um
aumento na concentração relativa do isoeugenol, tendo o Ψw de -0,5 MPa
89,27% e os Ψw de -1,6 e -1,9 MPa a concentração de 92,59 e 90,50 %,
respectivamente. Esses resultados diferem dos relatados na literatura para
várias espécies medicinais (PETROPOULOS et al., 2008; BETTAIEB et al.,
2009; KHALID, 2006; BAHREININEJAD et al., 2013 ) onde foram observadas
alterações significativas da composição do óleo quando submetida a estresse
por seca. No entanto, as variações na composição química observadas nestas
pesquisas com diferentes espécies podem ser resultados de diferenças
genéticas e de outros fatores ambientais.
O isoeugenol é o isômero químico do eugenol. Este último é conhecido
pela sua atividade antifúngica, antibacteriana e antioxidante já comprovada
(LEMOS et al., 2005; NAKAMURA et al., 1999; DUBEY et al., 2000; PEREIRA;
MAIA, 2007),
apresentando ampla utilização nas industrias de perfumaria,
cosméticos e farmacêutica (OLIVEIRA e tal. 2008; COSTA, 2000). Dessa
forma, considerando a elevada concentração relativa do isoeugenol nas folhas
47
e inflorescências, mesmo sob déficit hídrico, O.africanum pode ser considerada
como potencial fornecedora de eugenol para as indústrias. Além disso, o
manejo da colheita e pós-colheita pode ter seus custos reduzidos pela
ausência do beneficiamento das folhas e inflorescências.
48
Tabela 5: Concentração relativa (%) dos constituintes químicos do óleo essencial obtido da biomassa seca de folhas de Ocimum
africanum submetidos aos tratamentos de déficit hídrico, tendo os potenciais hídricos do ramo os valores de -0,5 ; -0,9 ; -1,6 e 1,9 MPa. Os valores representam a média de 3 repetições, com o erro padrão da média.
Potencial Hídrico de antemanhã do ramo (-MPa)
0,5
0,9
1,6
-1,9
Constituintes
IK
literatura
Linalol
(Z) metil cinamato
(Z) isoeugenol
(E)-cariofileno
cis-tujupseno
Monoterpernos oxigenados
Sesquiterpenos
Total Identificado (%)
1098
1301
1402
1418
1429
IK
experimental
1095
1302
1396
1425
1433
(%)
0,76 ± 0,25
4,95 ± 0,31
92,00 ± 0,60
0,63 ± 0,08
0,54 ± 0,07
98,71
1,17
99,88
0,28 ± 0,26
4,51 ± 0,17
94,24 ± 0,44
0,49 ± 0,05
0,43 ± 0,04
99,03
0,92
99,94
0,70 ± 0,26
5,09 ± 0,60
92,89 ± 1,15
0,71 ± 0,15
0,62 ± 0,14
98,67
1,33
100
0,38 ± 0,01
5,19 ± 0,20
93,54 ± 0,21
0,47 ± 0,01
0,43 ± 0,01
99,10
0,90
100
49
Tabela 6: Concentração relativa (%) dos constituintes químicos do óleo essencial obtido da biomassa seca das inflorescências de
Ocimum africanum submetidos aos tratamentos de déficit hídrico, tendo os potenciais hídricos do ramo os valores de -0,5 ; -0,9 ; 1,6 e -1,9 MPa. Os valores representam a média de 3 repetições, com o erro padrão da média.
Potencial Hídrico de antemanhã (-MPa)
0,5
0,9
1,6
1,9
Constituintes
IK
literatura
1087
Fenchol
1220
(endo) Fenchol acetato
1301
(Z) metil cinamato
1402
(Z) isoeugenol
1418
(E)-cariofileno
1429
cis-tujupseno
1480
curcumeno
1581
óxido de cariofileno
Monoterpernos oxigenados
Sesquiterpenos
Sesquiterpenos oxigenado
Total Identificado (%)
IK
experimental
1096
1218
1302
1400
1427
1434
1484
1580
0,91 ± 0,22
0,11 ± 0,11
2,25 ± 0,08
89,27 ± 1,28
2,92 ± 0,32
2,30 ± 0,24
1,56 ± 0,03
0,31 ± 0,15
92,54
6,77
0,31
99,62
(%)
0,84 ± 0,12
0,58 ± 0,04
0,20 ± 0,20
2,41 ± 0,12
1,56 ± 0,02
88,70 ± 0,81 92,59 ± 0,23
3,09 ± 0,27
1,97 ± 0,09
2,73 ± 0,25
1,76 ± 0,07
1,54 ± 0,01
0,21 ± 0,21
92,15
94,73
5,83
5,27
0,21
98,19
100
0,58 ± 0,26
2,36 ± 0,18
90,50 ± 1,47
2,26 ± 0,51
2,18 ± 0,50
1,32 ± 0,04
0,53 ± 0,12
93,43
5,77
0,53
99,2
50
CONCLUSÕES
O déficit hídrico, ao longo do tempo, afetou negativamente as trocas
gasosas foliares e os teores de pigmentos cloroplastídicos, acarretando
redução no crescimento, rendimento do óleo e na eficiência de uso da água
para a produção de biomassa. O aumento no teor e na eficiência de uso da
água para produção de óleo essencial (óleo produzido/ água consumida) foi
constatado nas condições de déficit moderado. Além disso, não foram
constatadas grandes alterações na composição química do óleo das folhas e
inflorescências de Ocimum africanum. Dessa forma, a irrigação de 80% da
capacidade de campo é a melhor condição para o crescimento e produção de
óleo essencial espécie. Considerando a produção e a qualidade do óleo
essencial, o cultivo torna-se economicamente viável nessa condição. Porém,
ainda são necessários estudos mais refinados que visem o manejo da
irrigação, em condições de campo, buscando conciliar o rendimento máximo de
óleo essencial com a economia financeira e ambiental, no que se refere ao uso
dos recursos hídricos.
51
REFERÊNCIAS
ADAMS, R.P. Identification of essential oil components by gas chromatography
and mass spectroscopy. Illinois: Allured, 1995. 698p.
AZHAR, N.; HUSSAIN,B.; ASHRAF,M,Y.; ABBASI,K,Y. Water stress mediated
changes in growth, physiology and secondary metabolites of desi ajwain
(Trachyspermum ammi l.). Medicinal Plants: Conservation & Sustainable
Use, v.43, p.15-19, 2011.
AKINCI, S. LÖSEL, D.M . Plant water-stress response mechanisms. In;
RAHMAN, I. M.. M. & HASEGAWA, H. Water Stress. (Ed.) Agricultural and
Biological Sciences: Hard cover, 300 pages, 2012.
BAGHALIAN,K.; ABDOSHAH,SH.; KHALIGHI-SIGAROODI,F.; PAKNEJAD,F.
Physiological and phytochemical response to drought stress of German
Chamomile (Matricaria recutita L.). Plant Physiology and Biochemistry v. 49,
p. 201-207,2011.
BAHREININEJADA.B.; RAZMJOO. J.; MIRZA, M. Influence of water stress on
morpho-physiological and phytochemical traits in Thymus daenensis.
International Journal of Plant Production v.7, n.1, p.151-166, 2013.
