CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE INDIVÍDUOS
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UNIVERSIDADE CEUMA-UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA THAYANNE FRANÇA MUNIZ CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax NO MUNICÍPIO DE CRUZEIRO DO SUL (AC) São Luís – MA 2015 1 THAYANNE FRANÇA MUNIZ CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax NO MUNICÍPIO DE CRUZEIRO DO SUL (AC) Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientador: Prof. Dr. – Marcos Augusto Grigolin Grisotto São Luís – MA 2015 2 THAYANNE FRANÇA MUNIZ Caracterização imunológica de indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax no município de Cruzeiro do Sul (AC) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou o candidato: ( ) APROVADO ( ) REPROVADO 1) Examinador __________________________________ 2) Examinador ___________________________________ 3) Examinador ___________________________________ 4) Presidente (Orientador)__________________________________ 3 Aos maiores incentivadores, que através da simplicidade sempre me proporcionaram os maiores aprendizados, meus pais. 4 AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus pelo dom da vida, por ser o autor e diretor da minha história, sem ti nada sou. Agradeço Pai, por me dá a graça de ter a mãe Maria, a qual sou devota pelo grande exemplo de fidelidade à Deus. Obrigada Nossa Senhora por interceder por mim. À minha família pelo reconhecimento e apoio, em especial aos meus pais, Gerson e Aurimar Muniz, que apesar das dificuldades, desde muito cedo me fizeram entender a necessidade de estudar. É por vocês que tento melhorar a cada dia e é para vocês o meu maior amor, cuidado e esforço. Aos meus pais de coração, tia Graça, tio Batista e Fábio Barros por toda a dedicação e acolhimento durante esses anos de convivência, como agradecer a disponibilidade de vocês? Só Deus pra lhes abençoar. Aos amigos fieis de infância, adolescência e/ou de vida muito obrigada pelas orações fervorosas, pelo companheirismo e pelo abrigo que nunca me deixaram desistir da concretização deste sonho. Em especial ao meu amigo-namorado Robson Gomes que esteve presente nos momentos mais difíceis e ofereceu palavras de encorajamento e carinho. A todos os professores do mestrado em Biologia Parasitária por contribuírem para minha formação profissional, em especial à Profª. Drª. Elisabeth Fernandes, ao Profº. Drº. Lídio Neto e ao Profº. Drº Silvio Monteiro que sempre se mostraram disponíveis às minhas muitas solicitações com paciência e profissionalismo. Ao Profº Drº. Claúdio Marinho e seus alunos Robrigo e Jamille que foram primordiais para a coleta das amostras e execução dos experimentos, obrigada pela atenção e esforço em nos ajudar. Ao meu orientador, Profº. Drº. Marcos Grisotto, meus sinceros agradecimentos pela confiança, compreensão, competência e inúmeros ensinamentos durante todo esse tempo de convivência. Obrigada por me fazer acreditar no meu potencial, quando eu mesma duvidei. Prof. este trabalho é fruto da sua perseverança e do seu 5 profissionalismo. Mesmo que eu quisesse não tenho palavras pra agradecer tudo o que você já fez por mim. Aos amigos da turma de mestrado, por todos os momentos de alegrias e desespero que compartilhamos, mas que contribuíram para enriquecer os conhecimentos. Aos amigos mais que presentes do Laboratório de Imunologia, Cristiane Silva, Domingos Magno, Ione Cristina, João Rodrigues, Larissa Nina e Saulo José que embarcaram comigo nessa jornada, obrigada pelo apoio, pelas caronas e por todos os momentos de dificuldades e alegrias vivenciados dentro e fora do laboratório. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Maranhão (FAPEMA) pela concessão da bolsa de mestrado e pelo financiamento do projeto assim como a CAPES e CNPq. À Universidade Ceuma, pela infraestrutura e equipamentos necessários para a realização deste trabalho. Em especial à secretária do Mestrado em Biologia Parasitária, Erymônica Câmara, pela prontidão. Aos indivíduos controles e pacientes pela compreensão e colaboração, pois sem os mesmos seria impossível realizar essa pesquisa. Muito obrigada a todos que de alguma forma participaram da elaboração deste trabalho. 6 Se Deus disse que eu posso, então eu posso! Irei e não temerei mal algum. Filipenses 4: 13 7 RESUMO A malária é uma doença infecciosa aguda causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida ao homem pela picada da fêmea do mosquito Anopheles. Dentre as cinco espécies de Plasmodium que infectam seres humanos, P. falciparum e P. vivax são as mais prevalentes na região Amazônica. As mulheres grávidas são mais suscetíveis à infecção e alguns fatores podem aumentar a vulnerabilidade da gravidez, causando complicações para a mãe e para o feto. Muitos mecanismos imunológicos associados a essa doença ainda não são compreendidos, dessa forma este estudo tem por objetivo realizar um levantamento epidemiológico e a caracterização imunológica de indivíduos gestantes ou não, infectados pelo Plasmodium vivax em uma área de transmissão ativa de malária, o município de Cruzeiro do Sul (AC), em comparação com indivíduos sadios. Para tanto, dados epidemiológicos assim como, o sangue periférico de indivíduos infectados foram coletados para análise hematológica e realização de fenotipagem por citometria de fluxo, onde foram analisados marcadores de ativação, apoptose e a presença de células regulatórias. Além disso, amostras de plasma foram utilizadas para detecção de citocinas e avaliação do estresse oxidativo. Mulheres jovens, apresentando baixa parasitemia, porém com sintomas clássicos da infecção e já infectadas anteriormente foram os indivíduos mais acometidas pela malária. Os pacientes gestantes e não gestantes infectados apresentaram plaquetopenia e aumento na expressão de marcadores de ativação e de apoptose. A infecção também induziu o aumento da expressão de moléculas coestimulatórias (ICOS, OX40 e GITR) em células T, e o aumento das células regulatórias no sangue periférico de gestantes e não gestantes infectados pelo P.vivax. No plasma de infectados gestantes ou não, houve baixa produção das citocinas, porém foram detectadas as citocinas IL-6, IL-10 e IL-17. A produção de marcadores do estresse oxidativo não mostrou diferença significativa nos grupos analisados. Em conjunto, esses dados sugerem que a infecção pelo P. vivax promove mudanças hematológicas e imunológicas em gestantes e não gestantes, uma vez que altera significantemente a expressão de marcadores de ativação e apoptose nos linfócitos de infectados e paralelamente ocorre um aumento das células regulatórias e moléculas coestimulatórias. Estes resultados apontam para a necessidade gerar informações acerca dos mecanismos imunológicos na malária pelo P. vivax que poderão subsidiar o desenvolvimento de futuras pesquisas sobre essa temática e consequentemente novas medidas de intervenção. Palavras-chave: Plasmodium vivax, malária gestacional, Tregs, marcadores de ativação. 