Enzimas Imobilizadas e Reatores Enzimáticos

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Enzimas Imobilizadas
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EQB4383 – Enzimologia Industrial
M.A.Z. Coelho
DEFINIÇÕES E HISTÓRICO
Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente
associada a um suporte ou matriz, usualmente sólida, insolúvel em
água e inerte, que não seja essencial a sua atividade.
Objetivos da imobilização :
1- Reutizar a enzima
2-Aumento da estabilidade
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Histórico do Uso de Enzimas Imobilizadas
1916 - ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada (invertase
em carvão vegetal) por Nelson e Griffin.
1960 - Katchalski introduziu os primeiros suportes úteis.
1978 - os processos com enzimas imobilizadas também têm
utilização industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada
em DEAE–Sephadex para produção L-aminoácidos.
Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes de
frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada em
grande escala nos Estados Unidos
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USOS EM ESCALA INDUSTRIAL DAS ENZIMAS
IMOBILIZADAS
Resolução de Misturas Racêmicas de Aminoácidos
aminoacilase - tanto L como D-aminoácidos são completamente
convertidos a L-aminoácidos.
Produção de Ácido 6-Aminopenicilâmico (6-APA)
peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada .
Produção de leites e soros deslactosados
lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso
ativado.
Produção de xaropes de frutose a partir de glicose
glicose isomerase utilizando como suporte proteínas entrecruzadas ou
vidro poroso ativado.
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Vantagens e Desvantagens
Vantagens
Desenvolvimento
de
contínuos
Desvantagens
sistemas Custo adicional de suportes,
reagentes e da operação de
imobilização
Maior estabilidade enzimática
Perdas de atividade durante a
imobilização
Uso mais eficiente do catalisador
Possíveis exigências adicionais de
através de reutilizações
purificação do catalisador
Flexibilidade no projeto de reatores
Técnica pouco adequada a substratos
insolúveis ou de alto peso molecular
Efluentes livres de catalisadores
Maiores riscos de contaminação na
operação contínua dos reatores
Maior versatilidade na etapa de
Restrições difusionais e impedimento
separação
estéreo
Menor custo de mão de obra
Facilidade de Automação e controle
Possibilidade de utilização das
enzimas “in-natura”
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ESCOLHA DE MÉTODOS E DO SUPORTE DE
IMOBILIZAÇÃO
Dependerá das características da enzima e das condições de uso da
enzima imobilizada.
Para uma escolha econômica do método de imobilização é necessário
o conhecimento da reação desejada, o processo de aplicação da
enzima imobilizada, condições do meio, modificações causadas na
estabilidade, atividade, pH e demais fatores.
O binômio suporte–método mais adequado será aquele que
propiciar uma maior atividade após imobilização.
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Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em
vários suportes e por diferentes métodos
SUPORTE
MÉTODO
Acetato de celulose Microencapsulamento
POROS
(A)
UI/g
0,02
45
Poliacrilamida
Microencapsulamento
2,5
50
Pérolas de vidro
Ligação covalente
0,2-1,0
200
DEAE-Sephadex
A25
Adsorção
0,1
650
Dowex 1X1
Adsorção
0,4
820
DEAE- Celulose
Adsorção
0,06
4200
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Suportes de Imobilização
Os suportes podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais.
Suportes necessitam de mudanças ou inclusão de grupos reativos – ativação
do suporte.
Classificação dos suportes utilizados na Imobilização de Enzimas
TIPO DE
SUPORTE
MATERIAIS
POROSIDADE
ESTABILIDADE
Não poroso
Vidro, sílica, aço
-
Alta
Microencapsulado
Triacetato de celulose
35 A
Moderada
Entrelaçado
Poliacrilamida, PVP
Variada
Baixa
Macroporoso
Alumina, sílica
200-1000 A
alta
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Tipos de Suporte para Imobilização
sílica
Alumina
Vidro
Poliacrilamida
Fibra de casca de coco
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tela de nylon
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Critérios para avaliação de um sistema
enzima-suporte
Estabilidade de fixação  a enzima deve estar bem fixa ao suporte.
Estabilidade enzimática  a enzima não deve sofrer modificações
como desnaturação.
Resistência mecânica  o suporte deve resistir a várias condições
desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator.
Capacidade de carga  o suporte deve fixar um número elevado de
unidades enzimáticas por unidade de área - um pequeno reator
uma grande capacidade catalítica.
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Por Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento
Oclusão em matrizes: Podem ser géis (amido, borracha, nylon,
poliacrilamida, sílica, alginato de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou
fibras. Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços
intersticiais da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas),
enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades.