BLANK, A.F.; CARVALHO FILHO, J.L.S.; SANTOS NETO, A.L.; ALVES, P.B.;
ARRIGONI-BLANK, M.F.; SILVA-MANN, R.; MENDONÇA, M.C. Caracterização
morfológica e agronômica de acessos de manjericão e alfavaca. Horticultura
Brasileira, Brasília, v.22, n.1, p. 113-116, 2000.
BLANK, A.F.; CARVALHO FILHO, J.L.S.; SANTOS NETO, A.L.; ALVES, P.B.;
ARRIGONI-BLANK, M.F.; SILVA-MANN, R.; MENDONÇA, M.C. Caracterização
morfológica e agronômica de acessos de manjericão e alfavaca. Horticultura
Brasileira, Brasília, v.22, n.1, p. 113-116,2004.
BLANK, A.F; SOUZA,E.M; ARRIGONI-BLANK,M.F; PAULA,J.W.A; ALVES,P.B.
Novas Cultivares Maria Bonita: cultivar de manjericão tipo linalol. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v.42, n.12, p.1811-1813, 2007.
BETTAIEB, I; ZAKHAMA,N; AIDI WANNES, W; KCHOUK M.E; MARZOUK, B.
Water deficit effects on Salvia officinalis fatty acids and essential oils
composition. Scientia Horticulturae, v. 120, p. 271–275, 2009.
COSTA, M. A Ocorrência de danos celulares e capacidade de defesa
antioxidante em mudas de andiroba (Carapa guianensis Aubl.) sob duas
condições de déficit hídrico e após reidratação. Belém: Universidade
Federal Rural da Amazônia. 36p. (Dissertação Mestrado em Agronomia) 2009.
52
COSTA P.R.R. Safrol e eugenol: estudo da reatividade química e uso em
síntese de produtos naturais biologicamente ativos e seus derivados. Química
Nova v.23, p.357-369, 2000.
DUBEY,N. K.; TIWARI,T.N. A, MANDIN,D.; ANDRIAMBOAVONJY, H.;
CHAUMONT, J.P. Antifungal properties of Ocimum gratissimum essential oil
(ethyl cinnamate chemotype). Fitoterapia. v.71, p.567- 569, 2000
DELFINE, S.; LORETO, F.; PINELLI, P; TOGNETTI, R.; ALVINO, A.
Isoprenoids content and photosynthetic limitations in rosemary and spearmint
plants under water stress. Agriculture, Ecosystems and Environment. v.
106, p.243–252, 2005
FERREIRA, D. F. SISVAR. Sistema de análises estatísticas para dados
balanceados. Versão 5.3. Lavras: UFLA/DEX, 2010.
GOBBO-NETO, L.; LOPES, N.P. Plantas medicinais: fatores de influência no
conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v.30, n.2, p.374-81,
2007
HUNT, R. Basic growth analysis. Londres: Unwin Hyman, 1990.
JALEEL,
C.A.;
GOPI,R.;
SANKAR,B.;
GOMATHINAYAGAM,M.;
PANNEERSELVAM,R. Differential responses in water use efficiency in two
varieties of Catharanthus roseus under drought stress. C.R. Biologies v.331,
p.42-47, 2008.
KHALID, K, H. A. Influence of water stress on growth, essential oil, and
chemical composition of herbs (Ocimum sp.). International Agrophysics,
2006, 20, 289-296.
LAMBERS, H.; CHAPIM III, F.S.; PONS, T.L. Plant Physiological Ecology.
Springer: New York (2a Ed.) 2008, 604p.
LARCHER, W. Ecofisiologia Vegetal. São Carlos, Rima, 2000. 531p.
LAWLOR, D.W. Limitation to photosynthesis in water-stressed leaves: Stomata
VS. Metabolism and the role of ATP. Annals of Botany. V.89, p. 871-885,
2002.
LEMOS, J. A; PASSOS, X.S; FERNANDES,O.F.L; DE PAULA, J.R;
FERRI,P.H; HASIMOTO,L.K; LEMOS, A.A;SILVA, M.R.R. Antifungal activity
from Ocimum gratissimum L. towards Cryptococcus neoformans. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz, v.100, n.1, p. 55- 68, 2005.
LEONARDO, M. Produção de óleo essencial associado à deficiência hídrica em
plantas de Ocimmum basilicum L.cv. genovese.2007. 132 f. Tese ( Doutorado
em Agronomia )- Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências
Agronômicas, Botucatu,2007.
53
LISAR, S. Y. S.; MOTAFAKKERAZAD, R.; HOSSAIN, M. M.; RAHMAN, I. M.
M. Water Stress in Plants: Causes, Effects and Responses, In: RAHMAN, I.
M.M.; HASEGAWA, H. Water Stress. (Ed) Agricultural and Biological Sciences:
Hard cover, 300 pages, 2012.
LIU F.; STÜTZEL, H.Biomass partitioning, specific leaf area, and water use
efficiency of vegetable amaranth (Amaranthus spp.) in response to drought
stress. Scientia Horticulturae.vol. 102. (1) :15 15–27,2004.
MARCHESE, J. A; FERREIRA, J.F.S; REHDER,V.L.G; RODRIGUES,O. Water
déficit effect on the accumulation of biomass and artemisinin in annual
wormwood (Artemisia annua L., Asteraceae). Brazilian Society of Plant
Physiology. v.22, p.1-9, 2010.
MORAIS, L. A. S.. Influência dos fatores abióticos na composição química dos
óleos essenciais. Horticultura Brasileira v. 27 n .2. Supl. CD- ROOM, 2009.
NAKAMURA, C.V.; UEDA-NAKAMURA, T.; BANDO,E.; MELO, A.F.N.;
CORTEZ, D.A.G.; FILHO, B.P.D.Antibacterial Activity of Ocimum gratissimum
L. Essential Oil. Memórias do Instituto Osvaldo Cruz. v. 94, p. 675-678,
1999.
OLIVEIRA, R. A.; REIS, T.V.; DUARTE, L.P.; SACRAMENTO, C.K.; OLIVEIRA,
F.F. Constituintes químicos voláteis de especiarias ricas em eugenol. Revista
Brasileira de Farmacognosia. v. 19, p. 771-775, 2008.
PARRY,M.A.J.;ANDRALOJC,P.J.; KHAN,S.; LEA,P.J. Rubisco activity: Effects
of drought stress. Annals of Botany. v.89, p. 833-839, 2002.
PEREIRA, C. A. M.; MAIA, J. F. Estudo da atividade antioxidante do extrato e
do óleo essencial obtidos das folhas de alfavaca (Ocimum gratissimum L.).
Ciência Tecnologia Alimentos. v.27, p. 624-632, 2007.
PETROPOULOS, S.A.; DAFERERA D; POLISSIOU M.G.; PASSAM H.C. The
effect of water deficit stress on the growth, yield and composition of essential
oils of parsley. Scientia Horticulturae. v. 115, p.393–397,2008.
REHEM, B. C.; BERTOLDE, F. Z.; ALMEIDA, A.A. F. Regulation of Gene
Expression in Response to Abiotic Stress in Plants. In: PAULA BUBULYA. Cell
Metabolism - Cell Homeostasis and Stress Response Biochemistry,
Genetics and Molecular Biology, Hard cover, 208 pages, 2012.