8 ABSTRACT Malaria is an acute infectious disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and transmitted by the bite of female Anopheles mosquito. Among the five species of Plasmodium that infect humans, P. falciparum and P. vivax are the most prevalent in the Amazon region. Pregnant are more susceptible to infection and some factors may increase the vulnerability of pregnancy, causing complications for the mother and the fetus. Many immunological mechanisms associated with this disease are not yet understood, therefore this study aims to carry out an epidemiological survey and immunological characterization of individuals pregnant or not, infected with Plasmodium vivax in an area of active transmission of malaria, the municipality of Cruzeiro South (AC), compared to healthy subjects. For this purpose, as well as epidemiological data, the peripheral blood of infected individuals were collected for hematological analysis, and performing phenotyping by flow cytometry, where activation markers were analyzed, and the presence of apoptotic regulatory cells. Furthermore, plasma samples were used for detection of cytokines and evaluation of oxidative stress. Young women, with low parasitaemia, but with classic symptoms of infection and already infected individuals were most affected by malaria. Patients infected pregnant and non-pregnant had thrombocytopenia and increased expression of activation and apoptosis markers. The infection also induced the increased expression of costimulatory molecule (ICOS and OX40 GITR) in T cells, and increased regulatory cells in peripheral blood of pregnant and non-pregnant infected with P. vivax. In the plasma of infected pregnant or not, cytokine production was low but was detected cytokines IL-6, IL-10 and IL-17. The production of markers of oxidative stress showed no significant difference in the groups. Together, these data suggest that the P. vivax infection promotes hematological and immunological changes in pregnant and nonpregnant, since significantly alter the activation and expression of markers of apoptosis in infected cells and in addition there is an increase of regulatory cells, and costimulatory molecules. These results point to the need to generate information about the immunological mechanisms in malaria by P. vivax that may inform the development of future research on this topic and consequently new intervention measures. Keywords: Plasmodium vivax, gestational malaria, Tregs, activation markers. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mapa de risco da malária por Município de infecção. Brasil, 2013. Fonte: (Sivep-Malária/SVS/MS) e (Sinan/SVS/MS).................................................................21 Figura 2 - Ciclo de vida do Plasmodium.........................................................................23 Figura 3 - Evidência do Plasmodium vivax em esfregaço de lâmina de sangue periférico em indivíduo positivo no exame de gota espessa coradas com Giemsa..........................44 Figura 4 - Média dos valores de hematócrito (%) (A), leucócitos totais (10 3/mm3) (C) e plaquetas (103/mm3) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de hematócrito (%) (B), leucócitos totais (10 3/mm3) (D) e plaquetas (103/mm3) (F) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax.................................................................................................................................47 Figura 5 - Média dos valores de monócitos (%) (A), linfócitos T CD4+ (%) (C), linfócitos B (%) (G) e mediana de linfócito T CD8 + (%) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de monócitos (%) (B), linfócitos T CD4 + (D), linfócitos T CD8+ (F) e linfócitos B (H) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax............................................................................................................49 Figura 6 - Expressão dos marcadores CD45RA e CD45RO em linfócitos T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................................................................................50 Figura 7 - Média dos valores de células T CD4+CD45RA (%) (A) e T CD4+CD45RO (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+CD45RA (%) (B) e T CD4+CD45RO (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax....................................................................................................51 10 Figura 8 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD4 + de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...............................52 Figura 9 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD8 + de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...............................53 Figura 10 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos B de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...............................54 Figura 11 - Mediana dos valores de células T CD4+CD69+ (%) (A), T CD8+CD69+ (%) (C) e CD19+CD69+ (%) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores células T CD4+CD69+ (%) (B), T CD8+CD69+ (%) (D) e CD19+CD69+ (%) (F) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax.................................................................................................................................55 Figura 12 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)..................................................................................................................56 Figura 13 - Expressão de células T CD4+HLA-DR de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...................................................57 Figura 14 - Mediana da intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos (A) e mediana dos valores de células CD4+HLA-DR (%) (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos (B) e mediana dos valores de células CD4 +HLA-DR (%) (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...................................................................................58 Figura 15 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...............................................................................................59 11 Figura 16 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...............................................................................................59 Figura 17 - Mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4 + (A) e T CD8+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4 + (B) e T CD8+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax.................................................60 Figura 18 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................................................................................61 Figura 19 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................................................................................61 Figura 20 - Mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4 + (A) e T CD8+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4 + (B) e T CD8+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax................................................................................62 Figura 21 - Expressão de células T CD4+ICOS de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................63 Figura 22 - Expressão de células T CD8+ICOS de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................64 Figura 23 - Média dos valores de células T CD4+ICOS (%) (A) e T CD8+ICOS (%) (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+ICOS (%) (B) e T CD8+ICOS (%) (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax............................................................................................................65 12 Figura 24 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................................................................................66 Figura 25 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de GITR em células CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes).........................................................................................................................66 Figura 26 - Mediana da intensidade de fluorescência de GITR em células CD14 + (A) e linfócitos T CD4+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ (B) e linfócitos T CD4+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...........................................67 Figura 27 - Expressão de células T CD4+CD25+CD127hi/low de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes................................68 Figura 28 - Média dos valores de células T CD4+CD25+CD127hi (A) e T CD4+CD25+CD127low (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+CD25+CD127hi (B) e T CD4+CD25+CD127low (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax.................................................69 Figura 29 - Detecção da produção de citocinas (pg/ml) pró (A e E) e anti-inflamatórias (C) no plasma de controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Detecção da produção de citocinas (pg/ml) pró (B e F) e anti-inflamatórias (D) no plasma de gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax................................................................70 Figura 30 - Dosagem de Nitrito + Nitrato (NO x) (A) e H2O2 (B) no plasma de mulheres infectadas pelo Plasmodium vivax...................................................................................71 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Distribuição das marcações dos anticorpos nas amostras de indivíduos sadios e infectados pelo Plasmodium vivax................................................................................39 Tabela 2 - Descrição epidemiológica dos indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax.................................................................................................................................43 Tabela 3 - Descrição epidemiológica das gestantes infectadas pelo Plasmodium vivax.................................................................................................................................45 Tabela 4 - Valor do teste de normalidade de Skapiro-Wilk das variáveis numéricas utilizadas no estudo.........................................................................................................46 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AICD - Morte celular induzida por ativação ANOVA - Análise de variância CBA – cytokine bead array CD - Grupamento de diferenciação CS - Proteína circunsporozoíta CTLA-4 - Antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico (do inglês cytotoxicTlymphocyte-associated antigen 4) EDTA - Etilenodiamino tetracético (anticoagulante) EROS - Espécies Reativas de Oxigênio FACS - Separação celular ativada por fluorescência FITC - Isotiocianato de fluoresceína FOXp3 - Gene envolvido na resposta do sistema imune que funciona como regulador das funções das células T FSC – Forward Scatter (tamanho) Hb - Hemoglobina Ht – Hematócrito HLA-DR - Antígeno leucocitário Humano/ Molécula do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe II H2O2 - Peróxido de Hidrogênio ICOS – co-estimulador induzível de células T (do inglês inducible T-cell costimulatory) ICOS-L – ligante do co-estimulador induzível de células T (do inglês IFN-Interferon gama IL - Interleucina IPA - Índice parasitário anual MFI - Mediana da intensidade de fluorescência MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade MiP - Malária na gravidez NK - Células matadoras profissionais NO - Óxido nítrico OMS - Organização mundial da saúde PE - Ficoeritrina 15 PECy5 - Ficoeritrina cianina PM - Malária placentária RNS - Espécies Reativas de Nitrogênio SIVEP - Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica SSC – Side Scatter (granulosidade) TCR – receptor de célula T TGFTransforming growth factor TH - Linfócitos T auxiliares TNFFator de Necrose Tumoral alfa Treg - Células T regulatórias (inducible T-cell costimulatory ligand) 16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................18 1.1 