LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA

PROGRAMA E PROTOCOLOS PRÁTICOS DA DISCIPLINA DE
LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
José António Henriques de Conde Belo
Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais
Faro, Fevereiro de 2007
Laboratórios de Engenharia Genética – 2006/07
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
Objectivos gerais dos trabalhos práticos
A construção de uma molécula de DNA recombinante que permitirá a
produção e inactivação in vitro de uma proteína.
OBJECTIVOS ESPECÍFICOS
1. Inserir um “Tag” numa sequência de um cDNA específico.
2. Subclonar este fragmento modificado do gene Cerl2 de ratinho no vector plamídico
de expressão pCS2+.
3. Transformar a estirpe XL-1 de E. coli com o DNA recombinante e seleccionar as
colónias transformadas.
4. Induzir a expressão/inactivação desta proteína recombinante em Reticulócitos de
coelho .
5. Análise de proteínas em gel de poliacrilamida.
Objectivos
Adquirir experiência em:
• isolar DNA plasmídico em pequena escala.
• utilizar enzimas de restrição e DNA ligase.
• transformação de bactérias
• sequenciação de DNA
• produção/inactivação de proteínas em bactérias.
• visualisação de proteínas em geis de poliacrilamida.
• planeamento de experiências e interpretação de resultados.
Sumário das aulas:
A primeira tarefa será a preparação e análise por enzimas de restrição de um plasmideo
contendo o cDNA de interesse. A este cDNA será inserido uma “tag” por PCR na sua
região 3’ de modo a poder ser produzida uma proteína recombinante. Este “tag” codifica
um epitopo de 19 aminoácidos contra o qual existe um anticorpo monoclonal específico.
Este fragmento de PCR será posteriormente digerido com enzimas de restrição de modo a
originar extremidades coesivas (EcoRI e XbaI) para ligar no vector de expressão.
De modo a analizar-se a eficiência da digestão, e de modo a obter-se o fragmento de
DNA a subclonar, o DNA digerido será corrido em gel de agarose. O fragmento desejado
deverá nesta altura ser isolado do gel. O fragmento isolado e o vector linearisado, com as
mesmas enzimas, serão então misturados e a ligação fragmento-vector efectuada por
adição de DNA ligase. A mistura de ligação assim obtida será utilizada na transformação
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de células de E. coli competentes, e a selecção de colónias transformadas com o DNA
recombinante será feita por plaqueamento em meio contendo ampicilina.
Este cDNA recombinante será introduzido no vector de expressão pCS2+ e
posteriormente digeridos com estas endonucleases de restricção de modo a verificar a
eficiência da clonagem. Em seguida será sequenciado para confirmação de que a
sequência recombinante está correcta.
Este vector de expressão recombinante será utilizado para induzir a expressão desta
proteína em reticulócitos de coelho. Este sistema in vitro de transcricção/tradução é muito
utilizado devido á sua elevada eficiência e fiabilidade. Ao mesmo tempo que estaremos a
activar esta transcricção/tradução da proteína recombinante de interesse iremos testar a
eficácia de um “Oligonucleótido Morfolino” especifico para impedir a tradução e
consequente produção da proteína recombinante. Estas proteínas serão então analisadas
em gel de poliacrilamida por coloração com Azul de Bromofenol.
Simulação em computador – “Gene Isolation and Characterization” da Biotol.
Propriedades importantes do plasmídeo pBlueScript KS (pBS KS; ver Anexo 1).
1. Contém vários locais unicos de digestão para diversos enzimas de restrição,
agrupados numa região do plasmídeo denominada local multiplo de clonagem
(LMC).
2. O plasmídeo pBS contém o gene de resistência à ampicilina, permitindo que as
células transformadas sejam seleccionadas em placas com meio contendo ampicilina.
A E. coli é sensível à ampicilina e não pode crescer na presença desta droga, e
apenas as células que incorporaram o plasmídeo (células transformadas) conseguem
crescer.
Propriedades importantes do plasmídeo pCS2+ (ver Anexo 2).
1. Contém vários locais unicos de digestão para diversos enzimas de restrição,
agrupados numa região do plasmídeo denominada local multiplo de clonagem
(LMC).
2. contém um local de ligação á RNA polimerase 6 (SP6) na regiao 5’ do LCM e
um local de PoliAdenilação a 3’.
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“FLOW CHART” DAS AULAS PRÁTICAS
Trabalho 1: Isolamento de DNA plamídico contendo o cDNA (pBS-Cerl2) de culturas
de E. coli. (14/03)
Digestão do DNA com enzimas de restricção. (15/03)
Análise do DNA em gel de agarose.
Trabalho 2: Estratégia de cloning e “tagging” deste cDNA por PCR. (16/03)
Análise e extração do fragmento de PCR em gel de agarose. (19/03)
Digestão do produto de PCR.
Digestão do vector pCS2+.
Trabalho 3: Análise e extração dos fragmentos de DNA em gel de agarose. (20/03)
Ligação do fragmento de DNA ao vector digerido.
Trabalho 4: Preparação de células competentes (21/03)
Transformação de células competentes com a mistura de ligação. (22/03)
Plaqueamento das células em meio contendo ampicilina.
Trabalho 5: Análise dos transformantes; lançamentos das culturas (23/03); (25/03–Prof)
Isolamento de DNA plamídico da aula anterior, de culturas de E. coli. (26/03)
Digestão do DNA com enzimas de restricção.
Análise do DNA em gel de agarose. (27/03)
Trabalho 6: Reacção de sequênciação dos clones positivos da aula anterior. (27/03)
Limpeza dos produtos de PCR da reação de sequenciação. (28/03)
Trabalho 7: Análise das reações de sequenciação. (29/03)
Expressão/inactivação da proteína em Reticulócitos de coelho.
Trabalho 8: Análise das proteínas em geis de poliacrilamida. (30/03)
Análise dos géis e discussões sobre os trabalhos (10/04)
Trabalho 9-10: Simulação em computador utilizando o programa “Gene Isolation and
Characterization” da Biotol. (11, 12/04)
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
TRABALHO PRÁTICO 1
EXTRACÇÃO, RESTRICÇÃO E ELECTROFORÉSE DE DNA PLASMÍDICO DE E. COLI
Trabalho Prático 1 – Isolamento do plamídeo contendo o cDNA (pBS-Cerl2).
- Digestão do DNA com enzimas de restricção.
- Análise do DNA em gel de agarose.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho isolar o vector plasmídico contendo o cDNA (pBS-Cerl2;
ver Anexo 3 e 4), que estão presentes em células transformadas de E. coli.
Introdução
Existem vários métodos de extracção de DNA plasmídico. O método utilizado neste
trabalho consiste numa modificação do método de lise alcalina (Birnboim & Doly, 1979).
O processo, que permite a extracção de DNA plamídico de células de bactéria, consiste
em provocar a lise destas numa solução fortemente alcalina (de hidróxido de sódio)
contendo SDS (dodecil sulfato de sódio). Esta solução causa simultaneamente a
dissolução da membrana plasmática, a desnaturação de macromoléculas (proteínas e
DNA) e a hidrólise do RNA. As macromoleculas são depois precipitadas por adição de
acetato de potássio (KAc), e devido ao pH ácido desta solução o pH do lisado é
neutralisado. O reequilíbrio do pH permite a renaturação do DNA plasmídico,
restabelecendo a sua conformação original. O DNA genómico, devido às suas dimensões
e estrutura, não consegue voltar à sua forma nativa, permanecendo sob a forma de
agregados complexos. Após a adição do KAc é pois possivel, por centrifugação, separar
um sedimento, constituído por membranas, proteínas e DNA cromossómico, de um
sobrenadante onde o DNA plamídico se encontra dissolvido. Uma desproteinização mais
profunda desse sobrenadante pode posteriormente ser levada a cabo utilizando-se uma
mistura de fenol-clorofórmio (1:1), de modo a obter DNA plasmídico suficientemente
puro e assim adequado a servir de substrato para os enzimas de restrição. No final, o
DNA plasmídico purificado é precipitado com etanol, seco sob vácuo, e ressuspenso em
tampão TE.
Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.
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Plasmid Miniprep
Cada grupo vai fazer 2 extracções (2 tubos Eppendorf iniciais).
Em cada tubo:
1.
Centrifugar 1,5 ml da cultura de E. Coli, durante 5 min. a 2,000 rpm; eliminar o
sobrenadante e adicionar 200ul GTE
2.
Vortex durante 2 min. para ressuspender o “pellet e adicionar 5ul Rnase A (solução
stock a 10mg/ml).
3.
Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
4.
Adicionar 400ul, de uma solução 0.2M NaOH / 1% SDS (preparado na altura);
5.
Misturar por inversão e colocar os tubos em gelo durante 5 min.
6.
Adicionar 300ul acetato de potássio (3M, pH 4,5);
7.
Misturar por inversão e colocar os tubos em gelo durante 10 min.
8.
Centrifugar o lisado durante 10 minutes a 12,000 rpm;
9.
Transferir 0,7 ml do sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga, contendo
0,8 ml de etanol arrefecidos a 4oC,
10. Misturar por inversão e colocar os tubos em gelo durante 15 - 30 min. para
precipitação do DNA.
11. Separar o precipitado por centrifugação, durante 10 min. a 12,000 rpm.
12. Deitar fora o sobrenadante, invertendo o tubo em cima de uma toalha de papel, e
batendo ligeiramente no tubo. É preciso cuidado tanto ao despejar o sobrenadante como
posteriormente, para não perder a pellet.
13. Lavar o sedimento de DNA plasmídico com 1ml de etanol a 70%.
14. Separar o precipitado por centrifugação, durante 10 min. a 12,000 rpm
15. Retirar o excesso de etanol com uma micropipeta
16. Secar o “pellet” ao ar livre (aproximadamente 15 min.)
17. Adicionar 50 ul de TE
18. Guardar a –20ºC e/ou prosseguir para digestão com enzimas de restrição.
Soluções:
TE:
10 mM Tris
1 mM EDTA, pH 8.0
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RESTRICÇÃO E ELECTROFORÉSE DE DNA DE PLASMÍDEO
Os objectivos deste trabalho são visualizar o DNA de plasmídeo extraído previamente.
Pretende-se fazer estimativa do tamanho das moléculas e da quantidade de DNA obtida,
através de comparação com marcadores de tamanho e de marcadores de peso molecular,
após electroforése em gel de agarose. Tem-se também em vista a observação das
diversas conformações que o DNA de plasmídeo pode apresentar através da mobilidade
diferencial daquelas formas sujeitas a electroforése.
1. Digestão de DNA de plasmídeo com EcoRI/XbaI e com HindIII :
Estas enzimas são endonucleases de restricção presentes no polylinker do plasmídeo.
A digestão do DNA com esta enzima vai conduzir ao aparecimento de 2 bandas, o
que vai ser observado após electroforése.
1.a) Preparar as seguintes reacções de digestão
Amostra
DNA (ul)
EcoRI/XbaI (ul) HindIII (ul)
Buffer10x (ul)
H2O (ul)
Total (ul)
DNA p
1.0
0.5/0.5
-----
1.5
11.5
15.0
DNA p
1.0
-----
0.5
1.5
12.0
15.0
DNA p
1.0
-----
-----
1.5
12.5
15.0
DNAp – DNA plasmídico
b)
Incubar a reacção no banho a 37° C, durante pelo menos 60 min.
2. Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
3. Preparação do gel de agarose:
Preparar 80 ml de 1.0 % agarose em TBE, a partir de TBE 10x. Aquecer no microondas até dissolver a agarose, com agitação. Arrefecer (até cerca de 50° C).
Adicionar 4.0 µl de Brometo de Etídeo do stock (a 10mg/ml). O brometo de etídeo é
um agente mutagénico forte e deve ser manipulado sempre com luvas e muito
cuidado.
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Enquanto a solução de agarose arrefece, preparar o tabuleiro com dois pentes e fita
adesiva. Despejar devagar solução de agarose suficiente. Deixar solidificar durante
20-30 min. Retirar a fita e os pentes e introduzir o tabuleiro com o gel na tina
contendo TBE (300 ml), com os poços onde vão ser colocadas as amostras perto do
eléctrodo negativo (azul).
4. Electroforése em gel de agarose:
Os plasmídeos encontram-se geralmente em várias conformações, tais como a forma
circular fechada super-enrolada (“supercoiled”) que é compacta e tem maior
mobilidade no gel do que as outras formas; a forma circular aberta que tem pelo
menos um corte numa das cadeias (a forma menos móvel); e a forma linear em que
os cortes ocorreram nas duas cadeias num sítio próximo, como é o caso das moléculas
digeridas com uma enzima de restrição.
a) As amostras de DNA vão ser introduzidas no gel, ao lado do marcador de
tamanho (1 kb Plus DNA Ladder), para fazer uma estimativa do tamanho e da
quantidade das moléculas de DNA. Usar 5,0 µl do 1 kb ladder (contendo um total
de 500 ng de DNA)
b) Correr o gel a 100V, durante 30-60 min.
c) O gel corado com brometo de etídeo pode ser visualizado sobre uma fonte de UV,
com uma máscara protectora, e fotografado.
Restricção e electroforése de DNA de plasmídeo:
DNA do plasmídeo pBS-Cerl2 foi extraído de E. coli e submetido a electroforése em
gel de agarose. A amostra foi também analisada por electroforése após digestão do DNA
de plasmídeo com endonucleases de restricção cujas sequências de reconhecimento são
únicas no plasmídeo.
Da observação do gel, pretende-se:
1. Identificar os padrões de tamanho (1kb Plus DNA Ladder) e de peso molecular e
as amostras correspondendo ao DNA do plasmídeo digerido com as endonucleases
de restricção.
2. Identificar as diversas conformações presentes no DNA de plasmídeo tais como a
molécula linear, as formas superenroladas, circulares abertas, e os múltiplos.
3. Estimar o tamanho e a quantidade do DNA de plasmídeo através da comparação
com os padrões de tamanho e peso molecular conhecidos.
4. Referir a concentração das amostras analisadas em µg/µl.
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Soluções:
TBE 10x, pH 8.3:
0.89 M Tris.base
0.89 M Ácido Bórico
0.02 M Na2EDTA.2H2O
Gel loading buffer:
0.25% azul bromofenol
40% glicerol
NOTA: Para fácil referência, há uma dupla de bandas mais afastadas das outras, a 2,000 e
a 1,650 pb. A banda de 1,650 pb contém aproximadamente 10% do total de DNA
presente em todas as bandas.
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TRABALHO PRÁTICO 2
“TAGGING” DO CDNA POR PCR
Trabalho Prático 2 – Estratégia de cloning e “tagging” deste cDNA por PCR.
- Análise e extração do fragmento de PCR em gel de agarose.
- Digestão do produto de PCR.
- Digestão do vector pCS2+.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho inserir um “tag” no porção 3’ do cDNA presente no vector
plasmídico pBS-Cerl2.
O método de PCR, introduzido inicialmente por Saiki et al. (1985) e Mullis & Faloona
(1987), foi utilizado para tentar obter uma ampliação selectiva de genes de interesse.
