validação dos diagnósticos molecular e sorológico da toxoplasmose

Fabio Antonio Colombo
VALIDAÇÃO DOS DIAGNÓSTICOS MOLECULAR E
SOROLÓGICO DA TOXOPLASMOSE CEREBRAL EM
PACIENTES COM AIDS
Defesa apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências da Coordenadoria
de Controle de Doenças da Secretaria de
Estado da Saúde de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração:
Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientadora:
Profa. Dra. Vera Lucia Pereira-Chioccola
SÃO PAULO
2007
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES
©reprodução autorizada pelo autor
Colombo, Fabio Antonio
Validação dos diagnósticos molecular e sorológico da toxoplasmose
cerebral em pacientes com Aids / Fabio Antonio Colombo – São Paulo,
2007.
Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde
de São Paulo.
Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Vera Lucia Pereira Chioccola
1. Toxoplasmose cerebral / diagnóstico 2. Síndrome de
imunodeficiência adquirida 3. Reação em cadeia da polimerase 4.
Testes sorológicos
SES/CCD/CD-155/06
II
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais Antônio e Darlete, pelo apoio
e por terem me deixado seguir o meu próprio caminho. E também a minha
estrela que sempre me guiou.
“O escritor é um descobridor; o mau crítico é
seu inimigo, pois é inimigo dos descobridores,
dos que procuram mundos desconhecidos.
Colombo deve ter sido sempre ilógico ou então
não teria descoberto a América. O escritor deve
ser um Colombo. Mas o crítico malévolo ou
insuficientemente instruído pertence àquela
camarilha que queria impedir a partida por ser
contrária à sua sacrossanta lógica. O bom
crítico, ao contrário, sobe a bordo da nave como
timoneiro.”
João Guimarães Rosa
III
Agradecimentos
À Profa. Dra. Vera Lúcia Pereira Chioccola, pela orientação, dedicação,
incentivo, amizade, confiança e atenção dispensada durante a execução
deste trabalho. Obrigado por me ajudar a crescer profissionalmente e
pessoalmente.
A todos os pesquisadores científicos, biologistas, auxiliares,
técnicos e aprimorandos das seções de Parasitoses Sistêmicas,
Enteroparasitoses e Micologia do 8° andar do Instituto Adolfo Lutz, que
contribuíram direta e indiretamente em minha formação acadêmica, pela
ajuda, amizade e compreensão.
As trigêmeas Cristina Meira, Isabelle Martins e Thais Alves pela
ajuda nos momentos difíceis, pelas conversas, pela paciência e pelo
trabalho em equipe. E principalmente por saber que sempre posso contar
com vocês.
A Elaine Cristina Corneta pelo carinho, incentivo e motivação
durante toda a execução deste trabalho. E por segurar a minha mão quando
foi preciso.
IV
Este trabalho teve apoio financeiro da Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP-03/12307-1).
Fabio Antonio Colombo teve apoio financeiro da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) do Ministério da
Educação.
V
Resumo
A toxoplasmose é uma das mais comuns infecções parasitárias
com alta prevalência em humanos. É uma infecção de caráter oportunista
que acomete principalmente mulheres grávidas e pode ameaçar a vida dos
pacientes imunocomprometidos, principalmente aqueles com a síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS). Ela é causada por Toxoplasma gondii,
um protozoário parasita intracelular obrigatório. A doença pode causar danos
graves
no
sistema
nervoso
central
pela
ocorrência
da
encefalite
toxoplásmica. A doença cerebral era uma rara infecção antes da epidemia
da AIDS, tornando-se a causa mais comum de lesões expansivas
intracranianas e a terceira doença definidora de AIDS.
Este estudo avaliou o diagnóstico molecular e imunológico da
toxoplasmose cerebral e determinou os perfis sorológicos dos pacientes.
Foram analisadas 256 amostras obtidas de 207 pacientes divididos em dois
grupos. O grupo I foi composto de 64 pacientes com toxoplasmose cerebral
obtendo um total de 82 amostras (64 de sangue e 18 de LCR). O grupo II foi
composto de 143 pacientes com outras doenças oportunistas, sendo 95
neurológicas e 79 doenças sistêmicas, obtendo um total de 174 amostras
(128 de sangue e 46 de LCR). A análise molecular das amostras foi
realizada pela reação da polimerase em cadeia (PCR), utilizando iniciadores
B22 e B23 do gene B1, e a análise imunológica pela imunofluorescência
indireta (IFI) e pela reação imunoenzimática (ELISA).
A PCR mostrou ser igualmente sensível e muito mais específica
que os testes imunológicos na análise das amostras de LCR e sangue. O
grave envolvimento neurológico na maioria dos pacientes estudados e a alta
prevalência de toxoplasmose no Brasil podem ter contribuído para o
aumento da sensibilidade da PCR.
Os perfis sorológicos dos pacientes do grupo I apresentaram
títulos significativamente mais altos daqueles encontrado no grupo II, e
sugerem a presença da toxoplasmose cerebral ou um alto risco de
desenvolver a doença. Apenas dois pacientes apresentaram resultados
sorológicos negativos e resultado positivo na PCR sugerindo um
VI
comprometimento no sistema imunológico. Entre os pacientes estudados, 49
deles tinham amostras de sangue e de LCR e apresentaram alta
concordância (90%) tanto nos testes imunológicos como no teste molecular.
A análise molecular da toxoplasmose contribuiu para se estabelecer um
diagnóstico da toxoplasmose cerebral mais rápido e preciso, tendo a PCR no
sangue se apresentado tão sensível quanto à realizada no LCR, porém não
sendo tão invasiva.
VII
Abstract
Toxoplasmosis is one of most common parasitic infections with
high prevalence in man. It is an opportunist infection that attacks mainly
pregnant women and the can threat the life of the immuno-compromised
hosts, principally in AIDS. This disease is caused by Toxoplasma gondii, an
obligate intracellular protozoan. It may cause serious damages in central
nervous system that can result in toxoplasmosis encephalitis. The cerebral
disease was rare before AIDS epidemic, becoming the most common cause
of expansive cerebral lesion and the third most frequent AIDS defining
condition.
This study evaluated molecular and immunological diagnosis of
cerebral toxoplasmosis and determined serological profiles of the patients.
We analyzed 256 samples from 207 patients divided into two groups. Group I
was composed of 64 patients with cerebral toxoplasmosis with 82 samples
(64 blood and 18 CSF samples). Group II was composed of 143 patients with
other opportunist diseases as 95 neurological and 79 systemic diseases with
174 samples (128 blood and 46 CSF samples).
Molecular analysis was carried out by polymerase chain reaction
(PCR) using B22 and B23 primers from B1 gene. Immunological analysis
was carried out by indirect immunofluorescence (IFI) and ELISA.
PCR and Immunological tests were highly sensitive, but PCR was
more specific than the immunological tests. The high prevalence of
toxoplasmosis in Brazil and the fact that the majority of patients here had
serious neurological involvement could be contributed for the increase of
PCR sensitivity.
Serological profiles from group I had titles significantly higher than
serological profiles from group II. These data strongly suggest the cerebral
toxoplasmosis in these patients or a high risk to develop the disease. Only
two patients had negative serological tests and positive PCR, suggesting
damages in the immunological system. CSF and blood samples were
colleted in the same day in 49 patients. The immunological and molecular
tests presented a high conformity (90%) between both samples.
VIII
The
molecular diagnosis contributed to establish a fast and accurate diagnosis of
cerebral toxoplasmosis. In addition, PCR performed in blood samples
showed the same sensitivity than those carried out in CSF samples, but not
so invasive.
IX
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – Graus centígrados
AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida
CD4+ - “Cluster of Differentiation”
CDC – “Centers for Disease Control “
DNA - Ácido desoxirribonucléico
D.O. - Densidade ótica
ELISA – “Enzyme-linked immunosorbent assay”
et al. - e outros
g – Aceleração da gravidade
HAART – “Highly active antiretroviral therapy”
HIV – Vírus da imunodeficiência humana
IFI – Imunofluorescência indireta
IgA - Imunoglobulina da classe A
IgE - Imunoglobulina da classe E
IgG - Imunoglobulina da classe G
IgM - Imunoglobulina da classe M
IIER - Instituto de Infectologia Emílio Ribas
LCR- Líquido cefalorraquidiano
LEMP- Leucoencefalopatia multifocal progressiva
PCR- Reação em cadeia da polimerase
PET – “Positron Emission Tomography”
RNM- Ressonância nuclear magnética
SNC - Sistema nervoso central
SPECT – “Single Photon Emission Computed Tomography”
TC – Tomografia computadorizada
T. gondii – Toxoplasma gondii
UV – Ultravioleta
X
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Página
Tabela 1- Distribuição de amostras clínicas dos pacientes dos Grupos I e
II......................................................................................................................42
Tabela 2- Relação de doenças oportunistas e respectivo número de
pacientes do Grupo II.....................................................................................43
Tabela 3- Valor diagnóstico de um teste laboratorial em relação ao
diagnóstico clínico..........................................................................................52
Tabela 4- Comparação entre os resultados de ELISA, IFI e PCR em
amostras de LCR de pacientes dos Grupos I e II...........................................56
Tabela 5- Sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e
negativo
em
amostras
de
LCR
no
diagnóstico
da
toxoplasmose
cerebral...........................................................................................................57
Tabela 6- Comparação entre os resultados de ELISA, IFI e PCR em
amostras de sangue de pacientes dos Grupos I e II......................................59
Tabela 7- Sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e
negativo em amostras de sangue no diagnóstico da toxoplasmose
cerebral...........................................................................................................60
Tabela 8- Correlação entre os resultados na PCR, IFI e ELISA no diagnóstico
laboratorial da toxoplasmose cerebral em sangue e em LCR....................... 65
XI
Figura 1- Ciclo biológico de Toxoplasma gondii............................................21
Figura 2- Reação da PCR para a pesquisa do segmento do gene B1 de T.
gondii usando os iniciadores B22 e B23........................................................54
Figura 3- Distribuição dos resultados de IFI e ELISA no sangue dos 64
pacientes com toxoplasmose cerebral..........................................................62
Figura 4- Distribuição dos resultados de IFI e ELISA no sangue dos 143
pacientes com outras doenças oportunistas................................................. 63
XII
ÍNDICE
página
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................16
1.1. Histórico..................................................................................................16
1.2. Morfologia...............................................................................................17
1.3. Ciclo Biológico........................................................................................18
1.4. Epidemiologia da Toxoplasmose............................................................22
1.5. Patogenia da Toxoplasmose..................................................................23
1.5.1. Toxoplasmose Congênita....................................................................24
1.5.2. Toxoplasmose Ocular..........................................................................26
1.5.3. Toxoplasmose Cerebral.......................................................................27
1.6. Toxoplasmose Cerebral e AIDS.............................................................28
1.6.1. Epidemiologia......................................................................................28
1.6.2. Diagnóstico..........................................................................................30
1.6.2.1.Diagnóstico Sorológico......................................................................31
1.6.2.2. Diagnóstico Molecular……………………………………....…………..34
2. OBJETIVOS..............................................................................................38
2.1. Objetivo Geral........................................................................................38
2.2. Objetivos Específicos.............................................................................38
3. MATÉRIAIS E MÉTODOS........................................................................40
3.1. Pacientes...............................................................................................40
3.1.1. Obtenção das amostras de sangue e LCR.........................................42
3.2. Animais experimentais e T. gondii.........................................................44
3.2.1.Manutenção e obtenção de T. gondii ..................................................44
3.3 Diagnóstico Molecular.............................................................................44
XIII
3.3.1. Extração de DNA em amostras de sangue.........................................44
3.3.2. Extração de DNA em amostras de LCR.............................................45
3.3.3. Extração de DNA de taquizoítos.........................................................46
3.3.4. Reação em Cadeia de Polimerase.....................................................46
3.3.5. Eletroforese em gel de agarose..........................................................47
3.4 . Diagnóstico Imunológico........................................................................47
3.4.1. Reação imunoenzimática (ELISA).......................................................47
3.4.1.1. Preparo do antígeno.........................................................................47
3.4.1.2. Metodologia......................................................................................48
3.4.2. Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI).......................................49
3.4.2.1. Preparo do antígeno.........................................................................49
3.4.2.2. Metodologia......................................................................................50
3.4.3. Teste de Avidez...................................................................................50
3.4.3.1. Preparo do antígeno.........................................................................50
3.4.3.2. Metodologia......................................................................................51
3.5. Análise estatística...................................................................................51
4. RESULTADOS..........................................................................................53
4.1. Padronização da PCR para o diagnóstico da Toxoplasmose.............. .53
4.2. Diagnóstico laboratorial da toxoplasmose no LCR.................................55
4.3. Diagnóstico laboratorial da toxoplasmose no sangue.................... .......58
4.4. Perfis sorológicos dos pacientes............................................................61
4.5. Correlação entre o diagnóstico laboratorial da toxoplasmose em sangue
e em LCR.......................................................................................................64
5. DISCUSSÃO.............................................................................................66
6. CONCLUSÕES.........................................................................................72
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................73
8. ANEXOS………………………………………………………………..........…93
XIV
Anexo 1-Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Infectologia
Emílo Ribas
Anexo 2- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz
Anexo 3- Parecer do Conselho Técnico Científico do Instituto Adolfo Lutz
Anexo 4- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz
para a alteração do Titulo do Projeto de Pesquisa
Anexo 5- Vidal JE, Colombo FA, Penalva de Oliveira AC, Focaccia R,
Pereira-Chioccola VL. PCR assay using cerebrospinal fluid for
diagnosis of cerebral toxoplasmosis in Brazilian AIDS patients. J.
Clin. Microbiol. 2004; 42: 4765-4768
Anexo 6- Colombo FA, Vidal JE, Penalva de Oliveira AC, Hernández AV,
Bonasser-Filho F, Nogueira RS, Focaccia R, Pereira-Chioccola
VL. Diagnosis of cerebral toxoplasmosis in AIDS patients in Brazil:
importance of molecular and immunological methods using
peripheral blood samples. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 5044-5047
Anexo 7 – Prêmio de 1° lugar na Área temática: AIDS, do XLI Congresso da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical e I Encontro de
Medicina Tropical do Cone Sul, em 2005.
Anexo 8 – Carta de informação ao paciente e termo de consentimento livre e
esclarecido.
XV
1. INTRODUÇÃO
1.1. Histórico
O agente causador da toxoplasmose foi descoberto parasitando
um coelho em um laboratório de São Paulo por Splendore em 1908, e na
mesma época, pelos pesquisadores Nicolle e Manceaux no Instituto Pasteur
na Tunísia em um roedor chamado gondii. Os casos humanos foram
descobertos em 1923 na antiga Tchecoslováquia, por Janku e em 1927 por
Magarinos Torres no Brasil, ambos classificados como Encephalitozoon
(Rey, 2001).
A toxoplasmose é uma doença com ampla distribuição na
natureza, podendo infectar diversas espécies de vertebrados, sendo
considerada uma zoonose, ou seja, uma doença de animais que
eventualmente pode ser transmitida ao homem. Ela é causada por uma
única espécie de protozoário, Toxoplasma gondii, que é um parasita
intracelular obrigatório pertencente ao filo Apicomplexa, classe Sporozoa,
subclasse Coccidia, ordem Eucoccidia. Esse filo tem por característica
principal algumas estruturas celulares especiais responsáveis pela invasão
celular chamada de complexo apical (Ravdin, 1995).
As espécies dos felídeos são consideradas os únicos hospedeiros
definitivos, principalmente os gatos, por permitirem a realização das fases
sexuadas de multiplicação parasitária. Os demais animais, inclusive o
homem são apenas considerados hospedeiros intermediários (Bushrod,
2004).
T. gondii é reconhecido mundialmente como um dos mais bem
sucedidos parasitas, podendo se hospedar em praticamente todos os
animais, incluindo vertebrados aéreos como aves e morcegos, herbívoros,
carnívoros e animais oceânicos como as baleias. Diferente de muitos
16
parasitas, que são amplamente restritos as regiões tropicais ou subtropicais,
é um parasita global onde não se conhecem fronteiras geográficas
(Carruthers, 2002).
Sua importância em saúde pública está relacionada a uma
infecção cosmopolita e de fácil difusão. Acomete mulheres grávidas e
crianças e, pode se tornar muito grave em indivíduos imunocomprometidos
por ser uma infecção de caráter oportunista. Seu papel na economia
também é relevante por ser uma das causas da mortalidade neonatal em
animais de criação (Rey, 2001).
1.2. Morfologia
Por anos sua natureza permaneceu incerta até que a microscopia
eletrônica demonstrou uma semelhança com coccídios e com esporozoítas
de plasmódios de malária. Apresenta o complexo apical, estrutura em forma
de cone oco que goza de mobilidade e permite a invasão de células de seus
hospedeiros. Apresenta-se sob diversas formas morfológicas: oocisto,
taquizoíto e cisto.
Os oocistos medem em torno de 10 μm por 10 μm e, durante a
fase aguda são liberados aos milhões nas fezes dos felinos, que são seus
hospedeiros definitivos, por sete a dez dias. Tornam-se infectantes após a
esporulação que leva de um a 21 dias (Dubey et al. 1970).
