avaliação da fermentação aeróbia para produção de etanol a partir

Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.15, n.2, p.117-122, 2013
ISSN 1517-8595
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AVALIAÇÃO DA FERMENTAÇÃO AERÓBIA PARA PRODUÇÃO DE ETANOL A
PARTIR DE XILOSE POR LINHAGENS DE LEVEDURAS ISOLADAS DA CASCA
DE UVA (Vitis spp)
*Débora Cristina Moraes1, Cleidiane Samara Murari1, Pedro Luiz Mota Aquino1, Gisele
Ferreira Bueno1, Vanildo Luiz Del Bianchi1
RESUMO
Isolar micro-organismos fermentadores de xilose em etanol é um desafio para ampliar a
produção deste biocombustível a partir de matérias lignocelulósicos. Para tanto neste trabalho
foi testada a fermentação de xilose por linhagens de leveduras isoladas da casca de uva (vitis
spp) com objetivo de produzir etanol. As levéduras foram cultivadas em fermentação submersa
com xilose como fonte de carboidrato. Alíquotas foram retiradas a cada 24h para medir o
crescimento celular, consumo de açúcar e produção de etanol. As leveduras tiveram uma
produção média de 2,5 g/L de etanol com rendimento de (Ye/s) 0,12g/g, mostrando que possuem
a capacidade de produzir etanol a partir da xilose.
Palavras-chave: levedura, etanol, xilose
EVALUATION OF THE AEROBIC FERMENTATION FOR ETHANOL
PRODUCTION FROM XYLOSE OF YEAST STRAINS ISOLATED FROM GRAPE
SKINS (Vitis spp)
ABSTRACT
Isolate microorganisms that fermenting xylose to ethanol is a challenge to expand production of
biofuels from lignocellulosic materials. For this work was tested fermentation of xylose by yeast
strains isolated from grape skins (Vitis spp) in order to ethanol produce. The yeasts were grown
in submerged fermentation with xylose as a carbohydrate source. Aliquots were taken every 24
hours to measure cell growth, sugar consumption and ethanol production. The yeast had an
production ethanol average of 2.5 g / L and yield (Ye / s) 0.12 g / g, showing that they have the
ability to produce ethanol from xylose.
Keywords: yeast, xylose, ethanol.
Protocolo de14-2012-16 de 30/07/2012
1 Pograma de Pós-Graduação. em Engenharia e Ciência de Alimentos, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
Filho” Rua Cristovão Colombo, nº 2265 Jardim Nazareth. São José do Rio Preto – SP. Email:
*[email protected]
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Avaliação da fermentação aeróbia para produção de etanol a partir de xilose por linhagens de leveduras ...... .Moraes et al.
INTRODUÇÃO
Micro-organismos
O estudo da fermentação de etanol tem
uma grande importância devido ao aumento na
demanda por este combustível (Gomez, 1985;
Cuzens & Miller, 1997; Dorta et al.,2006). A
utilização de materiais lignocelulósicos para
produzir o bioetanol tem sido muito pesquisada
nos últimos anos (Parisi, 1989; Pandey et al.,
2000; Arvanitoyannis et al.,2006; Carrion &
Dorta, 2009).
A maioria dos materiais lignocelulósicos
(resíduos agroindustriais, incluindo a casca de
uva) é composta por celulose, hemicelulose e
lignina (Aguilar et al., 2002; Matos et al., 2003;
Arvanitoyannis et al.,2006; Carrion & Dorta,
2009; Kipper, 2009). Estes materiais quando
hidrolisados originam monômeros de açúcares
que podem ser fermentados para a produção de
etanol (Parisi, 1989; Cuzens & Miller, 1997;
Aguilar et al., 2002; Carrion & Dorta, 2009;
Moraes et al.,2010). A glicose é facilmente
fermentada pela levedura Saccharomyces
cerevisiae, porém a xilose não é fermentada por
esta levedura, sendo necessária a busca por
linhagens que sejam capazes de metabolizar
esta pentose (Dellweg et al.,1984; Du Preez et
al.,1986; Matos et al.,2003; Rudolf et al., 2008).
Os gêneros Candida e Pichia estão entre os
mais promissores para realizar este tipo de
fermentação, porém devido ao fato de não
tolerarem altas concentrações de etanol esse
processo não é considerado muito viável
(Dellweg et al.,1984; Du Preez et al.,1986;
Felipe et al.,1997; Lachke, 2002; Matos et
al.,2003; Rudolf et al., 2008).
