Regiani Nascimento Gagno Porto - evz - ppgca

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
MICOPLASMOSE E UREAPLASMOSE GENITAL DE BOVINOS:
Avaliação histopatológica do trato reprodutor feminino e estudo
dos mecanismos de ativação do sistema imune inato.
Regiani Nascimento Gagno Pôrto
Orientadora: Profª. Drª. Maria Lúcia Gambarini Meirinhos
GOIÂNIA
2008
i
REGIANI NASCIMENTO GAGNO PÔRTO
MICOPLASMOSE E UREAPLASMOSE GENITAL DE BOVINOS:
Avaliação histopatológica do trato reprodutor feminino e estudo
dos mecanismos de ativação do sistema imune inato.
Tese apresentada para obtenção
do grau de Doutor em Ciência
Animal
junto
Veterinária
à
da
Escola
de
Universidade
Federal de Goiás
Área de concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientador:
Profª. Drª. Maria Lúcia Gambarini Meirinhos
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Benedito Dias de Oliveira Filho
Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito
GOIÂNIA
2008
ii
OFEREÇO
Aos meus pais, ITALCY e FORTUNATO, pelo amor, dedicação e por terem
me ensinado os verdadeiros valores da vida.
À família Gagno de Moraes, Regina, Rogério, Giovanna e Ivan pelo apoio e
incentivo em todos os momentos.
DEDICO
Ao meu esposo FÁBIO HENRIQUE e aos meus filhos,
HENRIQUE e FERNANDO, pelo amor, carinho, apoio e compreensão pelos
momentos de ausência.
iii
“Se as coisas parecem inatingíveis não é motivo para não querê-las
Que triste os caminhos se não fora a mágica presença das estrelas”
Mário Quintana
iv
AGRADECIMENTOS
A autora expressa os seus sinceros agradecimentos:
A Deus, por todas as graças a mim concedidas;
Aos integrantes da banca examinadora;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pelo
auxílio financeiro concedido, que viabilizou a execução deste trabalho;
À Universidade Federal de Goiás, pela oportunidade proporcionada à realização
deste curso;
À Professora Drª. Maria Lúcia Gambarini Meirinhos pela orientação segura,
amizade, apoio e tolerância durante este período;
Ao colega de pós-graduação Marco Antônio Viu, pela presteza e auxílio nas
análises estatísticas;
À Profª. Drª. Maria Auxiliadora Andrade e toda sua equipe pelo apoio, empenho e
determinação durante a execução dos exames bacteriológicos;
À Profª. Dª. Ana Paula Kipnis, à colega de pós graduação Ediane Batista e aos
colegas do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública – IPTSP pela valiosa
colaboração no processamento das amostras;
À Drª. Maristela Vasconcelos Cardoso e sua equipe do Instituto Bacteriológico de
São Paulo pelo isolamento e identificação do Ureaplasma diversum e
Mycoplasma spp.
A Rogério Moraes Souza pela confecção e tratamento das imagens;
v
Aos amigos e colegas do Setor de Patologia Animal, Luiz Augusto Batista Brito,
Eugênio Gonçalves de Araújo, Ana Paula Iglesias Santin, Moema Pacheco
Chediak Matos, Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura, pela amizade,
confiança, convivência harmoniosa e auxílio neste trabalho;
Ao amigo e colega técnico administrativo, Antônio Souza e Silva, pela amizade,
agradável convivência e auxílio na realização do experimento;
Aos
alunos
de
graduação
Érika,
Márcia
e
Rômulo,
pelo
auxílio
e
comprometimento na realização das colheitas de material, confecção das lâminas
e exames microbiológicos;
Aos demais familiares, pelo apoio e incentivo;
Aos docentes e funcionários da Escola de Veterinária – UFG, que direta ou
indiretamente colaboraram na realização deste trabalho.
vi
SUMÁRIO
CAPITULO 1 – Considerações gerais................................................................
01
REFERÊNCIAS................................................................................................... 13
CAPÍTULO 2 – Histopatologia do trato genital de fêmeas bovinas púberes
portadoras de ureaplasmose genital .................................................................. 16
RESUMO............................................................................................................
16
ABSTRACT.........................................................................................................
17
INTRODUCAO....................................................................................................
18
MATERIAL E METODOS.................................................................................... 28
RESULTADOS E DISCUSSAO..........................................................................
33
REFERÊNCIAS................................................................................................... 45
CAPÍTULO 3 – Avaliação in vitro da ativação de células mononucleares
endometriais, vaginais e no sangue periférico bovino pela produção de óxido
nítrico em resposta ao Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium e
Ureaplasma diversum ......................................................................................
51
RESUMO............................................................................................................
51
ABSTRACT.........................................................................................................
52
INTRODUCÃO....................................................................................................
53
MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 63
RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................
66
REFERÊNCIAS................................................................................................... 75
CAPÍTULO 4 – Considerações finais.................................................................. 81
vii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2
FIGURA 1 – Representação do trato reprodutor da fêmea bovina e locais dos
fragmentos histológicos....................................................................................... 31
FIGURA 2 – Fotomicrografia de: A – Tuba uterina, fímbria, mostrando
vesículas intra-epiteliais (seta) (200X - H&E); B – Fímbria onde se nota
curvatura de cílios (seta) (400X - H&E); C – Istmo apresentando projeção do
citoplasma de células epiteliais para o lúmen (seta) (400X - H&E); D – Ampola
com presença de áreas de destruição de cílios (seta)........................................
37
FIGURA 3 – Fotomicrografia de: A - Útero mostrando destruição de epitélio
glandular com infiltração de linfócitos (seta) (200X - H&E) e B – Útero
apresentando edema de submucosa (seta) (200X - H&E); C - Fragmento de
Cérvix onde se nota extensa necrose de fibras musculares, de aspecto
eosinofílico (seta) (400X - H&E) e D - Útero apresentando infiltrado
polimorfonuclear focal na submucosa (seta) (400X – H&E)...............................
40
FIGURA 4 – Fotomicrografia de: A - Fornix mostrando presença de
disceratose das células epiteliais (seta) (400X – H&E) e B – Fornix mostrando
presença de espongiose (seta), discreta atrofia do epitélio e congestão da
lâmina própria (400X – H&E); C – Vulva apresentando infiltrado linfocitário
difuso na submucosa - exocitose (seta) (100X – H&E) e D – Vulva mostrando
presença de disceratose das células epiteliais (setas). 400 X (H&E)................
43
CAPÍTULO 3
FIGURA 1 – A – Fotomicrografia de esfregaço oriundo de cultivo de células
vaginais e U. diversum mostrando presença de célula epitelial de
descamação com agente aderido externamente (seta) (400X - Giemsa) e B –
presença de microrganismos de forma filamentosa - Ureaplasma diversum
(seta) (400X - Giemsa); C - Esfregaço oriundo de cultivo de células do sangue
e M. bovis, mostrando célula mononuclear ativada (seta) (1000X - Giemsa). D
- Esfregaço oriundo de cultivo de células endometriais e M. bovigenitalium
mostrando célula mononuclear (400X - Giemsa)................................................
73
viii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
TABELA 1 – Freqüência de animais com diferentes graus de lesão na mucosa
vulvovaginal pelo exame macroscópico - Goiânia, 2006......................................... 33
TABELA 2 – Taxa de aproveitamento dos fragmentos obtidos nas diversas
porções do trato reprodutor de fêmeas bovinas - Goiânia, 2006.............................
34
TABELA 3 – Freqüência de fragmentos processados e examinados da mucosa
da tuba uterina, cérvix, vagina e vulva encontradas em fêmeas bovinas púberes,
de acordo com o grau de lesão encontrado - Goiânia,2006.................................... 35
TABELA 4 – Média e Erro Padrão dos escores das lesões nos diversos
segmentos do trato reprodutor* de fêmeas bovinas - Goiânia, 2006.......................
36
TABELA 5 - Média e Erro Padrão dos escores das lesões observadas na tuba
uterina de fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006..............................................
37
TABELA 6 - Freqüência de fragmentos processados e examinados da mucosa
uterina pelo exame histopatológico, de acordo com o grau de lesão encontrado Goiânia, 2006........................................................................................................... 38
TABELA 7 - Média dos escores das lesões observadas nos cornos uterinos
encontrados em fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006...................................... 40
TABELA 8 - Média e Erro Padrão dos escores das lesões observadas nas
porções cervicais de fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006.............................. 41
TABELA 9 - Média e Erro Padrão dos escores das lesões observadas no trato
reprodutor inferior de fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006............................. 44
CAPÍTULO 3
TABELA 1 - Freqüência de amostras de sangue, vagina e útero com maior
produção de NO, em relação aos meios de cultivo celulares – Goiânia, 2007........
66
TABELA 2 - Produção de óxido nítrico, em nM/mL, em cultura de células
mononucleares oriundas de amostras de sangue periférico, expostas aos cultivos
bacteriológicos de Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis e Mycoplasma
bovigenitalium - Goiânia, 2007................................................................................ 68
TABELA 3 - Produção de óxido nítrico, em nM/mL, em cultura de células
mononucleares oriundas de amostras de zaragatoas vaginais, expostas aos
cultivos bacteriológicos de Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis e
Mycoplasma bovigenitalium – Goiânia, 2007........................................................... 70
TABELA 4 - Produção de óxido nítrico, em nM/mL, em cultura de células
mononucleares oriundas de amostras de zaragatoas endometriais, expostas aos
cultivos bacteriológicos de Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis e
Mycoplasma bovigenitalium - Goiânia, 2007........................................................... 71
ix
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 2
Quadro 1 – Classificação das lesões de vulvovaginite granular conforme a
severidade...............................................................................................................
28
Quadro 2 – Classificação das lesões histopatológicas uterinas conforme a
severidade...............................................................................................................
30
Quadro 3 – Classificação das lesões histopatológicas do trato genital conforme a
severidade...............................................................................................................
32
x
RESUMO
Dois estudos foram desenvolvidos para avaliar a ação dos principais
micoplasmas considerados patogênicos ao trato reprodutor dos bovinos. No
primeiro estudo foi feita a avaliação das lesões causadas pelo Ureaplasma
diversum sobre as mucosas do trato reprodutor de fêmeas bovinas púberes e no
segundo, avaliou-se, in vitro, a habilidade do Ureaplasma diversum, Mycoplasma
bovis e Mycoplasma bovigenitalium em ativar células mononucleares oriundas do
endométrio, mucosa vaginal e sangue periférico de vacas negativas para estes
agentes pela verificação da produção de óxido nítrico. No estudo das lesões
causadas pelo U. diversum foram avaliadas 177 novilhas púberes, das quais 20
seriam abatidas por motivos econômicos. Nestes animais foi realizado exame
clínico geral, avaliação da mucosa vulvovaginal observando-se a presença ou não
de lesões e exame bacteriológico. Os animais dos quais se obteve isolamento
positivo para U. diversum foram abatidos e tiveram seus sistemas reprodutores
colhidos, processados e examinados descrevendo-se as lesões encontradas e
classificando-as em escores apropriados. Concluiu-se que os achados
histopatológicos do trato reprodutor de fêmeas naturalmente infectadas por este
agente são compatíveis com lesões que comprometem o processo reprodutivo
em todas as suas fases. Portanto, animais portadores de lesões vulvares e
vaginais compatíveis com a infecção pelo U. diversum devem ser precocemente
identificados e retirados do rebanho. O estudo sobre a habilidade dos
micoplasmas em ativar células do sistema imune inato foi realizado com 33
fêmeas bovinas adultas, hígidas e não gestantes. Colheram-se amostras de
células do sangue periférico, endométrio e vagina, as quais foram cultivadas,
expostas ao agente e tiveram mensurada a produção de óxido nítrico em cada um
dos meios. Conclui-se que estes agentes são capazes de ativar a produção de
óxido nítrico em material celular oriundo do endométrio, mucosa vaginal e sangue
periférico, sugerindo que este seja um dos mecanismos envolvidos na resposta
imediata do trato reprodutor à infecção por estes microrganismos, porém não o
mais efetivo.
Palavras-Chave: infertilidade, vulvovaginite granular, óxido nítrico, bovinos
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os sistemas de produção de bovinos são vistos hoje como empresas, e
como tal, devem gerar lucros a fim de garantir sua subsistência. Existem muitos
fatores que interferem, direta ou indiretamente, sobre os sistemas produtivos, os
relacionados à saúde reprodutiva dos rebanhos, bem como as desordens
observadas no processo reprodutivo.
As desordens reprodutivas são responsáveis por grandes prejuízos
econômicos, pois interferem diretamente na taxa de fertilidade dos rebanhos
bovinos, reduzindo o número de animais nascidos ao ano, retardando a obtenção
de nova gestação e impondo manejo diferenciado para as diversas categorias de
animais (CARDOSO et al, 2000a; KUNZ et al., 2004).
Para PETIT et al. (2008), muitos problemas reprodutivos são causados
por microrganismos que invadem o trato genital provocando lesões, levando à
infertilidade e morte embrionária, entre outras manifestações. Nos últimos anos é
crescente o relato da ocorrência de infecções por microrganismos diversos, entre
os quais se destacam os da família Mycoplasmataceae, em particular dos
gêneros Mycoplasma e Ureaplasma, isolados com freqüência do sistema
reprodutor dos bovinos (KUNZ et al., 2004). Segundo PETIT et al. (2008),
Mycoplasma (M.) spp. e Ureaplasma (U.) diversum existem no trato genital de
bovinos com ou sem doença genital.
O gênero Mycoplasma apresenta diversas espécies, porém somente
duas, Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium são consideradas
patógenos potenciais para o trato reprodutivo dos bovinos (METTIFOGO, 2000).
O Mycoplasma bovis, uma das espécies de maior patogenicidade para bovinos,
provoca casos graves de mastite, pneumonia e poliartrite, além de estar
relacionado com infertilidade e abortamento experimental. O Mycoplasma
bovigenitalium tem sido isolado em casos de vulvite granular, endometrite
necrosante, infertilidade, abortamento e mastite em fêmeas, bem como em
vesiculite seminal e epididimite em machos (CARDOSO et al., 2000b; THOMAS et
al., 2003; VANDEN BUSH & ROSENBUSCH, 2004; PETIT et al., 2008).
O Ureaplasma diversum, única espécie do gênero isolada em bovinos,
é um patógeno oportunista encontrado nas mucosas e secreções da vulva, vagina
2
e úbere, associado à ocorrência de vulvovaginite granular, salpingite, endometrite,
mastite, infertilidade, perda embrionária, abortamento, morte neonatal e no macho
leva à vesiculite seminal, balanopostite e epididimite (RAE et al., 1993;
CARDOSO et al., 2000b; CHELMONSKA-SOYTA et al., 2001; PETIT et al., 2008).
KUNZ et al. (2004), com a finalidade de estudar a síndrome
vulvovaginite granular pela identificação dos principais agentes causais e
relacionar sua ocorrência com a severidade das lesões na mucosa vulvovaginal,
avaliou novilhas da raça Nelore de três diferentes propriedades. O autor verificou
a presença de lesões características da colonização da mucosa vaginal pelos
microrganismos considerados oportunistas, destacando-se o Mycoplasma bovis e
o Ureaplasma diversum sendo que o U. diversum foi o agente isolado em 27
(56,25%) animais, seguido pelo gênero Mycoplasma, presente em 11 (22,29%)
novilhas; em amostras de 10 (20,38%) animais ambos os gêneros estiveram
presentes.
A presença de U. diversum foi relatada em rebanhos do Estado de São
Paulo que apresentavam problemas reprodutivos, onde a prevalência variou de
23% a 52,9% (CARDOSO et al., 2000a; CARDOSO et al., 2000b).
OLIVEIRA FILHO et al. (2005) em estudo realizado no estado de
Alagoas com o objetivo de avaliar a relação entre o U. diversum e lesões de
vulvovaginite em fêmeas de aptidão leiteira, relataram que em 93 vacas com
histórico de repetição regular de estro após três ou mais inseminações artificiais,
colheu-se
muco
vulvovaginal
de
24
(escolhidas
aleatoriamente)
para
processamento bacteriológico, encontrando-se 41,67% das amostras positivas
para o referido agente. Seu isolamento esteve positivamente relacionado à
presença de lesões na mucosa vulvovaginal, especialmente àquelas de grau 1, o
que indica que este agente deve ser considerado como responsável por queda na
eficiência reprodutiva, promovendo retorno ao estro, provavelmente em
conseqüência de mortalidade embrionária.
3
1 Micoplasmas
Os micoplasmas são microrganismos pertencentes à classe Mollicutes,
ordem Mycoplasmatales, família Mycoplasmataceae, que compreende o gênero
Mycoplasma, com 102 espécies conhecidas, e o gênero Ureaplasma com seis
espécies. Micoplasmas são pequenos procariontes desprovidos de parede
celular, sendo limitados apenas pela membrana citoplasmática (VANDEN BUSH
& ROSENBUSCH, 2002, 2004). São incapazes de sintetizar peptideoglicanos e
seus precursores, sendo conseqüentemente resistentes às penicilinas e seus
análogos. São pleomórficos, variando sua forma de esférica até delgados
filamentos ramificados. Geralmente são imóveis, Gram-negativos, coram-se bem
pela técnica de Giemsa e requerem esteróis e ácidos graxos para seu
crescimento. Suas colônias típicas são pequenas, usualmente menores que um
milímetro de diâmetro, apresentando aparência característica de “ovo frito”,
consistindo numa zona granular e opaca na região central e outra periférica, plana
e translúcida, sendo este aspecto dependente das condições de crescimento. São
anaeróbios facultativos, e as condições ótimas para seu isolamento primário são
atmosfera composta de 95% N2 + 5% de CO2, temperatura de 36-37º C e pH de
6,0 - 6,5 (CARDOSO et al., 2000b; METTIFOGO, 2000; KUNZ et al., 2004).
A virulência dos microrganismos da família Mycoplasmataceae está
relacionada a muitos fatores, incluindo interações com o sistema linforreticular,
alterações na resposta imune celular e humoral, bem como indução e produção
de substâncias citotóxicas como amônia e peroxidase, sendo a habilidade do
microrganismo de aderir à célula hospedeira um importante fator de virulência e
condição essencial para o estabelecimento da infecção (MILLER et al., 1994;
KUNZ et al., 2004).
