PROTEÍNAS CANDIDATAS À - pgbioexp

UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR
MESTRADO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
PROTEÍNAS CANDIDATAS Á SORODIAGNÓSTICO DAS PRINCIPAIS
DOENÇAS TROPICAIS INFECCIOSAS
PATRÍCIA VICENTE
PORTO VELHO – RO
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR
MESTRADO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
PROTEÍNAS CANDIDATAS À SORODIAGNÓSTICO DAS PRINCIPAIS
DOENÇAS TROPICAIS INFECCIOSAS
PATRÍCIA VICENTE
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Experimental do
Núcleo de Saúde da Universidade Federal
de Rondônia, como requisito para obtenção
do
título
de
Mestre
em
Biologia
Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Afonso Nogueira
Porto Velho – RO
2006
1
FICHA CATALOGRÁFICA
VICENTE, Patrícia
Proteínas candidatas á sorodiagnóstico das principais doenças
tropicais infecciosas. Patrícia Vicente. 57 p.
Dissertação de Mestrado apresentada ao curso de pós-graduação
(strict sensu) em Biologia Experimental Universidade Federal de Rondônia,
como requisito para obtenção do título de mestre na área de Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Afonso Nogueira
1. Doenças Tropicais; 2. Proteínas; 3. Sorodiagnóstico.
2
DEDICATÓRIA
Aos meus pais pela educação e amor, apoiando-me e orientando-me com sabedoria
nos momentos de desânimo.
Ao Antônio Francisco de Aguiar, pela compreensão, paciência e apoio incondicional.
3
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me concebido a oportunidade de obter novos conhecimentos,
dando-me discernimento e paciência para superar os obstáculos.
Aos meus professores, por acreditarem e dedicarem seu tempo orientandome pacientemente.
Ao Dr. Paulo Afonso Nogueira pela confiança, paciência e orientação no
desenvolvimento do estudo.
Ao Dr. Rodrigo Stábeli pelas sugestões e atenção no decorrer do trabalho.
À coordenadora do curso de mestrado Drª Vera Engrácia G. de Oliveira pela
disponibilidade e atenção dispensadas às soluções de questões burocráticas
relacionadas a minha pesquisa.
À amiga Msc. Kellen Günther pelo companheirismo na trajetória desde o início
de meu projeto científico.
À Drª Juliana Zuliani e ao Msc. Anderson Makoto Kayano pela amizade e
solidariedade, colaborando para o enriquecimento dos meus conhecimentos.
A todos os amigos do Laboratório de Bioquímica e Biotecnologia do
IPEPATRO.
A todos os amigos do Laboratório de Imunoparasitologia e Virologia do
CEPEM.
A todos os funcionários do CEPEM e IPEPATRO que de alguma forma
contribuíram para a realização dessa análise.
4
EPÍGRAFE
“Nas grandes batalhas da vida
o primeiro passo para a vitória
é o desejo de vencer”.
Ganhdi
5
RESUMO
As doenças tropicais continuam sendo grandes problemas de saúde pública e
estão correlacionadas com baixos níveis sócio-econômicos, pois se manifestam, em
sua maioria, em regiões onde são precárias as condições de implantar medidas
efetivas de controle, prevenção e tratamento. Essas doenças são verdadeiros
desafios à ciência, a despeito dos grandes avanços científicos, pois mais da metade
da população mundial encontra-se em áreas de risco. Malária, Leishmaniose,
Toxoplasmose, Doença de Chagas, Febre Amarela, Dengue e Hepatites virais
constituem as principais doenças presentes nas regiões tropicais e subtropicais. Os
testes de diagnóstico rápido representam uma excelente alternativa para controle e
tratamento
das
doenças
infecciosas.
Para
desenvolver
tais
ferramentas
epidemiológicas, diversos antígenos correspondentes a cada patógeno têm sido
identificados como marcadores de infecção e, com a acessibilidade das técnicas em
biologia molecular, elas constituem verdadeiros alvos para desenvolvimento de
insumos biológicos capazes de identificar a causa da doença. Insumos biológicos
de origem imunológica, tais como anticorpos monoclonais, representam uma
ferramenta fundamental para desenvolvimento de kits diagnóstico. Portanto este
estudo teve por objetivo revisar a bibliografia das principais doenças infecciosas, sob
o ponto de vista epidemiológico e clínico, e sobre os principais antígenos alvos para
diagnóstico da doença e uma visão sucinta da metodologia utilizada para
desenvolvimento dos anticorpos monoclonais.
Palavras-chave: Doenças Tropicais; Proteínas; Sorodiagnóstico.
6
ABSTRACT
The tropical illnesses like Malaria, Leishmaniasis, Toxoplasmosis, Chagas
disease, Yellow Fever, Dengue and Hepatite continue being major problems of public
health in poor areas of tropical and subtropical regions. These illnesses are major
challenges to science, the spite of the great scientific advances. The Rapid
Diagnostics Tests (RDT) represents an excellent alternative for control and treatment
of the infectious illnesses. The antigens of each pathogen have been identified as
marking of infection and, with the accessibility of the techniques in molecular biology,
them they constitute true targets for development of biological reactive capable to
identify the cause of the illness. These biological reactive such as monoclonais
antibodies represent a basic tool for RDT. Therefore this study had the objective to
revise the bibliography of the main infectious illnesses, under the point of view of
main antigens for diagnosis of the illness and a brief vision about methodology for
development of the monoclonal antibodies.
Word-key: Tropical Diseases; Proteins; Serodiagnostic.
7
SUMÁRIO
RESUMO....................................................................................................................05
ABSTRACT................................................................................................................06
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................09
INTRODUÇÃO ...........................................................................................................10
1. MALÁRIA ...............................................................................................................11
1.1 Proteínas Candidatas para Soro Diagnóstico da Malária .....................................14
1.1.1 Proteína HRP-2 .................................................................................................14
1.1.2 pLDH (Lactato Desidrogenase de plasmodio) ...................................................14
1.1.3 Aldolase.............................................................................................................15
2. FEBRE AMARELA ................................................................................................15
2.1 Proteínas Candidatas para Soro Diagnóstico da Febre Amarela .........................17
2.1.1 Proteína não estrutural NS5 .............................................................................17
2.2 Proteína E do Envelope........................................................................................18
3. DENGUE ................................................................................................................18
3.1 Proteínas para Sorodiagnóstico de Dengue .........................................................21
3.2 Proteína não-estrutura NS1..................................................................................21
3.3 Proteína não-estrutural NS3 .................................................................................22
3.4 Proteína Estrutural e do Envelope ........................................................................22
4. LEISHMANIOSE ....................................................................................................23
4.1 Proteínas Candidatas para Sorodiagnóstico de Leishmaniose ............................25
5. DOENÇA DE CHAGAS .........................................................................................26
5.1 Proteínas Candidatas ao Sorodiagnóstico da Doença de Chagas .......................28
6. DOENÇAS INFECCIOSAS DE INTERESSE NÃO RESTRITAS ÀS REGIÕES
TROPICAIS ................................................................................................................28
6.1 Toxoplasmose ......................................................................................................28
6.2 Proteínas Candidatas ao Sorodiagnóstico da Toxoplasmose ..............................29
7. HEPATITE..............................................................................................................30
7.1 Hepatite Aguda por Vírus tipo A ...........................................................................31
7.2 Hepatite B ou Hepatite por Vírus do Tipo B..........................................................32
7.3 Hepatite C ............................................................................................................34
7.4 Hepatites Delta .....................................................................................................37
8
7.5 Hepatite E.............................................................................................................38
7.6 Proteínas Candidatas ao Sorodiagnóstico de Hepatite ........................................39
8. METODOLOGIA PARA PRODUZIR INSUMO DIAGNÓSTICO A BASE DE
ANTICORPOS E PROTEÍNAS RECOMBINANTES ..................................................40
8.1 Seleção da Região Alvo para a Produção do Insumo ..........................................40
8.2 Clonagem Gênica e suas Ferramentas para Produção de Proteínas
Recombinantes ..........................................................................................................40
8.3 Produção de Anticorpos como Insumos Reagentes .............................................41
8.3.1 Principio Básico da Metodologia dos Anticorpos Monoclonais ..........................42
8.3.2 Células Utilizadas na Produção dos Anticorpos Monoclonais ...........................44
8.3.3 Principio da Fusão Celular ................................................................................45
8.4. Práticas Laboratoriais para Otimização da Cultura Celular .................................47
REFERÊNCIAS ..........................................................................................................48
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - O Anopheles .............................................................................................12
Figura 2 - Classificação das áreas de risco para malária, segundo a incidência
parasitária anual (IPA). Brasil, 2001 ...........................................................................13
Figura 3 - O Aedes aegypti, transmissor da febre amarela, vive em locais habitados
pelo homem. No entanto, só a fêmea pica o homem, mesmo durante o dia, para
alimentar-se de sangue, propagando, dessa forma, a doença infecciosa. .................16
Figura 4 - Áreas de risco redefinidas de Febre Amarela silvestre. Brasil, 2001 ........17
Figura 5 - Sorotipos do DENV circulantes por Estados no Brasil. Em Rondônia até o
momento foram isolados os sorotipos 1 e 3. ..............................................................19
Figura 6 - Esquema do DENV .................................................................................. 20
Figura 7- Organização genômica dos Flavivirus........................................................21
Figura 8 - A Leishmania brasiliensis, protozoário flagelado (1 flagelo e ausência de
membrana ondulante) causador da Leishmaniose Tegumentar Sul-americana ou
Ùlcera-de-Bauru .........................................................................................................23
Figura 9 - O “mosquito-palha” (Phebotomus sp) transmissor da Leishmaniose
tegumentar sul-americana ..........................................................................................24
Figura 10 - Circuitos por densidade de casos de LTA por município. Brasil, 19941999 ...........................................................................................................................25
Figura 11 - “Barbeiro” (Panstrongylus megistus) .......................................................26
Figura 12 - Formas Tripomastigotas encontrada no sangue de pacientes infectados
em fase aguda. Trypanosoma cruzi ...........................................................................27
Figura 13 - Prevalência mundial de pacientes crônicos de Hepatite B ......................33
Figura 14 - Prevalência mundial de portadores crônicos de Hepatite C ....................36
Figura 15 - Esquema das vias bioquímicas de síntese de nucleotídeos
por
células ....................................................................................................................... 44
Figura 16 - Produção de anticorpos monoclonais .....................................................46
10
INTRODUÇÃO
As doenças tropicais infecciosas ocorrem unicamente nas regiões tropicais e,
raramente nas regiões subtropicais. Receberam essa denominação desde a época
em que os ingleses colonizaram as regiões nos trópicos, principalmente na África,
sudeste asiático e Índia, e entraram em contato com uma série de doenças
desconhecidas no continente europeu (FERREIRA, 2003). Essa denominação ainda
é pertinente porque nos trópicos, fatores climáticos favorecem a proliferação de
insetos, os principais transmissores dessas doenças.
