de dissertação em pdf - Pós

Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos
COMPARAÇÃO DE UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA
DIAGNÓSTICO DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA (CAE)
COM OUTRAS TÉCNICAS SOROLÓGICAS E PCR.
Julianna Alves Torres
Salvador – Bahia
2008
ii
JULIANNA ALVES TORRES
COMPARAÇÃO DE UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA DIAGNÓSTICO DA
ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA (CAE) COM OUTRAS TÉCNICAS
SOROLÓGICAS E PCR.
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária
da Universidade Federal da Bahia, como requisito para
obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos
Trópicos, na área de Saúde Animal.
Orientador(a): Prof. Dra. Sílvia Inês Sardi
Co-orientador: Dr. Gúbio Soares Campos
Salvador – Bahia
2008
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Torres, Julianna Alves.
Comparação de um ensaio imunoenzimático para diagnóstico da artriteencefalite caprina (CAE) com outras técnicas sorológicas e PCR.
- Salvador: Bahia., 2008, 94 p.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos)
Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia,
2008.
Professor Orientador – Profa. Dra. Sílvia Inês Sardi
Palavras-chave - diagnóstico, CAEV,ELISA, IDGA, PCR.
iv
COMPARAÇÃO DE UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA DIAGNÓSTICO DA
ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA (CAE) COM OUTRAS TÉCNICAS
SOROLÓGICAS E PCR.
JULIANNA ALVES TORRES
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos
Trópicos
Salvador, 31 de julho de 2008
Comissão Examinadora:
____________________________________________________
Profa. Dra. Sílvia Inês Sardi - UFBA
Orientador
____________________________________________________
Profa. Dra. Lília Ferreira de Moura Costa – UFBA
____________________________________________________
Prof. Dr.Carlos Roberto Franke – UFBA
v
Dedico este trabalho:
A pessoa mais alto astral que conheço, mais versátil e inteligente: Minha
querida mãe Margarida. Minha fonte de inspiração, de amor e de novas
perspectivas. Amo-te incondicionalmente sempre.
AGRADECIMENTOS
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, pai amado, todo poderoso. Obrigada por tudo, sei que estais presente em todos os
momentos. Sempre que encontrava obstáculos, pensava em Ti e eras Tu que me guiava.
Minha amada mãe Margarida, a quem devo todo otimismo e coragem. Suas palavras e
conselhos...seu colo....seu amor. Obrigada, sua energia é sempre positiva. A meu pai Adelino
pelo orgulho que sentes de mim e pelo amor. Sua disciplina e ensinamentos me fizeram a pessoa
que sou hoje. Aos meus queridos irmãos Marcelo e Lula, obrigado pela torcida e carinho.
A Lucas (Meu Preto), não tenho palavras para agradecer.... seu apoio foi sempre
incondicional e tenho certeza que quantos degraus eu quiser subir, você estará lá sempre para me
apoiar. Amo-te demais, muito obrigada pela paciência.
A minha orientadora Profa. Sílvia Sardi por sua confiança, disciplina, orientação
incansável, amizade e pelas oportunidades de crescimento profissional. Sempre um exemplo de
dignidade e amor à pesquisa. Ao meu co-orientador Gúbio Campos, pelo incentivo a pesquisa,
conhecimento, orientação e amizade.
Aos grandes amigos conquistados no laboratório de virologia: Camila, amiga de todas as
horas, me passou todos os primeiros passos da pesquisa; Michael, um amigo que sempre tem
palavras de incentivo; Dellane, pelo carinho, paciência...., Margareth, Isa, Tereza, Déa, Pati...
enfim agradeço a todos vocês amigos pelo apoio e amizade fundamentais para a realização desse
trabalho, sem falar nos tantos momentos de descontração, não menos importantes.
A minha amiga Candanga Débora Matias por ter dado o primeiro impulso para realização
desse trabalho, por ter virado a noite me ajudando a preparar a apresentação, obrigada por estar
em minha vida, pelo carinho e apoio.
vii
Aos novos amigos conquistados no Instituto de Ciências da saúde (ICS) pelo prazer de
encontrá-los todos os dias e pelo carinho que têm por mim. Em especial a amiga Fúlvia Campos,
pelo auxílio e acolhida.
A Agência de Defesa Agropecuária da Bahia (ADAB) por ter nos ajudado com as
colheitas das amostras. A Bahia é quase um país e sem o apoio da equipe técnica da ADAB
ficaria impossível. Agradeço em especial a Dr. Antônio Maia, por sempre estar nos apoiando a
ajudando e a Dr. Paulo (ADAB - Feira de Santana) por sempre ser solícito nas colheitas, pela
paciência e pela amizade.
A Fundação de Amparo a pesquisa da Bahia (FAPESB) pela bolsa de estudos concedida
durante o curso de mestrado.
A professora Thereza Calmon pela colaboração essencial na estatística deste trabalho.
Ao curso de Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos e todos os seus professores,
funcionários e amigos conquistados que nos proporcionaram inesquecíveis momentos de prazer
em busca do conhecimento.
A todos os professores do Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos da Escola de
Medicina Veterinária da UFBA, em especial ao professor Joselito Nunes Costa, que me
encaminhou para o laboratório de virologia onde pude alcançar novos horizontes.
Aos proprietários de caprinos que gentilmente permitiram que realizássemos as colheitas.
Aos caprinos, animais que servem como meio de subsistência para muitas pessoas no nosso
Nordeste e é por eles que estamos desenvolvendo todo esse trabalho.
A todos aqueles que participaram de alguma forma deste trabalho e sonho. Agora se torna
realidade e eu só tenho a agradecer.
viii
"Cada dia a natureza produz o suficiente para nossa
carência. Se cada um tomasse o que lhe fosse
necessário, não haveria pobreza no mundo e ninguém
morreria de fome”.
(Mahatma Gandhi)
ix
ÍNDICE
Páginas
LISTA DE FIGURAS
xi
LISTA DE TABELAS
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
xiii
RESUMO
xv
SUMARY
xvi
1. INTRODUÇÃO GERAL
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. VÍRUS DA ARTRITE – ENCEFALITE CAPRINA
2.1.1. CLASSIFICAÇÃO
2.1.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
2.1.3. CICLO DE REPLICAÇÃO VIRAL
2.1.4. CÉLULAS HOSPEDEIRAS DO VÍRUS
2.1.5. PATOGENIA
2.1.6. ASPECTOS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS
A) Forma artrítica
B) Forma mamítica
C) Forma encefálica
D) Forma respiratória
2.1.7. TRANSMISSÃO
A) contato direto
B) leite
C) transmissão vertical
D) transmissão sexual
2.1.8. ASPECTOS IMUNOLÓGICOS
2.1.8.1. Resposta imune de células B e imunopatologia
2.1.8.2. Resposta imune de células T e imunopatologia
2.1.9. DIAGNÓSTICO
2.1.9.1. Clínico
2.1.9.2. laboratorial
A) Detecção sorológica
1) Imunodifusão em gel de agarose (IDGA)
2) Técnica imunoenzimática – enzime-linked immunsorbent
assay (ELISA)
3) Outras provas sorológicas – Western – Blot (WB) e
Imunofluorescência indireta (IFI)
B) Detecção do vírus ou componentes virais
1) Isolamento viral em cultivo de células
2) Detecção do ácido nucléico viral
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2.1.10. SITUAÇÃO NO BRASIL
3. ARTIGO CIENTÍFICO I
3.1. INTRODUÇÃO
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS
3.3. RESULTADOS
3.4. DISCUSSÃO
3.5. CONCLUSÕES
3.6. AGRADECIMENTOS
3.7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
27
30
32
34
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61
67
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69
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
72
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
74
6. ANEXOS
83
xi
LISTA DE FIGURAS
xi
Página
5
FIGURA 1
Representação esquemática da estrutura dos Retrovírus.
FIGURA 2
Ciclo de replicação dos Retrovirus.
7
FIGURA 3
Rebanho caprino acometido pela CAE com manifestação clínica de
12
artrite
FIGURA 4
Perfil eletroforético das proteínas virais do CAEV
49
FIGURA 5
Imunofluorescência Indireta
54
FIGURA 6
Western-Bloting
56
FIGURA 7
PCR
58
xii
LISTA DE TABELAS
xii
Página
TABELA 1
Municípios do Estado da Bahia onde foram coletadas amostras
38
TABELA 2
Comparação dos resultados obtidos em amostras de soros pelas
51
técnicas IDGA e ELISA indireto.
TABELA 3
Acompanhamento de uma propriedade de caprinos no Estado da
52
Bahia pelo período de 2 anos.
TABELA 4
Comparação dos resultados obtidos IDGA / ELISA / PCR
60
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
CAE = artrite-encefalite caprina
CAEV = vírus da artrite-encefalite caprina
DAB = 3’3’ Diaminobenzidine
DNA = ácido desoxiribonucléico
ELISA = enzime linked immunosorbent assay
Env = envelope
FITC = Isotiocianato de Fluoresceína
IDGA = Imunodifusão em Gel de Agarose
gp = glicoproteína
HIV = vírus da imunodeficiência humana
HTLV – III = vírus linfotrópico T humano tipo III
IFI = Imunofluorescência Indireta
IFN = interferon
LV = lentivirus
LVPR = Lentivírus de pequenos ruminantes
µg = micrograma
µl = microlitro
MEM – G = meio essencial mínimo – glasgow
MVV = Maedi Visna Vírus
MSC = membrana sinovial caprina
OIE = Organização Internacional de Epizootias
IL = interleucina
PBS = salina tamponada com fosfato
PBS – L = PBS leite 5%
PBS – T = PBS-Tween 0,05%
PEG = polietilenoglicol
PCR = reação em cadeia de polimerase
xiv
PM = peso molecular
Pol = polimerase
RNA = ácido ribonucléico
SDS = dodecil sulfato de sódio
SFB = soro fetal bovino
SHC = soro hiperimune de coelho
SRD = sem raça definida
SU = proteína de superfície
TMB = 3,3’ ,5,5’-tetramethylbenidine
TR = transcriptase reversa
TM = proteína transmembrana
WB = Western – Bloting
xv
TORRES, J.A. Comparação de um ensaio imunoenzimático para diagnóstico da artriteencefalite caprina (CAE) com outras técnicas sorológicas e PCR. 94 p. Dissertação (Mestrado
em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da
Bahia, 2008.
RESUMO
O vírus da Artrite-Encefalite Caprina (CAEV), pertence a família Retroviridae e causa uma
doença severa e progressiva caracterizada pelas manifestações clinicas de encefalomielite,
mastite, pneumonia e artrite. A resposta de anticorpos nos animais é lenta e a soroconversão pode
ocorrer vários meses após a infecção. O diagnóstico pode ser baseado na detecção de anticorpos
contra o vírus através das técnicas de Imunodifusão em gel de agarose (IDGA) e Enzime liked
immunosorbent assay (ELISA). O objetivo desse trabalho foi padronizar um teste
imunoenzomático (ELISA) para detecção de anticorpos contra o CAEV, assim como comparar
com as técnicas sorológicas como IDGA, Imunofluorescência Indireta (IFI) e Western-Bloting
(WB) e com a técnica de detecção do DNA viral Polymerase Chain Reaction (PCR). Para esse
trabalho foram coletadas amostras de soro (n=343) e amostras de leite (n=40) de caprinos no
Estado da Bahia. A técnica de ELISA indireto detectou 21% (72/343) enquanto a técnica de
IDGA detectou 8,75% (30/343) de animais soropositivos para o CAEV. Na técnica de IFI foi
mostrado reatividade contra o antígeno viral através de uma forte fluorescência citoplasmática
nas células infectadas testadas com soros positivos por ELISA, e na técnica WB foi mostrada
reatividade das proteínas virais utilizando soros caprinos. A técnica de PCR foi realizada com
amostras de leite soropositivas e soronegativas por ELISA, detectando 26 (65%) das amostras de
soro positivas. Os resultados encontrados neste trabalho de comparação das técnicas de IDGA,
ELISA, IFI, WB e PCR foram de fundamental importância para determinação da especificidade e
sensibilidade do teste ELISA como uma opção de melhor sensibilidade e processamento de um
maior número de amostras como prova diagnóstica para o CAEV.
Palavras Chave: ELISA, caprinos, diagnóstico, CAEV, IDGA, PCR.
xvi
TORRES, J.A. Comparação de um ensaio imunoenzimático para diagnóstico da artriteencefalite caprina (CAE) com outras técnicas sorológicas e PCR.
Comparison of an enzyme immunoassay for the diagnosis of arthritis encephalitis goats (CAE)
with other serological techniques and PCR. Salvador, Bahia 94p. Dissertation (Master’s degree) –
Veterinary Medicine School Federal University of Bahia, 2008.
SUMMARY
The virus of caprine arthritis-encephalitis (CAEV), belongs to the Retroviridae family and cause
a severe and gradual illness characterized by the clinical manifestations of encefalomielite,
mastitis, pneumonia and artrithis. The reply of antibodies in the animals she is slow and the
seroconvertion the infection can occur some months after. The diagnosis can be based on the
detention of antibodies against the virus through the techniques of Imunodifusion in agarose gel
(IDAG) and Enzime liked immunosorbent assay (ELISA). The objective of this work was
performed an imunoenzimatic test (ELISA) for detention of antibodies for the CAEV, as well as
comparing with serological techniques IDGA, Indirect Immunofluorescence (IFI) and Westernblot (WB) and with the technique of detention of the viral DNA Polymerase Chain Reaction
(PCR). For this work samples of soros (n=343) and milk samples had been collected (n=40). The
indirect technique of ELISA detected 21% (72/343) while the IDGA technique detected 8.75%
(30/343) of soropositivos animals for the CAEV. In the IFI technique reactivity against the viral
antigen through one strong cytoplasmic fluorescence in the tested infection cells with positive
soros for ELISA was shown, and in technique WB reactivity of proteins was shown capsizes
using soros goat. The PCR technique was carried through with seropositives and seronegatives
milk samples for ELISA having detected 26 (65%) positive samples. The results found in this
work with the techniques of IDGA, ELISA, IFI, WB and PCR had been of basic importance for
determination of the specificity and sensitivity of test ELISA as an option of better sensitivity and
processing of a bigger number of samples as diagnostic test for the CAEV.
Keywords: ELISA, goats, diagnosis, CAEV, IDGA, PCR.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
O vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) pertence à família Retroviridae,
gênero Lentivirus. É um patógeno que causa uma doença severa e progressiva em
caprinos determinando importantes perdas econômicas decorrentes da morte de animais
jovens, diminuição da produção láctea e perda de peso. As manifestações clínicas desta
doença são encefalomielite, artrite, pneumonia intersticial e mastite ( PHELPS &
SMITH, 1993; CALLADO et al., 2001).
