GENOTOXICIDADE EM TECIDO HEPÁTICO E SANGÜÍNEO DE

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO
JOSIMAR GRASSI PEREIRA
GENOTOXICIDADE EM TECIDO HEPÁTICO E SANGÜÍNEO DE
CAMUNDONGOS TRATADOS COM Baccharis trimera (Less.) DC. DE
OCORRÊNCIA EM SOLO DEGRADADO PELA MINERAÇÃO DE
CARVÃO A CÉU ABERTO, TREVISO, SANTA CATARINA
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2008.
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JOSIMAR GRASSI PEREIRA
GENOTOXICIDADE EM TECIDO HEPÁTICO E SANGÜÍNEO DE
CAMUNDONGOS TRATADOS COM Baccharis trimera (Less.) DC. DE
OCORRÊNCIA EM SOLO DEGRADADO PELA MINERAÇÃO DE
CARVÃO A CÉU ABERTO, TREVISO, SANTA CATARINA
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado
para a obtenção do grau de Bacharel no curso
de Ciências Biológicas Bacharelado da
Universidade do Extremo Sul Catarinense,
UNESC
Orientador: Prof. Dr. Marcos M.da Silva Paula.
Co-Orientadora: Profª.Drª. Vanessa M. de
Andrade.
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2008.
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JOSIMAR GRASSI PEREIRA
GENOTOXICIDADE EM TECIDO HEPÁTICO E SANGÜÍNEO DE CAMUNDONGOS
TRATADOS COM Baccharis trimera (Less.) DC. DE OCORRÊNCIA EM SOLO
DEGRADADO PELA MINERAÇÃO DE CARVÃO A CÉU ABERTO, TREVISO,
SANTA CATARINA
Trabalho de Conclusão de Curso aprovado pela
Banca Examinadora para obtenção do Grau de
Bacharel no curso de Ciências Biológicas
Bacharelado da Universidade do Extremo Sul
Catarinense, UNESC, com Linha de Pesquisa
em Genética.
Criciúma, 18 de novembro de 2008.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcos M.da Silva Paula.- (UNESC)
Prof. Dr Jairo José Zocche (UNESC)
Profª. Espª Maria Júlia F. Corrêa Angeloni - (UNESC)
4
A minha mãe, Terezinha, por sempre ser
para mim um exemplo de honestidade,
coragem e perseverança.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida, e por mais esta conquista.
A minha família, pelo carinho, apoio e compreensão.
Ao professor Marcos pela confiança depositada em mim na realização deste
trabalho.
A professora Vanessa, pela orientação nos trabalhos com o ensaio cometa.
A professora Carina pelos anos de orientação em minha iniciação científica, e
pela transmissão de valores pautados na ética, seriedade e responsabilidade.
As amigas Leandra e Daniela pela ajuda indispensável na realização deste
trabalho.
Aos colegas e amigos do Labim e do Neurolab, pelos momentos de alegria e
descontração.
Aos amigos do curso de Ciências Biológicas Bacharelado pelos anos de
convívio, amizades e descobertas.
A todos que de alguma forma contribuíram para que eu pudesse trilhar mais
esta jornada.
6
“A coisa mais bela que podemos vivenciar é
o mistério. Ele é fonte fundamental de toda
verdadeira arte e de toda ciência. Aquele
que não o conhece e não mais se maravilha,
paralisado em êxtase, é como se estivesse
morto: seus olhos estão fechados.”
Albert Einstein
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RESUMO
A mineração de carvão a céu aberto é uma atividade potencialmente poluidora que
provoca diversos danos ao meio ambiente. Em áreas onde são depositados rejeitos
de carvão pode ocorrer a drenagem ácida de minas, fenômeno responsável pela
liberação dos metais pesados presentes no carvão e seus rejeitos. Estes metais
quando dispostos no solo podem ser absorvidos por plantas que ocorrem nessas
regiões. Baccharis trimera, conhecida popularmente como carqueja, é utilizada pela
população em geral na forma de chá, para o tratamento de várias doenças. Esta
espécie caracteriza-se por ser uma planta pioneira muito freqüente em áreas
degradadas pelo carvão. Desse modo, ela pode servir como fonte de contaminação
por metais pesados para populações que habitam regiões próximas à áreas
degradadas pela mineração de carvão. O objetivo do presente trabalho é avaliar a
genotoxicidade de Baccharis trimera de ocorrência em áreas degradadas pela
mineração de carvão a céu aberto. Para isso foram administrados o extrato
hidroalcoólico e o decocto dessa planta em camundongos. A genotoxicidade destes
compostos foi avaliada através do ensaio cometa em células sanguíneas e
hepáticas de camundongos. O resultados indicam que o extrato hidroalcoólico causa
genotoxicidade em células hepáticas de camundongos, já o decocto induziu
genotoxicidade tanto em células do tecido sanguíneo quanto em células do fígado.
Portanto, a utilização de Baccharis trimera, de ocorrência em solo degradado pela
mineração de carvão à céu aberto, pode provocar a produção de danos ao DNA em
populações humanas.
Palavras-chave: Baccharis trimera, genotoxicidade, metais pesados.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Seções transversais típicas de pilhas de rejeito (com e sem vegetação
espontânea). (Fonte: ALEXANDRE, 1999)............................................................13
Figura 2: Componentes principais da dinâmica dos metais pesados no sistema
solo-planta (adaptado de ALOWAY, 1990)............................................................14
Figura 3: Plantas de Baccharis trimera (Less.) DC. em estado vegetativo (A) e
reprodutivo (B); ramo com inflorescência (C) e detalhe dos frutos maduros (D).