1.1 Mycoplasma spp.
O gênero Mycoplasma apresenta 19 espécies que já foram isoladas de
bovinos ocasionando infecções no trato respiratório, urogenital, articulações,
glândula mamária e conjuntiva. Apenas duas, Mycoplasma bovis e Mycoplasma
4
bovigenitalium,
são
considerados
patogênicos
para
o
trato
reprodutivo
(METTIFOGO, 2000; VANDEN BUSH & ROSENBUSCH, 2004).
Mycoplasma bovis é hospedeiro-específico e considera-se que a
maioria dos rebanhos bovinos está infectado (HAYMAN & HIRST, 2003). É
considerada uma das espécies de maior patogenicidade para bovinos,
provocando casos graves de mastite em gado leiteiro, pneumonia e poliartrite em
bezerros, além de estar relacionado com infertilidade e abortamento experimental.
Em novilhas inoculadas com este agente diretamente no útero foi possível
observar vários graus de endometrite, salpingite e salpingoperitonite. O agente
pode permanecer viável no sêmen de touros por até 18 meses congelado em
nitrogênio líquido, mantendo a capacidade de provocar lesões no sistema
reprodutor de fêmeas (METTIFOGO, 2000; LYSNYANSKY et al., 2001;
NICHOLAS & AYLING, 2003; THOMAS et al, 2003).
A despeito de evidências claras de seu potencial patogênico, pouco se
sabe sobre os mecanismos de citoaderência e fatores moleculares envolvidos.
THOMAS et al. (2003) utilizaram 18 amostras do agente, metabolicamente
marcadas, isoladas de diferentes órgãos e examinadas em ensaios de aderência
usando quatro diferentes linhagens de células do hospedeiro. Os autores
observaram que a taxa de aderência à célula fibroblástica foi significativamente
menor do que a aderência às células epiteliais, concluindo que não há correlação
entre expressão de proteínas de superfícies variáveis (Vsps) e as taxas de
aderência. Isto se deve provavelmente ao grande número de adesinas, variáveis
e não-variáveis, na superfície de células de M. bovis.
Em estudos conduzidos por KREUSEL et al. (1989), espécies de M.
bovis experimentalmente usadas em infecções intraprepuciais foram re-isoladas
em sete de oito touros, nos quais se observavam, apesar da ausência de
manifestação clínica da doença, lesões inflamatórias leves em dois animais.
BIELANSKI et al. (2000), utilizaram, para a fertilização de oócitos
bovinos, amostras de sêmen contaminado com células de micoplasmas e
submetidas aos protocolos de tratamento recomendados pela Sociedade
Internacional de Transferência de Embriões, com o objetivo de avaliar a
efetividade em remover a contaminação por esses agentes. Esses autores
concluíram que o M. bovis não é removido dos embriões mesmo após 10
5
lavagens e suplementação dos meios com antibióticos, o que prova a viabilidade
pós-congelação de ambos os agentes no sêmen e sua capacidade de aderir à
membrana do espermatozóide e à zona pelúcida de embriões produzidos in vitro.
PETIT et al. (2008), estudando a prevalência de infecções por
micoplasmas em gado de leite na Áustria, observaram em 261 esfregaços
cervicais, a presença de M. bovis e M. bovigenitalium (0,4% e 3,4% das amostras,
respectivamente). No que se refere ao M. bovigenitalium, verificaram correlação
entre a quantidade de animais que haviam abortado em um ano e os animais
positivos para este agente (12,5%), porém não houve diferença entre o número
de animais com endometrite e vaginite e o número de animais saudáveis. De 283
esfregaços vaginais colhidos de fêmeas aparentemente saudáveis, nenhum foi
positivo para M. bovis e 2,3% foram positivos para M. bovigenitalium.
Ainda neste estudo, os autores colheram soro sanguíneo de um grande
número de animais para análise da presença de anticorpos contra M. bovis e M.
bovigenitalium. Acima de 10% das amostras foram positivas para M. bovis e
acima de 25% para M. bovigenitalium. A ocorrência de anticorpos contra M. bovis
não foi correlacionada com endometrite, vaginite ou abortamento. Em relação ao
M. bovigenitalium, não houve correlação entre soropositividade e endometrite ou
vaginite. Metade dos animais com histórico de abortamento no período de um
ano, tinham anticorpos contra M. bovigenitalium e cerca de um terço dos animais
sem histórico de abortamento foram soropositivos para este mesmo agente.
1.2 Ureaplasma diversum
No gênero Ureaplasma estão incluídas cinco espécies que se
diferenciam de acordo com o hospedeiro, características sorológicas e relação
entre as bases guanina e citosina (G+C%) presentes no DNA. A única espécie
isolada em bovinos é o Ureaplasma diversum, que apresenta três sorotipos
classificados em A, B e C, devido às diferenças antigênicas, às quais são
atribuídos graus distintos de patogenicidade (CARDOSO et al., 2000b;
METTIFOGO, 2000). As células são pleomórficas, ou seja, sua forma varia de
acordo com a cepa, a idade da cultura e o método de exame. Embora apresentem
6
fraca coloração pelo método de Gram são considerados microrganismos Gramnegativos, sem parede celular contínua e têm em torno de 330 nm de diâmetro;
são imóveis, microaerófilos, sendo condições ótimas para seu crescimento
temperaturas ao redor de 37º C e pH de 6,0 a 6,5. Suas colônias geralmente são
pequenas, entre 15 e 60 µm de diâmetro, de coloração marrom dourado quando
em meios de cultura específicos acrescidos de indicadores, podendo muitas
vezes não apresentar o aspecto de “ovo frito” característico de outros membros
da classe dos Mollicutes. Para o crescimento requerem esteróis como fonte de
lipídios para síntese da membrana e todas as cepas possuem a habilidade de
hidrolisar a uréia com produção de amônia por meio da enzima urease, sendo
esta uma das principais características do gênero (CARDOSO et al., 2000a;
KUNZ et al., 2004).
Os ureaplasmas, anteriormente denominados Mycoplasma T devido à
morfologia da sua colônia, foram renomeados para Ureaplasma devido à sua
habilidade única de catabolizar a uréia (SANDERSON et al., 2000).
Existem evidências epidemiológicas e experimentais que comprovam o
papel do U. diversum como agente causador de doenças reprodutivas em
bovinos, mas a síndrome reprodutiva associada a este agente é multifatorial, pois
o mesmo, por si só não é capaz de produzir uma doença, embora os fatores
adicionais necessários para o estabelecimento desta síndrome ainda não sejam
conhecidos (SANDERSON et al., 2000).
O Ureaplasma diversum é um patógeno oportunista do trato genital de
bovinos que causa vulvite granular, abortamento e infertilidade. Mortes
embrionárias precoces contribuem para redução do desempenho reprodutivo em
vacas, entretanto, a patogênese deste processo ainda permanece obscura
(CARDOSO et al., 2000a; CHELMONSKA-SOYTA et al., 2001). O U. diversum
tem sido associado com abortamentos e infertilidade. Entretanto, culturas
positivas também são obtidas de animais sem doença reprodutiva aparente. Isto
sugere que o isolamento de U. diversum da vulva e vestíbulo pode ser normal,
mas do cérvix e útero significa uma condição patológica (SANDERSON et al.,
2000; PETIT et al., 2008).
A primeira vez que Ureaplasmas foram isolados do trato reprodutivo de
bovinos foi em 1967, na Inglaterra, sendo posteriormente isolados do muco
7
cérvico-vaginal e sêmen de animais aparentemente saudáveis (DOIG et al.,1980).
Estes autores, inoculando o agente no útero de 23 novilhas da raça Holstein e na
cérvix de três novilhas da mesma raça e necropsiando-as posteriormente,
concluíram que algumas cepas de ureaplasma podem ser patogênicas para o
trato reprodutivo superior e podem ser consideradas significantes quando isoladas
de casos de vulvite granular, endometrite ou salpingite.
O primeiro estudo bacteriológico da infecção por U. diversum em
bovinos foi conduzido na França em cinco touros e 565 vacas leiteiras. O agente
foi isolado em 74% das amostras de sêmen e em 40% das vacas. Estudos
sorológicos mostraram a predominância dos sorotipos B e C nos machos, e B nas
fêmeas. Porém a relação entre a infecção nas vacas e as lesões de vulvite
granular, ou entre a infecção e o desempenho reprodutivo não foi estabelecida
(Le GRAND et al., 1995).
O U. diversum está associado às doenças reprodutivas, em particular
com as lesões granulares da vulva e vagina ou vulvovaginite granular (VVG)
(CARDOSO et al, 2000a; SANDERSON et al., 2000). CARDOSO et al. (2000b),
pesquisando o agente em muco vulvovaginal de 152 animais com desordens
reprodutivas, provenientes de sete fazendas de produção de leite no estado de
São Paulo, encontraram freqüência de 38,8% e KUNZ et al. (2004) observaram
56,2% de positividade para o U. diversum em novilhas pré-púberes da raça
Nelore, o que sugere o envolvimento deste agente na VVG dos rebanhos
brasileiros e possivelmente em outras doenças reprodutivas.
O agente pode ser associado à morte embrionária precoce e
abortamento no primeiro trimestre. CARDOSO et al. (2000b) citando MAXIE
(1986), ressalta que em Ontário, Canadá, o U. diversum é considerado um dos
agentes mais importantes envolvidos em abortamentos, sendo responsável por
10% dos casos de abortamento analisados num período de 10 anos.
Este microrganismo tem distribuição mundial, tornando o comércio
internacional de animais, sêmen industrializado e produtos de transferência de
embriões uma fonte potencial de disseminação. Este agente também pode ser
introduzido na propriedade pela compra de animais provenientes de rebanhos
infectados e ser transmitido para outros animais através de equipamentos
8
contaminados, ou mesmo de animal para animal por meio das secreções (LEÓN
et al., 1995; CARDOSO et al., 2000b).
A principal forma de transmissão é a venérea, podendo acontecer
durante a monta natural, na inseminação artificial ou na transferência de
embriões. A transmissão pode ocorrer horizontalmente, pelo contato com urina
contaminada de vacas infectadas, ou verticalmente, durante a passagem do feto
pela vagina no momento do nascimento (CARDOSO et al., 2000b; KUNZ et al.,
2004).
SPRECHER et al. (1999) examinaram 100 amostras de sêmen de
bovinos de corte observando morfologia espermática, presença de leucócitos no
sêmen e presença de potenciais patógenos reprodutivos. A maioria das amostras
(94%) continha um ou mais patógenos reprodutivos tais como Haemophilus
sommus,
Mycoplasma
bovigenitalium,
Arcanobacterium
pyogenes
e
o
Ureaplasma diversum.
O U. diversum adere à zona pelúcida do embrião sem alterar sua
integridade, sendo freqüentemente encontrado nos fluidos utilizados no
processamento de embriões, o que sugere que o embrião pode atuar como vetor
mecânico para os microrganismos que seriam introduzidos no útero de animais
não contaminados (MILLER et al., 1994)
As síndromes clínicas freqüentemente associadas à infecção por U.
diversum são a vulvite granular, infertilidade, abortamento e nascimento
prematuro. A vulvite granular é caracterizada por hiperemia e desenvolvimento de
nódulos de cor cinza, marrons ou avermelhados, com um a dois milímetros de
diâmetro, sendo mais proeminentes na porção ventral da mucosa vulvar. Os
nódulos aparecem geralmente em um a cinco dias após a infecção, persistindo
por vários meses tornando-se pequenos e translúcidos, dificultando por vezes sua
visualização, podendo retornar à forma inicial com presença de descarga
purulenta nos estros subseqüentes (CARDOSO et al., 2000a; METTIFOGO,
2000).
Surtos de infertilidade causada pela infecção pelo U. diversum podem
ou não estar associados à evidências clínicas de vulvovaginite, mas quando a
fase aguda da doença predomina no rebanho pode-se observar marcada redução
de fertilidade, até 20%, e se prolongar por período de até seis meses. A taxa de
9
concepção do rebanho atingido aumenta gradualmente durante este período, mas
geralmente permanece de 10% a 15% abaixo dos índices adequados. A repetição
de estro, um dos principais sinais observados, ocorre devido à ausência da
fertilização, morte do embrião antes do 14º dia, ou em conseqüência de morte
embrionária ou fetal entre 40 e 90 dias de gestação (CARDOSO et al., 2000a;
METTIFOGO, 2000; KUNZ et al., 2004).
Em alguns casos o U. diversum estimula a síntese de prostaglandina
(PG) F2 , potente hormônio luteolítico. Em outros casos inibe a síntese da
prostaglandina E2, um dos principais hormônios relacionados ao reconhecimento
materno da gestação (CHELMONSKA-SOYTA et al., 1994; OLIVEIRA FILHO et
al., 2005), contribuindo para a redução do desempenho reprodutivo pelo aumento
da mortalidade embrionária.
Abortamento, nascimento prematuro ou a morte de bezerros fracos
recém-nascidos pode ocorrer após a infecção por este agente, devido à
placentite, caracterizada pela presença de fibrose difusa, infiltração acentuada de
células mononucleares, presença de focos de necrose, exsudato fibrinoso e
mineralização do tecido, ou em conseqüência de pneumonia que acomete o feto,
com alveolite difusa caracterizada por degeneração e necrose do epitélio alveolar
com intensa infiltração de macrófagos e granulócitos, com maior ocorrência no
terço final da gestação (MILLER et al., 1994; METTIFOGO, 2000).
Em estudos recentes PETIT et al. (2008), avaliando a prevalência de
infecções por micoplasmas em bovinos na Áustria, observaram a presença de U.
diversum em 261(11,9%) amostras de esfregaços cervicais. Observaram também
que animais com vaginite (8/15 - 53,3%) foram mais propensos a serem positivos
para U. diversum que animais sem sinais de vaginite (127/346 - 36,7%).
2. Mecanismos de defesa uterino
Segundo ABRAHAMS (2005), durante muito tempo o trato reprodutivo
feminino foi visto como um ambiente estéril, livre de microrganismos ou células de
defesa. Porém, atualmente sabe-se que este aparelho possui células de defesa,
principalmente ligadas ao sistema imune e que este último representa um
10
importante
componente
do
trato
reprodutivo,
influenciando-o
em
vários
momentos. O mecanismo pelo qual o útero responde aos agentes agressores
envolve uma interação entre os componentes da resposta imunológica celular,
representada pela fagocitose e morte pelos leucócitos uterinos, resposta humoral
por meio de imunoglobulinas e mecanismos físicos.
Segundo HUSSAIN (1989), o mecanismo celular da defesa é
representado principalmente pelos neutrófilos, sendo que a presença dessas
células é a característica mais importante num processo inflamatório agudo,
constituindo a primeira linha de defesa do organismo.
TIZARD (1985) afirmou que com a alteração da permeabilidade
vascular, a saída do fluido reduz a pressão osmótica dos vasos, fato que
impulsiona as células brancas de defesa para a periferia do endotélio,
favorecendo a migração destas células para os tecidos. Esta migração é
composta cronologicamente por marginação vascular, adesão à superfície
endotelial e diapedese, que representa a transposição da parede capilar, ou seja,
a mobilização dos neutrófilos para o local da lesão.
O mecanismo humoral da resposta imune contribui na defesa uterina
através das imunoglobulinas. No início do processo inflamatório a permeabilidade
do endotélio da circulação local está alterada, permitindo a saída de fluidos do
sistema vascular para os tecidos e cavidades. As imunoglobulinas são anticorpos
produzidos a partir de determinados antígenos e são constituídas basicamente
por proteínas chamadas globulinas (SONCINI, 1988).
GALINDO et al. (2004) afirma que o mecanismo físico é representado
pela remoção do fluido e partículas do útero através das contrações miometriais,
principalmente no período pós-parto imediato. A manutenção das contrações
uterinas após a expulsão fetal favorece a eliminação do conteúdo, reduzindo a
proliferação de microrganismos inespecíficos, pois nesta fase poderá ocorrer
comprometimento da cavidade uterina e conseqüentemente da vida reprodutiva.
Para PAISLEY et al. (1986), o mecanismo de defesa uterino durante a
fase progesterônica é pouco efetivo porque o pH uterino é baixo, sendo favorável
ao crescimento bacteriano; o epitélio uterino é menos permeável, impedindo a
estimulação do sistema leucocitário; o aparecimento dos leucócitos na luz uterina
11
é atrasado e a secreção uterina resultante da ação progesterônica não tem efeito
desintoxicante.
Processos inflamatórios, tais como a endometrite, ocorrem durante o
período pós-parto e estão associados primariamente com a contaminação do trato
reprodutivo
por
diferentes
microrganismos.
Células
inflamatórias
polimorfonucleares (PMNs) contribuem parcialmente com os mecanismos de
defesa contra agentes contaminantes da vagina e do lúmen uterino. O número de
leucócitos na luz uterina é relativamente alto durante o metaestro e diestro, porém
a atividade funcional não é afetada. As concentrações de anticorpos humorais no
trato reprodutivo são estimuladas através da exposição a antígenos locais e a
resposta é dependente da localização, sendo que imunoglobulina do tipo G (IgG)
predomina no útero. Geralmente a concentração de proteínas imunossupressoras
presentes no lúmen uterino aumenta sob influência do hormônio progesterona e
isso inibe a proliferação de linfócitos, tornando o útero mais suscetível à infecção.
A relação entre a suscetibilidade uterina, a contaminação de microrganismos e a
fase luteal do ciclo estral ainda não está esclarecida (DHALIWAL et al., 2001).
Vulvite e vaginite são periodicamente observadas em novilhas e vacas.
A infecção vaginal parece ser a mais freqüente em fêmeas jovens, mas pode ser
encontrada em animais de qualquer idade. A infecção ocorre tanto de forma
aguda quanto de forma crônica, resultando em lesões de um a cinco dias após o
contato com o U. diversum. A partir dos sinais característicos da doença, tais
como hiperemia, presença de grânulos no epitélio da vulva e vagina, seguidos ou
não por descarga vaginal purulenta, os animais apresentam alta sensibilidade
epitelial e todas as manifestações freqüentemente envolvidas nas endometrites
(CARDOSO et al., 2000b).
Segundo VASSELON & DETMERS (2002), a imunidade inata é um
sistema antigo e evolutivo que provê os organismos multicelulares com
mecanismos de defesa eficazes contra uma grande variedade de patógenos,
mesmo sem exposição prévia. Este sistema inclui a habilidade em reconhecer
estruturas presentes em grande grupo de microrganismos, a ativação de
mecanismos eficazes que destruirão microrganismos encontrados e a ativação e
orientação de respostas imunes adaptativas que, através do aumento de número
12
de
linfócitos
serão
destinadas
especificamente
contra
microrganismos
persistentes.