A artrite-encefalite caprina (CAE) é uma doença infecciosa específica dos
caprinos, caracterizando-se por um longo período de incubação com uma evolução
clínica lenta e progressiva (HUSO et al., 1988; FRANKE, 1998). A via mais comum de
transmissão do vírus é a ingestão do colostro ou leite de fêmeas infectadas. O vírus
também pode ser transmitido por via materno – fetal ou durante o parto, fômites, saliva,
urina, fezes e/ou secreções respiratórias (EAST et al., 1993; GUEDES et al., 2001). Os
lentivirus de pequenos ruminantes (LVPR) têm sido notificados em diversos países,
principalmente onde a ovinocaprinocultura é mais tecnificada (CALLADO, et al.,
2001).
Programas para o controle e erradicação do vírus precisam de testes diagnósticos
sensíveis e específicos. A prova utilizada como referência no diagnóstico da infecção é
a imunodifusão em gel de agarose (IDGA). Este teste sorológico é pouco sensível para
detectar animais com baixos títulos de anticorpos, facilitando a permanência de animais
2
falso-negativos no rebanho. Além disso, certo número de animais podem apresentar
soroconversão tardia ou ainda, reações intermitentes de soropositividade e
soronegatividade (EAST et al., 1993; PHELPS & SMITH, 1993; HANSON et al.,
1996). Entretanto, a IDGA até o momento é o teste de referência nacional para
detecção de animais infectados pela CAE (OIE, 2008).
Diante da significativa importância da ovinocaprinocultura, e os potenciais
efeitos negativos da infecção pelo CAEV no custo, controle, e restrições comerciais,
este trabalho visa avaliar um teste imunoenzimático (ELISA) para diagnóstico da CAE,
como uma técnica sorológica alternativa à IDGA.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 VÍRUS DA ARTRITE - ENCEFALITE CAPRINA
2.1.1 CLASSIFICAÇÃO
O CAEV pertence à família Retroviridae e ao gênero Lentivirus. Este vírus se
caracteriza por causar doenças degenerativas crônicas, com períodos de incubação
relativamente longos, persistência e replicação viral na presença de imunidade específica.
Neste gênero, encontramos outros vírus de importância para animais domésticos, entre
eles o vírus Maedi-Visna de ovinos, o vírus da anemia infecciosa eqüina, o vírus da
imunodeficiênica bovina e felina e no homem, o vírus relacionado à síndrome de
imunodeficiência adquirida (HIV) (NARAYAN et al., 1980; GOFF, 2006).
2.1.2 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
Os Lentivírus apresentam-se como vírions envelopados de 80 a 100 nm de diâmetro
contendo duas moléculas idênticas de ácido ribonucléico (RNA), um capsídeo de simetria
icosaédrica recoberto por um envelope viral, no qual se projetam as glicoproteínas.
Apresentam uma grande quantidade de ácido siálico na superfície do vírus, o qual protege
a proteína viral da digestão das proteases e de uma rápida neutralização viral por
anticorpos (HUSO et al., 1988; GOFF, 2006).
4
Estudos filogenéticos realizados com amostras de Lentivírus de pequenos ruminantes
(LVPR) indicam que esses vírus devem ser considerados como quasispécies virais
(compartilham características genéticas, morfológicas e patológicas) e que tem a
capacidade de infectar tanto ovinos quanto caprinos (PASICK, 1998; LIMA et al., 2004).
Pyper et al. (1986), demonstraram que há uma relação genética entre o vírus da MaediVisna, CAEV, e o vírus linfotrópico T humano tipo III – HTLV III (agente etiológico que
causa síndrome de deficiência imune), existindo uma correlação nas propriedades
biológicas destas viroses humanas e de animais.
O genoma dos Retrovírus apresenta alguns aspectos característicos, como: RNA
diplóide, um RNA transportador específico, cuja função é de iniciador da replicação, além
da capacidade de sintetizar uma enzima exclusiva dos Retrovírus, a transcriptase reversa
(TR) que atua como ácido desoxiribonucléico (DNA) polimerase RNA dependente. O gen
que compõe o genoma dos Retrovirus são basicamente três: o gene gag que codifica uma
poliproteína que é subseqüentemente clivada para formar as proteínas da matriz, do
capsídeo e a ligada ao ácido nucléico; gene pol que codifica as enzimas TR e a Integrase
(IN); e o gene env que codifica as duas glicoproteínas do envelope viral (glicoproteínas de
superfície - SU e transmembranar - TM) (MURPHY et al., 1999; GOFF, 2006).
Adicionalmente aos genes gag, env e pol, que são comuns a todos os retrovírus, os
vírus pertencentes ao gênero Lentivirus codificam vários outros genes, referidos como
gens acessórios. Esses incluem o gene tat, que codifica um potente transativador que
associado a fatores da célula infectada aprimora a eficiência da transcrição pela RNA
polimerase celular; o gene rev, que codifica a proteína que é envolvida na transcrição do
5
RNA viral e seu transporte do núcleo para o citoplasma, corrigindo RNAm na tradução; o
gene nef, que é essencial para replicação do vírus em macrófagos, regula a expressão de
CD4 e IL-2 e pode também alterar o estado de ativação de células alvo in vivo; e o gene
vif, que esta associado com a infectividade viral (MURPHY et al., 1999).
Figura 1. Representação esquemática da estrutura dos Retrovírus. (GOFF, 2006)
2.1.3 CICLO DE REPLICAÇÃO VIRAL
O ciclo de replicação do CAEV começa ligando as glicoproteínas de superfície (gp
135) com células receptoras susceptíveis, como as da linhagem monócito/macrofágo.
Ligado ao receptor da célula hospedeira, o complexo vírus-receptor é internalizado por
fusão resultando na penetração do vírus no citoplasma celular. Em alguns casos foi
mostrado que a entrada do vírus pode ser também por endocitose celular (HARKISS &
6
WATT, 1990; HULLINGER et al. 1993; MURPHY, et al., 1999; GOFF, 2006). A
disseminação da infecção celular “in vitro” pode também ocorrer via contato célulacélula, através da fusão celular induzida pelo vírus. Embora ambos os mecanismos citados
para entrada do vírus na célula possam ocorrer, a transmissão do vírus através da fusão
célula – célula tem indicativo de ser mais importante “in vivo” (HARKISS & WATT,
1990; MURPHY, et al., 1999; GOFF, 2006).
Em estudos realizados por Zink et al., (1990) foi observado que o CAEV pode passar
diretamente de macrófagos infectados produtivos para células não infectadas por fusão
celular não sendo necessários receptores virais específicos. A possibilidade de penetração
dos lentivírus em células infectadas tanto por endocitose mediada por receptores
específicos como também por fusão, pode permitir um tropismo mais amplo de células
hospedeiras.
Após entrada do vírus no citoplasma da célula, a enzima transcriptase reversa (TR)
copia o ácido ribonucléico (RNA) viral sintetizando um ácido desoxiribonucléico (DNA)
de fita dupla. O capsídeo é removido e o DNA viral é transportado ao núcleo, onde,
enzimas especializadas, inserem, randomicamente, este DNA viral no genoma da célula
hospedeira, compondo o “provírus”. Este, uma vez integrado ao DNA celular é estável, e
durante a replicação celular é transmitido à progênie como parte do genoma celular
(GOFF, 2006). Na forma provírus, o vírus pode permanecer latente por meses ou anos
(HARKISS & WATT, 1990).
Em condições adequadas à replicação, o DNA proviral é transcrito em
RNA genômico viral e RNA mensageiro, este último é traduzido nos ribossomos para a
7
síntese de proteínas virais. O RNA genômico viral e as proteínas estruturais são montadas
dentro da célula e a partícula viral recém formada “brota” através da membrana celular. O
vírus liberado no fluído extracelular é capaz de infectar outras células para iniciar um
novo ciclo viral (HARKISS & WATT, 1990; MURPHY,et al., 1999; GOFF, 2006).
Figura 2. Ciclo de replicação dos Retrovirus (GOFF, 2006)
Muitos Retrovírus replicam-se apenas em células em divisão, incluindo os do
gênero Lentivirus. Esses causam morte celular, formação de sincícios e apoptoses.
Diversos mecanismos possíveis existem pelos quais a infecção com Retrovírus pode levar
à destruição celular: (1) morte celular mediada pelo sistema imune; (2) toxicidade direta
por produtos dos genes virais; (3) replicação intensiva do vírus levando a uma opressão
das funções necessárias à sobrevivência celular e (4) os efeitos indiretos dos produtos dos
8
genes virais nas interações celulares necessárias as suas funções e sobrevivência.
Entretanto, existem certas condições em que a replicação viral pode acontecer sem uma
significativa destruição de células infectadas (MURPHY,et al., 1999).
Ravazzolo, et al. (2006) encontraram que os orgãos alvos do CAEV como a
glândula mamária, articulações e pulmão são importantes reservatórios do vírus, e que
células do leite e da glândula mamária são sítios proeminentes de replicação viral. Essa
replicação dos retrovírus é acompanhada por uma alta freqüência de mutação - de 10-4 a
10-5 de progênie viral por ciclo de replicação, o que sugere freqüentes erros pela TR
(MURPHY,et al., 1999).
2.1.4 CÉLULAS HOSPEDEIRAS DO VÍRUS
As células da linhagem monócito/macrófago são as principais células hospedeiras
do CAEV “in vivo”, e é nestas células que o vírus persiste por toda vida do animal. A
replicação viral é dependente do nível de maturação/diferenciação da célula monocítica
(PHELPS & SMITH, 1993; MURPHY et al., 1999).
Os monócitos suportam os estágios iniciais de replicação viral, entretanto, a
replicação somente se completa quando as células maturam para macrófagos, e enquanto
a montagem do vírion acontece intracelularmente em vacúolos citoplasmáticos, não é
visível nenhuma alteração celular Esse fenômeno, conhecido como restrição da
replicação, permite ao vírus permanecer nos monócitos por períodos prolongados e
indetectável para o sistema imune (GENDELMAN et al., 1986; ZINK et al, 1987;
9
MURPHY et al., 1999). Os macrófagos são a principal fonte do vírus em animais
experimental ou naturalmente infectados (NARAYAN et al,. 1982).
A susceptibilidade de células epiteliais de diferentes órgãos ao CAEV foi
demonstrada tanto “in vitro”, como “in vivo”, determinando um amplo tropismo desse
vírus (LAMARA et al., 2001). O RNA viral do CAEV foi detectado em células
semelhantes a macrófagos no pulmão, fígado, baço, linfonodos, nas células de
revestimento das veias do cérebro e sinoviais, células epiteliais das criptas intestinais,
túbulos renais e folículos tireoidianos (ZINK et al, 1990). Também se demonstrou que as
células epiteliais da glândula mamária, células da granulosa derivadas dos ovários e
células epiteliais do oviduto são susceptíveis a infecção “in vitro” (PHELPS & SMITH,
1993; LAMARA et al., 2001; LAMARA et al., 2002; FIENI et al., 2003) Essas células da
granulosa derivadas de ovários podem servir como reservatório durante a fase sub-clínica
da infecção (LAMARA et al., 2001).
2.1.5 PATOGENIA
Os vírus da família Retroviridae, gênero Lentivírus, caracterizam-se por um longo
período de incubação, por isso a denominação de slow vírus (GOFF, 2006). Vários meses
podem passar entre a infecção e a detecção de anticorpos para o vírus. Essa variação para
produção de anticorpos em cabras naturalmente infectadas ainda não esta bem estudada e
não há nenhuma correlação entre sintomas clínicos e padrão de produção de anticorpos
(HANSON et al., 1996). Porém, sabe-se que existe uma associação entre carga viral e
severidade das lesões causadas pelo CAEV (RAVAZZOLO et al., 2006).
10
O CAEV infecta monócitos e macrófagos, induzindo a infecção persistente, apesar
da produção de anticorpos pelo hospedeiro. Como mecanismos de persistência viral
propostos, incluem-se a presença do próvirus DNA; replicação viral que aguarda a
diferenciação de monócitos em macrófagos nos tecidos; baixa concentração de anticorpos
neutralizantes e mutação viral de genes env que ocorre durante o processo de replicação
devido à falha da TR em corrigir as novas seqüências nucleotídicas resultando em
variabilidade genética e escape ao sistema imune (REILLY et al., 2004).
Fatores quimiotáticos produzidos em tecidos inflamados recrutam macrófagos
(alguns podem estar carreando o genoma viral) para áreas de inflamação afetadas como
cérebro, medula espinhal, glândula mamária e membrana sinovial. Isso aumenta á carga
viral em tecidos inflamados (ZINK et al, 1990).
Os macrófagos infectados pelo CAEV estimulam de forma anormal os linfócitos,
induzindo a uma hiper-proliferação e reatividade linfocitária inespecífica, o que justifica
os danos imuno-mediados que caracterizam a evolução das lentiviroses clássicas. No caso
da CAE, esses danos vão se localizar nas articulações nos animais adultos e no sistema
nervoso central, nos animais jovens (GARCIA, 1993).
Segundo Ravazzolo et al. (2006), os LVPR não causam imunodeficiência como as
outras lentiviroses, tais como: vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da
imunodeficiência dos macacos (SIV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV), pelo fato
de infectar principalmente monócitos-macrófagos e não linfócitos. Os nódulos linfáticos
são uma importante reserva do CAEV, entretanto, com replicação viral moderada em
11
relação ao que se é relatada para lentiviroses em primatas. Os mais preferidos locais de
replicação deste vírus são as glândulas mamárias e células do leite. Além desses, os
monócitos infectados ao migrarem do sangue para os pulmões se diferenciam em
macrófagos, sendo crucial para replicação viral ocorrer neste órgão.
2.1.6 ASPECTOS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS
A CAE é uma enfermidade que se caracteriza por uma paralisia ascendente afebril
em cabritos, e por sinovite e artrite crônica em animais adultos (GARCIA, 1993). A
grande maioria dos animais infectados permanece assintomática (REILLY, et al., 2004),
porém dependendo do vírus e de fatores genéticos do hospedeiro, aproximadamente um
terço dos animais infectados com os LVPR pode desenvolver sintomas clínicos da doença
tais como artrite (que é a manifestação clínica mais importante em caprinos), mastite,
pneumonia e mais raramente encefalite (RAVAZZOLO, et al., 2006).
A) Forma Artrítica
Essa manifestação clínica geralmente acomete cabras adultas, com mais de um ano
de idade. A articulação do carpo esta freqüentemente envolvida com os sinais clínicos de
distensão da cápsula articular com variáveis níveis de manqueira (PHELPS & SMITH,
1993; FRANKE, 1998). No estágio inicial, a tumefação articular pode ser intermitente e a
claudicação mínima (REILLY et al., 2004). Animais com artrite apresentam altos títulos
de anticorpos especialmente para epítopos das glicoproteínas do envelope viral
(BERTONI et al., 1994).
12
A evolução da doença é variável; alguns animais vão definhando após alguns anos
e outros permanecem inalteráveis durante vários anos. Á medida que a doença evolui, os
animais tornam-se claudicantes ou se posicionam em decúbito e se debilitam (REILLY et
al.,2004). Um agravamento de artrite em cabras ocorre, geralmente, a partir da terceira
lactação (FRANKE, 1998).