Este método utiliza uma enzima DNA polimerase termoestável para copiar in vitro uma
determinada região da molécula de DNA, região esta que é condicionada pelo uso de
pequenos “primers” que hibridam com locais individualizados dos cadeias de DNA
delimitando assim o fragmento a amplificar. Este técnica permite amplificar uma
molécula vários biliões de vezes em poucas horas (Eidne, 1991), sendo particularmente
útil quando se analisa tipos de mRNA pouco abundantes ou quando as quantidades de
tecido disponível são limitadas (Dallman & Porter, 1993).
O PCR é um processo cíclico em que os seguintes passos, são repetidos durante um
número determinado de vezes: A cadeia dupla de DNA é desnaturada por aquecimento,
obtendo-se duas cadeias simples; os primers introduzidos na reacção ligam-se com zonas
homologas em cada uma destas cadeias; a DNA polimerase cataliza a produção de novas
cadeias complementares. Cada uma destes ciclos, que demora apenas alguns minutos,
duplica a quantidade da DNA pretendida, deixando-a como uma cadeia dupla.
Os reagentes necessários são, para além da enzima, primers e DNA, nucleótidos livres
(dNTP) para construção das cadeias e uma solução-tampão da reacção buffer, que
estabelece as condições óptimas para a enzima.
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O “tag” a adicionar, na região 3’’ do cDNA de Cerl2, vai codificar para o epitopo
designado “FLAG” (contra o qual existe um anticorpo monoclonal), cuja sequência de
aminoácidos é: DYKDDDDK. Para visualização do produto final pretendido ver Anexo5.
Objectivos:
•
Aprendizagem da técnica PCR
•
Adicionar uma sequencia de nucleotídeos ao cDNA de Cerl2 contido no
plasmideo pBS SK.
Protocolo
Amostras: DNA plasmídico do pBS-Cerl2.
1. Retirar a amostra de DNA plasmídico que deverá estar guardada no congelador.
2. Deixar descongelar à temperatura ambiente
3. Preparar 1 tubo de PCR com as quantidades de reagentes indicadas na tabela 1,
4. Adicionar a amostra de DNA plasmídico (200 ng) ao tubo preparado em 3. A
quantidade de amostra a usar será dada pelo prof. pois poderá ter de proceder a
uma diluição
5. Adicionar aos tubos 1 gota de óleo mineral antes de os colocar no aparelho PCR
Tabela 1 - Quantidades (em µl) de reagentes utilizados em cada tubo de reacção
PBS-
dNTPs
10XPCR
Enzima
Primer F
Primer R
H2O
10mM
buffer
Taq
20pmol
20pmol
esterile
1.0
2.5
0.4
1.0
1.0
18.1
DNA
1.0
Cerl2
PRIMERS UTILIZADOS:
Primer Forward: T3 – AATTAACCCTCACTAAAGGG
Primer Reverse: cerl2-Flag-XbaI (5’CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCT
CCTCCTCCCAGCTTCGGGCGGCACTGACACTTCTGG-3’).
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Programa PCR
1 ciclo →
desnaturação inicial
94oC, 2 min
20 ciclos→
desnaturação
94oC, 30 segundos
hibridação
55oC, 30 segundos
extensão
72oC, 1 min
1 ciclo→
extensão final
72oC, 10 min
1 ciclo→
Manutenção
4oC, 24 Horas
6. Parar a reação definitivamente adicionando 3.0 µl de GLB.
------------------------------ANÁLISE E EXTRAÇÃO DO FRAGMENTO DE PCR.
NOTA: Começar por fazer um Gel de agarose 1%
Método de “QIAquick Gel Extraction Kit”
1- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE
2- O volume total das amostras obtidas pela reação de PCR são introduzidas no gel.
Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora.
3-Cortar a banda do gel e colocar num tubo eppendorf.
4- Adicionar 300 µl Buffer QG.
5- Incubar a 50ºC durante 10min ou até ao gel se dissolver completamente. (vortexar ao
fim de 5min).
Protocol
6. Place a QIAquick spin column in a provided 2 ml collection tube.
7. To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column, and centrifuge for 1
min.
The maximum volume of the column reservoir is 800 µl. For sample volumes of more
than 800 µl, simply load and spin again.
8. Discard flow-through and place QIAquick column back in the same collection
tube.
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Collection tubes are re-used to reduce plastic waste.
9. (Optional): Add 0.5 ml of Buffer QG to QIAquick column and centrifuge for 1
min.
This step will remove all traces of agarose. It is only required when the DNA will
subsequently be used for direct sequencing, in vitro transcription or microinjection.
10. To wash, add 0.75 ml of Buffer PE to QIAquick column and centrifuge for 1
min.
Note: If the DNA will be used for salt sensitive applications, such as blunt-end ligation
and direct sequencing, let the column stand 2–5 min after addition of Buffer PE, before
centrifuging.
11. Discard the flow-through and centrifuge the QIAquick column for an additional
1 min at 13,000 rpm (~17,900 x g).
IMPORTANT: Residual ethanol from Buffer PE will not be completely removed unless
the flow-through is discarded before this additional centrifugation.
12. Place QIAquick column into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.
13. To elute DNA, add 50 µl of Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) to the center of
the QIAquick membrane and centrifuge the column for 1 min. Alternatively, for
increased DNA concentration, add 30 µl elution buffer to the center of the
QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min.
IMPORTANT: Ensure that the elution buffer is dispensed directly onto the QIAquick
membrane for complete elution of bound DNA. The average eluate volume is 48 µl from
50 µl elution buffer volume, and 28 µl from 30 µl. Elution efficiency is dependent on pH.
The maximum elution efficiency is achieved between pH 7.0 and 8.5. When using water,
make sure that the pH value is within this range, and store DNA at –20°C as DNA may
degrade in the absence of a buffering agent. The purified DNA can also be eluted in TE
(10 mM Tris·Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0), but the EDTA may inhibit subsequent enzymatic
reactions.
13- Usar 2.0µl deste DNA + 1 µl de GLB + 7.0µl H2O. Correr em gel de agarose
para verificar a eficiência da extração.
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DIGESTÃO COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Pretende-se agora digerir o produto de PCR e o vector de expressão pCS2+ com enzimas
de restrição de modo a que se possa proceder á clonagem do fragmento no novo vector.
1.a) Preparar as seguintes reacções de digestão
Amostra
DNA (ul)
EcoRI (ul)
XbaI (ul)
Buffer10x (ul)
H2O (ul)
Total (ul)
PCR
10.0
1.0
1.0
2.0
6.0
20.0
DNA p
5.0
1.0
1.0
2.0
11.0
20.0
DNAp – DNA plasmídico pSC2+; PCR- fragmento de PCR.
b)
Incubar a reacção no banho a 37° C, durante a noite (ON).
2. Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
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TRABALHO PRÁTICO 3
PREPARAÇÃO DE REAÇÕES DE LIGAÇÃO
Trabalho Prático 3 – Análise e extração dos fragmentos de DNA em gel de agarose.
- Ligação do fragmento de DNA ao vector digerido.
Objectivos: pretende-se preparar os fragmentos de DNA necessários para proceder á
reação de ligação que permitirá subclonar o fragmento de DNA
recombinante resultante do PCR, no novo vector de expressão pCS2+.
Método de “QIAquick Gel Extraction Kit”
1- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE
2- O volume total das amostras obtidas pela reação de restrição da aula Prática 2, são
adicionadas introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a
100V durante 1 hora.
3- Prosseguir com o método de ““QIAquick Gel Extraction Kit”” de acordo com o
protocolo da aula Prática 2 de modo a isolar as duas bandas de DNA.
4- Ressuspender os produtos em 30.0µl de Buffer EB.