(Fonte: CARREIRA, 2007).....................................................................................19
Figura 4 (Vista aérea da área de estudo. A, área degradada; B, Ponto Branco)
(Fonte Google Maps, 2008). ..................................................................................20
Figura 5: Etapas experimentais do Teste Cometa da coleta das células a leitura
em microscópio óptico Fonte: do autor..................................................................23
Figura 6: Teste Cometa.. .......................................................................................24
Figura 7: Índice de danos (ID) em células sanguíneas de camundongos tratados
com extrato hidroalcoólico de Baccharis trimera.. .................................................26
Figura 8: Índice de danos (ID) em células sanguíneas de camundongos tratados
com decocto de Baccharis trimera.........................................................................26
Figura 9: Índice de danos em células hepáticas de camundongos tratados com
extrato hidroalcoólico de Baccharis trimera. ..........................................................28
Figura 10: Índice de danos em células hepáticas de camundongos tratados com
decocto de Baccharis trimera. ...............................................................................28
Figura 11: Principais mecanismos de genotoxicidade e mutagenicidade induzida
por metais. (adaptado de BEYERSMANN; HARTWIG, 2008). .............................30
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Índice (ID) e freqüência de dano (FD) ao DNA, em células sanguíneas
de camundongos expostos à diferentes metodologias de preparação da Baccharis
trimera....................................................................................................................25
Tabela 2 - Índice (ID) e freqüência de dano (FD) ao DNA, em células hepáticas de
camundongos expostos à diferentes metodologias de preparação de Baccharis
trimera....................................................................................................................27
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................12
2 OBJETIVOS .......................................................................................................19
2.1 Objetivo geral.................................................................................................19
2.2 Objetivos específicos ....................................................................................19
3 DESCRIÇÃO DA PLANTA UTILIZADA.............................................................20
4 CARACTERIZAÇÃO GERAL DA ÁREA ...........................................................21
5 METODOLOGIA.................................................................................................22
5.1 Coleta do material vegetal ............................................................................22
5.2 Preparação do extrato e decocto .................................................................22
5.3 Animais...........................................................................................................22
5.4 Procedimento experimental..........................................................................23
5.5 Teste cometa..................................................................................................23
5.6 Análise estatística .........................................................................................25
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................26
7 CONCLUSÃO.....................................................................................................34
REFERÊNCIAS .....................................................................................................35
11
1 INTRODUÇÃO
A mineração é uma das atividades humanas que mais contribuem para a
alteração da superfície terrestre, afetando tanto o ambiente interno, como o externo,
provocando expressivos impactos sobre a água, o ar, o solo, o subsolo e a paisagem
como um todo (NAPPO, 1999).
No Brasil a descoberta do carvão ocorreu nos três estados do Sul, mas foi
em Santa Catarina que esta descoberta provocou profundas modificações no
ambiente (MARTINS, 2005).
O início das atividades de produção de carvão mineral no sudeste de
Santa Catarina deu-se nos primeiros anos do século XX e intensificou-se, sobretudo
a partir da década de 40, com a criação da CSN - Companhia Siderúrgica Nacional
(SOARES; TRINDADE, 2002).
O carvão de Santa Catarina se destaca por ser o único encontrado na
região Sul do Brasil que é coqueificável (pode ser usado para produção de aço),
além de servir como fonte de energia para usinas termoelétricas. Enquanto que o
carvão encontrado nos outros estados presta-se somente para a produção de
termoeletricidade (MARTINS, 2005).
Apesar de importante recurso energético, a extração, o beneficiamento e
a utilização de carvão mineral são atividades potencialmente poluidoras (GAIVIZZO;
VIDOR; TEDESCO, 2000).
Podem ser associadas a essas atividades as seguintes alterações:
desmatamento; alteração da superfície topográfica e da paisagem; perda ou
destruição de solos superficiais férteis; instabilização de encostas e terrenos em
geral; alteração de corpos de água e de níveis freáticos e exposição de áreas aos
fenômenos de dinâmica superficial, como erosão e assoreamento (KOPEZINSKI,
2000). A mineração de carvão gera também inúmeros rejeitos (30 a 60% do material
minerado), o que resulta na produção de grandes volumes constituídos basicamente
de matérias carbonosos e minerais (pirita e argilominerais) (GAIVIZZO; VIDOR;
TEDESCO, 2000; SOARES; SOUZA, 2008).
De acordo com Laus et al (2006) a mineração de carvão, além de
promover a exposição de grandes áreas por meio dos processos de lavra, gera uma
quantidade de rejeitos depositados em pilhas ou barragens próximas às áreas
12
mineradas. Estes depósitos, ricos em sulfetos, podem tornar-se fontes geradoras da
drenagem ácida de minas (DAM).
Para Daniels (1996 apud GAIVIZZO et al., 2002), a ocorrência de DAM
constitui-se no principal impacto das áreas de exploração mineral ao ambiente.
A DAM ocorre em áreas mineradas a céu aberto onde os compostos
sulfurados encontram-se principalmente na forma de pirita (FeS2) e outros sulfetos,
cuja exposição às condições oxidantes do meio é responsável pela formação de
grande quantidade de ácido sulfúrico (GAIVIZZO et al., 2002). Em períodos de
intensa precipitação pluviométrica, a água de escorrimento superficial ou a percolada
através do rejeito possui baixo pH, elevados teores de ferro, sulfatos e,
freqüentemente, concentrações elevadas de metais pesados (GALATTO et al., 2007;
SOARES; TRINDADE, 2002; SPOTTS; DOLLHOPF, 1992).
O grupo dos metais pesados também chamados de metais-traço, é
constituído por alguns metais que são considerados essênciais do ponto de vista
biológico, em percentagem muito pequena, tornado-se mais ou menos tóxicos em
percentagens mais elevadas (PRONCHOW; PORTO, 2000), podendo causar
impactos negativos a ecossistemas terrestres e aquáticos, constituindo-se, assim,
em contaminantes ou poluentes de solo e água (GUILHERME et al., 2005).
A DAM pode provocar a liberação de diversos íons metálicos dissolvidos
(Arsênio - As, Cádmio - Cd, Cobre - Cu, Níquel - Ni, Chumbo - Pb, Zinco - Zn, etc),
em composições e concentrações que dependem de condições geológicas
específicas (FUNGARO; IZIDORO, 2006).
Para se ter acesso à camada de carvão, na mineração a céu aberto, há a
necessidade de remover a cobertura vegetal, o solo orgânico e a camada de
estéreis (BARTH, 1989 apud ZOCCHE-DE-SOUZA; COSTA; ZOCCHE, 2007), o que
resulta na formação de uma paisagem constituída por pilhas de materiais piríticos e
carbonosos dispostos em corpos cônicos. Em algumas dessas áreas, partes do solo
ou da argila ficam por cima dos estéreis propiciando espontaneamente o retorno da
vegetação depois de passadas algumas décadas da mineração (Figura 1)
(ALEXANDRE, 1999).