FIGURA 3. Rebanho caprino acometido pela CAE com manifestação clínica de artrite
(Jornal A TARDE – Rural – 26/04/1999)
B) Forma Mamítica
O mecanismo de diminuição na produção de leite induzida pelo CAEV é
desconhecido. Mudanças histológicas têm sido detectadas nos úberes de cabras infectadas
com o CAEV, sugerindo que podem causar mastite intersticial (SMITH & CUTLIP,
1988).
13
Essa forma clínica caracteriza-se por: a) mamite intersticial, provocando o
endurecimento e a atrofia da glândula mamária atingida; b) mamite difusa, que acontece
por ocasião do parto que leva ao rápido descarte dos animais em propriedades de leite
pela baixa rentabilidade; e c) mamite nodular, que é uma forma crônica, o leite tem
aspecto normal, mas tem sua produção progressivamente reduzida e há presença de
nódulos na glândula mamária. O leite de cabra infectada não apresenta alterações visíveis,
porém podem surgir problemas na sua industrialização, como a formação insuficiente de
coalho (FRANKE, 1998).
C) Forma Encefálica
A forma neurológica da enfermidade acomete cabritos com 1 a 4 meses de idade e,
ocasionalmente, adultos. Os sinais clínicos incluem ataxia secundária e paresia que evolui
para tetraplegia. À medida que a doença evolui os cabritos tornam-se cegos, apresentam
rotação e desvio da cabeça, paralisia facial e opistótono (PHELPS & SMITH, 1993;
FRANKE, 1998; REILLY, et al., 2004).
D) Forma Respiratória
O CAEV causa uma pneumonia intersticial em cabritos e em caprinos adultos
infectados.
A doença provoca uma pneumonia crônica, perda de peso e dispnéia
(REILLY, et al., 2004). Essa pneumonia intersticial pode evoluir para pneumonia
broncointersticial, provavelmente pela invasão pulmonar por agentes bacterianos
secundários (SERAKIDES et al., 1996).
14
2.1.7
TRANSMISSÃO
Estudar a transmissão do vírus é importante para o delineamento eficiente de
medidas de controle e possível erradicação. A transmissão dos LVPR ocorre
principalmente pela ingestão de colostro e leite de fêmeas infectadas e por via
respiratória, mais comum em períodos de confinamento. Porém, o vírus tem se mantido,
por anos, em rebanhos submetidos a rígidos programas de controle da CAE. O sêmen para
inseminação artificial e a transferência de embrião representam o menor risco para a
transmissão dos LVPR (ANDRIOLI, et al, 2006).
A doença causada pelo CAEV pode levar vários meses, às vezes anos, para se
manifestar. Os animais que estão nessa condição, os portadores saudáveis, representam
um importante elo na transmissão da doença, pois aparentemente sadios, estão eliminando
vírus e infectando outros animais (GARCIA, 1993). Sendo assim, as cabras infectadas de
forma persistente atuam como reservatório e fonte de infecção do CAEV. A transmissão
ocorre por meio de secreções ou excreções ricas em células infectadas do sistema
monócito-fagocitário, principalmente macrófagos.
Estudos iniciais sugeriram que as LVPR eram patógenos específico, MV para
ovinos e CAE para caprinos, mas, atualmente, há hipóteses da transmissão natural de
ovinos para caprinos e vice-versa em criações conjuntas onde é usado leite de cabra ou
lactosoros, na alimentação de ovinos (COSTA, et al., 2007).
15
A) Contato Direto
O contato direto entre os animais, bem como toda a forma de contato indireto com os
líquidos corporais (principalmente o sangue), também são importantes meios de
transmissão do vírus (FRANKE, 1998). Assim, agulhas, tatuadores e aplicadores de
brincos, entre outros, podem atuar no contágio da CAE (GARCIA, 1993). A transmissão
horizontal se dá eficientemente em locais com alta densidade de caprinos, através de
fezes, saliva e urina (EAST et al., 1993; PHELPS, SMITH, 1993).
A via aerógena pode ser uma provável rota de infecção para o CAEV já que apresentou
imunomarcação positiva em macrófagos alveolares em inoculação experimental por via
intranasal (GUEDES et al., 2001).
B) Leite
A
via
mais
comum
de
transmissão
do
CAEV
é
a
ingestão
de
monócitos/macrófagos infectados presentes no leite ou colostro de animais com a CAE
(FRANKE, 1998; MASSELLI-LAKHAL et al., 1999; REILLY et al., 2004). Através de
pesquisas foi demonstrado que somente uma exposição oral do vírus no leite contendo 2 x
107 DICT50/ml resultou na infecção dos animais. A transmissão do vírus através da
ordenha mecânica também tem sido demonstrada sugerindo que as máquinas utilizadas
para ordenhar os animais podem servir como reservatório de leite contaminado, e um
possível mecanismo de abrigar o vírus na glândula mamária. A infecção experimental
16
através de uma infusão mamária de 2 x 107
DICT50/ml do CAEV resultou na
soroconversão de 100% das fêmeas soronegativas (EAST et al., 1993).
A inoculação intra-mamária de células halogênicas infectadas com o CAEV em
qualquer período do ciclo de lactação conduz a infecção generalizada. As células
infectadas são detectadas mais rapidamente no leite de cabras infectadas, antes mesmo do
aparecimento de anticorpos específicos (LERONDELLE, et al. 1995).
C) Transmissão Vertical
A transmissão vertical da CAE, não é completamente compreendida. A infecção da
fêmea positiva para o embrião ou feto necessita ser investigada. Estudos demonstraram
que cabritos, filhos de mães soropositivas nascidos através de cesárea tornaram-se
soropositivos apesar de separados, e de não ingerir o colostro. A cirurgia eliminou a
possibilidade de transmissão durante a passagem do cabrito no canal do parto e o contato
com secreções maternas, sugerindo assim que a transmissão do vírus pode ter sido
transplacentária (ADAMS et al., 1983).
Em um estudo realizado por Fieni et al. (2003), foi demonstrado que a presença de
células infectadas pelo CAEV no útero e oviduto sugerem uma potencial forma de
transmissão vertical para o embrião ou feto. Porém sabe-se que, a placenta cotiledonária
das fêmeas caprinas não permite o contato do feto com o sangue materno, mas pode
existir uma transferência de células durante um processo inflamatório local, o qual pode
acontecer durante a infecção viral. Blacklaws et al. (2004) afirmam que a infecção
17
transplacentária pode ocorrer em torno de 5-10% e que tem uma contribuição relativa na
transmissão da enfermidade.
D) Transmissão Sexual
A detecção do CAEV no sêmen de células livres como em células infectadas,
sugerem a possibilidade de transmissão sexual. Essa observação sugere a preocupação
com a reprodução natural e assistida com sêmen de machos soropositivos (TRAVASSOS
et al., 1999; PINHEIRO et al., 2001). O sêmen de animais infectados pode abrigar o vírus,
porém não há transmissão demonstrada por essa rota. Não existe nenhum estudo sobre a
transmissão do vírus das fêmeas para os machos (BLACKLAWS et al. 2004).
Andrioli et al., (2006) observaram que a transmissão de LVPR pelo sêmen de
reprodutores é potencializada pela presença de inflamações testiculares e pelo fato do
sêmen criopreservado conter o lentivírus caprino (LVC) na forma infectante. A
comprovação da presença do lentivírus no sêmen reforça a possibilidade de transmissão
de LVC pela via sexual.
2.1.8 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS
2.1.8.1 Resposta imune de células B e Imunopatologia
A resposta de anticorpos contra o CAEV em animais infectados é direcionada para
várias proteínas virais e em particular para as glicoproteínas do envelope (KNOWLES et
18
al., 1990). Esse reconhecimento do sistema imune pelos epítopos na superfície dos
patógenos fornece ao hospedeiro a chave para o início da eliminação microbiana
(FINLAY & McFADDEN, 2006). A resposta de anticorpos contra as glicoproteínas do
envelope esta associada com artrite severa, já que os anticorpos geram mecanismos
imunopatológicos que contribuem à doença induzida pelo vírus (KNOWLES et al., 1990).
A velocidade de soroconversão em animais naturalmente infectados pode abranger
uma ampla gama de algumas semanas a vários meses, portanto às vezes se torna difícil o
sorodiagnóstico dessas infecções (RIMSTAD et al, 1993).
Huso et al. (1988) mostraram que a superfície externa das partículas infecciosas do
CAEV recoberta com ácido siálico confere um notável grau de resistência para
neutralização por anticorpos facilitando o escape viral à resposta imune humoral.
O papel dos anticorpos no controle de infecções por LVPR é controverso (Mc
GUIRE et al., 1988). Variantes de escape do CAEV resistentes à neutralização têm sido
detectadas em cabras infectadas, sugerindo que os anticorpos impõem uma forte pressão
seletiva no vírus (ELLIS et al., 1987; CHEVEERS et al., 1993). A recorrente estimulação
antigênica causada pelo aparecimento de variantes resistentes a neutralização mostrou
estar associado à severidade dos sintomas clínicos nas articulações (CHEVEERS et al.,
1991; BERTONI, 2007).
Em uma investigação feita por Ellis (1990) com cabras clinicamente afetadas com
CAE não foi encontrada associação aparente entre os níveis de anticorpos e a proporção
19
de leucócitos do sangue periférico (PLB) infectados, indicando que a resposta imune não
é importante na regulação da infecção persistente.
2.1.8.2 Resposta imune de células T e Imunopatologia
A resposta imune celular contra o CAEV conduz à infiltração mononuclear de
vários tecidos do organismo, em particular para articulação do joelho (LECHNER et
al.,1997). Na infecção pelo CAEV o número de monócitos é reduzido (JOLLY, et al.,
1997) e a qualidade da resposta de células T helper pode ser afetada (PERRY, et al.,
1995). A resposta celular T CD4 tipo 2 (Th2) para antígeno env é caracterizada por uma
resposta interleucina 4 (IL4) dominante e uma reduzida expressão de interferon gama
(IFNγ) segundo o descrito em cabras infectadas que tiverem o desenvolvimento do
processo de artrite clínica. Inversamente, animais infectados e assintomáticos, mostraram
uma forte resposta IFNγ sobre estimulação antigênica env, demonstrando o efeito
benéfico da resposta de linfócitos T helper 1 (Th1) no controle da carga viral
(CHEEVERS et al., 1997).
Células T CD8 + têm sido detectadas em cabras e ovelhas infectadas e são
consideradas importantes para o sucesso no controle da carga viral de animais
persistentemente infectados (LICHTENSTEINGER et al., 1993; BIRD et al., 1993;
BLACKLAWS et al., 1994; BLACKLAWS et al., 1995).
Da mesma forma, foi
observado que em indivíduos infectados com HIV1 referidos como controladores de HIV
(HIC), o controle da replicação viral tem sido associado com uma resposta de célula T
CD8 específica, caracterizada por um fenótipo HLA – DR alto e CD – 38 baixo. Os
20
indivíduos HIC têm alta freqüência de células T CD8 específicas para HIV secretando
IFNγ ( SÁEZ-CIRON et al, 2007).
LECHNER et al. (1997) concluíram que na infecção pelo CAEV, macrófagos
infectados respondem diferentemente de células não infectadas para estímulos exógenos,
sugerindo que esse vírus pode modular as funções acessórias desses macrófagos, como
mudar o padrão de expressão de citocinas ou a resposta imune antiviral in vivo.
2.1.9 DIAGNÓSTICO
2.1.9.1 Clínico
Devido ao quadro clínico variável e o constante desenvolvimento sub-clínico da
doença, não se recomenda o diagnóstico clínico como suficiente para sustentar um
diagnóstico definitivo da CAE. Além disso, o manejo extensivo ou semi-extensivo
possivelmente contribui para redução na incidência de alterações detectáveis ao exame
clínico geral (COSTA, et al., 2007).
A manifestação clínica mais freqüente é a artrite, atingindo principalmente a
articulação carpo-metacarpiana (joelho) e por isso foi proposto o desenvolvimento de um
índice clínico. O cálculo deste índice consiste na diferenciação entre a medida da
circunferência do “joelho mais grosso” e da “canela mais fina” (metacarpo). Quando o
resultado dessa medida é igual ou superior a 7 cm, considera-se como artrite positiva
(FRANKE, 1998). Entretanto a artrite pode ser causada por outros agentes infecciosos
21
como por exemplo, o Mycoplasma e fatores nutricionais e/ou traumáticos (GARCIA,
1993; FRANKE, 1998).
2.1.9.2 Laboratorial
A) Detecção Sorológica
O diagnóstico sorológico visa detectar a presença de anticorpos em animais
infectados,
entretanto, a avaliação sorológica deve ser feita com cautela já que um resultado negativo
pode ser um falso negativo, pela possibilidade de soroconversão tardia ou baixas
concentrações de anticorpos no sangue (FRANKE, 1998).
No diagnóstico sorológico da infecção para LV, deve-se considerar a existência
da “janela imunológica” (período entre a infecção e soroconversão) e a possibilidade de
sororeação intermitente (HANSON et al., 1996).
1) Imunodifusão em gel de agarose (IDGA)
O teste sorológico mais empregado e oficialmente reconhecido em vários países
para o CAEV, inclusive no Brasil é a IDGA ((FRANKE, 1998). Este teste baseia-se na
difusão do antígeno e anticorpo no gel de agarose, onde a reação antígeno-anticorpo é
visível a olho nu pela formação de uma linha de precipitação no gel.
22
Para Abreu et al. (1998), na prova de diagnóstico para o CAEV, o antígeno
recomendável é a glicoproteína (gp 135) e nucleoproteína viral (p28). Pode também ser
utilizado o antígeno do vírus Maedi-Visna (MVV) (um Lentivírus de morfologia e
bioquímica similar ao CAEV). Na prática são utilizados os antígenos virais de MVV e de
CAEV (KNOWELES et al., 1994), já que na reação antigênica cruzada entre os isolados
do CAEV e MVV existe envolvimento das principais proteínas e glicoproteínas
associadas ao vírion. Sendo assim, os antígenos de MVV que alcançam altos títulos in
vitro podem então ser utilizados para detectar anticorpos específicos para LVPR tanto em
ovinos como em caprinos (REISCHAK et al., 2002).
2) Técnica Imunoenzimática - Enzime-linked immunsorbent assay (ELISA)
Na atualidade existem vários tipos de ensaios imunoenzimáticos desenvolvidos
para pesquisa de anticorpos contra o CAEV utilizando diferentes antígenos, entre eles
está: 1) núcleoproteína do capsídeo p28 e proteína de transmembrana viral p40 do CAEV
(CLAVIJO & THORSEN, 1995); 2) combinação da maior proteína do capsídeo p25 de
MVV e um peptídeo derivado de região imunodominante da proteína de transmembrana
viral a gp46 (SAMAN et al., 1999); 3) antígeno protéico total do CAEV (SIMARD et al.,
2001); 4) proteínas recombinantes internas e de transmembrana como p17 e p18 (BABA
et al., 2000), 5) como também glicoproteínas de superfície (SU) (HERRMANN et al.,
2003 a; HERRMANN et al., 2003 b).