A despeito dos grandes avanços científicos (ANNA NETO, 2000), essas
doenças são verdadeiros desafios à modernidade no século atual. Em 1993, mais da
metade da população mundial encontrava-se sob ameaça das doenças tropicais e
quinhentos milhões de indivíduos eram infectados por pelo menos uma delas
(FERREIRA, 2003).
As doenças tropicais infecciosas como a Malária, Leishmaniose, Dengue,
Febre Amarela e a Doença de Chagas causam sérios problemas para a saúde
pública mundial. A toxoplasmose e as hepatites, doenças não restritas as regiões
tropicais, também representam um alto índice de mortalidade, sendo que apenas a
hepatite C representa cerca de 170 a 200 milhões de infectados em todo o mundo
(PASSOS, 2006), e a Toxoplasmose, infecção oportunista, tem ampla distribuição
geográfica, principalmente em pacientes com AIDS (CANTOS et al., 2000).
11
1. MALÁRIA
A malária é uma doença tropical infecciosa, também chamada de maleita,
impaludismo, paludismo, febre terçã ou quartã. Apresenta sintomatologia típica e
manifesta-se por episódios de calafrios seguidos de febre alta que duram de 3 a 4
horas. Esses episódios maláricos são em geral, acompanhados de profundo malestar, náuseas, cefaléias e dores articulares. Passado o episódio malárico, o
paciente pode voltar a sua vida habitual. Mas depois de um ou dois dias, o quadro
calafrio/febre retorna e se repete por semanas. Dependendo da espécie, o paciente,
não tratado, sara espontaneamente, como no caso da malária vivax, ou evolui para
malária complicada, causada pelo Plasmodium falciparum que caracteriza-se por
anemia severa associada ou não a complicações cerebrais, renais e pulmonares
(CAMARGO, 2003).
A malária é causada por protozoários, que se multiplicam nos glóbulos
vermelhos do sangue do homem. As espécies causadoras da malária humana são
quatro Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae e P. ovale. O P. falciparum é
responsável por uma forma muito grave de malária, outrora chamada de terçã
maligna. O P.vivax causa uma doença mais branda que, no entanto, tem o
inconveniente de retornar na forma de recaídas. Isso porque nas células do fígado
do homem infectado, podem permanecer algumas formas hibernantes denominadas
hipnozoítas (CAMARGO, 2003).
A ocorrência da malária está intimamente associada à presença e proliferação
de mosquitos do gênero Anopheles. São muitas as espécies de Anopheles (Figura
1), cada uma com suas preferências alimentares. As fêmeas alimentam-se sempre
de sangue e podem ser permissivas ou exigentes quanto ao fornecedor desse
sangue, picando todo tipo de animal ou um tipo de animal apenas. Os machos
alimentam-se de fluidos de plantas e flores e, portanto, não transmitem a malária.
Cada região do mundo tem sua fauna específica de Anopheles e a
epidemiologia da malária depende da composição dessa fauna. Existem mais de
350 espécies de Anopheles em todo o mundo, as maiorias permitindo a proliferação
de plasmodios em seu organismo, em laboratório, mas apenas cerca de 30 a 50 são
capazes de transmitir os plasmodios humanos. (CAMARGO, 2003).
No Brasil, o problema da malária apresenta grandes variações, em
decorrência de fatores ligados à vastidão territorial, a fatores ecológicos que
12
favorecem o desenvolvimento de um grande número de espécies vetoras e a
influência das condições sócio-econômicas precárias nas regiões endêmicas
(NEVES, D. P., 2004).
Para a identificação e diagnóstico de malária a prática laboratorial mais
utilizada é a preparação de lâminas com gota espessa de sangue corado com
Giemsa. A técnica da gota espessa é aceita como “padrão ouro” no diagnóstico de
malária e pode ser utilizada para quantificação dos parasitas.
Para identificar e quantificar os anticorpos contra os parasitas da malária, as
provas de Imunofluorescência podem ser utilizadas com o propósito de se investigar
a exposição de populações em áreas onde a malária tenha sido erradicada.
Já o PCR, é considerado uma técnica dispendiosa para diagnóstico da
malária. Porém a maior vantagem da técnica de PCR está na sensibilidade em
detectar níveis baixos do parasita da malária no paciente.
Recentemente, desenvolveram-se testes de diagnóstico rápido de malária,
denominada Imunocromatografia de Captura do Antígeno. Esta técnica permite
detectar parasita no sangue no máximo em 20 minutos. (MOODY, 2002).
Figura 1 - O Anopheles
Fonte: www.google.com/ imagens
Site acessado em 15/11/2006.
A malária é considerada como um grave problema de Saúde Pública no
mundo, ocorrendo em mais de 40% da população de mais de 100 países. Sua
estimativa é que de 300 a 500 milhões de novos casos e 1 milhão de mortes são
registrados anualmente (FUNASA, Guia Vigilância epidemiológica, 2002).
13
A malária distribui-se pela África, Ásia e América Sul e Central permanecendo
como a doença parasitária mais prevalente no mundo (FERREIRA, 2003).
No Brasil, aproximadamente 99% dos casos de malária se concentram na
região amazônica, que possui características geográficas e ecológicas altamente
favoráveis à interação do plasmodio e do anophelino vetor, constituindo-se, portanto,
em áreas de alto e médio risco de infecção (FUNASA, Guia de Vigilância
Epidemiológica, 2002).
A região amazônica é composta pelo Acre (AC), Amazonas (AM), Maranhão
(MA), Mato Grosso (MT), Pará (PA), Rondônia (RO), Roraima (RR) e Tocantins
(TO), é considerada endêmica, entretanto o nível de transmissão é bem
heterogêneo, com áreas de alto risco (IPA ≥ 50 casos/1000 Hab.), médio risco (IPA
de 10 a 49 casos/1000 Hab.), baixo risco (de 0,1 a 9 casos/1000 Hab.) e nenhum
risco (IPA=0) (FUNASA, Guia de Vigilância Epidemiológica, 2002).
Figura 2 - Classificação das áreas de risco para malária, segundo a incidência
parasitária anual (IPA). Brasil, 2001.
Fonte: GT-Malária/CENEPI/FUNASA
14
1.1 Proteínas Candidatas para Soro Diagnóstico da Malária
1.1.1 Proteína HRP-2
O Plasmodio falciparum infecta as hemácias e sintetiza três proteínas ricas
em histidina e entre elas, a mais importante a HRP2, que foi o primeiro antígeno
utilizado em Imunodiagnóstico de malária.
A proteína HRP2 possui de 60.000 a 105.000 M, é encontrada no
sobrenadante de cultura sincronizada, sendo liberada em maior quantidade na fase
de esquizonte do parasita (fase de rompimento do eritrócito), portanto, é uma
proteína secretada, solúvel em água e produzida no estágio assexual e jovem dos
gametócitos de P. falciparum.
Essa proteína é expressa na membrana superficial das hemácias e foi o
primeiro antígeno a ser utilizado para o desenvolvimento de um kit de
Imunocromatografia (RDT) para detecção de antígenos de malaria (MOODY, 2002).
MAMANI Q. (2006) produziu anticorpos monoclonais contra a proteína HRP2
do Plasmodium falciparum a partir da imunização de camundongos com proteína
HRP2 recombinante fusionada com a proteína glutationa S transferase (GST). A
reatividade dos anticorpos monoclonais contra a proteína HRP2 nativa proveniente
da cultura sincronizada da cepa 3D7 do Plasmodium falciparum foi observada
através do método de Western blotting. Estes dados demonstraram a possibilidade
de se obter anticorpos candidatos a insumos reagentes.
1.1.2 pLDH (Lactato Desidrogenase de plasmodio)
É uma enzima glicolítica solúvel, expressa nos estágios sexual e assexual do
Plasmodio em altos níveis.
Está diretamente correlacionada com o nível de parasitemia em culturas in
vitro
de
malária
e
no
plasma
de
pacientes
infectados
determinados
microscopicamente, portanto esta sendo muito utilizada para detectar o nível de
parasitemia. Existe diferentes isômeros de pLDH para cada um dos quatro tipos de
Plasmodium ssp que infecta humanos e sua detecção constitui a segunda
descoberta para o desenvolvimento de um kit de imunocromatografia. A proteína
15
pLDH de Plasmodio ssp está presente no hospedeiro humano infectado e pode ser
detectada
por
anticorpos
monoclonais
que
são
utilizados
em
teste
de
Imunocromatografia ou usando substrato 3 acetilpiridina adenina dinucleotideo
(APAD) (MOODY, 2002).