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA................................................18 1.2 CICLO DE VIDA DO PARASITA, TRANSMISSÃO E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS.......................................................................................................................21 1.3 RESPOSTA IMUNOLÓGICA NA MALÁRIA........................................................24 1.3.1 Resposta Imune inata e adaptativa..........................................................................24 1.3.2 Estresse oxidativo e apoptose.................................................................................29 1.4 MALÁRIA GESTACIONAL....................................................................................31 2 OBJETIVOS................................................................................................................35 2.1 GERAL......................................................................................................................35 2.2 ESPECÍFICOS...........................................................................................................35 3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................36 3.1 POPULAÇÃO ESTUDADA E ASPECTOS ÉTICOS..............................................36 3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO...................................................................................36 3.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO..................................................................................37 3.4 COLETA E ESTOCAGEM DE MATERIAL...........................................................37 3.5 HEMOGRAMA, SEPARAÇÃO DE PLASMA E ISOLAMENTO DE CÉLULAS DO SANGUE PERIFÉRICO COM TAMPÃO DE LISE...............................................37 3.6 FENOTIPAGEM DE LEUCÓCITOS POR CITOMETRIA DE FLUXO................38 3.7 ANÁLISE DE CITOCINAS DO PLASMA DE PACIENTES UTILIZANDO O KIT CBA.................................................................................................................................39 3.8 DOSAGEM DE NOX.................................................................................................39 3.9 DOSAGEM DE H2O2................................................................................................40 3.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS..................................................................................40 4 RESULTADOS............................................................................................................42 4.1 DESCRIÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax............................................................................................................42 17 4.2 DADOS HEMATOLÓGICOS..................................................................................45 4.3 ANÁLISE FENOTÍPICA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax.................................................................................................................................48 4.3.1 População de monócitos, Linfócitos T (CD4 e CD8) e B.......................................48 4.3.2 Expressão de Marcadores de Células naive e de memória.....................................49 4.3.3 Expressão de marcadores de ativação na malária pelo Plasmodium vivax.............51 4.3.3.1 Expressão de CD69 em Linfócitos T (CD4 e CD8) e B.......................................51 4.3.3.2 Expressão de HLA-DR em monócitos e linfócitos T CD4...................................55 4.3.4 Expressão do marcador de apoptose (CD95 Fas) em linfócitos T..........................58 4.3.5 Expressão de moléculas coestimulatórias...............................................................59 4.3.5.1 Expressão de OX40 em linfócitos T (CD4 e CD8)...............................................60 4.3.5.2 Expressão de ICOS em linfócitos T (CD4 e CD8)...............................................62 4.3.5.3 Expressão de GITR em monócitos e linfócitos T CD4.........................................64 4.3.6 Análise da expressão de CD25 em células T CD4: células T ativadas e regulatórias.......................................................................................................................67 4.4 DETECÇÃO DE CITOCINAS NO PLASMA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax.................................................................................................69 4.5 PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO...............71 5 DISCUSSÃO................................................................................................................72 6 CONCLUSÕES...........................................................................................................85 REFERÊNCIAS.............................................................................................................86 APÊNDICE...................................................................................................................103 ANEXOS.......................................................................................................................105 18 1 INTRODUÇÃO 1.1 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA A malária, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), é uma das doenças parasitárias mais importante do mundo considerada uma doença infecciosa aguda, causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e transmitida naturalmente ao homem pela picada da fêmea do mosquito Anopheles durante seu repasto sanguíneo (WHO, 2010). Diferentes determinantes epidemiológicos como clima, forma de ocupação do solo, modalidade de exploração dos recursos naturais e da intensa migração de área rural para urbana aumentam a probabilidade de infecção malárica. A precária vigilância epidemiológica e entomológica e áreas que sofreram ações como o desmatamento contribuem para o agravamento desse quadro (SARAIVA et. al. 2009). A malária é a principal causa de morte e morbidade em muitos países em desenvolvimento (WHO, 2014). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 182, 2 milhões de casos clínicos de malária ocorrem pelo Plasmodium falciparum (P. falciparum) e 15,8 milhões de casos clínicos pelo Plasmodium vivax (P. vivax), sendo 584 mil mortes são atribuídas à malária todos os anos (WHO, 2014). Entre adultos expostos à malária, as grávidas são mais suscetíveis à infecção, sendo um dos principais grupos de risco. No mundo, mais de 125 milhões de grávidas vivem em áreas de risco para malária, sendo que 32 milhões estão sob o risco de infecções pelo P. falciparum, 40 milhões por P. vivax e 53 milhões encontram-se em risco de serem infectadas por ambas as espécies, aumentando assim, o risco de complicações associadas às infecções pelo Plasmodium, incluindo o desenvolvimento de malária placentária (PM) (DELLICOUR et al., 2010). A malária placentária decorre principalmente de infecções pelo P. falciparum, mas há estudos que evidenciam alterações morfológicas e histológicas em placentas infectadas pelo P. vivax (ATAÍDE et. al., 2015). Durante a gravidez, muitas alterações fisiológicas ocorrem no organismo da mulher e alguns eventos podem aumentar a complexidade da gestação, e a malária pode se apresentar como uma complicação (CHAGAS et. al., 2009). Dados provenientes de estudos no Brasil são escassos sobre a distribuição espaço-temporal dos casos de 19 malária e seus determinantes em uma escala microgeográfica (vilarejo, localidade), principalmente em relação à infecção gestacional. Os dados usualmente analisados provêm dos arquivos do Ministério da Saúde. As condições ambientais dos Estados brasileiros pertencentes à Amazônia Legal, como elevada temperatura, umidade e condições hídricas abundantes, propiciam o desenvolvimento do mosquito vetor. O risco de contrair a doença não é uniforme, sendo medido por índice parasitário anual (IPA). Este índice classifica as áreas de transmissão em alto risco (IPA maior que 50 casos de malária/1.000 habitantes); médio risco (IPA entre 10 e 50 casos/1.000 habitantes), baixo risco (IPA de 0,1 a 10 casos/1.000 habitantes), e zero – sem risco (SARAIVA et. al. 2009). Na região Amazônica, em 2011, os estados foram classificados como de alto risco de transmissão (Acre, Rondônia e Amazonas); médio (Roraima, Amapá e Pará); e baixo (Mato Grosso, Maranhão e Tocantins). Todos os estados tiveram redução da incidência quando comparado o ano de 2006 em relação a 2005, exceto o Acre, local de realização desse estudo, mais precisamente a cidade de Cruzeiro do Sul, segundo maior município do Estado e que é uma área de baixa transmissão, devido às medidas de controle realizadas pela política nacional de combate à Malária, como distribuição de mosquiteiros e inseticidas e tratamento precoce dos infectados, entretanto com alta prevalência de infecções por de P. vivax e P. falciparum (SIVEP- MALÁRIA, 2012). O Estado do Acre está situado na Amazônia Brasileira, no extremo sudoeste da região Norte, ocupando uma área de 153.194 Km 2. Administrativamente, é composto por 22 municípios, sendo Cruzeiro do Sul, considerado a segunda maior cidade do Acre. Cruzeiro do Sul foi o município de estudo, localiza-se à margem esquerda do rio Juruá, distante 648 km da capital Rio Branco. Limita-se ao norte com estado do Amazonas, ao sul com o município de Porto Valter, ao leste com o de Tarauacá e ao oeste com os de Rodrigues Alves, Mâncio Lima e com a República do Peru. Ele tem extensão territorial de 7881 km. A população total do município é estimada em 89.095 habitantes, sendo 44.987 mulheres e sua densidade demográfica e de 8,55 habitantes/km (IBGE, 2007). A estrutura de saúde pública do município conta com três hospitais, disponibilizando 243 leitos, desses 74 destinados à obstetrícia. Os partos são realizados de forma intrahospitalar em 88,7% dos casos, com registro em média de 2112 nascidos vivos/ano. A rede de atenção básica é formada por dois Centros de Saúde e doze Postos de Saúde, com uma cobertura de pré-natal em torno de 22,7%, considerando a realização de sete 20 ou mais consultas. Em 2006 o número de mulheres atendidas no pré-natal foi cerca de 1010 grávidas/ano. (DATASUS, 2007). Em Cruzeiro do Sul (AC), a incidência parasitária anual (IPA) em 2006 chegou a 571,5/1.000 habitantes, caracterizando essa área como hiperendêmica. As causas para tamanha endemicidade são mal compreendidas. Acredita-se que, dentre outros fatores, o grande número de tanques destinados à piscicultura, construídos como resultado de um programa estadual de incentivo a essa atividade econômica, tenham-se comportado como criadouros permanentes de Anopheles darlingi, em especial na área periurbana. Do total dos exames positivos confirmados em mulheres entre 2003 e 2008 em Cruzeiro do Sul, 2,6% estavam relacionados à pacientes grávidas (COSTA et al. 2010). Até a década de 80, houve relativa equivalência entre as espécies parasitárias (P. vivax e P. falciparum), mas o levantamento realizado no Brasil em 2013 mostra que dos 177.722 casos confirmados de malária, 18% das infecções foram causadas pelo P. falciparum e 82% pelo P. vivax. Das 177.722 notificações realizadas nesse ano, 33.715 tiveram o estado do Acre como provável local de infecção. Dos 22 municípios que compõem o estado do Acre, 8 são considerados endêmicos para a malária, sendo 2 de alto risco, 2 de médio risco e 4 de baixo risco (SIVEP MALÁRIA, 2014). No Brasil em 2013, 26,9 milhões de pessoas residiam em áreas de risco, distribuídas em 9 estados endêmicos. Nestes estados, dos 53 municípios considerados endêmicos, 23 são classificados com de alto risco, 15 de médio e 15 de baixo risco (Figura 1). 21 Figura 1- Mapa de risco da malária por Município de infecção. Brasil, 2013. Fonte: (Sivep-Malária/SVS/MS) e (Sinan/SVS/MS). 1.2 CICLO DE VIDA DO PARASITA, TRANSMISSÃO E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS A malária é uma doença causada por um protozoário do filo Apicomplexa, família Plasmodidae, gênero Plasmodium que inclui várias espécies que parasitam diferentes hospedeiros vertebrados. Apenas cinco espécies parasitam o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale (de transmissão natural apenas na África) e Plasmodium knowlesi, uma espécie de Plasmodium que infecta naturalmente símios em regiões de florestas no sudoeste asiático. A infecção por cada uma dessas espécies de Plasmodium tem suas características próprias, bem como apresentam diferenças em suas áreas de distribuição (COX-SINGH, 2012). Dentre as cinco espécies, P. falciparum e P. vivax são as mais prevalentes no mundo. O número de casos de malária pelo P. vivax vem aumentando, e isso pode está 22 relacionado ao fato da presença imediata de formas sexuadas do parasita no sangue de