Foi relatado por Wojciech & Michal (2001), que a aplicação de testes sorológicos
como ELISA e métodos de biologia molecular dão um resultado seguro ao diagnóstico da
23
CAE. A combinação de ELISA e PCR parece ser uma boa opção diagnóstica, pois o PCR
parece ser capaz de identificar animais infectados antes da fase de soroconversão, mas na
infecção pós-fase de soroconversão é geralmente menos sensível que as técnicas de
ELISA, devido à baixa carga viral nesta fase ou também pela falha da PCR de detectar
todas as variedades de LVPR (ANDRÉS et al.; 2005; LACERENZA et al., 2006). Após
infecção experimental, o teste ELISA pode detectar soroconversão em um estágio precoce
comparado ao teste IDGA (SAMAN et al., 1999).
A técnica de ELISA se baseia no uso de antígeno, anticorpos e de antiimunoglobulinas marcadas com uma enzima, apresentando tanto atividade imunológica
quanto enzimática. Existem vários tipos de ELISA que podem ser aplicados com técnica
diagnostica que são: ELISA direto, ELISA indireto, ELISA sanduíche e o ELISA
competitivo. Esta é uma técnica de grande sensibilidade, especificidade e uso de rotina,
permitindo o processamento e automação de um grande número de amostras em menor
tempo.
Destaca-se
ainda
como
ferramenta
indispensável
em
levantamentos
epidemiológicos e no diagnóstico sorológico de várias infecções virais (HECKERT et al.,
1992) Apresenta como desvantagem a possibilidade de resultados falsos positivos,
podendo ainda estes serem minimizados pela utilização de reagentes imunológicos mais
sensíveis, como os anticorpos monoclonais. (SOUZA, et al., 1999).
3) Outras provas sorológicas - Western-Blot (WB) e Imunofluorescência Indireta (IFI)
Para verificar a presença de anticorpos contra as principais proteínas virais, tem-se
recomendado à técnica de WB (HARKISS, WATT, 1990). Essa técnica é uma ferramenta
24
de êxito que para sua execução é necessário a prévia separação das proteínas virais por
eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecil de sódio (SDS), e em seguida
transferência para uma membrana sob ação de corrente eletroforética (MADRUGA et al.,
2001; KURIEN & SCOFIELD, 2003).
Simard et al. (2001), usando a técnica WB e soro policlonal de cabras infectadas
com o CAEV, detectou pelo menos três grandes proteínas virais imunogênicas com
antígeno precipitado com polietilenoglicol (PEG), representando provavelmente a
proteína do envelope trans-membrana (40 kDa), a proteína do capsídeo (28 kDa) e outra
proteína viral menor (p15).
Outro teste sorológico desenvolvido foi o da IFI, que em condições experimentais
tem apresentado potencial como teste alternativo e complementar ao diagnóstico da CAE,
além de recomendado pela OIE no diagnóstico da infecção (REISCHAH et al., 2002). Os
ensaios de IFI consistem em tornar visível a reação antígeno/anticorpo por meio de uma
anti-imunoglobulina marcada com fluorocromos (MADRUGA, et al., 2001).
Em resultados obtidos com outro LV, o HIV, foi evidenciado que a técnica de IFI para
o diagnóstico sorológico da infecção oferece sensibilidade e especificidade equivalentes
ao teste WB, sendo superior a este no que diz respeito a facilidade realização, rapidez e
custo. Porém, apesar de sua vasta utilização na pesquisa de anticorpos para diversos
agentes virais, são escassos os registros de emprego da IFI em estudos com LV animais
(REISCHAH et al., 2002).
25
B) Detecção do vírus ou componentes virais
1) Isolamento viral em cultivos de células
O isolamento viral a partir de células do sangue e tecidos do organismo se torna
uma alternativa para o diagnóstico dos Lentivírus. Para o isolamento do CAEV, obtêm-se
células mononucleares do sangue periférico. Os monócitos infectados são então cocultivados em células susceptíveis, como as da membrana sinovial caprina (MSC), a fim
de obter a infecção “in-vitro”. O vírus infecta as células da MSC, que tipicamente
formam abundantes estruturas sinciciais (15 dias após a infecção). Este efeito citopático,
entretanto, não é especifico para os LV, e pode ocorrer em vários outros vírus (TIGRE et
al., 2002).
O isolamento do vírus em cultivos celulares é uma técnica diagnóstica sensível e
demonstra a presença do vírus. Entretanto, é um diagnóstico demorado e, bastante
dispendioso, por isso não é indicado para diagnóstico de rotina (OIE, 2008). Apesar de
dispor de uma linhagem de células permissíveis à infecção, como as TIGEF (TEIXEIRA
et al., 1997), estas são menos susceptíveis a infecção viral que o cultivo primário de MSC.
2) Detecção do ácido nucléico viral
A detecção do ácido nucléico do CAEV baseia-se na detecção do vírus como
provírus (DNA proviral) integrado ao genoma celular ou como vírus livre (RNA). A
metodologia utilizada é a técnica de biologia molecular baseada na reação em cadeia de
26
polimerase (PCR) que é uma importante ferramenta para o diagnóstico de outras
infecções virais (HARKISS & WATT, 1990; TIGRE et al., 2002).
A PCR é um método diagnóstico que combina sensibilidade e especificidade,
capaz de identificar animais em estágios recentes da infecção ou que ainda não
soroconverteram (TIGRE et al., 2002; REILLY et al., 2004). A especificidade da PCR é
importante desde que caprinos podem ser infectados com outros LV antigenicamente
realcionados como o MVV.
Esta técnica é capaz de detectar animais infectados que ainda não soroconverteram.
Tigre et al. (2002), utilizando a técnica de PCR com células mononucleares do sangue
periférico (CMSP) e células do leite detectaram em animais soronegativos a presença de
DNA viral, sugerindo que o tempo entre o início da infecção e o aparecimento de
sintomas é variável Este estudo também foi o primeiro isolamento do CAEV na Bahia.
A técnica pode ser aplicada com sucesso ao diagnóstico da infecção pelo CAEV
principalmente, devido as características da infecção viral, resolvendo o problema da
permanência de animais falso-negativos no rebanho em decorrência de baixos títulos de
anticorpos , reações intermitentes de soropositividade e soroconversão tardia (PHELPS &
SMITH, 1993; CLAVIJO & THORSEN, 1995; EAST et al., 1993; HANSON et al.,
1996). Em comparação ao isolamento viral, Andrioli et al. (2006) mostraram que a PCR
foi superior na identificação de animais positivos.
27
A PCR é um método rápido, sensível e específico que detecta seqüências específicas do
ácido nucléico viral, apesar de que o êxito na amplificação, provavelmente depende da
quantidade de células infectadas. Esta técnica tem como desvantagem, não ser plausível
de usar como rotina diagnóstica, para um grande número de amostras devido ao alto custo
de equipamentos e reagentes (HARKISS & WATT, 1990; CLAVIJO & THORSEN,
1995).
2.1.10 SITUAÇÃO NO BRASIL
Os LVPR encontram-se difundidos mundialmente, sendo mais prevalentes em
países europeus (França, Suíça, Alemanha, Holanda, Inglaterra) e da América do Norte
(Estados Unidos e Canadá) com sistemas intensivos de produção caprina e ovina (ROWE
& EAST, 1997; CONCHA – BERMEJILLO, 1997). Até o desenvolvimento da
caprinocultura leiteira nacional, quadros clínicos sugestivos de CAE não haviam sido
descritos no Brasil. A importação de caprinos por diversos estados seguido da
movimentação interna entre os mesmos pode ter servido como vias de contaminação dos
plantéis.
No Brasil, a infecção por LV em caprinos tem sido relatada em diversos rebanhos,
sendo primeiramente detectada no Rio Grande do Sul em 1986 (MOOJEN et al., 1986).
Entretanto, em um inquérito sorológico realizado no Rio de Janeiro, o CAEV já estava
presente no país desde 1982 (CUNHA & NASCIMENTO, 1995).
28
Em 1989 foi descrito o primeiro isolamento do vírus no Brasil, que ocorreu no Rio
Grande do Sul, a partir de MSC de um animal clinicamente e sorologicamente positivo à
infecção por LVPR (HOTZEL et al., 1993). TIGRE et al. (2002) descreveram o primeiro
isolamento viral do estado da Bahia, realizado através do cultivo de macrófagos e cultivos
primários de células de membrana sinovial.
A presença de animais sorologicamente positivos para o CAEV foi também
relatada em diversos estados brasileiros, como na Bahia (FITTERMAN, 1988; ASSIS &
GOUVEIA, 1994; ALMEIDA et al. 2001; EDELWEIS et al., 2001), São Paulo (GARCIA
et al., 1992), Pernambuco (SARAIVA NETO et al.,1995), Minas Gerais (ASSIS &
GOUVEIA, 1994), Ceará (ASSIS & GOUVEIA, 1994; PINHEIRO et al., 2001) e outros
estados.
A ausência de dados sobre a ocorrência do CAEV tem limitado a implantação de
medidas profiláticas importantes para desenvolver um plano de controle desta doença já
instalada nos rebanhos caprinos brasileiros (PINHEIRO et al., 2001). Por enquanto o
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, através do Programa Nacional de
Sanidade de Caprinos e Ovinos (PNSCO), está atuando no controle e erradicação do
CAEV, estabelecendo no artigo 24, o uso da Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA)
como teste de rotina para o diagnóstico da Artrite Encefalite Caprina.
30
3. ARTIGO CIENTÍFICO I
Comparação de um ensaio imunoenzimático para diagnóstico da artrite-encefalite
caprina (CAE) com outras técnicas sorológicas e PCR.
Comparison of an enzyme immunoassay for the diagnosis of arthritis encephalitis goats
(CAE) with other serological techniques and PCR.
1
TORRES, Julianna Alves; 2SARDI, Sílvia Inês; 3 CAMPOS, Gúbio Soares; 4 BRANDÃO,
Camila Fonseca Lopes; 5 FREITAS, Michael Menezes.
1
2
Aluna de pós-graduação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos – UFBA);
Prof(a). Dr(a). Escola de Medicina Veterinária – UFBA; 3 Professor Dr.- Instituto de
Ciências da Saúde - UFBA; 4 Aluna de pós-graduação (Mestrado em Imunologia UFBA); 5 Aluno de pós-graduação (Mestrado em Imunologia - UFBA).
E-mail: [email protected]
RESUMO
O vírus da Artrite-encefalite caprina (CAEV) é um Retrovírus classificado como
Lentivírus, que causa uma doença severa e progressiva caracterizada por manifestações
clínicas como encefalomielite, mastite, pneumonia e artrite. A resposta imune humoral é
lenta e a soroconversão pode ocorrer vários meses após a infecção. O diagnóstico é
baseado na detecção de anticorpos contra o vírus através da Imunodifusão em Gel de
Agarose (IDGA), técnica sorológica de referência para CAEV. O objetivo deste
trabalho foi padronizar um teste imunoenzimático (ELISA) para detecção de anticorpos
para o CAEV. O ELISA foi comparado a outras técnicas sorológicas como IDGA,
Imunofluorescência Indireta (IFI) e Western – Bloting (WB). Amostras de soros
(n=343) de caprinos saudáveis entre 1 e 4 anos foram submetidas às técnicas de ELISA,
IDGA, IFI e WB, e para detecção do provirus DNA de CAEV, amostras de leite (n=40)
desses animais foram submetidas à reação em cadeia de polimerase (PCR). O ELISA
mostrou alta sensibilidade, detectando 21% (72/343) de animais positivos, enquanto a
técnica IDGA detectou somente 8,75% (30/343) de animais positivos para infecção pelo
CAEV. IFI e WB mostraram boa correlação com a técnica ELISA, e o PCR detectou o
provirus em amostras de leite de caprinos soropositivos pelo teste ELISA. Os resultados
deste trabalho sugerem que o teste ELISA padronizado poderia ser uma ferramenta útil
na detecção precoce da infecção pelo CAEV com maior sensibilidade que o teste IDGA.
Palavras-Chave: Diagnóstico, caprinos, CAEV, ELISA, PCR
31
SUMMARY
Caprine Arthritis-Encephalitis virus (CAEV) is a Retrovírus classified as a lentivirus,
cause severe and chronicle illness characterized by clinical manifestations of
encephalomyelitis, mastitis, pneumonia and arthritis. The humoral response in animals
is slow and the seroconvertion can be several months after the infection. The diagnosis
is based on the detection of antibodies against the virus by Immunodifusion in agarose
gel (IDAG) a serological reference technique for CAEV. The objective of this work was
performed an enzymatic linked immunosorbent assay (ELISA) test to detect antibodies
against CAEV. The ELISA test was compared to others serological techniques IDAG,
Indirect Immunofluorescence (IFI) and Western-blot (WB). Serum samples (n=343)
from healthy goats between 1 and 4 years old were submitted to ELISA, IDAG, IFI and
WB techniques and Polymerase Chain Reaction (PCR) these animals were submitted in
order to detect DNA CAEV provirus, milk samples (n=40). The ELISA show a high
sensivity detecting 21% (72/343) of positives animals meanwhile IDGA technique
detected only 8.75% (30/343) positives animals to CAEV infection. IFI and WB
showed good correlation with ELISA technique and PCR detected the provirus in the
milk samples from seropositives goats by ELISA test. The results of this work suggest
that the ELISA test performed here could be a helpful tool to detect animals in the early
period of CAEV infection with higher sensivity than IDAG test.
Keywords: CAEV; Diagnosis; ELISA; Goats, PCR
32
3.1. INTRODUÇÃO
A Artrite-encefalite Caprina (CAE) é uma doença progressiva e debilitante,
causada por um vírus da família Retroviridae, gênero Lentivírus, com distribuição
mundial que acomete primariamente caprinos.
Este vírus causa artrite progressiva
crônica, mastite, pneumonia intersticial em caprinos adultos e encefalomielite em
caprinos jovens (CALLADO et al., 2001; GOFF, 2006). A transmissão do vírus ocorre
principalmente através da ingestão de colostro e leite (TRAVASSOS et al., 1999) e o
aparecimento dos sinais clínicos nos animais infectados leva meses até alguns anos,
persistindo o vírus no organismo pela vida inteira. Além disso, certo número de animais
pode apresentar soroconversão tardia ou ainda, reações intermitentes de soropostividade
e soronegatividade (EAST, et al., 1993; HANSON, et al., 1996). A detecção precoce
destes animais infectados e sua segregação e/ou erradicação do rebanho é a prática mais
eficiente para limitar a disseminação do vírus.