Para Taylor et al (1992), Vários fatores de natureza física e química do
rejeito carbonífero limitam o estabelecimento vegetal, restringindo a reabilitação das
áreas de mineração. A DAM promove a solubilização de íons em níveis tóxicos para
13
as plantas, inibindo o crescimento de raízes e reduzindo o número de
microrganismos fixadores de nitrogênio.
Contudo, a vegetação espontânea que ocorre nestas áreas, é
caracterizada por crescer em locais inóspitos, apresentar dispersão de sementes
principalmente do tipo anemocoria, alta capacidade reprodutiva, resistência a
controle químico e grandes populações ocupando extensas áreas (CHAVES, 2003).
Figura 1: Seções transversais típicas de pilhas de rejeito (com e sem vegetação espontânea). (Fonte:
ALEXANDRE, 1999).
A maioria das espécies vegetais que crescem em solos contaminados por
metais pesados não consegue evitar a absorção desses elementos, mas somente
limitar sua translocação (SOARES, et al., 2001).
Isto ocorre principalmente porque durante os primeiros estádios da
revegetação, a comunidade de plantas extrai grandes quantidades de nutrientes do
solo. Este processo continua até a construção de uma reserva orgânica, com a qual
a absorção de nutrientes pelas plantas passa a depender dos processos de
decomposição da cobertura e mineralização dos nutrientes, principalmente o
Nitrogênio e o Fósforo (GAIVIZZO et al., 2002).
O sistema solo-planta é um sistema aberto, onde geralmente o teor e o
acúmulo de metais nos tecidos depende de fatores tais como: o tipo de metal e sua
disponibilidade na solução do solo; o movimento do metal no solo e na superfície
das raízes; o transporte destes da rizosfera para a raiz e a translocação dos mesmos
14
para
o
restante
da
planta
(Figura
2) (ALOWAY,
1990; GUSSARSSON;
ADALSTEINSSON; ASP, 1995).
Solo
Planta
Perda de compostos
voláteis
Folhas
Absorção de organominerais
Biomassa
e colóides
microrganismos
Sementes
Caule
Solução no solo
Erosão
Íons e complexos
RIZOSFERA
metálicos
Captação
Raiz
Xilema
Complexos
COPRECIPITAÇÃO
Com o húmus
Hidróxido de Fe, Mn, Al
Armazenamento
na raiz
Óxidos e Carbonatos
Lixiviação
CONTAMINAÇÃO
Figura 2: Componentes principais da dinâmica dos metais pesados no sistema solo-planta (adaptado
de ALOWAY, 1990).
Além disso, espécies ou variedades de uma mesma espécie vegetal,
expostas a uma concentração similar de metais pesados, podem diferir na absorção
e/ou distribuição interna desses na planta. Isso pode resultar em diferenças na
capacidade de retenção do elemento absorvido nas raízes, e/ou variação na carga
no xilema (GUSSARSSON; ADALSTEINSSON; ASP, 1995; SHAW, 1989). Os
metais podem ainda, induzir alterações na diferenciação do próprio sistema vascular,
uma vez que, em concentrações menores, alcançam as folhas, podendo alterar a
estrutura e a funcionalidade das células fotossintéticas (SOARES, et al., 2001).
A espécie Baccharis trimera (Less.) DC. conhecida popularmente por
carqueja, ocorre espontaneamente em áreas mineradas a céu aberto na região
carbonífera catarinense (CITADINI-ZANETTE; BOFF, 1992).
As plantas de Baccharis trimera são amplamente utilizadas no Brasil, em
medicina popular, hábito herdado de indígenas que há séculos as utilizavam para o
tratamento de várias doenças (LORENZI; MATOS, 2002). Popularmente a Baccharis
trimera é utilizada na forma de chás com indicações para males do estômago,
fígado, anemia, inflamações, diabetes, doenças na próstata, controle do colesterol,
emagrecedor, hipertensão, sendo também descrita como remédio para o processo
15
de
desintoxicação
do
organismo
(PEREIRA,
2006;
VERDI;
BRIGHENTE;
PIZZOLATTI, 2005;).
Dentre os componentes químicos de Baccharis trimera descritos estão
lactonas diterpênicas, sesquiterpenos, flavonóides, saponinas, taninos, polifenóis e
os seguintes óleos essenciais: acetato de carquejol, nopineno, calameno, α e
cardieno, eledol, eudesmol, sendo que o carquejol e os flavonóides são
considerados os principais constituintes ativos (SIMÕES, 1998).
Diversas das capacidades farmacêuticas da Baccharis trimera já foram
comprovadas e inúmeros trabalhos. A atividade hepatoprotetora foi relatada por
Soicke e Leng-Preschlow (1987), sendo que o flavonóide hispidulina demonstrou ser
o mais eficaz. Gené et al (1996), demonstrou que o flavonóide rutina, juntamente
com uma mistura de saponinas, obtidos através do extrato aquoso e B trimera, têm
atividade antiinflamatória e analgésica. A atividade antimutagênica in vitro da planta
foi atribuída aos flavonóides luteonina, apigenina, cirsimaritina, e hispidulina
(NAKASUGI; KOMAI, 1998).
Além
disso,
já
foram
atribuídos
a
Baccharis
trimera
atividade
antimicrobiana (AVANCINI et al., 2000), relaxante muscular (TORRES et al., 2000),
anti-artrítico hipoglicemiante e redutor de colesterol (COELHO et al., 2004), Januário
et al (2004) identificou um diterpenóide com atividade antiofídica demonstrando
propriedades anti-hemorrágica, antiproteolítica, antimiotóxica e atidematogênica. Por
todas estas razões a Baccharis trimera é uma das plantas medicinais mais utilizada
no Brasil (SIMÕES, 1998; VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005). Contudo devese atentar ao fato de que a Baccharis trimera bem como outras plantas que se
desenvolvem em áreas de mineradas pelo carvão e, que são utilizadas como
medicinais podem oferecer a oportunidade para o acúmulo de metais pesados nos
tecidos humanos (ZOCCHE-DE-SOUZA; COSTA; ZOCCHE, 2007).