REACÇÃO DE LIGAÇÃO
1- Proceder á reação de ligação do seguinte modo:
TUBO
PCR (ul)
vector (ul)
DNA ligase (ul)
Buffer 5x (ul)
H2O (ul)
Total (ul)
1
6.0
6.0
0.5
4.0
3.5
20.0
PCR - fragmento de PCR digerido; vector – pCS2+ digerido;
b)
Incubar a reacção a 16° C, durante a noite (ON) ou 2 horas TA.
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TRABALHO PRÁTICO 4
TRANSFORMAÇÃO DO CDNA RECOMBINANTE
Trabalho Prático 4 – Preparação de células competentes
- Transformação de células competentes com a mistura de ligação.
- Plaqueamento das células em meio contendo ampicilina.
PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DE E. COLI
Certas estirpes de E. coli podem-se tornar competentes para transformação com DNA
plasmídico através de tratamento com catiões, tais como Ca2+, Mn2+ ou Co3+. Uma
solução 0.1M de CaCl2 é utilizada frequentemente para este fim. O objectivo deste
trabalho é a obtenção de células competentes de E. coli para transformação genética.
1. Preparar uma cultura de E. coli em meio LB com uma densidade óptica a 550 nm
(A550) de 0.4-0.6, o que corresponde à fase logarítmica de crescimento. (Requer a
inoculação da cultura no dia anterior e diluição 1:500 no dia de utilização.)
2. Transferir assepticamente 25 ml de cultura para tubo esterilizado. Reduzir a
temperatura da cultura para aprox. 0° C, mantendo o tubo no gelo durante 10 min. As
células devem ser mantidas a baixas temperaturas e manuseadas com cuidado durante
todo o procedimento, porque o tratamento necessário para as tornar competentes
torna-las mais frágeis.
3. Centrifugar a cultura a 1 000 rpm e a 4° C, durante 10 min.
4. Despejar o sobrenadante e adicionar 10 ml de CaCl2 0.1M frio. Agitar com cuidado
para ressuspender a pellet (sobre gelo). Após ressuspensão, incubar no gelo durante
20 min.
5. Centrifugar novamente as células a 1 000 rpm e a 4° C, durante 10 min.
6. Despejar o sobrenadante e ressuspender a pellet em 1 ml de CaCl2 0.1M frio. Incubar
no gelo durante 10 min.
7. Neste ponto, as células estão competentes e prontas a ser transformadas. Podem
também ser armazenadas a -70° C durante alguns meses, sem grandes perdas de
competência. Distribuir as células em aliquotas de 200 µl, em tubos Eppendorf
previamente identificados e congelar rapidamente em azoto líquido.
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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE E. COLI
Transformação genética pode ser definida como a incorporação estável e hereditável
de DNA exógeno por células de um hospedeiro. Em certas bactérias, a transformação
ocorre naturalmente o que contribui para o aumento da variabilidade genética das
populações. Outras bactérias, tais como a E. coli, têm que ser tornadas competentes para
transformação antes de poderem ser transformadas (Prática 3). Com este trabalho vamos
colocar células competentes de E. coli em presença de DNA exógeno, com o fim de obter
células transformadas.
1. Cada grupo vai fazer três transformações- com a reacção de ligação da Prática 3 , um
controlo constituído por células competentes com DNA circular e um controlo
constituído por células competentes sem DNA. Descongelar/utilizar portanto, 3 tubos
com 200 µl de células competentes, no gelo.
2. Etiquetar cada tubo e adicionar 10.0µl do DNA ou H2O no fundo de cada tubo,
“mexendo” brevemente com a ponta. Incubar no gelo durante 30 min.
3. Remover os tubos do gelo directamente para um banho aquecido a 42° C, incubar
durante 90 segundos a 42° C, e de novo no gelo durante 2 min, causando um choque
térmico.
4. Adicionar 700 µl de meio SOC a cada tubo, e incubar a 37° C durante 45 min. Este é
o período de recuperação das células.
5. Transferir aliquotas de 100 µl de cada transformação e do controlo para uma placa de
Petri contendo meio LB com 50 µg/ml ampicilina e para uma placa contendo meio
LB sem antibiótico. O antibiótico permite seleccionar as células transformadas
através do gene de resistência presente no plasmídeo.
6. Espalhar o inóculo na superfície do meio com um espalhador esterilizado à chama, e
manter a placa semi-aberta na câmara de fluxo laminar durante 15-20 min até que o
líquido seja absorvido pelo meio de cultura.
7. Incubar as placas de Petri invertidas, numa estufa a 37° C durante 18-24h.
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Soluções:
Meio de cultura SOC
(1l):
Triptona
Extracto de levedura
NaCl
glucose
20 g
5g
0.5g
20 mM
Meio de cultura LB
(1l):
Triptona
Extracto de levedura
NaCl
10 g
5g
10g
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TRABALHO PRÁTICO 5
ANÁLISE DOS RESULTADOS DA TRANSFORMAÇÃO
Trabalho Prático 5 – Calcular a eficiência de transformação.
- Isolamento de DNA plamídico da aula anterior, de culturas de
E. coli.
- Digestão do DNA com enzimas de restricção.
- Análise do DNA em gel de agarose.
Transformação genética de E. coli
Para efectuar a transformação genética, células competentes da bactéria são postas
em contacto com DNA exógeno (DNA de plasmídeo). Após um período de recuperação,
em que as células são submetidas a condições óptimas de crescimento, as células são
incubadas no meio de selecção. Cada célula transformada exibe o fenótipo de resistência
ao antibiótico de selecção, conferido pelo gene presente no plasmídeo, e vai formar uma
colónia no meio de cultura.
O sucesso da transformação é medido através da eficiência de transformação,
definida como o número de células hospedeiras transformadas por micrograma de DNA:
Eficiência
de
=
Transformação
no de células
transformadas

µg de DNA usado
x
volume final da
suspensão celular (ml)

volume de suspensão
usado (ml)
Da análise das placas de Petri com as transformações e o controlo incubadas em
meio LB com ou sem antibiótico, observar:
1. A viabilidade das células competentes através do crescimento do controlo em
meio LB.
2. A ausência de resistência à ampicilina das células competentes indicada pela
ausência de crescimento em meio com antibiótico.
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3. A incorporação do plasmídeo pelas células competentes indicada através da
aquisição de resistência à ampicilina.
4. Cálculo da eficiência de transformação.
ISOLAMENTO DE DNA PLASMÍDICO
Plasmid Miniprep
Cada grupo vai fazer 2 extracções (2 tubos Eppendorf iniciais) de duas colónias
individuais resultantes da reação de ligação/transformação da aula Prática 4.
1- Proceder á extração de DNA plasmídico de acordo com o Protocolo Plasmid Miniprep
da aula Prática 1.
2- Ressuspender o DNA plasmídico num volume final de 50.0µl de TE.
3- Preparar as seguintes 2 reacções de digestão
Amostra
DNA (ul)
EcoRI/XbaI (ul) Buffer10x (ul)
H2O (ul)
Total (ul)
DNA p
1.0
0.5/0.5
11.5
15.0
1.5
DNAp – DNA plasmídico
4-
Incubar a reacção no banho a 37° C, durante pelo menos 60 min.
5- Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
6- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE
7- O volume total das amostras obtidas pela reação de restrição da no ponto 5, são
introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante
1 hora.
8- Tirar fotografia e analisar o padrão das bandas de DNA.
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TRABALHO PRÁTICO 6
PREPARAÇÃO DE REAÇÕES DE SEQUENCIAÇÃO
Trabalho Prático 6 – Reacção de sequênciação dos clones positivos da aula anterior.
- Limpeza dos produtos de PCR da reação de sequenciação.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho determinar a sequência de nucleótidos correcta do cDNA
recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag.