Frenkel (1973) chamou de taquizoítos as formas de “lua
crescente” ou ovais e de multiplicação rápida. Medem cerca de 6 μm de
comprimento por 3 μm de largura. São estruturas bastante refringentes
quando observado a fresco e corando-se com certa dificuldade. Apresentam
algumas organelas como conóide, anéis polares, roptrias e micronemas, que
são características do filo, além das organelas comuns às demais células
animais. Entram nas células por penetração ativa e, após replicações são
17
disseminados pela corrente sangüínea infectando muitos tecidos, inclusive
os do sistema nervoso central (SNC) (Dubey et al.,1988; Dubey,1991).
Como outros protozoários patogênicos para o homem, os taquizoítos
precisam de um ambiente intracelular para se replicar e são capazes de
invadir ativamente qualquer célula nucleada de mamíferos (Rondanelli et
al.,1986). Interagem com a célula usando muitos mecanismos como o
citoesqueleto que tem papel fundamental no processo de invasão (Monteiro
et al.,1998).
Durante o processo de invasão é formada uma membrana de
proteção chamada de vacúolo parasitóforo, onde os parasitas são capazes
de viver. Esse vacúolo ao mesmo tempo em que impede a fusão dos
lisossomos, promove a diferenciação de taquizoítos em bradizoítos, e
transformando a si mesmo em cisto. (Gross et al.,1996).
Os cistos teciduais, que medem de 20 a 200 μm, contém
centenas
de
bradizoítos,
que
são
morfologicamente
idênticos
aos
taquizoítos, exceto pela velocidade de multiplicação, que é mais lenta, pela
localização do núcleo na parte posterior do parasita, e pelo seu alto índice
de micronemas e grânulos de amilopectina, um constituinte pouco solúvel do
amido, que dá uma coloração avermelhada, ao contrário do amido que tem
uma coloração azul pela coloração de Lugol. Persistem dentro dos cistos por
toda a vida do hospedeiro e são mais resistentes à tripsina ou a pepsina que
os taquizoítos. (Gross et al.,1996; Montoya & Liesenfeld, 2004).
1.3. Ciclo biológico
A infecção por T. gondii acontece pela manipulação ou ingestão
de carnes mal passadas ou cruas contendo bradizoítos viáveis no tecido
muscular ou cerebral; ou ainda pela ingestão de água ou alimentos
18
contaminados com oocistos excretados nas fezes de felinos infectados (Rey,
2001; Bushrod, 2004; Montoya & Liesenfeld, 2004).
Outros autores nos mostram que vários fatores podem afetar o
curso da infecção como a virulência, o tamanho do inóculo e o estado
imunológico do paciente (Suzuki et al,1996; Liesenfeld, 1999). O complexo
ciclo
da
toxoplasmose
pode
ser
explicado
da
seguinte
forma
e
esquematizado na figura 1.
Nos hospedeiros definitivos: quando um gato jovem ingere cistos
presentes em tecidos de algum animal infectado dá-se início ao ciclo de T.
gondii (A). Esses cistos se rompem e os parasitas penetram nas células
epiteliais da parede do intestino (B), seguindo por dois caminhos. No
primeiro caminho os parasitas se arredondam e começam a se multiplicar
assexuadamente dando início a reprodução esquizogônica, onde primeiro se
formam os esquizontes que continuam a repetir esse ciclo por diversas
vezes (C). No outro caminho, alguns desses esquizontes se diferenciam em
macrogametas e microgametas, que juntos formarão o ciclo sexuado
chamado de gametogonia (D). O resultado da fusão dos gametas forma o
zigoto, que posteriormente dará origem ao oocisto (E).
Os oocistos deixam as células epiteliais antes mesmo de
completarem seu desenvolvimento e saem para o exterior junto com as
fezes. Eles necessitam de oxigênio para dar continuidade ao seu
desenvolvimento (F). No meio externo os oocistos produzem no seu interior
dois esporocistos, e cada esporocisto da origem a quatro esporozoítas, além
de uma massa de citoplasma residual. Agora esses oocistos estão maduros
e, são infectantes se ingeridos por quaisquer animais susceptíveis (Rey,
2001).
Nos hospedeiros intermediários: a infecção pode acontecer por
duas formas. A primeira, pela ingestão de alimentos ou contato com
materiais contaminados com oocistos esporulados e maduros. A segunda
19
pela ingestão de carnes mal cozidas de animais contendo cistos presentes
nos seus tecidos. Em ambos os caminhos os parasitas penetram no intestino
do hospedeiro e iniciam um processo de multiplicação assexuada chamado
de endodiogenia ou endogenia (G). Esse processo é semelhante a um
brotamento interno, onde primeiro formam-se os conóides (Rey, 2001).
Cada núcleo adota forma de ferradura e divide-se formando dois
toxoplasmas filhos. O resto da célula mãe se degenera. Isso ocorre
geralmente dentro de uma membrana formada pelo próprio parasita,
chamada de vacúolo parasitóforo. Esse vacúolo é formado durante o
processo de penetração ativa do parasita nas células do hospedeiro e
funciona como uma forma de resistência ao hospedeiro. Nas infecções
agudas, esses vacúolos formam os chamados pseudocistos, que se
multiplicam rapidamente, atingindo certo tamanho até se romperem (H).
Após a ruptura ficam livres os chamados taquizoítas (I), para a invasão de
novas células (J). Os taquizoítas não têm preferência por tipos específicos
de células, órgãos ou tecidos e podem infectar praticamente qualquer célula
nucleada do organismo do hospedeiro. Nas infecções crônicas, onde o
hospedeiro já desenvolveu algum tipo de imunidade, os taquizoítas
continuam se multiplicando por endodiogenia, mas agora muito lentamente,
formando os cistos contendo no seu interior centenas ou milhares de
parasitas, agora chamados de bradizoitas (L). Esses cistos são muito
resistentes às condições ambientais e aos medicamentos, podendo durar
por toda a vida do hospedeiro infectado. Os cistos são estágios infectantes
tanto para hospedeiros definitivos, como para intermediários (M). Os cistos
são boas formas de resistência, pois sobrevivem por até 3 semanas a 4ºC e
mais de 3 dias a -15ºC, já os oocistos resistem até um ano, no meio externo
em ambiente favorável. (Rey, 2001; Montoya & Liesenfeld, 2004).
20
C
Reprodução assexuada
– esquizogonia
formando esquizontes
que repetem este ciclo
várias vezes
D
Esquizontes
diferenciam em macro e
microgametasgametogonia
E
Reprodução sexuada
com formação do zigoto
-oocistos nas fezes
Hospedeiro
Definitivo- HD
B
Cistos se rompem e
parasitas penetram
células epitélio
intestinal
L
Resposta do hospedeiro
– multiplicação mais
lenta – formação dos
cistos de bradizoitos
A
Gato ingere oocistos
no solo ou cistos de
tecidos
M
Cistos teciduais
infectantes tanto para
hospedeiros definitivos
como para
intermediartios
F
Oocistos maduros e
infectantes no meio
ambiente
G
Ingestão de oocistos e
penetração no intestino
do HI– multiplicação
assexuada endodiogenia
Hospedeiro
Intermediário- HI
J
Invasão de novas
células e multiplicação
por endodiogenia
H
I
Ruptura dos
pseudocistos e liberação
dos taquizoitas
Figura 1: Ciclo biológico de Toxoplasma gondii
21
Formação dos
pseudocistos
1.4. Epidemiologia da Toxoplasmose
A toxoplasmose ocorre no mundo todo e é uma das mais comuns
infecções parasitárias, com alta prevalência em humanos (Gilbert, 2004;
Weiss & Kim, 2004). A incidência da doença está sujeita as variações
próprias de cada região, como o tipo de clima, hábitos culturais e
alimentares de determinadas populações. Contudo, a infecção é mais
prevalente em algumas regiões da Europa, Caribe e América do Sul.
(Lebech et al., 1999). A soroprevalência na Europa varia de menos de 20%
ao norte e mais de 60% ao sul (Pinon et al., 2001).
Grande parte das pessoas e animais infectados, inclusive os
selvagens, não apresenta a doença. O aparecimento dos sintomas está
relacionado com a virulência da cepa e ao estado imunológico da pessoa. A
infecção pode ocorrer congenitamente ou adquirida, e geralmente resulta
numa infecção mais branda e com pouca sintomatologia (Remington & Klein,
1995). Estima-se ainda que a toxoplasmose exista na forma assintomática
em cerca de 20 a 30 % da população nos Estados Unidos (Brindley et al.,
1993). Na grande São Paulo a prevalência gira em torno de 69% (Guimarães
et al., 1993).
Outro aspecto importante a ser abordado na toxoplasmose
cerebral é variedade da progressão e gravidade da doença. Tais fatores
dependem da condição do hospedeiro e a genética do parasita (Suzuki et
al.,
1996).
Está
bem
estabelecido
em
estudos
com
animais
de
experimentação, que a virulência varia de acordo com a cepa de T. gondii
utilizada para a infecção. No entanto, análises genéticas de populações
indicam que as cepas de T. gondii estão agrupadas em três linhagens
designadas Tipo I, II e III (Howe & Sibley, 1995). A identificação de uma
possível correlação entre a severidade da doença pode ser um dado para
determinação de condutas terapêuticas (Fuentes et al., 2001). Estudos sobre
22
a caracterização genotípica de cepas de T. gondii são mais conhecidos em
amostras clínicas e de animais das regiões norte do mundo (Estados Unidos
e Europa). No Brasil, existem poucos estudos em humanos. Não se conhece
quais dos subtipos circulam nestes pacientes ou qual deles é mais
prevalente (Howe et al., 1997; Fuentes et al., 2001; Dubey et al., 2004).
Estudos brasileiros em animais demonstram que existe um predomínio das
cepas do Tipo I e Tipo III (Dubey et al.,2004). Existe um relato em pacientes
com doença ocular em que a prevalência é maior do Tipo I (Vallochi et al.,
2005).
1.5. Patogenia da Toxoplasmose
Sendo o homem o hospedeiro intermediário de T. gondii, a
infecção
em
pacientes
imunocompetentes
é
assintomática
ou
oligossintomática. Na infecção aguda, predominam os taquizoítos de
replicação rápida. Aproximadamente 10-14 dias após a infecção, estes
taquizoítos diferenciam-se em bradizoítos, os quais se dividem mais
lentamente
e
formam
cistos
em
diversos
tecidos
do
organismo,
principalmente no cérebro, coração e músculo, estabelecendo infecção
crônica. Nos casos de infecção benigna, raramente necessita de tratamento.
Contudo, cerca de 10% dos indivíduos infectados apresentam sintomas
graves ou persistentes. A manifestação clínica mais típica consiste em
linfadenopatia isolada, com linfondos rígidos, não supurados e discretos.
Outras formas podem surgir, com menor freqüência, como miocardites,
pneumonites e encefalites. O aparecimento dos sintomas está relacionado
com a virulência da cepa e com o sistema imune da pessoa infectada
(Remington & Klein,1995; Su et al., 2002; Bushrod, 2004; Montoya &
Liesenfeld, 2004).
23
Em contraste com o curso favorável da toxoplasmose em quase
todos os indivíduos imunocompetentes, a doença pode ser uma ameaça de
vida naqueles com deficiências do sistema imune. Nesses indivíduos a
toxoplasmose quase sempre acontece como o resultado da reativação de
uma infecção crônica, produzindo ruptura dos cistos e proliferação dos
taquizoítos (Porter & Sande, 1992; Suzuki, 2002; Montoya & Liesenfeld,
2004). Os tipos clássicos serão descritos nos próximos itens:
1.5.1. Toxoplasmose Congênita
A toxoplasmose congênita é a transmissão vertical do parasita
passando da mãe para o feto via placenta. Essa transmissão ocorre durante
a fase aguda da infecção, e tem sua maior complicação devido à falta de um
contato prévio da mulher com o protozoário. Quando o contato ocorre
anteriormente à concepção, dificilmente o feto será infectado devido à
formação de anticorpos maternos. As conseqüências mais severas ocorrem
quando a infecção acontece no primeiro e segundo trimestre, podendo
resultar na morte do feto no útero ou aborto espontâneo. Quando a infecção
acontece tardiamente, no terceiro trimestre, normalmente resulta em recém
nascidos normais (Burg, 1988; Gavinet et al, 1997; Bichara & Povoa, 2001;
Jones et al.,2001).
As seqüelas mais freqüentes são danos oculares, neurológicos ou
morte prematura. Estas seqüelas podem, também, aparecer anos mais
tarde, durante a infância e a adolescência (Holfeld et al., 1994; Jenun et al.,
1998; Bushrod, 2004). As manifestações clínicas incluem hidrocefalia,
microcefalia, corioretinite, estrabismo, cegueira, epilepsia, retardo mental e
anemia. A tríade clássica, composta de corioretinite, hidrocefalia e
calcificações cerebrais, é rara (Remington et al., 1941; Swisher et al, 1994;
Jones et al., 2001). Nenhum desses sinais descritos em recém nascidos é
24
patognomônico para toxoplasmose congênita e podem ser apresentados por
infecções congênitas por outros patógenos, incluindo citomegalovírus,
herpes, rubéola e sífilis (Montoya & Liesenfeld, 2004).
O diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita se baseia em
exames de ultra-sonografia, amniocentese e análise de amostras de sangue
fetal (Hohlfeld et al., 1994). Antes o diagnóstico definitivo ocorre com a
demonstração do parasita, que pode ser pela cultura ou reação da
polimerase em cadeia (PCR) realizado em amostras do líquido aminiótico,
ambos tem suas limitações como o tempo prolongado e amostra de
obtenção difícil, respectivamente. (Burg et al., 1989). Ultra-sonografias
realizadas em fetos com suspeita de toxoplasmose podem aparecer
normais. No entanto, podem surgir achados sugestivos da doença como
calcificações intracranianas, aumento hepático e da espessura da placenta.
(Frenkel, 1974).
Cerca de 95% das crianças com toxoplasmose congênita
apresentam desenvolvimento normal, as mortes em recém nascidos ocorrem
em cerca de 1% e aproximadamente 2% tem prejuízos neurológicos graves.
São encontrados calcificações intracranianas em cerca de 9% das crianças
infectadas e 2% possuem dilatação ventricular detectada pela ultrasonografia (Gilbert, 2004).
As infecções fetais têm seqüelas imprevisíveis, mas a gravidade
das seqüelas pode ser prevenida ou reduzida com o tratamento da mãe
durante a gravidez (Wallon et al, 1999; Pinon et al., 2001).
No Brasil a ocorrência de toxoplasmose congênita varia de 0,2 e
2% (Silveira et al., 1988; Neto et al., 2000). Na região metropolitana de São
Paulo, estima-se que nasçam de 230 a 300 crianças infectadas por
toxoplasmose por ano (Guimarães et al., 1993).
Mais recentemente o diagnóstico laboratorial é composto pelos
métodos tradicionais e os métodos mais específicos. O teste da afinidade
25
funcional ou teste da avidez por anticorpos IgG, vem sendo utilizado para a
distinção entre infecção recente da infecção já adquirida anteriormente. A
avidez é um teste muito útil para o diagnóstico de gestantes e pode ser um
teste confirmatório quando usado em associação com outros testes
sorológicos (Camargo et al., 1991; Lappalainen & Hedman,2004).
1.5.2. Toxoplasmose Ocular
A toxoplasmose ocular é a causa mais comum de uveíte em
pacientes imunocompetentes, sendo responsável por 30 a 50 % dos casos
(Garweg et al., 2000; Villard et al., 2003). A infecção por T. gondii é uma
causa importante de corioretinite nos Estados Unidos e Europa. Na maioria
dos casos ela resulta de uma infecção congênita. No Brasil, estados do Rio
Grande do Sul, Paraná e Rio de Janeiro, apresentam alta incidência de
toxoplasmose ocular, sendo que a cidade de Erechim, no Rio Grande do Sul
apresentou um índice de 17,7%, em uma população estudada de pouco
mais de mil pessoas. (Glasner et al., 1992; Garcia et al., 1999; Petersen et
al., 2001).
As infecções oculares por T. gondii levam a corioretinite aguda
que é caracterizada por uma inflamação grave que aparece no fundo do olho
como uma elevação branco-amarelada, com margens indefinidas e
normalmente no pólo posterior (Bou et al., 1999).
Após a corioretinite focal necrosante pode aparecer uma
inflamação granulomatosa e, também uma exsudação no interior do humor
vítreo ou a invasão deste por capilares e necrose. Parasitas viáveis liberados
pela ruptura dos cistos causam inflamação que induz necrose ou de
hipersensibilidade
disparada
por
causas
desconhecidas.
Raramente
taquizoítos e cistos podem ser vistos na retina e os achados típicos podem
incluir uma lesão focal branca visível, com uma intensa reação inflamatória
26
vítrea. A corioretinite causada por T. gondii pode aparecer na transmissão
congênita ou na doença pós-natal como resultado da infecção aguda ou
reativação (Montoya & Remington, 1996).
1.5.3. Toxoplasmose Cerebral
A presença de cistos de T. gondii em indivíduos com algum tipo
de imunossupressão pode causar uma doença neurológica grave. Incluemse
neste
grupo
os
indivíduos
submetidos
ao
uso
de
drogas
imunossupressoras como aqueles submetidos a transplantes, pacientes com
doenças linfoproliferativas e pacientes com deficiência na imunidade celular
como os portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Burg, 1988;
Ferreira, 2000).