Os autores supracitados atentam para o fato da Baccharis trimera, ter o
comportamento de uma espécie concentradora de metais, mesmo em solos com
baixa disponibilidade dos mesmos. E enfatizam que pela mesma ser uma espécie
medicinal, esta deve ser monitorada com cuidado, a fim de verificar se não causará
danos à saúde humana ou se não estará contribuindo para o aumento da
concentração de elementos tóxicos ao longo da cadeia alimentar.
16
No presente trabalho, o extrato hidroalcoólico e o dococto de Baccharis
trimera foram previamente empregados por Constantino (2007) para avaliar os níveis
dos metais chumbo, cobre e zinco na planta.
O chumbo, quando liberado, persiste no ambiente por um longo período
se comparado com outros metais. Como resultado, os compostos contendo Pb são
acumulados no solo e permanecem passíveis de serem absorvidos por plantas e
animais por muito tempo (ALOWAY, 1990). No entanto, este metal não possui
nenhuma função fisiológica conhecida no organismo, e seus efeitos tóxicos sobre os
homens e animais já são conhecidos há muito tempo por afetarem praticamente
todos os órgãos e sistemas do corpo humano (MOREIRA; MOREIRA, 2004).
O sítio primário de armazenamento de Pb no organismo é o osso, contudo
a toxicidade está relacionada principalmente aos sistemas nervoso e hematopoiético
(sangue e tecidos moles - rins, medula óssea, fígado e cérebro), podendo ocorrer
efeitos renais, cardiovasculares e na reprodução. Nos casos de intoxicação crônica,
o chumbo pode provocar a doença conhecida como saturnismo, caracterizada
principalmente por forte anemia e retardo mental (ALOWAY, 1990; ASTDR, 2006;
MOREIRA; MOREIRA, 2004).
O Cobre é um elemento essencial importante para plantas e animais,
sendo encontrado em uma variedade de células e tecidos (ALOWAY, 1990;
GAETKE; CHOWB, 2003), atuando como co-fator com propriedades catalíticas para
um grande número de enzimas (GAETKE; CHOWB, 2003). Apesar de ser um
elemento essencial para os seres vivos, o acúmulo de Cu em animais pode provocar
cirrose hepática, necrose de túbulos renais e danos em outros órgãos (GAETKE;
CHOWB, 2003).
O Zinco é um elemento essencial para os animais e para a maioria das
plantas. Atua como um componente catalítico ou estrutural de numerosas enzimas
envolvidas no metabolismo energético na transcrição e tradução gênica, sendo
requerido para atividade de importantes enzimas tais como: deidrogênases,
isomerases e RNA e DNA polimerases (ALOWAY, 1990). Contudo, a ingestão
crônica de altos níveis de zinco por alguns meses pode causar anemia, e danos no
pâncreas e nos rins (ASTDR, 2005).
Efeitos adversos em sistemas biológicos, tais como genotoxicidade e
carcinogenicidade, têm sido atribuídos aos metais pesados (PARAÍBA et al., 2006).
A genotoxicidade está relacionada com o potencial que agentes físicos ou químicos
17
possuem em induzir mutações em células somáticas, ou aquelas que podem ser
transmitidas a gerações futuras (DA SILVA et al., 2003). Para avaliar estes danos à
carga genética foram criados vários testes que visam avaliar de diferentes maneiras
o resultado da interação destes agentes com o DNA. Entre eles destaca-se o teste
cometa que consiste em análise direta das células, quanto à freqüência de danos ao
DNA. O dano é verificado quando fragmentos do DNA migram do núcleo da célula.
Desse modo se obtém a informação de lesões que ocorrem in vivo. É uma técnica
rápida e sensível na quantificação de lesões e detecção de efeitos de reparo no
DNA em células de mamíferos (FAIRBAIRN et al., 1995; SINGH et al., 1988). Este
teste apresenta algumas vantagens sobre os testes bioquímicos e citogenéticos,
entre estas a necessidade de somente um pequeno número de células e de não ser
necessário células em divisão (FAUST et al., 2004; TICE et al., 2000).
A determinação de quebras simples no DNA através de eletroforese em
célula única ou ensaio cometa é útil para a detecção de efeitos de exposição a
mutágenos e carcinógenos (SALAMA et al., 1999).
No estudo do potencial mutagênico de um composto, os ensaios com
animais de laboratório oferecem grandes vantagens, especialmente a de reproduzir
as condições de exposição do homem (NUNES; TAJARA, 1998).
Desse modo devido aos inúmeros usos da Baccharis trimera como planta
medicinal, e o fato dessa ocorrer espontaneamente em áreas mineradas pelo carvão
a céu aberto, são necessários estudos para investigar uma possível genotoxicidade
em mamíferos, causada pelo uso da planta supostamente contaminada por metais
pesados.
18
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o possível dano ao DNA em fígado e sangue de camundongos
adultos tratados com Baccharis trimera (Less.) DC. de ocorrência espontânea em
solo degradado pela mineração de carvão a céu aberto em Treviso, Santa Catarina,
Brasil.
2.2 Objetivos específicos
•
Coletar amostras vegetais de Baccharis trimera (Less.) DC. de ocorrência
espontânea em solo degradado pela mineração de carvão a céu aberto e em
solo não degradado;
•
Preparar o extrato alcoólico e o decocto da parte aérea do material vegetal
seco;
•
Avaliar o possível dano ao DNA, através do ensaio Cometa, de tecido
hepático e sangüíneo de camundongos adultos tratados com extrato de
Baccharis trimera (Less.) DC. de ocorrência espontânea em solo degradado
pela mineração de carvão a céu aberto e em solo não degradado
19
3 DESCRIÇÃO DA PLANTA UTILIZADA
De acordo com Lorenzi e Matos (2002), a Baccharis trimera (Less.) DC. é
um subarbusto perene pertencente à família Asteraceae, ereto, muito ramificado na
base, com cerca de 50 cm de altura, nativa do sul e sudeste do Brasil. As folhas são
dispostas ao longo de caules e ramos com expansões aladas. Possui inflorescência
do tipo capítulo, disposta ao longo dos ramos de cor esbranquiçada. (Figura 3).