Introdução
A determinação da sequência de nucleótidos que compõem um fragmento de
DNA clonado representa um dos processos finais na análise de DNA. A capacidade de
sequenciar DNA rapidamente teve um impacto revolucionário na Biologia. Crucial para
os processos de sequenciação, foi o desenvolvimento de electroforese em gel de
acrilamida vertical que permite separar cadeias de DNA com centenas de nucleótidos e
com apenas um nucleótido de diferença entre elas (a mais ou a menos). O método
laboratorial mais comum de sequenciação de DNA, conhecido como o método de
Sanger ou método de terminação de cadeias. Este envolve a síntese de novo de uma série
de cadeias simples de DNA, usando como molde a cadeia de DNA que se quer
sequenciar. As cadeias sintetizadas são terminadas prematuramente nos vários tamanhos
possíveis. A síntese começa sempre num ponto definido (por um primer) e termina por
incorporação de nucleótidos terminadores. Estes são derivados didesoxi dos nucleótidos
normais que, não possuindo um grupo hidroxilo na posição 3’ da desoxirribose, impedem
as ligações fosfodiestéricas do DNA. Consequentemente, termina a incorporação de
nucleótidos à cadeia de DNA que está a ser sintetizada. Os quatro terminadores serão
abreviadamente designados ddA, ddC, ddG e ddT.
Um fragmento de DNA clonado num plasmídeo representa um substrato típico
para sequenciação. O primeiro passo é a separação (desnaturação) das cadeias de DNA.
Em seguida, um pequeno oligonucleótido primer (aproximadamente 20 resíduos) é
emparelhado numa zona adjacente ao DNA clonado, normalmente em sequências
conhecidas do plasmídeo. Uma DNA polimerase é utilizada para sintetizar DNA a partir
do primer.
Hoje em dia, para que o DNA fique marcado utilizam-se compostos que emitem
fluorescência a cores diferentes em cada um dos terminadores utilizados e depois são
analisados num aparelho chamado “Sequenciador Automático”. A função deste aparelho
é resolver as diferentes emissões que vão passando ao longo do tempo num detector
Laser e interpretar assim a sequência de nucleotides continda na amostra de DNA
analisada.
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PROTOCOLO PARA SEQUENCIAÇÃO CICLICA
Este protocolo utiliza uma mistura de reacção (BigDye Terminator v1.1) que por adição
da amostra e primers especificos, permite a determinação da sequência de nucleótidos
após uma reacção de PCR e análise num Sequenciador Automático
1- Para cada reacção de sequenciação misturar os seguintes componentes:
a) Terminator Ready Reaction Mix
b) Amostra de DNA pCS2+-Cerl2-Flag (300-500ng)
c) Primer de sequenciação SP6 (3.2pmol)
d) H2O
Volume final
4.0µl
1.0µl
1.0µl
4.0µl
10.0µl
2- Misturar bem e colocar os tubos no aparelho de PCR.
Programa para Sequenciação por PCR:
1 ciclo →
desnaturação inicial
96oC, 1 min
25 ciclos→
desnaturação
96oC, 10 segundos
hibridação
50oC, 10 segundos
extensão
60oC, min
Manutenção
4oC, 24 Horas
1 ciclo→
PURIFICAÇÃO DAS REAÇÕES POR PRECIPITAÇÃO COM ETANOL/NaAc.
1- Retirar os tubos do Termociclador e centrifugar por instantes
2- adicionar a cada tubo:
10.0µl de H2O
2.0µl de 3M NaAc, pH 4.6
50.0µl de 95% Etanol.
3- Transferir para um tubo eppendorf e e misturar bem.
4- Incubar a TA durante 30 minutos para precipitar os produtos de extensão.
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5- Centrifugar a 4ºC durante 10 min. a 14,000 rpm.
6- Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e deitar fora.
7- Lavar o sedimento com 250µl de etanol a 70%.
8- Centrifugar a 4ºC durante 10 min. a 14,000 rpm.
9- Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e deitar fora.
10- Secar o “pellet” ao ar livre (aproximadamente 15 min.).
11- Guardar a –20ºC.
As amostras estão agora prontas para serem analisadas no Sequenciador Automático.
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TRABALHO PRÁTICO 7
TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO IN VITRO
Trabalho Prático 7 – Análise das reações de sequenciação.
- Expressão/inactivação da proteína em Reticulócitos de coelho.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho determinar a sequência de nucleótidos correcta do cDNA
recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag.
Pretendese depois utilizar este cDna recombinante num sistema de transcrição/tradução in
vitro (sistema “TNT” da Promega) para testar a produção da proteína e sua inactivação
por “Oligonucleótidos de Morfolino” especificos.
Introdução
Quando a região codificante de um cDNA é clonada num plasmídeo, adjacente a
um promotor, a respectiva proteína pode ser expressa in vitro por sistemas de transcrição
e tradução. Estes sistemas são menos eficientes do que a expressão in vivo, obtendo-se
muito menos proteína. No entanto, a proteína pode ser marcada por incorporação de
aminoácidos radioactivos, uma marcação que é específica e facilita a sua detecção. Nos
sistemas de transcrição são utilizados promotores víricos, como os dos fagos T7, T3 e
SP6, pois as RNA polimerases envolvidas actuam exclusiva e eficientemente nos
respectivos promotores. O mRNA, codificado pelo cDNA, é sintetizado numa reacção in
vitro que contém o plasmídeo recombinante isolado e a correspondente RNA polimerase
purificada. A transcrição na presença de nucleótidos radioactivos permite a marcação do
mRNA, com alta actividade específica, e a sua utilização como sonda em experiências de
hibridação. Alternativamente, o mRNA pode ser traduzido in vitro para produzir a
respectiva proteína. Os sistemas de tradução utilizam extractos celulares, como lisados de
reticulócitos de coelho, que contêm grandes quantidades de todos os componentes
necessários à síntese de proteínas. A utilização destes extractos celulares envolve um
tratamento prévio para destruir o mRNA endógeno que eles possuem. Assim, quando um
mRNA específico é adicionado aos extractos, como o obtido por transcrição de um
plasmídeo recombinante, apenas é produzida a proteína desejada. Estas proteínas
marcadas podem ser usadas em diversos tipos de experiências, tais como estudos de
processamento, interacções com outras proteínas ou moléculas, distribuição celular e
muitas outras.
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OLIGONUCLEÓTIDOS MORFOLINO
Estes são compostos sintéticos de bases ribonucleicas. Isto confere bastante estabilidade a
estes pequenos oligos de RNA. Ver o WebSite http://www.gene-tools.com/.
Desenhando um oligo, normalmente 19-25 mer, com a sequência anti-sense do mRNA
que queremos inibir, este oligo ao emparelhar com o mRNA (Figura 1) vai impedir a sua
tradução a nivel dos ribossomas não havendo assim produção da respectiva proteína
(Figura 2). Este é um metodo que começa a ser cada vez mais utilizado em estudos de
actividae genética pois permite inferir de um modo bastante acessivel, o resultado da falta
de actividade de um determinado produto genético.
Figura 1
Figura 2
Utilizando um Morfolino contra Cerl2 (ver Anexo4, região a verde e
sublinhada) podemos testar este efeito conjugado com o sistema de
Trancrição/Tradução in vitro (Figura 3).
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Figura 3. Comparação de Sistema TNT de Lisados de Reticulócitos Integrado com o
Sistema Rápido Integrado de Transcrição/Tradução.
