UTILIZAÇÃO DE PCR MULTIPLEX PARA DETERMINAÇÃO DE

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UTILIZAÇÃO DE PCR MULTIPLEX PARA DETERMINAÇÃO DE SCCmec EM
Staphylococcus aureus RESISTENTE À METICILINA DE ISOLADOS CLÍNICOS.
(1 ESPAÇO OBRIGATÓRIO)
Oliveira, C. F.1; Gomes, L. V. P. G.1; Santos, J. P.1; Morey, A. T.1; Ferreira, A. R. M.2;
Perugini, M. R. E.2; Yamada-Ogatta, S. F.1*
1
Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Paraná, Brasil.
2
Departamento de Patologia, Análises Clínicas e Toxicológicas, Hospital Universitário de
Londrina, Paraná, Brasil. *e-mail: [email protected]
(1 ESPAÇO OBRIGATÓRIO)
O aumento e a disseminação de microrganismos multirresistentes (MR) em ambiente
hospitalar é uma das grandes preocupações em saúde na atualidade. Vários estudos
multicêntricos de vigilância têm relatado o aumento de infecções hospitalares por
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (Methicillin-resistant S. aureus – MRSA). A
resistência aos β-lactâmicos em S. aureus é devido à produção de proteínas ligadoras de
penicilina (PBPs) alteradas (PBP2’ ou PBP2a) com baixa afinidade aos β-lactâmicos,
codificadas pelo gene mecA. O mesmo encontra-se inserido em uma região do DNA exógeno,
conhecida como cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec – staphylococcal cassete
chromosome mec). O presente trabalho avaliou diferentes tipos de SCCmec pela PCR
multiplex, utilizando 11 oligonucleotídeos iniciadores, selecionados com base nas sequências
do elemento mec. O DNA genômico foi extraído por fervura e para a reação de amplificação
foi utilizada a seguinte mistura de reagentes: 13,5μl de água ultra pura, 2,5μl de tampão de
reação da Taq DNA polimerase, 0,5μl de dNTP (10mM), 1,0μl de Taq DNA polimerase (6U),
2,0μl de DNA molde (100ng) e 0,5μl de cada oligonucleotídeo iniciador em concentrações
previamente definidas. A reação de amplificação seguiu o seguinte programa: 4min a 94 °C,
seguidos por 30 ciclos de 30s a 94 °C, 30s a 55 °C e 1min a 72 °C. O programa terminou com
uma extensão adicional de 4min a 72 °C. Como controles positivos para os diferentes tipos de
SCCmec foram utilizados cepas de MRSA contendo SCCmec tipos I, II, III e IV, e como
controle negativo foi utilizado água ultra pura. Após a reação de amplificação os produtos de
PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,0% em tampão Tris-BoratoEDTA (TBE) a 100 V e corados com GelRedTM. Como padrão de peso molecular foi utilizado
marcador de 100 pb. A partir do padrão de amplificação obtido, pode-se concluir que o
protocolo está otimizado, podendo ser aplicado para determinação de SCCmec em isolados de
MRSA.
(1 ESPAÇO OBRIGATÓRIO)
Palavras-chaves: Staphylococcus aureus, resistência, MRSA, mecA.
Suporte financeiro: CAPES, CNPq, Fundação Araucária, PROPPG/E
Àrea de conhecimento: Microbiologia Médica
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