UTILIZAÇÃO DE PCR MULTIPLEX PARA DETERMINAÇÃO DE SCCmec EM Staphylococcus aureus RESISTENTE À METICILINA DE ISOLADOS CLÍNICOS. (1 ESPAÇO OBRIGATÓRIO) Oliveira, C. F.1; Gomes, L. V. P. G.1; Santos, J. P.1; Morey, A. T.1; Ferreira, A. R. M.2; Perugini, M. R. E.2; Yamada-Ogatta, S. F.1* 1 Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Paraná, Brasil. 2 Departamento de Patologia, Análises Clínicas e Toxicológicas, Hospital Universitário de Londrina, Paraná, Brasil. *e-mail: [email protected] (1 ESPAÇO OBRIGATÓRIO) O aumento e a disseminação de microrganismos multirresistentes (MR) em ambiente hospitalar é uma das grandes preocupações em saúde na atualidade. Vários estudos multicêntricos de vigilância têm relatado o aumento de infecções hospitalares por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (Methicillin-resistant S. aureus – MRSA). A resistência aos β-lactâmicos em S. aureus é devido à produção de proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) alteradas (PBP2’ ou PBP2a) com baixa afinidade aos β-lactâmicos, codificadas pelo gene mecA. O mesmo encontra-se inserido em uma região do DNA exógeno, conhecida como cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec – staphylococcal cassete chromosome mec). O presente trabalho avaliou diferentes tipos de SCCmec pela PCR multiplex, utilizando 11 oligonucleotídeos iniciadores, selecionados com base nas sequências do elemento mec. O DNA genômico foi extraído por fervura e para a reação de amplificação foi utilizada a seguinte mistura de reagentes: 13,5μl de água ultra pura, 2,5μl de tampão de reação da Taq DNA polimerase, 0,5μl de dNTP (10mM), 1,0μl de Taq DNA polimerase (6U), 2,0μl de DNA molde (100ng) e 0,5μl de cada oligonucleotídeo iniciador em concentrações previamente definidas. A reação de amplificação seguiu o seguinte programa: 4min a 94 °C, seguidos por 30 ciclos de 30s a 94 °C, 30s a 55 °C e 1min a 72 °C. O programa terminou com uma extensão adicional de 4min a 72 °C. Como controles positivos para os diferentes tipos de SCCmec foram utilizados cepas de MRSA contendo SCCmec tipos I, II, III e IV, e como controle negativo foi utilizado água ultra pura. Após a reação de amplificação os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,0% em tampão Tris-BoratoEDTA (TBE) a 100 V e corados com GelRedTM. Como padrão de peso molecular foi utilizado marcador de 100 pb. A partir do padrão de amplificação obtido, pode-se concluir que o protocolo está otimizado, podendo ser aplicado para determinação de SCCmec em isolados de MRSA. (1 ESPAÇO OBRIGATÓRIO) Palavras-chaves: Staphylococcus aureus, resistência, MRSA, mecA. Suporte financeiro: CAPES, CNPq, Fundação Araucária, PROPPG/E Àrea de conhecimento: Microbiologia Médica