PREPARAÇÃO DE REAÇÃO TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO
1- Preparar as seguintes 4 reacções
TUBO Nº
2-
TNT® Quick
PCs2-Cerl2-Flag (ul) Morpholino
H2O
Total
Master Mix (ul)
(500.0ng/µl)
(ul)
(ul)
Oligo
1
20.0
2.0
0.0
8.0
50.0
2
20.0
0.0
0.0
10.0
50.0
3
20.0
2.0
1.0 (CoMo)
7.0
50.0
4
20.0
2.0
1.0 (Cerl2Mo)
7.0
50.0
Incubar a reacção no banho a 30° C, durante pelo menos 60 min.
3- Parar a reacção de digestão juntando 5 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
4- Guardar a –20ºC.
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TRABALHO PRÁTICO 8
TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO IN VITRO
Trabalho Prático 8 – Análise das proteínas em geis de poliacrilamida.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho determinar a eficiência do sistema de transcrição/tradução
in vitro (sistema “TNT” da Promega) para testar a produção da proteína recombinante e
sua inactivação por “Oligonucleótidos de Morfolino” especificos.
Introdução
As proteínas celulares constituem uma vasta classe de biomoléculas que
desempenham na célula funções muito diversas. Para analisar simultaneamente um tão
grande e variado grupo de compostos, é necessário recorrer a técnicas que utilizem uma
propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem
pequenas variações no seu comportamento, de modo a que as várias moléculas sejam
diferenciadas.
As técnicas de electroforese caem nesta categoria, e são largamente utilizadas pois
baseiam-se no facto de todas as proteínas apresentarem uma carga eléctrica global
quando colocadas num meio de pH diferente do seu ponto isoeléctrico. Deste modo é
possivel provocar a migração de proteínas sugeitando-as a um campo electrico. Essa
migração variará de acordo com a proteína, uma vez que é influenciada pelo tamanho,
carga, forma e composição química de cada molécula. Grosseiramente, pode-se
considerar que a migração electroforética duma molécula é apenas função da sua
densidade de carga, ou seja , da respectiva razão carga/massa. Assim as proteínas separarse-ão de acordo com o respectivo valor desta razão: quanto maior ela for, maior será a
velocidade de migração da molécula.
A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é um método rápido e sensível para
analisar a composição de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em
que os monómeros de acrilamida, ao polimerizarem, formam longas cadeias, as quais se
ligam entre si por crosslinking (“ligações cruzadas”), através dos resíduos de bisacrilamida, também nelas incorporados. O processo de polimerização consiste numa
reacção em cadeia de radicais livres, iniciada pelo persulfato de amónio (PSA) e pelo
N,N,N’,N’-tetrametilinediamina (TEMED), os quais se encontram presentes na mistura
de polimerização. P PSA activa o TEMED, deixando-o com um electrão
desemparelhado. Este radical reage então com uma molécula de acrilamida,
transformando-a também num radical. Este, por sua vez, reage com um outro monómero
de acrilamida (ou, ocasionalmente, com a bis-acrilamida), dando origem a novo radical, e
assim sucessivamente até se formar um polímero com ligações cruzadas (crosslinked). O
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numero de ligações cruzadas (quantidade de crosslinking), controla o tamanho dos poros
do gel, e consequentemente determina o intervalo de massa molecular das proteínas que
podem ser separadas nesse gel. Isto quer dizer consoante o numero de ligações cruzadas
assim se separam as proteínas com baixa massa molecular ou com elevado massa
molecular. O conteudo total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30%,
correspondendo o valor da percentagem ao total das moleculas de acrilamida (i.e.
acrilamida e bis-acrilamida, p/v).
O gel em placa é, na realidade, constituido por dois geis: o gel de separação, no qual
as proteínas são separadas, e o gel de concentração (ou “stacking gel”), no qual se dá a
compressão da amostra antes desta entrar no gel de separação. Por isso se chama a este
sistema um sistema descontínuo. Devido à elevada resolução obtida com os sistemas
descontínuos, o sistema SDS-descontinuo (um sistema em que o detergente aniónico
dodecilsulfato de sódio é adicionado a todas as soluções), é normalmente escolhido para a
separação de elevada resolução de misturas proteicas. Nesta técnica as misturas são
primeiramente desnaturadas por aquecimento, a cerca de 100ºC, durante 2-5min, na
presença dum excesso de SDS e dum reagente tiólico (b-mercaptoetanol, que desfaz a
maior parte das ligações persulfureto presentes nas moléculas proteicas). O SDS liga-se
fortemente às proteínas desnaturando-as. Estudos realizados mostram que este detergente,
quando presente em largo excesso, liga-se às proteínas numa proporção constante de 1,4g
de SDS para 1g de proteína. Isto equivale aproximadamente a uma molécula de SDS para
cada dois resíduos de aminoácidos na proteína. Esta elevada taxa de ligação, e sendo as
moléculas de SDS carregadas negativamente, faz com que a carga intrínseca da proteína
se torne insignificante quando comparada com a carga total proveniente do SDS a ela
ligado. Simultaneamente, como esta taxa de ligação é constante, os diferentes complexos
SDS-proteína possuem densidades de carga essencialmente idênticas migrando , nos geis
de poliacrilamida, em função do respectivo valor de massa molecular. A separação de
uma mistura de proteínas no sistema SDS-PAGE é pois um reflexo da diferença dos
respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) proteína(s) em questão pode ser estimada
por comparação da respectiva mobilidade electroforética (Rf), com a de proteínas de
massa molecular conhecida (padrões).
A simplicidade e rapidez desta técnica, adicionadas ao facto de que apenas é
necessária uma pequena quantidade de amostra (alguns microgramas), tornam a
electroforese em gel de poliacrilamida no método mais utilizado para a análise de
misturas proteicas complexas. Uma vez que as proteínas de práticamente todas as origens
são fácilmente solubilizadas pelo SDS, a técnica possui aplicação generalizada.
As proteínas separadas no gel de poliacrilamida podem ser fácilmente coradas com
uma solução contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades
de proteína da ordem de 0,1 g. Apesar deste método permitir detectar praticamente
todos os constituintes da maior parte das amostras proteicas, surgem por vezes situações
em que é necessária uma maior sensibilidade, a qual pode ser alcançada recorrendo-se ao
método de coloração com nitrato de prata.
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POÇOS PARA APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS
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Preparação do gel de SDS-poliacrilamida
1. Limpe muito bem, com a mistura etanol-éter (2:1, v/v), todo o material de
electroforese, onde vai formar os geis (placas de vidro e de alumina, espaçadores
e pentes).
2. Monte as diferentes sanduíches, constituidas por duas placas (uma de vidro e
outra de alumina), intercaladas com um par de espaçadores. Coloque as molas
que apertam o sistema.
3. Introduza o pente na sanduíche até os dentes entrarem completamente e marque,
na placa de vidro, um traço 0,5cm abaixo do nível inferior do pente.
4. Prepare as soluções, de resolução e de concentração, sem adicionar os agentes
polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos
quadros 1 e 2.
(Atenção: a acrilamida é neurotóxica, portanto deve ser tomado o
cuidado máximo na manipulação das soluções deste composto. É
aconselhável o uso de luvas. Uma vez polimerizada a acrilamida não é
tóxica.)
5. Transfira a solução do gel resolvente para um goblet e adicione os agentes
polimerizantes (TEMED e PSA). Agite. Coloque imediatamente a solução, com
auxílio de uma pipeta e evitando a formação de bolhas, entre as placas de vidro
até à marca traçada préviamente.
6. Muito devagar, coloque com auxílio de uma seringa, um pouco de água destilada
sobre a superfície da solução do gel de resolução. (A água vai evitar que a
superfície de polimerização fique irregular).
7. Deixe em repouso até a acrilamida polimerizar (vísivel pela formação de uma
linha de interfase gel-água (demora cerca de 10min)).
8. Uma vez polimerizado o gel, inverta a sanduiche, de modo a escorrer toda a
água que se encontra na superfície do gel.
