Papel do IGF-I na infecção por Leishmania
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUACÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA. Papel do IGF-I na infecção por Leishmania amazonensis em macrófagos de indivíduos com deficiência isolada do hormônio do crescimento Mônica Rueda Barrios São Cristovão 2014 i MÔNICA RUEDA BARRIOS Papel do IGF-I na infecção por Leishmania amazonensis em macrófagos de indivíduos com deficiência isolada do hormônio do crescimento Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação, em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como requisito de aprovação para o curso do Mestrado em Biologia Parasitaria. Orientadora: Profa. Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus. São Cristóvão 2014 ii MÔNICA RUEDA BARRIOS Papel do IGF-I na infecção por Leishmania amazonensis em macrófagos de indivíduos com deficiência isolada do hormônio do crescimento Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação, em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como requisito de aprovação para o curso do Mestrado em Biologia Parasitaria. Aprovada em: _____/_____/_____ _____________________________________________ Orientadora: Prof. Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus __________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Manuel Hermínio Aguiar Oliveira __________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dra. Hiro Goto __________________________________________________ 3º Examinador: Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida PARECER ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ iii Aos meus pais, Nancy e Ramiro, aos meus irmãos, Erika, Ramiro e Luísa. Ao meu esposo, Mario, e ao meu filho Mario Jose, pelo amor, força e apoio que foram importantes para chegar até aqui. iv AGRADECIMENTOS A Deus todo-poderoso que comanda minha vida, colocando-me em lugares altos e com pessoas iluminadas. À Dra. Amélia Ribeiro de Jesus, maravilhosa mulher, exemplo de orientadora e conselheira. Sempre paciente e sorridente. Obrigada por ter me acolhido com amor na sua equipe e por confiar no meu desempenho. Ao Dr. Roque Pacheco de Almeida, grande exemplo de liderança. Obrigada pelas sugestões construtivas durante todas as etapas do experimento. Ao Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira, obrigada pela grande oportunidade de trabalhar neste grande projeto. À Dra. Tatiana Rodrigues de Moura, exemplo de integridade e competência. Obrigada por dar uma luz durante minha pesquisa. Ao Dr. Paulo Leopoldo, Obrigada pelos excelentes, sinceros e sábios conselhos. À Dra. Viviane Correia Campos, obrigada pela ajuda com os pacientes, e sugestões durante os experimentos. Aos meus queridos colegas de mestrado: Aline, Alda. Ana, Alan, Israel, Mary, Mércia, Thiago, Kathy por tornar nossas aulas muito divertidas, vocês me ensinaram o significado da palavra companheirismo. Aos meus colegas e amigos do laboratório que já são parte de meu coração muito obrigada: Aline, Fabrícia, Micheli, Ricardo, Sueli, Luana, Meyri, Juci, Marise, Cecília, Daniela, Marcio, Rodrigo, Rose e Lays. A toda equipe do laboratório de Patologia, por fazer a hora do cafezinho muito divertida. Aos principais colaboradores desta pesquisa, os pacientes com DIGH que se disponibilizaram para a realização desta pesquisa. A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram no desenvolvimento deste trabalho, o meu agradecimento. v Tenho aprendido... Que se aprende errando; Que crescer não significa fazer aniversário; Que o silêncio, às vezes, é a melhor resposta: Que trabalhar significa não só ganhar dinheiro: Que dinheiro não compra classe: Que amigos a gente conquista mostrando o que somos; Que os verdadeiros amigos sempre ficam até o fim; Que devemos sempre ter palavras doces e gentis, pois amanhã talvez tenhamos que engolilas; Que não se espera a felicidade chegar, mas se procura por ela; Que quando penso saber tudo, ainda não aprendi nada; Que ninguém é perfeito, até que você se apaixone por esta pessoa; Que um só dia pode ser muito importante que muitos anos; Que a vida é dura, mas eu sou mais ainda; Que sonhar é preciso; Que deveríamos ser gratos a Deus por não nos dar tudo que pedimos; Que Deus não fez tudo num só dia, o que me faria pensar que eu podia? Que não importa a seriedade que a vida exija de você, precisamos de um amigo brincalhão; Que nem sempre posso escolher como me sinto, mas posso escolher o que fazer a respeito; Que o que realmente importa é a paz interior; Que não se precisa morrer para aprender a viver. E, finalmente, tenho aprendido que... Quando menos tempo tenho, mais coisas consigo fazer. (adaptado de William Shakespeare) vi SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................................. i LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... ii LISTA DE TABELAS............................................................................................................. iii RESUMO................................................................................................................................. iv ABSTRACT.............................................................................................................................. v 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 1 2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................... 3 2.1 Leishmanioses......................................................................................................... 3 2.1.1 Resposta imune à infecção por Leishmania........................................................ 6 2.1.2 Macrófagos e mecanismos microbicidas............................................................. 9 2.1.3 Efeito do IGF-1 na infecção por Leishmania.......................................................11 2.2 Hormônio de Crescimento e metabolismo............................................................ 13 2.3 Deficiência Isolada do Hormônio do crescimento (DIGH) ................................... 16 3 OBJETIVOS...................................................................................................................... 18 4 DESENHO EXPERIMENTAL......................................................................................... 19 5 METODOLOGIA............................................................................................................. 20 5.1 Obtenção promastigotas de Leishmania amazonenses.................................................. 20 5.2 Obtenção de macrófagos em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos indivíduos..................................................................................................................... 20 5.3 Infecção de macrófagos por promastigotas de Leishmania amazonensis e tratamento com IGF-I.................................................................................................................... 21 5.4 Infecção de macrófagos por promastigotas de Leishmania amazonenses pré-tratadas com IGF-I................................................................................................................... 23 5.5 Expressão de mRNA de IGF-I por PCR em tempo real................................................ 24 5.6 Avaliação do parasitismo............................................................................................... 25 vii 5.7 Analise estatística.......................................................................................................... 25 6 RESULTADOS................................................................................................................. 26 6.1 Seleção dos pacientes e controles................................................................................. 26 6.2 Comparação da infecção de macrófagos por Leishmania in vitro entre indivíduos com deficiência genética de DIGH e em controles normais sem esta mutação....................................................................................................................... 27 6.3 Comparação da infecção de macrófagos por Leishmania in vitro entre indivíduos com DIGH e controles sem a mutação, sem e com o tratamento com IGFI.................................................................................................................................. 29 6.4 Comparação entre as infecções de macrófagos com L. amazonenses pré-tratadas ou não in vitro com IGF-I........................................................................................................ 32 7 DISCUSSÃO..................................................................................................................... 