SANTOS, MS; SILVA DC; GOMES, JAO; COSTA, LCB; MARTINS, ER;
MIELKE, MS; GOMES, FP. Determinação não destrutiva de pigmentos
cloroplastídicos em manjericão submetido ao déficit hídrico. Horticultura
Brasileira. v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012.
54
SANTOS, M.G.;RIBEIRO,R.V..;MACHADO,E.C.;PIMENTEL,C. Photosynthetic
parameters and leaf water potential of five common bean genotypes under mild
water deficit. Biologia Plantarum. v.53, n.2, p. 229-236, 2009.
SIMÕES, C. M. O.; SPITZER, V. Óleos Voláteis. In: SIMÕES, C. M. O.;
SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. (Org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed.
Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, cap. 18, p.
475, 2004.
SIMON, J.E., REISS-BUBENHEIM, D., JOLY, R.J., CHARLES, D.J. Water
stress-induced alterations in essential oil content and composition of sweet
basil. Journal of Essential Oil Research, v.4, p.71-5, 1992.
SINGH-SANGWAN, N.; FAROOQI, A. H.A.; SANGWAN R. S. Effect of drought
stress on growth and essential oil metabolism in lemongrasses. New
Phytology., v.128, p.173-179, 1994
SOUZA, R.P., E.C. MACHADO, J.A.B. SILVA, A.M.M.A Photosynthetic gas
exchange, chlorophyll fluorescence and some associated metabolic changes in
cowpea (Vigna unguiculata) during water stress and recovery. Environmental
and Experimental Botany. v. 51,p.45-56, 2004.
SCHOLANDER, P.F., HAMMEL, H.T., BRADSTREET, E.D., HEMMINGSEN,
E.A. Sap pressure in vascular. Plants Science. v. 148, p. 339–46, 1965.
TAIZ. L.; ZEIGER. E. Fisiologia Vegetal. 3ed. Porto Alegre: Artmed, 2004,
719p.
TEZARA,W.; MITCHELL, V. J.; DRISCOLL, S. D.; LAWLOR D. W. Water
stress inhibits plant photosynthesis by decreasing coupling factor and ATP.
Nature, vol.401, 1999.
TURTOLA, S., MANNINEN, A.M., RIKALA, R., KAINULAINEN, P. Drought
stress alters the concentration of wood terpenoids in Scots pine and Norway
spruce seedlings. Journal Chemical Ecology. V.29, p.1981-1985, 2003
VARGAS, M. E. O. Respostas ecofisiológicas e bioquímicas do Ocimum
basilicum L. cultivado em diferentes níveis hídricos 2007. 72f. Dissertação
(Mestre em Agroecossitemas) – Universidade Federal do Sergipe, São
Cristóvão, 2007.
55
CAPÍTULO II- ANATOMIA, MICROMORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA
FOLIAR
DE Ocimum africanum LOUR. (LAMIACEAE) SUBMETIDAS A
DÉFICIT HÍDRICO.
RESUMO
A água é o fator limitante para o desenvolvimento vegetal, pois afeta
diretamente os processos de divisão e expansão celular, causando alterações
na anatomia, micromorfologia e ultraestrutura. O objetivo do trabalho foi avaliar
alterações na anatomia, micromorfologia e ultraestruturais da folha de
espécie.Ocimum africanum Lour. (Lamiaceae) submetidas à deficiência hídrica.
O estudo foi conduzido em casa de vegetação em delineamento inteiramente
casualizado (DIC), com quatro tratamentos de deficiência hídrica (100, 80, 70 e
60 da capacidade de campo) correspondente aos potenciais hídricos dos
ramos (-0,5; -0,9; -1,6 e -1,9 MPa). Após os 60 dias de imposição dos
tratamentos foram coletadas cinco repetições de cada tratamento para as
análises anatômicas, micromorfológicas e ultraestruturais. Foram utilizadas as
técnicas convencionais de anatomia vegetal, microscopia eletrônica de
varredura e transmissão. As plantas de O. africanum sob défict hídrico
apresentaram as maiores espessuras do parênquima paliçádico, esponjoso,
epiderme abaxial e adaxial, mesofilo e limbo foliar para o potencial hídrico do
ramo entre -0,9 e -1,6 MPa. Verificou-se um acréscimo da densidade de
tricomas glandulares e tectores, sendo a maior densidade desses tricomas
observada na face abaxial da epiderme nos tratamentos de menores potenciais
hídricos. Enquanto, nas análises ultraestruturais observou-se degradações na
membrana nuclear, do cloroplasto e do vacúolo (tonoplasto), desorganização
dos tilacóides e a presença de plastoglóbulos em células de tecidos foliares de
plantas submetidas aos potenciais hídricos do ramo de -1,6 e -1,9 MPa. A
manutenção da integridade da estrutura celular é um fator importante na
capacidade da planta suportar ao estresse por seca e a irrigação de 80% da
capacidade de campo, ou seja -0,9 MPa, ocasionou menores alterações
anatômicas e ultraestruturais mostrando- se mais adequada para o manejo da
cultura.
Palavras-chave: Manjericão, Estresse abiótico, Alterações tissulares.
56
CHAPTER II- ANATOMY, MICROMORPHOLOGY AND LEAF
ULTRASTRUCTURE OF Ocimum africanum LOUR. (LAMIACEAE)
SUBMITTED TO WATER DEFICIT
ABSTRACT
Water is the limiting factor for the plant development because it directly affects
the cell division and expansion processes, causing changes in anatomy,
micromorphology and ultrastructure. The purpose of this study was to evaluate
changes in anatomy, micromorphology and ultrastructure of Ocimum africanum
Lour. (Lamiaceae) species leaf submitted to water deficit. The study was
conducted in a greenhouse in a completely randomized design (CRD) with four
treatments of water deficit (100, 80, 70 and 60 of field capacity) corresponding
to the branches water potentials (-0.5; -0, 9, -1.6 and -1.9 MPa). After 60 days
of treatment imposition five replicates of each treatment were collected for
anatomical, micromorphological and ultrastructural analysis. The conventional
techniques of plant anatomy, scanning electron microscopy and transmission
were used. O. africanum plants under water deficit showed the greatest
thickness of palisade and spongy parenchyma, adaxial and abaxial epidermis,
mesophyll and leaf limb for the branch water potential between -0.9 and -1.6
MPa. There was an increase in the density of glandular and tector trichomes,
with the highest density of these trichomes observed on the abaxial epidermis in
the lower water potential treatments. In ultrastructural analysis, degradations in
the chloroplasts and vacuoles (tonoplast) nuclear membrane, thylakoids
disorganization and the presence of plastoglobules in leaf tissues cells of plants
submitted to the branch water potentials of -1.6 and -1.9 MPa were observed.
Maintaining the cell structure integrity is an important factor in the ability of the
plant to withstand drought stress and the irrigation of 80% of field capacity,
corresponding to -0.9 MPa, caused minor anatomical and ultrastructural
changes, shown to be more appropriate for culture management.
Keywords: Basil, Abiotic stress, Tissue changes.