1.1.3 Aldolase
É uma enzima glicolítica presente no parasita da malária, que tem sido
reconhecida e considerada como alvo para testes de diagnóstico rápido de malária.
A energia do metabolismo humano no ciclo do ácido cítrico gera ATP dependente do
ciclo glicolítico e a aldolase é a enzima chave deste caminho.
Anticorpos monoclonais produzidos contra a aldolase de plasmodio têm sido
utilizados na combinação com a proteína HRP-2 para detectar Plasmodio vivax e
Plasmodio falciparum no sangue (MOODY, 2002).
2. FEBRE AMARELA
A denominação de febre amarela foi empregada pela primeira vez por Griffith
Hughes, em 1750, antes a doença era conhecida pelos mais variados nomes. A
Febre Amarela chegou ao Brasil no século XVII, trazida por via marítima em
embarcações
procedentes
das
Antilhas
(REZENDE
J.
M.,
2001).
A primeira vacina, após a comprovação da transmissão vetorial, foi
preparada por William Gorgas em Havana, em 1901, a partir de mosquitos
infectados. Em 1927, Stokes demonstrou que era possível infectar o macaco Rhesus
com o vírus da febre amarela, mas foi em 1930 que Max Theiler, um médico sulafricano, conseguiu infectar camundongos, injetando diretamente no cérebro desses
animais tecido hepático de macaco Rhesus infectado, e posteriormente cultivar o
vírus em embriões de camundongos (REZENDE J. M., 2001).
A febre amarela é uma doença febril aguda de curta duração (no máximo 12
dias) e de gravidade variável, cujo agente etiológico é um arbovirus do gênero
Flavivirus. A forma grave caracteriza-se clinicamente por manifestações de
insuficiência hepática e renal que podem levar a morte (ALMEIDA NETO J.C. et al.,
1991).
16
Apresenta-se sob duas formas epidemiologicamente distintas: febre amarela
silvestre e febre amarela urbana, semelhantes do ponto de vista etiológico,
fisiopatológico, imunológico e clinico. As diferenças entre elas são a localização
geográfica, espécie vetorial e tipo de hospedeiro (Ministério da Saúde/FNS, 1999).
O período de incubação varia de 3 a 6 dias após a picada do mosquito
infectante e o período de transmissão começa no primeiro dia antes do início dos
sintomas se estendendo até o terceiro ou quarto dia da doença, o que corresponde
ao período de viremia (ALMEIDA NETO J.C. et al.,1991).
Os sintomas mais comuns apresentados são prostração, dor epigástrica,
hepatomegalia moderada e icterícia de grau variado, sendo que podem ocorrer
formas atípicas fulminantes levando a morte precoce em 24 a 72 horas após o início
da doença.
Não há tratamento especifico, nas formas leves e moderadas faz-se apenas o
tratamento sintomático da febre e cefaléia e nas formas graves, os pacientes
necessitam de atendimento em unidades de saúde.
Nos últimos anos, têm-se desenvolvido diversas técnicas laboratoriais para
um diagnóstico mais rápido e de maior confiabilidade como o Mac-ELISA e outros
em centros especializados, para detecção de antígenos ou genoma do vírus,
mediante técnicas moleculares (Ministério da Saúde/FNS, 1991).
Figura 3-O Aedes aegypti, transmissor da febre amarela, vive em locais
habitados pelo homem. No entanto, só a fêmea pica o homem, mesmo durante
o dia, para alimentar-se de sangue, propagando, dessa forma, a doença
infecciosa.
Fonte: www.google.com/ imagens, Site acessado em 10/11/2006.
17
O combate ao mosquito Aedes aegypti é a medida de prevenção mais
eficiente e a epidemia é limitada pela vacinação de pessoas que vivem em zonas
ameaçadas.
Contra a febre amarela silvestre, como não se pode combater eficazmente o
mosquito nem o macaco, a aplicação de vacina é a única solução. Vacinas
preparadas com o vírus têm efeito duradouro sendo que ate mais de 10 anos depois
de vacinados, os indivíduos ainda têm no sangue anticorpos contra o vírus.
No Brasil as áreas endêmicas estão mostradas na Figura 4.
Figura 4 - Áreas de risco redefinidas de Febre Amarela silvestre. Brasil, 2001
Fonte: FUNASA/MS
2.1 Proteínas Candidatas para Soro Diagnóstico da Febre Amarela
2.1.1 Proteína não estrutural NS5
É uma proteína derivada da clivagem da poliproteína viral que recebe o
mesmo nome do gene que a originou, e não faz parte da estrutura do vírus, se
encontra no núcleo das células infectadas, sendo essencial para a replicação viral.
Análise da reatividade de anticorpos monoclonais específicos à NS5 por
radioimunoensaio mostrou a presença da proteína em lisados de células infectadas
18
demonstrando o potencial de se utilizar a NS5 como marcador dos estágios de
replicação viral (BUCKLEY et al, 1992).
2.2 Proteína E do Envelope
A proteína E do vírus da febre amarela é uma proteína que faz parte da
estrutura do vírus, induz secreção de anticorpos neutralizantes e proteção contra a
resposta imune, o que a torna um importante antígeno para ser utilizado em testes
de Imunodiagnóstico (DESPRÉS et al, 1988).
3. DENGUE
A dengue é a mais importante doença causada por arbovírus, em termos de
morbidade e mortalidade, sendo por essa razão, um dos grandes problemas de
saúde pública em cerca de 100 países situados em regiões tropicais do mundo
(YOUNG et al., 2000).
Benjamin Rush, em 1780, fez a primeira descrição clinica da dengue na
Filadélfia – EUA, embora existam indícios de que epidemias já ocorriam há vários
séculos. No início do século XX, Bancroft descobriu que o vetor de transmissão do
vírus da dengue, o Aedes aegypti, era o mesmo que transmitia a febre amarela. Em
1960, Hammon classificou os DENV por suas propriedades antigênicas em quatro
sorotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Scherer, em 1968, sugeriu que a
classificação de Hammon (sorotipo 1, 2, 3 e 4) fosse utilizada para discriminação de
sorotipos virais junto ao comitê de Organização Mundial de Saúde (OMS)
(BANCROFT, 1906; SILER et al., 1926; SCHERER, 1968, apud VERONESI &
FOCACCIA, 2002).
Atualmente, os quatro sorotipos estão circulando em quase todo o continente,
com ocorrência sistemática de casos de dengue hemorrágico (PAHO, 1999).
No Brasil, os primeiros relatos de dengue datam de 1846 e mostram surtos
ocorridos, simultaneamente nos Estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Bahia,
Pernambuco e em Estados do Norte do país. A partir de 1986, a dengue tornou-se
um problema de saúde pública nacional.
Fatores ecológicos associados a deficientes condições sócio-econômicas
resultaram em rápida dispersão do vírus pelo país e epidemias em diversos Estados
19
da Federação. Embora casos fatais de dengue tenham sido notificados durante a
epidemia do DENV-1 no Estado do Rio de Janeiro, foi após a introdução do DENV-2,
a partir de 1990, que resultou no aparecimento das formas mais severas da doença.
(SCHATZMAYR et al., 1986; CHIMELLI et al., 1990; NOGUEIRA et al., 1990).
Em 2004, a Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS), do Ministério da Saúde,
registrou um total de 107.168 casos de dengue, sendo confirmados 77 casos de
DHF/DSS (síndrome de choque da dengue), com 03 óbitos registrados nos Estados
de Minas Gerais e Alagoas. Foi identificada a circulação do sorotipo 3 do vírus no
Estado do Acre (Boletim da semana 04/2005 da Secretaria de Vigilância em Saúde SVS, página 02). Através desta denominação pode-se mostrar uma circulação dos
sorotipos 1, 2 e 3 do vírus em 24 unidades federais conforme mostrado na figura 5.
Figura 5 – Sorotipos do DENV circulantes por Estados no Brasil. Em Rondônia até o momento
foram isolados os sorotipos 1 e 3.
Fonte: Figura extraída do Boletim da semana 04/2005 da Secretaria de Vigilância em Saúde - SVS,
página 02.
O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e ao gênero flavivírus. São
esféricos, envelopados, com 40-50 nm de diâmetro e seu genoma é constituído por
um RNA de fita simples, de polaridade positiva, com aproximadamente 11 kb.
O vírus possui um nucleocapsídeo de simetria ecosaedrica envolvido por um
envelope viral, o qual e constituído por uma camada lipídica, como se observa na
figura 6 (BRINTON et al., 1986).
20
40 - 50 nm
Envelope E (55-60 KDa)
Membrana M (9 KDa)
Capside C (14KDa)
RNA fita simples (+) – (11KDa)
Figura 6 – Esquema do DENV. Os vírus dengue são envelopados e tem de 40-50 nm de diâmetro. A principal
proteína do envelope é a E que é glicosilada e possui propriedades antigênicas. A proteína M é da membrana e C
do capsídeo, juntamente com a proteína E compõe o grupo das proteínas estruturais do DENV. O material
genético viral é composto por uma fita simples de RNA de polaridade positiva (Figura extraída do “The Daily
Californian”, 21 de novembro de 2001, www.dailycal.org/article.php?id=7167)
Os sintomas gerais ocasionados por quaisquer sorotipos de vírus da dengue
são: febre, mal-estar, mialgias, cefaléia, dor retro-orbitraria, entre outros. Esses
sintomas surgem após o período de incubação de 3 a 14 dias com uma duração de
4 a 5 dias. Esses sintomas relacionam-se ao elevado nível cediço de citocinas
liberadas por macrófagos ao interagirem com linfócito T ativados. Durante a infecção
primaria são produzidos anticorpos IgM, detectáveis a partir do quarto dia após o
inicio dos sintomas, atingindo níveis mais elevados a partir do sétimo ou oitavo dia,
declinando lentamente.