33 8 CONCLUSÕES................................................................................................................. 36 9 PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 37 REFERÊNCIA BIBLIOGRAFICA.......................................................................................... 38 viii LISTA DE ABREVIATURAS ALS: Proteína ácido lábil. DIGH: Deficiência isolada do hormônio do crescimento. GH: Hormônio do crescimento. GHBP: Proteína transportadora do hormônio do crescimento. GHRH: Hormônio liberador do hormônio de crescimento GHRH-R: Receptor do liberador do hormônio de crescimento. GM-CSF: Fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos. HOMA-IR: Índice de resistência à insulina. IGF-1: Fator similar à insulina. IGFBP: Proteína transportadora de IGF. IL: Interleucina INF: Interferon M1: Macrófagos do tipo 1 M2: Macrófagos do tipo 2 MUT: Mutante. NK: Natural killer LPS: Lipopolissacarídeo PBMC: Células mononucleares do sangue periférico RTK: Tirosina-quinasse TCD4+: Células T apresentando a molécula CD4 na membrana celular TCD8+: Células T apresentando a molécula CD8 na membrana celular Th1: T helper tipo 1 Th2: T helper tipo 2 TNF-α: Fator de necrose tumoral i LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ciclo biológico da Leishmania................................................................................... 4. Figura 2: Modelo de resposta imune a infecção por Leishmania............................................... 8 Figura 3: Modelo de ativação de macrófagos M1 e M2 na resposta imune..............................10 Figura 4: Diferentes vias do metabolismo da L-arginina em Macrófago em resposta a infecção por Leishmania...........................................................................................................................13 Figura 5: Eixo hormonal do GH\IGF-I.....................................................................................14 Figura 6: Fluxograma do desenho experimental do estudo.......................................................19 Figura 7: Desenho esquemático da infecção e tratamento dos macrófagos com IGF-I............21 Figura 8: Desenho esquemático da infecção com tratamento dos macrófagos com as diferentes concentrações de IGF-I...............................................................................................................22 Figura 9: Desenho esquemático da L. amazonensis pré-tratadas com IGF-I............................23 Figura 10: Infecção de Macrófagos de pacientes com DIGH e controles..................................28 Figura 11: Comparação entre infecções por L. amazonensis de macrófagos de indivíduos controles e MUT\MUT................................................................................................................30 Figura 12: Expressão de mRNA de IGF-1 por PCR em tempo real..........................................31 Figura 13: Comparação entre as infecções por L. amazonensis de macrófagos de indivíduos controles e MUT\MUT................................................................................................................32 ii LISTA DE TABELAS Tabela 1: Caraterização demográfica dos pacientes com DIGH (MUT\MUT) e controles sem a mutação.......................................................................................................................................26 iii RESUMO Papel do IGF-I na infecção por Leishmania amazonensis em macrófagos de indivíduos com deficiência isolada do hormônio do crescimento. A leishmaniose é uma doença que acomete o homem desde tempos remotos. Um aumento do número de casos e ampliação de sua ocorrência geográfica tem ocorrido nos últimos 20 anos. No Brasil é encontrada atualmente em todos os estados, em especial nas regiões Norte e Nordeste, sob diferentes perfis epidemiológicos. Estudos in vitro mostraram que o peptídeo Insulin-Like Growth Factor type I (IGF-I), principal mediador das ações do hormônio de crescimento (GH), aumenta a infecção de macrófagos por Leishmania. Em modelos experimentais, o tratamento com IGF-I agrava a infecção por Leishmania. Em Itabaianinha, no nordeste do Brasil, foi descrito uma grande coorte de indivíduos homozigotos para a mutação c.57+1G>A (MUT/MUT) no receptor do hormônio liberador do hormônio de crescimento (GHRH), causando um nanismo acentuado devido à deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH), com concentrações séricas vitalícias muito baixas de GH e IGF-I. O propósito deste trabalho foi avaliar, in vitro, o papel do IGF-I na susceptibilidade à infecção por Leishmania, de macrófagos humanos dos indivíduos com DIGH. O comportamento da infecção in vitro com Leishmania amazonensis foi comparado em macrófagos derivados do sangue periférico de dois grupos de indivíduos: indivíduos MUT/MUT (n= 8), e indivíduos controles homozigóticos normais, N/N (n=7). O número de macrófagos infectados/100 macrófagos e a carga parasitária destes macrófagos (número de amastigotas /100 macrófagos) foram comparados entre estes grupos. Os macrófagos dos indivíduos com DIGH são mais resistentes à infecção com promastigotas de Leishmania amazonensis que os dos N/N e não parecem responder ao estímulo in vitro com IGF-I. Estes resultados comprovam em células humanas, os achados em camundongos que mostram que o IGF-I agrava a infecção na interação macrófago-Leishmania amazonensis. Palavras Chave: Leishmania, Insulin growth fator-1, deficiência isolada do hormônio de crescimento, Macrófagos. iv ABSTRACT Role of IGF-I in Leishmania amazonensis in macrophages of patients with isolated deficiency of growth hormone. Leishmaniasis is a disease that affects humans since ancient times. In the last 20 years an increased number of cases and expansion of the geographic occurrence of leishmaniasis has taken place. In Brazil, the disease is currently found in all states, especially in the North and Northeast regions, with different epidemiological profiles. In vitro studies have shown that the hormone "Insulin-Like Growth Factor" (IGF-I) enhances Leishmania infection in macrophage in vitro and, exacerbates Leishmania infection in vivo in experimental models, treatment with IGF-1. Individuals with a natural mutation of the receptor of growth hormone-releasing hormone (GHRH) and consequent deficiency of growth hormone (GH) and IGF-I have been described in Itabianinha, Sergipe, called Isolated deficiency of growth hormone (DIGH). This mutation affects the growth weight and height, but the immune response of these individuals has not been evaluated. To better understand the role of IGF-1 in susceptibility to Leishmania infection, the purpose of this work was to study the behavior of leishmania infection in vitro in human macrophages from these individuals with IGF-1 deficiency. Leishmania amazonensis infection was compared in monocytes-derived from peripheral blood from two groups of individuals: 1) Individuals affected with homozygous deficiency of GHRH/GH/IGF-I (dwarf phenotype) (n =8), 2) Homozygous controls without this mutation (normal phenotype) (n =7). The number of infected macrophages and the parasitic load/100 macrophages was compared between these groups. These data confirm the data from experimental model that of IGF-I interferes in Leishmania-macrophage interaction, increasing the parasitic load of this infection. Keywords: Leishmania, Growth Hormone, Insuline-like growth factor-I, Growth hormonereleasing hormone, Macrophages. v 1. INTRODUÇÃO. A leishmaniose é uma doença de amplo espectro de manifestações clínicas influenciadas por aspectos do indivíduo, como aspectos imunológicos, genéticos, nutricionais; aspectos do parasito, a exemplo da espécie e características fenotípicas da cepa da Leishmania (SCHERIFER, 2009); e por fatores do inseto vetor, como as inoculação de substâncias bioactivas da saliva dos flebotomíneos no repasto sanguíneo (JESUS-VALENZUELA, 2014); e aspectos ambientais que interferem na população do inseto vetor, alterando a carga infectante. Estes fatores interferem na resistência à infecção e na apresentação clínica da doença através de suas influências na relação parasito-hospedeiro. Nesse contexto da relação parasito-hospedeiro, a resposta imune nos eventos iniciais da infecção por Leishmania exerce um papel importante (ETTINGER, 2009). A