57
INTRODUÇÃO
Entre todos os recursos que os vegetais necessitam para crescer a
água é o mais abundante e ao mesmo tempo o mais limitante. Mesmos
pequenos desequilíbrios no fluxo de água podem causar mau funcionamento
de inúmeros processos celulares (TAIZ;ZEIGER, 2004). O déficit hídrico
provoca diversas alterações no metabolismo dos vegetais, podendo resultar,
também, em modifLicações anatômicas, micromorfológicas e ultraestruturais
nas células e tecidos vegetais (SILVA et al., 1999; WANG et al., 2012;
BATISTA et al., 2010).
A primeira e mais sensível resposta verificada ao déficit hídrico é a
condutância estomática. De acordo com Larcher (2000) na fase final, mas
antes da degeneração da célula, são observados, em nível estrutural,
aumentos no tamanho dos tilacóides dos cloroplastos e das cristas
mitocondriais, com posterior desintegração destas estruturas, bem como da
membrana nuclear e dos polirribossomos. Melo et al., (2007) estudando a
anatomia de Setaria anceps e Paspalum paniculatum, sob condições de déficit
hídrico, observaram reduções no diâmetro do metaxilema, córtex radicular,
feixe vascular, espessura do limbo foliar e aumento no tamanho de células
buliformes.
Quando submetidas ao estresse, as plantas podem apresentar
modificações em vários processos fisiológicos, entre estes diminuição da
emissão e redução da área foliar, aumento da densidade estomática e
tricomas; fechamento estomático e modificações no conteúdo e elasticidade da
parede celular (JOLY;ZAERR, 1987; KOZLOWSKI; PALLARDY, 2002;). As
alterações anatômicas e ultraestruturais podem ser consideradas como
mecanismos de adaptação, uma vez que, alteram a difusão de dióxido de
carbono nos espaços intercelulares, contribuindo assim para a manutenção da
taxa fotossintética, mesmo com baixa condutância estomática (CASTRO et al.,
2009).
Nas plantas medicinais além das alterações tissulares e ultraestruturais
há ainda os efeitos diretos do déficit hídrico sob o metabolismo secundário
58
afetando, por exemplo, a produção do óleo essencial (SILVA et al., 2002;
KHALID, 2006; PETROPOULOS et al., 2008; BETTAIEB et al., 2009).
Pertencente à família Lamiaceae, o gênero Ocimum compreende mais
de 60 espécies, que são popularmente conhecidas como alfavaca e/ou
manjericão (BLANK et al., 2004). No gênero, a espécie Ocimum basilicum
ganha destaque no mercado nacional e internacional, devido à presença do
constituinte majoritário linalol que é utilizado como fixador nas indústrias de
perfumaria. Muitos são os trabalhos que relatam os efeitos do déficit hídrico em
variedade
de
O.
basilicum
Bonita’,
(‘Maria
‘Genovese’
e
‘Mara’)
(VARGAS,2007; LEONARDO, 2007). Porém, poucas são as informações sobre
os efeitos da deficiência hídrica na anatomia, micromorfologia e ultraestrutura
do gênero, principalmente para a espécie Ocimum africanum.
A rota do ácido mevalônico envolve a condensação de três moléculas de
acetil CoA. Esse intermediário de seis carbonos sofre uma série de reações
culminando na produção do isopentenil difosfato (IPP 2), que é a unidade básica
na formação dos terpenos. O IPP pode ser sintetizado também a partir de
intermediários da glicólise (Piruvato) ou do ciclo de Calvin (Gliceraldeído-3fosfato), através da rota do metileritritol fosfato (MEP) que ocorre nos
cloroplastos e outros plastídios e que pode ser afetada pela disponibilidade de
hídrica (CROTEAU et al., 2000; CASTRO et al., 2004; TAIZ E ZEIGER, 2004).
O estudo das relações hídricas em plantas medicinais é imprescindível
para o estabelecimento das condições ideais de cultivo, pois pequenas
alterações
nas
condições
hídricas
podem
afetar
negativamente
as
características no crescimento e produtividade, fato que está interligado a
modificações anatômicas e a danos ultraestruturais. Dessa forma, o presente
estudo teve como objetivos (i) caracterizar a morfologia da espécie; (ii)
micromorfológica ; (iii) avaliar as possíveis alterações ultraestruturais; (iv)
quantificar a densidade de tricomas glandulares e tectores em folhas de O.
africanum submetidas à deficiência hídrica.
59
MATERIAIS E MÉTODOS
Cultivo da espécie
O experimento foi realizado na casa de vegetação no Campus da
Universidade Estadual de Santa Cruz localizada próxima à região urbana do
município Ilhéus, BA (14°47'00" S, 39°02'00" W), no período de 07 de janeiro a
17 de abril de 2012. As condições climáticas foram monitoradas utilizando-se
uma estação meteorológica Hobo Micro Station Data Logger (Onset Coputer,
Massachusetts, EUA).
As mudas de Ocimum africanum foram cultivadas em vasos de 10 litros
contendo substrato previamente adubado. As plantas foram irrigadas até a
capacidade de campo (1,3 L de água). Após os 20 dias de aclimatação, a
irrigação foi suspensa e os vasos foram cobertos com papel alumínio para o
controle da água transpirada. Cinco dias depois da interrupção da irrigação
foram iniciados os tratamentos. O controle da irrigação foi feita com pesagem
em dias alternados e o controle da quantidade de água a ser aplicada foi feita
pela diferença entre o peso atual e aquele correspondente à capacidade de
campo 100, 80, 70 e 60%.
A caracterização dos tratamentos foi determinada por meio do
potencial hídrico do ramo, avaliado após a imposição do estresse durante todo
o período experimental, com seis medições em cinco repetições, utilizando
uma câmera de pressão 1000 (PMS Instrument Company, EUA) segundo a
metodologia descrita por Scholander (1965). As medições foram realizadas in
situ no período de 2:00 às 4:00 h da manhã. Sendo os tratamentos -0,5 (bem
irrigadas), -0,9; -1,6 e -1,9 MPa. Após 60 dias da imposição dos tratamentos
foram realizadas coletas para as análises anatômicas e ultraestruturais da
folha.
60
Análise anatômica
Foram selecionadas folhas maduras e completamente expandidas do
terceiro nó do ápice para a base, sendo as coletas feitas sempre na região
mediana da folha. Foram coletadas cinco repetições de cada tratamento
perfazendo um total de 20 amostras, correspondendo cada repetição a uma
planta do tratamento. As amostras foram fixadas em glutaraldeído 2,5% em
tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 6,9 desidratadas em serie etanólica
crescente e incluídas em metacrilato@.
As amostras incluídas foram
seccionadas em micrótomo rotativo a 9 µm de espessura e coradas com azul
de toluidina a 1% (O’ BRIEN 1964). As análises e a documentação dos
resultados foram realizadas em microscópio fotônico, Leica @ modelo DMI 3000
B. Nestas análises foram efetuadas medições em 10 campos distintos de cada
amostra, sendo mensurada a espessura da epiderme nas faces adaxial e
abaxial; do parênquima paliçádico e esponjoso; do mesofilo e do limbo
(mesofilo + epiderme) foliar utilizando o software Leica application suite V3.