A prova utilizada como referência no diagnóstico da infecção é a Imunodifusão
em Gel de Agarose (IDGA). Este é um teste sorológico que detecta anticorpos para
CAEV, mas é pouco sensível para animais com baixo título de anticorpos, o que facilita
a permanência de falso-negativos nos rebanhos. Por isto, testes sorológicos mais
sensíveis devem ser utilizados, entre eles o enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA). Outras técnicas sorológicas que apresentam potencial como testes alternativos
e complementares ao diagnóstico do CAEV são as técnicas de Western-blot (WB) e
Imunofluorescência indireta (IFI).
33
Tendo em vista a importância da caprinocultura na economia da região nordeste
e a ação desta enfermidade nos rebanhos caprinos, este trabalho teve como objetivo
padronizar uma técnica imunoenzimática - enzime linked immunosorbent assay
(ELISA) para detecção de anticorpos contra o CAEV e comparar este teste com outras
técnicas para detecção de anticorpos como IDGA (técnica de referência nacional para
CAEV), WB, IFI.
34
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS
1. CULTIVO CELULAR DE MEMBRANA SINOVIAL DE CABRA (MSC)
Os cultivos de membrana sinovial, utilizados para replicação viral, foram obtidos
a partir do explante das membranas sinoviais da articulação intercarpial de ambos os
membros anteriores de cabritos, recém nascidos, negativos para CAEV pelo teste de
PCR.
A técnica utilizada para obtenção dos cultivos primários seguiu o protocolo
anteriormente descrito por Abreu et al. (1998). Após a remoção dos tecidos
periarticulares, as cavidades articulares foram abertas, e as membranas sinoviais
delicadamente dissecadas, umedecidas com Meio Essencial Mínimo – Glasgow (MEMG) e seccionadas em fragmentos de aproximadamente 1,0 mm os quais foram
distribuídos em garrafas para o cultivo de células (25 cm³) e incubadas a 37 ºC. Após 30
minutos, foram adicionados 2,0 ml de MEM-G suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB) inativado (GIBCO BRL) 100 UI penicilina G sódica, 100 µg/ml sulfato
de estreptomicina e 0,25 µg/ml de anfotericina B (FUNGIZONE-GIBCO BRL). Após
15 a 20 dias de incubação, os explantes e as monocamadas foram tripsinizadas (Tripsina
1:250 GIBCO) e subcultivadas para a obtenção de monocamadas celulares.
35
2. VÍRUS
O CAEV utilizado foi a cepa DECENTE (isolamento de campo – TIGRE et al.,
2002). Para a replicação viral foram utilizados cultivos de MSC mantendo a
monocamanda infectada incubada a 37 ºC com MEM-G e 2% de SFB até o
aparecimento do efeito viral (7 – 15 dias). Os cultivos de MSC infectados foram
congelados/descongelados e centrifugados a 10000rpm durante 30 minutos, 4ºC. Após
esta centrifugação o sobrenadante viral assim obtido, foi adicionado polietilenoglicol
8000 (PEG 8000, Sigma) 8% (p/v) e cloreto de sódio a 2,3% (NaCl, Sigma), para
concentração e ultracentrifugação do vírus segundo citado por Fontes et al, (2005). O
pellet obtido foi ressuspenso em uma solução NET (1% do volume inicial) e congelado
a -70 ºC até seu uso.
3. OBTENÇÃO DE SORO HIPERIMUNE DE COELHO (SHC)
Para a produção de soro hiperimune para o CAEV, imunizou-se coelhos New
Zeland adultos. O vírus concentrado e ultracentrifugado foi inoculado em quatro doses
de 50µg a cada 20 dias, emulsificado com 500µl de adjuvante completo de Freund
(Sigma) na primeira imunização (inoculação intramuscular) e nas subseqüentes com
adjuvante incompleto de Freund (Sigma) (inoculação subcutânea).
Para diminuir reações inespecíficas foi realizada a imunoadsorção do soro hiperimune
com células de MSC ( pellet celular) a 4ºC por toda a noite, centrifugando a 3000 rpm por 10
minutos. Esse procedimento foi repetido 3 vezes, coletando-se apenas o sobrenadante.
36
3.1. Caracterização do Soro Hiperimune de Coelho
A) Eletrotransferência das Proteínas Virais: WESTERN - BLOT
A reatividade do soro hiperimune de coelho contra as proteínas virais do CAEV foi
determinada através de Western-blot. Inicialmente as amostras de MSC infectadas e sem
infectadas (17,5 µg de proteína/poço) foram diluídas em tampão denaturante Laemmli
(glicerol 20%; SDS 4%; 10% 2-mercaptoetanol; 0,125M Tris HCl; azul de bromofenol
0,004%; pH 6,8) e levadas a 100°C durante 3 minutos em banho-maria. A corrida
eletroforética das proteínas virais se realizou durante 2,5 horas a 100 volts em gel de
poliacrilamida (SDS - PAGE) 10%.
Em seguida as proteínas foram eletrotransferidas a uma membrana de nitrocelulose
segundo o método de Burnett (1981), utilizando uma cuba de transferência com buffer
Glicina 192 mM, Tris 25 mM e Metanol 20%, a 100 volts durante 1 hora.A verificação
da eletrotransferência se realizou com a técnica de coloração de vermelho de Ponceau
10%.
Tiras de membrana de nitrocelulose foram bloqueadas para evitar sítios livres de
reação com uma solução de leite em pó desnatado 5% em solução tamponada com
fosfato (PBS – 137mM NaCl; 10mM fosfato; 2,7mM KCl; pH 7,4) (PBS-L) durante
1:30 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, as tiras de MSC infectadas e não
infectadas (controle) foram enfrentadas, individualmente, com soro hiperimune de
coelho (diluído 1:50). Após incubação durante 1 hora a 37°C, as tiras foram lavadas 3
37
vezes com uma solução de PBS-Tween 20 (PBS-T 0,05%) e incubadas novamente,
durante 1 hora a 37°C, com um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com Peroxidase
(Sigma), diluído 1:500 em solução de PBS-L. Em seguida, foram feitas outras 3
lavagens com PBS-T 0,05%. A revelação foi feita com uma solução com o substrato 3’3’
Diaminobenzidine (DAB) (10mg/10ml PBS) na presença de peróxido de hidrogênio
(10µl). A reação foi interrompida com sucessivas lavagens com água destilada.
B) Imunofluorescência Indireta (IFI)
Culturas de células de MSC foram cultivadas em tubos com lamínulas de vidro e
após 24 horas infectadas com o CAEV. Posterior às 72 horas da infecção, as lamínulas
com células infectadas foram fixadas em acetona –20 º C e utilizadas para a técnica de
Imunofluorescência indireta. Esta técnica consistiu em incubar estas lamínulas com o
soro hiperimune de coelho (1:50) em câmara úmida durante 1 hora a 37 ºC.
Posteriormente foram lavadas 3 vezes com solução PBS, cada lavagem de 10 minutos, e
enfrentadas com imunoglobulina anti-IgG de coelho FITC (Sigma) 1:50 e incubadas a
37ºC por 1 hora. O procedimento de lavagem foi repetido e em seguida as lamínulas
foram lavadas com uma solução de Evans (0,1%) durante 3 minutos e montadas em
lâminas com glicerina diluída 50% em solução de PBS e observadas no microscópio de
fluorescência para visualizar a presença de células com uma coloração verde
fluorescente (reação positiva).
38
4. DESENHO EXPERIMENTAL
A) Animais
Na realização destes experimentos foram utilizados caprinos (n=343), machos e
fêmeas, como idade entre 1 e 4 anos, das raças Anglonubiana, Saanen, Pardo-alpino e
sem raça definida (SRD), sem antecedentes da doença e aparentemente saudáveis.
Destes animais coletaram-se amostras de soro e leite.
Estes animais provinham de quatorze (14) propriedades, situadas nos municípios
de Camaçari, Bomfim de Feira, Feira de Santana, Guanambi, Central, Ipirá, Baixa
Grande e Itaberaba, do estado da Bahia (Tabela 1).
Município
Quantidade de animais
Município
Quantidade de animais
Camaçari
14 animais
Guanambi
25 animais
Camaçari 2
8 animais
Central 1
4 animais
Bonfim de Feira
31 animais
Central 2
8 animais
Feira de Santana 1
21 animais
Ipirá 1
21 animais
Feira de Santana 2
20 animais
Ipirá 2
20 animais
Feira de Santana 3
30 animais
Baixa Grande
98 animais
Feira de Santana 4
31 animais
Itaberaba
12 animais
TOTAL
155 animais
TOTAL
188 animais
Tabela 1. Municípios do Estado da Bahia onde foram coletadas amostras de sangue e
leite de 14 propriedades de criação de caprinos
39
B) Colheita de Amostras
1) Soro
Foram coletadas amostras de sangue por punção da veia jugular para obtenção de
soro (n = 343). Posteriormente cada soro foi centrifugado a 2000 rpm durante 5 minutos, e
transferido para um tubo tipo eppendorff para ser congelado (-20 ºC) até o momento do seu
uso. Estes soros foram submetidos às técnicas de referência de IDGA, ELISA indireto,
IFI e WB para determinação de anticorpos para CAEV.
2). Leite
Foram coletadas amostras de leite de fêmeas (n=40) soropositivas e
soronegativas pela técnica IDGA. O volume coletado (30 ml) de cada amostra de leite
foi conservado em frascos estéreis a 4ºC até o processamento para posterior extração do
DNA viral. Esta colheita foi realizada por ordenha manual.
5. DETECÇÃO DE ANTICORPOS PARA O CAEV
40
5.1 ELISA indireto
A) Produção de Antígeno Viral
Após a infecção das células de MSC em garrafas tipo ROUX e o aparecimento do
efeito citopático, os cultivos foram congelados (-20 ºC) (rompimento celular e liberação do
vírus). Em seguida, esses cultivos foram descongelados e o material foi centrifugado a 10000
rpm durante 30 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado para novas
infecções e o pellet de células infectadas foi ressuspenso em solução PBS (proporção de 1:10
do volume inicial) para ser utilizado como antígeno viral. O mesmo procedimento foi
realizado para MSC sem infectar.
B) Antígeno Viral
1. Tratamento do Antígeno Viral com Dodecil sulfato de Sódio (SDS)
O antígeno viral foi tratado com dodecil sulfato de sodio (SDS) a uma concentração
final de 0,1% (v/v) de SDS. Após 10 minutos com tratamento de SDS e homogeneizações
frequentes, o material foi centrifugado por 15 minutos a 10000 g e o sobrenadante resultante
utilizado como antígeno viral para o teste ELISA .
41
2. Titulação do Antígeno Viral
Para determinar a diluição de uso do antígeno viral, uma placa de poliestireno de 96
poços (NUNC-MAXISORP TM) foi sensibilizada com diluições seriadas deste antigeno em
tampão carbonato-bicarbonato (Na2CO3 1,7g/l, NaHCO3 2,86g/l) 0,05M pH 9,6. A placa
sensibilizada foi incubada a 4ºC toda a noite. Passado esse período, os poços foram lavados 5
vezes com uma solução de PBS-T 0,05%, e incubados novamente, durante 1 hora e 30 min. a
37°C, com solução de PBS leite (PBS-L) para fazer o bloqueio de sítios livres reativos. Em
seguida, foram adicionados aos poços soro hiperimune de coelho na diluição de 1:2000 em
solução de PBS-L e a placa foi novamente incubada pó 1 hora e 30 min. a 37ºC. Passado esse
período, os poços foram lavados como citado anteriormente e incubados novamente, durante
1 hora a 37°C, com anticorpo anti-IgG de coelho (1:5000) marcado com peroxidase (Sigma).
A revelação da reação foi feita com o substrato de TMB (3,3’ ,5,5’-tetramethylbenidine) e
após 10 min foi utilizado o ácido fluorídrico 0,125% para parar a reação e realizada a
leitura da densidade óptica a 630nm. A diluição de uso foi estabelecida em 1/50,
correspondendo a uma concentração protéica de aproximadamente 3 µg/poço.
3. Determinação de Concentração Protéica – Método de Lowry
A dosagem de proteína do antígeno viral para o ELISA indireto foi estimada
utilizando um kit comercial baseado no método de Lowry (BIORAD) seguindo as
indicações do fabricante. De acordo com esse método, foi obtida uma concentração
protéica de 1,6mg/ml.
42
B) Padrão Eletroforético das Proteínas Virais
As amostras de vírus foram submetidas à eletroforese pela técnica de SDS-PAGE
(LAEMMLI, 1970) em gel poliacrilamida de gradiente 5-15% para visualização das
proteínas do CAEV.
O peso molecular das proteínas virais foi calculado usando-se o RF (Distância em
centímetros de migração da proteína a partir do gel de corrida / distância da migração do
corante Coomassie blue a partir do gel de corrida) (GARFIN, 1990).
D) Detecção Sorológica de anticorpos pelo Teste Imunoenzimático (ELISA
indireto)
O teste ELISA indireto utilizado foi modificado de um procedimento previamente
descrito por Schalie et al. (1994). A placa de poliestireno de 96 poços (NUNC-MAXISORP
TM) foi sensibilizada com o antigeno viral tratado com 0,1% SDS na concentração protéica
de 3,0µg/100µl (poço) em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6, e com células de MSC sem
infectar, também na concentração protéica de 3,0µg/100µl (poço) . A placa foi incubada toda
a noite a 4º C. Passado esse período, os poços foram lavados 5 vezes com uma solução de
PBS-T 0,05%. Posteriormente foi adicionada uma solução de PBS-L para o bloqueio de sítios
livres reativos e incubados novamente, durante 1 hora e 30 min. a 37°C. Em seguida, foram
adicionados aos poços os soros testes dos animais na diluição de 1:100 em solução de PBS-L
43
+ 0,3% Tween 20, e a placa foi incubada toda a noite 4ºC. Passado esse período, os poços
foram lavados como citado anteriormente e incubados novamente, durante 1 hora a 37°C,
com anticorpo anti-IgG de cabra marcado com peroxidase (Sigma), na diluição de 1:15.000
em PBS-L+ 0,3% Tween 20. Os poços foram de lavados como mencionado anteriormente. A
revelação da reação foi feita com o substrato de TMB (3,3’ ,5,5’-tetramethylbenidine) em
presença de H2 O2 (10ml/3μl) e após 30 min foi utilizado o ácido fluorídrico 0,125% para
parar a reação e realizada a leitura da densidade óptica (D.O.) a 630nm. O resultado foi
dado pela diferença em densidade óptica:
D.O.final = D.O.soro com células de MSC infectadas com CAEV – D.O. soro
com células de MSC sem infectar.
O método de curva roc utilizando programa Med Calc calculou o cut-off ou valor de
corte da técnica ELISA o qual foi determinado como 0,209. Valores iguais ou acima
deste foram considerados como soros positivos. (Apêndice 2 – resultados obtidos pela
técnica ELISA indireto).
E) Detecção precoce de anticorpos pelo método de ELISA indireto.