A dengue pode evoluir para um quadro grave com hemorragia e/ou choque
hipovolemico, caracterizando a febre da dengue hemorrágica (DHF) ou a síndrome
do choque da dengue (DSS). Os fatores de risco da DHF e DSS são controversos.
Hastead em 1984 propôs a hipótese da “infecção secundária”, ou seja, anticorpos
não neutralizantes com imunoreatividade cruzada, produzidos durante a primeira
infecção podem facilitar a entrada em macrófagos de um vírus da dengue de
sorotipo diferente durante uma segunda infecção. No entanto, casos de DHF/DSS
são relatados em pacientes que tiveram a doença pela primeira vez (HENCHAL &
PUTNAK, 1990).
O diagnóstico da dengue pode ser obtido por isolamento direto do vírus no
sangue nos 3 a 5 dias iniciais da doença (fase de viremia), por exames de sangue
para detectar anticorpos contra o vírus (testes sorológicos),
moleculares conhecidos como PCR (LANCIOTTI et al 1992).
e por métodos
21
3.1 Proteínas para Sorodiagnóstico de Dengue
O genoma do DENV é constituído por 10 genes localizados em uma cadeia
aberta de leitura (OFR - Open Reading Frame) e traduzido em uma única
poliproteína que é clivada no lúmem do retículo endoplasmático. Os genes codificam
as 3 proteínas estruturais denominadas C, PrM e E, que estão localizadas na
extremidade 5’ do genoma viral. A partir desta região, no sentido 3’, estão
localizados os 7 genes que codificam as proteínas não-estruturais (NS) NS1; NS2a e
NS2b; NS3; NS4a e NS4b; NS5 (CHAMBERS et al., 1990).
No processo de replicação viral verifica-se a síntese de uma poliproteína que
após passar por modificações pós-traducionais, origina as proteínas com o mesmo
nome dos genes: estruturais C, PrM e E; e as proteínas não-estruturais NS1, NS2a e
NS2b, NS3, NS4a e NS4b, e NS5. (HANCHEL & PUTNAK, 1990) (Figura 7).
Figura 7 – Organização genômica dos Flavivirus. O genoma viral consiste em uma fita simples de RNA com
11.000 a 12.000 nucleotídeos, que codifica uma poliproteína que após proteólises gera 10 proteínas virais,
sendo 3 estruturais e 7 não-estruturais-NS (Peterson & Roehrig, 2001).
Colocar
3.2 Proteína não-estrutura NS1
Possuem cerca de 40 KDa e não tem função claramente definida na
fisiopatologia da infecção, embora haja evidências de que participe das etapas
iniciais da replicação viral. A proteína NS1 é secretada no meio extracelular, como
uma proteína solúvel, encontrada circulante no soro de pacientes infectados com
DENV (FALCONAR & YOUNG, 1991).
Esta proteína é secretada no plasma de indivíduos infectados na fase inicial
da infecção viral e o sistema imunológico produz anticorpos precocemente contra
ela, sendo assim, torna-se uma proteína de grande importância para produção de
insumos para diagnóstico precoce da dengue.
22
A predominância da resposta imunológica contra a proteína NS1 em
pacientes com infecção viral de dengue torna a NS1 um antígeno em potencial para
sorodiagnóstico.
3.3 Proteína não-estrutural NS3
A proteína NS3 de DENV é uma proteína citoplasmática relativamente grande
com 70 KDa, tem função de helicase e trifosfatase, além de funcionar como serina
protease
envolvida
na
clivagem
pós-traducional
da
poliproteína
viral.
(GORBALENYA et al., 1989; JAN et al., 1995; MONATH & HEINZ, 1996;
NESTOROWICZ et al., 1994; RICE et al., 1985; VICKY et al., 1999).
A proteína NS3 é conhecida por possuir atividade ATPase, helicase e
protease que são uma parte constituinte do complexo de replicação do vírus dengue.
(CORDEIRO G. et al., 2005).
Contudo, segundo estudos recentes, é possível detectar a proteína NS3
através
de
anticorpos
monoclonais
específicos
para
padronização
de
sorodiagnóstico da dengue, visto que essa proteína participa dos processos de
replicação de vírus da dengue. (CORDEIRO G. et al., 2005).
3.4 Proteína Estrutural E do Envelope
A proteína do envelope (E) é uma glicoproteina de 51-60 KDa, sendo o
principal componente protéico estrutural do vírus da dengue e o principal alvo da
resposta imune humoral. Apresenta quatro isoformas com diferenças na sua
estrutura primaria refletindo na possibilidade de se encontrar quatro sorotipos
diferentes.
E responsável pela fusão e interação com receptores específicos para o vírus
na superfície celular (FALCONAR & YOUNG, 1991; LEE et al., 1991).
Anticorpos monoclonais contra essas regiões especificas para cada isoforma
podem ser úteis para desenvolver um diagnóstico que permita monitorar a
distribuição precoce dos quatro sorotipos do vírus da dengue de forma eficaz.
23
4. LEISHMANIOSE
As leishmanioses constituem um crescente problema de saúde pública, não
somente no Brasil, mas como em grande parte dos continentes americano, asiático,
europeu e africano (WHO, 1990).
No Brasil existem duas formas do protozoário que causam a Leishmaniose
Visceral (LV) (Leishmania chagasi) e Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
(principalmente Leishmania amazonensis, L. guyanensis e L. braziliensis) que são
transmitidas ao homem, por insetos vetores conhecidos como flebótomos.
O
mosquito transmissor da LTA é popularmente denominado de “mosquito palha” ou
“birigui” (Figura 9).
A Leishmaniose Tegumentar Sul-Americana causa lesões ulcerativas da pele
muito parecidas com a forma lepromatosa da hanseníase, provocada pela ação do
protozoário flagelado Leishmania brasiliensis (Figura 8).
Figura 8- A Leishmania brasiliensis, protozoário flagelado (1 flagelo e ausência de membrana
ondulante) causador da Leishmaniose Tegumentar Sul-americana ou Ùlcera-de-Bauru.
Fonte: www.google.com/imagens. Site acessado em 15/11/2006.
/
24
Figura 9- O “mosquito-palha” (Phebotomus sp).
Fonte:www.google.com/ Imagens. Site acessado em 06/11/2006
/imagens
O quadro clínico da doença apresenta um período de incubação de dez dias a
três meses. Depois surge uma mancha avermelhada, uma lesão de aspecto
ulceroso na pele e esse primeiro sintoma geralmente regride espontaneamente. A
infecção, contudo, evolui e após vários meses aparecem lesões na pele e nas
mucosas. A seguir aparecem lesões cutâneas ulceradas ou não, disseminadas e
invasão das mucosas nasobucofaríngeas (NEVES D. P., 2004)
O parasita apresenta-se sob a forma aflagelada nos tecidos parasitados do
homem e dos animais receptivos, ou flagelada, no tubo digestivo do inseto
transmissor e nas culturas. Apresenta diferentes formas, de acordo com o ciclo do
parasita, medindo de 2 a 4 micra por 1,5 a 2,5 micra, nos maiores diâmetros.Possui
um núcleo situado na periferia e uma formação paranuclear, o cinetoblasto, que dá
origem ao flagelo (NEVES D.P., 2004).
A evolução da Leishmaniose no Brasil mostra uma expansão geográfica, pois
de acordo com a estatística mundial, foi calculado um índice global de infecção de
mais de 400.000 casos por ano, havendo indicações do aumento a cada ano
(DESJEUX P., 1992). A figura 10 mostra a incidência da Leishmaniose Tegumentar
Americana no Brasil de 1994 a 1999 principalmente na região norte e sua
distribuição geográfica no país com o decorrer dos anos.
25
Figura 10 - Circuitos por densidade de casos de LTA por município. Brasil, 1994-1999.
Fonte: FIOCRUZ/ENSP/DESP/ FUNASA/GENEPI/CGVEP/COVEH
4.1 Proteínas Candidatas para Sorodiagnóstico de Leishmaniose
Peptídeos sintéticos derivados da proteína ribossomal L-25 de Leishmania
braziliensis tem sido utilizada para diagnóstico de L. braziliensis. (GONZÁLE et al ,
2002).
A Proteína K-39 da Leishmania chagasi tem sido utilizada como insumo
diagnóstico. O titulo de anticorpos anti-rK39 diminuem significativamente após o
tratamento. A presença de anticorpos foi diretamente correlacionada com o
desenvolvimento positivo do resultado do teste da pele. A detecção de anticorpos
anti-proteína recombinante rK39 demonstrou ser sensível e específico para
sintomáticos de L. Visceral e pode diferenciar o progresso da auto-infecção. (BRAZ,
et al.,2002).
Os dados da antigenicidade mostraram que a proteína Hsp 70 da Leishmania
(Viannia) braziliensis é um antígeno altamente imunodominante reconhecido em
84% em soro de pacientes com L. cutânea e Mucocutânea podendo ser um
candidato potencial para sorodiagnóstico específico de L. Cutânea e L. MucoCutânea causada pela L. braziliensis. (ZURITA et al., 2003).
26
5. DOENÇA DE CHAGAS
A doença de chagas é uma das mais graves endemias brasileiras. Seu
agente etiológico é o protozoário Trypanossoma cruzi, descoberto em 1909 pelo
cientista brasileiro Carlos Chagas. O nome específico do parasita foi dado em
homenagem a Oswaldo Cruz, um grande pesquisador brasileiro, que fez importantes
estudos sobre doenças endêmicas (NEVES D. P., 2004).
Segundo o Ministério da Saúde e o Instituto de Medicina Tropical de São
Paulo, o Brasil apresenta cerca de 5 milhões de chagásicos no Brasil.
(MARCONDES, 2003).