interação parasita – hospedeiro depende de fatores de ordem ambiental e da susceptibilidade ou resistência dos indivíduos às infecções. Fatores hormonais de natureza adquirida ou genética são decisivos pra a resposta imune aos agentes invasivos ambientais (RAMOS, 2006; CHAGAS et al., 2006; REBOLLEDO e SÁNCHEZ, 2008). Dentre eles, o hormônio de crescimento (GH) e seu principal mediador, o peptídeo Insulin-Like Growth Factor type I (IGF-I) recebem muita importância pelas numerosas ações em várias vias da resposta imune (refs). Estudos in vitro mostraram que o IGF-I, exibe um papel facilitador da infecção por Leishmania em macrófagos murinos, suprimindo a resposta imune do hospedeiro (GOMES et.al. 2001). Por outro lado, o tratamento com GH, aumentando os níveis de IGF-I, também aumenta a infecção de macrófagos por Leishmania. Em modelos experimentais, o tratamento com IGF-I aumenta o crescimento de promastigotas de Leishmania, quando adicionado em cultura (GOMES et al. 2001), sendo demonstrado um receptor para o IGF-I na superfície de promastigotas de Leishmania. Este receptor é uma glicoproteína monomérica de 65-kDa, antigenicamente relacionada à cadeia α do receptor humano. Desta forma, especula-se que este receptor seja um dos mecanismos adaptativos desenvolvidos pelo parasita para sobreviver e proliferar, após invadir o hospedeiro humano (GOMES et al 2001). 1 Cerca de dez espécies do protozoário Leishmania são transmitidas ao homem por hospedeiros invertebrados flebotomídeos, (NEVES, et al 2005) sendo que a L.(L) amazonensis e L.(V) braziliensis podem relacionar-se a várias formas clínicas da doença (BARRAL, GUERREIRO et al 1995). Há cerca de 12 milhões de seres humanos infectados com leishmaniose, com um amplo espectro de doenças, que inclue desde infecções cutâneas leves a doenças viscerais fatais, com uma incidência de 0,5 milhões de casos da forma visceral da doença. 90% por cento dos casos de leishmaniose visceral são localizados na Índia, Nepal, Bangladesh e Brasil especialmente nas regiões norte e nordeste. Foram descritas seis formas clínicas da leishmaniose, divididas em dois grupos, a forma visceral e a tegumentar, a qual pode ser cutânea, disseminada, cutânea difusa, mucosa e leishmaniose dérmica pós calazar. Em Itabaianinha, Sergipe no Nordeste do Brasil existe um grupo de 105 indivíduos da mesma família com acentuada baixa estatura, devido a mutação homozigótica c.57+1G>A no gene do receptor do hormônio liberador do GH (GHRH-R), que impede a formação do RNA mensageiro do GHRH-R, abolindo completamente sua expressão (Salvatori et al 1999), levando a uma grave deficiência isolada do GH (DIGH). Estes pacientes vivem com níveis extremamente baixos de GH e de IGF-1(Aguiar-oliveira, 1999), constituindo uma valiosa oportunidade para definir as consequências da DIGH vitalícia e não tratada (SOUZA et al 2004) sobre a função imune. Chama atenção o fato de que estes indivíduos apresentam uma longevidade normal, porém com uma maior frequência de morte em mulheres com DIGH com menos de 20 anos de idade, provavelmente por causa infecciosas, e desidratação devido a doenças diarréicas. Leishmaniose em nenhuma de suas formas foi registrada em 20 anos de seguimento desta população e nenhuma causa de óbito devido à Leishamiose foi registrada nesta coorte desde 1853 (Aguiar-oliveira, 2010). Tendo em vista o aumento do crescimento de Leishmanias in vitro e do favorecimento do parasitismo em macrófagos murinos na presença do IGF-1, os indivíduos com DIGH de Itabaianinha representam uma excelente oportunidade para avaliação do comportamento da infecção por leishmania in vitro, em macrófagos humanos com deficiência natural de IGF-I. Nossa hipótese é que macrófagos de indivíduos com DIGH são mais resistentes à infecção por Leishmania amazonensis. 2 2. 2.1 REVISÃO DA LITERATURA Leishmanioses As Leishmanioses são antropozoonoses, cuja transmissão do parasito ocorre pela picada da fêmea de mosquitos vetores para animais silvestres ou domésticos, sendo o homem um hospedeiro acidental. No Brasil e uma zoonose adquirida acidentalmente. A transmissão do parasito é feita pelo inseto popularmente conhecido como asa-branca, mosquito-palha ou flebotomíneo, inseto-vetor da família Psychodidae, gênero Lutzomyia sp. As leishmania tem um ciclo digenético com uma fase no hospedeiro invertebrado e outra em hospedeiros mamíferos, incluindo o homem e animais silvestres e cães domiciliados. No hospedeiro intermediário, ela se desenvolve no intestino, sob a forma promastigota. O ciclo da Leishmania envolve dois hospedeiros, o hospedeiro vertebrado e o vetor flebotomíneo. Nos hospedeiros mamíferos, a Leishmania é obrigatoriamente um parasita intracelular e existe na forma amastigota no interior de células fagocíticas, principalmente macrófagos. Durante o repasto sanguíneo, a fêmea do flebotomíneo torna-se infectada após ingerir as formas amastigotas presentes nos fluidos intersticiais, células da pele ou sangue do hospedeiro. No intestino dos flebotomíneos, as amastigotas são liberadas e se transformam em promastigotas flageladas. Estas passam por um processo chamado de metaciclogênese, em que a forma procíclica não infectiva adquire capacidade de virulência e é transformada na forma infecciosa denominada promastigota metacíclica (Da SILVA & SACKS, 1987). Durante o repasto sanguíneo, as formas promastigotas metacíclicas são inoculadas na pele do hospedeiro mamífero. No homem, o parasita se estabelece em células do sistema fagocítico mononuclear na forma amastigota, causando doença nos susceptíveis. (Figura 1). 3 Figura 1: Ciclo biológico da Leishmania. (modificado sameens.dia.uned.) No Brasil, tanto a Leishmaniose tegumentar quanto a visceral são endêmicas e em crescente expansão. A prevalência elevada, dificuldades na intervenção no ciclo de transmissão e a repercussão socioeconômica por ser uma doença incapacitante, fazem das leishmanioses um grande problema de saúde pública. (FUNASA 2003). Segundo a Organização Mundial de Saúde, as leishmanioses são consideradas um importante problema de saúde pública mundial, com cerca de 12 milhões de seres humanos infectados com leishmaniose e ocorrência de 2 4 milhões de casos novos anualmente. Estima-se que 350 milhões de pessoas encontram-se em risco de contrair leishmaniose. A ocorrência da forma visceral da doença é 500 mil casos novos anualmente, sendo 90% destes na Índia, Nepal, Bangladesh e Brasil (WHO, 2010). Em Sergipe os casos são registrados desde 1934, a incidência média dobro da década de 80 com 3,37 para década de 90 com uma incidência de 7,60 sendo a região leste a mais afetada. TAVARES & TAVARES, 1999. Segundo a Secretaria de Saúde foram registrados 493 casos novos nos anos de 2000 a 2009 distribuídos em Aracaju, Estancia e Nossa Senhora do Socorro. A leishmaniose possui manifestações clínicas que vão desde infecções cutâneas leves até doenças viscerais fatais. As diferentes formas clínicas são influenciadas pela espécie do parasito, por fatores ambientais e individuais como a genética do indivíduo e a resposta imune. A leishmaniose visceral (LV) é associada a L.(L) infantum e L.(L) donovani (velho mundo) e L.(L) chagasi (novo mundo). A LV é uma doença sistêmica, de evolução crônica, cujo agente etiológico no Brasil é a Leishmania (L) chagasi. (NEVES, et al 2005). A LV pode ser classificada como: a) Assintomática, caraterizada por reatividade cutânea de hipersensibilidade tardia (DTH) positiva para antígeno solúvel de leishmania (SLA) sem nenhuma manifestação clínica de doença, b) Oligossintomática caraterizada por sorologia positiva e presença de sinais e\ou sintomas clínicos discretos como febre, hepatomegalia e\ou esplenomegalia de pequeno grau. c) Forma clássica da doença plenamente manifesta, leishmaniose visceral (LV), caraterizada por hepatoesplenomegalia volumosa, febre, pancitopenia, hipergamaglobulinemia e com grande comprometimento geral do estado do paciente, podendo levar à morte se não tratada. (BADARO et al 1986). Em infecções por Leishmania, as atividades microbicidas de macrófagos são severamente prejudicadas, levando à sobrevivência e proliferação dos parasitas dentro dos mesmos (OLIVIER et al , 2005). As formas tegumentares são causadas por L.(L) tropica e L.(L) major no velho mundo As principais espécies que causam LC no Novo Mundo são Leishmania braziliensis viannia , L. (V) guianensis, L (V) panamensis , L.(L) mexicana e L.(L) venezuelensis, L.(L) amazonensis pode causar todo o espectro clínico da leishmaniose humana e L.