Algumas bactérias também vêm sendo
estudadas com esse objetivo já que são mais
tolerantes a inibição provocada pelo etanol, mas
como as elas geralmente realizam fermentação
mista, ou seja, há uma variedade de produtos
formados entre eles ácidos orgânicos, ésteres,
alcoóis o rendimento em etanol é muito baixo
(Moraes et al., 2010). Uma alternativa seria
isolar novas linhagens de micro-organismos da
natureza
que
consigam
realizar
esta
fermentação e apresentar rendimentos que
possibilitem a sua utilização no processo de
produção do bioetanol.
O objetivo deste trabalho foi testar duas
linhagens de leveduras isoladas da casca de uva
(Vitis spp) quanto à assimilação de xilose e
conseqüente produção de etanol através de
fermentação submersa em condição aeróbia.
Os micro-organismos utilizados no
ensaio foram duas linhagens de leveduras,
denominadas de RL1 e RL5, isoladas da casca
de uva (Vitis spp). Estas leveduras foram
mantidas em meio XA (xilose-ágar) e
armazenadas a 5ºC. Os repiques foram
realizados mensalmente.
Meio e condições de cultivo
Foi realizada uma pré-fermentação em
meio líquido com xilose (1%) com volume final
de 100 mL, agitação de 200 RPM, com pH 6,0,
onde foram incubadas as leveduras RL1 e RL5
por 24h a 30ºC.
A fermentação ocorreu no meio base:
peptona 0,5%(p:v); ZnSO4.7H2O 0,02%(p:v);
MgSO4 0,035%(p:v); MnSO4.H2O 0,01%(p:v);
Na2HPO4 0,05%(p:v); K2HPO4 0,05%(p:v) com
xilose 2% com volume final de 40 mL, pH 6,0,
agitação de 150 RPM. Foram incubadas a 30°C
por 96h. Alíquotas foram retiradas a cada 24h
para realizar as análises.
Técnicas analíticas
Quantificação do crescimento por densidade
ótica
O crescimento celular foi determinado
pela medida da absorbância a 600nm. Para
calcular a concentração foi obtida uma curva de
calibração entre o peso seco e absorbância
obtidas para as leveduras RL1 e RL5(Silva,
2007).
Fator de conversão substrato a célula (g/g)
YX

S
X
f
 X0
St  S f
onde,
Xf – concentração celular final (g/L),
X0 – concentração celular inicial (g/L),
St – concentração de substrato total (g/L),
Sf – concentração de substrato final (g/L),
Y x/s – fator de conversão substrato a célula
(g/g)
Determinação de açúcar redutor
MATERIAL E MÉTODOS
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Avaliação da fermentação aeróbia para produção de etanol a partir de xilose por linhagens de leveduras ...... .Moraes et al.
O consumo de xilose foi medido por
ADNS (ácido dinitrossalicílico)16. Simultaneamente, foi feita uma curva de calibração
com diferentes concentrações de xilose (P.A.
Labsynth). A leitura em espectrofotômetro foi
feita a 540nm.
Velocidade média de consumo do substrato
g/L.h
A velocidade média do consumo de
substrato foi calculada através da seguinte
fórmula.
PS 
St  S f
tf
onde,
Sf – concentração substrato final (g/L),
St – concentração substrato total (g/L),
tf – tempo total de fermentação (horas),
Ps – velocidade média consumo de substrato
(g/L.h)
Y e/s – fator de conversão substrato a produto
(g/g)
Rendimento em etanol (%)
 (t ) 
Fator de conversão substrato a etanol (g/g)
YE

S
E f  E0
St  S f
onde,
Ef – concentração produto final (g/L),
E0 – concentração produto inicial (g/L),
St – concentração de substrato total (g/L),
Sf – concentração de substrato final (g/L),
YE
S
0,511
 100
onde,
Y e/s – fator de conversão substrato a produto
(g/g),
0,511 – coeficiente de transformação de açúcar
a etanol
Análise dos resultados
Os experimentos foram realizados em
triplicata. Os dados amostrais foram submetidos
à análise de variância (ANOVA) e as médias
comparadas pelo teste de Tukey e Kramer
através do programa GRAPHPAD INSTAT
(Rutgers University Camden, New Jersey). Os
resultados foram considerados significativos
para P<0,05.
Determinação da concentração de etanol
A concentração de etanol foi determinada
através do cromatógrafo a gás Hewlett Packard
series II modelo 5890 equipado com coluna
SPB-35 e detector de ionização de chama. As
temperaturas do injetor e detector serão
mantidas a 230ºC. A temperatura do forno será
programada inicialmente para 40ºC, sendo
aumentada a uma velocidade de 20ºC/min até a
temperatura final de 100ºC. Como gás de
arraste será utilizado nitrogênio e uma taxa split
de 1:5.. A amostra do headspace foi retirada
por meio de uma seringa própria para gases.