9. Transfira a solução do gel de concentração para um gobelet e adicione os
agentes polimerizantes TEMED e PSA. Agite. Deite imediatamente na
sanduiche até ao cimo (ou seja até começar a escorrer por fora).
10. Deixe em repouso até polimerizar (cerca de 15 min). (Aqui não é necessário
adicionar água para obter uma superfície de polimerização lisa).
11. Após o gel ter polimerizado retire o pente (com cuidado para não destruir os
poços).
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Preparação e aplicação das amostras no gel.
1. Adicione a cada amostra de proteína um volume idêntico de tampão de amostra.
2. Ferva 2min e coloque em gelo até a aplicação no gel.
3. Com a ajuda de uma pipeta automática, aplique as amostras e padrões no gel que
foi já préviamente preparado. (Não se esqueça de anotar a ordem de aplicação
das amostras e padrões).
4. Coloque a solução de electroforese (já diluída) nas tinas superior e inferior do
aparelho de electroforese.
5. Coloque a tampa da camara de electroforese, fazendo a conexão dos electrodos.
6. Ligue os electrodos à fonte de electroforese, tendo em atenção à respectiva
polaridade. (Por convenção, o vermelho é o positivo e o preto é o negativo). As
proteínas irão migrar para o polo positivo.
7. Coloque o botão que regula a voltagem no máximo, de forma a esta não ser
limitante.
8. Regule o botão da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA
por gel.
9. Deixe que a migração do azul de bromofenol atinja o fim do gel de resolução.
10. Desligue a fonte de energia, desligue os electrodos, remova a tampa da câmara,
despeje a solução de electroforese, e remova a sanduiche retirando as respectivas
molas.
11. Com o auxilio de um espaçador (ou de qualquer outro objecto de plástico),
separe as duas placas (a de vidro e a de alumina).
Colorir as proteínas no gel
1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo solução corante com azul
de Coomassie.
2. Deixe a corar durante 15-20min.
3. Retire o gel para outra caixa contendo água destilada. Escorra a água e lave
novamente com água destilada.
4. Escorra a água e adicine solução descorante. Agite durante 5-10min.
5. Repita o ponto anterior até observar nítidamente as bandas correspondendo às
várias proteínas.
6. Coloque o gel sobre um pedaço de papel de filtro grosso (3MM), cubra com
“Larfilm” e seque no secador de geis.
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Tris-HCl 1.5M pH8,8
SDS 10% (p/v)
1
Sol. Acri-Bis
Água destilada
Quadro 1 – Solução do gel de resolução
10ml
2,5ml
0.1ml
3.3ml
4.1ml
TEMED
6µl
PSA 10% (p/v)
20µl
1
Solução contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)
Tris-HCl 0.5M pH6,82,
SDS 10% (p/v)
1
Sol. Acri-Bis
Água destilada
Quadro 2 – Solução do gel de concentração
10ml
5ml
0,1ml
1,7ml
5,7ml
TEMED
PSA 10% (p/v)
1
26µl
40µl
Solução contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)
Soluções
Tampão do gel de resolução: Tris 1.5M pH8.8, SDS 10%
Tampão do gel de concentração: Tris 0.5M pH6.8, SDS 10%
Solução de acrilamida/bis-acrilamida: acrilamida 30% p/v, bis acrilamida 0.8% p/v.
Persulfato de amónio 10%
Tampão de electroforese: Tris 0.25M pH 8.3, glicina 1.92M, SDS 1%.
Tampão para as amostras: 2ml glicerol, 1ml b-mercaptoetanol, 5ml SDS 10%, 2.5ml
tampão gel de concentração, 2mg azul de bromofenol.
Solução corante: Coomassie Blue R-250 0.3%, ácido acético 5%, metanol 25%.
Solução descorante: Ácido acético 7.5%, metanol 45%.
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TRABALHO PRÁTICO 9-10
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES
Objectivos:
O obectivo deste trabalho é a aquisição de experiência nas estratégias a seguir para o
isolamento de um gene correspondente a uma proteína de interesse industrial.
A actividade de um investigador numa empresa de Biotecnologia é simulada através
de um programa de computador – “Gene Isolation and Characterization” da Biotol. O
investigador é responsável pela produção de uma proteína nova com propriedades antimicrobianas, tendo disponíveis laboratórios onde se podem efectuar um determinado
número de técnicas, e uma biblioteca. Ao longo do trabalho, vão ser tomadas, pelo
investigador, decisões relativas à investigação e ao desenvolvimento do novo produto,
através da identificação, caracterização, e expressão do respectivo gene.
Execução:
A empresa pretende explorar as propriedades de uma planta que contém uma
proteína com propriedades anti-fúngicas, comprovadas medicamente. O trabalho
envolvido no desenvolvimento da produção da proteína pela empresa encontra-se
dividido em 3 partes:
Fase 1: O investigador tem que identificar os tecidos da planta responsáveis pela
actividade anti-microbiana e determinar o tamanho da(s) proteína(s)
envolvida(s). Com base nisto, escolhe uma estratégia para clonar e isolar o
respectivo gene.
Fase 2: Tomada de decisões respeitantes à extracção de ácidos nucleicos e
construção de um banco de clones adequado. Estas técnicas são aspectos
fundamentais da aplicação da Biologia Molecular à Biotecnologia.
Fase 3: O investigador conduz a pesquisa do banco de clones e identificação do
gene que codifica a proteína. O gene é caracterizado e introduzido num
vector de expressão para produção da proteína em larga escala.
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Calendarização:
Aula 9:
Fase 1: Determinação da estratégia de clonagem
1.1 Análise da actividade anti-microbiana
1.2 Abordagens para a clonagem do(s) gene(s) envolvido(s)
Fase 2: Construção do banco de clones de DNA
2.1 Extracção de ácidos nucleicos
2.2 Construção do banco de clones
Aula 10: Fase 3: Identificação e caracterização do gene
3.1 Transferência do DNA para suporte sólido
3.2 Isolamento, caracterização e expressão do gene
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Fontes de informação/técnicas e protocolos:
-
Tecnologia DNA Recombinante; Protocolos Práticos, A.
Cravador
-
Bioquímica; Protocolos Práticos, A. Tavares
-
Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction
procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic
Acids Res. 7: 1513-1523
-
Quiagen, QIAquick Gel Extraction Kit Protocols
-
Applied Biosystems, BigDye Terminator v1.1 Protocols
(http://ifr31.toulouse.inserm.fr/PFT/BM/Mediabm/bd1versusbd
3.pdf)
-
Gene Tools, Morpholino oligonucleotides (http://www.genetools.com/)
-
Promega, “TNT Quick” Protocols
(http://www.promega.com/tbs/tm045/tm045.html)
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
ANEXO 1
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
ANEXO 2
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
ANEXO 3
CONSTRUCT NAME: mCerl2-CDNA
VECTOR: pBluescript II KS+
INSERT: EcoRI/XbaI 0.8 Kb fragment with mCerl2 cDNA
ANTISENSE PROBE: Cut with EcoRI, transcribe with T7 RNA Pol.
SENSE RNA: Cut with XbaI, transcribe with T3 RNA pol.