A família de receptores conhecidos como receptores Toll exercem papel
central no início das respostas imune-celulares inatas. Esta família de receptores
fornece moléculas de transmembrana que se ligam ao compartimento extracelular
onde ocorre o contato e reconhecimento de patógenos bacterianos, e o
compartimento intracelular, onde cascatas de eventos conduzem o início das
respostas celulares (VASSELON & DETMERS, 2002).
ABRAHAMS (2005) descreve 11 receptores do tipo Toll identificados
em mamíferos, dos quais 10 são expressos em humanos, TRL-1 ao TRL-10.
Receptores do tipo Toll são amplamente expressos em todo o sistema imune,
particularmente no inato. Entretanto, estes receptores podem estar presentes em
células não integrantes do sistema imune, especialmente aquelas de barreiras
biológicas tais como o epitélio presente nas mucosas. Além disso, a expressão
desses receptores nas mucosas é importante para o sistema de defesa do
hospedeiro contra patógenos externos.
Apesar de existirem vários estudos focalizando a expressão dos
receptores Toll na mucosa intestinal e respiratória, têm crescido as evidências
que a mucosa dos órgãos reprodutivos representam uma importante barreira
imunológica. Portanto, a expressão dos receptores Toll no trato reprodutivo das
fêmeas provê este sistema com um especializado mecanismo de defesa
(ABRAHAMS, 2005).
Com o objetivo de avaliar a condição histopatológica do trato genital de
fêmeas bovinas púberes naturalmente infectadas com Ureaplasma diversum e
avaliar in vitro a possível ativação de células mononucleares presentes em
amostras obtidas da mucosa do endométrio e vaginal, assim como do sangue
periférico por meio da avaliação da produção de óxido nítrico em resposta ao
Mycoplasma
bovis,
Mycoplasma
desenvolveu-se este estudo.
bovigenitalium
e
Ureaplasma
diversum,
13
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CAPÍTULO 2. HISTOPATOLOGIA DO TRATO GENITAL DE FÊMEAS BOVINAS
PÚBERES PORTADORAS DE UREAPLASMOSE GENITAL.
RESUMO
Com o objetivo de estudar e caracterizar as lesões presentes no trato
reprodutor de novilhas naturalmente infectadas por Ureaplasma diversum e
portadoras de lesões características da vulvovaginite granular por este agente,
fragmentos de tuba uterina, útero, cérvix, vagina e vulva de 20 animais
pertencentes a um rebanho comercial foram avaliados. As lesões macroscópicas
da mucosa vulvovaginal foram classificadas em graus de Zero, ausência de
lesões, até Quatro, com inflamação acentuada e lesões pustulares e/ou
necróticas. Na avaliação histopatológica utilizou-se uma classificação de lesões
em escores de Zero a Quatro, de acordo com o tipo e quantidade de alterações
inflamatórias presentes. Nenhum dos animais examinados apresentou lesão
macroscópica vaginal de Grau Zero, no entanto, os diferentes segmentos internos
dos tratos reprodutivos não mostraram alterações dignas de nota. Os fragmentos
com lesões microscópicas mais severas (Graus 3 e 4) foram aqueles oriundos
das tubas uterinas e do útero, os quais apresentaram infiltração leucocitária com
destruição do epitélio e/ou necrose. As alterações teciduais verificadas nos
fragmentos obtidos da região inferior do trato reprodutivo foram menos severas,
porém com características de processos inflamatórios mais agudos,
provavelmente pela re-infecção constante. Os resultados mostram que os
achados histopatológicos do trato reprodutor de fêmeas naturalmente infectadas
por Ureaplasma diversum são compatíveis com lesões que podem comprometer o
processo reprodutivo desde o processo de capacitação do espermatozóide para
fertilizar o gameta feminino, a implantação do embrião até a manutenção da
gestação. Portanto, animais portadores de lesões vulvares e vaginais compatíveis
com a infecção por este microrganismo devem ser precocemente identificados no
rebanho, pois além de favorecer a redução nas taxas de fertilidade ainda podem
tornar-se disseminadores do microrganismo.
Palavras-Chave: Histopatologia, Ureaplasma diversum, reprodução, bovinos.
17
CHAPTER II. HISTOPATOLOGY OF THE REPRODUCTIVE TRACT OF
PUBERTAL HEIFERS WITH GENITAL UREAPLASMOSIS
ABSTRACT
In order to study and characterize the lesions present in the
reproductive tract of heifers naturally infected with Ureaplasma diversum and
granular vulvovaginitis by this agent, fragments of uterine tube, uterus, cervix,
vagina and vulva of 20 animals belonging to a commercial herd were evaluated.
The macroscopic lesions of the vulvovaginal mucosa were classified in scores of
“0”, no injuries, until “4”, with severe inflammation and pustular and/or necrotic
lesions. The hystopathological evaluation was performed using a classification of
injuries in scores of “0” to “4”, according to the type and quantity of inflammatory
present alterations. None of the animals examined showed macroscopic vaginal
lesion 0, but the macroscopic evaluation of the different segments of the internal
reproductive tract showed no changes. The fragments with more severe
microscopic lesions (3 and 4) were those from the uterine tubes and uterus, which
showed leukocytes infiltration and destruction and/or necrosis of epithelium.
Alterations observed in the lower reproductive tract fragments were mild, but
characteristics of more acute inflammatory processes, probably by the constant reinfection. The results show that the histopathological findings of the reproductive
tract of females naturally infected with Ureaplasma diversum are consistent with
injuries that compromise the reproductive process since the acquisition of the
ability of sperm to fertilize and of the oocyte to be fertilized until the pregnancy
maintenance. Therefore, animals with vaginal and vulvar lesions consistent with
infection by this microorganism should be identified early in the herd, because,
besides the reduction in the fertility rates caused by tissue damages, they can
contribute to disseminate the microorganism.
Key words: Hystopatology, Ureaplasma diversum, reproduction, bovine.
18
1. INTRODUÇÃO
O processo reprodutivo é um dos mais importantes fatores que
determinam a eficiência do sistema de produção de bovinos. Esta eficiência pode
ser traduzida nos lucros gerados por este sistema, sendo o principal objetivo de
qualquer sistema de produção a obtenção do maior número de nascimentos de
animais saudáveis, no menor período de tempo.
Os baixos índices de natalidade de um sistema de produção podem
estar relacionados com a fertilidade da fêmea bovina, sendo que o processo
inflamatório e a infecção do trato reprodutor atuam como importantes fatores
neste acontecimento, pois promovem condições indesejáveis no ambiente uterino
e tubárico, dificultando ou mesmo inviabilizando desde a sobrevivência do
espermatozóide até o desenvolvimento embrionário (MARTINS et al., 2002).
A involução uterina no puerpério, por exemplo, pode ser dificultada pela
ação de microrganismos que chegam ao útero pela vagina, processo nem sempre
associado às condições de higiene e manejo durante o parto. A detecção da
fêmea infértil no rebanho ocorre freqüentemente pela verificação da repetição do
estro em intervalos regulares ou não, após o período puberal. Mesmo as fêmeas
que concebem mais tardiamente são consideradas inférteis apenas após o
primeiro parto, quando a persistência de processos infecciosos uterinos atrasa a
nova concepção e pode ser um fator de descarte precoce de fêmeas que seriam
potencialmente produtivas no rebanho. Para BELL & ROBERTS (2007), o dano
tecidual causado pelo parto ou durante a inseminação artificial, e a
imunossupressão têm importante papel no estabelecimento e manutenção de
processos infecciosos do sistema reprodutor bovino.
BONNET et al. (1991) obtiveram forte associação entre isolamentos
positivos para Arcanobacterium pyogenes e lesões teciduais uterinas em material
proveniente de vacas entre o 26º e 40º dias após o parto. Já GALINDO et al.
(2004) verificaram que vacas repetidoras de estro nem sempre mostravam
cultivos de conteúdo uterino positivos para microrganismos potencialmente
patogênicos ou oportunistas, mas sempre apresentavam algum dano no
endométrio. KUNZ et al. (2004) observaram que mesmo antes da puberdade,
fêmeas bovinas podem apresentar cultivos positivos para microrganismos
19
patogênicos ao sistema reprodutor, demonstrando associação entre a presença
de microrganismos da família Mycoplasmataceae, principalmente dos gêneros
Mycoplasma e Ureaplasma, com taxas de gestação reduzidas em novilhas.
Ureaplasmas são membros da classe Mollicutes, oportunistas, que
colonizam o trato reprodutor de fêmeas e machos e estão envolvidos na
infertilidade de muitas espécies, incluindo humanos e bovinos, distintos dos outros
membros dessa classe pela habilidade de hidrolisar a uréia em dióxido de
carbono e amônia, e esta se constitui no fator ciliostático dos ureaplasmas. O
Ureaplasma diversum é a única espécie do gênero presente em bovinos,
causando surtos de vulvovaginite granular, seguido de abortamento e redução da
eficiência reprodutiva do rebanho (OLIVEIRA FILHO et al., 2005). Para
STALHEIM & GALLAGHER (1977), as lesões observadas nas infecções por
ureaplasmas, tanto no trato genital quanto no respiratório se devem, em parte, à
elaboração in situ de gás tóxico e de amônia.
Apesar de sua simplicidade estrutural e funcional, a forma como
micoplasmas e ureaplasmas interagem com seu hospedeiro não está totalmente
elucidada, porém estudos recentes demonstraram que a forma de parasitar a
célula hospedeira é prioritariamente extra-celular (YOU et al., 2006).
A presença do Ureaplasma diversum na vulva representa uma fonte
constante de infecção por esse microrganismo, que pode ser carreado até o útero
durante o estro. Além disso, a presença deste agente por cerca de sete dias é
suficiente para criar um ambiente uterino adverso para o desenvolvimento inicial
do embrião (SMITS et al., 1994; METTIFOGO, 2000).
No Canadá, onde o U. diversum é responsabilizado por queda na
eficiência reprodutiva de bovinos, o primeiro relato de infecção ocorreu em 1975;
e a partir de 1978, a vulvite granular causada por Ureaplasma diversum foi
considerada um problema clínico de alerta, na medida em que sua disseminação
natural associada à vulvite granular foi correlacionada com infertilidade
significativa nos rebanhos afetados. Posteriormente demonstrou-se a relação
entre o microrganismo e a vesiculite seminal e balanopostite nos touros,
reabsorção embrionária, abortamentos, morte neonatal, nascimentos de bezerros
fracos, infertilidade e, em alguns casos, conjuntivite (MULIRA et al., 1992; SMITS
et al., 1994; METTIFOGO, 2000).
20
Estudos epidemiológicos têm mostrado que a eficiência reprodutiva do
rebanho é fortemente influenciada por fatores ambientais, individuais e de manejo
(LÓPEZ-GATIUS et al., 2003), e que as taxas de concepção ao primeiro serviço
resultam da combinação de uma seqüência de eventos que envolvem desde a
fertilização e desenvolvimento inicial do embrião, ainda na tuba uterina, até a
evolução
subseqüente
do
embrião
para
feto,
com
a
implantação
e
desenvolvimento dos envoltórios fetais (GÁBOR et al., 2008).
Para viabilizar cada um destes eventos, o sistema reprodutor atua tanto
por meio de hormônios quanto pela renovação e reestruturação tecidual. Para
SCOTT (2000), a dinâmica interação do gameta masculino com os fluidos e o
epitélio do trato reprodutivo feminino melhora a sobrevivência e regula a função
espermática na fêmea, constituindo-se em um componente chave no transporte e
capacitação espermática.
A
tuba
uterina
possui
epitélio
cilíndrico
simples
composto
essencialmente por células ciliadas e secretórias não-ciliadas, e na vaca o epitélio
pode apresentar-se, em algumas regiões, cilíndrico pseudo-estratificado (BANKS,
1993). As células ciliadas e secretórias da tuba uterina sofrem mudanças
estruturais e funcionais sob influência dos hormônios ovarianos, podendo
modificar a altura do epitélio (SENGER, 2003).
Muitos estudos têm sido desenvolvidos para avaliar o envolvimento do
epitélio
tubário
no
processo
reprodutivo.
LEE
&
AX
(1984)
isolaram
glicosaminoglicanos, polissacarídeos envolvidos na capacitação espermática, de
fluido oriundo de tuba uterina bovina. BERGQUIST et al. (2005) confirmaram que
o glicosaminoglicano presente no epitélio da tuba uterina bovina é o hialuronan,
predominantemente na região do istmo, local de estocagem espermática,
evidenciando a importância da integridade do tecido da tuba uterina.
ABUGHRIEN et al. (2000), estudando a organização celular dos três
segmentos da tuba uterina de novilhas verificaram diferenças no número de
células basais epiteliais entre eles, além de observarem a existência de dois tipos
de células que foram caracterizadas, pela imunoistoquímica, como linfócitos e
macrófagos. Também em novilhas, ABUGHRIEN & DORE (2000), investigando a
ciliogênese em tecido da tuba uterina descreveram maior atividade na formação
de tecido ciliar no período inicial do ciclo estral, caracterizado por alterações
21
hormonais tais como variação na concentração de PGF2 , estradiol e
progesterona.
BAGE et al. (2002) mostraram que novilhas repetidoras de estro
apresentam alterações ultraestruturais do epitélio, especialmente em relação às
células secretoras, o que pode influenciar o micro-ambiente tubárico durante a
fase final de maturação do oócito e o desenvolvimento embrionário precoce.
Estudos demonstraram que a região do istmo da fêmea bovina atua como
reservatório de espermatozóides, sendo este um processo reversível e
dependente da secreção de substâncias específicas pelas células epiteliais locais
íntegras (BOSCH & WRIGHT, 2005).
Com base no conceito da reconstrução tecidual e da ativação de
fatores de crescimento a partir da matriz extracelular, GABLER et al. (2001),
estudaram os fatores envolvidos na interação entre o embrião bovino e o epitélio
da tuba uterina, indicando que a regulação celular local influencia tanto a
fertilização quanto o desenvolvimento embrionário precoce.
O epitélio secretor da tuba uterina produz um grande número de
glicoproteínas, as quais se ligam ao oócito, ao espermatozóide e ao embrião
inicial, e podem coordenar a capacitação espermática (ELLINGTON et al., 1993).
GABLER et al. (2003), avaliando a expressão e presença de dois elementos
mediadores da fixação de uma célula à outra e da migração celular, a
osteopontina, uma glicoproteína fosforilada, e a integrina, um receptor da matriz
extracelular, concluíram que a interação entre ambos tem papel funcional
importante na fisiologia da tuba uterina normal, e influenciam potencialmente a
interação entre os gametas, o embrião e o epitélio local, o qual, então, depende
de sua integridade tecidual para cumprir esta função.
STALHEIM et al. (1976), estudando o efeito dos ureaplasmas em
culturas de células da tuba uterina de bovinos, observaram falhas na atividade
dos cílios, representadas principalmente pela diminuição da atividade ciliar
acompanhada de lesões epiteliais como descamação das células epiteliais de
revestimento, podendo chegar até a exposição da membrana basal, o que pode
ocorrer do cérvix até a fímbria, justificando as severas perdas reprodutivas.
22
SMITS et al. (1994), utilizando amostras de tecido da tuba uterina para
infecção experimental com U. diversum, in vitro, verificaram alterações leves na
condição histológica.
A ausência da atividade ciliar, ou mesmo a diminuição da taxa de vigor
das batidas ciliares, interfere na concepção e no desenvolvimento do concepto
desde a migração do espermatozóide e do óvulo, capacitação, fertilização,
movimentação do embrião pela tuba uterina e implantação no útero. GARG et al.
(2004), estudando o efeito da infecção experimental por micoplasmas na mucosa
da tuba uterina verificaram que houve perda significativa de cílios, descamação
moderada e infiltração de células mononucleares.
O útero é um órgão complexo, composto por diferentes tipos celulares,
que interagem para favorecer o processo reprodutivo, sendo o papel do
endométrio no estabelecimento da gestação bem conhecido. O espermatozóide
deve atravessar toda a barreira física e ambiental uterina para alcançar a ampola
da tuba, local de fertilização, e o embrião resultante deve encontrar o endométrio
em condições favoráveis para sua manutenção. GÁBOR et al. (2008), citando
BOYD (1965), dividem a perda gestacional em fatores genéticos e ambientais,
incluindo nestes últimos a infecção uterina e desequilíbrio hormonal do meio
ambiente uterino.
Nos
bovinos
o
epitélio
de
revestimento
uterino
é
do
tipo
pseudoestratificado cilíndrico, freqüentemente intercalado por áreas de epitélio
cilíndrico e/ou cúbico simples. As glândulas endometriais presentes em grande
número, principalmente no estrato profundo, são constituídas por epitélio cilíndrico
simples. As células colunares possuem inúmeras microvilosidades, que podem
ser do tipo secretor e não-secretor. A porção mais superficial, ou também
denominada funcional, sofre um processo degenerativo após a gestação ou estro,
e a regeneração ocorre a partir das células do estrato mais profundo. O estrato
compacto, logo abaixo da superfície epitelial consiste de tecido conjuntivo frouxo,
ricamente vascularizado, com muitos fibrócitos, mastócitos e macrófagos. Em
todo endométrio estão presentes glândulas tubulares, exceto nas áreas das
carúnculas, que são espessamentos da lâmina própria ricos em fibroblastos e
altamente vascularizados (BACHA & WOOD, 1990; MONTEIRO et al., 2003).
23
KRZYMOWSKI & STEFANCZYK-KRZYMOWSKA (2008), reunindo
informações de diferentes trabalhos científicos apontam o endométrio como o
principal responsável pela regulação hormonal do ciclo estral bovino, por meio da
PGF2
e PGE2, eicosanóides secretados por células endometriais, cuja
renovação é imprescindível para a manutenção tanto do ambiente favorável ao
embrião e especialmente ao espermatozóide, já que esta célula altamente
diferenciada é desprovida de um sistema de transcrição e translação ativo e deve
sobreviver no trato reprodutivo feminino sem se beneficiar de mecanismos
reparadores, como ocorre com outras células (SUAREZ & PACEY, 2006).