infectados, existência de hipnozoítos, efeitos colaterais das medicações, assim como existência de cepas resistentes aos antimaláricos (BAIRD et al., 2004 e 2007; ANSTEY, 2009; OLIVEIRA-FERREIRA, 2010). No Brasil, a grande extensão geográfica da área endêmica e as condições climáticas favorecem o desenvolvimento dos transmissores e agentes causais da malária pelas espécies de P. vivax, P. falciparum e P. malariae (este último com menor frequência) (OMS, 2009). A malária é transmitida ao homem através da picada da fêmea do mosquito Anopheles, sendo o A. darlingi o principal vetor no Brasil. O ciclo do parasita é dividido em sexuado (que ocorre no inseto vetor) e assexuado (que ocorre no homem). A fase sexuada se inicia quando os gametócitos ingeridos durante a alimentação são transportados para o intestino do mosquito. Como a temperatura é mais baixa, os gametas emergem das hemácias infectadas, sendo fertilizados, originando os zigotos. Estes se desenvolvem em oocistos, iniciando a esporogonia. Em seguida ocorre o rompimento do oocisto e as formas infectantes do protozoário para o ser humano, os esporozoítos, são libertados, alojando-se na glândula salivar do mosquito. (FREITAS DO ROSÁRIO, 2008) (Figura 2). A partir da picada do mosquito, a fêmea inocula os esporozoítos do parasito na pele do hospedeiro, estes caem na corrente sanguínea, invadindo os hepatócitos. Dentro dessas células, os esporozoítos multiplicam-se e originam milhares de merozoítos (esquizogonia pré- eritrocítica). Os hepatócitos infectados se rompem e liberam, na corrente sanguínea, vesículas denominadas de merossomas contendo agregados de merozoítos em seu interior. Os merozoítos rompem os merossomas e invadem rapidamente os eritrócitos (Figura 2). O ciclo sanguíneo (esquizogonia eritrocítica) se repete sucessivas vezes, conduzindo à lise de eritrócitos e sendo responsável pelas manifestações clínicas, hematológicas e processos patogênicos associados à doença. A ruptura de hemácias é normalmente acompanhada por episódios de febre, náuseas, dores de cabeça e outros sintomas em resposta às citocinas pró-inflamatórias sistêmicas. 23 Figura 2 - Ciclo de vida do Plasmodium. 1 - Os esporozoítos são inoculados na pele humana através da picada da fêmea do mosquito Anopheles. 2 - Os parasitas migram para o fígado, infectando os hepatócitos e iniciam a esquizogonia pré-eritrocítica. 3 – Parasitas seguem para o sangue (esquizogonia eritrocítica) liberando merozoítos que são responsáveis pela sintomatologia da malária. 4 - As formas sexuadas do parasita (gametócitos) são inoculadas pelo mosquito que inicia o ciclo sexuado. 5 – No intestino do mosquito ocorre a fecundação dos gametócitos e forma-se o zigoto. 6 – Os parasitas multiplicam-se e rompem o oocisto liberando esporozoítos que se alojam nas glândulas salivares do mosquito. Fonte: http: //negritosbio.blogspot.com.br/p/doencas-provocadas-por-protozoarios_6.html. Adaptado pela autora. As recaídas de malária por P. vivax podem ocorrer apesar da parasitemia não ser mais detectada no sangue, isso se dá pela presença dos hipnozoítos, formas latentes de Plasmodium no fígado. Por isso que a administração de cloroquina por 3 dias e de primaquina, droga que combate os hipnozoítos, por 7 dias (esquema curto) ou por 14 dias (esquema longo) é recomendado como tratamento padrão para prevenir recaídas. As possíveis causas de reincidência da infecção estão relacionadas com resistência a cloroquina, ou à primaquina, dosagem inadequada primaquina, baixa adesão à medicação, ou mesmo a reinfecção. A resistência à medicação sugere a aquisição de novas características fenotípicas por parasitos de diferentes regiões geográficas (PRICE, 2009). Manifestações hematológicas estão presentes na infecção pelo Plasmodium como anemia, decorrente da lise eritrocitária e leucopenia periférica. Em relação às plaquetas mais recentemente, nos casos de malária por P. vivax com complicações, tem- 24 se observado, sistematicamente, o aparecimento de plaquetopenia. Em estudo descritivo de 43 casos de malária infectados pelo P. vivax grave, em Manaus, a média da contagem de plaquetas em pacientes graves, no dia da admissão, foi significativamente menor do que a de pacientes não-graves (DE LACERDA, 2007). Desta maneira, pode-se dizer que durante o ciclo de desenvolvimento no hospedeiro vertebrado, o parasita pode, portanto, ser alvo da resposta imune em maior ou menor grau em função do seu estágio de desenvolvimento. Mas é durante o ciclo eritrocítico que, fundamentalmente, o sistema imune do hospedeiro responde aos antígenos parasitários levando à resposta imune efetiva contra o Plasmodium ou à imunopatologia (SILVA, 2013). Os ciclos eritrocitários repetem-se a cada 48 horas nas infecções por P. vivax, P. falciparum e P. ovale (terçã), a cada 72 horas nas infecções por P. malariae (quartã) e a cada 24 horas no P. knowlesi (COX-SINGH, 2008). A transmissão da malária também pode ser acidental, como resultado de transfusão de sangue cujo doador esteja infectado ou de contatos involuntários com sangue contaminado. Outros episódios conhecidos de infecção da doença resultam do compartilhamento de agulhas e seringas contaminadas entre dependentes de droga injetável, cuja forma é chamada de malária induzida (VERONESI; FOCACCIA, 2006). Além disso, a transmissão congênita ou perinatal, apesar de rara, existe quando ocorre mistura do sangue materno com o fetal, ainda na fase intra-uterina ou durante o trabalho de parto (VERONESI; FOCACCIA, 2006). 1.3 RESPOSTA IMUNOLÓGICA NA MALÁRIA 1.3.1 Resposta Imune inata e adaptativa A composição complexa do parasita apresenta moléculas com propriedades antigênicas que são responsáveis pela ativação da resposta imune do hospedeiro e garantem que a resposta imune na malária seja diversificada e estágio-específica, atuando contra as diferentes formas evolutivas do parasita. Esta resposta pode ser influenciada por fatores relacionados ao hospedeiro e pela exposição ao parasita (PLEBANSKI & HIIL, 2000; MALAGUARNERA & MUSUMECI, 2002; BECKER et al., 2004; LANGHORNE et al., 2008). A imunidade à malaria envolve tanto uma resposta inata como adaptativa. 