Figura 11- “Barbeiro” (Panstrongylus megistus)
Fonte:www.google.com/imagens. Site acessado em 10/ 11/2006.
27
Figura 12- Formas de Tripanossoma cruzi encontrada no sangue de
pacientes infectados em fase aguda.
Fonte:www.google.com/imagens. Site acessado em 13/11/2006.
O Trypanossoma cruzi entra no hospedeiro a partir do ferimento da “picada”
dos triatomas, os populares “ barbeiros “ou “chupança” (Figura 11), sendo uma
moléstia de contágio indireto que atingem o baço e os gânglios linfáticos
comprometendo as fibras musculares, cardíacas
e ate as células neurológicas
(VASCONCELOS et al., 2006).
No interior celular, o parasita sofre um processo de diferenciação de uma
forma flagelada para uma forma esférica para posteriormente começar uma
reprodução assexuada ativa por bipartição, provocando lesões nas células.
O quadro clínico possui fase aguda e fase crônica e o período de incubação e
variável, sendo que no local da picada a área torna-se vermelha e endurecida,
constituindo o chamado Chagoma e quando esta lesão ocorre próxima aos olhos,
leva o nome de sinal de Romanã, que consiste em um edema bipalpebral unilateral
com infartamento ganglionar satélite (NEVES D. P., 2004).
Os casos fatais são raros e mesmo sem tratamento, a doença fica mais
branda e os sintomas desaparecem após algumas semanas ou meses. O coração, o
esôfago e o intestino grosso podem aumentar de tamanho, tornando inviável seu
funcionamento (NEVES D. P., 2004).
Mais recentemente, a associação de doença de Chagas a AIDS ou outros
estados de imunodepressão tem mostrado reincidência de quadro grave com o
comprometimento neurológico relacionados com meningite.
28
A profilaxia consiste basicamente no combate ao inseto vetor pelo uso de
inseticidas, melhoria das condições de habitação e educação sanitária (NEVES D.P.,
2004).
5.1 Proteínas Candidatas ao Sorodiagnóstico da Doença de Chagas
A proteína P2 Beta Ribossomal do Trypanossoma cruzi é o principal
determinante antigênico associado à cardiopatia chagásica crônica. Entretanto o
comportamento antigênico de cada proteína recombinante P 2 beta difere no
desempenho do diagnóstico e pode ocorrer uma reação cruzada com soro de
paciente negativo (MARCIPAR et al., 2004).
6. DOENÇAS INFECCIOSAS DE INTERESSE NÃO RESTRITAS ÀS REGIÕES
TROPICAIS
6.1 Toxoplasmose
A toxoplasmose é uma doença causada pelo protozoário Toxoplama gondii,
transmitido principalmente por contato com animais doméstico – entre os quais se
destaca o gato. Os animais eliminam nas fezes formas resistentes do protozoário
(cistos) que podem durar meses no solo úmido. O homem adquire então a doença
ingerindo essas formas, que são disseminadas por moscas, baratas e minhocas. A
ingestão de carne crua ou mal cozida, que contenha os cistos, e a transmissão ao
feto pela placenta são também formas de contágio. (VASCONCELOS et al., 2006).
O diagnóstico da doença é difícil, sendo possível apenas com testes de
laboratório, pois os sintomas são, na maioria das vezes, muito semelhantes aos de
várias outras doenças: mal-estar, dores de cabeça e musculares, prostração e febre
que geralmente duram muito tempo (semanas ou meses). Após alguns dias há
também aumento dos gânglios linfáticos em todo o corpo. Geralmente a evolução da
doença é benigna e desaparece sem qualquer conseqüência para o organismo. Às
vezes, porém, pode causar lesões oculares com perda parcial ou quase total da
visão. A doença pode atingir mulheres grávidas, comprometendo principalmente o
sistema nervoso do feto, causando retardamento mental ou levar à cegueira
permanente da criança (NEVES D. P.,2004).
29
O parasita possue estágio de reprodução sexuada (esporogonia) no interior
do organismo reservatório (rato, cão, gato) e uma fase de reprodução assexuada
(esquizogonia), no organismo humano. Essa reprodução alternante é indispensável
ao desenvolvimento do toxoplasma, razão pela qual não se pode deixar de
considerar a doença como enquadrada entre as de contágio indireto, a despeito de
se dar à contaminação através da água, alimentos e objetos de uso comum que
tiveram contato com a urina daqueles animais infectados (NEVES D.P., 2004).
O Toxoplasma gondii é um parasita intracelular do grupo dos Coccídios que
se encontra na natureza sob três formas evolutivas distintas. Duas delas, as formas
proliferativa e cística, são encontradas nos hospedeiros intermediários: o homem, os
mamíferos em geral e as aves. A outra se passa exclusivamente no epitélio intestinal
do gato, que é o hospedeiro definitivo, constituindo assim, o ciclo entero-epitelial
(FRENKEL J. K., 1982).
A Toxoplasmose na maioria das vezes é uma infecção silenciosa e seu
polimorfismo clínico dificulta o diagnóstico. O Toxoplasma pode ser encontrado nos
mais diversos tecidos e líquidos orgânicos, tais como líquor, exudatos, aspirado ou
fragmento de linfonodo, fígado músculo etc. (NEVES D. P. , 2004).).
6.2 Proteínas Candidatas ao Sorodiagnóstico da Toxoplasmose
A proteína P-35 é um antígeno de superfície do Toxoplasma gondii e já foi
seqüenciada (Gen Bank). Segundo experimentos de Imunoblot soros de pacientes
infectados com T. gondii na fase aguda reagem com a P-35 recombinante. Segundo
estudo recente (2006) a proteína P-35-GST foi utilizada como antígeno em Elisa
sanduíche duplo, e observaram uma sensibilidade de 100% e especificidade de 96%
deste antígeno. Os resultados mostraram que a taxa de IgM contra a proteína P-35
foi capaz de marcar a infecção aguda com o T. gondii (WU; SHY; ZHANG, 2006).
Na superfície do Toxoplasma gondii estão presentes 5 proteínas majoritárias
denominadas SAG, pelas quais se realiza o reconhecimento celular e adesão, as
mais abundantes são a P30 (SAG1) e a P22 (SAG2).
As proteínas GRA, oriundas do granulo denso do parasito e são secretadas
na forma de proteína de 29 KDa (GRA7), contendo regiões imunodominates do 24º100º aminoácido. Já a proteína GRA1 é secretada e reage com soro humano na
fase aguda e crônica da infecção.
30
Os antígenos recombinantes SAG1, GRA1 e GRA7 do Toxoplasma gondii
podem ser considerados uma importante ferramenta para detecção de anticorpos
IgG contra o Toxoplasma gondii em pessoas com Toxoplasma gondii aguda e
crônica e a GRA7 está mais relacionada com a Toxoplasmose aguda. A combinação
desses antígenos poderá aumentar a sensibilidade do teste de Elisa (PIETKIEWICZ
et al., 2004).
7. HEPATITE
A hepatite é uma inflamação do fígado que pode estar relacionada a causas
diversas, tais como: uso de alguns medicamentos, intoxicação por defensivos
agrícolas, uso excessivo de bebidas alcoólicas e agentes infecciosos. Os vírus são
os principais agentes infecciosos causadores das hepatites.
As hepatites virais apresentam distribuição mundial ampla e estão entre as
doenças infecciosas de maior importância para a saúde pública (LIEBER, 2002).
Antes da descoberta dos vírus, a diferenciação dos tipos de hepatite só era
possível pela observação do tempo de incubação da doença e forma provável de
contágio. Assim, eram identificados apenas dois tipos de hepatites: a de transmissão
oral-fecal, por exemplo, pela água ou alimentos contaminados e a de transmissão
sanguínea.
Na década de 60, Blumberg pesquisando as proteínas do sangue observou
no soro de um australiano a presença de um antígeno que denominou de “Antígeno
Austrália”, hoje reconhecido como o antígeno de superfície do vírus da hepatite B.
Desde então, a rápida evolução dos conhecimentos, possibilitou a detecção de
diferentes vírus capazes de causar hepatites na espécie humana.
Nos anos 70, foram descritos as partículas do vírus da hepatite B por Dane,
do vírus da hepatite A por Feinstone e da hepatite D, por Rizzeto. Na década de 80,
Choo descobriu o vírus da hepatite C e Balayan o vírus da hepatite E (LIEBER,
2002).
À medida que os vírus foram sendo descobertos, os testes para sua
identificação puderam ser desenvolvidos, possibilitando o diagnóstico.
31
A utilização rotineira dos testes sorológicos em unidades de hemoterapias
tem contribuído, de forma decisiva, para a redução do número de casos de hepatite
B e C pós-transfusionais.
Os principais vírus que causam hepatites na espécie humana são os vírus da
hepatite A, B, C, D e E. Esses vírus têm estrutura, forma e classificação diferentes
(LIEBER, 2002).
7.1 Hepatite Aguda por Vírus tipo A
A hepatite infecciosa A é transmissível pela ingestão de alimentos ou água
contaminada.
O vírus da hepatite A (hepa-RNA vírus) é um hepatovírus, com simetria
ecosaédrica e genoma constituído por uma simples fita linear de RNA, pertencente à
família Picornaviridae. É encontrado nas fezes de pessoas portadoras da doença e
de alguns primatas não humanos, incluindo chimpanzés. Questiona-se a
possibilidade
de
estes
animais
funcionarem
com
reservatórios
silvestres
(VASCONCELOS & GEWANDSNADJER, 2006).
Essa doença tem caráter esporádico e, por vezes, epidêmico. Tem evolução
benigna, com curso médio de duas semanas e regressão espontânea pela resposta
imune. Os sintomas são: mal-estar, fraqueza, falta de apetite, náuseas e dores
abdominais ao nível do fígado. Em pouco tempo a urina fica escura e a pele e a
esclerótica . ictéricos.