A constatação de que os ureaplasmas possuem fosfolipases sugere
que esta seja uma das formas do microrganismo alterar a síntese de
prostaglandinas a partir do ácido araquidônico (WAITES et al., 2005). O útero
libera PGE2 e PGI2, levando ao relaxamento da musculatura lisa e dilatação dos
vasos sanguíneos e linfáticos. Durante o período precoce gestacional, a
sinalização do embrião por meio de citocinas e a produção endometrial de PGE 2
favorecem o aumento da vascularização uterina e previne que ocorram alterações
regressivas das células uterinas bem desenvolvidas. Adicionalmente, foi
demonstrado que o corpo lúteo de ruminantes é protegido pela PGE 2 de origem
tanto embrionária quanto endometrial (KUCHARSKI & JANA, 2005). A PGI2 é
secretada prioritariamente pelo endotélio dos microcapilares e exerce importante
papel na prevenção da agregação plaquetária (MONCADA, 1982).
KIM et al. (1994) verificaram que a infecção experimental de células
endometriais bovinas com U. diversum altera o padrão de produção de
prostaglandinas (E2 e F2 ) sem modificar a viabilidade dessas células.
BONNET
et
al.
(1991)
associaram
o
acúmulo
de
células
mononucleares no endométrio com processos patológicos locais, enquanto BELL
& ROBERTS (2007) obtiveram associação positiva entre a falha em conceber e a
infecção uterina, em vacas. MARTINS et al. (2002) apontam que as modificações
histopatológicas
endometriais
de
vacas
inférteis
caracterizam-se,
predominantemente, por inflamação crônica difusa e degeneração endometrial
discreta a moderada. GALINDO et al. (2004) verificaram a predominância de
24
lesões teciduais caracterizadas por infiltrado mononuclear e destruição de tecido
glandular no endométrio de vacas inférteis repetidoras de estro.
MULIRA et al. (1992) apontam o Ureaplasma diversum como um
agente responsável pela ocorrência de endometrite em vacas, mas seu efeito
diretamente sobre o tecido endometrial não foi elucidado. A condição de
microaerofilia necessária à sobrevivência do agente pode ser um fator limitante de
seu efeito sobre o endométrio, sendo que GALE (1987) não obteve cultivos
positivos após a infecção experimental do útero de novilhas com U. diversum.
A maior parte das informações é proveniente de estudos desenvolvidos
com material oriundo de mulheres inférteis e positivas para U. urealyticum,
apontando que, mesmo sem lesões endometriais aparentes, a produção de
substâncias semelhantes à neuraminidase no útero contaminado prejudica a
penetração espermática (CHANG, 1989). Adicionalmente, a presença de
ureaplasmas parece ser um fator predisponente para o aparecimento de lesões
pré-cancerosas no útero e cérvix de mulheres, com associação positiva com a
detecção do vírus (LUKIC et al., 2006). Estudos feitos com mulheres mostraram a
associação entre a endometrite após cesareana ou parto prematuro e a
ureaplasmose genital. A constatação de que os ureaplasmas podem invadir a
cavidade
amniótica
e
iniciar
reações
inflamatórias
severas
coloca
o
microrganismo na lista daqueles capazes de desencadear o abortamento, e,
portanto, como um fator de infertilidade (WAITES et al., 2005).
O cérvix bovino é muito desenvolvido e funciona como órgão de
separação entre o útero e a vagina. O epitélio de revestimento é composto
principalmente
por
células
semelhantes
às
caliciformes,
intensamente
glandulares, com atividade secretora dependente do estágio do ciclo estral,
mostrando muco claro e viscoso durante o estro e denso na gestação, período
durante o qual atua como tampão. A lâmina própria é constituída de tecido
conjuntivo frouxo, que passa a denso de acordo com o estágio do ciclo. A mucosa
epitelial cervical possui contorno extremamente irregular com a presença de
criptas, aumentando a superfície de uma área restrita, a qual contém grande
número de células produtoras do muco constituído de matriz protéica importante
no transporte dos espermatozóides, que também são retidos em número elevado
25
nas criptas cervicais (HEYDON & ADAMS, 1979; BACHA & WOOD, 1990;
BUERGUELT, 1997).
WORDINGER et al. (1973) comprovaram a presença de epitélio ciliado
colunar na mucosa cervical de bovinos, com intensa atividade eosinofílica após o
estro. Durante o transporte dos espermatozóides no trato reprodutor feminino, o
cérvix atua como regulador do fluxo, tanto pela ação do muco quanto pela
presença dos anéis, os quais retêm mecanicamente grande parte dos
espermatozóides ejaculados no fundo de saco vaginal. Os estudos de HEYDON &
ADAMS (1979) mostraram que as células presentes nas criptas secretam mais
sialomucinas, que reduzem a viscosidade do muco, e que estas células são
bastante responsivas ao estrógeno. A reação do acrossoma espermático depende
da ação dos glicosaminoglicanos presentes nas criptas cervicais (LEE & AX,
1984).
BREEVELD-DWARKASING et al. (2002) verificaram grande número de
células com receptores ao estrógeno presentes na submucosa cervical de vacas,
e FUCHS et al. (2002) descreveram a secreção de PGE2 pelas células cervicais.
AHMADI et al. (2006) verificaram que as diferentes fases do ciclo estral de vacas
afetam também a migração de neutrófilos e linfócitos para a mucosa cervical,
descrevendo maior quantidade dessas células em esfregaços obtidos durante o
período de três a quatro dias após o estro, evidenciando a importância da
integridade desta região anatômica durante o período pós-coito.
A cervicite tem sido associada à ureaplasmose genital, em especial nas
mulheres (MONTAGNER et al, 2007). Em vacas, HUSTED (2003) considerou a
cervicite como um sinal da presença do Ureaplasma diversum.
O fundo de saco vaginal, ou fornix, está em associação com o cérvix e
corresponde à região onde este último e o canal vaginal se encontram; além
disso, corresponde ao local de deposição do sêmen nos bovinos, quando da
monta natural. Sob o ponto de vista histológico possui a mesma constituição que
a porção anterior da vagina, mas estudos demonstraram que sua secreção é
capaz de iniciar um processo de favorecimento do deslocamento espermático para
dentro do cérvix (MULLINS & SAAKE, 1989), especialmente pela ação das
sialomucinas, mucinas que contém carboidratos e ácido siálico.
26
A vagina é o órgão copulatório, provida de epitélio colunar na porção
anterior e colunar estratificado escamoso na porção posterior, possui glândulas
responsáveis por secreções mucosas. Já se demonstrou a associação entre a
qualidade do muco vaginal e a colonização por microrganismos potencialmente
patogênicos (DOHMEN et al., 1995; LEBLANC et al., 2002), e WILLIAMS et al.
(2005) verificaram modificação na viscosidade e odor do muco vaginal durante a
fase de resposta de proteína de fase aguda nas infecções uterinas. Para
BONDURANT (1999), a secreção vaginal atua em conjunto com a cervical como
uma barreira física e química contra a invasão uterina por microrganismos.
O estrógeno favorece a proliferação do epitélio vaginal, mas estudos
prévios (REZENDE, 2006; FERRAZ, 2007) mostraram que as modificações
celulares do epitélio de fêmeas bovinas durante o ciclo estral não ocorrem em
compasso com as alterações hormonais, o que pode ser um fator de
favorecimento para a colonização local por microrganismos de parasitismo
extracelular.
A vulva pode ser dividida em vestíbulo, região comum ao trato
reprodutor e urinário, e lábios vulvares, onde se encontra o clitóris. Com epitélio
escamoso estratificado, a maior parte das glândulas no vestíbulo são bilaterais e
secretoras de muco, mas as glândulas da submucosa nas vacas são do tipo
túbulo-acinar (BACHA & WOOD, 1990).
O primeiro sinal que conduz à suspeita da presença do U. diversum é a
observação de lesões granulosas na mucosa vulvovaginal, as quais podem
apresentar diferentes graus de severidade. A confirmação é feita pela obtenção
de cultivos positivos a partir de muco vulvovaginal, embora cultivos negativos não
excluam a presença do agente (KUNZ et al., 2004). LEON et al. (1994) e PETIT et
al. (2008) obtiveram cerca de 50% de positividade para U. diversum em amostras
de muco vulvovaginal oriundas de animais com vulvovaginite. CARDOSO et al.
(2000) reportaram pela primeira vez, no Brasil, o isolamento de U. diversum do
muco vulvovaginal de vacas com desordens reprodutivas e ressaltaram a
importância do diagnóstico diferencial com outros organismos de ação
semelhante.
27
A vulvovaginite também está associada à infecção viral (Herpes vírus),
porém KUNZ et al. (2004), estudando animais com lesões de vulvovaginite, não
obtiveram isolamentos positivos para Herpesvirus bovino Tipo I, mas 50% das
amostras estudadas pelos autores foram positivas para micoplasmas e
ureaplasma. Relato semelhante foi feito por OLIVEIRA FILHO et al. (2005), que
avaliaram o muco vulvovaginal de vacas leiteiras repetidoras de estro, verificando
grande número de amostras positivas para U.diversum associado à presença de
diferentes graus de lesões típicas de vulvovaginite, porém não houve isolamento
positivo do Herpesvirus Bovino Tipo I.
As lesões na mucosa vulvovaginal apresentam-se, em geral, nos
primeiros cinco dias após a infecção, e podem aparentar a forma aguda ou
crônica, constituindo-se, no entanto, em uma alteração funcional vaginal dolorosa
(MULIRA et al., 1992). Em muitas espécies de mamíferos a mucosa vulvovaginal
é colonizada normalmente por lactobacilos, os quais favorecem mecanismos de
defesa local e reduzem a possibilidade de microrganismos oportunistas ou
potencialmente patogênicos provocarem infecções, mas nos bovinos sua
presença ou efeito não foi comprovado (OTERO et al., 1999).
Mollicutes são microrganismos primariamente associados às mucosas
do hospedeiro e fortemente correlacionados com parasitismo de células epiteliais.
Embora a aderência e a atividade da urease sejam reconhecidas como fatores de
virulência dos ureaplasmas, o mecanismo patogênico permanece obscuro. Assim,
considerando a exígua quantidade de informações sobre as modificações
teciduais decorrentes da infecção natural por ureaplasma nos bovinos, e que o
entendimento do modo de ação do microrganismo passa pela avaliação macro e
microscópica das lesões nos diferentes órgãos, este trabalho foi desenvolvido
para estudar as alterações teciduais causadas pela presença do Ureaplasma
diversum no trato genital de fêmeas púberes naturalmente infectadas, por meio da
avaliação histopatológica das tubas uterinas, útero, cérvix, vagina e vulva.
28
2. MATERIAL E MÉTODOS
Os animais foram oriundos de uma propriedade rural localizada no
Sudoeste Goiano, destinada à produção comercial de bovinos da raça Nelore.
Durante os meses de março e abril de 2006, cento e setenta e sete novilhas
púberes com idade entre 24 e 30 meses, oriundas de um único lote de manejo
foram examinadas. Do total de fêmeas examinadas, somente 20 foram
selecionadas e abatidas, de acordo com os resultados do exame bacteriológico,
obtendo-se fragmentos do sistema reprodutivo para avaliação.
Inicialmente os animais eram contidos em tronco e examinados
individualmente. Após exame clínico geral efetuava-se a avaliação da mucosa
vulvovaginal, observando-se a presença ou não de lesões, assim como sua
aparência e intensidade, categorizando-as em escala variando de grau zero a
quatro (Quadro 1), conforme classificação proposta por KUNZ et al. (2004).
Quadro 1 – Classificação das lesões de vulvovaginite granular conforme a
severidade.
Grau de
Características
lesão
0
Ausência de lesões
1
Mucosa vulvar e/ou vaginal levemente inflamada (hiperemia leve) com presença
de poucas vesículas
2
Mucosa vulvar e/ou vaginal moderadamente inflamada (hiperemia moderada)
com presença de grande número de vesículas
3
Mucosa vulvar e/ou vaginal apresentando acentuada inflamação (acentuada
hiperemia), com presença de grande número de vesículas e lesões
hemorrágicas
4
Mucosa vulvar e/ou vaginal severamente inflamada (hiperemia intensa), com
presença de lesões pustulares e/ou necróticas
Fonte: KUNZ et al. (2004)
Após esta avaliação, os animais foram novamente colocados no tronco
de contenção e submetidos à colheita de conteúdo vulvovaginal, conforme
descrito previamente (KUNZ et al., 2004). Em resumo, após a higienização seca
29
do local, os lábios vulvares eram afastados e uma zaragatoa esterilizada e seca
era firmemente friccionada por toda a área de lesão, depositando-se a mesma
imediatamente em tubo de ensaio de plástico estéril e tampa de borracha,
contendo meio A3XB e mantidas sob refrigeração a 4º C até o processamento
laboratorial.
Este material foi encaminhado ao Laboratório de Doenças
Bacterianas da Reprodução do Instituto Biológico de São Paulo, para o
isolamento e identificação de Ureaplasma diversum e Mycoplasma spp.
Trinta dias depois, vinte fêmeas das quais se obteve isolamento positivo
apenas para U. diversum foram abatidas no frigorífico local. Durante os
procedimentos de abate, os sistemas reprodutores foram retirados em uma só
peça contendo ovários, tubas uterinas, útero, cérvix, vagina e vulva e
acondicionados em sacos plásticos fechados. Após a obtenção de todas as
peças, o material foi retirado da sala de abate e manipulado em local limpo para
retirada dos fragmentos. Cada conjunto foi higienizado utilizando-se toalhas de
papel, procedendo-se a abertura a partir da fímbria, iniciando-se sempre pelo lado
direito. Após a avaliação macroscópica procedeu-se a colheita de fragmentos, na
seguinte ordem: lados direito e esquerdo da tuba uterina (fímbria, ampola e
istmo), lados direito e esquerdo dos cornos uterinos (porção anterior e medial),
fragmentos únicos do corpo do útero, cérvix (cranial, medial e vaginal), lados
direito e esquerdo do fornix, vagina, clitóris e vulva (lados direito e esquerdo) de
acordo com o esquema representado na Figura 1. Os fragmentos foram
imediatamente fixados em formol tamponado com pH neutro a 10%, como
proposto por STEVENS et al. (1995) e SAR et al. (1996), e após 24 horas,
acondicionados em cassetes devidamente identificados e mantidos em formol
para posterior processamento histológico.
Após completa fixação, os fragmentos foram processados conforme
rotina do Laboratório de Histopatologia do Setor de Patologia Animal da EV/UFG,
sendo a amostra corada pelo método da Hematoxilina e Eosina (LUNA, 1968).
Para a avaliação histológica uterina seguiu-se a classificação sugerida
por GALINDO et al. (2004) de acordo com as seguintes alterações inflamatórias e
teciduais: infiltração linfocitária, dilatação glandular, fibrose periglandular e
destruição epitelial e necrose muscular. De acordo com os achados descritos, o
30
grau de lesão foi estimado em escores variando de grau zero a quatro,
apresentados no Quadro 2.
Quadro 2 – Classificação das lesões histopatológicas uterinas conforme a
severidade.
Grau de lesão
Características
0
Ausência de alterações inflamatórias
1
Presença de uma alteração inflamatória
2
Presença de duas alterações inflamatórias
3
Presença de três alterações inflamatórias
4
Presença de três ou mais alterações inflamatórias, destruição de epitélio e/ou
necrose muscular
Fonte: GALINDO et al. (2004)
31
1
Ovário
5
6
2
5
3
4
4
4
3
3
Lúme n
2
2
1
1
Ovário
Esquerdo
Ovário Direito
7
Colo (ou Cérvix)
8
9
10
10
LEGENDA
Trompa (Direita/Esquerda)
1- Fímbria
2- Ampola
3- Istmo
11
Corno (Direito/Esquerdo)
4- Corno Uterino Anterior
5- Corno Uterino Medial
13
13
12
6- Corpo do Útero
7- Cérvix Cranial (Endocérvix)
8- Cérvix Medial
9- Cérvix Vaginal
10-Fornix (Direito/Esquerdo)
11- Vagina
12-Clitóris
13-Vulva (Direita/Esquerda)
ROGÉRIO DE MORAES SOUZA / 2008
FIGURA 1 – Representação do trato reprodutor da fêmea bovina e locais dos
fragmentos histológicos.
32
Para os demais cortes considerou-se a presença de infiltrado celular, o
tipo de células infiltradas, a presença de outras alterações inflamatórias, perda
e/ou lesão tecidual. De acordo com os achados descritos, o grau de lesão foi
estimado em escores variando de 0 a 4, descritos no Quadro 3, adaptado de
GALINDO et al. (2004).
Quadro 3 – Classificação das lesões histopatológicas do trato genital de fêmeas
bovinas conforme a severidade.
Grau de lesão
Características
0
Ausência de alterações inflamatórias
1
Presença de infiltração linfocitária e/ou neutrofílica
2
Presença de infiltração eosinofílica
3
Infiltração leucocitária e/ou lesão epitelial
4
Presença de alterações inflamatórias generalizadas (edema, hiperemia,
infiltração celular, perda de epitélio e/ou necrose muscular)
A leitura foi realizada em microscópio óptico (Modelo Jenaval, Carl
Zeiss®, Alemanha) e os campos microscópicos fotografados com câmera digital
(Digital Still Câmera DSC P-71 Cybershot, SONY®, Manaus, Brasil) acoplada ao
microscópio óptico.
Os resultados foram analisados pelo U-Test (Mann – Whitney) e
Kruskal-Wallis para amostras não – paramétricas, utilizando-se o pacote
computacional WINSTAT (2006).
33
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em todas as fêmeas avaliadas foi possível observar algum grau de
lesão característica da síndrome vulvovaginite granular, ou seja, hiperemia de
mucosas, presença de grânulos de um a dois milímetros de diâmetro, em média,
translúcidos, distribuídos em parte ou por toda a região examinada. Em alguns
casos foram observadas petéquias e necrose, porém sem descarga vulvar, fato
que, segundo DOIG et al. (1979), caracteriza a forma crônica da síndrome. Dos
20 animais abatidos e examinados, um foi descartado por apresentar útero
infantil. Nos 19 animais verificou-se a predominância de lesão grau 2, presente
em oito
(42,10%) fêmeas, seguida pela lesão grau 1, observada em cinco
(26,31%) animais. Os graus 3 e 4 estiveram presentes em três (15,78%) animais,
cada um (Tabela 1). Durante a avaliação macroscópica não foram verificadas
lesões dignas de nota, além daquelas presentes na região vulvovaginal.