Em um rebanho caprino situado no município de Feira de Santana – BA, 13
animais foram acompanhados sorologicamente pelos testes IDGA e ELISA por um
período de dois anos, sendo realizada até 3 colheitas de soro em intervalos de 10 e 11
meses.
44
5.2. Detecção Sorológica de anticorpos por Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA)
O teste sorológico de IDGA foi realizado com um kit de uso comercial (Biovetech®)
seguindo-se as orientações do fabricante. Este teste utiliza um antígeno específico do CAEV,
a proteína do capsídeo ( p28).
A primeira leitura foi feita às 24 horas, e após 48 horas realizou-se a leitura
confirmatória. A interpretação dos resultados é feita verificando a presença e a identidade das
linhas de precipitação (continuidade ou não de linhas entre soro reagente e soro teste).
5.3 Detecção de Anticorpos para o CAEV pela Técnica de Imunofluorescência Indireta
(IFI)
Utilizando a técnica de IFI já descrita para o SHC, os soros caprinos foram
incubados na diluição de 1:5 nas lamínulas de células infectadas e enfrentados com um
imunoglobulina anti-IgG de cabra marcado com Isotiocianato de Fluoresceína (FITC Sigma), na diluição de 1:300.
5.4. Detecção de Anticorpos para o Vírus da CAE pela Técnica de Western Blot (WB)
Utilizando a técnica de Western – blot já descrita para SHC, foram avaliadas a
reatividade dos soros de caprinos infectados contra as proteínas virais do CAEV. As
proteínas virais foram fracionadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Os
45
soros caprinos foram diluídos em 1:5 em solução PBS-L e foram posteriormente
enfrentados com imunoglobulina anti-espécie (caprina) conjugada com peroxidase na
diluição de 1:500 em solução PBS-L.
6. DETECÇÃO DO CAEV
Double nested PCR (dn - PCR) em amostras de leite
A) Processamento das amostras de leite
As amostras de leite (n=40) foram processadas para obtenção da fração celular. Esta
fração foi obtida através da centrifugação do leite a 4000 rpm por 15 minutos a 10ºC.
Posteriormente, com uma espátula estéril, retirou-se a camada de gordura e desprezou-se o
sobrenadante. Cuidadosamente, o precipitado foi lavado com solução de PBS estéril,
repetindo o processo por 4 vezes, a fim de se retirar o excesso de gordura. Após a lavagem o
precipitado foi ressuspenso em 0,8ml de solução PBS, transferido para tubos estéreis e
congelado -20ºC até o momento da extração do DNA.
B) Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada como o “kit” (QIAamp – QIAGEN) seguindo o
protocolo do fabricante.
46
C) Amplificação do DNA viral – dn - PCR
Após a extração de DNA de células do leite, a reação de PCR segue segundo
Travassos et al, 1999 e Tigre et al., 2003. Utilizando dois pares de primers para env e
pol. Os fragmentos de DNA de 175 pb e 350 pb, correspondendo respectivamente às
regiões pol e env, foram co-amplificadas pela técnica de double nested - PCR. Os
primers externos (P1) utilizados foram: 5374 e 5376 para a região pol, e 99001 e 5086
para a região env. Os primers internos (P2) utilizados foram: 5375 e 5377 para a região
pol e 99006 e 99008 para a região env. As reações de amplificação para ambos os
primers foram realizadas em um único tubo (dn - PCR) em um termociclador Gene
Amp OCR System 2400 (Perkin Elmer). Durante o primeiro ciclo de amplificação 20 µl
do DNA genômico foi adicionada à mistura para a reação de 50 µl, contendo 10mM de
Tris HCl, pH8.3, 50mM KCl, 2mM MgCl2, dNTP (200mM cada dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), P1 (100ng cada) e 1U Taq DNA polimerase (GIBCO BRL). O primeiro ciclo
da amplificação consistiu de 5 minutos a 95ºC, 35 ciclos a 92ºC por 40 segundos para
desnaturação, 56ºC por 50 segundos para anelação e 72ºC por 1 minuto para extensão.
No final foi feita uma etapa de extensão a 72ºC por 4 minutos. Uma alíquota de 10 ul do
produto deste primeiro ciclo foi novamente amplificada em um 2º ciclo mantendo-se as
mesmas concentrações dos reagentes e alterando os primers (P2). No segundo ciclo
mantiveram-se as condições de desnaturação e foram alteradas as etapas de anelamento
para 60ºC por 40 segundos e extensão para 72 ºC por 50 segundos. Um controle
positivo (vírus cepa CAE - Decente) foi adicionado a cada grupo de amostras testadas.
Os produtos amplificados (5 µl) foram separados por eletroforese em gel de Agarose a
1% juntamente com marcadores de peso molecular (100kb DNA ladder-GIBCO). Os
47
géis foram tratados com Brometo de Etídio (1mg/ml) durante 15 minutos, e visualizados
por transluminação com luz ultravioleta.
7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
O teste Qui-quadrado (SPSS13.0 versão Windows) foi utilizado para avaliar a
correlação e o índice kappa foi usado para analisar a concordância entre as técnicas ELISA,
IDGA, IFI, WB e PCR (THRUSFIELD, 1995).
48
3.3. RESULTADOS
3.3.1 Padrão eletroforético das proteínas virais
Na Figura 4 observa-se o padrão eletroforético das proteínas virais de CAEV.
O vírus concentrado e ultracentrifugado (Linha 2) mostra um padrão eletroforético de
proteínas com pesos moleculares (PM) aproximados entre 97 e 30. Destas deve-se
destacar o grupo de proteínas com PM de 28, 34, 46 e 55. Ao comparar este padrão
com o perfil protéico do MSC infectadas com CAEV, mostra-se que este último tem um
perfil similar, mas com uma massa protéica maior (Linha 4). Observa-se a presença de
algumas proteínas, possivelmente proteínas de origem viral, que não estão no perfil de
proteínas de MSC sem infectar (linha 5).
Por outro lado, ao analisar o padrão
eletroforético do vírus utilizado como antígeno viral no ELISA observamos que o
tratamento realizado com SDS 0,1% não altera praticamente o perfil protéico do vírus
(Linhas 3 e 4). As proteínas virais de antígeno viral tratado e sem tratar permanecem
sem alteração evidente, entretanto foi escolhido utilizar este tratamento com SDS 0,1%
porque obteve-se uma melhora significativa no sinal antígeno viral/antígeno celular.
49
97
\66
55 Kd
46 Kd
45
35 Kd
30
28 Kd
20
1
2
3
4
5
Figura 4. Perfil eletroforético das proteínas virais do CAEV. Eletroforese em gel de
poliacrilamida de gradiente (5 - 15%) na presença de SDS (SDS - PAGE)
das proteínas do CAEV e coloração de Comassie Blue. 1) Marcador de peso
molecular (Amershan); 2) CAEV Ultracentrifugado; 3) Células MSC
infectadas tratadas com SDS; 4) Células MSC infectadas sem tratamento
com SDS; 5) Célula MSC sem infectar. Os pesos moleculares das proteínas
virais foram calculados usando-se o RF (distância de centímetros de
migração da proteína a partir do gel de corrida / distância da migração do
corante Comassie blue a paritr do gel de corrida).
50
3.3.2 Detecção de anticorpos para CAEV
A) Técnica de IDGA
Com os resultados obtidos através da reação de IDGA para detecção de
anticorpos contra o CAEV, observou-se que das 343 amostras analisadas por esta
técnica, 30 (8,75%) foram positivas e 313 (91,25%) foram negativas. Estes animais
apresentavam-se clinicamente sadios e sem sintomatologia característica da doença.
B) Técnica imunenzimática: ELISA indireto
Pelos resultados obtidos através da técnica ELISA indireto para detecção de
anticorpos anti – CAEV, pode-se observar que das 343 amostras analisadas por esta
técnica, 72 (21 %) foram positivas e 271 (79%) foram negativas.
C) Comparação dos resultados obtidos através da técnica imunoenzimática –
ELISA e IDGA
A técnica ELISA indireto mostrou uma maior sensibilidade a respeito da técnica
de referencia atual: IDGA (Tabela 2). O número de soros positivos para o CAEV
detectados pela técnica ELISA foi maior (72/313) que o detectado pela técnica de
referência IDGA (30/313). Teve uma divergência nestes resultados onde 8 amostras
foram positivas pela técnica IDGA e negativas pelo teste ELISA.
51
Ao ser comparado o teste ELISA indireto com o padrão ouro para CAEV, a
técnica de IDGA, o teste ELISA apresentou uma diferença significativa com a IDGA
(x2; p < 0,05), mostrando 73,3% de sensibilidade e 84% de especificidade com índice
fraco de concordância entre as técnicas (índice Kappa = 0,35).
IDGA
+
-
TOTAL
ELISA +
22
50
72
ELISA -
8
263
271
TOTAL
30
313
343
Tabela 2. Comparação dos resultados obtidos em amostras de soros pelas técnicas IDGA
e ELISA indireto.
Os resultados foram expressos como positivos (+) e negativos (-).
(sensibilidade 73,3%; especificidade 84%, índice Kappa = 0,35, fraca concordância
entre as técnicas).
D) Detecção precoce de anticorpos pelo método de ELISA indireto.
Na Tabela 3 mostra-se o acompanhamento de um rebanho caprino no município
de Feira de Santana – BA pelo período de dois anos (com até 3 colheitas de soro em
intervalos de 10 e 11 meses). Nos 13 caprinos avaliados durante este período de
colheita, nos animais A, B, C, E, G foi possível à detecção precoce de anticorpos pelo
teste ELISA. A soroconversão nestes animais segundo a técnica de IDGA aconteceu nos
animais C, E, G quase um ano depois e nos animais A e B não foi possível detectar a
soroconversão pela IDGA durante este período de tempo.
52
ANIMAIS
DATA COLHEITA
IDGA
ELISA
A
08/09/2005
-
+
17/07/2006
-
+
08/09/2005
-
+
17/07/2006
-
+
08/09/2005
-
+
17/07/2006
-
+
20/06/2007
+
+
08/09/2005
-
-
17/07/2006
-
-
08/09/2005
-
-
17/07/2006
-
+
20/06/2007
+
+
17/07/2006
-
-
20/06/2007
-
-
17/07/2006
-
+
20/06/2007
+
+
17/07/2006
-
-
20/06/2007
-
-
B
C
D
E
F
G
H
I
17/07/2006
-
-
20/06/2007
+
+
17/07/2006
-
-
20/06/2007
-
-
17/07/2006
-
-
20/06/2007
-
-
L
17/07/2006
-
-
20/06/2007
-
-
M
17/07/2006
-
-
20/06/2007
-
-
J
K
Tabela 3. Acompanhamento sorológico de 13 caprinos de uma mesma
propriedade pelo período de 2 anos, Bahia
Os resultados foram expressos como positivos (+) e negativos (-).
E) Imunofluorescência Indireta
No teste IFI foram avaliadas 11 amostras de soros negativos ou positivos pelas
técnicas IDGA e ELISA indireto (Figura 5). Observou-se que 9 amostras (81,8%) foram
positivas e 1 negativa (9,09%) pelas técnicas IDGA, ELISA e IFI demonstrando alta
correlação entre os resultados das técnicas. Apenas em um animal foi detectado
anticorpos para o CAEV por IFI e não foi detectado pelas técnicas IDGA e ELISA.
53
A sensibilidade do teste IFI foi de 100% e a especificidade de 50%,
apresentando um índice bom de concordância com o teste ELISA (índice Kappa =
0,62).
54
1
3
2
4
Figura 5. Imunofluorescência Indireta (IFI). (1) Células de MSC infectadas em
presença de soro caprino positivo; (2) Células de MSC sem infectar com
soro caprino positivo; (3) Células de MSC infectadas em presença de
soro hiperimune de coelho (SHC); (4) Células de MSC sem infectar com
SHC. As setas indicam células positivas. Aumento das figuras 400x.
55
F) Western – Blot
Amostras de soros (n=13) foram submetidas a técnica de WB, IDGA e ELISA.
Destas amostras, 10 foram concordantes nas três técnicas, 2 foram positivas para WB e
IDGA e 1 apenas por WB. A sensibilidade do teste WB foi de 100% e a especificidade
de 57,1%, apresentando índice moderado de concordância com o teste ELISA (índice
Kappa = 0,55).
Na Figura 6 observa-se o padrão protéico viral reconhecido pelos soros caprinos.
A maioria dos soros possuíam este padrão de resposta para as proteínas de peso
molecular entre 28 kDa (proteína do capsídeo) e 97 kDa. O soro hiperimune de coelho
(SHC) teve um padrão de resposta ligeiramente diferente, considerando que este animal
foi hiperimunizado, onde se destacam as proteínas de 46 e 55 kDa possivelmente
precursoras de proteínas virais e uma proteína de alto PM acima de 97 kDa
(glicoproteina 130 kDa). Uma proteína viral de peso molecular aproximado de 28 kDa
(proteína do capsídeo) observa-se também neste perfil protéico, Observou-se, ainda, que
o SHC reagiu com algumas proteínas celulares.
56
1 2
97
97
66
45
30
20
A
B
Figura 6. Western-blot. Identificação de proteínas do CAEV por anticorpos
policlonais de caprinos e SHC. (A) 1. Reatividade do soro caprino contra
proteínas de células MSC infectadas; 2. Ausência de reação do soro
caprino contra proteínas de células MSC sem infectar; (B) 1.Reação do
soro hiperimune de coelho (SHC) contra proteínas de células MSC
infectadas; 2. Reação do soro hiperimune contra proteínas de células
MSC sem infectar. O marcador de peso molecular está indicado a
esquerda de cada figura e as setas a direita indicam posição das proteínas
detectadas no WB.
57
3.3.3 Detecção do vírus pela técnica de dn PCR
As amostras foram consideradas positivas quando uma ou duas seqüências alvo, pol
(175pb) e/ou env (350pb), foram amplificadas.
A. Detecção do provírus no leite:
Utilizando a técnica de PCR foram avaliadas 40 amostras de leite que tinham
sido soronegativas e soropositivas pelas técnicas IDGA e ELISA indireto. Observou-se
que foi detectada a presença do vírus em 26 delas (65%), enquanto que 14 amostras
(35%) foram negativas.
58
1
2
3
4
5
6
7
Figura 7. PCR. Representação de resultados do dn-PCR para detecção do CAEV em
amostras de leite caprino. 1) controle negativo; 5) controle positivo; 2, 3, 4, 6,
7) amostras positivas para CAEV.
59
3.3.4 Comparações dos resultados obtidos através da técnica imunoenzimática – ELISA
/ PCR
Ao analisar comparativamente os resultados do ELISA indireto e PCR (Tabela
4), observa-se que do total de 25 amostras soropositivas, 18 delas (80%) eram
portadoras do vírus nas células do leite, confirmando a especificidade dos resultados.
Nas amostras restantes soropositivas (n=7) não foi possível à detecção viral,
provavelmente uma carga viral menor impossibilitou a detecção do vírus nos animais.