Simultaneamente, foi feita uma curva de
calibração com diferentes concentrações de
etanol.
119
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados estão apresentados nas
Figuras 1 e 2. Os resultados da cinética de
fermentação estão na Tabela 1.
Tabela 1. Dados cinéticos da fermentação em
aerobiose pelas leveduras RL1 e RL5
Linhagem
RL1
RL5
Y x/s
Ps
YE/s Rendimento
g/g g/L.h g/g
(%)
0,255 0,20 0,12
23,4%
0,305 0,20 0,12
23,4%
Para as duas linhagens RL1 e RL5
houve um rápido consumo de xilose em 24h,
praticamente zerando o açúcar disponível,
sendo este consumo significativo em relação às
medições realizadas nos tempos posteriores
(Tukey, P<0,05), porém não diferindo
estatisticamente entre as linhagens RL1 e RL5
(Tukey, P>0,05) (Figuras 1 e 2).
Quanto a produção de etanol as duas
linhagens produziram cerca de 2,5 g/L, sendo
que a maior produção 1,4 g/L para RL1 e 1,2
g/L para RL5 ocorreu no período de 48h de
fermentação. Esta produção foi significativa em
relação aos outros períodos medidos (Tukey,
P<0,05).O rendimento (Ye/s) foi de 0,12 g/g
para ambas as linhagens após as 96h de
fermentação, estes resultados são inferiores aos
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Avaliação da fermentação aeróbia para produção de etanol a partir de xilose por linhagens de leveduras ...... .Moraes et al.
encontrados por Silva et al. 23 que encontrou
0,32 g/g com a levedura Pichia stipitis NRRL
Y-7124.
A levedura Pachysolen tannophilus em
fermentação de xilose com aeração apresentou
produção máxima de etanol de 3,2 g/L com
rendimento (Ye/s) 0,15 g/g, valor este mais
próximo do encontrado neste estudo.
Figura 1. Biomassa
pela levedura RL1.
,consumo de xilose
e produção de etanol
na fermentação aeróbia
Figura 2. Biomassa
pela levedura RL5.
,consumo de xilose
e produção de etanol
na fermentação aeróbia
CONCLUSÃO
As linhagens de leveduras isoladas da
casca de uva (Vitis spp) denominadas RL1 e
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Avaliação da fermentação aeróbia para produção de etanol a partir de xilose por linhagens de leveduras ...... .Moraes et al.
RL5, foram capazes de consumir a xilose e
produzir etanol a partir desta sob condições
aeróbias, ainda que os rendimentos e produção
tenham sido mais baixos que os encontrados na
literatura, elas se mostraram micro-organismos
promissores já que são poucos encontrados na
literatura que possuem a capacidade de
converter esta pentose a etanol.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aguilar, R.; Ramírez, J. A.; Garrote, G.;
Vázquerez, M. Kinetic study of the acid
hydrolysis of sugar cane bagasse. J. Food
Eng, 2002, v. 55, p. 309–318.
Arvanitoyannis, I. S.; Ladas, D.; Mavromatis,
A. Potential uses and applications of treated
wine waste: a review. Int. J. Food Sci.
Technol., Oxford, 2006, v. 41, p. 475-487.
Carrion, L. M.; Dorta, C. Inativação de
compostos tóxicos derivados da hidrólise
ácida do bagaço de cana-de-açúcar. Revista
Analytica (São Paulo), 2009, v. 42, p. 8292.
Cuzens, J. C.; Miller, J. R. Acid Hydrolysis of
bagasse for ethanol production. Renewable
Energy, 1997, v. 10, p. 285-290.
Dellweg, H.; Rizzi, M.; Methner, H.; Debus, D.
Xylose fermentation by yeasts. Biotechnol.
Lett, 1984, v. 6, p. 395-400.
Dorta, C.; Oliva-Neto, P.; Abreu-Neto, M. S.;
Nicolau-Junior, N.; Nagashima, A. I.
Synergism among lactic acid, sulfite, pH and
ethanol in alcoholic fermentation of
Saccharomyces cerevisiae (PE-2 and M-26).
World
Journal
of
Microbiology
Biotecgnology, 2006, v.22, p.177–182.
Du Preez, J. C.; Bosch, M., Prior, B. A. The
fermentation of hexose and pentose sugars
by Candida shehatae and Pichia stipitis.
Applied Microbiology and Biotechnology,
1986, v. 23, p. 228–233.