O vírus é encontrado nas fezes e em secreções do paciente, de modo que a
transmissão se faz principalmente pelo contato pessoa a pessoa (mãos não
devidamente lavadas após as evacuações, cumprimentos, uso de objetos comuns,
ingestão de alimentos e de água contaminados) bem como pela deficiência de
recursos higiênicos e de saneamento básico da região (VASCONCELOS &
GEWANDSNADJER, 2006).
O diagnóstico virológico da infecção pelo VHA pode ser feito pela detecção do
RNA do VHA (no soro, nas fezes ou no fígado) ou do antígeno (nas fezes) durante o
período de incubação ou no início da fase sintomática, mas o diagnóstico sorológico
é mais prático e está amplamente disponível (SILVA M.D. et al, 2001). Anticorpos
contra o VHA (Anti-VHA) podem ser detectados por uma variedade de técnicas
32
sorológicas, incluindo imunomicroscopia eletrônica, fixação do complemento,
imunofluorescência, radioimunoensaio e, o mais utilizado, o ensaio imunoenzimático
(EIE).
Estão em desenvolvimento testes para detecção de anticorpos na saliva (OBA
et al, 2000).
7.2 Hepatite B ou Hepatite por Vírus do Tipo B
O vírus da hepatite B (Hepa-DNA vírus) foi descoberto em 1965 e pertence à
família Hepadnaviridade. É o único vírus de hepatite que possui DNA (dupla fita),
como material genético, ao contrário de replicar seu DNA diretamente, ela passa
através de um estágio intermediário de RNA, semelhante ao retrovírus.
Apresenta longo período de incubação (de 30 a 180 dias, com media de 60 a
90 dias) e acomete preferencialmente indivíduos da faixa etária de 30 a 40 anos,
devido à transmissão sexual e transfusional.
Tem evolução mais complexa e seu curso tem sido relacionado a
complicações mais sérias e prognóstico mais reservado. Admite-se alguma relação
entre esse estado patológico e certa degeneração neoplásica (câncer) do fígado
(LIEBER et al, 2003)
O HBV pode evoluir para doença crônica, conhecida como cirrose hepática,
com danos permanentes no fígado e até mesmo evoluir para câncer hepático. As
hepatites dos tipos B podem se tornar hepatite crônica caracterizada pela
persistência da replicação viral por mais de seis meses. Estima-se a existência de
350 milhões de portadores crônicos do vírus da hepatite B, representando mais de
5% da população mundial. Uma preocupação importante é a forte correlação entre a
ocorrência de câncer de fígado e a incidência de infecções crônicas por hepatite B
(LIEBER, 2003).
A figura 13 mostra a prevalência mundial de pacientes crônicos para hepatite
B.
33
Figura 13 - Prevalência mundial de pacientes crônicos de Hepatite B.
Fonte: CDC 2000.
Potencialmente, todos os portadores (sintomáticos ou não) têm a capacidade
de infectar outras pessoas (ZUKERMAN & THOMAS, 1998). Os portadores crônicos
têm um risco 200 vezes maior de terem câncer de fígado, em relação à população
em geral (TORTORA, FUNKE & CASE, 2000).
O diagnóstico das formas clínicas da hepatite B realiza-se através de
técnicas sorológicas, por meio de marcadores sorológicos do vírus da hepatite B.
Tais técnicas revelam-se fundamentais não apenas para o diagnóstico, mas também
no seguimento da infecção viral, para avaliação do estado clínico do paciente e
monitoração da terapia antiviral (HOOFNAGLE J. H., 1983; HOOFNAGLE J. H. &
BISCEGLIE A. M., 1991).
As importantes descobertas realizadas nas áreas da virologia e da biologia
molecular desses vírus nos últimos anos foram progressivamente sendo
incorporadas na rotina diária dos laboratórios, permitindo acesso às modernas
técnicas capazes de avaliar a carga viral presente no indivíduo, o índice de
replicação do agente infeccioso e a eficácia de novas medicações utilizadas no
tratamento dessas viroses (LAU J.Y., 1993).
O antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) é o primeiro marcador a
aparecer, geralmente precede a hepatite clinicamente evidente, e também está
34
presente no portador crônico. O antígeno HBe (HBeAg) é detectado logo após o
aparecimento do HBsAg, sua presença indica a replicação viral ativa e sua
positividade por 8 a 12 semanas indica o desenvolvimento da hepatite B crônica.
O anticorpo contra o antígeno central da hepatite B tipo IgM (anti-HBc IgM) é
um marcador de replicação virótica e aparece no início da hepatite clínica , podendo
ser o único marcador sorológico do tipo agudo presente em alguns pacientes.
O anticorpo superficial da hepatite B (anti-HBs) pode aparecer tardiamente na
fase convalescente, e sua presença indica imunidade (CRUZ F. M. M. et al, 2000).
7.3 Hepatite C
O vírus da hepatite C foi identificado apenas em 1989 e representa um dos
mais relevantes problemas de saúde pública nos dias atuais.
O vírus possui 60nm de diâmetro, revestido de um invólucro lipoprotéico,
genoma constituído de ácido ribonucléico (RNA) e transmissível mediante sangue e
hemoderivados. Existem, pelo menos, seis variantes genotípicos. Cada variante
possui vários subtipos. Devido à alta capacidade de mutação do vírus da hepatite C,
muitos pacientes não conseguem eliminá-lo (LIEBER et al 2002-2003)
A seqüência do ácido nucléico do HCV apresenta organização genômica
similar a dos vírus pertencentes à família Flaviviridae (MILLER & PURCELL, 1990);
SUKLA et al., 1995). O genoma do HCV é constituído de uma molécula de RNA fita
simples, de polaridade positiva, com aproximadamente 9500 nucleotídeos. Esta fita
contém uma única e longa fase de leitura aberta (ORF- Open Reading Frame) que
codifica uma proteína com cerca de 3000 aminoácidos (BARTENSCHLAGER &
LOHMNN, 2000; CHO et al., 1991; SIMMONDS, 1999).
O desenvolvimento de técnicas laboratoriais que permitem o seu diagnóstico,
disponíveis desde 1992, tornou possível estimar em cerca de 170 a 200 milhões de
infectados em todo o mundo. Duas características de sua história natural conferem à
hepatite C uma enorme importância médico-sanitária: o longo período em que a
infecção permanece completamente assintomática, fazendo com que o indivíduo
não tome conhecimento e, portanto, não procure atenção especializada, e a sua
capacidade de se tornar crônica em até 85% dos infectados, elevando o risco de
complicações graves, como cirrose hepática e câncer de fígado. A hepatite C vem
35
sendo apontada como a mais importante pandemia desse início de século 21, sendo
responsável pela maioria dos casos de transplantes de fígado em inúmeros países.
(PASSOS, 2006).
A infecção pelo VHC tem uma distribuição universal, e suas altas taxas de
prevalência estão diretamente relacionadas aos chamados grupos de riscos
(hemofílicos, pacientes de hemodiálise, receptores de múltiplas transfusões de
sangue, recém-nascidos de mães portadoras de toxicômanos. A Figura 14 mostra a
prevalência mundial de portadores crônicos de hepatite C.
36
Figura 14 - Prevalência mundial de portadores crônicos de Hepatite C.
Fonte: WHO 2000.
A infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) também pode ser assintomática, ou
se apresentar na forma de hepatite aguda, com sintomatologia semelhante à
encontrada nas infecções pelos vírus das hepatites A e B. O período de incubação
varia de 2 semanas a 6 meses. A infecção sintomática ocorre em 30 a 40% dos
infectados, com icterícia presente em 20 a 30%. Os anticorpos desenvolvidos com a
infecção aguda não são protetores, portanto deixam de impedir a evolução para
hepatite crônica. A hepatite crônica se desenvolve em até 70% dos indivíduos
infectados, sendo que 85 a 100% dos indivíduos que apresentam infecção aguda
sintomática vão se tornar cronicamente infectados. Estas pessoas apresentam maior
risco ao desenvolvimento de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular, como
ocorre na hepatite crônica pelo vírus B. A hepatite fulminante é rara, entretanto
apresenta 80% de letalidade (ZUCKERMAN & THOMAS, 1998).
A principal forma de transmissão é a pós-transfusional (90 a 95% dos casos).
Há, também, a transmissão pós-hemodiálise e a dos usuários de drogas que
compartilham agulhas e seringas. Existem outras formas raras de infecção,
chamadas esporádicas, que incluem a sexual e a de mãe-filho.
37
Não existe, até o presente momento, vacina para o vírus da hepatite C.
Portanto, a prevenção está baseada nos controles de doadores de sangue e na
orientação quanto aos comportamentos, semelhante à recomendada para hepatite B
e AIDS.
Inicialmente, o diagnóstico da hepatite C pode ser realizado pela pesquisa de
anticorpos Anti-VHC, utilizando testes comerciais que empregam anticorpos
recombinantes. Os primeiros testes denominados testes de primeira geração,
empregavam apenas uma proteína. Para aumentar a sensibilidade do método e
diminuir o tempo necessário para a produção de anticorpos após a infecção , foram
desenvolvidos testes que incluem a combinação de antígenos, com isso o tempo de
soroconversão diminui em média para quinze semanas (SILVA M. D. et al, 2001).
Apesar dessas modificações para aumentar a sensibilidade, os ensaios
imunoenzimáticos ainda são questionados pelos resultados falso-positivos. A
especificidade pode ser aumentada com o emprego de um teste complementar do
tipo immunoblot recombinante, no qual os antígenos do VHC são individualizados
em uma fita de nitrocelulose (SILVA M. D. et al, 2001).