Por outro lado, amostras soronegativas (n = 8) tiveram detecção viral positiva, o que
condiz com a vantagem do uso do PCR para detectar precocemente portadores sadios
soronegativos.
Desta forma quando comparou-se a técnica ELISA e PCR utilizando Quiquadrado, constatou-se que não houve diferença significativa entre elas (x2 ; p > 0,05),
tendo um índice de concordância pobre (índice Kappa = 0,15).
Na tabela 4 estão expressos os resultados comparativos das técnicas IDGA,
ELISA e PCR separados por grupos. No grupo 1 estão os resultados positivos por todas
as 3 técnicas; No grupo 2 estão os resultados negativos por todas as 3 técnicas; No
grupo 3 estão os resultados soronegativos por IDGA e positivos por ELISA e PCR; No
grupo 4 estão os resultados negativos por IDGA e PCR e positivos pela técnica ELISA;
E no grupo 5 estão os resultados soronegativos por IDGA e ELISA e positivos por PCR.
60
Tabela 4. Comparação dos resultados obtidos com amostras pareadas de soro e leite de
caprinos fêmeas sorologicamente positivas e negativas entre as técnicas IDGA,
ELISA indireto e PCR.
Grupo 1
Grupo 2
Animais
IDGA
ELISA
PCR
Animais
IDGA
ELISA
PCR
1
+
+
+
1
-
-
-
2
+
+
+
2
-
-
-
3
+
+
+
3
-
-
-
4
+
+
+
4
-
-
-
5
+
+
+
5
-
-
-
6
+
+
+
6
-
-
-
7
+
+
+
7
-
-
-
8
+
+
+
9
+
+
+
10
+
+
+
Grupo 3
11
+
+
+
Animais
IDGA
ELISA
PCR
12
+
+
+
1
-
+
+
13
+
+
+
2
-
+
+
14
+
+
+
3
-
+
+
4
-
+
+
Grupo 4
Grupo 5
Animais
IDGA
ELISA
PCR
-
1
-
-
+
+
-
2
-
-
+
-
+
-
3
-
-
+
4
-
+
-
4
-
-
+
5
-
+
-
5
-
-
+
6
-
+
-
6
-
-
+
7
-
+
-
7
-
-
+
8
-
-
+
Animais
IDGA
ELISA
PCR
1
+
+
2
-
3
Os resultados foram expressos como positivos (+) e negativos (-).
(índice Kappa = 0,15, pobre de concordância)
61
3.4. DISCUSSÃO
O diagnóstico sorológico de animais infectados pelo CAEV é difícil
considerando que alguns animais podem apresentar baixos títulos de anticorpos,
soroconversão tardia, ou ainda reações intermitentes de soropositividade e
soronegatividade, exigindo-se assim provas sensíveis. (EAST et al., 1993; PHELPS &
SMITH, 1993; CLAVIJO & THORSEN, 1995; HANSON et al., 1996;). A IDGA técnica de referência para o diagnóstico do CAEV, é uma prova de baixa sensibilidade,
mas é um teste amplamente utilizado no diagnóstico de infecções por este Lentivírus
(KNOWLES et al., 1994; ABREU et al., 1998).
O CAEV tem várias vias de transmissão sendo as principais o colostro ou leite de
fêmeas infectadas, e sua disseminação acontece facilmente no rebanho. Por isto,
diagnosticar e separar os animais infectados é uma das ferramentas para erradicação do
vírus no plantel (CALLADO et al., 2001). Assim, a utilização de provas sorológicas
mais sensíveis para detecção de anticorpos, como o teste imunoenzimático – ELISA
seria de valor particular na identificação precoce de animais infectados ou com baixos
títulos de anticorpos.
Neste trabalho as amostras foram inicialmente processadas pela técnica de IDGA,
mostrando um índice baixo de animais positivos. Esta baixa soroprevalência já foi
citada por outros autores em alguns levantamentos sorológicos realizado na Bahia
(Almeida et al., 2001 e Edelweis et al., 2001) citando variações dentro de 13 a 24% de
prevalência de infecção. Os animais aqui avaliados estavam aparentemente sadios e não
62
possuíam sintomatologia evidente. A maioria das propriedades em que foram feitas as
colheitas eram de rebanhos de corte. Os animais nestes rebanhos têm um curto tempo de
permanência na propriedade e por conseqüência menor tempo para detectar a
soroconversão. Entretanto, Adams et al (1984) explica que em rebanhos leiteiros o
número de animais soropositivos para CAEV é mais alto pelas condições de manejo ou
práticas aplicadas neste tipo de rebanho como a maior permanência do animal na
propriedade, cabras e cabritos juntos, etc.
A técnica sorológica IDGA permite detectar rapidamente os animais infectados. O
Ministério da Agricultura em seu plano nacional de vigilância e controle das
lentiviroses de pequenos ruminantes, artigo 24, recomenda como teste oficial para o
diagnóstico da CAEV em laboratórios credenciados o teste IDGA, entretanto, este
diagnóstico sorológico facilita presença de animais falso-negativos no rebanho.
Considerando a importância da identificação precoce de animais infectados, a técnica de
ELISA indireto poderia ser uma alternativa à atual.
O teste ELISA permite processar um grande número de amostras e a sensibilidade e
especificidade do teste depende da qualidade do antígeno. De acordo com a
Organização Mundial de Epizootias (OIE), a produção de preparações de antígenos de
qualidade satisfatória tem limitado a aplicação de rotina do teste ELISA para o
diagnóstico do CAEV. Neste trabalho, o antígeno utilizado permitiu detectar anticorpos
para CAEV em animais soronegativos ou com baixos títulos de anticorpos para serem
detectados pelo IDGA. Uma técnica de baixa sensibilidade como esta última, dificulta a
identificação desses animais (HARKISS & WATT, 1990). Esta baixa sensibilidade
63
pode ser explicada pelos mecanismos de interação antígeno – anticorpo que acontece
durante esta reação. Enquanto os testes imunoenzimáticos requerem a interação de
apenas um epítopo por anticorpo para obter um resultado positivo, o teste de IDGA
requer a interação de vários epítopos por reação. Além disso, alterações antigênicas nas
proteínas e glicoproteínas também podem influenciar a sensibilidade do teste (CELER
JR. et al., 1998; REISCHAK et al., 2002).
Os valores de sensibilidade e especificidade obtidos no presente estudo, para o
ELISA (73,3% e 84% respectivamente), foram semelhantes com os referidos por Castro
et al. (1999) com uma sensibilidade 54,2% e especificidade 100%, utilizando um
antígeno produzido a partir do sobrenadante de células de MSC inoculadas com cepa
Cork -CAEV. O antígeno viral utilizado neste trabalho foi obtido diretamente de células
infectadas e foi tratado com SDS visando melhorar a exposição dos epítopos das
proteínas virais, o qual justificaria a maior sensibilidade comparada a Castro et al.
(1999). Este tratamento do antígeno com um detergente iônico (SDS) foi também
utilizado com êxito por Simard et al. (2001) para produção de antígeno total de CAEV.
Como foi observado aqui, este tratamento com SDS não altera aparentemente o perfil
protéico do antígeno viral, conservando suas principais proteínas virais.
A confiabilidade e especificidade na detecção precoce de animais infectados pela
técnica de ELISA foram confirmadas também na técnica de PCR onde foi detectado o
provírus de CAEV em amostras de células do leite de animais soropositivos. Alguns
autores têm citado que em certas ocasiões apesar de resultados positivos por ELISA não
se detecta a presença do vírus. Este fato pode ser explicado por: (a) baixo número de
64
cópias do DNA proviral integrado às células do sangue; (b) número de células do
sangue infectadas na amostra, insuficiente para detecção do vírus; (c) baixa carga viral
no sangue de animais aparentemente saudáveis. A este respeito é importante salientar
que outros Lentivírus, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), replicam-se em
linfócitos, entretanto o CAEV replica-se em monócitos, sendo que estes constituem
apenas 10% da população leucocitária e normalmente apenas 0,1% estão infectados
(REDDY et al., 1993, RUTKOSKI et al., 2001).
O diagnóstico de infecções que apresentam intermitência de soroconversão ou
baixa resposta humoral como as causadas pelo CAEV, precisariam utilizar técnicas mais
sensíveis minimizando a possibilidade de resultados falso-negativos. A sensibilidade do
teste na detecção precoce da infecção foi demonstrado neste trabalho ao acompanhar
uma propriedade de caprinos pelo período de 2 anos utilizando as técnicas IDGA e
ELISA. Nessa propriedade constatou-se que este último teste detectou precocemente a
infecção em 5 animais soronegativos pelo IDGA. Estes animais chegaram a
soroconverter após 1 ano. Portanto, este estudo indicaria que o ELISA indireto pode ter
um papel importante na detecção precoce de animais infectados, favorecendo o controle
e erradicação do CAEV em rebanhos infectados.
A detecção precoce constatada pelo teste ELISA tem uma importância
significativa, pois se considerarmos que se essa propriedade fosse acompanhada apenas
pelo teste IDGA, ficariam mais animais como falso-negativos no rebanho, aumentando
a disseminação do vírus e dificultando a erradicação deste no rebanho.
65
Dentre os outros testes sorológicos analisados, apesar do pequeno número de
amostras avaliadas, as técnicas IFI e WB foram altamente correlacionadas ao teste
ELISA. Estes testes complementares podem ser também empregados no diagnóstico, a
exemplo do HIV, onde o WB ou IFI são utilizados como testes confirmatórios para
amostras de soros classificados como reagentes ou indeterminados por testes
imunoenzimáticos (MACHADO & COSTA, 1999; REISCHAK et al., 2002).
A correta determinação do estado de infecção do animal no caso dos Lentivirus é
complexa. Normalmente requer a combinação de testes de diagnóstico ou colheita de
amostras sorológicas durante um período de tempo para descartar a positividade do
animal (MOREIRA et al., 2005). Embora o teste ELISA seja de alta eficiência, fácil,
rápido e de baixo custo, a técnica de PCR seria indicada na fase prévia a soroconversão.
Portanto a combinação da sorologia com um teste de detecção do vírus seria o mais
indicado para otimizar o diagnóstico dos Lentivirus (ANDRÉS et al., 2005).
Estes resultados mostram que foi padronizado um teste imunoenzimático – ELISA
indireto de fácil execução, custo baixo de produção, e com uma sensibilidade superior a
IDGA (principalmente na detecção precoce da infecção), com resultados similares às técnicas
sorológicas de IFI e WB, e a detecção do DNA viral pela técnica de PCR. Portanto o ELISA
indireto poderia representar uma importante ferramenta diagnóstica na detecção precoce de
animais infectados. Contudo, são necessários estudos complementares, com valor amostral
maior, para tornar viável a execução da técnica diagnóstica, visando principalmente às
vantagens apresentadas como processamento de um grande número de amostras, alta
sensibilidade da técnica e bem-estar animal por promover melhor controle da infecção.
66
Concluiu-se então que o uso de pellet ou concentrado de células da MSC infectadas
pode ser utilizado como antígeno viral na detecção de anticorpos contra o vírus da CAE;
O teste imunoenzimático ELISA indireto foi mais sensível que a técnica IDGA; O teste
ELISA indireto detectou precocemente a infecção viral em amostras soronegativos por
IDGA; O teste imunoenzimático ELISA indireto mostrou concordância de resultados
com os testes IFI e WB e que uma alternativa para detecção precoce do vírus pode ser o
uso da técnica de PCR em animais soronegativos.
67
3.5. CONCLUSÕES
1) O uso de pellet ou concentrado de células da MSC infectadas pode ser utilizado
como antígeno viral na detecção de anticorpos contra o vírus da CAE.
2) O teste imunoenzimático ELISA indireto foi mais sensível que a técnica IDGA.
.
3) O teste ELISA indireto detectou precocemente a infecção viral em amostras
soronegativos por IDGA.
4) O teste imunoenzimático ELISA indireto mostrou concordância de resultados
com os testes IFI e WB.
5) Uma alternativa de detecção precoce do vírus pode ser o uso da técnica de PCR
em animais soronegativos.
68
3.6. AGRADECIMENTOS
A Agência Estadual de defesa agropecuária da Bahia (ADAB) por ter nos
ajudado com as colheitas das amostras e a Fundação de amparo à pesquisa da Bahia
(FAPESB) pela bolsa concedida durante o desenvolvimento deste trabalho.
69
3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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72
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho teve como objetivo principal padronizar um teste imunoenzomático
(ELISA) para detecção de anticorpos contra o vírus da Artrite-encefalite caprina
(CAEV), uma vez que este vírus causa uma doença severa e progressiva levando a
perdas econômicas em rebanhos caprinos, caracterizada por artrite, encefalite, mastite e
pneumonia. Além disso, nosso objetivo também foi produzir um antígeno viral que foi
utilizado para o teste ELISA indireto utilizando células de membrana sinovial de cabras
(MSC) infectadas com o CAEV.
A separação de animais sorologicamente positivos através de provas diagnósticas
mais sensíveis como o teste ELISA contribuirá para erradicação do vírus no rebanho.
Essa técnica permitiria identificar animais infectados com baixos títulos de anticorpos
que possivelmente não seriam detectados por provas menos sensíveis como o teste
IDGA permanecendo como falso negativos no rebanho. Neste trabalho foi detectado
quase o dobro do número de animais infectados pelo teste ELISA quando comparado ao
teste IDGA.
Foi possível também identificar precocemente animais infectados através do teste
ELISA. Em uma propriedade de criação de caprinos que foi acompanhada por 2 anos,
verificou-se que aproximadamente 45% dos animais soronegativos pelo teste IDGA, se
apresentavam soropositivos pelo teste ELISA. Sendo assim, mesmo apresentando
intermitência de soroconversão, a infecção foi mais precocemente detectada.
72
73
O teste ELISA padronizado ao ser comparado com os testes sorológicos WB e
IFI para detecção de anticorpos, teve concordância com os resultados encontrados
nestas técnicas, o que fortaleceria a sensibilidade da técnica imunoenzimática. Foi
possível também comparar o teste ELISA com a técnica de detecção do DNA viral,
PCR, confirmando em animais sorologicamente positivos a detecção do vírus.
É importante ressaltar que o uso células da MSC infectadas como antígeno viral
poderia ser utilizado na detecção de anticorpos para o CAEV. Neste trabalho este
antígeno usado no teste ELISA indireto apresentou valor na indicação precoce de
animais infectados e soronegativos por técnicas sorológicas menos sensíveis.
Por fim considera-se que animais com baixa carga viral podem ser portadores do
vírus e fontes de infecção de doenças infecciosas em um rebanho se não forem usadas
técnicas diagnósticas sensíveis. O teste ELISA então se apresenta como importante
ferramenta na prevenção e controle da CAE pela possibilidade de identificação precoce
de animais infectados.
