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GASTRULAÇÃO NEURULAÇÃO DOBRAMENTO DO CORPO FECHAMENTO DO TUBO ENDODÉRMICO EXPANSÃO DO ÂMNION GASTRULAÇÃO NEURULAÇÃO DOBRAMENTO DO CORPO FECHAMENTO DO TUBO ENDODÉRMICO EXPANSÃO DO ÂMNION GASTRULAÇÃO NEURULAÇÃO DOBRAMENTO DO CORPO FECHAMENTO DO TUBO ENDODÉRMICO EXPANSÃO DO ÂMNION NEURULAÇÃO DOBRAMENTO DO CORPO A formação do tubo neural se dá pela elevação das DOBRAS NEURAIS e a perda da conexão do tubo com o ectoderma de revestimento A NEURULAÇÂO forma o tubo neural. Glibert 8a Ed Embrião de galinha Embrião de Xenopus laevis Embrião de Xenopus laevis Embrião de camudongo O fechamento do Tubo Neural ocorre de forma desigual ao longo do eixo embrionário Fenda Neural Placa Neural Ponto de dobradiça Dobra Neural A constrição apical é essencial para o fechamento do tubo neural NORMAL Sem constrição apical Embrião de Xenopus laevis A EXTENSÃO CONVERGENTE está presente no dobramento do MHP Fengzhu Xiong, Megason Lab Harvard University 1. Indução da formação da PLACA NEURAL pelo Mesoderma (Mudança na forma celular, expressão de marcadores gênicos) 2. Associação da Placa Neural com a Notocorda subjacente; constrição apical nas células da borda da Placa Neural 3. Dobramento da Placa Neural 1. A convergência do Tubo Neural é uma combinação de fatores: Pressão lateral e constrição nos pontos de dobradiça e extensão convergente 2. Fusão do Tubo Neural na porção dorsal concomitante com a Migração da Crista Neural O QUE INDUZ A FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO? Prêmio Nobel em 1935 Resultados: 1. Gerou dois eixos embrionários= DUPLICAÇÃO AXIAL 2. O segundo embrião é composto de células doadoras E aceptoras. Conclusão: O Lábio dorsal do blastóporo tem capacidade INDUTIVA O ORGANIZADOR Propriedades do Organizador: 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma A origem das células do blastóporo dorsal (Organizador) Ovo recém-fertilizado Gástrula A fertilização em anfíbios é seguida pela ROTAÇÃO CORTICAL, que forma o CRESCENTE CINZA O Organizador da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero) Crescente cinza Spemann, 1938 Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões? a) Porque dividiu o ovo pela metade b) Foi um resultado aleatório c) Porque dividiu o crescente cinza. d) Porque dividiu o Organizador. Spemann, 1938 Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões? a) Porque dividiu o ovo pela metade b) Foi um resultado aleatório c) Porque dividiu o crescente cinza. d) Porque dividiu o Organizador. Propriedades do Organizador: 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário? a)Fator de transcrição (proteína nuclear) b)Receptor de membrana c)Ligante de membrana d)Proteína extracelular secretada No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário? a)Fator de transcrição (proteína nuclear) b)Receptor de membrana c)Ligante de membrana d)Proteína extracelular secretada 1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? 2. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Spemann, 1938 Pergunta: O ovo recémfertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente? 1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? Sem Crescente cinza não há região dorsal ENTÃO, qual o elemento ativo no crescente cinza? 2. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Recémfertilizado Rotação cortical Crescente Cinza Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula Organizador Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: •A TRANSCRIÇÃO no embrião de Xenopus só ocorre NA BLÁSTULA 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Capaz de compensar pelo efeito do UV 4. Ser de origem materna •Os fatores indutivos do Organizador estão presentes ANTES da blástula Membros da Família Wnt Obs.: Wnt=Wingless +int Heasman, J. Development 124, 4179-4191 (1997) Via de sinalização Wnt O Dsh, assim como o Wnt, causa duplicação axial controle Injetados com XDsh Sokol et al.,Development 121:1637-1647 (1995) Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: Wnt/Dsh 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna Ventral Dorsal O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas Western Blot para Dsh Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: Wnt/Dsh 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna Ventral Dorsal O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas Western Blot para Dsh Antes da Transcrição zigótica Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: Wnt/Dsh 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna dorsal ventral O embrião de Xenopus expressa beta-catenina desde cedo Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina) 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna Localização da beta-catenina na blástula de Xenopus ventral dorsal Schohl and Fagotto Development 129, 37-52 (2002) Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina) 1. Expressão na região dorsal 2. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna VISUALIZAÇÃO DA ROTAÇÃO CORTICAL Ponto de entrada do esperma Development 1992 Mar;114(3):699-709. Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs. Schroeder MM, Gard DL O áster do esperma organiza a polimerização dos microtúbulos que resultam na rotação cortical Slide 37 da Profa Nathalie: A rotação cortical desloca elementos citoplasmáticos especificamente para o crescente cinza 1. Fertilização 2. Polimerização polarizada dos microtúbulos pelo aster espermático 3. Rotação cortical 4. Concentração de Dsh na região vegetal-dorsal 5. Inibição de GSK-3 na região vegetal-dorsal 6. Atividade da betacatenina na região vegetal-dorsal Região Ventral Região Dorsal 1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? Acúmulo de beta catenina nuclear. 2. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? No experimento acima, ocorreu uma duplicação na blástula aceptor a e uma duplicação do início da gastrulação. O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular? a)Nada, porque o embrião se regenera. b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizador c)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizador d)Ausência de gastrulação porque faltariam células. Spemann, 1938 Pergunta: O ovo recémfertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente? Este pedaço é só endoderma! A região DORSAL da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero) Crescente cinza No experimento acima, ocorreu uma duplicação do na blástula aceptoar e uma duplicação do início da gastrulação. O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular? a)Nada, porque o embrião se regenera. b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizador c)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizador d)Ausência de gastrulação porque faltariam células. 1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? Acúmulo de beta catenina nuclear. 2. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Sem Crescente Cinza não há Organizador e não há gastrulação. 1. Mas beta-catenina é uma proteína nuclear, e o efeito do Organizador depende de uma proteína secretada… Recémfertilizado Rotação cortical Crescente Cinza Mesoblástula Gástrula Organizador Recémfertilizado Rotação cortical Mesoblástula Gástrula Organizador Crescente Cinza ? Recémfertilizado Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula Organizador Neural Recémfertilizado Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Mesoblástula Transcrição zigótica 2. Transcrição zigótica do que? Gástrula Organizador COMO É FORMADO O ORGANIZADOR? Propriedades do Organizador: 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma O Organizador de Spemann fica no MESODERMA DORSAL Crescente cinza Organizador de Spemann Após a gastrulação, as células do Organizador irão formar a notocorda QUAL É A RELAÇÃO ENTRE O CRESCENTE CINZA, BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!! Como é formado o MESODERMA? Nieuwkoop, anos 70 O pólo vegetal SECRETA elementos que induzem o mesoderma mesmo antes da transcrição zigótica. Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades: ? Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades: 1. Capaz de induzir MESODERMA 2. Expresso no pólo vegetal 3. Ser de origem materna Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do pólo vegetal que induzem o Mesoderma Mas, VegT é uma proteína nuclear..... VegT Como é formado o MESODERMA DORSAL? Dale and Slack, 1987 Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul) a) b) c) d) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais Os blastõmeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza Dale and Slack, 1987 Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul) a) b) c) d) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais Os blastõmeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza Dale and Slack, 1987 Blastômero dorsal do pólo vegetal é capaz de induzir mesoderma DORSAL no ectoderma NASCE O CENTRO DE NIEUWKOOP! Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Dorsal/Organizador Dale and Slack, 1987 Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente? a) Fator de transcrição (proteína nuclear) b) Receptor de membrana c) Ligante de membrana d) Proteína extracelular secretada Dale and Slack, 1987 Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente? a) Fator de transcrição (proteína nuclear) b) Receptor de membrana c) Ligante de membrana d) Proteína extracelular secretada Hipótese: Existem fatores SECREATDOS do pólo vegetal DORSAL que induzem o Mesoderma DORSAL VegT Que elemento materno está na região dorsal ? QUAL É A RELAÇÃO ENTRE O CRESCENTE CINZA, BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!! (VegT) O Centro de Nieuwkoop é formado pela sobreposição de VegT e Beta-catenina b-catenina Mesoderma Dorsal VegT e outros TGF-betas Mesoderma Ventral Mas VegT e beta-catenina são fatores de transcrição!!! E são maternais (= antes da transcrição zigótica!) E agora????!!!! O que é secretado pelo Centro de Nieuwkoop para formar o Organizador? b-catenina VegT e outros TGF-betas Nieuwkoop ? ? Mesoderma Dorsal (Org) Mesoderma Ventral A presença SIMULTÂNEA dos fatores de transcrição betacatenina e VegT inicia a transcrição zigótica de genes que codificam proteínas secretadas b-catenina VegT Nieuwkoop ? ? Mesoderma Dorsal (Org) Mesoderma Ventral VegT Beta-Catenina Nieuwkoop 1. 2. 3. Ativado por VegT Ativado por beta-cat Induz Organizador 4. ZIGÓTICO!! ? Organizador Genes do Organizador O centro de Nieuwkooop no pólo vegetal, secreta Nodal, que induz a formação do Organizador no mesoderma VegT Beta-Catenina Nieuwkoop 1. 2. 3. 4. Zigótico Ativado por VegT Ativado por beta-cat Induz Organizador Xnr-1/ Nodal Organizador Genes do Organizador Xnrs são expressos zigóticamente Transc. Zigótica 1. 2. 3. 4. Zigótico Ativado por VegT Ativado por beta-cat Induz Organizador Recémfertilizado Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula Organizador Nodal VegT no pólo vegetal (produzido pelo C. Nieuwkoop) Neural Propriedades do Organizador: 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma por proteínas secretadas Recémfertilizado Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula Organizador ? Nodal VegT no pólo vegetal Neural O que é que o lábio do blastóporo dorsal secreta que pode induzir diferenciação neural no ectoderma? VIA DE SINALIZAÇÂO DE BMP Existem proteínas extracelulares que são inibidores de BMP e atuam evitando a ligação de BMP com o seu Receptor O lábio do blastóporo dorsal produz inibidores de BMP como Chordin, Noggin e Follistatin. CHORDIN NOGGIN Superexpressão de inibidores de BMP induzem um segundo eixo neural. Development October 15, 2003 vol. 130 no. 20 4975-4988 O que é que o lábio do blastóporo dorsal secreta que pode induzir diferenciação neural no ectoderma? Inibidores de BMP BMP SE inibição do BMP induz destino neural Epidermal Neural BMP induz destino epidermal BMP ENTÃO Neural Epidermal Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma? a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial. b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma? a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial. b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural Remoção da via de sinalização de BMP>> neural mRNA para receptor dominante negativo de BMP (pg) Normal Duplicação 0 88% 0 20 52% 27% 200 7% 76% Suzuki et al. 1994 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 25;91(22):10255-9. O potencial de cada célula é indefinido A posição de cada célula em relação a fonte de morfógeno é interpretada em programas de diferenciação distintos Gradiente morfogenético Fator Morfogenético: Tem efeitos diferentes em doses-diferentes Ou seja: Gera um gradiente de resposta a partir da origem do fator BMC Developmental Biology 2007 7:22 O ectoderma exposto a altos níveis de BMP = Epitélio Neural Epitélio BMP4 O ectoderma exposto a baixos níveis de BMP = Neural Neural Epitélio BMP4 BMP SE BMP induz epidermal Neural Epidermal ENTÂO ausência de sinal deve favorecer a diferenciação neural Epidermal Neural ENTÃO ausência de qualquer sinal favorece NEURAL Modelo de diferenciação neural por default Epidermal Neural Redução da densidade de células tronco aumenta a expressão de genes neuraisof neural markers. Pluriipotency Neural markers Evidence for the “default neural state” Tropepe, V. et al., 2001. Neuron, 30(1), pp.65–78. Lim et al., Neuron, Vol. 28, 713–726, December, 2000 Gobeske et al., PLoS One Vol 4 e7506 October 2009 Recémfertilizado Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula Organizador Inibidor de BMP Nodal VegT no pólo vegetal Neural O nò de Hensen de embrião de aves, é similar ao Organizador, porque é onde se inicia a gastrulação = O nò de Hensen de embrião de aves tem propriedades indutoras similares ao Organizador Wolpert, Biologia do Desenvolvimento Que genes devem estar expressos no nó de Hensen? a) b) c) d) Beta-catenina Inibidores de BMP Dsh BMP O padrão de expressão de BMP e seus inibidores são complementares na gástrula e nêurula Neural Epidermal NÊURULA Chordin BMP4 GÁSTRULA Streit et al., Development (1998) Reese et al., Dev. Bio (2004) Mod from Gitton et al., Development (2011) Os micrômeros precisam da atividade de betacatenina para formar células mesênquimais primárias Inibição de beta-catenina beta-catenina normal Os micrômeros precisam da atividade de betacatenina para induzir um segundo eixo dorso-ventral Inibição de beta-catenina beta-catenina normal