Análise ultraestrutural
Para a análise ultraestrutural o material foi fixado em glutaraldeído em
tampão cacodilato de sódio pH 6,9 pós- fixado em tetróxido de ósmio,
desidratado em série etanólica e incluídas e resina Epon@. Cortes ultrafinos de
aproximadamente 50-60 nm de espessura foram obtidos com auxílio de um
ultramicrótomo Leica UC6, equipado com navalha de diamante. Os cortes
foram coletados em grades contrastados com uma solução de acetato de
uranila por cinco minutos e citrato de chumbo por 3 minutos em pH 12,0. Em
seguida as amostras foram observados no microscópio eletrônico de
transmissão marca Philips, modelo Morgagni 260 D, a voltagem de aceleração
de 80 kV.
Microscopia eletrônica de Varredura
Para avaliar a densidade de tricomas foram realizadas análise em
microscopia eletrônica de varredura (MEV). As amostras e cada tratamento
61
foram fixadas com solução de glutaraldeído em tampão cacodilato de sódio, pH
6,9
desidratadas em série etanólica crescente de 60 a 100% , levadas à
secagem em ponto crítico aparelho modelo CPD030, marca BALZERS, e
cobertos com uma camada de ouro de 30 nm de espessura de ouro, utilizando
o aparelho SPUTTER COATER, modelo SCD 050, marca BALZERS, para
observação no microscopia eletrônico de varredura modelo JEOL JSM-6390
LV.
Foram feitas quatro repetições de cada tratamento e cinco campos de
cada amostra para as epidermes das faces adaxial e abaxial. As contagens
foram feitas através de eletromicrografias, com área de 100 mm2.
Delineamento experimental
O
experimento foi montado segundo o modelo estatístico
do
delineamento inteiramente casualizado (DIC), com quatro tratamentos de
deficiência
hídrica.
Para
as
análises
anatômicas,
ultraestruturais
e
micromorfológicas foram utilizadas cinco repetições por tratamento. Os dados
obtidos foram submetidos ao teste F da análise de variância. Para as médias
dos tratamentos foram ajustados modelos de regressão polinomial pelo
programa estatístico SISVAR 5.3 (FERREIRA, 2010). E os gráficos foram feitos
usando o Software Prism GraphPad 6.01 (SALES, 1992-2012).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Ocimum africanum Lour. é um subarbusto que apresenta um ciclo de vida
curto de aproximadamente 90 dias. O caule é ereto e ramificado com
aproximadamente 60 cm de altura com um formato quadrangular e como
tricomas ao longo de sua extensão. Suas folhas são simples, ovadas e pilosas
e estão distribuídas no caule de forma oposta e cruzada. As inflorescências são
apicais, com flores alvas e pequenas possuindo tricomas. As sementes são
pequenas e compridas de coloração negra que quando umedecidas
apresentam mucilagem, característica do gênero (ALBURQUERQUE et al.,
1998; COSTA, et al.,2010) (Figura 1a-c).
62
A
C
B
Figura 1- A) Hábito de Ocimum africanum; B) Detalhe da flor; C) Sementes
mostrando a formação da mucilagem quando irrigada (seta) e sementes
enegrecidas.
A espécie O. africanum apresenta tricomas glandulares e tectores em
ambas as faces epidérmicas. Os tricomas da espécie estão localizados nas
faces adaxial e abaxial e podem ser classificados como glandulares peltados,
com quatro células secretoras protegidas por uma cutícula, e tectores
pluricelulares com ornamentações da região mediana até o ápice (Figura 2 a c).
A
B
C
Figura 2. Eletromicrografia de microscopia eletrônica de varredura da
superfície foliar de Ocimumafricanum; (A) Vista geral da epiderme, face
abaxial; (B) Tricoma tector; (C) Tricoma glandular peltado.
63
As folhas de O. africanum apresentam mesofilo do tipo dorsiventral com
o parênquima paliçádico constituído por uma camada de células, enquanto o
parênquima esponjoso apresenta variações de quatro a cinco camadas
celulares, com pequenos espaços intercelulares (Figura 2). A epiderme, nas
duas faces, apresenta-se uniestratificada constituída por células de formato
retangular. Estômatos cômodo tipo anomocíticos estão distribuídas em ambas
as faces da epiderme, sendo mais frequente na face abaxial, sendo a folha
caracterizada como anfihipoestomática.
A
B
C
D
FIGURA 3. Seção transversal da folha de Ocimum africanum submetida a
diferentes regimes hídricos: - 0,5 MPa (A) ; -0,9 MPa (B); -1,6 MPa (C); -1,9
MPa (D) . Barra = 50µm.
A espessura das células epidérmicas das faces adaxial e abaxial sofreu
redução nos tratamentos de maior déficit hídrico, apresentando respostas
quadráticas com valores estimados de 18,03 e 15,21 µm respectivamente, nos
potenciais hídricos de -1,4 e -1,0 MPa (Figura 4). Para todos os tratamentos, a
face adaxial apresentou-se sempre mais espessa que a epiderme abaxial em
todos os tratamentos.
64
Figura 4. Espessura da epiderme, face adaxial (círculos cheios), face abaxial
(círculos vazios), de Ocimum africanum submetido aos diferentes potenciais
hídricos. Os pontos representam média de cinco repetições e as barras o erro
padrão da média.
Para a face adaxial a redução se deu de forma mais acentuada no
potencial hídrico de 0,9 MPa com uma leve recuperação nos tratamentos mais
drásticos. Já as células da face abaxial apresentaram inicialmente um aumento
dessa espessura no potencial de -0,9 MPa seguida de redução dessa
espessura nos tratamentos de -1,6 e -1,9 MPa.
Segundo Bosabalidis, et al., (2002) células epidérmicas pequenas pode
apresentar mais resistência ao colapso que as grandes. Além disso,
considerando que de maneira geral a epiderme da face adaxial recebe a maior
incidência de radiação luminosa, uma pequena redução na espessura das
células pode favorecer uma distribuição mais uniforme da luz no interior das
folhas e aumentar a eficiência da etapa fotoquímica da fotossíntese (BATISTA
et al., 2010).
65
Em O. africanum a espessura do parênquima esponjoso foi maior que a
do parênquima paliçádico, principalmente nas condições de maior deficiência
hídrica aplicada. A espessura dos dois tecidos clorofilianos apresentou
resposta quadrática (Figura 5) em função do potencial hídrico do ramo. Sendo
que o valor estimado de -1,3 MPa proporcionou as maiores espessuras, tendo
os valores máximos de 103 e 134 µm para o parênquima paliçádico e
esponjoso, respectivamente.
Figura 5. Espessura do parênquimas paliçádico (círculos cheios) e parênquima
esponjoso (círculos vazios) de Ocimum africanum submetido aos diferentes
potenciais hídricos. Os pontos representam média de cinco repetições e as
barras o erro padrão da média.
O aumento da espessura dos tecidos foliares nas condições de -0,9 MPa
a -1,3 MPa está relacionado ao maior alongamento das células, uma vez que o
número de camadas nos diferentes potenciais hídricos não foi alterada (Figura
3). Bosabalidis e Kofidi (2002) ao avaliarem os efeitos do déficit hídrico em
duas cultivares de Olea europeae (‘Mastoidis’ e ‘Koroneiki’) nos potencias
hídricos de -0,3 (controle) e -1,5 MPa (seca)
verificaram diferenças
significativas, com aumento na espessura da epiderme da face adaxial e
abaxial e dos parênquimas paliçádico e esponjoso na condição de déficit
hídrico. Resultados semelhantes foram observados por Guerfel et al., (2009)
66
para as cultivares cv. ‘Chemlali’ e cv. ‘Chétoui’ de Olea europaea L. cultivadas
sob deficiência hídrica.