O local da infecção típica é o sistema nervoso central e aparece
na forma de uma encefalite toxoplásmica, que varia de um processo subagudo e pode evoluir gradualmente para um estado de confusão agudo
(Franzen et al., 1997; Ferreira, 2000).
As manifestações clínicas são: mudanças no estado mental,
apreensões, distúrbios de nervos cranianos, anomalias sensoriais, desordem
de movimentos e achados neuropsiquiátricos. O achado focal mais típico é a
hemiparesia e anormalidades de fala (Franzen et al., 1997; Ferreira, 2000;
Montoya & Liesenfeld, 2004).
O dano no sistema nervoso central é caracterizado por muitos
focos de necrose. Essas áreas necrosadas podem calcificar e levar
sugestivos exames radiográficos, mas não patognomônicos da doença.
Outro aspecto da encefalite por toxoplasma é a presença de necroses
cerebrais com predileção das lesões nos gânglios da base em ambos os
hemisférios cerebrais (Luft & Remington, 1992). Os métodos de imagens
podem revelar lesões focais no sistema nervoso, embora estas imagens
27
possam compartilhar características semelhantes a abscessos, tumores,
linfomas ou outras infecções oportunistas do sistema nervoso em pacientes
HIV positivos. (Franzen et al., 1997; Ferreira, 2000).
1.6 Toxoplasmose Cerebral e AIDS
1.6.1. Epidemiologia
A toxoplasmose cerebral era uma rara infecção antes da
epidemia causada pelo vírus HIV que acometia somente pacientes
imunossuprimidos (Harrison & McArthur, 1995). Contudo, tornou-se a causa
mais comum de lesões expansivas intracranianas em pacientes com AIDS
(Simpson & Tagliati, 1994; Cohen, 1999; Luft & Chua, 2000; Mamidi et al.,
2002).
O número de pessoas infectadas com T. gondii aumentou
dramaticamente com o aumento de número de casos de AIDS (Burg, 1988).
Segundo a UNAIDS (2006), existem em torno de 40 milhões de pessoas
vivendo com HIV em 2005 no mundo, sendo que cerca de 5 milhões foram
infectadas no ano de 2005. Os dados ainda mostram cerca de 3 milhões de
mortes no ano. No Brasil, o primeiro caso apareceu no Estado de São Paulo
em 1980 e até julho de 2005, já foram notificados cerca de 371 mil casos da
doença, sendo que no Estado de São Paulo já são mais de 152 mil casos no
mesmo período. O país já acumulou cerca de 172 mil óbitos devidos à AIDS
até dezembro de 2004 (Ministério da Saúde, 2006).
Pacientes com toxoplasmose e AIDS que apresentam menos de
200 células T CD4+/μL de sangue, podem ser acometidos com a reativação
de infecção latente, sendo que mais de 80% destes pacientes desenvolvem
encefalite (Porter & Sande, 1992; Renold et al., 1992; Luft et al., 1993
Mariuz et al., 1997).
28
A prevalência da toxoplasmose cerebral em pacientes com AIDS
se correlaciona com a prevalência da infecção por T. gondii na população
geral. Nos primeiros anos da epidemia da infecção pelo HIV, estimava-se
que 25-50% dos pacientes que apresentavam anticorpos IgG anti-T. gondii e
menos de 200 células T CD4+/μL de sangue desenvolviam toxoplasmose
cerebral (Beamon et al., 1992; Luft & Remington, 1992; Oksenhendler et al.,
1994). Em Berlim e Paris, 25% dos pacientes com AIDS apresentariam
toxoplasmose cerebral. Já, em algumas localidades dos Estados Unidos
esse valor é de 10% e na Bélgica 12 %. A toxoplasmose cerebral foi a
segunda infecção oportunista mais comum relacionada à AIDS vindo atrás
apenas da pneumocistose, causada por fungos da espécie Pneumocystis
carinii, e a primeira causa mais comum de doença no sistema nervoso
central nestes pacientes (Luft & Remington, 1992; Holliman, 1988).
A introdução de terapias anti-retrovirais altamente eficientes
(HAART) ocasionou o declínio da incidência e das mortes associadas à
toxoplasmose cerebral em países desenvolvidos (Ammassari et al.,2000;
Jones et al., 2000; Sacktor, 2001). Porém, ocorreu discreta mudança na
distribuição das doenças oportunistas definidoras de AIDS, incluindo a
toxoplasmose cerebral. Muitos pacientes apresentam como primeira doença,
a toxoplasmose cerebral e só após está manifestação, são diagnosticados
como apresentando AIDS. Como desconhecem que estão infectados pelo
vírus HIV, não se beneficiaram do uso dos anti-retrovirais. (Ammassari et al.,
2000; Leport et al., 2001; Manfredi & Chiodo, 2001; Gray & Keohane, 2003;
Antinori et al., 2004). No Brasil, apesar dos avanços obtidos nos últimos
anos, a queda da incidência foi inferior à observada em países
desenvolvidos.
Atualmente, a prevalência mundial da toxoplasmose é muito
variável. Nos Estados Unidos e na Inglaterra estima-se que 16 a 40% da
população estejam infectados. No entanto, na Europa continental, América
29
Central e América do Sul, incluindo Brasil, os índices de infecção variam
entre 50 a 80% da população (Hill & Dubey, 2002; Bahia-Oliveira et al.,
2003). As lesões expansivas intracranianas entre os pacientes com AIDS
ainda apresenta considerável morbidade e mortalidade especialmente em
países em desenvolvimento (Ammassari et al., 2000; Sacktor, 2002; Antinori
et al., 2004). No Brasil, a toxoplasmose cerebral representa a doença que
mais causa lesões expansivas intracranianas focais e a terceira doença
definidora de AIDS (depois da tuberculose e da pneumonia por
Pneumocystis carinii) (Cohen, 1999; Bahia-Oliveira et al., 2003; Marins et al.,
2003; Vidal et al., 2003; Ministério da Saúde, 2006). Estes dados mostram
que a toxoplasmose cerebral ainda é um problema sério de saúde pública no
Brasil.
1. 6.2. Diagnóstico
Tradicionalmente, o diagnóstico definitivo da toxoplasmose
cerebral requer a comprovação do parasita no tecido cerebral (biópsia ou
necropsia). O diagnóstico provável ou sugestivo, estabelecido pelo "Centers
for Disease Control” (CDC, 1992; CDC, 1993), baseia-se na presença de
achados neurológicos compatíveis, principalmente déficits focais; presença
de anticorpos IgG contra T. gondii, alterações nos estudos de imagens
sendo pela tomografia computadorizada (TC) ou pela ressonância nuclear
magnética (RNM), evidenciando geralmente múltiplas lesões expansivas
com realce anelar e edema perilesional; e uma adequada resposta
terapêutica ao tratamento específico (American Academy of Neurology,
1998; Cohen, 1999; Luft & Chua, 2000; Skiest, 2002; Mamidi et al., 2002). O
diagnóstico da toxoplasmose cerebral baseado em imagens pode ser
confundido com outros processos patológicos como o vírus Epstein-Barr
associado ao linfoma primário do SNC. Portanto, deve ser acompanhada a
30
evolução favorável tanto do ponto de vista clínico como radiológico após a
administração de terapia especifica (Alonso et al., 2002). Contudo, as
características clínicas e radiológicas podem ser idênticas em ambas as
infecções (Roberts & Storch, 1997).
As técnicas de imagem apresentam baixa sensibilidade. Portanto
a biópsia cerebral continua sendo a única modalidade diagnóstica definitiva
in vivo nestes pacientes (Skiest, 2002).
Os testes convencionais para o diagnóstico definitivo de
toxoplasmose são os de detecção do parasita, incluindo detecção
microscópica direta de T. gondii no sangue, inoculação em camundongos e
cultura de células.
Estes testes levam muito tempo e tem baixa
sensibilidade e por isso são pouco utilizados (Franzen et al., 1997; Jenun et
al., 1998; Alonso et al, 2002; Joseph et al., 2002).
O isolamento de T. gondii a partir de sangue ou outros fluidos
corpóreos pode demonstrar a infecção como sendo aguda. A detecção de
taquizoítos também pode ser feita em cortes histológicos do cérebro, ou por
esfregaços de líquidos corpóreos, mas a biópsia cerebral é um procedimento
muito agressivo para uso em rotina (Dupouy-Camet et al., 1993; Montoya &
Liesenfeld, 2004).
Na prática de clínica médica o tratamento é usualmente iniciado
quando é determinado o diagnóstico presuntivo (provável ou sugestivo)
baseado em achados clínicos e radiológicos (Luft & Remington, 1993;
Eggers et al., 1995; Cohen, 1999; Bahia-Oliveira et al., 2003).
1.6.2.1-Diagnóstico Sorológico
As
técnicas
mais
usadas
no
diagnóstico
laboratorial
da
toxoplasmose são os métodos sorológicos que utilizam métodos indiretos de
detecção de anticorpos, geralmente os da classe G e M. Os métodos mais
31
utilizados são: imunofluorescência indireta (IFI), considerado o teste padrão
ouro, e ELISA. Normalmente, os antígenos utilizados são extratos brutos de
taquizoítos. São testes muito úteis para estudos epidemiológicos, mas com a
desvantagem de não indicarem precisamente em qual fase se encontra a
doença, fator imprescindível para se estabelecer o tratamento (Montoya &
Lisenfeld, 2004).
Estes
testes
sorológicos
são
amplamente
usados,
mas
apresentam limitações. Anticorpos específicos como os produzidos em
pacientes imunocomprometidos são dificilmente detectados e, por isso, não
são muito confiáveis nestes casos (Franzen et al., 1997; Joseph et al.,
2002). Por este motivo, os títulos de anticorpos IgG anti-T. gondii não são
utilizados para identificar pacientes com reativação ou com risco de
desenvolver toxoplasmose cerebral. Alguns artigos relatam que não
observaram nenhuma correlação com o aparecimento da doença e a
variação de títulos IgG (Navia et al., 1986; Bishburg, et al., 1989; Grant et al.,
1990; Luft et al., 1993; Aarons et al., 1996; Raffi et al., 1999; Leport et al.,
2001). Contraditoriamente, alguns artigos sugerem que altos títulos de
anticorpos anti T. gondii em pacientes com AIDS podem ser preditores de
toxoplasmose cerebral e salientaram a importância do estudo dos padrões
específicos de anticorpos IgG (Derouin et al., 1991; LaRocco et al., 1993;
Hellerbrand et al., 1996; Derouin et al.1996; Vidal & Penalva de Oliveira,
2002).
Um estudo de caso-controle utilizando os testes de Sabin-Feldman,
hemaglutinação indireta e aglutinação direta em pacientes que apresentavam
concentrações de células T CD4+ menores que 150/μL demonstrou que os
títulos altos de anticorpos IgG anti-T. gondii foram fortemente preditores de
toxoplasmose cerebral (Hellerbrand et al., 1996). Derouin et al. (1996)
realizaram um estudo prospectivo avaliando os títulos de anticorpos IgG
contra T. gondii em relação ao risco de desenvolver doença. Os pacientes
32
com títulos maiores que 150 UI /mL apresentavam risco 3,3 vezes maior do
que os pacientes com títulos menores que 150 UI/mL. Finalmente, três
estudos não controlados e com casuística pequena, um deles retrospectivo
(LaRocco et al., 1993) e dois prospectivos (Derouin et al., 1991; Vidal &
Penalva de Oliveira, 2002), relataram que títulos altos de anticorpos anti-T.
gondii foram indicadores de toxoplasmose clínica.
Contrariamente, dois estudos prospectivos (Raffi et al., 1999;
Leport et al., 2001) evidenciaram, na análise multivariada, que títulos de
anticorpos IgG anti-T. gondii não foram preditores de toxoplasmose
cerebral. Apesar disso, na análise univariada, Leport et al. (2001)
identificaram que títulos altos podem ser um prognóstico da doença. Ambos
os trabalhos salientaram a importância do estudo dos padrões específicos
de anticorpos IgG, utilizando o perfil de imunoblot, o que permite definir
algumas bandas como preditoras de doença.
Testes de detecção de anticorpos IgA podem ser utilizados,
quando a dosagem de anticorpos IgM em fetos e recém nascidos se
apresentam negativa (Lappalainem & Hedman, 2004). Em adultos,
anticorpos IgA permanecem na circulação pelo período de um ano ou mais e
os IgE podem ser usados no complemento do diagnóstico (Pinon et al, 1990;
Wong et al, 1993).
Os métodos sorológicos tradicionais pouco diferenciam entre a
toxoplasmose aguda e a crônica em mulheres grávidas, principalmente
quando
anticorpos
IgG
e
IgM
para
T.
gondii
estão
presentes
simultaneamente (Cozon et al., 1998). O teste de avidez é um importante
marcador sorológico adicional que auxilia no diagnóstico da doença aguda.
Este teste se baseia na demonstração do aumento significativo dos níveis de
anticorpos específicos IgG e/ou a presença de anticorpos específicos IgM,
relacionado-os com o tempo. Os anticorpos com alta avidez são encontrados
em infecções tardias e os de baixa avidez em infecções recentes, após o
33
primeiro encontro com o parasita (Bertozzi et al., 1999). O teste de avidez
combina a exatidão dos ensaios baseados em titulação de ponto final com a
facilidade relativa dos ensaios baseados na leitura de densidades óticas. O
índice de avidez consiste na diferença dos valores da reatividade de
anticorpos IgG lavados com tampão de uréia 6M que rompe os complexos
com baixa avidez, versus os testes lavados com tampão controle (Cozon et
al, 1998; Mechain et al., 2000; Prince & Wilson, 2001). Pesquisadores
europeus relataram que anticorpos IgG com alta avidez dirigidos para T.
gondii, excluem infecção aguda nos três meses anteriores (Liesenfeld et al,
2001). A medida da avidez da IgG ajuda na distinção entre anticorpos
ativamente produzidos pelos recém nascidos com toxoplasmose congênita e
os anticorpos de origem materna adquiridos passivamente em bebes não
infectados (Holliman et al., 1994). A avidez é um método que pode fornecer
segurança para as pacientes cronicamente infectadas e evitar a necessidade
de repetir os testes sorológicos (Cozon et al, 1998).
Apesar
destes
resultados
contraditórios,
a
utilização
do
diagnóstico sorológico, parece ser um recurso a ser considerado na
abordagem inicial dos pacientes com suspeita ou risco de toxoplasmose
cerebral. No entanto, outros estudos devem ser realizados para que se
possa avaliar a sua real utilidade.
1.6.2.2-Diagnóstico Molecular
Nos últimos anos, a disponibilidade de novas metodologias
diagnósticas como o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) no
líquido cefalorraquidiano (LCR) e as técnicas de imagens como a tomografia
computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) e a tomografia por
emissão de pósitrons (PET) caracterizaram abordagens minimamente
invasivas na avaliação inicial das lesões focais nos pacientes com AIDS.
34
Estes procedimentos diminuíram o número de biópsias estereotáxicas e
aumentaram os diagnósticos pré-mortem (Antinori et al., 1997; Cingolani et
al., 1998; Antinori et al., 2000; Ammassari et al., 2000). Na toxoplasmose
cerebral, a sensibilidade do PCR para detectar moléculas de DNA de T.
gondii é de apenas 50% (Schoondermark-van de Ven et al., 1993; Novati et
al., 1994; Gianotti et al., 1997) e as técnicas de imagens continuam
apresentando baixa sensibilidade. Até dispor de estudos que validem a real
importância destas custosas metodologias, a biópsia cerebral continua
sendo a única modalidade diagnóstica definitiva in vivo nestes pacientes
(Skiest, 2002).
Os artigos de revisão não destacam a utilização da PCR em
amostras de sangue para o diagnóstico da toxoplasmose cerebral em
pacientes com AIDS (Cohen, 1999; Mamidi, 2002; Skiest, 2002). Embora
pouco avaliada em estudos clínicos controlados, esta metodologia tem sido
aplicada
há
quase
10
anos,
principalmente,
nos
pacientes
com
toxoplasmose disseminada (Lavareda, 1992; Dupouy-Camet et al., 1993;
Khalifa, 1994, Lamoril et al., 1996). A baixa sensibilidade da metodologia
pode estar relacionada à baixa parasitemia em pacientes com toxoplasmose
cerebral (Dannemann et al., 1991; Pelloux et al. 1997). Por outro lado, a
terapia específica anti-Toxoplasma pode também interferir na sensibilidade
do método. A sensibilidade torna-se mais alta quando as amostras
sanguíneas ou no liquido cefalorraquiano (LCR) são colhidas dentro da
primeira semana de tratamento (Dupouy-Camet et al., 1993; Novati, 1994;
Cingolani, 1996; Franzen, 1997). Apesar destas considerações, estudos
recentes salientam o potencial uso dos métodos moleculares em amostras
sanguíneas como auxiliares no diagnóstico da toxoplasmose cerebral em
pacientes com AIDS. (Alonso, 2002; Priya et al., 2002).
Ainda, a detecção de T. gondii pela PCR tem sido utilizada com
freqüência em diferentes fluidos biológicos e usando vários marcadores
35
como iniciadores. A PCR tem sido aplicada para o diagnóstico de infecções
em tecido cerebral, LCR, lavado broncoalveolar, sangue, tecido hepático,
líquido amniótico, líquido pleural, líquido ascítico, urina e líquido ocular,
porém o sangue é o que se apresenta com maior facilidade na coleta
(Dupouy-Camet et al., 1993; Franzen et al., 1997; Montoya, 2002).