TABELA 1 – Freqüência de animais com diferentes graus de lesão na mucosa
vulvovaginal pelo exame macroscópico - Goiânia, 2006.
Grau de lesão
Nº de animais (%)
0
-
1
5 (26,32)
2
8 (42,10)
3
3 (15,79)
4
3 (15,79)
Total
19 (100,00)
De
380
fragmentos
histológicos,
foram
obtidos
294
(77,36%)
fragmentos de tecido passíveis de processamento, visto que 86 (22,64%) foram
descartados, desde o momento da colheita das amostras, até o processamento
das lâminas (Tabela 2), resultando em índice abaixo dos descritos por BONNETT
et al. (1991), de 95% e NOGUEIRA et al. (1993), que obtiveram 86,2% de
sucesso no preparo das lâminas.
34
TABELA 2 – Taxa de aproveitamento dos fragmentos obtidos nas diversas
porções do trato reprodutor de fêmeas bovinas - Goiânia, 2006.
Quantidade de
Órgão
Fragmentos Aproveitados
N
%
direita
04
1,06
esquerda
15
3,95
direita
06
1,58
esquerda
17
4,48
direito
08
2,10
esquerdo
18
4,73
Corno uterino
direito
13
3,42
anterior
esquerdo
15
3,95
Corno uterino
direito
17
4,48
medial
esquerdo
16
4,21
Corpo do útero
15
3,95
Cérvix cranial
18
4,73
Cérvix medial
16
4,21
Cérvix vaginal
15
3,95
direito
18
4,73
esquerdo
15
3,95
Vagina
16
4,21
Clitóris
18
4,73
direito
18
4,73
esquerdo
16
4,21
Fragmentos descartados
86
22,64
Total
380
100
Fímbria
Ampola
Istmo
Fornix
Vulva lado
TABELA 3 – Freqüência de fragmentos processados e examinados da mucosa da tuba uterina, cérvix, vagina e vulva
encontradas em fêmeas bovinas púberes, de acordo com o grau de lesão encontrado - Goiânia, 2006.
Grau
de
Nº de animais (%)
Fímbria
Ampola
Istmo
lesão
Cérvix
Cérvix
Cérvix
cranial
medial
vaginal
Vagina
Vulva
0
--
--
--
--
--
--
--
4 (11,76%)
1
--
--
--
--
--
--
--
--
2
--
--
3 (11,54%)
--
--
--
--
--
3
18 (94,74%)
14 (60,87%)
--
2 (11,12%)
4 (25%)
1 (6,66%)
4 (25%)
24 (70,59%)
4
1 (5,26%)
9 (39,13%)
23 (88,46%)
16 (88,88%)
12 (75%)
14 (93,34%)
12 (75%)
6 (17,65%)
Total*
19
23
26
18
16
15
16
34
* Total de fragmentos examinados em cada segmento colhido.
36
O exame histopatológico das lesões presentes nos diversos fragmentos
do trato reprodutor feminino revelou predomínio do Grau 3 na fímbria (18 /
94,74%), ampola (14 / 60,87%) e vulva (24 / 70,59%) amostras; enquanto nos
demais segmentos prevaleceu o Grau 4, sendo: istmo com 23 (88,46%) amostras,
cérvix com 16 (88,88%) amostras na porção cranial, 12 (75%) amostras no cérvix
medial e 14 (93,34%) amostras no cérvix vaginal, além da vagina com 12 (75%)
amostras (Tabela 3). As lesões observadas em todo o trato reprodutor feminino
podem ser consideradas severas, pois refletem a presença de alterações
inflamatórias generalizadas como edema, hiperemia, infiltração celular, perda de
epitélio e/ou necrose muscular.
TABELA 4 – Média e Erro Padrão dos escores das lesões nos diversos
segmentos do trato reprodutor* de fêmeas bovinas - Goiânia,
2006.
Estrutura anatômica
N
Média (erro padrão)
Fímbrias
19
1,45 ±0,25 a
Ampolas
23
1,95 ± 0,27 a,b
Istmo
26
2,45 ± 0,30 b,c,d
Corno uterino anterior
28
4,00 c,d
Corno uterino medial
33
4,00 d
Corpo do útero
15**
2,90 ± 0,40 c,d
Cérvix cranial
18**
3,50 ± 0,28 d
Cérvix (medial e vaginal)
31
2,98 ± 0,26 c,d
Fornix
33
2,83 ± 0,25 b,c,d
Vagina
16**
3,00 ± 0,36 c,d
Clitóris
18**
2,95 ± 0,30 b,c,d
Vulva
34
2,50 ± 0,21 a,b,c
Total
294
* Tuba uterina (fímbria, ampola e istmo – direito / esquerdo), cornos uterinos (porção anterior e
medial - direito / esquerdo), fragmentos únicos do corpo do útero, cérvix (cranial, medial e
vaginal), fornix ( direito e esquerdo), fragmentos únicos da vagina e clitóris e vulva ( direito /
esquerdo).
** Fragmentos com corte único.
*** Letras diferentes na mesma coluna significam diferença (p< 0,01) entre si (Kruskal-Wallis).
37
TABELA 5 - Média e Erro Padrão dos escores das lesões observadas na tuba
uterina de fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006.
Fragmento
Direito
Fímbrias
Esquerdo
Direito
Ampola
Esquerdo
Direito
Istmo
Esquerdo
Total
N
04
15
06
17
08
18
68
Média (erro padrão)
0,60 ± 0,28
2,30 ± 0,31
1,05 ± 0,37
2,85 ± 0,29
1,60 ± 0,45
3,30 ± 0,30
As Tabelas 4 e 5 apresentam a média e o erro padrão dos escores de
lesão nos diversos segmentos do trato reprodutor e de cada fragmento da tuba
uterina, respectivamente. A média e erro padrão para os escores de lesão dos
segmentos da tuba uterina apresentados nessas Tabelas permitem inferir que o
istmo foi o segmento mais atingido pela ação do U. diversum, com diferença para
a região da fímbria.
Este resultado pode significar que, no processo reprodutivo, quando a
fímbria, região que capta o oócito e que é influenciada, principalmente, por ação
hormonal,
é
lesionada
pela
ação
de
patógenos
pode
não
significar
necessariamente alterações nas taxas de fertilidade. Porém, a integridade do
istmo parece ser fundamental para que ocorra a fertilização já que é nesta região
que ocorre o armazenamento dos espermatozóides, e onde o gameta masculino
efetivamente adquire a habilidade de fertilização, em virtude da secreção de
substâncias específicas pelas células epiteliais locais íntegras (SCOTT, 2000;
BOSCH & WRIGHT, 2005; GÁBOR et al, 2008).
Na avaliação microscópica dos fragmentos de tuba uterina verificaramse, com maior freqüência, descamação do epitélio de revestimento tubário com
exposição da membrana basal, formação de grumos no lúmen, áreas onde havia
a curvatura dos cílios e outras onde os cílios já estavam ausentes, bem como a
projeção do citoplasma de muitas células epiteliais para o lúmen (Figura 2).
38
FIGURA 2 – Fotomicrografia de: A – Tuba uterina, fímbria, mostrando vesículas intraepiteliais (seta) (200X - H&E); B – Fímbria onde se nota curvatura de cílios (seta)
(400X - H&E); C - Istmo apresentando projeção do citoplasma de células epiteliais para
o lúmen (seta); D – Ampola com presença de áreas de destruição de cílios (seta)
(400X - H&E).
STALHEIM et al.(1976), verificaram descamação do epitélio com
formação de grumos e marginação da cromatina das células da submucosa,
curvatura dos cílios, grumos e nódulos irregulares na superfície 10 horas após a
exposição ao agente, seguido de ausência dos cílios, citoplasma projetado para o
lúmen nas 24 horas seguintes e descamação da maior parte das células epiteliais
com exposição da membrana basal após 144 horas, alterações estas
semelhantes às observadas neste estudo.
GARG et al. (2004) também observaram, na mucosa do trato reprodutor
feminino, perda significativa de cílios e descamação moderada, assim como a
infiltração de células mononucleares devido à ação de micoplasmas. Segundo
STALHEIM & GALLAGHER (1977) é uma característica peculiar aos ureaplasmas
39
cessarem a atividade ciliar e causarem severas lesões epiteliais quando
presentes na tuba uterina, sejam estes isolados do trato genital humano ou do
trato genital de bovinos.
As alterações ultraestruturais do epitélio atingindo células secretoras
prejudicam a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário precoce
(BAGE et al., 2002). ABUGHRIEN & DORE (2000) associaram a maior atividade
ciliar tubária à fase inicial do ciclo estral quando as variações na concentração de
PGF2 , estradiol e progesterona são marcadas. Os resultados expostos mostram
que o microrganismo foi capaz de lesar as células ciliadas e, em alguns casos,
destruir completamente o epitélio, inviabilizando então sua atividade favorecedora
na migração dos gametas para o local de fertilização.
TABELA 6 - Freqüência de fragmentos processados e examinados da mucosa
uterina de fêmeas bovinas pelo exame histopatológico, de acordo
com o grau de lesão encontrado - Goiânia, 2006.
Grau
de
Nº de amostras (%)
Corno uterino anterior
Corno uterino medial
Corpo do útero
0
-
-
-
1
-
-
-
2
-
-
1 (6,66)
3
-
-
-
4
28 (100%)
33 (100%)
14 (93,34%)
Total*
28
33
15
lesão
* Total de fragmentos examinados em cada segmento colhido.
Nos cornos uterinos e no corpo do útero as lesões verificadas foram
severas, sendo a porção medial a mais atingida, mas não houve diferença entre
os escores de lesão. As lesões mais observadas foram destruição dos cílios das
células epiteliais de revestimento e áreas de ulceração epitelial; destruição de
epitélio glandular com infiltração de linfócitos; edema, proliferação de tecido
conjuntivo e presença de infiltrado linfocitário neutrofílico e eosinofílico na
submucosa, bem como necrose de fibras musculares (Figura 3). Nos bovinos a
regulação do ciclo estral é diretamente dependente da integridade do endométrio,
40
uma vez que esta porção é responsável pela regulação hormonal do ciclo estral
por meio da PGF2
e PGE2. (KRZYMOWSKI & STEFANCZYK-KRZYMOWSKA,
2008). No presente estudo as lesões endometriais foram classificadas de acordo
com o número de alterações inflamatórias presentes. Pelo exposto na Tabela 6,
100% dos fragmentos de cornos uterinos mostraram lesão de Grau 4, ou seja,
presença de três ou mais tipos de alterações inflamatórias, além de destruição de
epitélio e/ou necrose muscular. Neste sentido, GALINDO et al. (2004) verificaram
o predomínio de lesões teciduais com presença de infiltrado mononuclear e
destruição de tecido glandular no endométrio de fêmeas inférteis repetidoras de
estro, fato associado à positividade para U. diversum por OLIVEIRA FILHO et al.
(2005).
De acordo com WAITES et al. (2005), o útero inflamado libera PGI2, um
potente inibidor da agregação plaquetária e ativador da vasodilatação.
Adicionalmete, as fosfolipases provenientes dos ureaplasmas podem alterar a
síntese de prostaglandinas a partir do ácido araquidônico. Como a maior fonte de
PGI2 é o microcapilar, no endométrio íntegro ela aumenta a irrigação local,
favorecendo, provavelmente, a função dos neutrófilos, mas na presença de lesões
esta função está prejudicada. Adicionalmente, a proteção exercida pela PGE 2 de
origem endometrial sobre o corpo lúteo dessas fêmeas está comprometida,
facilitando então a ação luteolítica da PGF2
(MONCADA, 1982; KUCHARSKI &
JANA, 2005). Embora KIM et al. (1994) relatem que o U. diversum foi capaz de
alterar o padrão de produção de PGE2 e PGF2
sem modificar a viabilidade
dessas células, os resultados histopatológicos aqui descritos sugerem que
estudos devem ser conduzidos para avaliar o efeito a médio e longo prazo deste
agente sobre estas células.
41
FIGURA 3 – Fotomicrografia de: A - Útero mostrando destruição de epitélio glandular
com infiltração de linfócitos (seta) (200X - H&E) e B – Útero apresentando edema de
submucosa (seta) (200X - H&E); C - Fragmento de Cérvix onde se nota extensa
necrose de fibras musculares, de aspecto eosinofílico (seta) (400X - H&E) e D - Útero
apresentando infiltrado polimorfonuclear focal na submucosa (seta) (400X – H&E).
A Tabela 7 apresenta a média dos escores das lesões verificadas nos
cornos uterinos, porções anterior e medial, lados direito e esquerdo.
TABELA 7 - Média dos escores das lesões observadas nos cornos uterinos
encontrados em fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006.
Fragmento
Direito
Corno Uterino Anterior
Esquerdo
Direito
Corno Uterino Medial
Esquerdo
Total
N
13
15
17
16
61
Média
4,00
4,00
4,00
4,00
42
Quando os resultados referentes aos graus de lesão foram avaliados de
acordo com o lado de maior ocorrência, não houve diferença entre os achados.
Isto pode estar correlacionado ao fato de que, uma vez dentro do útero, o
microrganismo multiplica-se e atua sobre todo o endométrio. Outro ponto a ser
considerado é o processo de re-infecção, pois como não possui parede celular a
sobrevivência dos ureaplasmas é comprometida pela condição ambiente,
especialmente por ser um organismo de crescimento em microaerofilia, condição
inexistente no útero. Esta condição foi relatada por GALE (1987), que não obteve
isolamentos positivos para Ureaplasma diversum de conteúdo uterino, mesmo
após infectar experimentalmente novilhas com este microrganismo. Então, ao ser
re-introduzido no útero durante períodos mais favoráveis tais como o estro,
quando o cérvix está aberto, ou durante a inseminação artificial, ele procura
células íntegras para parasitar, já que a aderência e o parasitismo de células
epiteliais são condições essenciais para sua sobrevivência. Assim, seu efeito local
ocorre, provavelmente, não por um mecanismo de multiplicação, como outros
organismos oportunistas, mas pela re-contaminação constante.
A Tabela 8 apresenta a média e o erro padrão dos escores das lesões
teciduais observadas nos fragmentos colhidos do cérvix (cérvix cranial, cérvix
medial e cérvix vaginal).
TABELA 8 - Média e Erro Padrão dos escores das lesões observadas nas
porções cervicais de fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006.
Fragmento
N
Média (erro padrão)
Cérvix cranial
18
3,50 ± 0,28
Cérvix medial
16
3,00 ± 0,36
Cérvix vaginal
15
2,95 ± 0,39
Total
49
No cérvix verificaram-se lesões igualmente severas (Tabela 8), sem
diferença entre os três segmentos (cranial, medial e vaginal). De acordo com os
escores utilizados, as alterações variaram desde a presença de infiltração
eosinofílica e infiltração leucocitária com lesão epitelial (Graus 2 e 4) até
a
43
verificação de edema, hiperemia, infiltração celular, perda de epitélio e/ou necrose
muscular. A cervicite está associada à ureaplasmose genital tanto em mulheres
quanto em bovinos (MONTAGNER et al., 2007; HUSTED, 2003).
O cérvix é uma barreira natural à entrada de diversos patógenos
comensais ou mesmo oportunistas freqüentemente encontrados na vulva e
vagina, seja pela produção de muco, seja pela presença de seus anéis
(WORDINGER et al., 1973). Lesões observadas neste segmento podem alterar o
pH do muco, tornando o ambiente adverso à sobrevivência dos espermatozóides.
Considerando que o epitélio cervical contém células com grande habilidade
glandular, e que o contorno irregular com criptas aumenta a superfície de uma
área restrita, e mantém a produção de um muco constituído de matriz protéica
importante no transporte dos espermatozóides (BACHA & WOOD, 1990;
BUERGUELT, 1997), o comprometimento do tecido local prejudica diretamente o
processo de habilitação do espermatozóide para a fertilização, já que estas
células têm a responsabilidade de liberar os glicosaminoglicanos envolvidos na
reação do acrossoma, a qual deve ocorrer durante a capacitação espermática
(LEE & AX, 1984).
A atividade eosinofílica do epitélio ciliado colunar na mucosa cervical foi
descrita por WORDINGER et al. (1973) e confirmada por BREEVELDDWARKASING et al. (2002). Eosinófilos são células relacionadas à defesa local
do hospedeiro, e sua presença como infiltrado pode sinalizar a ativação dos
mecanismos de quimiotaxia durante a re-exposição ao agente.
A Figura 4 apresenta algumas lesões teciduais observadas no trato
reprodutor inferior (fornix, vagina, clitóris e vulva).
Na região do fornix observaram-se lesões no epitélio como presença de
vacuolização de células epiteliais, espongiose, áreas de destruição de células
epiteliais com exposição da membrana basal, focos de infiltrado linfocitário, além
de focos de necrose na camada muscular. Na espécie bovina a integridade desta
região é importante por ser o local de deposição do sêmen, sendo fundamental
para a viabilidade e deslocamento dos espermatozóides. MULLINS & SAAKE
(1989) descrevem que esta região favorece o deslocamento espermático em
bovinos, especialmente em virtude da secreção das sialomucinas, assim como
pela orientação da movimentação espermática em direção ao cérvix.
44
FIGURA 4 – Fotomicrografia de: A - Fornix mostrando presença de disceratose
das células epiteliais (seta) (400X – H&E) e B – Fornix mostrando presença de
espongiose (seta), discreta atrofia do epitélio e congestão da lâmina própria
(400X – H&E); C – Vulva apresentando infiltrado linfocitário difuso na
submucosa - exocitose (seta) (100X – H&E) e D – Vulva mostrando presença
de disceratose das células epiteliais (setas). 400 X (H&E).
A Tabela 9 apresenta a média e o erro padrão das lesões observadas
no trato reprodutor feminino inferior: lados direito e esquerdo do fornix e vulva e
fragmentos únicos da vagina e clitóris.