Felipe, M. G. A.; Hauly, M. C. O.; Canettieri,
E. V.; Cândido, E. J.; Tamanini, C.
Avaliação da casca de aveia para obtenção
de hidrolisado hemicelulósico e produção de
xilitol por processo fermentativo. In:
SIMPÓSIO
NACIONAL
DE
FERMENTAÇÕES,
14.,
2003,
Florianópolis. Anais... Florianópolis, 2003. 1
CD-ROM, 2003.
Felipe, M. G. A.; Vitolo, M.; Mancilha, I. M.;
Silva, S.S. Fermentation of sugar cane
bagasse hemicellulosic hydrolysate for
121
xylitol production: Effect of pH. Biomass
and Bioenergy, 1997, v. 13, p. 11–14.
Gomez, R. J. H. C. Tese de Doutorado,
Faculdade de Engenharia de Alimentos e
Agrícola de Campinas, Brasil, 1985.
Jackson, S.; Nicolson, S.W. Xylose as a néctar
sugar : from biochemistry to ecology,
Comparative Biochemistry and Physiology
Part B, 2002, v.131, 613-620.
Kipper, P. G. Dissertação de MestradoUNESP Instituto de Biociências de Rio
Claro, 2009.
Lachke, A. Biofuel from D-xylose – the Second
Most Abundant Sugar. Resonance, 2002,
p.50-58.
Mamede, M. E. O.; Pastore, G. M. Avaliação da
produção dos compostos majoritários da
fermentação de mosto de uva por leveduras
isoladas da região da “Serra Gaúcha” (RS).
Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2004, v.
24, p. 453–458.
Matos, G. S.; S.; Felipe, M. G. A.; Silva, S. S.
Formação de xilitol, etanol e glicerol por
Candida guilliermondii FTI 20037 durante a
fermentação do hidrolisado hemicelulósico
de bagaço de cana-de-açúcar. In:
SIMPÓSIO
NACIONAL
DE
FERMENTAÇÕES,
14.,
2003,
Florianópolis. Anais... Florianópolis, 2003. 1
CD-ROM, 2003.
Miller, G. H. Use of dinitrosalicylic acid
reagent for determination of reducing sugar.
Analytical. Chemistry, 1959, v. 31, p. 426429.
Moraes, D. C.; Perez, C. A.; Dorta, C. Seleção
de microrganismos fermentadores de xilose.
Revista Analytica, 2010, v. 47, p. 59-66.
Pandey, A.; Soccol, C. R.; Nigam, P.; Soccol,
V. T. Biotechnological potential of agroindustrial residues. I: sugarcane bagasse.
Bioresource Technology, v.74, p. 69-80.
2000.
Parisi, F. Advances in lignocellulosics
hydrolysis and in the utilization of the
hydrolysates. Advances in Biochemical
Engineering/ Biotechnology,1989, v. 38, p.
53-87.
Roels, J. A. Energetics and kinetics in
biotechnology. Elsevier Biomedical Press,
Amsterdã, 1983, p. 54.
Rudolf, A.; Baudel, H.; Zacchi, G.; Hagerdal,
B.
H.;
Liden,
G.
Simultaneous
Saccharification and Fermentations of
Steam-Pretreated
Bagasse
Using
Saccharomyces cerevisae TMB3400 and
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.15, n.2, p.117-122, 2013
122
Avaliação da fermentação aeróbia para produção de etanol a partir de xilose por linhagens de leveduras ...... .Moraes et al.
Pichia stipitis CBS6054. Biotechnology and
Bioengineering, 2008, v 99, p. 783 – 790.
Schneider, H.; Maleszka, R.; Neirinck, L.;
Veliky, I. A.; Wang, P. Y.; Chan, Y. K.
Ethanol Production from D-Xylose and
Several Other Carbohydrates by Pachysolen
tannophilus and Other Yeasts. Adv.
Biochem. Eng./Biotechnol, 1983, v.27, p.
57-71.
Silva, J. P. A.; Mussato, S. I.; Roberto, I. C.;
Teixeira, J. A. Avaliação do Processo de
Bioprodução de Etanol a partir de Xilose
pela Levedura Pichia stipitis NRRL Y-7124
em Reator de Bancada In: SIMPÓSIO
Nacional de Fermentações, 14., 2009, Natal.
Anais... Natal, 2009. 1 CD-ROM, 2009.
Silva, N, Junqueira, V.C.A., Silveira, N.F.A.
Manual
de
Métodos
de
Análise
Microbiológica de Alimentos. ed. 3. São
Paulo. Livraria Varela, 2007. 536 p.
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.15, n.2, p.117-122, 2013