DIAGRAM:
EcoRV
HindIII
ClaI
SalI
XhoI
EcoRI 0.00
ATG 0.14 BamHI 0.27
SmaI 0.48
T3
CDS
Stop 0.70
XbaI 0.77
T7
NotI
mCer2/CDS in PBS
3.80 kb
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
ANEXO 4
TCA
TGA
GAC
CAA
ACT
GGG
CCT
GTG
CTC
CCG
GAG
ATG
M
AAG
CAC
CCC
TTC
F
CTG
TCC
ATT
CGT
R
CTT
ACA
TTA
AGC
S
CCA
CAC
AGA
CAG
Q
GGA
TAG
CAA
TTC
F
ACA
ACA
ACA
ACC
T
GTA
GCA
GAC
ACG
T
TAA
GGG
AAA
CTG
L
AAA
CCC
CGA
CTG
L
GCA
ACT
CTG
GGT
G
G
GAC
GCG
CAC
CTG
L
AAT
CTC
AAG
AGC
TTC
F
AGT GGG GCC TGG CTA CCC ACA GGC TCA GGG AGG CCT GGG GCC CCA
S
G
A
W
L
P
T
G
S
G
R
P
G
A
P
GCG ACC CCT GTT CAG TCC GGG ACT GCT ATC AAT CAG AGC TGG ACT
A
T
P
V
Q
S
G
T
A
I
N
Q
S
W
T
CTG GAT CCC CTG GTG CCC ATC TCT GCC CTG GGT AGC TGG GAG GCC
L
D
P
L
V
P
I
S
A
L
G
S
W
E
A
TTC CTG GGC CTG CAG AAC AAA CAG CAG GGG ACA GGT GAG CTG CAG
F
L
G
L
Q
N
K
Q
Q
G
T
G
E
L
Q
GGA GGA GGG CAG AGA GTA GCT GCT GGT GTG CCT TTG CCC TTG GCT
G
G
G
Q
R
V
A
A
G
V
P
L
P
L
A
CCT CAA GAA GTG CTT CAG GAG ACT TGT AAA GCT CTG TCC TTT GTT
P
Q
E
V
L
Q
E
T
C
K
A
L
S
F
V
CAG GTG ATC TCC AGG CCT GGT TGC ACA AGT GCC CGG GTC CTT AAT
Q
V
I
S
R
P
G
C
T
S
A
R
V
L
N
CAT CTC TGT TTT GGC CGC TGT TCC TCC TTC TAC ATT CCC AGC TCA
H
L
C
F
G
R
C
S
S
F
Y
I
P
S
S
GAT CCC ACC CCT GTA GTC TTC TGC AAC AGC TGT GTG CCG GCT CGA
D
P
T
P
V
V
F
C
N
S
C
V
P
A
R
AAG CGC TGG ACA TCG GTG ACG CTG TGG TGT GGA GCT GGC CAA TTA
K
R
W
T
S
V
T
L
W
C
G
A
G
Q
L
GCC TCC CCT CGG CGG GTG AGG ATT TCC ACG GTA TTG GTC CAG AAG
A
S
P
R
R
V
R
I
S
T
V
L
V
Q
K
TGT CAG TGC CGC CCG AAG CTG TGA GCT GAG CAT CCT AGA GGA ATG
C
Q
C
R
P
K
L
*
CGC AGG ACA TGA ATG AAC CTT GGC AAG AAG CAG GAG ACG CAA TAG
ATC TAG A
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
ANEXO 5
mCer2-flag
GAATTCAACT
GAGGGCCGCA
GAGCCCATTT
CCGTAGCCAG
CCACAGGCTC
ACTGCTATCA
CCTGGGTAGC
CAGGTGAGCT
CCCTTGGCTC
TGTTCAGGTG
ATCTCTGTTT
ACCCCTGTAG
ATCGGTGACG
TGAGGATTTC
cDNA
CTCAAGCTGC
CTCCACACAC
TAAGACAAAC
TTCACCACGC
AGGGAGGCCT
ATCAGAGCTG
TGGGAGGCCT
GCAGGGAGGA
CTCAAGAAGT
ATCTCCAGGC
TGGCCGCTGT
TCTTCTGCAA
CTGTGGTGTG
CACGGTATTG
TTCCAGGAAC
TAGACAGCAG
AGACAAACGA
TGCTGGGTCT
GGGGCCCCAG
GACTCTGGAT
TCCTGGGCCT
GGGCAGAGAG
GCTTCAGGAG
CTGGTTGCAC
TCCTCCTTCT
CAGCTGTGTG
GAGCTGGCCA
GTCCAGAAGT
CCAGAAGT
AGTATAAAAA
GGCCCACTGC
CTGCACAGCC
GTTCAGTGGG
CGACCCCTGT
CCCCTGGTGC
GCAGAACAAA
TAGCTGCTGG
ACTTGTAAAG
AAGTGCCCGG
ACATTCCCAG
CCGGCTCGAA
ATTAGCCTCC
GTCAGTGCCG
GTCAGTGCCG
GCAGACCTCT
GAAGGACCCT
AAGTGATGTT
GCCTGGCTAC
TCAGTCCGGG
CCATCTCTGC
CAGCAGGGGA
TGTGCCTTTG
CTCTGTCCTT
GTCCTTAATC
CTCAGATCCC
AGCGCTGGAC
CCTCGGCGGG
CCCGAAGCTG
CCCGAAGCTG
TGAGCTGAGC
GGAGGAGGAG ATTACAAGGA TGACGACGAT AAGTGATCTA GACGG
mcer2-flag-prot
MFRSQFTTLL GLFSGAWLPT
SALGSWEAFL GLQNKQQGTG
SFVQVISRPG CTSARVLNHL
WTSVTLWCGA GQLASPRRVR
GSGRPGAPAT
ELQGGGQRVA
CFGRCSSFYI
ISTVLVQKCQ
PVQSGTAINQ SWTLDPLVPI
AGVPLPLAPQ EVLQETCKAL
PSSDPTPVVF CNSCVPARKR
CRPKLGGGDYKDDDDK
Information on Entire Sequence :
Sequence Length
:
196
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
ANEXO 6
MCerl2-cDNA (in pBluescript KS+)
GAATTCAACT
GAGGGCCGCA
GAGCCCATTT
CCGTAGCCAG
CCACAGGCTC
ACTGCTATCA
CCTGGGTAGC
CAGGTGAGCT
CCCTTGGCTC
TGTTCAGGTG
ATCTCTGTTT
ACCCCTGTAG
ATCGGTGACG
TGAGGATTTC
TGAGCTGAGC
GAAGCAGGAG
CTCAAGCTGC
CTCCACACAC
TAAGACAAAC
TTCACCACGC
AGGGAGGCCT
ATCAGAGCTG
TGGGAGGCCT
GCAGGGAGGA
CTCAAGAAGT
ATCTCCAGGC
TGGCCGCTGT
TCTTCTGCAA
CTGTGGTGTG
CACGGTATTG
ATCCTAGAGG
ACGCAATAGA
TTCCAGGAAC
TAGACAGCAG
AGACAAACGA
TGCTGGGTCT
GGGGCCCCAG
GACTCTGGAT
TCCTGGGCCT
GGGCAGAGAG
GCTTCAGGAG
CTGGTTGCAC
TCCTCCTTCT
CAGCTGTGTG
GAGCTGGCCA
GTCCAGAAGT
AATGCGCAGG
GCTCTAGATC
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AGTATAAAAA
GGCCCACTGC
CTGCACAGCC
GTTCAGTGGG
CGACCCCTGT
CCCCTGGTGC
GCAGAACAAA
TAGCTGCTGG
ACTTGTAAAG
AAGTGCCCGG
ACATTCCCAG
CCGGCTCGAA
ATTAGCCTCC
GTCAGTGCCG
ACATGAATGA
TAGA
GCAGACCTCT
GAAGGACCCT
AAGTGATGTT
GCCTGGCTAC
TCAGTCCGGG
CCATCTCTGC
CAGCAGGGGA
TGTGCCTTTG
CTCTGTCCTT
GTCCTTAATC
CTCAGATCCC
AGCGCTGGAC
CCTCGGCGGG
CCCGAAGCTG
ACCTTGGCAA
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