A sensibilidade dos resultados da PCR pode ser afetada por
diversas razões como: manuseio inadequado da amostra, transporte e
condições de armazenamento, introdução de tratamento anti-toxoplasmose
(Hohlfeld et al, 1994).
Outros fatores influenciam os resultados, principalmente a escolha
dos iniciadores e o DNA alvo. Já foram descritos mais de 25 pares de
seqüências iniciadores para detectar T. gondii. A maioria delas tem como
alvo a região repetitiva gene B1. O gene B1 é composto por 35 copias
repetitivas, que são rotineiramente utilizadas para a detecção por PCR por
ser altamente sensível e especifica em amostras clinicas (Burg et al, 1989;
Grigg & Boothroyd, 2000). Alguns estudos relatam que a seqüência
repetitiva do gene B1 apresenta sensibilidade variável quando utilizada em
LCR (Franzen et al., 1997; Montoya e Liesenfeld, 2004).
Estudos realizados com objetivo de comparar sensibilidade de
seqüências iniciadoras mostraram que as seqüências alvo B22 e B23 do
gene B1 apresentaram maior sensibilidade e especificidade (Brindley et al.,
1993; Chabbert et al., 2004).
Geralmente a terapia anti-toxoplasmica se baseia na clínica
presuntiva e/ou sinais radiológicos. A resposta à terapia é considerada
padrão ouro na ausência de biópsia cerebral, embora demore alguns dias ou
semanas após a introdução da medicação. A terapia empírica pode ser
desnecessária em 40% dos casos. Adicionalmente, pacientes com AIDS
demonstram freqüente intolerância às drogas anti-toxoplasmicas (Raffi et al.,
1999). O diagnóstico rápido e menos invasivo corroboram para o diagnóstico
36
rápido de outras complicações do sistema nervoso central para uma terapia
especifica.
Considerando a importância de abordagens diagnósticas não
invasivas das lesões focais cerebrais nos pacientes com AIDS, a pesquisa
utilizando-se métodos moleculares e sorológicos em amostras de sangue
pode otimizar os recursos diagnósticos atualmente disponíveis.
37
2. OBJETIVOS
Pacientes com AIDS e com lesões focais cerebrais são
submetidos a exames invasivos para determinar o agente causador da
infecção. A pesquisa de métodos moleculares e sorológicos em amostras de
sangue ou LCR para determinar agentes infecciosos pode aperfeiçoar o
diagnóstico atual.
2.1. Objetivo geral:
Diagnosticar a toxoplasmose cerebral em pacientes com AIDS,
usando técnicas imunológicas e de biologia molecular, e verificar se e os
títulos altos de anticorpos IgG anti-T. gondii podem auxiliar no diagnóstico
da toxoplasmose cerebral nesses pacientes.
2.2. Objetivos específicos
1- Padronizar a técnica da PCR para a pesquisa do segmento do gene B1
de T. gondii no sangue e no LCR visando o diagnóstico molecular da
Toxoplasmose;
2- Realizar e avaliar os resultados obtidos com o diagnóstico molecular da
toxoplasmose cerebral em pacientes com AIDS;
3- Realizar e avaliar o diagnóstico imunológico da toxoplasmose cerebral
usando as técnicas de imunofluorescência indireta, ELISA e teste de
avidez para a pesquisa de anticorpos anti-T. gondii em pacientes com
AIDS;
4- Determinar a sensibilidade e especificidade de cada ensaio laboratorial
no diagnóstico da toxoplasmose cerebral em pacientes com AIDS.
38
5- Comparar se os resultados obtidos pela PCR realizada no sangue tem a
mesma sensibilidade e especificidade do que a realizada no LCR para o
diagnóstico da toxoplasmose cerebral.
39
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Pacientes
Foram analisadas 256 amostras de 207 pacientes maiores de 18
anos admitidos e tratados no Instituto de Infectologia Emilio Ribas, São
Paulo, Brasil. Todos apresentavam diagnóstico sorológico positivo para HIV
e valores de células CD4+ < 200 /µl. Os pacientes foram divididos em dois
grupos:
Grupo I: Foram analisadas 82 amostras, sendo 64 de sangue e 18 de LCR,
de 64 pacientes com toxoplasmose cerebral, diagnosticados pelos exames
clínicos e radiológicos. As “definições de diagnóstico clínico-radiológico de
toxoplasmose cerebral em pacientes com AIDS” foram orientadas pelas
definições do “Centers for Disease Control and Prevention” (CDC, 1993) e
consistem em: 1) pacientes com sinais neurológicos focais, alterações do
nível ou do conteúdo da consciência, evidência de imagem tomográfica de
lesão expansiva, com ou sem realce da substância de contraste e resposta
terapêutica ao tratamento anti-Toxoplasma ou 2) amostras de tecido
cerebral, obtidas mediante necropsia ou biópsia estereotáxica, com achado
de taquizoítos ou imunohistoquímica positiva para T. gondii e 3) resposta ao
tratamento específico anti-Toxoplasma. Todas as amostras de sangue ou
LCR foram coletadas antes ou até o terceiro dia de terapia específica para
toxoplasmose (tabela 1).
Grupo II: Foram analisadas 174 amostras, sendo 128 de sangue e 46 de
LCR, de 143 pacientes maiores de 18 anos sem antecedente e ausência de
diagnóstico clínico-radiológico para toxoplasmose cerebral. O diagnóstico
definitivo desses pacientes para as outras doenças oportunistas foi
determinado pela história clínica, avaliações laboratoriais e radiológicas.
40
Noventa e cinco amostras de 70 pacientes com doenças neurológicas e 79
amostras de 73 pacientes com doenças não neurológicas. As doenças e o
número de pacientes estão descriminados na tabela 2, enquanto o número
de amostras de sangue e LCR aparecem na tabela 1. Este grupo foi
considerado como controle.
Todos os pacientes que participaram da pesquisa aceitaram
espontaneamente sua inclusão, pessoalmente ou através de familiares ou
responsáveis. Todos assinaram o termo de consentimento que foi aprovado
para este estudo nos comitês de ética do Instituto de Infectologia Emilio
Ribas e do Instituto Adolfo Lutz (anexos).
41
3.1.1. Obtenção das amostras de sangue e LCR:
Foram coletadas de cada paciente 10 ml de sangue em tubo
contendo EDTA para o diagnóstico molecular e 5 ml em tubo seco para
diagnóstico sorológico.
Foram coletados de cada paciente cerca de 2 ml de LCR para a
realização de diagnóstico molecular e imunológico.
A coleta de LCR não foi realizada todos os pacientes devido à
contra-indicação em pacientes com lesões cerebrais expansivas (Eggers et
al., 1995; Antinori et al., 1997; Cingolani et al., 1998; Cohen, 1999).
Pacientes
Sangue
LCR
Total
64
18
82
128
46
174
192
64
256
Grupo I
(n=64)
Grupo II
(n=143)
Total (n=207)
Tabela 1- Distribuição de amostras clínicas dos pacientes dos Grupos I e II
42
Doenças neurológicas
Número de
Doenças Sistêmicas
amostras*
Menigoencefalite/
40 (27)
C. neoformans
Número de
amostras*
Pneumonia/
26 (26)
Pneumocystis carinii
Neuro-Tuberculose
19 (15)
Tuberculose
20 (19)
Encefalite por HIV
18 (14)
Pneumonia bacteriana
13 (13)
Leucoencefalopatia
11 (7)
Candidíase oral
7 (7)
7 (7)
Linfoma difuso
6 (4)
Diarréia
5 (3)
Meningite bacteriana
2 (1)
multifocal progressiva
Neuro-sífilis
Total
95 (70)
79 (73)
Tabela 2-Relação de doenças oportunistas e respectivos números de
amostras do Grupo II. * O número entre parênteses representa o número de
pacientes.
43
3.2. Animais experimentais e T.gondii:
3.2.1. Manutenção e obtenção de T. gondii
Os parasitas utilizados foram taquizoítos de cepa RH, que é uma
linhagem altamente virulenta, não cistogênica e de multiplicação rápida, e foi
gentilmente cedida pelo Instituto de Medicina Tropical da Universidade de
São Paulo. A manutenção da cepa foi realizada em camundongos machos
da linhagem Swiss, com idade entre 25 e 30 dias, provenientes do Biotério
Central do Instituto Adolfo Lutz, por via intraperitonial com média de 100
taquizoítos por animal. Após três ou quatro dias de infecção foi feita uma
lavagem intraperitonial com 5 ml de solução fisiológica estéril para a retirada
dos taquizoítos. A seguir, foi feita a contagem de parasitas em câmara de
Neubauer e acertada na concentração desejada. Os taquizoítos obtidos
foram utilizados para a manutenção da cepa através de passagem para um
novo grupo de animais, para extração de DNA e para a preparação dos
antígenos.
3.3.- Diagnóstico molecular:
3.3.1.- Extração de DNA em amostras de sangue
A metodologia foi padronizada neste trabalho e publicada em
Colombo et al. (2005). As amostras coletadas foram transferidas para um
tubo de 15 ml, centrifugadas por 10 minutos a 2800 g para retirada de
plasma. Para que ocorresse a lise de hemácias, nos tubos contendo o
sedimento foram adicionados 3 vezes o volume de tampão ACK (150 mM
cloreto de amônio; 1 mM bicarbonato de potássio; 0,1 mM EDTA pH 7,3) e
incubados a temperatura ambiente sob agitação por 10 minutos. Após uma
44
nova centrifugação por 10 minutos a 2800 g, os sobrenadantes contendo
restos de hemácias foram desprezados e os sedimentos foram transferidos
para tubos de 1,5 ml. Para que ocorresse a lise das células nucleada
adicionou-se 200 μl de um tampão de lise contendo 100 μg / ml Proteinase
K; 50 mM Tris-HCl pH 8,0; 25 mM EDTA; 2% SDS. Os tubos foram agitados
em vortex e incubados por 30 minutos a 56°C.
Para a extração do DNA utilizou-se o método fenol-clorofórmio-isoamil
(Sambrook et al., 1989) com algumas modificações. Aos tubos contendo as
células lisadas foram adicionados 200 μl de fenol equilibrado e centrifugados
por 10 minutos a 10.000 g. Os sobrenadantes foram retirados e transferidos
para novos tubos onde foram adicionados de 200 μl uma mistura de
clorofórmio/isopropanol (24:1), agitados e centrifugados por 10 minutos a
10.000 g. Os sobrenadantes foram novamente transferidos para novos
tubos, adicionados 3 vezes o volume de isopropanol gelado e agitados para
a precipitação do DNA. A seguir, os tubos foram centrifugados por 10
minutos a 10.000 g e os sobrenadantes descartados. Os sedimentos
contendo DNA foram lavados com 200 μl de álcool etílico 70% por
centrifugação a 10.000 g por 10 minutos. Os tubos foram deixados a 4°C
para a evaporação do álcool. Após a secagem, as amostras de DNA foram
re-hidratadas com 50 μl de água Milli-Q contendo 20 μg/ml de RNase.
3.3.2. Extração de DNA em amostras de LCR
A metodologia de extração de DNA no LCR também foi
padronizada neste trabalho e está descrita em Vidal et al. (2004). As
amostras foram transferidas para tubos de 1,5 ml e centrifugadas por 5
minutos a 10.000 g. O sobrenadante foi retirado e utilizado para o
diagnóstico imunológico. Os sedimentos contendo células foram lavados
com 500 μl de PBS estéril por centrifugação por 5 minutos a 10.000 g. Após
45
o descarte dos sobrenadantes, foram adicionados 50 μl de água Milli-Q
contendo 20 μg/ml de RNase e incubados a 100ºC por 5 a 10 minutos.
3.3.3. Extração de DNA taquizoítos
Os taquizoítos provenientes de camundongos foram extraídos
pelo método fenol-clorofórmio-isoamil (Sambrook et al., 1989) como descrito
no item 3.3.1. As concentrações de DNA foram determinadas por
espectrofotometria a 260 nm UV em um espectrofotômetro HACH DR/4000
U.
3.3.4. Reação em Cadeia de Polimerase.
As reações para a amplificação do DNA foram realizadas com
auxilio de um kit comercial (Amersham-Pharmacia-Biotech) em um tubo
contendo 1,5 unidades de Taq DNA polimerase; 10 mM Tris-HCl pH 9,0; 50
mM de KCl; 1,5 mM MgCl2; 200 mM de cada um dos desoxinucleosídeos
trifosfatados. Em cada reação foram adicionados 5 μl de cada amostra de
DNA proveniente de amostra de sangue ou 10 μl proveniente de amostra de
LCR. Junto foram adicionados 50 pmoles de cada um dos iniciadores em um
volume final de 25 μl completado com água ultra pura. Foram utilizados os
oligonucleotideos B22 (5’AACGGGCGAGTAGCACCTGAGGAGA3’) e B23
(5’TGGGTCTACGTCGATGGCATGACAAC3’),
que
amplificam
uma
seqüência de 115 pares de bases de uma região repetitiva do gene B1 de T.
gondii (Burg et al., 1988, 1989). As amplificações foram realizadas num
termociclador
(Techne-Progene)
e
consistiam
num
ciclo
inicial
de
desnaturação de 5 minutos a 95°C, uma segunda etapa com 35 ciclos de
desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 62°C por 1 minuto e
extensão a 72°C por 1 minuto. Após essa etapa o processo foi finalizado por
46
um ciclo final de extensão por 10 minutos a 72º C. Cada reação foi
acompanhada pela adição de um controle positivo a partir de DNA extraído
de taquizoítos e dois controles negativos. O primeiro adicionou-se DNA
proveniente de um indivíduo sem toxoplasmose e o segundo, água ultra pura
substituiu o DNA.
3.3.5. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos amplificados foram diluídos em tampão de corrida
(30% glicerol; 0,25% xilenocianol FF; 0,25% azul de bromefenol) na
proporção de 1:6, aplicados em gel de agarose 2% em TBE (0,045M de TrisBorato; 0,001M EDTA) com 0,5 μl/ml de brometo de etídio e separados por
um sistema de eletroforese horizontal numa cuba contendo o mesmo
tampão. Os géis foram visualizados, e as imagens adquiridas em um
sistema de aquisição de imagens (Gene Snap-Syngene).
3.4.- Diagnóstico Imunológico.
3.4.1. Reação imunoenzimática (ELISA).
3.4.1.1. Preparo do antígeno.
Um lote de 35 camundongos recebeu, por via intraperitonial,
1x107 taquizoítos/animal. Após 5 dias os parasitas foram retirados através da
lavagem intraperitonial com 5 ml de solução fisiológica estéril e, a seguir, a
solução foi centrifugada por 1 minuto a 1800 g. Após o descarte do
sobrenadante os parasitas foram lavados por três vezes com 40 ml de PBS
pH 7,2 por 15 minutos a 2800 g. Por fim, foi adicionado 1 ml de água
destilada ao sedimento, contendo os parasitas
47
A solução foi colocada em um becker com banho de gelo, e os
parasitas rompidos por ultra-som (MSE). Foram feitos 6 ciclos (1,0 A por 1
minuto), sendo verificado após cada minuto a integridade dos toxoplasmas.
Após a total destruição dos toxoplasmas, as concentrações protéicas foram
determinadas por espectrofotometria UV a 280 nm. A seguir, a solução foi
diluída em água destilada até que se atingisse a concentração protéica
desejada. O antígeno foi separado em alíquotas e estocado a -20°C.
3.4.1.2. Metodologia.
O antígeno foi diluído em 0,1 M bicarbonato de sódio pH 8,5 na
concentração de 1 μg/ml e colocado 50 μl por orifício em placas escavadas
de fundo chato com 96 orifícios (Evergreen Scientific). Após a incubação por
24 horas a 4°C, as placas foram lavadas por 2 vezes com PBS 0,05%Tween 20. Os orifícios da placa foram bloqueados com 100 μl de PBS-Leite
desnatado 5% por 30 minutos em temperatura ambiente.
Os soros testados foram diluídos a 1:500 em PBS-Leite
desnatado 5%, adicionados nos orifícios em duplicata num volume de 50 μl
e incubados por 45 minutos a 37°C. A seguir as placas foram lavadas por 5
vezes com PBS 0,05%-Tween 20 e adicionado 50 μl/ orifício de IgG de
cabra anti-IgG humana conjugada a peroxidase (Sigma) na diluição 1:5000
em PBS 5%-Leite desnatado. As placas foram incubadas por mais 45
minutos a 37°C e, novamente lavadas 5 vezes com PBS 0,05%-Tween 20. A
revelação ocorreu com a adição de 100 μl do substrato enzimático contendo
0,5 mg/ml de OPD (o-fenilenodiamina) diluído em 0,1M fosfato de sódio
dibásico pH 4,5; 0,1M ácido cítrico; 0,1% H2O2; por 15 minutos em câmara
escura, a temperatura ambiente. A reação foi interrompida adicionando 50 μl
de H2SO4 4 N.
48
Os
resultados
foram
analisados
em
espectrofotômetro
(Labsystens Multiskan) em comprimento de onda de 492 nm. Foram
calculadas as médias dos valores em densidade ótica (D.O.) dos soros
testados em duplicatas. Os soros que apresentaram média superior ao “cutoff” (D.O. = 0,143 na diluição 1:500) foram testados pelo método
quantitativo. Neste caso, os soros foram diluídos em série até 1:128 000.