(V) braziliensis pode causar cutânea (LC), e leishmaniose mucosa (LM). (BARRAL, GUERREIRO et al,1995). 5 Entre as formas tegumentares, a leishmaniose cutânea (LC) é a mais frequentemente encontrada. A doença é habitualmente caracterizada por uma úlcera de bordas elevadas, porém outros aspectos tais como, lesões tuberculares, placas infiltradas e lesões verrucosas, têm sido observados. A leishmaniose disseminada (LD) pode ser observada em mais de 2% e se apresenta com múltiplas lesões (> 10 lesões) acneiformes, pápulas e pequenas úlceras, localizadas abaixo e acima da cintura (TURETZ, MACHADO et al 2002). A leishmaniose cutânea difusa (LCD), é uma forma rara de leishmaniose tegumentar e se caracteriza principalmente por nódulos cutâneos disseminados com lesões ricas em parasitos (CONVIT, PINARDI et al 1972). A leishmaniose mucosa (LM), que ocorre em aproximadamente 3 a 4 % dos pacientes se inicia com envolvimento da mucosa nasal, podendo atingir o palato, amídala, gengiva e lábio superior (MARSDEN, SAMPAIO et al. 1985). Essa forma é considerada a mais grave da leishmaniose tegumentar (CARVALHO, CORREIA FILHO et al 1995). 2.1.1. Resposta imune à infecção por Leishmania. Modelos experimentais de infecção por leishmania foram importantes para entender a resposta imunológica na leishmaniose, A partir desses modelos, os conhecimentos sobre essas células foram estudados em outras doenças e outros tipos de células foram posteriormente descritas, como alguns tipos de células T regulatórias e Th17. Foi demonstrado que os subtipos de linfócitos se desenvolvem a partir de células precursoras virgens (Th0), e vários fatores contribuem para esta diferenciação como, por exemplo, o tipo de célula apresentadora de antígeno (APC), a natureza dos sinais coestimulatórios, via e dose de administração do antígeno e tipos de citocinas produzidas durante a apresentação do antígeno. De acordo com os seus perfis, as células Th1 produzem citocinas, tais como o interferon-gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2) que promovem respostas imunitárias celulares, pois ativam os mecanismos microbicidas dos macrófagos e, na infecção por Leishmania, está associada a resistência à infecção. Por outro lado, a resposta Th2, sintetizam citocinas , tais como IL-4 , IL5 , IL-10 e IL-13, as quais desempenham um papel na resposta imunitária humoral e nas infecções por agentes multicelulares e reações alérgicas. As células Th2 estão associadas à susceptibildade à infecção por Leishmania (ALMEIDA et al 2009). A produção de IL -12 por DC leva os linfocitos T CD4+ à diferenciação para Th1, necessárias para uma ação eficiente do macrófagos e a morte do parasita, enquanto a produção 6 de IL-4 e IL- 10, levam à resposta Th2 ou T reguladora e à persistência do parasita. As funções da IL-10 são inibir a síntese de citocinas/quimiocinas produzidas por macrófagos, a função de macrófagos, a exemplo dos eventos metabólicos associados com a ativação de seus mecanismos microbicidas, além da inibição de sua atividade como célula apresentadora de antígenos (ALMEIDA et al 2009). Posteriormente, foi observado um papel protetor das células Th17 na leishmaniose visceral (KITANI.et al 2008) Os linfócitos Th0 diferenciam-se em Th17 pelo estímulo das citocinas IL-6/TGF-beta e IL-23. Estas células produzem a IL-17, citocina com função inflamatória, que atrai e ativa neutrófilos no sítio da lesão (DAI-XG et al 2008) (Figura 2). 7 Figura 2: Modelo de Resposta imune à infecção por Leishmania sp. (Diagrama desenhado por Dra. Amelia Ribeiro de Jesus). Apesar dos conhecimento sobre a resposta imune nas leishmanioses abordarem mais aspectos da resposta imune adaptativa, nas infecções experimentais têm sido demonstrado um papel importante das diferentes células da resposta imune inata nos eventos iniciais da infecção. Vários tipos celulares predominantes na pele, como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas (CD), reconhecem os patógenos, através de diferentes receptores de reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (rPMAP). Na leishmaniose cutânea, na fase "silenciosa" inicial sem inflamação clinicamente aparente, promastigotas são fagocitados principalmente por macrófagos residentes via CR3. Além disso, os mastócitos cutâneos são ativados, recrutando neutrófilos e monócitos para a pele com o desenvolvimento de uma placa de nodular. Trabalhos experimentais em camumdongos BALB\c ressaltam a participação de neutrófilos nesta fase, contribuindo para modular a infecção. Os neutrófilos não ativados e que sofrem apoptose contendo leishmania em seus interiores, são fagocitados por macrófagos, carreando as leishmanias (como “cavalos de Tróia”), e inibem os mecanismos microbicidas dos macrófagos, favorecendo a infecção por leishmania (BARRAL, GUERREIRO et al, 1995). Esses eventos iniciais da infecção, influenciam a diferenciação dos macrófagos e células dendríticas em subtipos, que produzem diferentes perfis de citocinas e, por sua vez, induzem a 8 diferenciação dos linfócitos T CD4+ nos subtipos descritos acima, influenciando, assim os diferentes perfis da resposta imune adaptativa. 2.1.2. Macrófagos e mecanismos microbicidas. Os macrófagos são células do sistema imunológico inato, com papéis bem estabelecidos na resposta primária a patógenos. São amplamente distribuídas no organismo humano, e desempenham um papel importante na homeostase dos tecidos, coordenação e modulação da resposta imune adaptativa, inflamação, e reparo dos tecidos. (MARTINEZ. et al 2009). Os macrófagos podem ser classificados em subtipos funcionais: M1 e M2. Os macrófagos M1 são induzidos por estímulos microbianos como o Lipopolissacarídeo (LPS), através do reconhecimento desta molécula por receptor de PMAP, no caso do LPS o receptor Toll-like 4 (TLR 4), associado à molécula de CD14, ou induzidos por citocinas como IFN-γ, TNF- e GM-CSF. Os macrófagos M1 produzem concentrações elevadas de IL-12 e IL-23, citocinas inflamatórias (IL-1β, TNF- e IL-6), reativos intermediários de oxigênio e nitrogênio (O-, OH- e NO-), e baixas concentrações de IL-10. Assim, eles são bons efetores contra agentes intracelulares (GORDON, 2003; MANTOVANI et al , 2005). Os macrófagos do subtipo M2 são induzidos por IL-4 ou IL-13, TGF-β, IL-21, imunocomplexos e IL-10, produzem baixas concentrações de IL-12 e IL-23 e produzem altas concentrações de IL-10 e TGF- β. Estes macrófagos permitem a propagação de agentes intracelulares. (FARROW et al 2011). (Figura 3). 9 Figura 3.: Modelo de ativação de macrófagos M1 e M2 na resposta imune (MARTINEZ 2009). Os macrófagos são a principal célula efetora de defesa contra a leishmania, e quando ativados exibem caraterísticas funcionais moduladas após a fagocitose do parasita, ativando seus mecanismos oxidativos (SAHA, 2006). No entanto, (SACKS 2008) demonstrarão que a Leishmania tem diversos mecanismos adaptativos que facilitam sua própria fagocitose, por ser um agente intracelular. Na infecção por Leishmania, os macrófagos são ativados, tornando-se "células efetoras", que podem fagocitar e destruir o hóspede indesejado. Vários processos celulares começam após a ativação dos macrófagos, incluindo a produção de enzimas de degradação fagolisossomais (ex: proteases, nucleases, fosfatases, lipases e esterases), a geração do estresse oxidativo com produção de ânion superóxido (O2-) e óxido nítrico (NO-) (ASSCHE et al., 2011). Além disso, pelo seu papel como célula apresentadora de antígenos (APC), a diferenciação do macrófago em M1 e M2, pode afetar o tipo de resposta imune celular que se desenvolverá em resposta às infecções. O subtipo M1 induz a diferenciação de linfócitos T CD4+ em Th1 e/ou Th17 e o subtipo M2 em Th2 ou T regulatória. Por sua vez, as células T CD4+ diferenciadas estimulam também a diferenciação desses dois subtipos de macrófagos. 