Conhecida popularmente como carqueja, carqueja-amargosa, carquejado-mato, carquejinha e tiririca-de-balaio, é uma das espécies melhor estudadas em
termos botânicos, químicos e farmacológicos, apresentando elevado valor sócioeconômico, com ampla dispersão nos estados de Santa Catarina, Paraná, São
Paulo e Rio Grande do Sul (LORENZI; MATOS, 2002).
Figura 3: Plantas de Baccharis trimera (Less.) DC. em estado vegetativo (A) e reprodutivo (B); ramo
com inflorescência (C) e detalhe dos frutos maduros (D). (Fonte: CARREIRA, 2007).
20
4 CARACTERIZAÇÃO GERAL DA ÁREA
A área de estudo está situada entre as seguintes coordenadas
geográficas: Área degradada, 28° 32' 0.03" latitude Sul e 49° 26' 18" longitude Oeste
(Figura 4A); Ponto branco, 28° 31' 45" latitude Sul e 49° 26' 18" longitude Oeste
(Figura 4B), junto ao Campo Morozini, no Município de Treviso, Santa Catarina,
Brasil. Segundo o sistema de classificação de Köppen, o clima predominante na
região é mesotérmico úmido com versões quentes (Cfa), registrando temperaturas
médias anuais que variam entre 18ºC e 19ºC (SANTA CATARINA, 1991).
A área minerada sofreu processo de mineração de carvão a céu aberto
entre os anos de 1982 e 1989, com o uso da dragline Marion, sendo que após o
término da mineração essa área recebeu apenas nivelamento do substrato. O solo
foi caracterizado como sendo de área degradada, fraco-arenoso e arenoso, com
presença de arenitos pirito-carbonosos e depósitos de argilas sobre o rejeito de
carvão (SANTO; LOPES, 2003).
B
A
Figura 4 (Vista aérea da área de estudo. A, área degradada; B, Ponto Branco) (Fonte Google Maps,
2008).
21
5 METODOLOGIA
5.1 Coleta do material vegetal
Foram coletadas amostras de Baccharis trimera (Less.) DC. em cada área
de estudo (minerada e não minerada), acondicionadas em sacos plásticos
devidamente identificados. A planta foi encaminhada ao herbário Pe. Dr. Raulino
Reitz da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC) para confirmação
taxonômica.
5.2 Preparação do extrato e decocto
Para obtenção do extrato a parte aérea da planta foi seca em estufa
durante sete dias, com temperatura entre 30 e 40º C. Após a secagem este material
foi triturado, extraído com metanol 70% e filtrado após 48h. O resíduo de planta foi
re-extraído com adição de metanol 70%, e depois de 24h foi filtrado novamente. Os
filtrados foram evaporados à pressão reduzida e temperatura de 45ºC para
eliminação do metanol, e os mesmos foram mantidos em garrafas estéreis em
condições refrigeradas até o seu uso (BETONI, et al., 2006).
O decocto da planta foi produzido segundo a Farmacopéia brasileira
(1959), fervendo-se 5g da planta seca e triturada em 50mL de água destilada estéril
durante 15 minutos. Em seguida o volume inicial de água foi reposto e o decocto
filtrado pronto para uso.
5.3 Animais
Os animais utilizados para este experimento foram camundongos CF-1
adultos, machos, com 2 a 3 meses de idade, armazenados em gaiolas plásticas,
mantidos em temperatura de 22ºC ± 1ºC em um ciclo claro/escuro de 12h/12h (6h –
18h) com acesso livre para comida e água. O trabalho foi realizado após aprovação
pelo comitê de ética em pesquisa da Universidade do Extremo Sul Catarinense.
22
5.4 Procedimento experimental
Os animais foram divididos em três grupos: controle – recebeu apenas
solução salina (NaCl 0,9g%); grupo 1 – recebeu o extrato ou o decocto da planta de
solo não degradado; e grupo 2 – recebeu o extrato ou decocto da planta de solo
degradado pela mineração. Cada tratamento foi administrado para um grupo
composto de cinco indivíduos, duas vezes ao dia durante sete dias, com o extrato
alcoólico de Baccharis trimera em uma dose de 100µL/25g de peso corporal, ou
decocto na dose de 500µL/25g de peso corporal por gavagem (via oral), para manter
a concentração de 500mg/mL (OLIVEIRA, et al., 2005). Os animais foram
manipulados de maneira que tivessem o mínimo de sofrimento possível, conforme
recomendação do Comitê de Ética da UNESC.
5.5 Teste cometa
Duas horas após a última administração do extrato alcoólico ou decocto
de Baccharis trimera. Coletou-se o sangue da cauda de cada camundongo 10uL, em
seguida os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, o fígado foi
imediatamente retirado e fracionado. Um protocolo padrão para a preparação e
análises do teste cometa foi adotado (TICE et al., 2000).
Uma pequena porção do fígado foi lavada em tampão PBS com auxílio de
uma pipeta de 1000 L, por meio de um movimento de sobe e desce.