45
TABELA 9 - Média e Erro Padrão dos escores das lesões observadas no trato
reprodutor inferior de fêmeas bovinas púberes - Goiânia, 2006
Fórnix
Fragmento
Direito
Esquerdo
N
18
15
16
18
16
18
101
Vagina
Vulva
Direito
Esquerdo
Clitóris
Total
Média (erro padrão)
2,70 ± 0,31
2,95 ± 0,39
3,00 ± 0,36
2,40 ± 0,28
2,60 ± 0,31
2,95 ± 0,30
Os dados expostos na Tabela 9 mostram que a severidade das lesões
segue aos outros fragmentos estudados. PETIT et al. (2008) verificaram que das
amostras
positivas
para
U.
diversum
a
partir
de
material
vaginal,
aproximadamente um terço também foram positivas para material do fornix, o que
indica ser esta uma região na qual o agente já encontra condições favoráveis ao
seu desenvolvimento. De fato, a média para os escores de lesão nos dois lados
foi mais baixa que aquela dos segmentos anteriores (tuba uterina, útero e cérvix),
sinalizando maior número de fragmentos com infiltração leucocitária (mais
evidente em infecções recentes) do que lesões no epitélio ou necrose tecidual, as
quais caracterizam lesões mais antigas.
Na vagina, vulva e clitóris verificaram-se lesões graves, compatíveis
com as observações macroscópicas. Vulvite e vaginite podem ser periodicamente
observadas em novilhas e vacas positivas para
Ureaplasma diversum
(CARDOSO et al., 2000), resultando em transtornos durante a monta, e
agravamento das lesões. As lesões provocadas na mucosa peniana dos machos
podem servir como fonte de contaminação de microrganismos, presentes nas
lesões granulomatosas, resultando em balanopostite ou mesmo contaminação do
sêmen (MILLER et al., 1994).
Em conclusão, os resultados aqui descritos mostram que os achados
histopatológicos do trato reprodutor de fêmeas naturalmente infectadas por
Ureaplasma diversum são compatíveis com lesões que podem comprometer o
processo reprodutivo desde o processo de capacitação do espermatozóide para
fertilizar o gameta feminino, a implantação do embrião até a manutenção da
gestação. Portanto, animais portadores de lesões vulvares e vaginais compatíveis
46
com a infecção por este microrganismo devem ser precocemente identificados no
rebanho, pois além de favorecer a redução nas taxas de fertilidade ainda podem
tornar-se disseminadores do microrganismo.
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CAPÍTULO 3.
AVALIAÇÃO
IN VITRO DA ATIVAÇÃO
DE CÉLULAS
MONONUCLEARES ENDOMETRIAIS, VAGINAIS E NO SANGUE PERIFÉRICO
BOVINO PELA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO EM RESPOSTA AO
Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum.
RESUMO
Este estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar in vitro, a
habilidade do Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis e Mycoplasma
bovigenitalium em ativar células mononucleares oriundas do endométrio, mucosa
vaginal e sangue periférico de vacas pela verificação da produção de óxido nítrico
(NO). Trinta e três amostras de células da mucosa endometrial e vaginal foram
cultivadas para obtenção de 2X106 cel/100 L em meio RPMI, em placas para
cultura de tecidos. Após a contagem das células mononucleares no material
cultivado, 20 L de solução contendo Mycoplasma bovis (9,95X102UFC/mL),
Mycoplasma bovigenitalium (19,25X102 UFC/mL) e Ureaplasma diversum (mínimo
de 1X10 UFC/mL), originados da quarta passagem em caldos específicos, foram
adicionados às placas, as quais foram mantidas sob incubação a 37º C em tensão
de 5% de CO2 por 48 horas. Após este período 50 L do sobrenadante foram
retirados e submetidos à reação de Greiss para determinação da produção de
NO. A absorbância das amostras foi medida em uma leitora para microplacas,
utilizando o comprimento de onda de 540 nanômetros. A confirmação da
presença de células mononucleares e dos agentes viáveis após a reação de
Greiss foi feita pela avaliação de esfregaços corados pelo Giemsa e do cultivo em
ágar Hayflik (M. bovis e M. bovigenitalium) e Agar UB (U.diversum). Todas as
amostras celulares produziram NO em resposta aos agentes, sem diferença
(p<0,05) entre elas. Sem considerar as reações exacerbadas isoladas, a maior
resposta celular observada correspondeu às amostras de sangue periférico e
esfregaço vaginal sem exposição aos agentes, e as amostras de conteúdo
endometrial desafiadas pelo Mycoplasma bovigenitalium produziram mais NO que
aquelas da vagina ou sangue periférico. Em conclusão, verificou-se que os três
agentes foram capazes de ativar as células mononucleares e induzir à produção
de NO, sugerindo que este seja um caminho de resposta do hospedeiro à primoinfecção por estes agentes, mas provavelmente não é o mais efetivo.
Palavras-Chave: Imunidade inata, resposta celular, i-NOS.
53
CHAPTER 3. EVALUATION OF IN VITRO ACTIVATION OF BOVINE
ENDOMETRIAL, VAGINAL AND BLOOD MONONUCLEAR CELLS TO
PRODUCE NITRIC OXIDE IN RESPONSE TO Mycoplasma bovis, Mycoplasma
bovigenitalium and Ureaplasma diversum.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate, in vitro, the ability of
Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis and Mycoplasma bovigenitalium to
activate mononuclear cells from the endometrium, vaginal mucosa and peripheral
blood of cows for verifying the production of nitric oxide. Thirty three samples of
endometrial, vaginal and blood cells were cultivated to obtain 2X106 cel/100 L in
RPMI medium, in microplates for tissue culture. After the cell counting 20 L of the
broth containing Mycoplasma bovis (9,95X102CFU/mL), Mycoplasma
bovigenitalium (19,25X102 CFU/mL) and Ureaplasma diversum (minimum of 1X10
CFU/mL), originated the fourth passage in specific broths were added to the
plates, which were kept under incubation at 37º C and 5% CO 2 for 48 hours. After
this time 50 L of supernatant was removed and submitted to the Griess reaction to
determine the production of nitric oxide. The absorbance of the samples was
measured in a microplate reader using the wavelength of 540 nm. The
confirmation of the presence of mononuclear cells and viable agents after the
Greiss reaction was done through the evaluation of Giemsa stained smears and
cultures in agar Hayflik (M. bovis and M. bovigenitalium) and agar UB
(U.diversum). All samples produced nitric oxide in response to the agents, with no
difference (p <0.05) between them. Without considering the isolated exacerbated
reactions, the cellular response to Ureaplasma diversum was lower than to the
other agents, and the endometrial samples exposed to Mycoplasma
bovigenitalium produced more nitric oxide than those of the vagina or peripheral
blood. In conclusion, it was found that the three agents were able to activate
mononuclear cells and induce the production of nitric oxide, suggesting that this is
a way of response of the host to primoinfection by these agents, but not the most
effective.
Key words: Innate Immunity, cell response, i-NOS.
54
1. INTRODUÇÃO
Os micoplasmas são considerados agentes patogênicos, oportunistas e
responsáveis por causar lesões em diversos órgãos, trazendo muitos prejuízos à
saúde dos animais. Devido à limitada quantidade de informações no tocante à
patogenia desses microrganismos, pouco se sabe sobre a forma como o sistema
imune do hospedeiro responde à infecção por eles causada.
Microrganismos do gênero Mycoplasma, classe Mollicutes, são as
menores e mais simples bactérias que se auto-replicam. Estes microrganismos
não apresentam parede celular rígida e são circundados por uma membrana
simples chamada membrana plasmática. Bactérias sem parede foram descritas
há mais de 100 anos e atualmente existem mais de 190 espécies amplamente
distribuídas entre humanos, animais, insetos e plantas. A maioria dos Mollicutes
que parasitam humanos e animais são espécies de Mycoplasma e Ureaplasma da
família Mycoplasmataceae. Devido ao genoma extremamente pequeno dos
micoplasmas (0,58 – 2,20 Mb), estes organismos têm opções limitadas de
metabolismo para replicação e sobrevivência (CHAMBAUD et al., 1999;
ROTTEM, 2003; YOU et al., 2006).
Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium estão diretamente
ligados às situações de infertilidade em bovinos, assim como o Ureaplasma
diversum (PETIT et al., 2008). Eles estão envolvidos em uma série de eventos
que envolvem não apenas o trato reprodutor, e têm sido associados à síndrome
do bezerro fraco (weak calf syndrome), desde que bezerros nascidos de vacas
positivas para estes agentes apresentam dificuldades respiratórias e podem
morrer nas primeiras horas de vida (GIVENS, 2006). Este autor refere-se ao
Ureaplasma diversum como o agente do abortamento epizoótico. Até 2004, esses
microrganismos constavam da Lista B da Organização Internacional de
Epizootias, ou seja, doenças consideradas como um fator sócio-econômico
importante e, portanto, de notificação obrigatória.
Devido
à
limitada capacidade de biossíntese,
a maioria dos
micoplasmas é parasita com especificidade quanto ao hospedeiro e aos tecidos.
Depois de entrarem no hospedeiro específico, eles podem se multiplicar e viver
por
longos
períodos
de
tempo.
Estes
microrganismos
desenvolveram
55
mecanismos necessários para interagir com as respostas imunes do hospedeiro e
colonizar outros hospedeiros (ROTTEM, 2003).
Alguns pontos permanecem obscuros em relação à ação destes
microrganismos nos hospedeiros específicos. Um deles é a permanência na
mucosa vaginal, mesmo em animais que não apresentam as lesões tipicamente
associadas à vulvovaginite granular (KUNZ et al., 2004). Outro ponto seria a
dificuldade na obtenção de mecanismos de imunização (BOOTHBY et al., 1987;
MULIRA et al., 1994; BYRNE et al., 2005), assim como do hospedeiro em se livrar
do microrganismo mesmo após uma resposta inflamatória sustentada por longo
período (KAUF et al., 2007). Adicionalmente, a baixa resposta dos membros da
família Mycoplasmatacae aos agentes terapêuticos (AL-MOMANI et al., 2006)
dificulta o entendimento de aspectos relacionados à sua patogenia.
Por exemplo, os fatores de virulência e os mecanismos de
patogenicidade do Mycoplasma bovis não são conhecidos, mas sua habilidade
em variar a expressão das proteínas de superfície de membrana (vsp) é muito
grande. As vsp estão envolvidas nas variações antigênicas que alteram as
características antigênicas de seus componentes de superfície e podem atuar
como um fator que eleva a colonização e aderência celular, e assim desviar o
mecanismo de defesa imune do hospedeiro (LYSNYANSKY et al., 2001;
NICHOLAS & AYLING, 2003).
CHAMBAUD et al. (1999) afirmam que existem grandes evidências
que sugerem que durante as infecções por micoplasmas, as lipoproteínas de
superfície são alvo da resposta imune humoral. A grande imunogenicidade das
lipoproteínas comparada a outros antígenos micoplasmáticos é provavelmente
causada pela exposição da superfície.
Segundo VASSELON & DETMERS (2002), a rápida reação inflamatória
que segue a infecção é mediada principalmente por monócitos, neutrófilos e
células endoteliais e pode ser reproduzida in vitro na ausência de componentes
do sistema imune adaptativo. Produtos bacterianos suscitam o aumento de
moléculas de adesão ao endotélio vascular contribuindo para o recrutamento de
leucócitos para o foco da infecção e, também, induzem a síntese e liberação de
citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF), e interleucina
1(IL -1), que ampliam a resposta à infecção. O reconhecimento imune inato age
56
de três formas: induzindo a secreção de citocinas efetoras tais como a IL-12 que
controla a diferenciação de células T - CD4; induzindo o aumento de moléculas
co-estimulantes em células apresentadoras de antígenos necessárias à ativação
de Células T; e induzindo sinais necessários à proliferação de Células B. Assim, a
resposta inata aos desafios microbianos controla e instrui respostas imunes
adaptativas.
A família de receptores conhecidos como receptores do tipo Toll (TLR)
exercem papel central no início da resposta imune celular inata. Esta família de
receptores fornece proteínas de transmembrana que podem se ligar ao
compartimento extracelular, onde ocorre o contato e reconhecimento de
patógenos bacterianos, ou ao compartimento intracelular, onde sinalizam o início
das respostas celulares (VASSELON & DETMERS, 2002). Os receptores do tipo
Toll são expressos constitutivamente pelas células do hospedeiro e estão
envolvidos na resposta imediata aos agentes infecciosos, controlando a infecção
até que a resposta adquirida se desenvolva.
HURST & von LANDENBERG (2008) descrevem os receptores do tipo
Toll como proteínas de transmembrana do tipo I que são expressas em várias
células do sistema imune tais como células B, macrófagos e tipos específicos de
células T. Esta família tem a habilidade de reconhecer vários padrões moleculares
associados aos patógenos de diferentes origens tais como bactérias, fungos ou
protozoários. Os membros da sub-família dos TLRs incluindo TLR 3, 7, 8 e 9
apresentam localização intracelular no retículo endoplasmático, endossomos e
lisossomos nos quais estes receptores reconhecem componentes do ácido
nucléico que normalmente são encontrados em bactérias e vírus.
Apesar dos micoplasmas serem parasitas de superfície extracelular de
hospedeiros e tecidos, algumas espécies podem ocupar ninhos intracelulares
(BASEMAN et al., 1995). Eles possuem apenas uma membrana plasmática
limitante sem outros sistemas de membrana para proteção. Porém, apesar destes
organismos não possuírem parede, eles possuem um grande número de
lipoproteínas
chamadas
proteínas
de
membrana
associadas
a
lipídios
denominadas LAMPs (YOU et al., 2006).
Segundo YOU et al. (2006), a resposta imune inata contra agentes
infecciosos patogênicos precede a imunidade mediada por células. As células do
57
sistema imune inato reconhecem constituintes dos microrganismos através de
receptores específicos, os quais transmitem sinais para dentro da célula.
Trabalhos recentes têm demonstrado que, em humanos, receptores do tipo Toll
são receptores de superfície de macrófagos para LAMPs, observados nos
micoplasmas. Existem pelo menos 10 receptores do tipo Toll em humanos e eles
têm demonstrado participação importante na sinalização de padrões moleculares
associados aos patógenos, tais como lipopolisacarídeos (LPS), peptidioglicanos e
LAMPs (AKIRA et al., 2001; TAKEDA & AKIRA, 2001; VASSELON & DETMERS,
2002).
De acordo com VASSELON & DETMERS (2002), TLRs são ativados
quimicamente por diversos componentes microbianos. O TLR4 é ativado por
lipopolissacarídeos, TLR9 é ativado in vivo e in vitro por DNA bacteriano, TLR3
pode ser ativado por RNA viral (ABRAHAMS, 2005), TLR2 por uma variedade de
componentes da parede celular de bactérias Gram-positivas tais como
lipoproteínas que podem ser encontradas em bactérias Gram-positivas e Gramnegativas e Mycoplasma spp. , TLR-7 e TLR-10 ainda não estão determinados
(ABRAHAMS, 2005), e TLR5 pode ser ativado pela flagelina presente no flagelo
bacteriano. Além disso, TLR1 e TLR6 podem se combinar com TLR2 para mediar
respostas a alguns produtos microbianos. Tais combinações podem alterar não
somente a especificidade de determinado reconhecimento, mas também a
natureza e a intensidade dos sinais gerados. Nove TLRs formando homo ou
heterodímeros podem resultar em mais de 500 possíveis combinações. TLRs
poderiam estar potencialmente associados aos complexos maiores que dímeros,
abrindo assim a possibilidade de um grande repertório de combinações.
Embora existam muitas evidências de que LAMPs são reconhecidas
por TLR 2 e TRL 6, ainda permanece obscuro como os TLR reconhecem seus
ligantes. Estudos prévios mostram que LAMPs interagem com TLRs causando
indução de citocinas, e que esta via de estimulação foi independente de CD 14 e
de lipopolisacarídeos ligados a proteínas (YOU et al., 2006).
A ligação de TLR com produtos microbianos resulta na resposta imune
inflamatória caracterizada pela produção de citocinas e fatores antimicrobianos.
Além disso, através da regulação de moléculas co-estimulantes, receptores do
58
tipo Toll podem facilitar o desenvolvimento de respostas imuno-adaptativas
(ABRAHAMS, 2005).
Segundo ABRAHAMS (2005), o trato reprodutivo feminino, durante
muitos anos, foi visto como um ambiente estéril, livre de microrganismos ou
células imunes. Atualmente se sabe que o sistema imune representa um
importante componente do trato reprodutivo, influenciando muitas funções
biológicas.
Além
disso,
o
trato
reprodutivo
inferior
é
colonizado
por
microrganismos comensais que eventualmente podem ascender ao trato
reprodutivo superior. Um dos mecanismos de proteção destes órgãos é o
processo de reconhecimento realizado pelos receptores do tipo Toll.
O óxido nítrico (NO) constitui uma das menores e mais simples
moléculas biossintetizadas (MORRIS & BILLIAR, 1994). Trata-se de um derivado
do aminoácido L-arginina pela atividade enzimática de três dioxigenases,
denominadas óxido nítrico-sintetases (NOS). Dois isômeros dessa enzima são
expressos na forma constitutiva (c-NOS) em células endoteliais, nos neurônios,
músculos esqueléticos e miométrio (BUHIMSCHI et al, 2000). O terceiro isômero
induzido (i-NOS) é identificado nas células do sistema imune, a exemplo dos
macrofágos e outras células ativadas por citocinas (MARLETTA, 1988;
MONCADA et al., 1991; FLORA FILHO & ZILBERSTEIN, 2000).
Até meados da década de 1980, o NO era considerado apenas membro
de uma família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais
(DUSSE et al., 2003). MONCADA et al. (1991) afirmam que este radical livre
gasoso participa de vários processos fisiológicos e patológicos no organismo, tais
como regular a pressão sangüínea, suprimir a atividade dos macrófagos, inibir a
adesão de leucócitos ao endotélio vascular e promover a apoptose.
Segundo ARCHER (1993), o NO pode ser um oxidante ou um redutor,
dependendo do meio em que ele está, e é rapidamente destruído pelo oxigênio,
sendo que sua oxidação produz nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-) (KIECHLE &
MALINSKI, 1993).
A produção de NO ocorre de duas formas. A forma constitucional que é
cálcio/calmodulina dependente e produz pequenas quantidades constantes de NO
e a forma indutível citoplasmática, que é cálcio independente e produz grandes
59
quantidades de NO após a ativação celular (PALACIOS-CALLENDER et al.,
2007).
Segundo DUSSE et al (2003), até o final da década de 70, acreditavase que óxidos de nitrogênio inorgânicos eram produzidos somente por bactérias e
que em mamíferos estes compostos derivavam somente da dieta. Posteriormente
foi demonstrada a produção de nitrato (NO3-) em camundongos isentos de germes
e um estudo do balanço metabólico comprovou a biossíntese de NO3- em homens
saudáveis.