10 2.1.3. Efeito do IGF-I na infecção por Leishmania. Goto et al., 1998 demonstraram que promastigotas de Leishmania proliferam mais na presença de IGF-1. Além disso, demonstraram a presença de receptor para IGF-1 na superfície de promastigotas de Leishmania, glicoproteína monomérica de 65 KDa. O receptor de IGF-1 de Leishmania é antigenicamente similar à cadeia α do receptor humano, reconhecido por meio de imunoprecipitação com anti-IGF-1 humano, com um único sítio de ligação, com média a alta afinidade. O receptor IGF-1 humano é constituído por uma molécula tetrâmera com duas cadeias α e duas β com massa total de 456 kDa. Desta forma especula-se que este receptor na Leishmania, seja uma das respostas adaptativas desenvolvida pelo parasita para sobreviver e proliferar após invadir o hospedeiro vertebrado. (GOMES et al 2001). Estudos in vitro também mostraram que o hormônio IGF-I aumenta a infecção de macrófagos por Leishmania, e, em modelos experimentais, o tratamento com IGF-1 agrava a infecção por Leishmania (GOTO, 2001). VENDRAME, 2007 demonstra também que a infecção in vitro de macrófagos com Leishmania amazonensis, na presença do IGF-1, não só aumenta as taxas de infecção, como induz também um desvio do metabolismo da L-arginina para a via da arginase. O desvio do metabolismo da L-arginina não só reduz a produção de óxido nítrico, importante agente com atividade microbicida contra a Leishmania, como também induz a produção de arginase, a qual é um nutriente utilizado pelo parasito (figura 4). Assim, há um efeito direto do IGF-1 na leishmania, e nos macrófagos, não ficando claro se o efeito neste último é devido a ação direta do IGF-1 ou uma resposta a um aumento do parasitismo e este, por sua vez, afete os mecanismos microbicidas dos macrófagos. Por exemplo, é demonstrado que a infecção por leishmania induz uma série de modificações nos macrófagos. A Leishmania escapa da ação de enzimas hidrolíticas presentes nos lisossomas. O LPG da Leishmania previne ou retarda a fusão do fagossoma com o lisossoma, dando tempo para que as formas promastigotas, sensíveis às enzimas lisossomiais, transformem-se em amastigotas, formas mais resistentes as hidrolases (DERMINE et al., 2000, DESJARDINS & DESCOTEAUX, 1997). Caso o fagolisossoma se forme, a gp63, molécula presente na superfície da Leishmania é capaz de inibir a ação das enzimas (SORENSEN et al., 1994). A leishmania inibe também a expressão de moléculas de MHC classe II nos macrófagos. Amastigotas de Leishmanias são capazes de endocitar e degradar moléculas do MHC bem como a -2 microglobulina, reduzindo sua capacidade de apresentar os antígenos dos linfócitos T (SACKS & SHER, 2002). Adicionalmente, diminuem a expressão da molécula co11 estimulatória B7-1 em macrófagos, e a gp63 de L. donovani e L. chagasi é capaz de clivar a molécula de CD4 (COURA 2005). Além disso, a infecção por Leishmania sp também inibe a produção de IL-12 (McDOWELL & SACKS, 1999). Esses efeitos da infecção sobre os macrófagos podem interferir na diferenciação de células Th0 para CD4 Th1, a principal fonte produtora de IFN-. Assim, como parasito adaptado a sobreviver no ambiente intracelular, a Leishmania apresenta diversos mecanismos evasivos dos efeitos microbicidas dos macrófagos. Dentre estes, a glicoproteína de 63 KDa (GP63), presente na superfície da Leishmania, inativa o fator de transcrição da AP-1, o qual está envolvido na transcrição de genes que codificam para funções antimicrobianas dos macrófagos, facilitando sua sobrevivência e proliferação nas células hospedeiras, permitindo desta maneira, escapar da resposta imune inata (CONTRERAS, 2010). Outros mecanismos adaptativos da Leishmania incluem: a) Evasão da ação de enzimas hidrolíticas presentes nos lisossomas, pela ação do LPG, o qual previne ou retarda a fusão do fagossoma com o lisossoma, dando tempo para que as formas promastigotas, sensíveis às enzimas lisossomiais, transformem-se em amastigotas, formas mais resistentes às hidrolases lisossomais (DERMINE et al., 2000, DESJARDINS & DESCOTEAUX, 1997); b) Caso o fagolisossoma se forme, a gp63, molécula presente na superfície da Leishmania é capaz de inibir a ação das enzimas (SORENSEN et al., 1994); c) Inibição da expressão de moléculas de MHC classe II nos macrófagos; d) Endocitose e degradação de moléculas do MHC, -2 microglobulina e da molécula co-estimulatória B7-1 nos macrófagos, reduzindo sua capacidade de apresentar antígenos aos linfócitos T. (SACKS & SHER, 2002); e) A gp63 de L. donovani e L. chagasi é capaz de clivar a molécula de CD4, importante amplificadora de sinal na apresentação de antígenos pelos macrófagos (COURA 2005); f) Inibição da produção de IL-12 (McDOWELL & SACKS, 1999). 12 Figura 4: Diferentes vias do metabolismo da L-arginina em macrófago, em resposta a infecção por Leishmania. (Fonte: 2.2 www.sciencedirect.com). Hormônio de Crescimento e metabolismo. O hormônio do crescimento (GH) foi demonstrado por Evans e Long em 1921. Em 1944, Li e Evans isolaram e sintetizaram o hormônio cristalino (SOUZA et al 2004). A demonstração da ação do GH seria indireta, mediada por um outro fator (teoria da somatomedina de 1957), quando Salmon & Daughaday observaram que a cartilagem era estimulada por soro de animais normais, mas não por soro de animais com hipopituitarismo. Este fator, inicialmente denominado “sulfatation fator activity”, foi posteriormente renomeado somatomedina e, finalmente, Insulin like Growth factor (IGF)-1. (MARTINELLI et al. 2002). A produção de GH é estimulada pelo hipotálamo, pela liberação de GHRH. Este hormônio age na hipófise, através do receptor GHRH-R. O GH é produzido pela hipófise e tem 13 importantes funções no organismo. Uma vez secretado, o GH age através de um receptor, o Growth-Hormone binding-peptide (GHBP), estimulando a produção de Insulin-Like Growth Factor (IGF-I), que estimula o processo de crescimento das cartilagens epifisárias e dos ossos longos e de células musculares. Existem duas formas de IGF, IGF1 e IGF2, que guardam grande homologia estrutural com a molécula de insulina. Os IGFs são produzidos na maioria dos órgãos e tecidos, sendo o fígado a principal fonte dos IGFs circulantes (Figura 4). (MARTINELLI et al. 2002). Figura 5: Eixo hormonal do GH \ IGF-1. (www.medicinageriatrica.com). O hipotálamo, libera o GHRH. Este hormônio age na hipófise, através do receptor RGHRH, que estimula a produção do GH. Uma vez secretado, o GH age através de um receptor, o Growth-Hormone binding-peptide (GHBP), estimulando a produção de Insulin-Like Growth Factor (IGF-I), que estimula o processo de crescimento das cartilagens epifisárias dos ossos longos e de células musculares. Os IGFs têm efeitos metabólicos específicos como: aumenta a utilização dos carboidratos e dos ácidos graxos e a velocidade da síntese protéica, resultando em balanço nitrogenado positivo e produzindo efeito anabólico, lipolítico e antagonista da insulina; síntese de DNA; proliferação, diferenciação, regeneração e cicatrização. São encontrados em associação com uma família de seis proteínas transportadoras IGF-binding proteins, IGFBP14 1,2,3,4,5 e 6 que apresentam elevada afinidade pelos IGFs e modulam suas biodisponibilidades e bioatividades. O GH é o principal estimulador da síntese da IGFBP-3 e da IGFBP-5, e também estimula a secreção de uma proteína ácido-lábil (ALS) que juntamente com os IGFs e IGFBP-5, forma um complexo ternário que não atravessa a barreira endotelial e assim se constitui em um verdadeiro reservatório de IGFs circulante. (MARTINELLI et al., 2002). Nas células humanas, IGF-1 liga-se ao receptor tipo 1, que pertence à subclasse da família de receptores Tirosina quinases (RTK) e apresenta 80% de similaridade estrutural ao receptor de IGF-2, que, por sua vez, interage com o receptor tipo 2, o qual apresenta similaridade ao receptor de Manose-6 fosfato. (GOMES et al 2001). A concentração sérica em adultos normais é em média de 250 ng|ml para IGF-1 e 600 ng|ml para IGF-2. IGFs estão presentes numa ampla variedade de tecidos como o fígado, sendo a maior fonte de IGFs, e linhagens de células incluindo NK, monócitos, células B, células TCD4+, TCD8+, células mononucleares e polimorfonucleares neutrófilos. (GOTO 2004). WEIGENT & BLALOCK (1995) e WOODS (2000) relataram que o GH pode estimular resposta imune no baço e timo, modular a atividade citotóxica de linfócitos T e células NK, além de estimular a função de macrófagos. Para PEDERSEN & HOFFMAN-GOETZ (2000), a combinação de GH com adrenalina, provavelmente pode ser responsável pelo recrutamento de neutrófilos, durante o estresse físico. Os IGFs atuam sobre várias células do sistema imune, inato e adquirido, especialmente em macrófagos. Vários fatores controlam a expressão de IGF-1 em macrófagos: TNF-α na ausência de INF-, prostaglandina E2, citocinas do tipo Th2 IL-4, IL-13, estimulam a produção de IGF-1, enquanto INF- inibe a sua produção. (GOTO 2004). 