O parênquima paliçádico e o esponjoso estão diretamente relacionados
com os processos que envolvem a fotossíntese, uma vez que o maior volume
de espaço intercelular entre as células destes tecidos juntamente com os
estômatos presentes na epiderme facilitam a difusão de O 2 e CO2. Assim, um
maior desenvolvimento desses tecidos pode permitir aumento da fixação de
CO2 e consequentemente na eficiência de carboxilação, mesmo com a abertura
dos estômatos em curto espaço de tempo (CASTRO et al., 2009). Além disso,
é nos espaços intercelulares do parênquima esponjoso que ocorre a interface
entre ar e água, permitindo que a radiação seja refratada e refletida resultando
em uma distribuição mais uniforme da luz e favorecendo o aproveitamento do
processo fotossintético.
Figura 6. Espessura do mesofilo (círculos vazios) e do limbo foliar (círculos
cheios) de Ocimum africanum submetido aos diferentes potenciais hídricos (MPa). Os pontos representam média de cinco repetições e as barras o erro
padrão da média.
A deficiência hídrica provocou alterações na estrutura anatômica foliar
de O. africanum, ocasionando aumento tanto da espessura do mesofilo quanto
do limbo foliar, quando comparado à condição mais irrigada (-0,5 MPa). No
67
mesofilo o potencial hídrico foliar de -1,3 MPa proporcionou os valores
máximos estimados de 236 µm, enquanto que para o limbo foliar o mesmo
potencial hídrico proporcionou uma espessura de 270 µm (figura 6). Essa
resposta de aumento da espessura do mesofilo nas condições de déficit hídrico
está relacionada à redução da área do limbo foliar e ao aumento da massa
foliar especifica, conforme demonstrado no capítulo I.
Batista et al., (2010) ao avaliarem 15 cultivares de café sob déficit
hídrico, verificaram que a maior espessura do limbo foliar do cultivar Palma
ocorreu com o potencial hídrico de -1,4 MPa. Estes autores consideraram que
as alterações anatômicas observadas para essa cultivar foram decorrentes das
maiores espessuras da cutícula, das células da face adaxial da epiderme e dos
parênquimas paliçádico e esponjoso. Além disso, Silva et al., (1999) ao
analisarem a influência do estresse hídrico em seis variedades de Phasealus
vulgaris
verificaram
que
as
maiores
espessuras
do
mesofilo
estão
correlacionadas com o aumento da massa foliar específica das plantas sob
seca.
O déficit hídrico, em geral, normalmente está relacionado a altas
temperaturas, excesso de radiação luminosa e altos valores do déficit de
pressão de vapor (DPV). Na estrutura anatômica da folha, o aumento das
espessuras dos parênquimas clorofilianos em plantas sob déficit hídrico ou
condições de pleno sol são responsáveis por minimizar o aquecimento foliar
devido à canalização e dispersão da luz (BATISTA et al., 2010). Além disso, a
aumento dos espaços intercelulares do parênquima esponjoso pode auxiliar na
etapa difusiva da fotossíntese devido a redução da resistência do mesofilo ao
CO2 (NASCIMENTO et al., 2006).
Na análise micromorfológica da superfície foliar foram constatadas
alterações na densidade de tricomas glandulares peltados e tectores situados
nas duas faces epidérmicas. A maior densidade desses tricomas foi observada
sempre na epiderme da face abaxial em relação a adaxial (Figuras 7 e 8).
68
A
E
B
F
C
G
D
H
Figura 7 - Eletromicrografias de microscopia eletrônica de varredura das
superfícies adaxial (A, B, C, D) e abaxial (E, F, G, H) da folha de Ocimum
africanum submetido aos potenciais hídricos de -0,5 MPa (A e E); -0,9 MPa (B
e F); -1,6 MPa ( C e G) e -1,9 MPa (D e H).
69
A densidade de tricomas glandulares peltados apresentou ajuste linear
para a epiderme da face adaxial com 9 tricomas por mm-2 no tratamento de 1,5 MPa e quadrático para a face abaxial com o valor máximo estimado 10
tricomas por mm-2 para os potenciais hídricos de -1,5 MPa. Para os tricomas
tectores foi observada ajuste quadrático com valor máximo estimado de 23
tricomas mm-2 para face adaxial e linear para a epiderme da face abaxial, que
apresentou um total de 31 tricomas no potencial de -1,9 MPa (Figura 8).
A
B
Figura 8. A- Densidade de tricomas glandulares peltados e B- tricomas
tectores (B) nas faces adaxial e abaxial de Ocimum. africanum nos diferentes
potenciais hídricos (-MPa). Os pontos representam média de cinco repetições e
as barras o erro padrão da média
70
Em O. africanum o aumento na densidade de tricomas glandulares e
tectores observados nos tratamentos de menores potenciais hídricos podem
estar relacionados à redução na área do limbo foliar. Em situações de seca as
plantas tendem a apresentar menor área foliar, pois o desenvolvimento do
órgão é prejudicado pela redução nos processos de divisão e expansão celular.
De acordo com et al., (1999) e Guerfel et al., (2009), a presença de tricomas
tectores nas superfícies foliares pode auxiliar na construção de um microclima
úmido que reduz a transpiração. Além disso, estes tricomas são importantes
para ajudar na redução do aquecimento foliar, uma vez que reflete os raios
solares que incidem na folha.
Para a ultraestrutura foliar de O. africanum foram verificadas alterações
para as condições de maior deficiência hídrica, ou seja, os menores potenciais
hídricos. As principais alterações incluíram rompimento da membrana nuclear,
presença de corpos lipídicos nos cloroplastos, degeneração da membrana do
tonoplasto com a formação de vesículas e a contração da membrana
plasmática, devido a perda do turgor celular no potencial hídrico de -1,9 MPa
(Figura 9 a-f). Além disso, foi verificado que os cloroplastos das plantas sob o
potencial hídrico de -0,5 MPa (bem irrigadas) apresentaram uma estrutura
típica na forma elipsoidal, localizados próximos a parede celular, o sistema de
lamelas apresenta granas bem organizados e grãos de amido presente no
estroma (Figura 8 a-b). E sob as condições de seca, notou-se que o
empilhamento do grana foi menos frequente nas plantas do tratamento -1,6 e 1,9 MPa com alterações nos tilacóides intergranais (Figura 8 e-h).
Cl
71
Figura 9 - Eletromicrografia de microscopia eletrônica de transmissão das
células do mesofilo foliar de plantas de Ocimum africanum submetidas a
diferentes potenciais hídrico do ramo. A-B: Aspecto geral da célula do
parênquima paliçádico evidenciando a ruptura da membrana nuclear (seta) no
potencial hídrico de -1,9 MPa; C- Detalhe do plastoglóbulos no potencial de 0,9 MPa. D- Presença de vesículas, devido ao rompimento do tonoplasto
(seta). E-F- contração da membrana plasmática (seta). Cl: cloroplasto; nu:
núcleo; ga: grão de amido;va: vacúolo; pc: parede celular; pg: plastoglóbulos.