Os testes realizados com as amostras de LCR foram executados
da mesma maneira, diferindo apenas nas diluições. No teste qualitativo as
amostras foram ensaiadas sem diluição e no quantitativo, em diluições
seriadas até 1:16.
3.4.2. - Reação de Imunofluorescência indireta (IFI).
3.4.2.1. Preparo de antígeno.
A obtenção de parasitas foi inicialmente realizada como descrito
no item 3.4.1.1., até a sedimentação. Aos tubos contendo parasitas foram
adicionados formol 2% em PBS pH 7,2 na proporção de 1:1 e incubados por
30 minutos a 37°C. O sobrenadante foi desprezado após uma centrifugação
por 15 minutos a 2800 g e, ao sedimento foi adicionada aleatoriamente,
solução salina até que se obtivesse 20 a 30 taquizoítos por campo, quando
observado em microscopia no aumento de 400 vezes. O antígeno, então foi
distribuído em lâminas de 10 orifícios contendo em média 20 μl por orifício e
deixadas secar naturalmente em temperatura ambiente. As lâminas secas
foram embrulhadas em papel vegetal e acondicionadas em papel de
alumínio e posteriormente conservadas em freezer a -20°C até o momento
do uso.
49
3.4.2.2. Metodologia.
As lâminas com antígeno contendo taquizoítos íntegros foram
retiradas do freezer e mantidas em temperatura ambiente. Os soros foram
diluídos nas concentrações 1:16, 1:256, 1:1024, 1:2048, 1:4096 e
acrescentados na lâmina em ordem decrescente num volume de 15 μl. A
seguir, foram incubadas por 30 minutos em câmara úmida a 37°C e,
posteriormente, lavadas com PBS pH 7,2 por dois períodos de 10 minutos.
As lâminas foram secas suavemente com papel de filtro, e sobre os orifícios
foram acrescentados 15 μl de uma globulina anti-IgG humana marcada com
fluoresceína (Biolab-Merieux) diluído 1:200 em 0,05% Azul de Evans PBS
pH 7,2. Após nova incubação em câmara úmida por 30 minutos a 37°C, as
lâminas foram novamente lavadas por 2 vezes com PBS pH 7,2. A seguir,
foram secas, receberam uma fina camada de glicerina tamponada com PBS
pH 7,2 e foram recobertas com lamínula. As leituras foram feitas em
microscópio de fluorescência (Nikon) em aumento de 400 vezes. O cut-off, já
estabelecido pela seção de Toxoplasmose do Instituto Adolfo Lutz foi
considerado a diluição de 1:16 (Camargo & Leser,1976).
Os testes realizados com as amostras de LCR foram executados
da mesma maneira, diferindo apenas nas diluições. No teste qualitativo as
amostras foram ensaiadas sem diluição e no quantitativo, em diluições
seriadas até 1:16.
3.4.3. Teste de Avidez.
3.4.3.1 Preparo do Antígeno.
O preparo do antígeno foi realizado como descrito no item 3.4.1.1.
50
3.4.3.2 Metodologia.
A metodologia foi realizada como descrito no item 3.4.1.2. com as
seguintes alterações. Os soros foram diluídos na proporção de 1:100 em
PBS 0,05%-Tween 20; 5% Leite desnatado e aplicados em duplicata uma
em cada fileira e incubados a 37°C. A seguir, foram adicionados 250 μl de
uma solução 6M de uréia; PBS 0,05%-Tween 20 por orifício em fileiras
alternadas. As placas foram incubadas por 15 minutos a 37°C.
Os índices de avidez foram calculados pela divisão dos valores
das D.O. nas reações tratadas com uréia pelos valores das D.O. obtidas nas
reações sem tratamento pela uréia. Os produtos obtidos foram multiplicados
por 100. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem e foram
considerados como descrito a seguir: 1- índices de avidez menor que 15%
representaram valores preditivos sugerindo uma infecção adquirida a menos
de 5 meses; 2- índices entre 15 e 30% representam valores preditivos
sugerindo infecção adquirida a mais de 5 meses. Altos índices de avidez
(acima de 30%) determinaram infecções crônicas (Korhonen et al, 1999;
Garweg et al, 2000; Mechain et al, 2000).
3.5. Análise estatística.
Os testes estatísticos foram calculados como descrito por Ferreira
& Ávila (2001). Foram determinadas a sensibilidade e especificidade, e
valores preditivos (positivo e negativo). Os testes foram aplicados nos
métodos sorológicos (IFI e ELISA) e moleculares (PCR determinada em
amostras de LCR e de sangue). A análise foi realizada em todas as
amostras de ambos os grupos de pacientes. As amostras dos pacientes
diagnosticados clinicamente como tendo toxoplasmose cerebral foram
51
denominadas “com doença”. As amostras do grupo dos pacientes com
outras doenças oportunistas foram chamadas de “sem doença”. Os cálculos
foram baseados em uma tabela 2 x 2 (Tabela 3), onde: VP (verdadeiro
positivo) = número de indivíduos com a doença e que apresentaram o teste
positivo; FP (falso positivo) = número de indivíduos sem a presença da
doença e que apresentaram o teste positivo; VN (verdadeiro negativo) =
número de indivíduos sem toxoplasmose cerebral e com o teste negativo e
FN (falso negativo) = número total de indivíduos com toxoplasmose cerebral
e com o teste negativo.
Teste
Com doença
Sem doença
Positivo
VP
FP
Negativo
FN
VN
Tabela 3- Valor diagnóstico de um teste laboratorial em relação ao
diagnóstico clínico
As fórmulas estatísticas aplicadas foram:
1-Sensibilidade = VP / VP + FN;
2-Especificidade = VN / VN + FP;
3-Valor preditivo positivo = VP / VP + FP;
4-Valor preditivo negativo = VN / VN + FN.
52
4. Resultados.
4.1. Padronização da PCR no diagnóstico da Toxoplasmose.
Os primeiros experimentos foram realizados para padronizar cada
seguimento dos testes utilizados para avaliar as amostras clínicas. Os testes
iniciais em LCR foram realizados em amostras congeladas (Vidal et al.,
2004).
Foram incluídos alguns procedimentos ao processamento das
amostras clínicas com objetivo de eliminar inibidores da Taq polimerase,
presentes em fluidos biológicos. As amostras de sangue e LCR foram
processadas rapidamente e, após a centrifugação, as células foram lavadas
com tampão para retirar restos de sangue ou LCR. Considerando-se que os
parasitas poderiam ser raros, então, as amostras foram centrifugadas para
maior recuperação de células. No caso de LCR, as células foram lisadas por
aquecimento para liberação do DNA, evitando-se assim, centrifugações e
perda de células.
A seguir, foi determinada a quantidade mínima de DNA de T.
gondii capaz de ser detectada na PCR quando presente no sangue e no
LCR. DNA extraído de 1x107 taquizoítos coletados de camundongos foram
diluídos serialmente até 1x102 e amplificados por PCR na presença de DNA
extraído de sangue ou de LCR humano. Como ilustração a figura 1 mostra
uma seqüência de 115 pb amplificada pelos iniciadores B22 e B23.
53
pB
1
2
3
500-
200100-
115 pb
Figura 2: Reação da PCR para a pesquisa do segmento do gene B1 de T.
gondii usando os oligonucleotideos B22 e B23. Gel de agarose a 2% corado
com brometo de etídio: 1 - Peso molecular (DNA Ladder 100pb); 2- amostra
positiva; 3- amostra negativa. Os orifícios receberam 5μl do produto
amplificado.
54
4.2. Diagnóstico laboratorial da toxoplasmose no LCR.
Após as padronizações dos testes laboratoriais, estes foram
empregados no diagnóstico da toxoplasmose e os resultados foram
avaliados e comparados. Foram analisados os dados obtidos com as
amostras de LCR. A Tabela 4 mostra os resultados de ELISA, IFI e PCR de
64 amostras, sendo 18 de pacientes do grupo I e 46, de pacientes do grupo
II.
Dentre
os
18
pacientes
com
toxoplasmose
cerebral,
16
apresentaram anticorpos anti-T. gondii detectados por IFI e 15 por ELISA. A
PCR detectou a presença de T. gondii em 16 pacientes.
No grupo II, das 46 amostras de pacientes com outras doenças
oportunistas, a IFI detectou a presença de anticorpos anti-T. gondii em 20
pacientes, e ELISA em 16. A PCR foi positiva em apenas 3 (6,5%) pacientes
do Grupo II. IFI foi negativa em 26 pacientes e ELISA em 30. A PCR foi
negativa 43 pacientes.
Foram calculados a sensibilidade, a especificidade e os valores
preditivos positivo e negativo para cada um dos testes. Como mostra a
Tabela 5, as porcentagens de sensibilidade foram semelhantes entre os três
testes: 89% para a IFI e a PCR, e 83 % para ELISA. Grande diferença foi
notada nas especificidades: 93% para PCR, 56% para IFI e 65% para
ELISA. Estes dados refletiram nos valores preditivos positivos dos testes
mostrando significante diferença entre a PCR (0,84) e os testes sorológicos
(IFI – 0,44 e ELISA - 0,48).
55
Tabela 4: Comparação entre ELISA, IFI e PCR em amostras de LCR dos pacientes dos Grupos I e II.
LCR
Pacientes
IFI
Total
positivo
ELISA
negativo
positivo
PCR
negativo
positivo
negativo
Grupo I
Pacientes com AIDS
18
16
02
15
46
20
26
16
64
36
28
03
16
02
30
03
43
33
19
toxoplasmose cerebral
Grupo II
Pacientes com AIDS e
outras doenças
oportunistas
Total
31
56
45
Tabela 5: Comparação entre parâmetros para validação calculados para ELISA, IFI e PCR nas amostras de LCR.
LCR
Teste
PCR
IFI
Sensibilidade
0,8889
0,8889
0,8333
Especificidade
0,9348
0,5652
0,6521
Valor Preditivo Positivo
0,8421
0,4444
0,4838
Valor Preditivo Negativo
0,9555
0,9286
0,9090
57
ELISA
4.3. Diagnóstico laboratorial da toxoplasmose no sangue.
A seguir, foram analisados os dados obtidos com as amostras de
sangue. A Tabela 6 mostra os resultados de ELISA, IFI e PCR de 192
amostras, sendo 64 de pacientes do grupo I e, 128 de pacientes do grupo II.
Dentre os 64 pacientes com toxoplasmose cerebral, 58 (90,6%)
apresentaram anticorpos anti-T. gondii detectados pela IFI e por ELISA. A PCR
detectou a presença de T. gondii em 51 (79,7%) pacientes. Seis (9,4%)
pacientes apresentaram resultados negativos na IFI e na ELISA e 13 (20,3%)
na PCR.
No grupo II, das 128 amostras de pacientes com outras doenças
oportunistas, IFI e ELISA detectaram a presença de anticorpos anti-T. gondii
em 72 pacientes (56,3%). A PCR foi positiva em apenas 03 pacientes (2,3%).
ELISA e IFI foram negativas em 56 pacientes (43,8%). PCR foi negativa em
125 pacientes (97,7%).
A tabela 7 mostra os valores de sensibilidade, especificidade e
valores preditivos positivo e negativo para cada teste. A sensibilidade foi de
80% para a PCR e de 90,6% para ELISA e IFI. Assim como nas amostras de
LCR foi notada grande diferença nos índices de especificidade sendo de 98%
para a PCR, e de 44% para a IFI e para ELISA. Estes dados refletiram nos
valores preditivos positivos dos testes mostrando significante diferença entre a
PCR (0,94) e os testes sorológicos (IFI e ELISA - 0,44).
58
Tabela 6: Comparação entre ELISA, IFI e PCR em amostras de sangue dos pacientes dos Grupos I e II.
Sangue
Pacientes
IFI
Total
positivo
ELISA
negativo
positivo
PCR
negativo
positivo
negativo
Grupo I
Pacientes com AIDS
64
58
06
58
128
72
56
72
192
130
06
51
13
03
125
54
138
toxoplasmose cerebral
Grupo II
Pacientes com AIDS e
56
outras doenças
oportunistas
Total
62
130
59
62
Tabela 7: Comparação entre parâmetros para validação calculados para ELISA, IFI e PCR nas amostras de sangue.
Sangue
Teste
PCR
IFI
Sensibilidade
0,7969
0,9063
0,9063
Especificidade
0,9766
0,4375
0,4375
Valor Preditivo Positivo
0,9444
0,4462
0,4462
Valor Preditivo Negativo
0,9058
0,9032
0,9032
60
ELISA
4.4. Perfis sorológicos dos pacientes.
Os testes de avidez de IgG específicos para T. gondii foram
executados em todas as amostras de sangue. Todos os valores de avidez
encontrados foram superiores a 30%, indicando que todos os pacientes
estavam na fase crônica da infecção.
Para avaliar se os títulos de anticorpos poderiam ser preditores da
toxoplasmose cerebral, os resultados obtidos das amostras de sangue dos
192 pacientes (64 do Grupo I e 128 do Grupo II), foram agrupados por
títulos.
Para a IFI foram considerados títulos intermediários os que
apresentaram resultados positivos nas diluições de 1:32 a 1:512 e títulos
altos, as diluições acima de 1:1024. Para ELISA, os títulos intermediários
foram considerados nas diluições entre 1:500 a 1:4000 e títulos altos acima
da diluição 1:8000.
A Figura 2 mostra a distribuição dos resultados de ELISA e IFI
dos pacientes do Grupo I e a Figura 3, dos pacientes do Grupo II. Houve
maior número de casos positivos com títulos intermediários e altos no grupo
I de pacientes com toxoplasmose cerebral (Figura 3), enquanto no grupo II
de pacientes com outras infecções oportunistas houve um maior número de
casos com títulos negativos (Figura 4).
61
IFI
ELISA
60
60
40
40
20
20
0
0
neg
32 to 512
>1024
neg
500 to 4000 > 8000
Títulos dos soros *
Figura 3: Distribuição dos resultados de IFI e ELISA no sangue dos 64
pacientes com toxoplasmose cerebral.
* Cada título corresponde ao inverso da diluição
62
Número de pacientes
IFI
ELISA
60
60
40
40
20
20
0
0
neg
32 to 512
>1024
neg
500 to 4000 > 8000
Figura 4: Distribuição dos resultados de IFI e ELISA no sangue dos 143
pacientes com outras doenças oportunistas.
* Cada título corresponde ao inverso da diluição.
63
4.5. Correlação entre o diagnóstico laboratorial da
toxoplasmose em sangue e em LCR.
Entre os 207 pacientes participantes deste estudo, apenas 49
tinham amostras pareadas de sangue e de LCR, sendo 18 do Grupo I e 31
do Grupo II. Os resultados de ELISA, IFI e PCR foram comparados e tanto
os resultados negativos quanto os positivos foram concordantes em 90% (44
de 49 pacientes) para as três metodologias. Houve 5 (10%) pacientes com
resultados discordantes (tabela 8).
64
65
Tabela 8: Correlação entre o diagnóstico laboratorial da toxoplasmose em sangue e em LCR de 49 pacientes (18 do Grupo I e 31
do Grupo II).
Concordantes
Discordantes
índice de
concordância (%)
LCR negativo
Sangue positivo
LCR positivo
Sangue negativo
positivo
negativo
PCR
17
27
44 (90%)
05
0
IFI
17
27
44 (90%)
05
0
ELISA
24
20
44 (90 %)
03
02
65
5- Discussão.
O diagnóstico rápido e preciso da toxoplasmose cerebral é de vital
importância para o rápido início do tratamento evitando-se seqüelas, assim
como
o
aumento
da
sobrevida
dos
pacientes,
principalmente
os
imunocomprometidos como os portadores do HIV. Para os programas de
saúde, tais medidas evitam gastos com os altos índices de morbidade e
mortalidade de indivíduos em idade produtiva.
A introdução da HAART
levou a um declínio da incidência de infecções oportunistas no SNC
(Harrison & McArthur, 1995; Ammassari et al., 2000; Sacktor, 2002).
Entretanto a toxoplasmose cerebral continua apresentando altos índices de
mortalidade e morbidade em vários países em desenvolvimento (Mehari &
Hairmanot, 2003; Shankar et al, 2003; Vidal et al; 2005). Atualmente, no
Brasil é a doença neurológica mais freqüente em pacientes com AIDS (Silva
et al, 2005).
O diagnóstico presuntivo da toxoplasmose cerebral em pacientes
com AIDS consiste na presença de menos de 200 células CD4+/ μl,
anticorpos IgG anti-T. gondii no soro, achados característicos no diagnóstico
por imagem, e melhora após a administração da terapia específica. Neste
trabalho foi avaliado o valor da PCR como ferramenta para compor o
diagnóstico da toxoplasmose cerebral, tornando-o mais rápido, preciso e
pouco invasivo.