15 2.3 Deficiência Isolada do Hormônio do crescimento (DIGH). Em Itabaianinha, Sergipe no Nordeste do Brasil existe um grupo exclusivo de 105 indivíduos de uma mesma família afetados em mais de 7 gerações com acentuada baixa estatura, apresentando uma mutação homozigótica do tipo splicing no início do intron 1 do gene do receptor do hormônio liberador do hormônio de crescimento (GHRH-R), com uma substituição de Guanina por Adenina (G/A) de herança autossômica recessiva. Esta mutação impede a formação do RNA mensageiro do GHRH-R, abolindo completamente sua expressão, levando a uma deficiência isolada do hormônio de crescimento (GH) (DIGH). Estes pacientes apresentam níveis extremamente baixos de GH e de IGF-1 (OLIVEIRA et al 2008) A DIGH provoca acentuada baixa estatura de início pós natal, tendo estes indivíduos estatura final entre 107 e 136 cm. Nessa síndrome, mãos, pés, membros, tórax e crânio são proporcionalmente reduzidos, embora os dentes sejam de dimensões normais. Se observa redução do tamanho de alguns órgãos intra-abdominais, incluindo redução do volume do baço, mesmo após correção para a superfície corporal (OLIVEIRA et al 2007). Outras alterações descritas nesses indivíduos: na composição corporal, há uma redução importante de massa magra desde a infância, com agravamento na puberdade e nos adultos, com predomínio de gordura abdominal (BARRETO et al 2002); Níveis elevados de colesterol LDL e de colesterol total em comparação com os controles da mesma região, os níveis insulínicos reduzidos e dos valores de índice de resistência a insulina HOMA-IR, menores que dos controles da mesma região. (OLIVEIRA et al 2008). Foi também observada uma maior frequência de morte em mulheres com DIGH com idade entre 4 - 20 anos, por causa infecciosa e desidratação, devido doenças diarreicas; (AGUIAR-OLIVEIRA et al 2010) mais sangramentos e inflamação gengival, levando a possibilidade da associação entre o eixo GH\IGF-1 e a função imunológica. (BRITTO 2011). Devido ao grande isolamento geográfico dessa família e alto índice de consanguinidade, representa o mais valioso agrupamento até agora descrito com DIGH. (SOUZA et al 2004). Na espécie humana, GH e IGF-I e seus receptores são expressos em células e órgãos linfóides e exibem efeitos estimulatórios na resposta imunológica. (OLIVEIRA J.C. 2008). Em ratos hipofisectomizados ou com mutações nos fatores de transcrição da pituitária há um 16 comprometimento no desenvolvimento primário tanto de células B na medula óssea como das células T (timo) (CLARK. R.1997). A correção das deficiências da pituitária, corrige os defeitos do sistema imune (NAGY & BERCZI 1989). EDWARDS et al. 1991 publicaram que ratos hipofisectomizados eram mais susceptíveis aos efeitos letais da bactéria Salmonella typhimurium, devido à inabilidade dos macrófagos tornarem-se ativados normalmente. O GH e IGF-I agem como hormônios anabólicos e moduladores do estresse em muitas células, incluindo as do sistema imune. Até o momento, a interação entre o sistema endócrino e imune ainda é motivo de intensa pesquisa, principalmente em humanos. A presença desse grande grupo de pacientes com DIGH de Itabaianinha-Sergipe, possibilita uma oportunidade para um melhor entendimento da relação entre o sistema imune e o eixo GH-IGF-I em humanos, sem a interferência de outras deficiências hormonais. Considerando os estudos sobre os efeitos favorecedores do IGF-I na infecção por Leishmania, o acesso pelo nosso grupo dessa população humana com DIGH, a qual apresenta deficiência de GHRH, GH e IGF-I, possibilita avaliar o efeito desta deficiência no comportamento de macrófagos desses indivíduos, frente à infecção por Leishmania. Assim, este projeto é uma grande oportunidade de esclarecer o papel do IGF-I na infecção in vitro por Leishmania. 17 3. OBJETIVOS ________________________________________________________________________ Geral: Avaliar o comportamento in vitro da cultura de monócitos derivados do sangue periférico de indivíduos com DIGH frente à infecção por Leishmania amazonensis. Específicos: Comparar a infecção de macrófagos por Leishmania amazonensis in vitro entre indivíduos com DIGH e em controles homozigotos normais sem esta mutação. Hipótese: Macrófagos de indivíduos com DIGH são mais resistentes à infecção por L. amazonensis. Comparar o efeito do IGF-I, na infecção de macrófagos por L.amazonensis in vitro entre indivíduos com DIGH e controles sem a mutação. Hipótese: Macrófagos de indivíduos com DIGH e controles agravarão a infecção por L. amazonensis após o estimulo com IGF-I. Comparar as infecções de macrófagos in vitro com L.amazonensis pré-tratadas ou não com IGF-I. Hipótese: Leishmanias pre-tratadas com IGF-I são mais infectivas para macrófagos in vitro. 18 4. DESENHO EXPERIMENTAL ________________________________________________________________________ Figura 6: Fluxograma do desenho experimental do estudo. 19 5. METODOLOGIA ________________________________________________________________________ 5.1 Obtenção promastigotas de Leishmania amazonensis: As cepas utilizadas foram a Leishmania amazonensis (LTCP 9667). As formas promastigotas foram obtidas a partir de cultura em meio Schneider (GIBCO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil), acrescido de penicilina (100 o UI/mL), gentamicina (10 C. A infecção foi feita com Leishmania na fase estacionária. 5.2 Obtenção de macrófagos em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos indivíduos: Macrófagos foram obtidos de 8 indivíduos com DIGH, e de 7 indivíduos controles sem a deficiência de GH/IGF-1. Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram fracionadas do sangue por gradiente de centrifugação (400 x g, 30 min, 20ºC) com FicollHypaque, como previamente descrito. Os homozigotos normais são familiares dos indivíduos com a deficiência de GH/IGF ou controles previamente genotipados do laboratório. Os monócitos foram obtidos e cultivados como previamente descrito (VENDRAME 2007). Resumidamente, as PBMC resuspensas em RPMI (RPMI 1640, LGC, Brasil) com 0,5% de SBF, ou de soro humano autólogo, 100 U penicilina/ml e 100 μg streptomicina/ml. PBMCs (1 × 106 células) foram colocadas por poço em placas de 8 poços de LabteK® por 2 ou 4 horas em estufa úmida com CO2 (5%) a 37ºC, para isolamento dos macrófagos por aderência. Após essa incubação, foram removidas as células não aderentes, lavando por 3 vezes com SBF diluído com solução fisiológica 0.9 % NaCl, na proporção 1:2. Após lavagem, foi acrescentado meio de cultura completo RPMI com SBF 5%, e os monócitos foram cultivados por 7 dias em cultura para diferenciação em macrófagos, em estufa a 37˚C e 5% de CO². 20 5.3 Infecção de macrófagos por promastigotas de Leishmania amazonensis e tratamento com IGF-1: A infecção de macrófagos foi adaptada de metodologia previamente descrita (VENDRAME 2007). Os macrófagos (MØ) derivados de PBMCs de indivíduos dos 2 grupos nas lâminas LabteK® foram infectados com L. amazonensis na relação 3 leishmanias:1 macrófagos por 2 horas (37˚C5% CO2). Após esse período foram adicionados 200µL de meio de cultura RPMI 1640 (LGC, Brasil) suplementado com 0.5% de albumina bovina sérica livre de insulina 100 UI/mL de penicilina e 10 mg/ml de gentamicina. Inicialmente, foi feita uma curva de infecção com diferentes tempos de adição do IGF1. Os macrófagos foram cultivados: em meio sem infecção, infectados com Leishmania sem tratamento hormonal, infetados com Leishmania + IGF-1 (50 ng\ml) mantido na cultura e macrófagos pré-incubados com IGF-1 (50 ng\ml) 48 hs antes da infecção com Leishmania. (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, EUA). Neste experimento a concentração de IGF-1 foi baseada em estudos prévios (VENDRAME 2007) (Figura 7) A. Macrófagos + Meio. B. Macrófagos + L. amazonensis C. Macrófagos + L. amazonensis + IGF-1 (50ng\ml) mantido D. Macrófagos pré-incubados com IGF-1 + L. amazonensis Figura 7. Desenho esquemático da lâmina LabteK® com a descrição da infecção e tratamento dos macrófagos com IGF-1 em diferentes momentos, pré ou durante a infecção com L. amazonensis. 21 Posteriormente, foi feita uma curva dose-resposta com diferentes concentrações de IGF-1 mantido na cultura, para verificar se haveria melhor resposta com doses mais elevadas de IGF-1, desde que os estudos prévios utilizaram macrófagos murinos (GOMES 2001, VENDRAME 2007). Os macrófagos foram cultivados sem estímulo, antes da infecção, e/ou macrófagos foram tratados com 50, 75, e 100 ng/ml de IGF-1 mantido em cultura durante a infecção. (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, EUA). (Figura 8) B. Macrófagos + Meio + Leishmania amazonensis. B. Macrófagos + L. amazonensis + IGF-1 (50 ng\ml) C. Macrófagos + L. amazonensis + IGF-1 (75 ng\ml) D. Macrófagos + L. amazonensis + IGF-1 (100 ng\ml) Figura 8. Desenho esquemático da lâmina LabteK® com a descrição da infecção e tratamento dos macrófagos com as diferentes concentrações de IGF-1 utilizadas. 