Os esfregaços foram preparados pela mistura de 5µL de sangue com
95µL de agarose LMP (0,75%) ou 20µL de fígado com 80µL agarose LMP (0,75%)
Essa mistura foi colocada em lâmina de microscópico pré-revestida com cobertura
de 300 L de agarose normal a 1,5%, logo em seguida, foi coberta com uma
lamínula. Depois da solidificação em geladeira por aproximadamente 5 minutos, as
lamínulas foram cuidadosamente retiradas e as lâminas foram imersas em tampão
de lise (2,5M NaCl, 100mM EDTA e 10mM Tris, pH 10,0-10,5), por no mínimo 1 hora
até duas semanas em 4°C, com adição de Triton X – 100 1% e dimetil sulfóxido
(DMSO) 10% na hora do uso. Subseqüentemente, as lâminas foram incubadas em
tampão alcalino (NaOH 300mM e EDTA 1mM, pH>13) por 20 minutos. A corrida
eletroforética foi realizada por mais 15 minutos, a 25 volts e 300mA. Todas essas
23
etapas foram realizadas sob luz indireta. Em seguida as lâminas foram neutralizadas
com Tris 0,4M (pH 7,5). Finalmente, o DNA foi corado com uma solução com prata
(5% carbonato de sódio, mais uma solução de 0,1% nitrato de amônia, 0,1% de
nitrato de prata, 0,25% de ácido tungstosílico e 0,15% de formaldeído) (Figura 4)
Coletar
sangue ou
fígado
Misturar
agarose LMP
Depositar sobre
lâminas previamente
cobertas com agarose
normal
solução
de lise
molho em
tampão
alcalino
eletroforese
análise em microscópio
óptico
corar com nitrato de
prata
neutralização
Figura 5: Etapas experimentais do Teste Cometa da coleta das células a leitura em microscópio
óptico. Fonte do autor.
As lâminas coradas foram analisadas em microscópio óptico com
aumento de 400x. As células foram avaliadas visualmente e identificadas como, de
zero (sem danos) a quatro (dano máximo), de acordo com o tamanho e a forma da
cauda (figura 5), resultando em um índice de dano único contado para cada célula
e,conseqüentemente, para cada grupo. O índice de danos dos grupos pode variar de
zero (todas as células sem caudas, 100 células x 0) a 400 (100 x 4; 100 células
observadas com dano máximo) (COLLINS, et al., 1997).
24
Figura 6: Teste Cometa. A = dano 0; B = dano 1; C = dano 2; D = dano 3; E = dano 4; e F = apoptose.
Fonte: DA SILVA et al., 2000.
5.6 Análise estatística
As análises estatísticas foram executadas usando o programa “Statistical
Product and Service Solutions” versão 15.0 (SPSS). Os resultados foram
apresentados como média e desvio padrão e diferenças entre os grupos
experimentais para o índice de dano ao DNA foram avaliadas por uma via (ANOVA),
seguido pelo teste de Duncan quando ANOVA foi significante. Em todos os
experimentos, foram considerados significativos p < 0,05.
25
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Muitos contaminantes presentes em nosso ambiente afetam os
organismos de forma direta e rápida, podendo causar distúrbios fisiológicos e/ou
desenvolvimento anormal. Alguns destes agentes exógenos também afetam o DNA
dos organismos induzindo tumores e/ou mutações genéticas (LIN, 1990).
A tabela 1 apresenta os valores médios e desvio padrão da
genotoxicidade observada em células sanguíneas de camundongos tratados com
diferentes metodologias de preparação de Baccharis trimera. Os parâmetros de
dano avaliados pelo Ensaio Cometa foram o índice (ID) e freqüência de danos (FD).
Os índices de danos às células também estão representados graficamente nas
figuras 7 e 8.
Tabela 1- Índice (ID) e freqüência de dano (FD) ao DNA, em células sanguíneas de
camundongos expostos à diferentes metodologias de preparação da Baccharis
trimera.
Grupos
ID
FD
Salina
10,5 ± 8,58
6,5 ± 4,73
Extrato Ponto Branco
3,2 ± 3,03
2,4 ± 2,61
Extrato Área Degradada
3,4 ± 3,29
2,4 ± 2,19
Decocto Ponto branco
5,67± 9,81
5,33 ± 9,24
145,54 ± 1,90a
52,75 ± 13,52a
Decocto Área Degradada
a
Diferente significativamente de todos os grupos (p < 0,05, ANOVA de uma via seguido pelo teste de
Duncan).
Nas
células
sanguíneas
de
camundongos
tratados
com
extrato
hidroalcóolico de Baccharis trimera, não houve diferença significativa no índice e na
freqüência de danos, tanto no extrato da planta obtida de área degradada, quanto no
extrato da planta do ponto branco (Tabela 1 e Figura 7).
Já, no tratamento com o decocto de Baccharis trimera houve um aumento
significativo (p < 0,05), no índice e na freqüência de danos em células sanguíneas
de camundongos que receberam o decocto de plantas provenientes da área
degradada (Tabela 1 e Figura 8).
26
Índice de danos (0-400)
Média ID Sangue
25
20
15
10
5
0
Salina
Extrato Ponto
Branco
Extrato Área
Degradada
Figura 7: Índice de danos (ID) em células sanguíneas de camundongos tratados com extrato
hidroalcoólico de Baccharis trimera. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão da
média de amostras coletadas de 4-5 animais.
Média ID Sangue
Índice de danos (0-400)
200
*
150
100
50
0
Salina
-50
Decocto Ponto Decocto Área
Branco
Degradada
Figura 8: Índice de danos (ID) em células sanguíneas de camundongos tratados com decocto de
Baccharis trimera. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão da média de amostras
coletadas de 4-5 animais.
* Diferença significativa quando comparado com os demais grupos (p < 0,05 ANOVA de uma via
seguido pelo teste de Duncan.
Essa diferença entre as análises a partir dos dois tratamentos (decocto ou
extrato hidroalcoólico) pode ser atribuída ao fato da metodologia de extração por
metanol ser capaz de retirar uma variedade maior de substâncias ativas se
comparada com a decocção (FALKENBERG; DOS SANTOS; SIMÕES, 2003).
Possivelmente,
os
atributos
terapêuticos
da
Baccharis
trimera
seriam
potencializados pelo processo de extração por metanol, o que poderia ser uma
27
possível causa de impedimento da genotoxicidade em células sanguíneas de
camundongos pelo uso do extrato da planta.
A partir de Baccharis trimera, foram isolados do extrato metanólico das
folhas, quatro flavonóides: 5,4’-diidroxi-7-metoxiflavona (genkwanina), 5,4’-diidroxi6,7-dimetoxiflavona (cirsimaritina), 5,7,4’-triidroxi-6-metoxiflavona (hispidulina) e
5,7,4’-triidroxiflavona
(apigenina).
Estes
compostos
apresentaram
atividade
antimutagênica, mostrando que tais flavonas são substâncias de alto potencial para
esta
atividade
da
Baccharis
trimera
(NAKASUGI;
KOMAI,
1998;
VERDI;
BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005).