Para padronizar a reação em amostras de LCR, teve início uma
análise retrospectiva de amostras de LCR congeladas e conservadas no
Serviço de Parasitologia do Instituto Adolfo Lutz. Estas amostras foram
encaminhadas para o laboratório para realizar pesquisa de anticorpos anti-T.
gondii por ELISA e IFI, durante o período de janeiro a outubro de 2002. As
amostras eram provenientes de adultos e recém nascidos com quadro
66
neurológico grave e com suspeita de doença causada por Toxoplasma
gondii
As amostras de LCR foram utilizadas para se estabelecer um
procedimento simples para a obtenção da maior parte do DNA presente nas
células das amostras (dados não apresentados; Vidal et al. 2004).
Inicialmente, escolheu-se como seqüência alvo uma região
localizada no gene B1 que é amplificada pelos iniciadores B22 e B23. O uso
destes iniciadores no diagnóstico e sua alta sensibilidade já foram
previamente demonstrados por outros estudos (Burg et al, 1989; Hohlfeld et
al., 1994; Jones et al., 2000; Vidal et al., 2004; Chabbert et al., 2004).
Após esta primeira etapa, teve início um estudo prospectivo com
amostras de LCR colhidas de pacientes com diagnóstico sorológico positivo
para o HIV e que apresentavam envolvimento neurológico, admitidos e
tratados no Instituto de Infectologia Emilio Ribas. Nesta fase foram
realizados além do PCR, os testes de IFI e ELISA.
Dando continuidade ao estudo prospectivo, foi investigada a
presença de DNA de T. gondii em amostras de sangue. Apesar da obtenção
das amostras serem mais fáceis que as amostras de LCR, a extração do
DNA em sangue periférico foi mais complexa devido a maior presença de
células e substâncias que podem inibir a reação de amplificação, como o
fenol, utilizado na extração do DNA.
As condições laboratoriais também foram essenciais para elevar a
sensibilidade e a especificidade da PCR em sangue. Para evitar falsos
resultados e a inibição da ação da Taq polimerase, três condições foram
importantes: (i) as amostras de sangue foram coletadas com EDTA e
processadas rapidamente; (ii) o plasma foi removido e os eritrócitos lisados
rapidamente com um tampão específico; e (iii) os eritrócitos lisados foram
removidos antes da lise das células nucleadas. Foram utilizados
rotineiramente controles para investigar se algum inibidor de Taq polimerase
67
poderia mudar os resultados obtidos. Durante o processamento de algumas
amostras foi incluído um tubo contendo uma mistura v/v de DNA extraído de
um paciente negativo para toxoplasmose com DNA extraído de um paciente
com toxoplasmose. Um resultado positivo confirmava a ausência de
substâncias inibitórias.
A PCR realizada tanto no LCR quanto no sangue destaca-se pelo
seu poder altamente discriminatório entre indivíduos soropositivos para
toxoplasmose e outro com doença ativa, seja disseminada ou cerebral.
Os resultados obtidos nas amostras de LCR foram concordantes
quanto à sensibilidade: PCR e IFI apresentaram índice de sensibilidade de
88,9% e ELISA, 83,0%. Por outro lado, a especificidade de 93,5% da PCR
foi superior à encontrada nos testes imunológicos que ficaram entre 56,5%
(IFI) e 65,2% (ELISA). Resultados diferentes com a PCR podem ser
detectados de acordo com os procedimentos técnicos de cada laboratório
(Cingolani et al., 1996). Alguns trabalhos anteriores mostram sensibilidade
moderada e alta especificidade da PCR em relação a outras técnicas
diagnósticas (Parmley et al, 1992; Schoondermark-van de Ven et al., 1993;
Novati et al., 1994; Dupon et al., 1995; Cinque et al., 1996; Kupferschmidt et
al., 2001; Priya et al., 2002).
Neste trabalho algumas condições podem ter contribuído para
aumentar a sensibilidade da PCR, como o grave envolvimento neurológico
na maioria dos pacientes estudados e a alta prevalência de toxoplasmose no
Brasil (Cingolani et al., 1998; Marins et al., 2003). Outro fator que pode ter
colaborado foi a coleta de amostra antes ou até o terceiro dia da terapia
específica (Rodriguez et al., 1997; Montoya, 2002).
Trabalhos
anteriores
mostram
índices
de
sensibilidade
extremamente variáveis (16 a 86%) na PCR em amostras de sangue
periférico (Dupouy-Camet et al., 1993; Khalifa et al., 1994; Gianotti et
al.,1997; Pelloux et al., 1997; Bastien, 2002; Priya et al., 2002). Tais
68
divergências provavelmente devem-se a diferentes tipos de iniciadores para
diversos alvos de DNA e ao pequeno número de amostras analisadas
(Bastien, 2002; Vidal et al, 2004). Estes achados nos levaram a analisar uma
casuística grande. Todos os 207 pacientes analisados apresentavam
imunodeficiência grave (menos de 200 células CD4+/μl). Alguns pacientes
também apresentaram a forma disseminada e, provavelmente, grande carga
parasitária. Assim, a sensibilidade da PCR quando se utilizou amostras de
sangue foi de 87% e especificidade de 92,1%, muito acima das encontradas
na IFI e ELISA, 30,3% e 57,3%, respectivamente.
Duas amostras de LCR e treze amostras de sangue de pacientes
do Grupo I apresentaram resultados negativos na PCR, que leva a supor
uma quantidade insuficiente de DNA do parasita para a amplificação. Os
resultados da IFI e da ELISA realizados em LCR foram negativos em 2 e 3
amostras, respectivamente. Já os realizados em sangue foram negativos em
6 amostras tanto na IFI quanto na ELISA. Esses resultados imunológicos
negativos nos permitem especular sobre o comprometimento imunológico do
paciente.
Das 46 amostras de LCR de pacientes sem toxoplasmose
cerebral do Grupo II, IFI e ELISA detectaram anticorpos anti- T. gondii em 20
e 16 pacientes, respectivamente. Isso pode ser explicado pela alta
prevalência de toxoplasmose na população brasileira. Na PCR no Grupo II,
apenas três amostras de pacientes diagnosticados com criptococose
apresentaram resultados positivos, situação que permite especular sobre a
presença conjunta de T. gondii e Cryptococcus sp, podendo levar o paciente
a desenvolver mais tarde a toxoplasmose cerebral.
Das 128 amostras de sangue de pacientes do Grupo II, a PCR
resultou em teste positivo em apenas 3 amostras, em contrapartida os teste
sorológicos detectaram anticorpos anti-T. gondii em 72 pacientes pela IFI e
pela ELISA. Como estes pacientes são imunodeprimidos, existia a
69
possibilidade de eles estarem também desenvolvendo toxoplasmose
cerebral.
Investigamos também os perfis sorológicos dos pacientes de
ambos os grupos. Alguns estudos mostraram que diferentes níveis de
anticorpos IgG anti-T. gondii foram incapazes de determinar reativação ou o
seguimento em curso da toxoplasmose cerebral (Luft & Remington, 1992;
Sadler et al., 1998; Luft et al, 2000). Outros sugeriram que altos títulos em
pacientes podem ser indicativos da presença de toxoplasmose cerebral ou
um alto risco de desenvolver a doença (Derouin et al., 1996; Hellerbrand et
al., 1996). Apesar desses dados controversos, os resultados obtidos
confirmam a utilidade clínica de medir os níveis de anticorpos IgG anti-T.
gondii na toxoplasmose cerebral. Estes pacientes desenvolvem altos títulos
de anticorpos anti-T gondii e sendo significativamente mais altos daqueles
encontrados no grupo controle.
Estes resultados confirmam estudos
anteriores (Derouin et al., 1996; Hellerbrand et al., 1996). Contudo, existem
pacientes que já não produzem anticorpos, tal o comprometimento do
sistema imunológico. Dois pacientes apresentaram resultados negativos nos
testes sorológicos e a PCR resultou positiva. Com exceção destes dois
pacientes, independentemente dos níveis de anticorpos, o teste de avidez de
IgG revelou que todos os pacientes tinham anticorpos de avidez
intermediária a alta, o que significa infecção estabelecida à tempo.
Independente
dos
níveis
de
anticorpos,
todos
pacientes
apresentaram anticorpos IgG com alta avidez. Esses dados sustentam a
idéia que a reativação da infecção latente observada em pacientes
imunocomprometidos leva a resposta imune secundária (Mechain et al.,
2000).
Outro ponto importante que este trabalho pôde mostrar é que a
PCR realizada no sangue pode ser tão sensível quanto à realizada no LCR.
A punção lombar além de ser invasiva, é contra indicada num grupo de
70
pacientes com lesões cerebrais expansivas (Cingolani et al., 1998). Dentre
os pacientes estudados, 49 deles tinham amostras de LCR e sangue.
Houve concordância de 90% nos três testes. Em resumo, o presente
trabalho permite concluir com bastante segurança devido a grande
amostragem, que o diagnóstico molecular, tanto no LCR quanto no sangue
pode
contribuir
eficazmente
para
estabelecer
o
diagnóstico
da
toxoplasmose cerebral. Por outro lado, o diagnóstico sorológico pode ser
um indicativo de infecção ativa desde que seja realizado como um teste
quantitativo.
71
6. Conclusões
1- Após a padronização, a PCR utilizada para o diagnóstico da
toxoplasmose em amostras de LCR e sangue mostrou-se eficiente
apresentando sensibilidades de 88% e 80% e especificidades de
93% e 97% para LCR e sangue respectivamente;
2-
Os resultados obtidos pela PCR realizada em amostras de pacientes
com AIDS mostraram a capacidade desta metodologia em realizar o
diagnóstico diferencial da doença, separando pacientes com doença
ativa daqueles com infecção crônica. Os resultados das análises em
sangue foram coerentes com as análises em LCR;
3- Os resultados obtidos com os testes imunológicos (IFI, ELISA e teste
de avidez) foram coerentes com os resultados obtidos através do
diagnóstico molecular;
4-
Altos títulos de anticorpos anti-T.gondii podem ser indicadores de
toxoplasmose cerebral ou infecção ativa.
72
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8- Anexos.
Anexo 1- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de
Infectologia.
Anexo 2- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo
Lutz.
Anexo 3- Parecer do Conselho Técnico Cientifico do Instituto Adolfo
Lutz.
Anexo 4-Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz
para a alteração do Titulo do Projeto de Pesquisa
Anexo 5-Vidal JE, Colombo FA, Penalva de Oliveira AC, Focaccia R,
Pereira-Chioccola VL. PCR assay using cerebrospinal fluid for
diagnosis of cerebral toxoplasmosis in Brazilian AIDS patients. J.
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JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 2004, p. 4765–4768
0095-1137/04/$08.00⫹0 DOI: 10.1128/JCM.42.10.4765–4768.2004
Copyright © 2004, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Vol. 42, No. 10
PCR Assay Using Cerebrospinal Fluid for Diagnosis of Cerebral
Toxoplasmosis in Brazilian AIDS patients
José E. Vidal,1 Fabio Antonio Colombo,2 Augusto C. Penalva de Oliveira,3
Roberto Focaccia,1 and Vera Lucia Pereira-Chioccola2*
Department of Infectious Disease1 and Department of Neurology,3 Instituto de Infectologia Emílio
Ribas, and Department of Parasitology, Instituto Adolfo Lutz,2 Sao Paulo, Brazil
Received 2 March 2004/Returned for modification 12 April 2004/Accepted 29 June 2004
Highly active antiretroviral therapy has decreased the incidence of opportunistic infections in the central
nervous system in AIDS patients. However, neurological abnormalities still remain important causes of
mortality and morbidity in developing countries. In Brazil, cerebral toxoplasmosis is the most common
cerebral mass lesion in AIDS patients. For these reasons, early, inexpensive, and sensitive diagnostic tests must
be evaluated. The aim of this study was to evaluate PCR, using cerebrospinal fluid (CSF) samples to detect
Toxoplasma gondii DNA, and to determine if the association of PCR with immunological assays can contribute
to a timely diagnosis. We studied two sample groups. First, we analyzed stored CSF samples from 29 newborns and
from 39 adults with AIDS without a definitive diagnosis of toxoplasmosis. The goal of this step was to standardize
the methodology with a simple and economical procedure to recover the T. gondii DNA. Next, we prospectively
evaluated CSF samples from 12 AIDS patients with a first episode of cerebral toxoplasmosis and 18 AIDS patients
with other neurological opportunistic diseases and without previous cerebral toxoplasmosis. In all PCR samples, an
indirect immunofluorescent assay and an enzyme-linked immunosorbent assay were performed. Samples from all
patients with cerebral toxoplasmosis presented positive PCR results (sensitivity, 100%), and a sample from one of
the 18 AIDS patients with other neurological diseases also presented positive PCR results (specificity, 94.4%). These
findings suggest the clinical utility of PCR in the diagnosis of cerebral toxoplasmosis in developing countries.
central nervous system (CNS) dysfunction, and on typical lesions in the brain, detected by computed tomography or by
magnetic resonance imaging scan (5, 14, 18, 29, 30).
In recent years, PCR and other methods have been used
together to detect T. gondii in various biological specimens,
including amniotic fluid (22, 25), aqueous humor (26), cerebrospinal fluid (CSF), and blood (16, 17, 27, 28, 37). At the
same time, several DNA targets were used for this purpose,
and sensitivity has proved to be high, principally in the diagnosis of congenital and ocular toxoplasmosis.
In this study, we report the results of a PCR study of CSF
samples from Brazilian AIDS patients with cerebral toxoplasmosis.
The worldwide human population is constantly exposed to
and infected by Toxoplasma gondii. Normally, human infections occur from the ingestion of raw or undercooked meat
that is infected with cysts, contaminated water, or foods contaminated with oocysts or from transplacental transmission
from a mother who acquired her infection during gestation (15,
21). The chronic asymptomatic form exists in 80 to 90% of
infected people. Only 10 to 20% of cases of T. gondii infection
in adults and children are symptomatic (15, 21, 25). In Brazil,
the serological prevalence of T. gondii infection is high, ranging
from 50 to 80% in the adult population (5).
Toxoplasmosis is a serious and often life-threatening disease
in immunodeficient patients. Moreover, the incidence of cerebral toxoplasmosis among human immunodeficiency virus-infected individuals directly correlates with the prevalence of
anti-T. gondii antibodies among the general human immunodeficiency virus-infected population. Frequently, the disease
results in the reactivation of latent chronic infections from
cysts present in the brain, eyes, heart, and muscles. Cerebral
toxoplasmosis represents the most common cerebral mass lesion in AIDS patients and is the third-most-frequent condition
associated with AIDS in Brazil (5, 14, 23, 24, 31, 32).
The definitive diagnosis of cerebral toxoplasmosis requires
demonstration of tachyzoites in brain biopsy or necropsy. The
presumptive diagnosis is based on positive tests for anti-T.
gondii antibodies, on suggestive clinical signs and symptoms of
MATERIALS AND METHODS
CSF samples. For the present study, we used two different groups of samples.
For group I, we retrospectively analyzed samples stored in the Department of
Parasitology at the Instituto Adolfo Lutz during the period from January 2002 to
October 2002. We received 68 CSF samples from different hospitals located in
São Paulo, Brazil. These samples were from 29 newborns and from 39 adult
AIDS adult patients who presented serious neurological alterations and were
suspected of having a disease caused by T. gondii. After immunoglobulin M
(IgM) or IgG evaluation by indirect immunofluorescence assay (IF) and enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), the samples were stored at ⫺20°C. Next,
they were assayed by PCR. For group II, we prospectively studied CSF samples
from 30 AIDS patients with neurological involvement who were admitted to the
Instituto de Infectologia Emilio Ribas, São Paulo, Brazil, between April and July
2003. The first episode of cerebral toxoplasmosis was confirmed in 12 patients by
immunological, clinical, radiological, and imaging diagnostic methods. These
criteria were established by the Centers for Disease Control and Prevention (9,
10) and included the following: (i) the recent onset of a consistent focal neurological abnormality with intracranial disease or reduced level of consciousness,
(ii) a lesion having a mass effect evidenced by brain imaging (on computed
tomography or magnetic resonance imaging) or a lesion with radiographic appearance enhanced by the injection of contrast medium, and (iii) a positive test
* Corresponding author. Mailing address: Laboratório de Parasitologia, Instituto Adolfo Lutz, Av. Dr. Arnaldo, 355 no. 8 andar, CEP
01246-902, São Paulo SP, Brazil. Phone: (55 11) 3068 2889. Fax: (55
11) 3068 2890. E-mail: [email protected].
4765
4766
VIDAL ET AL.
J. CLIN. MICROBIOL.
TABLE 1. CSF sample results by IF, ELISA, and PCR
CSF sample results by:
Patient population
Group I
Newborns
Adults with AIDS
Group II
Adult AIDS patients with cerebral
toxoplasmosis
Adult AIDS patients with other
neurological disease
Total no.
of samples
IF
ELISA
PCR
Positive
Negative
Positive
Negative
Positive
Negative
29
39
20
22
9
17
17
22
12
17
20
24
9
15
12
12
0
12
0
12
0
18
4
14
4
14
1
17
for anti-T. gondii antibodies in serum or a successful response to treatment for
cerebral toxoplasmosis. CSF samples were collected before or until the third day
of anti-toxoplasmosis therapy. Of the 18 patients with noncerebral toxoplasmosis,
11 patients were diagnosed with cryptococcal meningitis, defined by the presence of
Cryptococcus neoformans in CSF culture. Three patients presented with progressive
multifocal leukoencephalopathy, defined by a positive PCR to JC virus in CSF and
a typical magnetic resonance imaging pattern. Two patients suffered from cerebrovascular disease, which was defined as acute onset of consistent clinical features and
characteristic neuroimaging studies. Finally, two patients had tuberculosis meningitis, defined by a CSF culture positive for Mycobacterium tuberculosis. Samples from
patients with a previous history of cerebral toxoplasmosis and patients with more
than one opportunistic CNS infection were excluded. No patient had been receiving
highly active antiretroviral therapy (HAART). The institutional review boards of the
ethics committees of the Instituto de Infectologia Emilio Ribas and Instituto Adolfo
Lutz approved this study. All patients in group II gave informed written consent to
participate in this protocol.