22 5.4. Infecção de macrófagos por promastigotas de Leishmania amazonensis pré-tratadas com IGF-1: Neste experimento testamos o efeito do pré-tratamento da Leishmania com o IGF-1. A infecção de macrófagos foi adaptada de metodologia previamente descrita (VENDRAME 2007). Os macrófagos (MØ) derivados de PBMCs de indivíduos dos 2 grupos nas lâminas LabteK® foram infectados com L. amazonensis, pré-tratadas por 5 minutos com IGF-1 (50ng/mL), (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, EUA), na relação 3 leishmanias: 1 macrófagos por 2 horas (37˚C5% CO2). Após esse período foram adicionados 200µL de meio de cultura RPMI 1640 (LGC, Brasil) suplementado com 0.5% de albumina bovina sérica livre de insulina 100 UI/mL de penicilina e 10 mg/ml de gentamicina. Desenho esquemático da lâmina LabteK®, com o experimento pode ser observado abaixo: macrófagos cultivados sem IGF-1, antes da infecção, a infecção foi feita com as L. amazonensis sem tratamento ou prétratadas por 5 minutos com IGF-1 (50ng/mL), (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, EUA) e Leishmania + IGF-1 (50ng\ml) mantido na cultura (Figura 9). A. Macrófagos + Meio RPMI. B. Macrófagos + L. amazonensis sem tratamento C. Macrófago + L. amazonensis pré-tratada com IGF-1 (50ng\ml) D. Macrófago + L.amazonensis + IGF-1 (50ng\ml) mantido na cultura. Figura 9: Desenho esquemático da lâmina LabteK® com a descrição da infecção com L. amazonensis pré-tratadas com IGF-1. 23 5.5 Expressão de mRNA de IGF-I por PCR em tempo real. Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram fracionadas do sangue por gradiente de centrifugação (400 x g, 30 min, 20ºC) com Ficoll-Hypaque, como previamente descrito. Primers (Humano) IGF-1 Forward: 5´-CTG ACG TGG TGG ATG CTC TTC A-3´ Reward: 5´-GAC TGC TGG ACG CAT ACC CTG T-3´ IGF-IR (Receptor) Forward: 5´-GTT CTC TGA GGC CAG AAA TGG A -3´ Reward: 5´-CAG CAA GGT CTC TGT GGA CGA A -3´ B-ACTINA (Housekeeping) Forward: 5´-AAA ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC A -3´ Reward: 5´-AAA CAT GAT CTG GGT CAT CTT CTC G -3´ Protocolo do qPCR (40 ciclos) 92˚C- 2 minutos Temperatura de Anelamento: 57,5˚C- 30 segundos 70˚C -30 segundos Preparação da reação: 1ul cDNA (concentração 1000 ng\ul) 1ul primer “Forward” 5 uM (concentração final 200 nM) 1ul primer “Reverse” 5uM (concentração final 200 nM) 10 ul Sybr (Applied) 7ul H²O 24 5.6 Avaliação do parasitismo: Para avaliação do parasitismo por microscopia óptica, as lamínulas foram coradas com Panótico Rápido (LB-Laborclin Ltda) após 2, 24, 48 e 72 horas após a infecção foram contadas 100 células por lamínula e o resultado expresso em número de MØ infectados/100 e de parasitos/100 MØ. 5.7 Analise estatística: Os resultados obtidos nas contagens dos macrófagos foram comparados por métodos não paramétricos, utilizando o Software GraphPad Prism, versão 4.0c, após ser verificado que os dados não obedeciam a uma distribuição normal. Para múltiplas comparações foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis e para comparações entre dois grupos foi realizado o teste de MannWhitney com intervalo de confiança de 95% sendo os valores considerados estatisticamente significantes quando p< 0,05. 25 6. RESULTADOS ______________________________________________________________________ 6.1 Seleção dos pacientes e controles: O grupo foi composto por 15 pacientes, sendo 08 do gênero feminino com uma média de idade de 37.5 anos e 07 do gênero masculino com uma média de idade de 38.7. Destes, 08 pacientes eram portadores de DIGH (MUT\MUT), sendo 04 do gênero feminino com média de idade 38.2 e 04 do gênero masculino com uma média de idade 43,7, e os 07 restantes eram Controles normais genotipados, sendo 04 do gênero feminino com uma média de idade 36,7 e 03 do gênero masculino com uma média de idade 31,6 anos (Tabela 1). Tabela 1. Caraterização demográfica dos pacientes MUT\MUT e controles avaliados. Variáveis MUT\MUT Controle n= 8 n=7 Variação 25- 60 20 - 55 Média 40.9 ± 2 34.1 ± 2 Gênero M (%) 04 (50%) 03 (43%) Gênero F (%) 04 (50%) 04 (57%) Média de idade (anos) 26 6.2 Comparação da infecção de macrófagos por Leishmania in vitro entre indivíduos com deficiência genética de DIGH e em controles normais sem esta mutação. Para comparar a infecção de macrófagos avaliamos 08 pacientes homozigotos de DIGH (MUT\MUT) e 07 controles genotipados no laboratório. Os macrófagos dos pacientes MUT\MUT apresentaram um baixo índice de infecção em todos os tempos 2, 24, 48 e 72 horas. O grupo controle apresentou maior índice de infecção nas 2 e 24 horas controlando a infecção às 48 e 72 horas. (Figura 10A). Para verificar a intensidade da infecção se realizou a contagem de amastigotas dentro dos macrófagos infetados, observando-se que a carga parasitária nos pacientes MUT\MUT se manteve com uma taxa baixa, mantendo um padrão linear, enquanto que o controle teve uma maior taxa de infecção nas 2, 24 h, reduzindo as taxas de infecção nas 48 e 72 h. (Figura 10B). Observa-se nos macrófagos dos controles normais, uma alta penetração de promastigotas, com uma elevada carga parasitária. (Figura 10C). Nos pacientes MUT\MUT foi observado que os parasitos se localizam ao redor dos macrófagos, com pouca penetração e baixa carga parasitaria intracelular. (Figura10D). 27 Figura 10: Infecção de macrófagos de pacientes com DIGH (MUT\MUT) n = 8 e controles n = 7 sem a mutação, com Leishmania amazonensis. PBMC foi fracionado do sangue periférico por gradiente de centrifugação. Macrófagos foram isolados das PBMC por aderência em lâminas LabteK®, diferenciados por 6 dias e infectados com leishmania na relação 3 leishmanias por macrófago (3:1). As placas foram coradas após 2, 24, 48 e 72 horas após à infecção. As figuras representam a média Desvio Padrão (DP) da contagem do: (A) Número de macrófagos infectados em 100 macrófagos e (B) Número de leishmanias/100 macrófagos. (C) e (D) São foto micrografias de macrófagos infectados após 2 horas da infecção de controle e paciente MUT\MUT, respectivamente. **Mann-Whitney p = 0.004 28 6.3 Comparação da infecção de macrófagos por Leishmania in vitro entre indivíduos com DIGH e controles sem a mutação, sem e com o tratamento com IGF-1. Na infecção dos macrófagos com a adição in vitro de IGF-1 mantidos na cultura, nas concentrações de IGF-1 (50, 75 e 100ng\ml), observamos que os controles normais apresentaram um aumento crescente no número de amastigotas nos macrófagos, após 24 horas da infecção, com o aumento das concentrações hormonais utilizadas (Figura 11A). Porém, verificamos a falta de resposta ao tratamento com IGF-1 dos macrófagos dos pacientes MUT\MUT, os quais mantiveram um número de amastigotas significativamente mais baixo independente do aumento da concentração de IGF-1 (Figura 11B). Evidenciou-se que os macrófagos do controle normal, às 2 horas apresentam uma elevada carga parasitaria com uma grande penetração do parasita na célula (Figura 11C), às 24 horas do mesmo controle observamos que a carga parasitaria e mantida com um alto índice de parasitas intracelulares (Figura11 D). 29 Figura 11: Comparação entre as infecções por L. amazonensis de macrófagos de indivíduos controles (n = 3), e MUT\MUT (n = 2), tratados com diferentes concentrações de IGF-1 (50, 75 e 100 ng/ml). As figuras representam a média Desvio Padrão (DP) da contagem do: (A) Número de leishmanias/100 macrófagos em controle normal e (B) Número de leishmanias/100 macrófagos em paciente MUT\MUT. (C) e (D) São foto micrografias de macrófagos infectados por leishmania de controle normal, tratados com IGF-1 após 2 e 24 horas da infecção. 30 Como não houve resposta ao tratamento com IGF-1 nos pacientes com DIGH foi realizado um estudo piloto, verificando a expressão do IGF-1 e do IGF-1-R nesses pacientes em comparação com os controles por PCR em tempo real (PCR-RT). Esse estudo foi realizado em colaboração com Instituto de Medicina tropical USP, e incluiu 3 pacientes com DIGH e 2 controles normais. Evidenciamos uma expressão baixa de mRNA para IGF-1 e de seu receptor em ambos os grupos, porém a expressão foi significativamente mais baixa nos pacientes com DIGH e do que nos controles (Figura 12). Estes dados são preliminares e experimentos adicionais estão em andamento, ampliando o número de pacientes e controles. Figura 12: Expressão de mRNA de IGF-I por PCR em tempo real, de indivíduos controles (n = 2), e MUT\MUT (n = 3) As figuras representam a média Desvio Padrão (DP) da contagem do: (A) Expressão de IGF-1 e (B) Expressão do receptor do IGF-1. 