A tabela 2 apresenta os valores médios e desvio padrão da
genotoxicidade à células hepáticas de camundongos tratados com diferentes
metodologias de preparação de Baccharis trimera, para os ambos os parâmetros do
Ensaio Cometa, Os parâmetros de dano avaliados pelo Ensaio Cometa foram o
índice (ID) e freqüência de danos (FD). Os índices de danos às células também
estão representados graficamente nas figuras 9 e 10
Tabela 2 - Índice (ID) e freqüência de dano (FD) ao DNA, em células hepáticas de
camundongos expostos à diferentes metodologias de preparação de Baccharis
trimera.
Grupos
ID
FD
Salina
21,25 ± 15,11
13,25 ± 7,14
Extrato Ponto Branco
19,75 ± 9,22
9 ± 2,16
Extrato Área Degradada
150,75 ± 41,80b
72 ± 12,68b
Decocto Ponto Branco
126,6 ± 34,72b
45,8 ± 25,11b
232,25 ± 108,64a
75,5 ± 20,47a
Decocto Área Degradada
a
Diferente significativamente de todos os grupos (p < 0,05, ANOVA de uma via seguido pelo teste de
Duncan).
b
Diferente significativamente de grupo salina e do extrato Ponto Branco (p < 0,05, ANOVA de uma via
seguido pelo teste de Duncan).
Na avaliação do índice e da freqüência de danos ao DNA, em células
hepáticas de camundongos tratados com o extrato hidroalcoólico de Baccharis
trimera foi encontrada diferença significativa (p < 0,05) entre os animais que
receberam o extrato hidroalcoólico de Baccharis trimera da área degradada e do
grupo de animais tratados com o extrato da planta obtida do ponto branco (Tabela 2
e Figura 9).
28
Ambos os grupos tratados com o decocto de Baccharis trimera diferiram
significativamente quando comparados com o grupo salina (p < 0,05), quanto ao
índice e a freqüência de danos ao DNA em células do fígado de camundongos. No
grupo de animais que recebeu o decocto proveniente da área degrada, também
houve diferença significativa em relação ao grupo de animais tratados com o decocto
de Baccharis trimera do ponto branco (p < 0,05) (Tabela 2, Figura 10).
Índice de danos (0-400)
Média ID Fígado
250
*
200
150
100
50
0
Salina
Extrato Ponto
Branco
Extrato Área
Degradada
Figura 9: Índice de danos em células hepáticas de camundongos tratados com extrato hidroalcoólico
de Baccharis trimera. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão da média de amostras
coletadas de 4-5 animais.
* Diferença significativa quando comparado com os outros grupos (p < 0,05, ANOVA de uma via
seguido pelo teste de Duncan).
Índice de danos (0-400)
Média ID Fígado
400
350
#
**
300
250
200
150
*
100
50
0
Salina
Decocto Ponto Decocto Área
Branco
Degradada
Figura 10: Índice de danos em células hepáticas de camundongos tratados com decocto de Baccharis
trimera. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão da média de amostras coletadas de
4-5 animais.
* Diferença significativa quando comparado com o grupo salina (p < 0,05, ANOVA de uma via seguido
#
pelo teste de Duncan). Diferença significativa quando comparado com os outros grupos (p < 0,05,
ANOVA de uma via seguido pelo teste de Duncan).
29
Apesar do extrato hidroalcoólico não ter induzido danos ao DNA em
células sanguíneas de camundongos (Figura 7), ocorreu genotoxicidade nas células
hepáticas destes animais (Figura 9). Isto pode estar relacionado à característica
peculiar do fígado em ser o centro da biotransformação de xenobióticos (compostos
químicos estranhos a um organismo) (RAMSDORF, 2007).
O sangue transporta os nutrientes absorvidos até o fígado para filtragem e
processamento adicional. O fígado metaboliza muitos compostos de forma tão
extensiva que apenas uma pequena quantidade do composto original inalterado
entra na circulação sistêmica. Quando isto ocorre, uma quantidade reduzida do
composto alcança o tecido desejado, tais como as paredes das veias e artérias ou
as próprias células sangüíneas (HORST, 2007). Assim, a partir do presente estudo,
os possíveis impactos deletérios do extrato hidroalcoólico e decocto de Baccharis
trimera de ocorrência em solo degradado pela mineração de carvão estariam sendo
mais atuantes no fígado.
A hepatogenotoxicidade apresenta características semelhantes em
roedores e em humanos. Algumas alterações comuns são a hipometilação do DNA,
que levaria ao aumento de expressão de genes reguladores de sinais mitogênicos,
como os observados em células tumorais, e ainda, mudanças nos genes
supressores de tumor e a desregulação de genes controladores do ciclo celular
(HORST, 2007).
A ocorrência de dano ao DNA em células hepáticas de camundongos
tratados com o decocto de Baccharis trimera do ponto branco (Figura 10), pode ter
sido influenciada por fatores como: a função do fígado no metabolismo primário dos
xenobióticos ingeridos, o fato da metodologia de extração por decocção não ser tão
eficiente para a retirada das substâncias ativas da planta quanto a extração por
metanol, e a área de coleta definida como ponto branco não estar completamente
isolada da área degradada (Figura 4).
Em estudo prévio valores aumentados de Pb, Cu, e Zn foram encontrados
no extrato hidroalcoólico e decocto de Baccharis trimera de ocorrência em solo
degradado pela mineração de carvão a céu aberto em Treviso, Santa Catarina
(Constantino, 2007), o que indica que neste ambiente a Baccharis trimera pode atuar
30
como uma espécie concentradora de metais (ZOCCHE-DE-SOUZA; COSTA;
ZOCCHE, 2007).
O acúmulo de metais pesados e outros poluentes por organismos, pode
ter efeito bastante abrangente, já que possibilita o transporte dos contaminantes nos
diversos níveis tróficos da cadeia alimentar de tal forma que os predadores
apresentam as maiores concentrações, ou seja, este efeito culmina com a
ocorrência das maiores taxas de contaminação nos níveis mais altos da cadeia
alimentar (consumidores secundários e terciários) (BROWN, 1975). Nestes
organismos, os principais mecanismos relacionados com a genotoxicidade
provocada por metais pesados são: o estresse oxidativo, a inibição do sistema de
reparo, a ativação da sinalização mitótica e mudanças na modulação dos genes
(BEYERSMANN; HARTWIG, 2008) (Figura 11).