A PCR (polymerase chain reaction) é considerada a técnica “padrão ouro” no
diagnóstico do VHC, pois e capaz de diagnosticar pequenas quantidades de vírus no
soro, durante as primeiras semanas após a exposição ao vírus.Pode ser utilizada
para pesquisa qualitativa do RNA ou para estimar a quantidade presente no soro
(carga viral), também e útil na avaliação da resposta do tratamento da hepatite
crônica (DI BISCEGLIE, 1998).
Recentemente surgiu a possibilidade de detecção do VHC circulante pelo
método ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay) modificado, permitindo a
identificação presente, e não apenas de contato prévio ou atual (TANAKA et al.,
2000).
7.4 Hepatites Delta
O vírus da hepatite D (HDV) é um satélite para o vírus da hepatite B (HBV)
para transmissão e propagação e infecta quase 20 milhões de pessoas no mundo.
(DÉNY, 2006). A hepatite causada pelo vírus delta (HDV) é uma infecção que ocorre
como uma co-infecção em pacientes crônicos pelo vírus da hepatite B (HBV).
38
O genoma do vírus é constituído por RNA, protegido por uma capa protéica.
Ela sozinha não consegue se replicar nas células hepáticas, necessitando de
enzimas codificadas pelo genoma do vírus da hepatite B. Daí, a necessidade de coinfecção (LIEBER 2002-2003).
A infecção pelo vírus da hepatite D (HDV) é uma das mais importantes
etiologias de hepatites fulminante e pode agravar o desenvolvimento da infecção
pela HBV crônica no fígado. O HDV foi classificado em três genótipos, sendo que o
genótipo I é largamente propagado, o genótipo II é encontrado no leste da Ásia e o
genótipo II do HDV é predominante na América do Sul. (WU, 2006).
Estudos filogenéticos molecular recente do HDV sugerem a existência de
mais ou menos 07 classes. (WU, 2006).
O diagnóstico da hepatite D é baseado nos testes sorológicos, os mais
utilizados são os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) para pesquisa do Anti-VHD
IgM. A pesquisa do RNA do VHD por PCR ou por técnicas de hibridização molecular
tem importância fundamental no diagnóstico da hepatite crônica (SILVA M. S.,
2001).
O antígeno VHD aparece no soro no começo da infecção aguda e depende
principalmente da presença do Anti- HDV (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
7.5 Hepatite E
A doença é causada pelo vírus HEV e é também denominada de doença nãoA e não-B transmitida por via entérica. Essa doença não deve ser confundida com
outras hepatites também denominadas hepatites não-A e não-B transmitidas por via
parenteral, como a hepatite C. Os sintomas incluem indisposição, anorexia, dor
abdominal, artralgia e febre (FOCACCIA., 1996)
O vírus da hepatite E possui 32 a 34 nm de diâmetro e pode ser encontrado
nas fezes durante a fase aguda precoce da infecção. É um vírus pequeno,
constituído por ácido ribonucléico (RNA), não possui envelope e pertence à família
Calcinavidae.
O período de incubação pode variar de 15 a 64 dias, com uma média de 26 a
42 dias em epidemias e a transmissão ocorre principalmente por água contaminada
e pessoa-a-pessoa, por via oral-fecal, existindo também a possibilidade de ser
transmitida por outros alimentos (FOCACCIA, 1996).
39
Saneamento básico e higiene pessoal parecem ser as melhores medidas de
prevenção (CVE/SES-SP, 2000).
A definição do agente infeccioso responsável pela hepatite E é dado através
da investigação dos marcadores sorológicos Anti-VHE ou RNA-VHE. Existem várias
técnicas para investigação dos marcadores sorológicos, porem a mais utilizada é a
imunoenzimática. O vírus tipo E é detectado na fase aguda, através da presença do
Anti-VHE IgM, que geralmente aparece após 3 ou 4 semanas após ter surgido à
icterícia. Apenas 50% dos indivíduos mantém-se detectáveis após 6 a 12 meses.
7.6 Proteínas Candidatas ao Sorodiagnóstico de Hepatite
As proteínas utilizadas no soro diagnóstico das hepatites virais, B e C são do
Capsídeo do Vírus.
Em relação à hepatite E pesquisadores expressaram e purificaram a proteína
ORF2 do vírus da larva Spodoptera litura infectada com baculovírus recombinante. A
proteína purificada tem aproximadamente 56 KDa e foi utilizada em Elisa para
detectar anticorpos para HEV. (SEGHAL; MALIK; JAMEEL, 2003). Os resultados
foram compatíveis com os resultados obtidos usando um kit comercial de detecção
de anticorpos anti-HEV. Segundo o estudo a expressão do antígeno em sistema de
larva de insetos é rápido e de baixo custo, não havendo a necessidade de
equipamentos especiais, alem de se tratar de sistemas de expressão de proteínas
em organismos eucarióticos (SEHGAL; MALIK; JAMEEL, 2003).
Já existe no mercado um teste de ELISA de terceira geração que utiliza
proteínas recombinantes (core (proteína-estrutural), NS3, NS4 e NS5 (proteínas
não-estruturais) que tem como função capturar anticorpos Anti-HCV circulantes no
soro de pacientes. Essas proteínas são empregadas também no teste denominado
imunoblot, complementar ao ELISA, e foi desenvolvido para distinguir as
reatividades sorológicas especificas das não especificas encontradas nos testes de
ELISA. No imnunoblot, as proteínas recombinantes do HCV estão individualmente
fixadas em uma fita de nitrocelulose (SILVA M. D., 2001).
O teste é considerado positivo quando 2 ou mais bandas são detectadas na
fita de nitrocelulose , representando uma reação antígeno-anticorpo especifica.
Entretanto, um resultado pode ser considerado indeterminado quando a reação gera
somente 1 banda na fita de diagnóstico. Nesse caso, e necessário realizar o
40
diagnóstico através de técnicas moleculares. Segundo HONDINKA (1999), o
imunoblot é um teste de fácil execução , mas de custo elevado e menos sensível do
que o ELISA (SILVA M. D. et al, 2001).
8. METODOLOGIA PARA PRODUZIR INSUMO DIAGNÓSTICO A BASE DE
ANTICORPOS E PROTEÍNAS RECOMBINANTES
8.1 Seleção da Região Alvo para a Produção do Insumo
Primeiramente, antes de produzir Insumo Diagnóstico para detecção de uma
determinada doença, é de suma importância que se faça um estudo aprofundado da
mesma e de seu agente etiológico em todos os seus aspectos, para que se possa
cultivá-lo em laboratório para a realização de vários testes.
Dando seguimento a obtenção de proteínas recombinantes, é necessário
análises de bioinformática daquilo que será clonado. A maioria dos cromossomos já
está disponível em bancos genômicos e a estrutura do DNA molde poderá
selecionar as regiões a serem clonadas.
Fazer o seqüenciamento e a análise comparativa da estrutura do gene entre
as seqüências de nucleotídeos do gene disponíveis no GenBank é um passo
essencial para confirmação daquilo que está sendo produzido.
8.2 Clonagem Gênica e suas Ferramentas para Produção de Proteínas
Recombinantes
A partir da década de 70, novas tecnologias foram desenvolvidas, permitindo
o desenvolvimento e purificação de genes específicos num processo chamado de
Clonagem Gênica. Atualmente a tecnologia para tal está acessível para qualquer
pesquisador.
A clonagem gênica compreende vários estágios assim resumidos: Isolamento
de regiões alvo do DNA, na qual requer ferramentas que permitam a manipulação da
dupla fita de DNA específicas obtidas por extração do DNA do agente etiológico e
amplificação da região selecionada em grandes quantidades por PCR. Inserção,
com auxilio de enzimas de restrição, da região alvo do DNA em vetores gênicos, tais
41
como plasmídios bacterianos. Incorporação do plasmideo contendo a região alvo
por bactérias especiais que são capazes de produzir a proteína escolhida como se
fosse estruturas próprias da bactéria (PATUSSI et al, 2003).
Atualmente, os tipos básicos de vetores gênicos usados na metodologia
clonagem gênica apresentam características específicas que os tornam excelentes
veículos de clonagem em diferentes situações. Os principais tipos de vetores
gênicos que estão sendo atualmente utilizados são: Plasmídeos, Cosmídeos,
Bacteriófagos, BACs e YaCs, vetores de expressão são os Plasmídeos Baculovírus
e Leveduras, respectivamente. Estes vetores gênicos são introduzidos em
organismos vivos, procarióticos ou eucarióticos para produção da proteína alvo.
Como já citado acima, é importante checar durante a clonagem nos vetores
gênicos a seqüência inserida. Atualmente, o seqüenciamento gênico se tornou muito
acessível,
em
razão
da
tercerização
de
laboratório
especializados
em
seqüenciamento gênico.
Após a clonagem gênica em sistemas de expressão, o passo seguinte é a
purificação das proteínas alvo. Atualmente, os vetores gênicos são desenvolvidos de
modo que a proteína produzida pelo organismo procariótico ou eucariótico apresente
domínio especial que permitirá a purificação por cromatografia de afinidade. Dois
tipos de domínio especial são utilizados na biologia molecular das proteínas
recombinantes: domínio com hexapeptídio de Histidina ou proteína glutationa S
transferase. A pureza das proteínas pode ser monitorada pela técnica tradicional de
eletroforese em gel de poliacrilamida e espectrometria ótica.
8.3 Produção de Anticorpos como Insumos Reagentes
Os testes sorológicos utilizam o princípio da detecção de antígenos oriundos
do agente causador da doença infecciosa através de anticorpos específicos. O
anticorpo é uma ferramenta molecular excepcional devido a sua capacidade
bifuncional, atribuída pela capacidade em reagir especificamente a um antígeno pela
região Fab e pela interação molecular da região Fc com diferentes moléculas.