31 6.4 Comparação entre as infecções de macrófagos com L. amazonenses pré-tratadas ou não in vitro com IGF-1. Para observar o efeito do IGF-1 na Leishmania, estas foram pré-incubadas com IGF-1 (50 ng\ml) por 5 min. Após 2 horas da infecção não se observou diferença no aumento do número de macrófagos infetados com leishmanias pré-incubadas, como também das Leishmanias que não foram tratadas com IGF-1 tanto no grupo controle, como no grupo MUT\MUT (Figura 13A). Porém, se observou um aumento representativo do número de parasitas nos macrófagos do grupo controle infetados com Leishmanias previamente préincubadas com IGF-1 em relação ao número de parasitas/MO nos macrófagos infectados com leishmania não tratadas. Contudo, no grupo MUT\MUT não se observou diferença nem no número de macrófagos infectados nem no número de parasitos/macrófago com Leishmanias pre-incubadas ou não com IGF-1. (Figura 13B). Figura 13: Comparação entre as infecções por L. amazonensis de macrófagos de indivíduos controles e pacientes MUT\MUT após 2 horas de infecção com leishmanias pre-incubadas com IGF-1. As figuras representam a média Desvio Padrão (DP) da contagem do: (A) Número de MØ infetados/100 macrófagos e (B) Número de leishmanias/100 macrófagos. **MannWhitney p = 0.005. 32 7. DISCUSSÃO Segundo GOMES (1998), a presença de um receptor para IGF-1 na Leishmania, com uma antigenicidade cruzada com o receptor humano de IGF-1 pode ser mais um mecanismo adaptativo da Leishmania para utilizar o IGF-1 humano como fator de crescimento e proliferação. Assim, foram demonstrados diversos efeitos do IGF-1 na Leishmania: a) Aumento da infecção por Leishmania em camundongos (GOMES 2001); b) Aumento da proliferação de formas promastigotas pela adição de IGF-1 em cultura; c) Aumento da proliferação de formas amastigotas pela adição de IGF-1 a culturas de macrófagos murinos invitro (GOMES 1997, GOTO 1998). O presente estudo, demonstra também os efeitos do IGF-1 na infecção por L. amazonensis em macrófagos humanos. Além disso, constata que indivíduos com deficiência genética do receptor de GHRH (GHRH-R), que afeta a produção de GH e IGF-1(DIGH) apresentam maior resistência à esta infecção. Estes dados demonstram uma interação imuno-endócrina influenciando a infecção por Leishmania. A leishmania utiliza o IGF-1 hormônio como fator de proliferação e crescimento nas células do hospedeiro. Este efeito é bem documentado pelo aumento das taxas de infecção após o tratamento com doses crescentes de IGF-1 in vitro nas culturas de macrófagos. A redução das taxas de infecção pela Leishmania no grupo com DIGH, comparada com o grupo controle, reforça ainda mais a importância dessa interação (IGF-1\Leishmania). Curiosamente, demostra-se no grupo com DIGH que a adição de IGF-1 não aumentou as taxas de infecção dos macrófagos. Dado preliminares explicam esses resultados, demonstrando uma baixa expressão do mRNA tanto para o IGF-1 como para o receptor de IGF-1 nas células mononucleares dos pacientes com DIGH. A adição de IGF-1 às Leishmania antes da infecção também aumentou as taxas de infecção nos macrófagos dos indivíduos controles, sendo uma evidência do efeito direto deste hormônio nos parasitos. No entanto, este efeito não foi demonstrado na infecção dos macrófagos dos pacientes com DIGH, sugerindo que a deficiência grave de IGF-I abole o efeito agudo do IGF-I sobre a dos macrófagos. 33 Estudos realizados por VENDRAME (2007), mostraram que a produção do H²O² não é afetada na presença do IGF-1, por outro lado, a produção de NO pelos MØ infetados é diminuída quando são infetados com Leishmanias pré-incubadas com IGF-1 por 5 minutos ou quando o IGF-1 é mantido na cultura, portanto, é demostrado que o efeito do IGF-1 sobre o aumento do número de parasitas intracelulares deve-se ao efeito sobre o metabolismo da Larginina, desviando a produção de óxido nítrico para a de arginina, favorecendo o parasita. É possível que a Leishmania possa carrear em sua superfície o IGF-1 para o interior dos macrófagos. De fato, REIS et al. (2013) utilizaram a microscopia confocal e confirmaram a colocalização do IGF-1 e dos parasitas dentro dos macrófagos, o IGF-1 foi observado distribuído na região do citoplasma do macrófago e ao redor da Leishmania, sugerindo uma direta interação entre parasita\ IGF-1 presente na célula. (REIS, 2013). Quando as culturas são estimuladas com INF-γ, há uma inibição da produção do IGF-1 pelo macrófago, documentada pela redução da expressão do mRNA do IGF-1, acompanhado pela redução do número de parasitos. Essa infecção é recuperada com adição de IGF-1 recombinante na cultura. Desta forma, observa-se o papel essencial do IGF-1 para o crescimento e proliferação intracelular da Leishmania. A interação imuno-endócrina é bem demonstrada por estes experimentos. O efeito do IGF-1 é também demonstrado in vivo em camundongos BALB\c infetados com L. amazonensis pré-incubadas com IGF-1. Nesse estudo observa-se que o tamanho da lesão é maior a partir de 21 dias após a infecção, com um número de parasitas viáveis no sitio da lesão a partir do sétimo dia, acompanhado de maior infiltrado inflamatório. (GOMES, 19982000; HIRO, 2004). 34 Os resultados alcançados no nosso estudo, quando a Leishmania foi pré-incubada por 5 mim com IGF-1 foram de um aumento na taxa de infecção dos macrófagos no grupo controle, portanto, sugere-se que a interação do IGF-1 e Leishmania favorece ao crescimento do parasita no interior da célula do hospedeiro. No entanto, no grupo MUT\MUT, não se observou essa interação, sugerindo que o IGF-1 não atua somente na Leishmania, devendo ter também um papel inibidor nos mecanismos microbicidas dos macrófagos, pois devido a DIGH dos pacientes estes macrófagos não só apresentam baixos níveis de IGF-1 na célula, como parecem não responder as doses utilizadas de IGF-I, devido a reduzida expressão do receptor de IGF-1, provavelmente pela endocitose do receptor por desuso. Esse dado é preliminar e experimentos adicionais estão em andamento. Em conclusão a deficiência de IGF-1 e de seu receptor funcionam como um fator protetor para infecção por Leishmania, limitando o crescimento e proliferação do parasita nos macrófagos. Como o macrófago é também uma célula apresentadora de antígenos, podendo influenciar na diferenciação dos linfócitos T CD4+, o presente trabalho pode ajudar a abrir uma ampla área de pesquisa sobre as interações de IGF-1 e indução da diferenciação de macrófagos em M1 e M2 e suas consequências na indução da resposta imune adaptativa, na infecção por Leishmania. 35 8. CONCLUSÕES 1. Macrófagos de pacientes com DIGH são mais resistentes à infecção com Leishmania amazonensis do que os controles normais sem essa mutação, confirmando o papel do IGF-1 em aumentar a infecção por L. amazonensis em células humanas. 2. Macrófagos de indivíduos controles aumentam as taxas de infecção por Leishmania na presença de IGF-1, ou quando infectado por Leishmania pré-tratadas com este hormônio, sugerindo um duplo efeito do IGF-1 nos macrófagos e na Leishmania. 3. Macrófagos de pacientes com DIGH não respondem ao estimulo in vitro com IGF-1, pela redução da expressão do receptor do IGF-1. Apesar de preliminar, este dado pode ser explicado pela endocitose do receptor por desuso, o que deve ser avaliado por estudos posteriores. 36 9. PERSPECTIVAS ___________________________________________________________________________ 1. Realizar dosagem dos sobrenadantes dos macrófagos que foram coletados nos tempos de 2, 24, 48, 72 e 96 horas, das citocinas, TNF-, IL-10, IL-12, IL-18, IL-23 e IL-27 e das quimiocinas MCP1/CCL2, RANTES/CCL5, MIP-1/CCL3 para avaliar se há uma diferenciação de subtipos M1 e M2 dos macrófagos grupos de pacientes estudados MUT\MUT e controle. 2. Confirmar os dados de redução do receptor de IGF-1 nos macrófagos dos indivíduos com DIGH, aumentando o número de pacientes. 37 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA. ___________________________________________________________________________ ABBAS. A. K.; LICHTMAN, A.H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 6ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier. p. 273-378, 2008. AGUIAR, OLIVEIRA et al. 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