Inibição do
reparo ao
DNA
Compostos
metálicos
•Diminuição
da
estabilidade
genômica
Inibição de
defesas
antioxidantes
•Estresse
Oxidativo
Ativação da
sinalização
mitótica
•Indução de
procongeneses
Modulação da
expressão do
gene
•Inativação
de
genes
supressores
de tumor
•Acúmulo de
mutações
críticas
•Desregulação
da proliferação
celular
Desenvolvimento
de tumor.
Figura 11: Principais mecanismos de genotoxicidade e mutagenicidade induzida por metais.
(adaptado de BEYERSMANN; HARTWIG, 2008).
Em um estudo recente, Constantino (2007) não encontrou dano oxidativo
em células hepáticas de camundongos tratados com decocto e extrato hidroalcoólico
de Baccharis trimera oriunda de uma área de mineração de carvão a céu aberto.
Contudo, no presente trabalho, se observou dano ao DNA nas células hepáticas e
sanguíneas de animais tratados com o decocto ou extrato hidroalcoólico de plantas
provenientes desta área. Podemos considerar que os metais presentes nos extratos
31
da planta de área degradada poderiam causar alterações celulares tais como a
inibição do sistema de reparo e/ou mudanças na expressão gênica.
Hashimoto et al (2007) expõe que o DNA é continuamente exposto a
danos, tanto de forma direta quanto indireta, todavia existem mecanismos de reparo
para manter a sua integridade. Porém, quando o sistema de reparo não é suficiente,
o dano é cumulativo. Defeitos no sistema de reparo de dano ao DNA têm sido
associados
a
muitas
patologias,
tais
como
câncer,
imunodeficiência
e
neurodegeneração (EL-KHAMISY; CALDECOTT, 2006).
Os metais carcinogênicos são freqüentemente comutagênicos, ou seja,
aumentam a mutagenicidade do outros agentes genotóxicos. Muitos compostos
metálicos em baixas concentrações têm sido identificados como inibidores de reparo
aos danos causados ao DNA, quer seja por agentes xenobióticos ou por fatores
endógenos (BEYERSMANN; HARTWIG, 2008). A atuação dos metais na inibição do
sistema de reparo está relacionada com a interferência dos mesmos na ação de
importantes proteínas com função reparo. (GIAGINIS, GATZIDOU; THEOCHARIS,
2006).
Diversos estudos demonstraram que o chumbo em baixas concentrações
atua de maneira comutagênica, inibindo o sistema de reparo através de alterações
em enzimas de reparo (MCNEILL et al., 2007), ativando cascatas enzimáticas
relacionadas com a quebra de fitas duplas do DNA (GASTALDO et al., 2007) e
bloqueando a ligação de fatores de transcrição gênica com função de reparo ao
DNA (HANAS et al., 1999).
Verificou-se a relação do cobre com a indução de aberrações
cromossômicas em hepatócitos de ratos tratados com sulfato de cobre (SINA et al.,
1983), Bhunya e Jena (1996), observaram um efeito clastogênico (quebras
cromossômicas) do cobre em filhotes de Gallus domesticus.
Em Allium cepa a diminuição da atividade mitótica foi associada à poeira
de
carvão
contaminada
com
chumbo
cobre
e
zinco
(CHAKRABORTY;
MUKHERJEE; MUKHERJEE, 2008). Foi também encontrada uma correlação
positiva entre a concentração destes metais e a ocorrência de genotoxicidade em
Vicia Faba (FENG et al., 2007), Formigari (2007) demonstrou que concentrações
diferentes de Zinco podem bloquear ou acelerar processos de apoptose.
De acordo com dados apresentados no presente trabalho, pode-se
concluir que a absorção de metais pesados por camundongos que consumiram
32
preparados da Baccharis trimera, provoca danos ao DNA nas células sanguíneas e
hepáticas dos animais expostos ao decocto da planta e nas células hepáticas
daqueles expostos ao extrato hidroalcoólico da planta.
Os mecanismos de toxidade dos metais pesados não estão totalmente
elucidados (BEYERSMANN; HARTWIG, 2008), porém a ausência de danos
oxidativos demonstrados por Constantino (2007), indica que a genotoxicidade
observada no presente trabalho nas células sanguíneas e hepáticas pode estar
relacionada aos mecanismos de comutagenicidade através da inibição do sistema
de reparo ao DNA induzido por metais.
33
7 CONCLUSÃO
No presente trabalho demonstrou-se que administração do extrato
hidroalcoólico de Baccharis trimera de ocorrências em solo degradado pela
mineração de carvão a céu aberto não foi capaz de induzir genotoxicidade em
células sanguíneas de camundongos. Contudo, ocorreram danos significativos ao
DNA em células hepáticas desses animais.
Danos significativos ao DNA de células sanguíneas e hepáticas
decorrentes do uso do decocto da Baccharis trimera foram encontrados, um fato
preocupante uma vez que, a decocção é uma das formas mais comuns da utilização
de Baccharis trimera como planta medicinal pela população em geral.
Apesar da Baccharis trimera ser considerada como uma espécie
concentradora de metais, a hipótese da ocorrência de genotoxicidade induzida por
metais, via estresse oxidativo, foi descartada neste estudo. Porém os resultados do
presente trabalho indicam uma possível ação direta dos metais no DNA,
provavelmente, por meio da inibição do sistema de reparo das células.
Nesse sentido, deve-se tomar cuidado quanto à utilização de plantas
medicinais provenientes de áreas que foram degradadas pelo mineração de carvão,
já que estas plantas podem servir de rota para a acumulação de metais nos
organismos, podendo causar genotoxicidade. Por fim, mais estudos são necessários
para esclarecer os mecanismos envolvidos na genotoxicidade induzida pelo uso de
Baccahris trimera proveniente de áreas degradadas pela mineração de carvão a céu
aberto.
34
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