72
Cl
Figura 10- Eletromicrografia de transmissão de células do mesofilo foliar de
plantas de Ocimum africanum submetidas a diferentes potenciais hídricos do
ramo. A-B Aspecto ultraestrutural normal dos cloroplastos e do grana no
potencial hídrico do ramo de -0,5 MPa. C-D Cloroplastos do tratamento de -0,9
MPa evidenciando alterações na forma da organela. E- F Tratamento de -1,6
MPa, evidenciando a presença de plastoglóbulos (seta) e desorganização de
tilacóides no cloroplasto com estrutura eletrodensa na periferia (estrela). G-H
Potencial de -1,9 MPa evidenciando o rompimento da membrana do cloroplasto
(cabeça de seta) e a desorganização no empilhamento do grana (seta). Cl:
cloroplasto; nu: núcleo; ga: grão de amido; va: vacúolo; pg: plastoglóbulos.
73
Foi verificado que no potencial hídrico de -1,9 MPa algumas células dos
parênquimas paliçádico e esponjoso apresentaram rompimento total da
membrana dos cloroplastos com a exposição do amido de assimilação. Além
disso, o rompimento da membrana ocasionou a formação de pequenas
vesículas (Figura 11 a-d). Possivelmente, a destruição da membrana dessas
organelas esteja relacionada ação de espécies reativas de oxigênio (O-2; H2O2;
OH) uma vez que foi observado aumento no número e tamanho dos
plastoglóbulos no tratamento de maior deficiência hídrica, ou seja -1,9 MPa
quando comparado ao controle (0,5 MPa) (Figura 12 a-b).
Figura 11- Eletromicrografia de microscopia eletrônica de transmissão de
células do mesofilo foliar em plantas de Ocimum africanum submetidas ao
potencial hídrico de -1,9 MPa. A-B Vista geral de célula do parênquima
esponjoso evidenciando cloroplasto rompido e a formação de vesículas (setas).
C-D Vista geral da célula do parênquima paliçádico com cloroplastos
degradados e grãos de amido expostos no citoplasma (seta), além da presença
de plastoglóbulos (estrelas). Cl: cloroplasto; ga: grão de amido.
74
Figura 12. Eletromicrografia de microscopia eletrônica de transmissão de
células do mesofilo foliar de Ocimum africanum submetidas a diferentes
potenciais hídricos do ramo. A- Potencial hídrico do ramo de -0,5 MPa
evidenciando aspecto ultraestrutural normal dos cloroplastos com grão de
amido (ga) e pequenos plastoglóbulos (seta). B-C Tratamento de -1,9 MPa,
evidenciando a desorganização de tilacóides no cloroplasto e a ocorrência de
pequenos aglomerados de plastoglóbulos . Cl: cloroplasto; ga: grão de amido;
mi: mitocôndria.
Cl
Os plastoglóbulos são partículas de lipoproteína localizadas dentro dos
cloroplastos e são responsáveis pela proteção das membranas dos tilacóides e
das
proteínas
do
aparato
fotossintético
contra
os
radicais
livres
e
consequentemente o estresse oxidativo. Estão relacionados à condições
ambientais e seus fatores de estresse, tais com o déficit hídrico ( AUSTIN,
2006). Portanto, os plastoglóbulos visualizados no interior dos cloroplastos de
O. africanum (Fig 12 a-c) podem representar um mecanismo utilizado por esta
espécie para evitar possíveis danos ao aparato fotossintético.
Danos ultraestruturais nos cloroplastos foram observados nas espécies
Malus prunifolia e Malus hupehensis (WANG et al., 2012) e Zea mays L.
(GILES et al.,, 1974) quando submentidas a condições de déficit hídrico. A
manutenção da integridade da estrutura celular é um fator importante na
capacidade da planta suportar o estresse por seca e as alterações observadas
na ultraestrutura foliar de O. africanum sob déficit hídrico podem esclarecer os
mecanismos utilizados pelo vegetal para sobreviver nessas condições.
75
CONCLUSÃO
As modificações observadas no espessamento dos tecidos foliares e nas
densidades dos tricomas glandulares e tectores, bem como as alterações na
organização dos tilacóides, a destruição das membranas dos cloroplastos e a
presença de plastoglóbulos evidenciam a sensibilidade de O. africanum ao
déficit hídrico mais severo, sendo que a irrigação de 80% da capacidade de
campo, ou seja -0,9 MPa, ocasionou menores alterações anatômicas e
ultraestruturais mostrando- se mais adequada para o manejo da cultura.
A degradação dos cloroplastos observados na espécie sob deficiência
hídrica permitirão explicar possíveis alterações nas trocas gasosas foliares,
pois é nessa organela que ocorre às etapas da fotossíntese. Estudos
anatômicos
e
micromorfológicos
poderão
fornecem
informações
da
autoecologia de O. africanum sob condições de estresse ambiental, porém fazse necessários mais estudos em condições de campo.
76
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Considerando as condições ambientais na qual o experimento foi realizado
é possível concluir que a intensidade e duração do déficit hídrico reduziram
progressivamente as trocas gasosas foliares e os teores de pigmentos
cloroplastídicos, que acarretaram decréscimo na produção de biomassa, no
rendimento do óleo essencial e na eficiência no uso da água para essa
variável. Enquanto que, para o teor e eficiência de uso da água com base na
produção de óleo essencial foi constatado acréscimo nas condições de déficit
hídrico moderado, devido ao aumento na densidade de tricomas glandulares e
tectores. Os óleos essenciais das folhas e inflorescências não apresentaram
grandes alterações na composição nas diferentes potenciais hídrico do ramo.
As variações fisiológicas e de produção de óleo observadas neste estudo
estão
associadas
às
alterações
anatômicas,
ultraestruturais
e
micromorfológicas. Dessa forma, o cultivo de O. africanum em condições de
déficit hídrico regulado pode aumentar a produção do óleo essencial. Porém,
estudos futuros, em condição de campo, poderão explorar a possibilidade de
implementar estratégias de irrigação específicas para a espécie, buscando
otimizar o rendimento máximo de óleo essencial e componentes aromáticos.
77
REFERÊNCIAS
ALBUQUERQUE, U.P.; ANDRADE, L. H. de. El género Ocimum L.
(Lamiaceae) en el nordeste del Brasil. Anales Jardim Botanico Madrid. v.
56,p.43-64, 1998.
AUSTIN,J.R.; FROST,E.; VIDI, P.A.; KESSLER,F.; STAEHELINA,A.
Plastoglobules Are Lipoprotein Subcompartments of the Chloroplast That Are
Permanently Coupled to Thylakoid Membranes and Contain Biosynthetic
Enzymes. The Plant Cell. v.18, p. 1693-1703, 2006.
BOSABALIDIS,A.M; KOFIDIS G. Comparative effects of drought stress on leaf
anatomy of two olive cultivars. Plant Science. v.163, p. 375- 379, 2002.
CASTRO, H.G; FERREIRA, F.A; SILVA, D.J.H; MOSQUIM,P.R. Contribuições
ao estudo das plantas medicinais: metabólitos secundários. 2ed. Visconde
do Rio Branco, 2004, p.113.
CASTRO, E. M.; PEREIRA, F. J.; PAIVA, R. Histologia Vegetal: Estrutura e
Função de Órgãos Vegetativos. Lavras: UFLA, 2009. 234 p.