As observações de que altas concentrações de nitrato eram um achado
constante em crianças com diarréia aguda de etiologias diversas sugeriram, pela
primeira vez, uma associação entre a produção de NO3- e o sistema imunológico
(HEGESH & SHILOAH, 1982). As observações de que animais portadores da
deficiência de macrófagos apresentavam baixa excreção de NO3- reforçaram a
relação entre o sistema imunológico e a produção de nitrato (SNYDER & BREDT,
1992).
O NO é o principal mediador citotóxico de células imunes efetoras
ativadas e constitui a mais importante molécula reguladora do sistema imune
(HIBBS, et al., 1987; MARLETTA, 1988). No tocante às infecções bacterianas, a
síntese de NO se mostrou importante no controle de infecções de uma variedade
de bactérias intracelulares, incluindo o Mycobacterium tuberculosis (JUNGI et al,
1999).
A detecção do NO em amostras biológicas representa um desafio, em
função da ínfima concentração e da meia-vida extremamente curta deste
composto, cerca de 4 a 6 segundos no plasma e 10 a 60 segundos nos tecidos
(ARCHER, 1993; KIECHLE & MALINSKI, 1993).
A habilidade de macrófagos expostos aos componentes bacterianos
expressarem óxido nítrico sintetase (iNOS) e gerar NO é considerada uma
importante via efetora no combate aos patógenos intracelulares, mas isto também
implica numa seqüela imunopatológica ( JUNGI et al. , 1999).
O NO resultante da ativação da i-NOS possui ação citotóxica e
citostática, promovendo a destruição de microrganismos, parasitas e células
tumorais. A citotoxidade do NO resulta da sua ação direta ou da sua reação com
outros compostos liberados durante o processo inflamatório (DUSSE et al, 2003).
60
Em processos infecciosos, células ativadas como macrófagos,
neutrófilos e células endoteliais secretam simultaneamente NO e intermediários
reativos do oxigênio, sendo a ação citotóxica indireta do NO decorrente de sua
reação com esses intermediários do oxigênio. A célula produtora de NO e sua
vizinhança não estão a salvo da toxicidade dessa molécula, podendo até mesmo
ser destruídas (DUSSE et al, 2003).
CERQUEIRA & YOSHIDA (2002) ressaltam que lipopolissacarideos
(LPS) ou endotoxinas bacterianas, junto com citocinas, como fator de necrose
tumoral
(TNF- ), IL-1 ou IF- , induzem a síntese de iNOS, de 2 a 4 horas após
a exposição ao agente. A iNOS requer síntese protéica para sua expressão e sua
atividade persiste por mais de 24 horas (ADAMS & REN, 1996). Segundo
KIECHLE & MALINSKI (1993), a indução da iNOS é responsável pelas
propriedades citotóxicas do NO. KMONÍČKOVÁ et al. (2007), estudando a relação
entre macrófagos, secreção de citocinas por estas células e por mononucleares
oriundos de sangue periférico e a produção de NO in vitro verificaram correlação
significativa entre estes parâmetros.
JUNGI et al (1999), estudando a atividade de várias bactérias e
componentes bacterianos em induzir a síntese de NO pelos macrófagos
derivados de monócitos e o efeito da co-estimulação de IFN-
quando co-
administrado a vários componentes bacterianos, concluíram que macrófagos
bovinos expostos a interferon-
recombinante bovino (rboIFN- ) adquirem
mecanismos através dos quais reagem melhor a componentes bacterianos
distintos do LPS induzindo a síntese de NO. PELTIER et al. (2005) foram capazes
de caracterizar um fator estimulante de macrófagos relacionado ao Mycoplasma
hominis, envolvido na infertilidade humana e no desencadeamento do parto
prematuro, associando-o mais aos receptores Toll que à liberação de NO.
JUNGI et al (1999), estudando a indução da síntese de NO através da
exposição às bactérias Gram-negativas, observaram que apesar de se saber que
lipopolissacarídeos e bactérias que expressam LPS induzem a síntese de NO em
macrófagos bovinos, a proporção de fluido associado à indução de iNOS foi
variada, sendo maior para E. coli e menor para M. bovis. Para se distinguir entre
os efeitos mediados por LPS e outros componentes, determinou-se o efeito da
polymixina –B na indução da síntese de NO por LPS. A atividade de
61
sobrenadantes solúveis bacterianos foi inibida em maior medida do que as
próprias bactérias, sugerindo que a atividade indutora de NO se deve em parte a
constituintes não-LPS.
Segundo SUTCLIFFE & RUSSELL (1995) uma propriedade comum
aos micoplasmas e às bactérias Gram negativas é a presença de uma membrana
que constitui a camada ultra-periférica de seu envelope celular, ou seja, a camada
exterior pode ser revestida com uma cápsula polissacarídica. Entretanto, como o
envelope dos micoplasmas carece da parede celular e membrana externa, esta é
consideravelmente menos complexa do que a das bactérias Gram negativas.
Ambos tipos de envelope contém grande quantidade de lipoproteínas, mas nos
micoplasmas estas moléculas estão ancoradas num folheto exterior à membrana
plasmática.
A presença de grandes quantidades de lipopolissacarideos (LPS) na
membrana externa é uma propriedade distinta das bactérias Gram – negativas;
entretanto, a membrana plasmática de algumas espécies de micoplasmas
também contém lipoglicanos, os quais, embora claramente distintos dos LPS,
compartilham com LPS uma membrana lipídica âncora e uma estrutura repetitiva
de oligossacarídeos. Adicionalmente, nos micoplasmas algumas lipoproteínas são
antígenos variáveis, atravessam ambas as fases e variações de seqüências.
Variabilidade na seqüência baseada na presença de motivos repetitivos é,
portanto, outra propriedade compartilhada pelos LPS e lipoproteínas, em adição
ao seu papel na modulação da atividade do sistema imune do hospedeiro
(CHAMBAUD et al.,1999).
O termo modulina bacteriana tem sido proposto para descrever
agrupamentos de moléculas que induzem a síntese de citocinas com
conseqüências patológicas. LPS é uma das modulinas mais estudada, mas
existem mais 16 classes de componentes celulares que podem se listados como
capazes de estimular a produção de citocinas.
Micoplasmas produzem pelo
menos três classes de modulinas; lipoproteínas e lipídios e, somente no M.
arthritidis, um polipeptídeo super-antigênico (COLE et al., 1996; HENDERSON et
al., 1996). Estudos feitos com micoplasmas causadores de síndromes
respiratórias em humanos mostraram que a produção parece ser sustentada
pelos lipopeptídeos presentes neste microrganismo (MÜHLRADT et al., 1997).
62
Muitos estudos têm mostrado que lipoproteínas estimulam monócitos e
induzem a secreção de citocinas pro-inflamatórias, como fator de necrose tumoral
(TNF- ), interleucina 6 (IL-6) e IL (1). O sinergismo entre lipoproteínas e LPS in
vivo na indução de choque letal e na produção de citocinas pro-inflamatórias
sugerem que as lipoproteínas e os LPS ativam macrófagos por diferentes vias,
talvez como resultado de diferentes interações com distintos membros da família
dos TLR. Os TLRs conservados detectam um espectro de produtos microbianos
que incluem não somente LPS e lipoproteínas mas também peptideoglicanos e
ácido lipoteicoico (BRENNER et al., 1997; CHAMBAUD et al.,1999).
Os lipoglicanos dos micoplasmas podem induzir a morte de
determinados tipos celulares, provavelmente pela mediação do NO, em um
mecanismo dose dependente (CHELMONSKA-SOYTA et al. 1994). Estes
autores, avaliando a habilidade do Ureaplasma diversum em induzir a produção
de NO por células mononucleares de camundongos verificaram que a produção
ocorreu de forma dose dependente. CHELMONSKA-SOYTA et al. (2001),
utilizando cultivos de células do sangue periférico de bovinos e avaliando a
produção de NO não verificaram diferenças entre os valores para as células
ativadas pelo Ureaplasma diversum (1,38 nM/mL) e aquelas não ativadas (1,34
nM/mL).
Para ROSENDAL et al. (1995) muitas das espécies patogênicas de
micoplasmas possuem atividade imunomodulatória tais como ativação do
complemento, ativação da mitose linfocitária e supressão da função dos
macrófagos e neutrófilos.
Embora
a
elevada
quantidade
de
NO
disponibilizada
ocorra,
provavelmente, para proteger o hospedeiro da infecção, seu efeito supressor
sobre a proliferação de linfócitos e os danos provocados sobre as células do
hospedeiro conferem ao NO uma dualidade entre proteção e destruição inerente a
outros componentes da resposta imune (MacMICKING et al, 1997). De fato,
dados de GALINDO et al. (2004) mostram quão danificado o endométrio de vacas
repetidoras de estro pode se apresentar, independente da patogenicidade do
microrganismo isolado.
63
ROSSELLI et al. (1998) apontam o NO como um elemento regulador
fisiológico do trato reprodutor de mamíferos, envolvido na remodelação tecidual e
presente tanto no endométrio quanto na mucosa cervical e vaginal.
ULBRICH et al. (2006) verificaram que o epitélio da tuba uterina bovina
é capaz de sintetizar as duas formas do NO (constitucional e indutível),
estimulado pela progesterona mas não pelo estradiol, indicando que o NO
endógeno está estreitamente relacionado com a função da tuba uterina. Quanto
ao endométrio, WOCLAWEK-POTOCKA et al. (2004) mostraram que células
endometriais de vacas são capazes de produzir NO durante a fase pré-ovulatória,
mas ROBERTO da COSTA et al. (2007) verificaram que as células do epitélio
endometrial de éguas são capazes de produzir NO tanto sob ação progesterônica
quanto estrogênica, mostrando seu envolvimento na fase proliferativa, a qual
caracteriza, nos mamíferos, a fase durante a qual os mecanismos de defesa
naturais do útero estão ativados.
No entanto, a interface entre a produção de NO por células
mononucleares e a imunidade inata parece estar estreitamente relacionada à sua
contribuição no controle da replicação ou na morte de microrganismos de
parasitismo intracelular (BOGDAN et al., 2001). Recentemente PORTO et al.
(2008) evidenciaram a extensa destruição tecidual presente em amostras
oriundas do trato reprodutor de vacas naturalmente infectadas por Ureaplasma
diversum, o que pode estar relacionado com este efeito destrutivo, mas este,
como a maior parte dos micoplasmas e ureaplasmas, é um agente de ação
extracelular. Paradoxalmente, as dificuldades encontradas no tratamento das
micoplasmoses genitais em bovinos, a facilidade de re-infecção, assim como no
desenvolvimento de vacinas que sejam efetivas na proteção contra esses agentes
leva os pesquisadores a acreditarem haver ainda elementos desconhecidos
envolvidos na patogenia desses microrganismos.
Durante um processo inflamatório do trato reprodutor feminino causado
por micoplasmas ou pelo Ureaplasma diversum as alterações histopatológicas
mais comuns são caracterizadas pelo infiltrado de neutrófilos e células
mononucleares, o que sugere a estimulação da resposta celular e de mediadores
inflamatórios. Para ARAI et al. (1990), um fenômeno que pode contribuir na
patogenia das doenças causadas por micoplasmas é sua capacidade mitogênica
64
sobre os linfócitos, sua habilidade em induzir a blastogênese e a produção de
citocinas.
Com base nas evidências de que o óxido nítrico mantém significativa
associação com a destruição tecidual mediada pelos processos inflamatórios, e
de que os membros da família Mycoplasmatacae com afinidade pelo trato
reprodutor dos bovinos são capazes de promover reações locais severas, sem, no
entanto, exercer parasitimo intracelular, foi questionado se o Mycoplasma bovis,
Mycoplasma bovigenitalium e o Ureaplasma diversum seriam capazes de ativar
células mononucleares bovinas e assim, desencadear alguma resposta
sinalizadora do reconhecimento deles no trato reprodutor.
Com o objetivo de avaliar, in vitro, a habilidade do Ureaplasma
diversum, Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium em ativar células
mononucleares oriundas do endométrio, mucosa vaginal e sangue periférico de
vacas negativas para estes agentes, por meio da verificação da produção de NO,
contribuindo assim para o entendimento da patogenia destes agentes, é que se
desenvolveu este trabalho.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido no Setor de Reprodução Animal do
Departamento de Produção Animal da Escola de Veterinária, e no Laboratório de
Imunologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás, no período de agosto a novembro de 2007. Para se avaliar a
ativação de células mononucleares endometriais, vaginais e no sangue periférico
pela produção de óxido nítrico em resposta à exposição ao Mycoplasma bovis,
Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum foram colhidas amostras de
material celular endometrial, vaginal e sangue total de 33 fêmeas bovinas adultas,
hígidas, não gestantes, oriundas de um único lote de manejo.
A colheita do material celular endometrial foi realizada conforme
descrito por GALINDO et al. (2004), com auxílio de uma escova ginecológica
descartável, de uso humano, acoplada a uma haste plástica flexível. Para evitar o
contato da escova com as mucosas vaginal e cervical, a mesma era acomodada
65
no interior de uma bainha francesa utilizada para inseminação artificial, protegida
por camisa sanitária. Este conjunto era introduzido pelo canal cervical até o corpo
do útero e, após o rompimento da camisa sanitária, já no corpo do útero,
efetuava-se pressão através do reto, pressionando-se a parede uterina contra a
escova ginecológica, ao mesmo tempo em que eram feitos movimentos de
rotação desta, permitindo o contato com o endométrio e a colheita de células. As
amostras eram então colocadas em frascos plásticos devidamente identificados e
contendo 4mL de solução tampão fosfato estéril e acondicionadas em gelo.
A colheita do material celular vaginal também foi realizada com auxílio
de escova ginecológica descartável de uso humano. Para evitar a contaminação
da escova efetuou-se a higienização seca da região vulvar externa com papel
toalha descartável. Enquanto um auxiliar da equipe mantinha os lábios vulvares
do animal abertos, outro colhia esfregaços da região vaginal, pela fricção da
escova ginecológica na referida mucosa. Os esfregaços foram imediatamente
introduzidos em frasco plástico contendo 4mL de solução tampão fosfato estéril e
acondicionados em gelo.
Após a obtenção de amostras de material celular endometrial e vaginal,
colheu-se uma amostra de 10 mL de sangue de cada animal, por meio da punção
da veia coccígea com auxílio de agulhas descartáveis 40 X 12 mm, depositandose o sangue em tubos de ensaio de vidro esterilizados com tampa de borracha e
heparina, e mantidos sob refrigeração. Imediatamente após o término das
colheitas, todos os tubos foram levados ao Laboratório de Imunologia do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG para processamento.
A contagem das células foi realizada em câmara de Neubauer, para
obtenção da concentração de 2 x106 células/100 L de meio constituído por uma
mistura de sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes
essenciais para o crescimento celular (meio RPMI) e cultivada por 48 horas em
placa de cultura de tecido, esterilizadas, com 96 poços e capacidade de 50
L
cada. Após a adição de 20 µl do caldo Hayflick da quarta passagem da cepa
ATCC (American Type Cell Culture) 25523 (Donetta) de Mycoplasma bovis, cepa
ATCC 19852 de Mycoplasma bovigenitalium e do caldo UB da quarta passagem
da cepa ATCC 49783 do Ureaplasma diversum à placa de cultura de tecidos com
células mononucleares, fez-se incubação por 48 horas, a 37º C, em uma tensão
66
de 5,0% de CO2. Na fase final, 50µl do sobrenadante da cultura de células foram
removidos e colocados em outra placa, acrescentando-se 50µl do reagente de
Griess, e após o período de repouso por dez minutos à temperatura ambiente,
procedeu-se a determinação da concentração de NO utilizando o leitor automático
de microplacas (ORGANON, Reader 2001, USA) com um filtro 540 nanômetros.
O grupo-controle negativo constou de suspensão celular sem presença
de microrganismos. Os resultados foram expressos em nanomols (nM) a partir de
uma curva-padrão estabelecida em cada ensaio, constituída de concentrações
nanomolares conhecidas de óxido nítrico.
Para verificação da presença de células mononucleares e dos
microrganismos no material endometrial, vaginal e sanguíneo, foram feitos
esfregaços a partir da cultura de células (grupo controle negativo) e da cultura de
células
expostas
ao
Mycoplasma
bovis,
Mycoplasma
bovigenitalium
e
Ureaplasma diversum, obtendo-se as alíquotas diretamente da placa de cultura
de tecido. Retirou-se uma gota do sedimento presente nos poços da placa e
depositou-se
em
lâminas
de
vidro,
confeccionando-se
esfregaços.
Posteriormente, foram fixados em metanol por cerca de 5 minutos, sendo
submetidos posteriormente à técnica de coloração pela Solução de Giemsa (3
gotas em 1 mL de água destilada), permanecendo nesse corante por 3 minutos, e
armazenadas para posterior avaliação em microscópio ótico, seguindo o proposto
por CORREA & CORREA (1992).
A avaliação foi feita em microscópio ótico binocular, com aumento de
400X,
percorrendo-se
a
lâmina
em
zigue-zague,
tomando-se
campos
microscópicos das regiões de maior concentração celular, observando-se as
células de descamação, leucócitos e presença de microrganismos, segundo
descrito por GALINDO et al. (2004).
Da
mesma
forma,
para
comprovação
da
concentração
de
microrganismos pós-ensaio, alíquotas foram aleatoriamente retiradas das placas
imediatamente após a leitura da absorbância.
Estas alíquotas foram cultivadas
nos caldos Hayflik e UB por 18 horas, semeadas em agar Hayflik e UB e cultivadas
por 48 a 72 horas, efetuando-se a contagem das unidades formadoras de colônia
em estereomicroscópio.
67
Os resultados foram tabulados e submetidos à análise de variância,
com nível de significância estabelecido em 5% (p<0,05).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todos os cultivos celulares, expostos ou não aos agentes patogênicos
mostraram produção de NO pela Reação de Griess. A Tabela 1 traz as
freqüências de amostras de sangue periférico, vagina e útero com maior produção
de NO em relação aos meios de cultivo celulares.
Durante a realização dos exames verificou-se que não havia amostras
de sangue periférico de seis animais (18,18%), um animal sem amostras de
esfregaço vaginal (3,03%) e nove animais sem amostra de esfregaço uterino
(27,27%).