Mice and parasites. T. gondii tachyzoites (strain RH) were maintained in Swiss
mice by intraperitoneal inoculation. Every 2 or 3 days after infection, the peritoneal
fluids from infected mice were collected in phosphate-buffered saline (PBS), pooled,
and centrifuged at 1,000 ⫻ g for 10 min. The parasite pellets were washed twice,
counted, and suspended in PBS at concentration of 2 ⫻ 107 cells/ml.
Antigens and immunological tests. For IF, the tachyzoites were incubated in
2% buffered formalin for 30 min at 37°C, washed twice in PBS at 1,000 ⫻ g for 10
min, and fixed on glass slides. For ELISA, the tachyzoites were frozen and heated.
The crude antigen was dissolved in PBS, and the protein concentration was determined. The IF and ELISA were carried out as previously described (8). CSF samples
were used in serial dilutions and assayed in duplicate. The presence of IgM antibodies in newborns’ samples from group I was investigated by both assays.
DNA purification. DNA molecules were extracted from whole CSF samples
sent to the laboratory. Samples were centrifuged for 10 min at 3,000 ⫻ g. CSF
supernatants were used in immunological tests for anti-T. gondii antibody determination. Packed cells were washed twice in PBS to prevent the action of any Taq
polymerase inhibitor. Whole cells were lysed by incubation for 5 min at 100°C in 50
␮l of ultrapure water containing 20 ␮g of RNase/ml. As a positive control, DNA was
extracted from the tachyzoites of infected mice. The cell pellets were digested with
proteinase K (100 ␮g/ml) in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA, 2% sodium
dodecyl sulfate and incubated for 2 h at 56°C. DNA was extracted by the phenol–
chloroform-isoamylalcohol method and precipitated with isopropanol (42). After
being washed with 70% ethanol for 10 min at 5,000 ⫻ g, the DNA pellet was
dissolved in ultrapure water containing 20 ␮g of RNase/ml. The DNA concentrations were determined at an optical density of 260 nm.
PCR. The amplifications were carried out with a kit purchased from Amersham-Pharmacia Biotech. The PCR beads were composed of 1.5 U of Taq DNA
polymerase, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 mM of
each deoxynucleoside triphosphate, and stabilizers such as bovine serum albumin. Each reaction was performed by the addition of 10 ␮l of each DNA template
and 50 pmol of each primer in a final volume of 25 ␮l. The primer pair used was B22
and B23, which amplified a 115-bp sequence in a specific repetitive region of the B1
gene (6, 7). The amplifications were performed in an automated thermal cycler
(Progene) and consisted of one initial cycle of denaturation for 5 min at 95°C and 35
cycles each consisting of denaturation at 95°C for 1 min, annealing at 62°C for 30 s,
and extension at 72°C for 1 min. The procedure was completed by a final cycle
extension for 10 min. Each amplification run contained two negative controls (ultrapure water and toxoplasmosis-negative CSF sample) and a positive control. After
the thermal cycles, the amplicons were electrophoresed in a 2% agarose gel and
stained with ethidium bromide. The DNA fragments were visualized under UV
illumination (42). To standardize the procedure, different DNA concentrations and
thermal cycles were tested (data not shown).
RESULTS
The first step of our study was to establish a simple and
economical procedure to recover most of the DNA present in
CSF samples. The samples were centrifuged to recover all cells
and washed to remove any Taq polymerase inhibitor. Heat and
hydrolysis lysed the pellet cells. Under the conditions described in Materials and Methods, the primer pair from the B1
gene amplified a 115-bp sequence from the DNA template.
The next step was to investigate the presence of T. gondii
DNA by PCR in 68 CSF samples from group I patients. The
samples were from newborns and adults with serious neurological symptoms but without a definitive clinical diagnosis.
Among these samples, 42 presented antibodies against T. gondii, including IgM or IgG detected by IF and 39 samples with
antibodies detected by ELISA. T. gondii was detected by PCR
in 44 CSF samples. IF was negative with 26 samples and
ELISA was negative with 29 samples. PCR was negative with
24 CSF samples. Samples from all patients with cerebral toxoplasmosis from group II presented IgG antibodies against T.
gondii determined by ELISA, IF, and positive PCR. On the
other hand, of 18 samples from AIDS patients without cerebral
toxoplasmosis, 4 (22.2%) samples presented IgG antibodies
against T. gondii and 1 (5.6%) was positive for T. gondii by
PCR. A summary of these results, including IF, ELISA, and
PCR methodologies, is shown in Table 1.
As the definitive diagnosis was not reached for group I
patients, PCR sensibility and specificity were evaluated using
the IF as a “gold standard” for detecting T. gondii infection, as
established previously (8). The values obtained are shown in
Table 2. The 42 reagent samples determined to be positive by
IF were also positive by PCR, presenting a sensitivity of 100%.
Among the 26 nonreagent CSF samples, 24 had negative PCR
results. In this case, two samples from AIDS patients had
positive PCR results, resulting in a specificity of 92.3%.
PCR sensibility and specificity in group II samples were
evaluated with Centers for Disease Control and Prevention
criteria as the gold standard (9, 10); PCR sensibility and specificity are described in detail in Materials and Methods. The
values obtained are shown in Table 3. Samples obtained from
VOL. 42, 2004
PCR ASSAY FOR DIAGNOSIS OF CEREBRAL TOXOPLASMOSIS
TABLE 2. Group I infection analysis of PCR assay sensitivity and
specificity, considering IF results
CSF sample source
No. of
positive
results
by IF
PCR result
No. of
patients
Positivea
Negativeb
Newborns
Adult AIDS patients
29
39
20 (100%)
24 (100%)
9 (100%)
15 (88.2%)
20
22
Total
68
44 (100%)
24 (92.3%)
42
a
b
The values in parentheses are percent sensitivity.
The values in parentheses are percent specificity.
all 12 AIDS patients with cerebral toxoplasmosis presented
positive PCR results, giving a sensitivity of 100%. A sample
from 1 of the 18 AIDS patients with other neurological diseases presented a positive PCR. These data resulted in a specificity of 94.4%.
DISCUSSION
The introduction of HAART resulted in the decline of incidence of opportunistic infections in the CNS (41). However,
cerebral toxoplasmosis still results in high levels of morbidity
and mortality in developing countries (33, 44, 45). In addition,
atypical forms of cerebral toxoplasmosis have been described
in the HAART era (20). These data show the importance of
evaluating a sensitive, inexpensive, and rapid diagnostic test.
This study evaluated the usefulness of a PCR assay with B1
gene sequences as primers to detect T. gondii DNA in CSF
samples from Brazilian patients with cerebral toxoplasmosis.
We chose these primers because they were able to amplify and
detect the DNA of a single organism directly from a crude cell
lysate or 10 parasites in the presence of 100,000 human leukocytes (6).
We found PCR sensitivity to be higher than other studies
have. Data from most previously published studies showed
moderate sensitivity and high specificity (13, 16, 28, 35, 36, 39,
43). Our data, studying Brazilian AIDS patients with neurological involvement, presented a sensitivity of 100% in both
groups and specificity of 92 and 94% for groups I and II,
respectively. Two samples in group I presented false-positive
results, and a sample in group II from one patient with cryptococcal meningitis had PCR results that were positive for
toxoplasmosis.
TABLE 3. Group II disease analysis of PCR sensitivity and
specificity, considering chemotherapy response and
clinical and radiological diagnoses
PCR result
No. of
patients
Adult AIDS patients with:
Cerebral
toxoplasmosis
Other neurological
diseases
Positive
Negative
13
17
12 (100%)a
0
1
17 (94.4%)b
Total
30
12
18
a
b
The values in parentheses are percent sensitivity.
The values in parentheses are percent specificity.
4767
Variations in technical procedure between different laboratories can affect PCR results (11). We believe that some conditions contributed to raise sensitivity with our PCR assay. The
first step was to establish a simple procedure to recover most of
the DNA present in the samples. CSF collection is invasive,
principally in children; normally, laboratories use small volumes (sometimes only 0.1 ml) from newborns to diagnose
different infections. The CSF contains few cells, and the DNA
molecules are easily released with water and heat. However,
when the DNA molecules were extracted by the phenol–chloroform-isoamylalcohol method, DNA concentrations were
very low and no or a small amount of DNA amplification was
observed (data not shown). The second step was to determine
whether any Taq polymerase inhibitor could change the results. PCRs were performed with a mixture of a negative DNA
sample with positive DNA (from a positive control) as a template. The results were positive, showing that no substance
present in DNA samples inhibits the reaction.
After procedure standardization with samples from group I
patients, the second step was to collect CSF samples from
group II patients. Knowledge of the specific treatment and the
sample collection during the first week of specific therapy is an
important tool for PCR sensitivity (34, 40). In agreement, we
only collected CSF samples from patients who had received
anti-toxoplasmosis treatment up to day 3. The high sensitivity
found here could also be explained by the presence of severe
neurological involvement in most of the patients studied and
by the high prevalence of toxoplasmosis in Brazil (12, 32).
The presumptive diagnosis of cerebral toxoplasmosis in
AIDS patients consists of the presence of less than 200 CD4⫹
T lymphocytes/␮l, anti-T. gondii IgG antibodies in the serum,
consistent clinical features, characteristic neuroimaging studies, and a positive response to empirical specific therapy (10).
Failure to respond to therapy is indicated by the persistence or
worsening of either clinical symptomatology or the mass lesions observed by diagnostic stereotactic biopsy. In addition,
negative toxoplasmosis serology and a single lesion on radiographic imaging are sufficient to perform a biopsy (2, 19). In
recent years, brain biopsies have been replaced by molecular
approaches, including the use of PCR in focal brain lesion
diagnosis, for AIDS patients. This minimally invasive approach
has been evaluated principally to detect Epstein-Barr virus
DNA or JC virus DNA, as a useful tool for the rapid diagnosis
of primary CNS lymphoma or progressive multifocal leukoencephalopathy, respectively (3, 4). We believe that the data
presented here emphasize the applicability of these approaches.
The IF and ELISA detected anti-T. gondii antibodies in
samples from 4 of 18 patients without cerebral toxoplasmosis
(group II). This finding could be explained, in part, by the high
prevalence of toxoplasmosis in the Brazilian population. The
sensitivity to both serological methods was also high in samples
from this group. These findings suggest and confirm other
studies (1, 37, 38) in which the association of both PCR and
serological methods can be a good tool for early diagnosis and
timely therapy.
In conclusion, this study demonstrates the importance of
including PCR in cerebral toxoplasmosis diagnosis in AIDS
patients, because neurological problems caused by opportunist
diseases still remain a serious problem in developing countries.
4768
VIDAL ET AL.
J. CLIN. MICROBIOL.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Aurea Célia S. Guimarães and Massami Kawarabayashi,
Toxoplasmosis Laboratory, Instituto Adolfo Lutz, for carrying out the
serological diagnosis in samples from group I.
This work was partially supported by grants from the Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 03/12307-1) and
the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq).
21.
22.
23.
24.
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Anexo 6- Colombo FA, Vidal JE, Penalva de Oliveira AC, Hernández AV,
Bonasser-Filho F, Nogueira RS, Focaccia R, Pereira-Chioccola
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Copyright © 2005, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Vol. 43, No. 10
Diagnosis of Cerebral Toxoplasmosis in AIDS Patients in Brazil:
Importance of Molecular and Immunological Methods
Using Peripheral Blood Samples
Fabio A. Colombo,1 José E. Vidal,2 Augusto C. Penalva de Oliveira,3 Adrián V. Hernandez,4
Francisco Bonasser-Filho,2 Roberta S. Nogueira,2 Roberto Focaccia,2 and
Vera Lucia Pereira-Chioccola1*
Department of Parasitology, Instituto Adolfo Lutz,1 and Departments of Infectious Disease2 and Neurology,3
Instituto de Infectologia Emı́lio Ribas, Sao Paulo, SP, Brazil, and
Erasmus Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands4
Received 9 May 2005/Returned for modification 21 June 2005/Accepted 5 July 2005
Cerebral toxoplasmosis is the most common cerebral focal lesion in AIDS and still accounts for high
morbidity and mortality in Brazil. Its occurrence is more frequent in patients with low CD4ⴙ T-cell counts. It
is directly related to the prevalence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in the population. Therefore, it is
important to evaluate sensitive, less invasive, and rapid diagnostic tests. We evaluated the value of PCR using
peripheral blood samples on the diagnosis of cerebral toxoplasmosis and whether its association with immunological assays can contribute to a timely diagnosis. We prospectively analyzed blood samples from 192 AIDS
patients divided into two groups. The first group was composed of samples from 64 patients with cerebral
toxoplasmosis diagnosed by clinical and radiological features. The second group was composed of samples
from 128 patients with other opportunistic diseases. Blood collection from patients with cerebral toxoplasmosis
was done before or on the third day of anti-toxoplasma therapy. PCR for T. gondii, indirect immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbent assay, and an avidity test for toxoplasmosis were performed on all
samples. The PCR sensitivity and specificity for diagnosis of cerebral toxoplasmosis in blood were 80% and
98%, respectively. Patients with cerebral toxoplasmosis (89%) presented higher titers of anti-T. gondii IgG
antibodies than patients with other diseases (57%) (P < 0.001). These findings suggest the clinical value of the
use of both PCR and high titers of anti-T. gondii IgG antibodies for the diagnosis of cerebral toxoplasmosis.
This strategy may prevent more invasive approaches.
Toxoplasma gondii infection occurs worldwide, and it is one
of the most common infections in humans. The infection is
mainly acquired by ingestion of undercooked or raw meat
containing viable tissue cysts or by ingestion of food and water
that is contaminated with oocysts shed by cats. The course of
the primary infection is usually subclinical. The vast majority of
the infected human population remains asymptomatic, and
some patients present mild symptoms. However, the infection
can cause significant morbidity and mortality. The reactivation
of latent infection occurs in immunocompromised patients,
causing life-threatening disease, especially encephalitis (14,
19).
Cerebral toxoplasmosis is one of the most common opportunistic neurological infections in AIDS patients, and it is typically observed in the later stages of human immunodeficiency
virus (HIV) infection (26). It is also directly related to the
prevalence of anti-T. gondii antibodies in the general population (21).
The introduction of highly active antiretroviral therapy
(HAART) has decreased the incidence of cerebral toxoplasmosis. Currently, the prevalence of AIDS-related focal brain
disorders still accounts for a considerable proportion of mor-
tality and morbidity, especially in developing countries (33). In
Brazil, cerebral toxoplasmosis is the most common cerebral
focal lesion in AIDS patients, and it is the third most frequent
AIDS-defining condition (37). In clinical practice, treatment
for cerebral toxoplasmosis is usually initiated upon a presumptive diagnosis, which is based on clinical and radiological features (12, 27).
During the last decade, significant progress has been made
in immunological and molecular techniques for the diagnosis
of infectious diseases. Several studies, have demonstrated the
usefulness of PCR on cerebrospinal fluid (CSF) samples for
the diagnosis of cerebral toxoplasmosis (11, 15, 23, 30, 36, 38).
However, a lumbar puncture could be contraindicated in a
subgroup of patients with expansive cerebral lesions (10). In
this setting, peripheral blood samples present an additional
advantage.
In this study, we evaluated the immunological and molecular
diagnosis of cerebral toxoplasmosis using peripheral blood
samples from Brazilian AIDS patients.
MATERIALS AND METHODS
Patients and blood samples. We analyzed blood samples from 192 AIDS
patients admitted and treated at the Instituto de Infectologia Emilio Ribas, São
Paulo, Brazil. The patients were divided into two groups. Group I consisted of 64
patients with cerebral toxoplasmosis, defined by the Centers for Disease Control
and Prevention criteria. The criteria for AIDS-related cerebral toxoplasmosis
included clinical and radiological features: (i) recent onset of a consistent focal
neurological abnormality with intracranial disease or reduced level of conscious-
* Corresponding author. Mailing address: Laboratório de Parasitologia, Instituto Adolfo Lutz, Av. Dr Arnaldo, 355 8° andar, CEP
01246-902, São Paulo, SP, Brazil. Phone: 55 11 3068 2889. Fax: 55 11
3068 2890. E-mail: [email protected].
5044
VOL. 43, 2005
CEREBRAL TOXOPLASMOSIS IN AIDS PATIENTS IN BRAZIL
5045
TABLE 1. Blood sample results in IF, ELISA, and PCRa
No. of patients
Patient
groupb
Total
IF
Positive
ELISA
Negative
Positive
PCR
Negative
Positive
c
Negative
I
II
64
128
58
72
6
56
58
72
6
56
51
3d
13
125
Total
192
130
62
130
62
54
138
a
The predictive values were positive, 94.4%, and negative, 90.6%. The accuracy was 91.7%.