COSTA,L. C. B. ; PINTO, J. E. B. P. ; BERTOLUCCI,S.K.V.; GUIMARÃES,
R.M. Qualidade fisiológica de sementes de Ocimum selloi benth. Sob
condições de luz, temperatura e tempo de armazenamento. Ciências Agro
técnica, v. 34, p. 675-680, 2010.
CROTEAU R, KUTCHAN, TM, LEWIS NG. Natural products:secondary
metabolites. In Buchanan B, Gruissem W, Jones R (Eds.), Biochemistry and
Molecular Biology of Plants. Rockville, MD: American Society of Plant
Physiologists. p. 1250-1318. 2000
BATISTA, L.A.; GUIMARÃES, R. J.; PEREIRA, F.J.; CARVALHO,G.R.;
CASTRO, E.M. Anatomia foliar e potencial hídrico na tolerância de cultivares de
café ao estresse hídrico. Revista Ciência Agronômica, v. 41, n. 3, p. 475-481,
jul-set, 2010
BAHREININEJADA. B.; RAZMJOO. J.; MIRZA, M. Influence of water stress on
morpho-physiological and phytochemical traits in Thymus daenensis.
International Journal of Plant Production v.7, n.1, p.151-166, 2013.
BETTAIEB, I; ZAKHAMA,N; AIDI WANNES, W; KCHOUK M.E; MARZOUK, B.
Water deficit effects on Salvia officinalis fatty acids and essential oils
composition. Scientia Horticulturae. v.120, p. 271–275, 2009.
BLANK, A.F.; CARVALHO FILHO, J.L.S.; SANTOS NETO, A.L.; ALVES, P.B.;
ARRIGONI-BLANK, M.F.; SILVA-MANN, R.; MENDONÇA, M.C. Caracterização
78
morfológica e agronômica de acessos de manjericão e alfavaca. Horticultura
Brasileira, Brasília, v.22, n.1, p. 113-116, 2004
BOSABALIDIS,A.M; KOFIDIS G. Comparative effects of drought stress on leaf
anatomy of two olive cultivars. Plant Science. v.163, p. 375- 379 ,2002.
FERREIRA, D. F. SISVAR. Sistema de análises estatísticas para dados
balanceados. Versão 5.3. Lavras: UFLA/DEX, 2010.
JOLY.R.J; ZAERR,J.B. Alteration of cell-wall water content and elasticity in
Douglas-fir during periods of water deficit. Plant Physiology. v.83, p. 418-422,
1987.
KHALID, A. Influence of water stress on growth, essential oil, and chemical
composition of herbs (Ocimum sp.). International Agrophysics, v,20, p. 289296. 2006
KOZLOWSKI T. T; PALLARDY,S.G. Acclimation and Adaptive Responses of
Woody Plants to Environmental Stresses. The Botanical Review. v.68, n.02, p.
270-334, 2002.
GILES,K.L.; BEARDSELL,M.F.; COHEN,D. Cellular and Ultrastructural
Changes in Mesophyll and Bundle Sheath Cells of Maize in Response to Water
Stress. Plant Physiology v.54, p. 208-212, 1974.
GUERFEL, M; BACCOURI, O; BOUJNAH, D; CHAI, W; ZARROUK,
MOKHTAR. Impacts of water stress on gas exchange, water relations,
chlorophyll content and leaf structure in the two main Tunisian olive (Olea
europaea L.) cultivars. Scientia Horticulturae. v,119 , p.257–263, 2009.
LARCHER, W. Ecofisiologia Vegetal. São Carlos, Rima, 2000. 531p.
LEONARDO, M. Produção de óleo essencial associado à deficiência
hídrica em plantas de Ocimum basilicum L.cv. genovese.2007. 132 f. Tese
( Doutotado em Agronomia )- Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Ciências Agronômicas, Botucatu, 2007
MELO, H. C. et al., Alterações anatômicas e fisiológicas em Setaria anceps
Stapf ex Massey e Paspalum paniculatum L. sob condições de deficit hidrico.
Hoehnea, v. 34, n. 02, p. 145-153, 2007.
NASCIMENTO, E.A., L.E.M. OLIVEIRA, E.M. CASTRO, N. DELU FILHO, A.C.
MESQUITA, AND C.V. VIEIRA. Alterações morfofisiológicas em folhas de
cafeeiro (Coffea
arabica L.)
consorciado
com
seringueira (Hevea
brasiliensis Muell.Arg.) Ciência Rural v.36, p.852-857,2006.
O’BRIEN,T.P; FEDER,N;MUCULLY,M.E. Polycromatic stairing of plant cell
walls by toluidine blue. Protoplasma. v.59, p.368, 1964.
79
PETROPOULOS, S.A.; DAFERERA D; POLISSIOU M.G.; PASSAM H.C. The
effect of water deficit stress on the growth, yield and composition of essential
oils of parsley. Scientia Horticulturae, v.115 p. 393–397, 2008.
REIS MS; MARIOT A. 2000. Diversidade natural e aspectos agronômicos de
plantas medicinais. In: Simões, CMO. (ed). Farmacognosia: da planta ao
medicamento. 2. ed. Porto Alegre/ Florianópolis: Ed. da UFRGS/ Ed. da UFSC
p. 39-60.
REHEM, B. C.; BERTOLDE, F. Z.; ALMEIDA, A.A. F. Regulation of Gene
Expression in Response to Abiotic Stress in Plants. In: PAULA BUBULYA. Cell
Metabolism - Cell Homeostasis and Stress Response Biochemistry,
Genetics and Molecular Biology, Hard cover, 208 pages, 2012.
SALES,O. GraphPad Software 6.01 , Inc, 1992-2012.
SILVA, H.; MARTINEZ, J, P.; BAGINSKY, C.;PINTO, M. Efecto del déficit
hídrico en la anatomía foliar de seis cultivares de Poroto Phaseolus vulgaris.
Revista Chilena de Historia Natural. v.72 p.219-235, 1999.
SILVA R. S. S, DEMUNER, A. J ; BARBOSA, L. C DE A; CASALI,V.W.D;
NASCIMENTO,E.A; PINHEIRO,A.L. Efeito do estresse hídrico sobre
características de crescimento e a produção de óleo essencial de Melaleuca
alternifolia Cheel. Maringá, v. 24, n. 05, p. 1363-1368, 2002
SCHOLANDER, P.F., HAMMEL, H.T., BRADSTREET, E.D., HEMMINGSEN,
E.A. Sap pressure in vascular plants. Science. v. 148, p. 339–46, 1965.
TAIZ. L.;ZEIGER. E. Fisiologia vegetal. 3ed. Porto Alegre: Artmed, 2004,
719p.
VARGAS, M. E. O. Respostas ecofisiológicas e bioquímicas do Ocimum
basilicum L. cultivado em diferentes níveis hídricos 2007. 72f. Dissertação
(Mestre em Agroecossitemas) – Universidade Federal do Sergipe, São
Cristóvão, 2007.
WANG, S.; LIANG, D.; CHAO LI.; HAO Y.; FENGWANG MA.; SHU H. Influence
of drought stress on the cellular ultrastructure and antioxidant system in leaves
of drought-tolerant and drought-sensitive apple rootstocks. Plant Physiology
and Biochemistry, v.51, p. 81- 89, 2012.