Métodos de
Imobilização
da enzima por
encapsulamento
em gel de ágar
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Microencapsulamento:
A enzima é oclusa em membranas poliméricas de porosidade de
300 µm (celulose, policarbonato, colágeno, politereftalato,
polímeros em geral), semi-permeáveis esféricas de pequeno
diâmetro.
Microencapsulamento de enzima em material polimérico
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Reticulação ou Ligação Cruzada
Método que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multi-funcionais,
em geral diaminas alifáticas (di-isocianato) ou glutaraldeído, que induzem a
auto-reticulação das enzimas, resultando assim na formação de uma rede
tridimensional de moléculas de enzima
Ligação Covalente
A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte,
matrizes como vidro, cerâmica, polímeros sintéticos, celulose, nylon e
alumina, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima ligação de
grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em
condições fisiológicas brandas, baixa temperatura, baixa força iônica, pH
ótimo e muitas vezes na presença do substrato, a fim de proteger o sítio
ativo da enzima evitando que haja diminuição da atividade da mesma
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Adsorção Física
Utiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia na adsorção física em
superfícies sólidas, como alumina, carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por
ligações iônicas, polares ou de Van der Waals.
Ligação Iônica
Ligação de grupos com cargas opostas através de forças eletrostáticas. Processo
simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo inclusive
desprezíveis os efeitos difusionais.
Ligação Metálica
Forma quelatos pela ativação da superfície do suporte por meio do metal ou por seu
óxido.
Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são fracas levando a pequenas
modificações conformacionais na enzima e, conseqüente, possibilidade de
dissolução da mesma (perda).
De uma forma geral, os processos de imobilização por ligação são preferidos quando
se confronta eficiência, apesar da inclusão em géis ou matrizes ser mais barato.
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Imobilização de -amilase por adsorção física em
carvão de casca de coco
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EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO
Retenção da Atividade Enzimática
- algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em uma
configuração que impede completamente o acesso do substrato ao
centro ativo;
- o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação ao
suporte (a proteção do sítio ativo da enzima através de um inibidor
reversível durante a ligação pode resultar em aumento na retenção da
atividade;
- moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração que as
torne inativas;
- as condições de reação no processo de imobilização podem causar
desnaturação ou inativação.
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Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase na
forma solúvel e imobilizada em três diferentes suportes (alginato de cálcio,
quitina e polietileno ativado, respectivamente)
PARÃMETRO
INVERTASE SOLÚVEL
INVERTASE IMOBILIZADA
Km
26,0 mM
Vmáx
1,10 U
pH
(para atividade máxima)
4,6
pH
(maior estabilidade)
4,0-4,6
T
(para atividade máxima)
55-60 C
T
(maior estabilidade)
25-37 C
Ea
(energia de ativação a 37C)
27,8 kJ/mol
H
(variação de entalpia a 37C)
25,2 kJ/mol
8,1 mM
52,2 mM
32,2 mM
0,25 U
0,74 U
0,32 U
4,6
4,0
4,6
4,5 – 6,5
5,0 – 6,0
4,6
60 C
60 C
70C
45-50 C
25-40 C
25-40 C
24,4 kJ/mol
51,9 kJ/mol
37,5 kJ/mol
21,9 kJ/mol
49,3 kJ/mol
34,9 kJ/mol
-13,9 kJ/mol
-11,5 kJ/mol
-14,7 kJ/mol
0,115 kJ/mol
0,196 kJ/mol
0,160 kJ/mol
G
-13,6 kJ/mol
(variação de energia livre de
Gibs a 37C)
S
0,125 kJ/mol
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(variação de entropia a 37C)
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Efeitos Difusionais
Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na
solução através de um filme líquido estacionário presente nas
superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros
até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de
reação
velocidade de difusão do substrato < velocidade de
transformação pela enzima
Vmáx mais baixa
não se atinge a saturação.
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Resistência Difusional Externa
Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio
da solução até a superfície de catalise, devendo, por conseguinte
atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato
através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de
um gradiente.
A difusão do substrato e produtos dos centros ativos para a solução (ou
vice-versa) ocorre através de mecanismos de difusão molecular e
convectiva.
Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem
ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores
continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de
substrato, caso do reator pistonado (PFR).
Efeitos Difusionais Internos
Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio
catalítico - difusão e reação ocorre simultaneamente
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Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente
diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz
ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhança, que
dependem da natureza física e química do suporte, podem
acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e
cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto
da solução.
Efeitos Estereoespecíficos
Existem situações onde a atividade da enzima frente a um substrato
com elevado peso molecular é reduzida durante o processo de
imobilização, de uma forma mais extensa que frente a um
substrato com menor peso molecular - resultado de
impedimento estéreo, formado pelo suporte, ao acesso de
moléculas grandes ao centro ativo da enzima (impedimento
estérico).
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