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83
APÊNDICE 1 - LOCALIZAÇÃO DAS PROPRIEDADES DE CRIAÇÃO DE
CAPRINOS PARTICIPANTES DA PESQUISA
Município
Quantidade de animais
Município
Quantidade de animais
· Camaçari
14 animais
· Guanambi
25 animais
· Camaçari 2
8 animais
· Central 1
4 animais
· Bonfim de Feira
31 animais
Central 2
8 animais
· Feira de Santana 1
21 animais
· Ipirá 1
21 animais
· Feira de Santana 2
20 animais
· Ipirá 2
20 animais
· Feira de Santana 3
30 animais
· Baixa Grande
98 animais
· Feira de Santana 4
31 animais
· Itaberaba
12 animais
84
APÊNDICE 2 – RESULTADOS OBTIDOS PELA TÉCNICA ELISA indireto
COM 343 SOROS CAPRINOS UTILIZANDO COMO ANTÍGENO CÉLULAS
DE MSC INFECTADAS COM CAEV E CÉLULAS DE MSC NORMAIS.
SORO
2
6
7
8
9
10
11
12
13
14
16
A
B
C
17
19
23
24
26
28
30
31
61
62
64
65
72
81
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
IDGA
2
2
2
1
2
2
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MSC infectada
0,377
0,291
0,223
0,421
0,183
0,285
0,393
0,324
0,282
0,334
0,271
0,278
0,235
0,218
0,273
0,354
0,316
0,284
0,325
0,427
0,377
0,275
0,265
0,568
0,303
0,226
0,277
0,269
0,275
0,434
0,276
0,61
0,239
0,359
0,36
0,286
0,248
0,194
0,25
0,383
0,661
0,428
0,418
0,401
0,375
0,293
0,296
0,287
0,281
MSC
0,227
0,159
0,198
0,21
0,102
0,24
0,16
0,158
0,255
0,187
0,241
0,229
0,12
0,183
0,215
0,226
0,272
0,266
0,235
0,227
0,223
0,191
0,178
0,137
0,159
0,124
0,173
0,193
0,193
0,162
0,171
0,243
0,165
0,15
0,162
0,174
0,144
0,113
0,169
0,188
0,329
0,268
0,274
0,256
0,209
0,203
0,154
0,197
0,209
RESULTADO
0,15
0,132
0,025
0,211
0,081
0,045
0,233
0,166
0,027
0,147
0,03
0,049
0,115
0,035
0,058
0,128
0,044
0,018
0,09
0,2
0,154
0,084
0,087
0,431
0,144
0,102
0,104
0,076
0,082
0,272
0,105
0,367
0,074
0,209
0,198
0,112
0,104
0,081
0,081
0,195
0,332
0,16
0,144
0,145
0,166
0,09
0,142
0,09
0,072
85
SORO
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
IDGA
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
1
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MSC infectada
0,349
0,325
0,303
0,229
0,59
0,51
0,467
0,352
0,451
0,405
0,282
0,551
0,582
0,376
0,417
0,393
0,391
0,618
0,498
0,422
0,44
0,411
0,385
0,554
0,42
0,431
0,376
0,56
0,559
0,38
0,414
0,361
0,635
0,46
0,296
0,236
0,367
0,663
0,297
0,453
0,35
0,468
0,425
0,454
0,396
0,319
0,321
0,466
0,344
0,266
0,342
0,26
0,246
MSC
0,209
0,207
0,239
0,152
0,184
0,218
0,205
0,277
0,336
0,284
0,224
0,255
0,247
0,303
0,309
0,233
0,23
0,266
0,226
0,347
0,193
0,197
0,299
0,195
0,286
0,288
0,27
0,248
0,213
0,243
0,266
0,234
0,262
0,32
0,239
0,186
0,265
0,27
0,234
0,255
0,262
0,232
0,253
0,21
0,271
0,228
0,251
0,285
0,256
0,223
0,27
0,194
0,206
RESULTADO
0,14
0,118
0,064
0,077
0,406
0,292
0,262
0,075
0,115
0,121
0,058
0,296
0,335
0,073
0,108
0,16
0,161
0,352
0,272
0,075
0,247
0,214
0,086
0,359
0,134
0,143
0,106
0,312
0,346
0,137
0,148
0,127
0,373
0,14
0,057
0,05
0,102
0,393
0,063
0,198
0,088
0,236
0,172
0,244
0,125
0,091
0,07
0,181
0,088
0,043
0,072
0,066
0,04
86
SORO
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
198'
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
IDGA
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MSC infectada
0,392
0,285
0,377
0,294
0,322
0,333
0,31
0,411
0,321
0,346
0,333
0,231
0,375
0,387
0,61
0,395
0,426
0,344
0,431
0,638
0,465
0,404
0,337
0,271
0,342
0,368
0,251
0,401
0,26
0,398
0,359
0,298
0,305
0,261
0,321
0,35
0,367
0,36
0,23
0,255
0,305
0,291
0,323
0,247
0,299
0,322
0,236
0,289
0,2
0,214
0,281
0,339
0,305
MSC
0,226
0,225
0,204
0,224
0,199
0,248
0,205
0,226
0,281
0,249
0,189
0,169
0,211
0,236
0,31
0,271
0,298
0,222
0,339
0,333
0,259
0,269
0,28
0,238
0,227
0,257
0,202
0,262
0,177
0,236
0,288
0,201
0,274
0,182
0,233
0,227
0,239
0,246
0,179
0,203
0,184
0,229
0,2
0,208
0,183
0,281
0,208
0,224
0,155
0,173
0,271
0,204
0,234
RESULTADO
0,166
0,06
0,173
0,07
0,123
0,085
0,105
0,185
0,04
0,097
0,144
0,062
0,164
0,151
0,3
0,124
0,128
0,122
0,092
0,305
0,206
0,135
0,057
0,033
0,115
0,111
0,049
0,139
0,083
0,162
0,071
0,097
0,031
0,079
0,088
0,123
0,128
0,114
0,051
0,052
0,121
0,062
0,123
0,039
0,116
0,041
0,028
0,065
0,045
0,041
0,01
0,135
0,071
87
SORO
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
270
271
272
273
274
275
276
277
278
279
280
281
282
283
284
285
286
287
288
IDGA
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MSC infectada
0,314
0,306
0,266
0,4
0,367
0,386
0,488
0,421
0,305
0,469
0,356
0,355
0,429
0,434
0,475
0,471
0,425
0,398
0,361
0,315
0,332
0,44
0,281
0,355
0,286
0,356
0,5
0,667
0,32
0,363
0,55
0,416
0,532
0,275
0,351
0,306
0,538
0,306
0,392
0,392
0,298
0,332
0,339
0,329
0,368
0,337
0,45
0,473
0,451
0,441
0,395
0,373
0,618
MSC
0,26
0,27
0,223
0,299
0,276
0,341
0,291
0,247
0,235
0,269
0,245
0,209
0,231
0,214
0,217
0,267
0,231
0,202
0,256
0,248
0,255
0,262
0,215
0,187
0,185
0,192
0,194
0,218
0,183
0,169
0,208
0,266
0,209
0,191
0,202
0,2
0,326
0,212
0,263
0,287
0,18
0,208
0,231
0,194
0,151
0,165
0,234
0,197
0,151
0,113
0,189
0,183
0,219
RESULTADO
0,054
0,036
0,043
0,101
0,091
0,045
0,197
0,174
0,07
0,2
0,111
0,146
0,198
0,22
0,258
0,204
0,194
0,196
0,105
0,067
0,077
0,178
0,066
0,168
0,101
0,164
0,306
0,449
0,137
0,194
0,342
0,15
0,323
0,084
0,149
0,106
0,212
0,094
0,129
0,105
0,118
0,124
0,108
0,135
0,217
0,172
0,216
0,276
0,3
0,328
0,206
0,19
0,399
88
SORO
289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
307
308
309
310
311
312
313
314
315
316
317
318
319
320
321
322
323
324
325
326
327
328
329
330
331
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
IDGA
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MSC infectada
0,505
0,6
0,346
0,28
0,331
0,281
0,565
0,488
0,239
0,407
0,281
0,376
0,375
0,282
0,309
0,333
0,316
0,356
0,513
0,441
0,306
0,306
0,481
0,391
0,277
0,352
0,339
0,383
0,415
0,283
0,318
0,333
0,364
0,449
0,381
0,32
0,374
0,387
0,259
0,265
0,484
0,298
0,263
0,327
0,357
0,317
0,378
0,434
0,442
0,378
0,418
0,46
0,276
MSC
0,131
0,224
0,209
0,181
0,161
0,139
0,164
0,21
0,178
0,186
0,207
0,311
0,197
0,18
0,186
0,214
0,173
0,204
0,233
0,237
0,191
0,18
0,263
0,237
0,162
0,198
0,171
0,225
0,251
0,161
0,209
0,227
0,209
0,267
0,233
0,195
0,197
0,16
0,172
0,193
0,168
0,165
0,141
0,163
0,198
0,181
0,178
0,135
0,217
0,228
0,165
0,233
0,143
RESULTADO
0,374
0,376
0,137
0,099
0,17
0,142
0,401
0,278
0,061
0,221
0,074
0,065
0,178
0,102
0,123
0,119
0,143
0,152
0,28
0,204
0,115
0,126
0,218
0,154
0,115
0,154
0,168
0,158
0,164
0,122
0,109
0,106
0,155
0,182
0,148
0,125
0,177
0,227
0,087
0,072
0,316
0,133
0,122
0,164
0,159
0,136
0,2
0,299
0,225
0,15
0,253
0,227
0,133
89
SORO
342
343
344
345
346
347
348
349
350
351
352
353
354
355
356
357
358
359
360
361
362
363
364
365
366
367
368
369
370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
380
381
382
383
384
385
386
387
388
389
390
391
392
393
394
IDGA
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
1
2
2
2
1
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
MSC infectada
0,505
0,394
0,457
0,375
0,345
0,364
0,212
0,291
0,296
0,398
0,298
0,349
0,254
0,325
0,355
0,287
0,329
0,44
0,281
0,301
0,445
0,263
0,318
0,316
0,546
0,39
0,319
0,414
0,212
0,511
0,305
0,225
0,283
0,214
0,262
0,267
0,441
0,197
0,282
0,316
0,199
0,213
0,223
0,261
0,246
0,217
0,238
0,206
0,261
0,264
0,216
0,212
0,264
MSC
0,203
0,181
0,253
0,209
0,176
0,197
0,127
0,153
0,199
0,191
0,2
0,245
0,231
0,138
0,189
0,161
0,19
0,159
0,122
0,184
0,193
0,148
0,196
0,18
0,181
0,212
0,308
0,182
0,198
0,152
0,191
0,165
0,139
0,185
0,198
0,23
0,119
0,178
0,16
0,115
0,215
0,141
0,202
0,174
0,177
0,178
0,176
0,147
0,181
0,167
0,178
0,176
0,201
RESULTADO
0,302
0,213
0,204
0,166
0,169
0,167
0,085
0,138
0,097
0,207
0,098
0,104
0,023
0,187
0,166
0,126
0,139
0,281
0,159
0,117
0,252
0,115
0,122
0,136
0,365
0,178
0,011
0,232
0,014
0,359
0,114
0,06
0,144
0,029
0,064
0,037
0,322
0,019
0,122
0,201
-0,016
0,072
0,021
0,087
0,069
0,039
0,062
0,059
0,08
0,097
0,038
0,036
0,063
90
SORO
395
396
397
398
66M
7M
30M
37M
38M
78M
67M
75M
73M
3M
79M
17
61
1M
82M
52M
53M
54M
55M
56M
57M
58M
59M
60M
9
IDGA
2
2
2
2
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
MSC infectada
0,14
0,25
0,276
0,316
0,559
0,135
0,276
0,282
0,268
0,463
0,477
0,449
0,432
0,558
0,562
0,273
0,265
0,434
0,429
0,451
0,439
0,425
0,261
0,274
0,261
0,405
0,198
0,528
0,143
MSC
0,142
0,215
0,24
0,178
0,113
0,154
0,216
0,157
0,173
0,153
0,163
0,126
0,108
0,122
0,134
0,215
0,178
0,194
0,218
0,159
0,167
0,154
0,144
0,189
0,17
0,159
0,161
0,172
0,119
RESULTADO
-0,002
0,035
0,036
0,138
0,446
-0,019
0,06
0,125
0,095
0,31
0,314
0,323
0,324
0,436
0,428
0,058
0,087
0,24
0,211
0,292
0,272
0,271
0,117
0,085
0,091
0,246
0,037
0,356
0,024
As amostras testadas por IDGA foram consideradas como positivas (1) e negativas (2).
O cut-off ou ponto de corte do teste ELISA foi 0,209 da diferença de MSC infectada e
MSC sem infectar.
91
APÊNDICE 3 - COLHEITA DE SANGUE E LEITE DE CAPRINOS
92
APÊNDICE 4 – FIGURAS ELISA INDIRETO E IDGA
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
B
C
D
E
F
G
H
ELISA INDIRETO. As placas foram sensibilizadas com células de MSC
infectadas tratadas com 0,1% de SDS (3µg/poço) (poços ímpares) e células de
MSC sem infectar (3µg/poço)(poços pares). Acresccentaram-se os soros-testes de
caprinos na diluição de 1:100, em ambos os poços. Imunoglobulina anti- IgG de
cabra marcada com peroxidade foi usada como conjugado. A reação foi revelada
com uma solução de TMB e a leitura foi feita após 30 minutos em leitor de
densidade óptica a 630nm.
Figura esquemática do teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (Fonte:
Caprine arthritis-encephalitis / Ovine Progressive Pneumonia vírus antibody
test kit (“Veterinary Diagnostic Technology”, Wheat Ridge, EUA)). As reações
antigeno-anticorpo são visualizadas como linhas de precipitação no gel de
agarose
93
APÊNDICE 5 – RESULTADOS OBTIDOS COM AS TÉCNICAS IDGA E ELISA
INDIRETO
IDGA
8,75%
AMOSTRAS POSITIVAS
91,25% AMOSTRAS NEGATIVAS
Resultados obtidos através da técnica IDGA para detecção de
anticorpos para CAEV em 343 soros caprinos no estado da Bahia.
ELISA INDIRETO
AMOSTRAS POSITIVAS
21%
79%
AMOSTRAS NEGATIVAS
Resultados obtidos através da técnica ELISA indireto para detecção
de anticorpos para o CAEV em 343 soros caprinos no estado da Bahia.
94
APÊNDICE 6 – RESULTADOS OBTIDOS COM AS TÉCNICAS IFI E
PCR
IFI
AMOSTRAS NEGATIVAS
9,09%
81,8%
AMOSTRAS POSITIVAS
Resultados obtidos através da técnica IFI para detecção de anticorpos
contra o CAEV em 11 amostras de soros caprinos, Bahia.
PCR
AMOSTRAS NEGATIVAS
35%
65%
AMOSTRAS POSITIVAS
Resultados obtidos através da técnica de dn PCR para detecção
do DNA viral do CAEV em 40 amostras de leite.