Assim, a produção de anticorpo depende da capacidade, principalmente dos
mamíferos, em produzir anticorpo específico a um antígeno em resposta a um
contato com o mesmo antígeno. Os animais mais utilizados para este fim são:
camundongos, ratos, coelhos e cabras. Entretanto a imunização induz a produção
42
de uma gama de anticorpos específicos aos diferentes epítopos do antígeno. O
desenvolvimento da tecnologia dos anticorpos monoclonais (KHÖLER e MILSTEIN,
1975) permite o desenvolvimento de clones de células B que secretam o mesmo
anticorpo através de um processo de formação de células hibridas denominadas
hibridomas. Estas células se originam pela fusão da membrana celular de linfócito B
com uma célula mielóide de camundongo tumoral.
Os hibridomas adquirem a
capacidade em secretar anticorpos do linfócito B e a capacidade de crescimento
contínuo em cultura celular das células tumorais.
Os protocolos para imunização variam dependendo do potencial antigênico e
da natureza do antígeno. Em geral, utiliza-se de 3 a 4 inoculações do antígeno com
adjuvante de Freund. Geralmente, os animais utilizados em esquemas de
imunização para obtenção de anticorpos monoclonais são ratos e camundongos. As
vias de inoculação mais empregadas para a imunização são intraperitoneal,
subcutânea, intravenosa e intramuscular.
Os esquemas de imunização são elaborados para obter IgG de alta afinidade.
Para isso, se empregam concentrações de antígeno mais baixas, porém períodos de
imunização longos (três ou mais doses). As proteínas solúveis de alto peso
molecular e os antígenos celulares são bons imunógenos. Os peptídeos sintéticos,
devido ao seu menor peso molecular, são pobres imunógenos, sendo necessário
acoplá-los a uma proteína carreadora, para uma adequada resposta imune, Como
exemplo de proteínas carreadoras, podemos citar a albumina sérica bovina (BSA).
Carboidratos e lipopolissacarídeos dificilmente induzem a uma resposta secundária.
Para camundongos adultos a quantidade de proteínas na imunização deve
ser de 5 a 50 g. Em coelhos, estes valores aumentam em 10 vezes. O intervalo
entre as inoculações geralmente é de uma semana. Entre
os
períodos
de
imunização, o sangue dos animais imunizados deve ser coletado para avaliar a
produção dos anticorpos no soro.
8.3.1 Principio Básico da Metodologia dos Anticorpos Monoclonais
O princípio da produção de anticorpos monoclonais envolve a fusão de dois
tipos de células: uma de origem mielóide, denominada mieloma, que se tornou
alterada a ponto de crescer continuamente em meio de cultura e é capaz de induzir
43
tumor em camundongos; e o outro tipo de célula é oriundo de animais mortos para
extração de órgãos linfóides secundários, tais como baço e linfonodos.
O mieloma é também de origem murina e produzem nucleotídeos apenas
pela via denominada “de novo” (Figura 15). Esta via é bloqueada pela
suplementação de aminopterina no meu de cultura provocando a morte das células
mielóides tumorais. Além disto, estas linhagens tumorais são deficientes das vias de
salvação nas quais utilizam a timidina quinase e hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (Figura 15). Estes vias estão presentes nos linfócitos B de camundongos
e
são
estimuladas
bioquimicamente
quando
timidina
e
hipoxantina
são
suplementadas em meio de cultura.
Assim na fusão do mieloma com o linfócito B extraído do camundongo,
originam-se células hibridas denominadas hibridomas, e que são selecionadas pela
capacidade de crescimento contínuo na presença de meio HAT contendo
aminopterina, para bloqueio da síntese de novo, e timidina e hipoxantina, que são
substratos iniciais de duas vias de salvação, a timidina quinase e a hipoxantina
guanina fosforribosil transferase, respectivamente (Figura 15).
44
Figura 15 - Esquema das vias bioquímicas de síntese de nucleotídeos por células. Bloqueio da via “de novo”
por aminopterina e síntese de nucleotídeos pelas vias HGPRT e TK pela suplementação dos substratos iniciais
(hipoxantina e timidina) no meio de cultura seletivo para produção de hibridomas em que o meio de seleção
atua no crescimento de híbridos. (Adaptado a partir de Abbott & Povey, 1995 e Abbas Lichtman & Pober,
1998).
8.3.2 Células Utilizadas na Produção dos Anticorpos Monoclonais
Os hibridomas originam-se da fusão de dois tipos de células obtidas por
caminhos diferentes e que continuam a crescer em meio seletivo HAT suplementado
com hipoxantina, aminopterina e timidina. São elas: linfócitos B e mielomas.
Os linfócitos B são obtidos após a morte de animais imunizados sob anestesia
e excisão do órgão linfóide, seja baço ou linfonodo. A população de células
predominantemente constituída de linfócitos B, T e células dendríticas ou
macrofágicas é tratada de modo que não haja sofrimento que poderia diminuir a
viabilidade celular.
Para isto, o baço ou linfonodo do animal imunizado e que
apresenta uma boa resposta imune deve ser coletado em condições estéreis e
transferido para meio RPMI contendo soro fetal bovino a 10%. Para evitar
45
sofrimento, as células extraídas do órgão macerado é centrifugado com velocidades
não drásticas (200 g, por 10 min) e a viabilidade do sedimento celular é determinada
microscopicamente.
A população de mielomas é mantida em cultura celular tradicional em razão
da característica de imortalidade das células crescidas in vitro. Existem algumas
linhagens de mielomas, um exemplo é a célula SP2-0 (SHULMAN et al., 1978).
Estas células crescem e são armazenadas da maneira tradicional. Estas células são
mantidas em meio RPMI e soro fetal bovino e a viabilidade celular é importante para
desenvolvimento dos hibridomas.
Uma outra população celular utilizada durante o desenvolvimento dos
hibridomas é extraída do peritônio de animais sacrificados. Esta população celular e
rica em células fibroblásticas e macrofagicas que fornecem fatores de crescimento e
citocinas para o crescimento e estabilidade dos hibridomas. Esta população
denominada “feeder-layer”, em razão de ser camada alimentadora de fatores
endógenos, permite crescimento dos hibridomas recém formados com também
auxilia na manutenção da estabilidade quando os hibridomas são crescidos
isoladamente por diluição limite. Estas células são retiradas facilmente por infusão
de um lavado peritoneal.
8.3.3 Principio da Fusão Celular
O princípio de fusão para formação dos hibridomas envolve a capacidade de
uma solução de polietilenoglicol (PEG 1500) em promover a fusão da membrana
plasmática e permitir a mistura dos núcleos e citoplasmas de mielomas e linfócitos
do órgão linfóide. Isto é realizado rápido e suavemente. De uma maneira aleatória,
as células híbridas que conseguirem misturar seus cromossomos a ponto de adquirir
as duas características desejadas, imortalidade in vitro e capacidade em secretar
anticorpos específicos ao antígeno usado na imunização, são selecionadas e
utilizadas continuamente como fonte de uma célula clonal secretora de um único tipo
de anticorpo, denominado monoclonal. A Figura 16 mostra resumidamente as
etapas da metodologia de desenvolvimento dos anticorpos monoclonais.
46
Figura 16 - Produção de anticorpos
monoclonais: Imunização de camundongo (ou
rato) com o antígeno de interesse, induzindo a
proliferação de linfócitos produtores de
anticorpos específicos ao antígeno; Cultivo in
vitro das células de mieloma, deficientes em
HGPRT; Fusão dos linfócitos B do animal
imunizado com as células de mieloma, pela
adição do PEG, com posterior formação dos
híbridos; Seleção das culturas produtoras de
anticorpos de interesse através do meio HAT;
Clonagem e posterior expansão in vitro ou in
vivo dos híbridos de interesse. (Adaptado a
partir de Abbott & Povey, 1995).
O tempo necessário para a obtenção dos Hibridomas é de aproximadamente
10 dias. A estabilidade dos hidridomas é observada pelo crescimento de população
celular em cada cavidade das placas de cultura. Observada a confluência nas
cavidades de cultura, inicia-se o teste para a detecção de populações híbridas
secretoras dos anticorpos de interesse. Estes testes utilizam os mesmos ensaios
imunológicos usados durante a imunização dos animais.
Os hibridomas crescem imortalizados pela característica do mieloma e
selecionam-se aqueles que secretam anticorpos específicos ao antígeno usado na
imunização após os ensaios imunológicos. Contudo a formação dos hibridomas
47
ocorre de uma maneira aleatória e geralmente as populações celulares de cada
cavidade são constituídas de uma mistura de clones de hibridomas diferentes.
Para a obtenção de uma população clonal secretora de um único tipo de
anticorpo os hibridomas são crescidas em uma concentração limite ajustada de 1 a 2
células por cavidade em placas previamente preparadas com células “feeder”. Esta
etapa, conhecida como clonagem de hibridomas (Peres C. M. et al., 2005)
8.4. Práticas Laboratoriais para Otimização da Cultura Celular
Temperatura e pH devem ser constantes e monitorados. A temperatura ideal
da incubadora deve ser de 37°C ± 1°C e o pH ótimo não deve variar de 7,2. Assim o
meio de cultura mais utilizado é o RPMI suplementado com 10-20% de soro fetal
bovino e glutamina, piruvato e aminoácidos não essenciais.
Células de mamíferos não são boas competidoras com microrganismos,
portanto antibióticos, penicilina e estreptomicina, são os mais utilizados em razão do
grande espectro em se evitar o crescimento de microrganismos.
O Polietilenoglicol é disponível em diferentes pesos moleculares. O
polietilenoglicol a ser utilizado varia de acordo com o protocolo, contudo pesos
moleculares mais baixos são mais tóxicos às células.
48
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