Group I, adults with AIDS and cerebral toxoplasmosis; group II, adults with AIDS and other opportunistic diseases.
Sensitivity, 79.7%.
d
Specificity, 97.7%.
b
c
ness; (ii) a lesion having a mass effect evidenced by brain imaging (on computed
tomography or magnetic resonance imaging) or a lesion whose radiographic
appearance was enhanced by injection of contrast medium. These diagnoses
were associated with a successful response to the specific treatment (7). Blood
samples were collected before or on the third day of specific therapy for toxoplamosis. Group II consisted of 128 patients with other diseases. Sixty-four
presented with neurological diseases: 25 with cryptococcal meningoencephalitis,
7 with progressive multifocal leukoencephalopathy, 14 with central nervous system tuberculosis, 12 with HIV-associated cognitive motor disorder, and 6 with
syphilitic meningitis. The other 64 patients presented with nonneurological diseases: 18 with pulmonary tuberculosis, 12 with bacterial pneumonia, 7 with oral
candidiasis, 5 with diffuse lymphoma, and 22 with Pneumocystis carinii pneumonia. Group II was considered the control group. The definitive diagnosis of these
patients was determined by clinical, radiological, and laboratory assessments.
From each patient, 10 ml of peripheral blood with EDTA was collected for DNA
extraction and 5 ml for immunological tests. No patient had been receiving
HAART before the blood sample collection. The institutional review boards of
the Ethics Committees of the Instituto de Infectologia Emilio Ribas and the
Instituto Adolfo Lutz approved this study. All patients gave informed written
consent.
Parasite preparation. T. gondii tachyzoites (RH strain) were grown and maintained in Swiss mouse ascites by intraperitoneal inoculation. Every 2 or 3 days
after infection, the peritoneal fluids from infected mice were collected in phosphate-buffered saline (PBS), pooled, and centrifuged at 1,000 ⫻ g for 10 min.
The parasite pellets were washed twice, counted, and suspended in PBS at a
concentration of 2 ⫻ 107 cells/ml.
Antigens and immunological tests. Indirect immunofluorescence (IF) and
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were carried out as previously
described (38). Both tests determined the presence or absence of anti-T. gondii
immunoglobulin G (IgG) antibodies. Serum samples were used in serial dilutions
and assayed in duplicate. For IF, the tachyzoites were incubated in 2% buffered
formalin for 30 min at 37°C, washed twice in PBS at 1,000 ⫻ g for 10 min, and
fixed on glass slides. The sera were diluted from 1:4 to 1:4,096, and the cutoff was
considered to be 1:16. For ELISA, T. gondii antigen was obtained by sonication.
The optical density (OD) cutoff was 0.143 at 492-nm wavelength. The starting
serum dilution was 1:500, and it was assayed up to 1:128,000. Intermediate titers
were considered to be between 1:32 and 1:512 in IF and between 1:500 and
1:2,000 in ELISA. High titers were considered to be up to 1:1,024 in IF and up
to 1:4,000 in ELISA. The cutoff of both reactions was determined after testing
100 reactive and 200 nonreactive sera (data not shown). The Toxoplasma-specific
IgG avidity assay was performed as described before (25, 28). The basic test used
was ELISA. The differences were that (i) each serum sample was analyzed in two
fourfold titration rows at a dilution of 1:500 and (ii) after 1 hour of incubation at
37°C, the first row was washed three times with 250 ␮l of 6 M urea in phosphatebuffered saline containing 0.05% Tween 20 in order to remove low-avidity antibodies from their binding sites. The control row was washed three times with
buffer without urea. The IgG avidity index was calculated as the following ratio:
(OD values under dissociative conditions)/(OD values of untreated control without urea) ⫻ 100. A low avidity index (ⱕ15%) represented the predictive value for
an infection of less than 5 months, and an index between 15 and 30% represented
the predictive value for an infection of more than 5 months. A high avidity index
(over 30%) determined a chronic infection.
DNA purification. The blood samples were centrifuged and washed with phosphate-buffered saline at 3,000 ⫻ g for 10 min. The supernatants with plasma were
discarded. In order to lyse the erythrocytes, the packed cells were mixed with a
3⫻ volume of a buffer containing 150 mM ammonium chlorate, 1 mM potassium
bicarbonate, 0.1 mM EDTA, pH 7.3; incubated for 15 min at room temperature
with mild shaking; and centrifuged for 10 min at 3,000 ⫻ g. The pellet, containing
only the cells with nucleus, were digested with proteinase K (100 ␮g/ml) in
50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate and
incubated for 30 min at 56°C. DNA was extracted by the phenol-chloroform–
isoamyl alcohol method and precipitated with isopropanol (35). After being
washed with 70% ethanol for 10 min at 5,000 ⫻ g, the DNA pellet was dissolved
in ultrapure water containing RNase at 20 ␮g/ml. For positive controls, DNA was
extracted from tachyzoites of infected mice. The DNA concentrations were
determined as the OD at 260 nm.
PCR. The amplifications were carried out with a kit from Amersham-Pharmacia-Biotech (Little Chalfont, Buckinghamshire, England) as described before
(38). The primer pair used was B22 and B23, which amplified a 115-base-pair
sequence in a specific repetitive region of the B1 gene (5, 6). Each amplification
run contained two negative controls (ultrapure water and a negative DNA for
toxoplasmosis) and one positive control. After the thermal cycles, the amplicons
were electrophoresed in a 2% agarose gel and stained with ethidium bromide.
The DNA fragments were visualized under UV illumination (35).
Statistical analysis. Predictive values, accuracy, sensitivity, specificity, and
chi-square tests were performed with SPSS 10.0 software.
RESULTS
The results of the serological and molecular tests are shown
in Table 1. In group I, 58 (91%) of the 64 patients with cerebral
toxoplasmosis had detectable Toxoplasma-specific antibodies.
T. gondii DNA was detected by PCR in 51 (79.7%) of 64 blood
samples. In group II, 72 (56%) of 128 AIDS patients without
cerebral toxoplasmosis had Toxoplasma-specific IgG antibodies. Three of the 128 patients were found to be PCR positive.
Two of the three were Toxoplasma antibody positive. Positive
and negative predictive values for PCR were 94.4% and 90.6%,
respectively, with 91.7% accuracy. In both groups, all patients
with Toxoplasma-specific antibodies presented high avidity indexes. Figure 1 presents data on the levels of antibody detection in both groups. Patients with cerebral toxoplasmosis
(89%) presented higher titers of anti-T. gondii IgG antibodies
than patients with other diseases (57%) (P ⬍ 0.001).
DISCUSSION
During the first years of the HAART era, the incidence of
cerebral toxoplasmosis had declined in AIDS patients (2).
However, at present, its occurrence still represents a determinant of a poor diagnosis in the natural history of HIV-infected
patients, even in the HAART era (3). Cerebral toxoplasmosis
has caused high morbidity and mortality, particularly in Brazilian AIDS patients (37). For these reasons, it is necessary to
evaluate accurate, less invasive, and rapid diagnostic tools.
5046
COLOMBO ET AL.
FIG. 1. Serum sample distributions of the results of IF and ELISA
methods. The samples are from group I (above) and from group II
(below). Each serum titer was calculated as the inverse dilution. neg,
negative.
The evaluation of molecular diagnosis in cerebral toxoplasmosis is normally done in CSF samples. In general, the sensitivity of the PCR test is extremely variable (11.5 to 100%), but
the specificity is high (96 to 100%) (9, 11, 15, 29, 30, 36, 38).
Nevertheless, CSF collection is invasive and is inappropriate in
a subset of patients with expansive cerebral lesions.
PCR in peripheral blood samples has also been used with
several reported sensitivities (16 to 86%) (4, 16, 17, 24, 31, 32).
In addition, methodologies have been developed using different sets of primers for different DNA targets and small numbers of samples (4, 38). The present study presents good sensitivity and specificity (80% and 98%, respectively) using a
considerable number of samples (from 192 AIDS patients).
The sensitivity and specificity percentages were similar to those
in a previous study by our group using CSF samples (38), even
though DNA extraction from the blood samples was more
complex than from CSF samples. These results may be explained as follows. First, the usefulness of the PCR assay using
the B1 gene sequences as primers for detection of T. gondii
DNA has been demonstrated (5, 20, 22, 38). B22 and B23
primers were able to amplify and detect the DNA of a single
organism directly from a crude cell lysate or 10 parasites in the
presence of 100,000 human leukocytes (5). The high sensitivity
and specificity of this primer pair were previously reported in
comparison with other T. gondii sequence primers (8). Second,
J. CLIN. MICROBIOL.
all blood samples from patients with cerebral toxoplasmosis
were collected before or on day 3 of specific therapy. Previous
studies reported that anti-Toxoplasma therapy decreases diagnosis sensitivity, especially if samples are collected after the
first week of treatment (9). Finally, most of the studied patients
with cerebral toxoplasmosis presented severe immunodeficiency (less than 200 CD4⫹ T lymphocytes/␮l). Some of them
also presented disseminated forms and probably great parasite
burdens. In this setting, performing PCR on blood samples
seems to be more sensitive (24). Three patients without cerebral toxoplasmosis presented positive PCR results. Two of
them with cryptococcal meningoencephalitis were Toxoplasma
antibody positive. Another, with progressive multifocal leukoencephalopathy, was Toxoplasma antibody negative. We
cannot exclude the possibility that these patients carried T.
gondii and other microorganisms in their blood.
The laboratory conditions are also essential to raise PCR
sensitivity and specificity in peripheral blood. To avoid false
results and the action of any Taq polymerase inhibitor, three
conditions are important: (i) the blood samples must be collected with EDTA and be processed rapidly, (ii) the plasma
must be removed and the erythrocytes lysed rapidly with a
specific buffer, and (iii) the lysed cells must be removed before
lysis of cells with nucleus for DNA extraction. To determine
whether any Taq polymerase inhibitor could change the actual
results, PCRs were performed using a mixture of a negative
DNA sample with a positive DNA (from the positive control)
as a template. A positive result confirmed the absence of inhibitory substances.
Earlier studies showed that different levels of anti-T. gondii
IgG antibodies were unable to determine a reactivation or to
follow the course of cerebral toxoplasmosis (26, 27, 34). However, others have suggested that high titers in patients might be
indicative of the presence of cerebral toxoplasmosis or a higher
risk of developing the disease (13, 18). Despite these controversial data, our results confirm the clinical utility of measuring
anti-T. gondii IgG antibody levels in the diagnosis of cerebral
toxoplasmosis. Patients with cerebral toxoplasmosis presented
significantly higher anti-T. gondii IgG titers measured by IF
and ELISA than patients without cerebral toxoplasmosis. Although these antibodies suggest the neurological disease, all
patients presented high-avidity IgG antibodies. These data
support the idea that the reactivation of the latent infection
observed in immunocompromised patients occurs in the secondary immune response (28).
The majority of patients with cerebral toxoplasmosis seem to
develop high titers of anti-T. gondii antibodies, as confirmed
here and by others (13, 18). However, six patients from group
I presented positive PCR and negative ELISA and IF results
(for both IgG and IgM antibodies). Thus, we emphasize that a
negative serological result does not exclude a positive diagnosis
(3, 34).
In conclusion, our results suggest that quantitative serology
and PCR in blood can be useful in cerebral toxoplasmosis
diagnosis. Although a definitive diagnosis of cerebral toxoplasmosis requires the demonstration of parasites by a histopathological procedure, the clinical and radiological data could be
complemented by a less invasive approach, such as molecular
and immunological diagnoses.
VOL. 43, 2005
CEREBRAL TOXOPLASMOSIS IN AIDS PATIENTS IN BRAZIL
ACKNOWLEDGMENTS
We thank M. C. D. S. Fink and C. S. Pannuti from Virology Laboratory, Instituto de Medicina Tropical, USP, for carrying out the JC
virus diagnosis.
This work was supported by a grant from Fundaçao de Amparo à
Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP-03/12307-1). F.A.C. and
J.E.V. contributed equally to this work and were supported by fellowships from “Coordenaçao de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nı́vel
Superior (CAPES) do Ministério da Educaçao do Brazil”.
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Anexo 7 – Prêmio de 1° lugar na Área temática: AIDS, do XLI Congresso da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical e I Encontro de
Medicina Tropical do Cone Sul, em 2005
Anexo 8 – Carta de informação ao paciente e termo de consentimento livre e
esclarecido
Carta de Informações ao Paciente
Nome do estudo: Títulos altos de anticorpos IgG contra
Toxoplasmose gondii e reação em cadeia da polimerase no sangue no
diagnóstico da toxoplasmose cerebral em pacientes com AIDS: um
estudo de caso controle.
Você (ou seu familiar ) foi admitido neste hospital devido a uma doença
infecciosa conhecida como toxoplasmose cerebral. A toxoplasmose é causada por um
parasita chamado Toxoplasma gondii que acomete principalmente o cérebro e
manifesta-se com alterações do sistema nervoso como dor de cabeça, convulsões,
fraqueza, sonolência, confusão, dentre outras.
A suspeita diagnostica da toxoplasmose utiliza dados clínicos e das
imagens do cérebro (tomografia computadorizada ou ressonância nuclear magnética),
a qual demonstra geralmente várias lesões tumorais no cérebro. Duas semanas depois
de iniciado o tratamento para essa doença a grande maioria dos pacientes apresentam
melhora nas suas queixas e também nas imagens do cérebro. Um pequeno grupo de
pacientes não melhora com o tratamento, sendo necessário a realização de uma
biópsia do cérebro ( que consiste em retirar um pequeno fragmento do cérebro para
seu posterior estudo), procedimento que tem como principal risco o sangramento,
porém que oferece a oportunidade de fazer o diagnostico e ajudar a tratar a doença.
Estamos realizando uma pesquisa com o objetivo de demonstrar a utilidade de
alguns exames que possam ajudar a diagnosticar a toxoplasmose de uma forma
rápida e segura, tentando evitar a realização de procedimentos mais agressivos como
a punção das costas (para obter liquido da espinha) ou as biópsias de cérebro.
Esta pesquisa envolve a coleta de amostra de sangue em pacientes com
toxoplasmose cerebral internados no hospital e em indivíduos que não tem a doença.
As amostras de sangue permitirão estabelecer a utilidade das provas que estamos
avaliando. Serão necessários que 60 pacientes com toxoplasmose cerebral e 60
pacientes sem toxoplasmose cerebral participem deste estudo para chegarmos as
conclusões necessárias.
Somente no final do estudo poderemos concluir a presença de algum benefício dos
exames que estamos avaliando.
O objetivo deste termo é convida-lo (você ou seu parente) a participar da
pesquisa. Caso você aceite participar, será colhida uma amostra de sangue de 15ml,
que servirá apenas e tão somente para o processamento dos exames que estamos
estudando.
O seu tratamento prosseguirá normalmente a cargo dos médicos que lhe
acompanham, e não será modificado de maneira alguma caso você participe ou não
da pesquisa.
Todas as informações coletadas serão mantidas confidencialmente. Os dados
serão armazenados em um computador sem identificação, e seu nome não aparecerá
em nenhuma publicação. Você poderá ter acesso aos resultados dos seus exames
colhidos durante o estudo, bem como terá acesso, se assim desejar, as publicações
pertinentes. Este estudo foi revisado e aprovado por um Comitê de Ética em Pesquisa
e está de acordo com a Declaração de Helsinque que regulamenta a pesquisa médica
em humanos.
A sua participação neste estudo é voluntária. Este estudo não implica
qualquer ônus para o paciente, assim como não trará nenhuma despesa financeira por
sua participação.
Caso você decida não participar, os cuidados médicos que você recebe não
serão afetados de qualquer forma. Caso você aceita participar, você poderá retirar-se
do estudo em qualquer momento, sem afetar os cuidados médicos.
Por favor, sinta-se a vontade para discutir qualquer aspecto referente a esta
protocolo com os médicos pesquisadores responsáveis por este estudo Dr. José Vidal
Bermúdez ( telefone 9588-8756, email: [email protected]), ou Dr.
Augusto
Cesar
Penalva
de
Oliveira
(telefone
9933-2917,
e-mail:
[email protected]).
Adicionalmente, você poderá contatar o Comitê de Ética em Pesquisa do
Instituto de Infectologia Emílio Ribas através do telefone 3896-1281.
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Eu, abaixo assinado, afirmo que li na íntegra e entendi completamente a
Carta de Informações. Concordo que as informações a respeito de minha condição
médica e os resultados obtidos através de meu sangue podem ser usadas neste estudo.
Entendo que mediante qualquer duvida relacionado a este estudo poderei discutir
com os Drs. José Vidal Bermúdez e Augusto César Penalva de Oliveira. Minha
participação é voluntária e livre de qualquer tipo de pressão ou coação. Da mesma
maneira, poderei me desligar do estudo em qualquer fase de evolução, sem qualquer
penalidade ou ônus ao meu atendimento pela Instituição.
Eu entendo que as informações serão confidencias e que meu nome não será
mencionado em qualquer publicação deste estudo.
Nome:_____________________________________________________
Assinatura:___________________________________________________________
Data:___/___/___
Nome do investigador :__________________________________________
Assinatura:___________________________________________________________
Data:___/___/___
Se o paciente não puder assinar:
Nome do representante:_________________________________________________
Grau de parentesco: ____________________________________________________
Assinatura:___________________________________________________________
Data:___/___/___