TABELA 1 – Freqüência de amostras de sangue, vagina e útero com maior
produção de NO em relação aos meios de cultivo celulares Goiânia, 2007
Cultivos
celulares*
Meio
UD
MB
MBv
Total
Sangue
N
11
5
5
6
27
%
33,34
15,15
15,15
18,18
81,82
Amostras
Vagina
N
%
10
30,31
7
21,21
7
21,21
8
24,24
32
96,97
Útero
N
7
5
3
9
24
%
21,21
15,15
9,10
27,27
72,73
*Meio: Somente cultivo celular; UD: cultivo celular + Ureaplasma diversum; MB: cultivo celular +
Mycoplasma bovis; MBv: cultivo celular + Mycoplasma bovigenitalium.
Não houve diferença entre a produção de NO nas amostras de cultivos
celulares de sangue periférico, vagina e útero submetidas ou não ao desafio com
os três agentes estudados.
Nas amostras de sangue periférico verificou-se maior produção de
óxido nítrico no grupo controle representado pelo cultivo celular sem exposição a
nenhum dos agentes (33,34%), seguido pelo cultivo celular exposto ao M.
bovigenitalium (18,18%).
68
Nas amostras de esfregaço vaginal também observou-se maior
produção de NO quando havia somente células vaginais sem exposição a
nenhum agente (30,31%), seguido pelo cultivo celular exposto ao
M.
bovigenitalium (24,24%).
Já nos cultivos de células endometriais a maior produção de NO foi
verificada nos cultivos celulares expostos ao M. bovigenitalium (27,27%), seguido
pelo grupo controle (21,21%).
As Tabelas 2, 3 e 4 apresentam os resultados relativos à produção de
NO em cultura de células mononucleares oriundas de amostras de sangue
periférico, vagina e endométrio, expostos aos cultivos bacteriológicos de
Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium para
todas as amostras, respectivamente.
69
TABELA 2 – Produção de óxido nítrico, em nM/mL, em cultura de células
mononucleares oriundas de amostras de sangue periférico,
expostas aos cultivos bacteriológicos de Ureaplasma diversum,
Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium – Goiânia, 2007.
ANIMAL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Meio
3,95
4,52
5,79
8,15
4,81
2,92
11,67
2,92
19,37
5,04
4,87
4,33
5,62
4,33
3,72
5,27
4,35
4,12
19,37
4,00
11,22
--3,98
--2,18
22,12
--4,53
19,82
0,35
SANGUE (nM/mL)
UD
4,29
4,24
4,52
3,89
4,52
4,05
10,26
4,05
2,56
6,02
6,14
2,77
4,81
2,77
3,89
4,87
8,50
4,52
2,56
4,70
5,90
--4,25
--5,55
5,99
--4,71
14,14
0,81
MB
5,16
4,70
4,52
3,72
7,17
4,68
9,26
4,68
2,63
5,45
4,52
3,06
4,41
3,06
3,95
17,84
4,75
5,16
2,63
4,24
3,78
--2,53
--1,47
5,19
--4,80
2,98
0,53
MBv
4,41
4,87
4,75
6,48
6,14
7,29
5,60
7,29
3,76
5,12
4,47
2,85
4,64
2,85
4,06
7,17
4,58
4,52
3,76
4,12
2,80
--2,08
--17,42
7,94
--3,44
1,65
2,08
*Meio: Somente cultivo celular; UD: cultivo celular + Ureaplasma diversum; MB: cultivo celular +
Mycoplasma bovis; MBv: cultivo celular + Mycoplasma bovigenitalium
Os macrófagos podem ser induzidos a liberar NO por uma variedade
de estímulos, tais como produtos de bactérias e citocinas, e alguns micoplasmas
70
são capazes de efetuar esta indução. A produção de NO parece permitir ao
macrófagos sustentar a atividade citostática e citotóxica contra bactérias, vírus,
protozoários, helmintos, e ao mesmo tempo, permite ao macrófago produzir
outras substâncias que favorecem o combate aos agressores (BOGDAN, 2001).
JUNGI et al. (1999) sugerem que somente os macrófagos bovinos, e não os
monócitos, são capazes de expressar altos níveis de iNOS mediante a exposição
a constituintes bacterianos, o que explicaria as baixas concentrações de NO
encontradas nas amostras de sangue periférico no presente experimento.
Ainda, estes mesmos autores afirmam que a ativação de monócitos e
macrófagos bovinos produzem óxido nítrico de forma dependente da iNOS,
demonstrando, in vitro, que a regulação de iNOS dependente de citocinas em
macrófagos bovinos é distinta, e que monócitos adquirem a habilidade de
responder a estímulos bacterianos através da síntese de NO durante a
diferenciação para macrófagos. Os mesmos autores verificaram que a indução à
produção de NO foi menor para Mycoplasma bovis quando comparada a outros
agentes como a E. coli, por exemplo.
71
TABELA 3 – Produção de óxido nítrico, em nM/mL, em cultura de células
mononucleares oriundas de amostras de zaragatoas vaginais,
expostas aos cultivos bacteriológicos de Ureaplasma diversum,
Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium – Goiânia, 2007.
ANIMAL
Meio
1
3,69
2
5,45
3
3,20
4
3,80
5
3,95
6
7,35
7
5,10
8
5,16
9
5,10
10
5,16
11
16,48
12
4,40
13
3,62
14
14,64
15
7,44
16
5,16
17
3,80
18
14,57
19
14,57
20
5,18
21
4,80
22
0,08
23
4,98
24
0,81
25
22,30
26
46,25
27
-28
1,08
29
4,22
30
0,26
31
2,89
32
0,08
33
17,31
*Meio: Somente cultivo celular;
VAGINA (nM/mL)
UD
MB
MBv
2,92
2,85
3,90
4,24
8,27
4,64
3,48
2,99
3,13
3,80
3,69
13,27
4,29
13,74
4,58
3,89
11,61
8,15
9,10
5,74
5,63
3,95
4,47
4,46
9,10
5,74
5,63
4,16
4,27
3,80
4,68
2,99
11,96
3,98
8,35
2,92
2,85
4,05
2,56
2,63
3,76
3,20
3,62
4,33
2,99
4,16
4,27
3,80
3,80
3,69
13,27
3,13
4,19
3,48
3,13
4,19
3,48
8,92
8,64
13,51
4,80
5,34
2,80
0,26
0,26
0,53
14,59
10,87
8,97
0,17
0,17
1,90
8,79
19,31
7,52
48,06
46,52
19,31
---1,54
0,44
1,44
4,93
6,08
6,12
1,53
0,26
0,44
0,85
0,59
0,32
0,15
0,08
0,26
12,60
25,48
8,06
UD: cultivo celular + Ureaplasma diversum; MB: cultivo celular +
Mycoplasma bovis; MBv: cultivo celular + Mycoplasma bovigenitalium
A produção de NO é uma ação genuinamente originada nas células do
sistema imune (BOGDAN, 2001). No presente estudo verificou-se grande
variação na produção de NO, medida como nitrato, que foi mais elevada, na maior
parte das amostras, nos cultivos celulares obtidos de material vaginal. Isto pode
72
estar relacionado ao modo de obtenção das células, com maior quantidade no
material colhido da mucosa vaginal, ou mesmo à rapidez de resposta das células
mononucleares presentes na mucosa vaginal, já que esta seria a primeira e
principal via de acesso dos microrganismos no trato reprodutor feminino.
TABELA 4 – Produção de óxido nítrico, em nM/mL, em cultura de células
mononucleares oriundas de amostras de zaragatoas endometriais,
expostas aos cultivos bacteriológicos de Ureaplasma diversum,
Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium – Goiânia, 2007.
ANIMAL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
*Meio:
ÚTERO (nM/mL)
Meio
UD
MB
MBv
3,27
2,99
3,06
3,13
2,99
14,15
5,32
12,80
--------6,31
5,79
4,47
5,27
----4,27
4,33
4,10
6,16
----4,24
4,58
9,13
4,58
----10,12
3,27
2,99
3,62
10,47
18,95
4,19
7,79
--------7,65
9,55
3,41
52,64
----2,92
2,49
3,06
2,70
----2,14
2,42
2,56
20,29
3,62
30,32
2,92
5,25
0,63
0,72
1,08
0,81
1,99
0,26
0,26
0,81
52,25
19,82
32,49
9,54
1,65
1,21
0,68
3,69
3,78
0,94
0,85
0,59
0,63
0,53
1,99
36,81
1,83
1,38
1,21
4,49
0,44
0,44
0,44
0,53
1,12
2,18
1,21
1,03
4,89
1,80
1,44
3,44
2,09
1,21
1,30
7,14
5,80
40,62
7,88
10,97
1,03
2,18
2,62
14,06
Somente cultivo celular; UD: cultivo celular + Ureaplasma diversum; MB: cultivo celular +
Mycoplasma bovis; MBv: cultivo celular + Mycoplasma bovigenitalium
73
Considerando que as células epiteliais uterinas também têm a
habilidade de produzir NO, como comprovado por ROSSELLI et al. (1998) e
WOCLAWEK-POTOCKA et al. (2004), é possível que parte do NO detectado nas
amostras de endométrio tenha origem nas células epiteliais presentes, e não
apenas nas células mononucleares.
Não existem relatos na literatura especializada utilizando amostras de
endométrio e mucosa vaginal colhidas diretamente de fêmeas bovinas, sem
nenhum tratamento pré-exposição aos microrganismos. Com amostras oriundas
da espécie bovina, existem apenas os relatos feitos por CHELMONSKA-SOYTA
et al.,(1994 e 2001), testando o U. diversum em cultivos de macrófagos de
peritônio de camundongos e em cultivos de células mononucleares de sangue
periférico de bovinos, respectivamente.
Os valores descritos neste estudo estão mais elevados que aqueles
relatados por CHELMONSKA-SOYTA et al.,(1994), testando apenas o U.
diversum, (0,46 a 0,96 nM/mL) em cultivos de macrófagos de camundongos, mas
os autores ressaltaram que as células mononucleares bovinas deveriam ser
testadas. Quando utilizaram cultivos de células mononucleares de sangue
periférico, CHELMONSKA-SOYTA et al. (2001) não verificaram diferenças entre
os valores para as células ativadas ou não pelo Ureaplasma diversum, dado
compatível com aqueles aqui apresentados.
A produção de óxido nítrico observada em todos os cultivos celulares,
desafiados ou não, mostrou-se irregular com valores variando de 0,35 a 19,82
nM/mL em cultivos com células do sangue periférico; 0,08 a 48,06 nM/mL em
cultivos com células vaginais e 0,26 a 52,64 nM/mL em cultivos com células
endometriais. Esses resultados sugerem que as concentrações maiores são
decorrentes da produção inespecífica oriunda de células não integrantes do
sistema imune.
A avaliação citológica dos esfregaços corados confirmou a presença
dos microrganismos e de células epiteliais (Figura 1). Pode-se observar a
presença de microrganismos variando sua forma de esférica até delgados
filamentos ramificados, conforme descrito por CARDOSO (2003), células de
descamação epitelial vaginal e uterina, presença de hemácias e leucócitos nas
amostras de sangue periférico.
74
FIGURA 1 – A – Fotomicrografia de esfregaço oriundo de cultivo de células vaginais e
U. diversum mostrando presença de célula epitelial de descamação com agente
aderido externamente (seta) (400X - Giemsa) e B – presença de microrganismos de
forma filamentosa - Ureaplasma diversum (seta) (400X - Giemsa); C - Esfregaço
oriundo de cultivo de células do sangue e M. bovis, mostrando célula mononuclear
ativada (seta) (1000X - Giemsa). D - Esfregaço oriundo de cultivo de células
endometriais e M. bovigenitalium mostrando célula mononuclear (400X - Giemsa).
Nas amostras cultivadas após a leitura das placas verificou-se a
concentração de 8,44X103 UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônias) de
Mycoplasma bovis; 10,04X103 UFC/mL de Mycoplasma bovigenitalium e 1,04X103
UFC/mL de Ureaplasma diversum. A obtenção de cultivos positivos para os três
microrganismos nas alíquotas retiradas após a leitura da produção de NO, em
concentrações mais elevadas que aquelas inoculadas pode indicar que, embora
os agentes tenham ativado as células para produção de NO, o efeito citotóxico do
NO, como relatado por HIBBS, et al, (1987) e MARLETTA (1988) não foi efetivo
sobre estes organismos, pois mantiveram sua replicação.
75
Tem sido descrito que lipoproteínas de micoplasmas estimulam
respostas imunes do hospedeiro. Entretanto, infecções por micoplasmas não são
necessariamente associadas com uma resposta inflamatória forte e alguns
micoplasmas colonizam o trato respiratório e urogenital sem sintomas clínicos
aparentes, sugerindo que tenham desenvolvido mecanismos de supressão da
síntese das citocinas pró–inflamatórias (ROTTEM, 2003), as quais induzem a
síntese de NO (CERQUEIRA & YOSHIDA, 2002). Estes mecanismos podem ser
responsáveis por desregular a resposta imune imediata, prejudicando o
reconhecimento do agressor por parte do hospedeiro. LI et al. (2000) descrevem
que a produção de NO por macrófagos induzida pelo U. urealyticum não utiliza a
via das citocinas.
Coerente com esta idéia foi demonstrado que proteínas associadas a
lipídios, incluindo lipoproteínas de M. fermentans também induzem a produção de
IL-10, mas não IL-12 em monócitos humanos recém-isolados. IL-10 entre outras
citocinas suprimem respostas inflamatórias.
Seria, portanto, aparente que a
intensidade das reações inflamatórias decorrentes de infecções por micoplasmas
seja determinada por uma reação cruzada entre citocinas (CHAMBAUD et
al.,1999). ROSENDAL et al. (1995) discutem que o mecanismo pelo qual os
micoplasmas desencadeiam respostas mediadas pelas citocinas seja diferente
daquele mediado pelos lipopolissacarídeos, já que micoplasmas não possuem
este elemento associado à membrana.
Além disso, deve se discutir a ação predominantemente parácrina do
NO. Em condições normais, microrganismos de parasitismo intracelular induzem
a produção de NO pelas células mononucleares, predominantemente pelos
macrófagos, e o NO liberado atua sobre as células vizinhas, levando-as à morte,
e desta forma, matando os organismos internos. O fato de micoplasmas e
ureaplasmas atuarem mais efetivamente em um mecanismo extracelular pode
prejudicar o reconhecimento do agressor por parte do hospedeiro, resultando em
menores quantidades de NO liberadas nos ensaios in vitro.
Neste contexto, seria fundamental a participação dos receptores Toll
reconhecendo micoplasmas ou parte deles e gerando uma resposta por meio de
células do sistema imune do hospedeiro. O receptor do tipo Toll humano 2 (TLR2) foi determinado como um receptor de superfície de macrófagos para LPS e
76
lipoproteínas, assim, é possível que outros membros da família dos receptores do
tipo Toll tenham uma função similar sendo capazes de deflagrar a resposta imune
frente aos micoplasmas e ureplasmas. Depois da ativação de TLR pelo LPS, o
sinal é transmitido através da membrana plasmática, resultando na ativação de
fatores nucleares e a regulação de genes responsivos (CHAMBAUD et al.,1999).
Os resultados apresentados mostram que o Ureaplasma diversum,
Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium são capazes de ativar a
produção de óxido nítrico em material celular oriundo do endométrio, mucosa
vaginal e sangue periférico de vacas, sugerindo que este seja um dos
mecanismos envolvidos na resposta imediata do trato reprodutor à infecção por
estes agentes, desencadeada pelo sistema imune inato de defesa, mas não o
mais efetivo.
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CAPÍTULO 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Micoplasmas e ureaplasmas são patógenos eficientes em provocar
lesões nos seres humanos e em uma grande variedade de animais, apesar de
sua estrutura relativamente simples. Devido à falta de terapêutica eficaz e à
dificuldade no desenvolvimento de vacinas, além do caráter “silencioso” que
caracteriza sua presença no rebanho, as micoplasmoses constituem-se em um
problema significativo para a produção animal, o que indica a necessidade
urgente de desenvolver novas abordagens para a prevenção e tratamento.
Contudo, isto requer um sólido conhecimento da biologia e patogenia destes
agentes pois são conhecidos como as menores bactérias capazes de autoreplicação, de caráter oportunista e que necessitam parasitar células do
hospedeiro na dependência de nutrientes pré-existentes, pois faltam a eles muitas
das vias metabólicas associadas à produção de energia e à síntese de
componentes celulares.
A forma como os micoplasmas evoluem e adquirem patogenicidade,
incluindo a adesão celular e a forma como conseguem passar desapercebidos
pelas células fagocíticas, bem como seus mecanismos de fuga do sistema imune
inato é intrigante. Nos bovinos a presença do Mycoplasma bovis, do Mycoplasma
bovigenitalium e do Ureaplasma diversum no rebanho está estreitamente
relacionada com queda na eficiência reprodutiva, repetição de estro, abortamento
e nascimento de bezerros fracos.
O primeiro estudo apresentado avaliou o efeito tecidual da infecção
natural pelo Ureaplasma diversum, utilizando fragmentos de tuba uterina, útero,
cervix, fornix, vagina e vulva de novilhas que não eram consideradas inférteis no
rebanho de origem, com base na hipótese de que a presença ou a severidade das
lesões ficassem circunscritas à mucosa vulvovaginal. Os resultados mostraram
que todos os segmentos do trato reprodutor feminino são afetados, com lesões
histopatológicas compatíveis com o comprometimento do processo reprodutivo
desde a capacitação do gameta masculino para a fertilização e do gameta
feminino para ser fertilizado até a manutenção da gestação.
No segundo trabalho avaliou-se, in vitro, a habilidade de células
mononucleares uterinas, vaginais e sanguíneas de vacas em responder à
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infecção por Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma
diversum com base na hipótese de que o primeiro caminho de resposta do
sistema imune inato a estes agentes seria a apresentação do antígeno pelas
células mononucleares, sinalizada pela produção de óxido nítrico. Os resultados
mostraram que os agentes foram capazes de ativar a produção de óxido nítrico,
porém de forma irregular, sugerindo que este seja um dos mecanismos
envolvidos na resposta imediata do trato reprodutor à infecção por estes agentes,
desencadeada pelo sistema inato de defesa, mas não o mais efetivo.
Os dados aqui apresentados mostram a necessidade de mais estudos,
inclusive testando cepas de campo, teoricamente com maior virulência que cepas
ATCC, utilizando cultivos celulares.