25 A resposta imune inata é essencial não somente para limitar a fase inicial de multiplicação do parasita como também para a primeira onda de parasitemia, controlando a infecção até que a imunidade adaptativa seja estabelecida (STEVENSON et al., 2004). A imunidade inata na malária compreende a participação das moléculas do sistema complemento, ativação de macrófagos, células dendríticas, células NK e NKT. As moléculas do sistema complemento causam a lise direta do parasita, os macrófagos fagocitam os parasitos livres e os eritrócitos parasitados; as células NK e NKT induzem a lise das células parasitadas (ENGWERDA & GOOD, 2005). Além destas, também participam as células dendríticas que junto aos macrófagos, iniciam a resposta imune adquirida (URBAN et al., 1999; DIALLO et al., 2008). Durante a infecção por Plasmodium, além de atuarem como células apresentadoras de antígenos, os macrófagos apresentam um importante papel devido a sua habilidade de fagocitar eritrócitos infectados na ausência de anticorpos específicos citofílicos e/ou opsonizantes (SERGHIDES et al., 2003). As células dendríticas iniciam a resposta imune adaptativa promovendo o estímulo de células T e B. BUENO e colaboradores em 2009 demonstraram que indivíduos naturalmente infectados por P. vivax apresentam uma modulação negativa de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que são responsáveis por apresentar de antígenos. Essa modulação pode está diretamente relacionada com a presença do eritrócito infectado (URBAN et al., 1999; URBAN et al., 2001; OCANAMORGNER et al., 2003). Na resposta imune inata, as células NK representam uma importante fonte inicial de IFN- e são responsáveis pela eliminação do parasito devido aos processos de citotoxidade desencadeados em resposta à infecção (OJO-AMAIZE et al., 1984; DOOLAN et al., 1999; ARTAVANIS-TSAKONAS et al., 2002). Os loci genéticos envolvidos na rejeição de tecidos estranhos ou não próprios constituem uma região conhecida como complexo principal de histocompatibilidade (CPH), também chamado de HLA (human leukocyte antigen) em humanos (DONADI, 2000; KLEIN, 2000; TURNER, 2004). O sistema HLA é dividido, didaticamente, em três regiões: classe I, II e III. A região de classe I é composta, principalmente, pelos loci HLA-A, B, C, que codificam as moléculas presentes praticamente em todas as células nucleadas. A região de classe II engloba os loci HLA-DR, -DP e –DQ, que codificam moléculas presentes, principalmente, na superfície de células imunes, como macrófagos, 26 células dendríticas, monócitos, linfócitos T ativados e linfócitos B. Que atuam na apresentação de antígenos e na regulação da interação entre células e o início da resposta imune. A região de classe III possui genes que codificam componentes do complemento, como C4A, C4B e o fator B, além de conter genes para as enzimas 21hidroxilase (CYP21), proteína do choque térmico (Hsp.70) e fatores de necrose tumoral (FERNANDES, 2003). Vários estudos têm investigado a influência do HLA na imunologia da malária (BANIC et al., 2002;. JOHNSON et al., 2004; OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2004). Alguns dos alelos HLA-DR foram associada a uma melhor resposta de anticorpos para P. falciparum (BANIC et al., 2002; JOHNSON et al., 2004) e P. vivax (OLIVEIRAFERREIRA et al., 2004). Além disso, estudos prévios têm relatado uma associação entre alelos específicos do HLA e a resposta imunológica aos antígenos da malária em ensaios de vacinas humanas (NARDIN et al., 2001; ZHANG et al., 2009), porém pouco sucesso tem-se alcançado devido à grande variabilidade antigênica relacionado aos estágios de vida do parasito (LONGLEY et al., 2015). A imunidade adquirida na malária envolve tanto uma resposta celular como humoral. As células T são essenciais na estimulação da produção de anticorpos e na indução da imunidade celular. No início da infecção, os anticorpos podem desencadear resposta imune contra os esporozoítos ao reconhecerem a proteína circunsporozoíta (CS), localizada na superfície do parasito, e impedir a invasão dos hepatócitos. A resposta imune adquirida contra os esporozoítos e os demais estágios hepáticos é limitada e geralmente não impede o desenvolvimento do estágio eritrocítico. Os esporozoítos, assim como as formas sexuais, possuem antígenos de superfície pouco imunogênicos do que os antígenos das formas sanguíneas, provavelmente porque os esporozoítos sofrem menor seleção pelo sistema imune do hospedeiro (STRUIK & RILEY, 2004). Essa baixa ativação da resposta imune contra formas do ciclo préeritrocítico pode estar associada a fatores de tolerância inerentes ao fígado ou ao tempo reduzido que o esporozoíto permanece na corrente sanguínea, antes de infectar os hepatócitos (MOORE et al., 2002). Durante a fase hepática, a resposta imune é predominantemente celular. A redução da densidade parasitária nesse estágio depende da ativação dos linfócitos T CD8+, além de linfócitos T CD4+ capazes de polarizar a resposta para Th1 no início da infecção e direcionar a resposta para Th2 durante o curso da infecção (TAYLORROBINSON et al., 1993; WINKLER et al., 1998; GREENWOOD et al., 2008). 27 As células T CD8+ e as citocinas INF e TNF conferem proteção contra as formas pré-eritrocíticas nos hepatócitos (SCHMIDT, 2011). O IFN é uma citocina próinflamatória produzida pelas células T CD8+, T CD4+ do tipo Th1, células NK e linfócitos Tγδ. Na malária, o IFN tem ação antiparasitária direta e, em sinergismo com o TNF, capaz de induzir a produção do óxido nítrico (NO) e radicais livres. A ação do IFN, assim como das demais citocinas pró-inflamatórias, deve ser controlada para que ocorra produção em nível adequado e, consequentemente, a eliminação da infecção com poucos danos para o hospedeiro (ARTAVANIS-TSAKONAS & RILEY, 2002). Várias citocinas produzidas por linfócitos T ativados, monócitos, células de Kupffer, células NK e células endoteliais são capazes de inibir o desenvolvimento do estágio hepático, sendo que as principais citocinas envolvidas nessa fase são IFN, IL– 1, IL-6, IL-12 e TNF (FERREIRA & RIBEIRO, 2000; JASON et al., 2001; CLARK et al., 2006). As formas sanguíneas dos plasmódios são as responsáveis pelas manifestações patológicas da doença, uma vez que os sintomas são decorrentes do desenvolvimento parasitário durante o ciclo assexuado sanguíneo. No estágio eritrocítico, potenciais alvos de uma resposta imune são os merozoítos livres ou parasitos intra-eritrocitários. Neste estágio, a eliminação do parasito parece ocorrer após desenvolvimento de uma resposta específica de anticorpos a antígenos variantes de superfície (GOOD et al., 2005). As células T CD4+ são importantes no controle do número de parasitas sanguíneos através da secreção de citocinas, ativação de macrófagos e direcionamento para a imunidade humoral (IMAI, 2010). Na fase inicial da infecção, os linfócitos T CD4+ participam da redução da densidade parasitaria, sendo que, durante o curso da infecção, a proporção de células Th2 aumenta, favorecendo o desenvolvimento da imunidade mediada por anticorpos e, consequentemente a redução da parasitemia e a resolução da infecção patente (TAYLOR-ROBINSON et al., 1993; FONSECA et al., 2007). Se por um lado se tem ativação de células imunológicas a fim de combater a infecção concomitantemente aparecem na corrente sanguínea, células responsáveis por limitar a ativação e proliferação excessiva dos linfócitos, limitando a magnitude de respostas imunes efetoras, o que pode incapacitar o organismo de controlar adequadamente a infecção Estas células são descritas como células regulatórias, que possuem vários marcadores e fatores de transcrição, tendo sido descritas na literatura 28 por alguns autores com o fenótipo CD4+FOXp3+CD25+CD127low (SEDDIKI et al., 2006; BELKAID E TARBELL, 2009). Além dos marcadores CD25, CD127 e FOXp3, uma variedade de mediadores de células Tregs podem contribuir para a supressão de respostas imunológicas no hospedeiro, como, CTLA-4 (antígeno-4 do linfócito T citotóxico), GITR (membro da superfamília dos receptores TNF), OX40 (CD134) e ICOS (SHEVACH et al., 2006). Contudo, esses marcadores não são específicos para as células Treg, uma vez que eles também podem ser expressos em outras células T ativadas (BELKAID E TARBELL, 2009). Este estudo é pioneiro na avaliação das moléculas coestimulatórias (GITR, OX40 e ICOS) durante a malária gestacional causada pelo Plasmodium vivax. A molécula GITR é expressa na superfície de células regulatórias naturais (BELKAID, 2005) e é regulada pela expressão do fator de transcrição FOXp3 (YAGI et al, 2004; NOCENTINI, 2007). Isso também foi demonstrado por Bueno (2010), onde houve aumento do número de circulantes CD4+CD25+FOXp3+ que coexpressam GITR em pacientes infectados pelo P. vivax. Neste contexto, pode-se sugerir que a proliferação de células regulatórias nos infectados é provocada pela expressão GITR, que possivelmente está regulada positivamente pela expressão FOXp3. O OX40 é uma molécula, presente em linfócitos, faz parte do grupo de receptores membros da família do TNF, que são potentes ativadores da resposta efetora das células T, regulando a ação das células T CD4+ e CD8+. Também tem papel importante na geração de memória (WEINBERG, 2004; SALEK-ARDAKANI, 2006), é expresso nas células virgens que se tornaram ativadas entre 12 e 24 h (SO e CROFT, 2007), tendo um pico de expressão em 48 h, com declínio após 72 e 96 h após e estimulação via TCR (VALZASINA et al., 2005). Estudos demonstram que a expressão de OX40 está relacionada com a proliferação, homeostase e sobrevivência das células T (ISHII et al., 2010). Na malária, os estudos com a molécula OX40 em camundongos apontam que animais com malária cerebral apresentam alta expressão de OX40 em seus tecidos cerebrais, o que gera indícios que a expressão dessa molécula exerça função na caracterização da patologia (OAKLEY et al., 2009) e a importância dessa molécula na regulação do sistema imune. O ICOS foi inicialmente caracterizado como uma molécula facilitadora da diferenciação de células T para a produção de IL-4 e IL-10. Foi demonstrado que a expressão da molécula ICOS, está diretamente relacionada com a resposta imune e ativação celular, com grande expansão de células T CD4 + convencionais e permanência 29 das células Treg (LISHKE et al., 2012). A molécula ICOS exerce papel importante para os mecanismos supressores das células regulatórias. 1.3.2 Estresse oxidativo e apoptose Em situação normal o sistema antioxidante é capaz de neutralizar a formação de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) pela mitocôndria, porém, quando há um desequilíbrio entre os componentes pró-oxidantes e antioxidantes, ocorre o que chamamos de estresse oxidativo (ANDRADES et al., 2011). EROS é um termo coletivo para descrever os radicais livres: anion superóxido (O2-), radical hidroxila (OH-), radicais peroxila (RO2) e radicais alcoxila (RO) e o peróxido de hidrogênio (H2O2), embora este último não seja derivado das espécies do oxigênio (CIRCU & AW, 2010). As EROs são produzidas em consequência de processos fisiológicos. E em grandes quantidades durante uma infecção, por células fagocíticas com a finalidade de destruir os micro-organismos invasores (EVANS, 2000; BULGUER, 2001). Por outro lado, quando sua produção é exacerbada existe efeitos deletérios como dano tissular, inflamação, dentre outros (VASCONCELOS et al., 2007). A infecção pelo Plasmodium é acompanhada por grande aumento do estresse oxidativo, resultado da produção de EROS. Essa produção ocorre por dois mecanismos separados: o primeiro envolve a degradação da hemoglobina do hospedeiro pelo parasita intracelular, com a oxidação do Fe +² na forma Fe+³ após a separação da heme da globina, produzindo elétrons que reagem com o oxigênio molecular para a formação das EROS. O segundo mecanismo é resultado da ativação da resposta imune do hospedeiro, pela produção de citocinas (TNF-α e INF-γ) que leva a ativação dos fagócitos e produção EROS principalmente por linfócitos e macrófagos (PABON, et al. 2003). Como resultado da alta taxa metabólica, os parasitas se multiplicam rapidamente e grandes quantidades de substâncias tóxicas são geradas. Na infecção malárica, a elevação de EROS pode danificar os tecidos, como endotélio do hospedeiro e exercer um papel significativo na morbidade da doença por causar ativação de produtos inflamatórios e consequentemente aumentar o estresse oxidativo sobre os eritrócitos o que pode contribuir para a hemólise e desenvolvimento da anemia (BECKER et al., 2004). Estudos apontam que indicadores de estresse oxidativo, especificamente da peroxidação de lipídios, como o malondialdeído (MDA), estão aumentados em amostras de sangue de pacientes trombocitopênicos infectados com P. vivax, demonstrando que 30 as EROS exercem importante papel nas alterações funcionais e estruturais das plaquetas e no mecanismo da trombocitopenia na malária (ARAUJO et al., 2008). Além de produzir EROS, a cadeia respiratória mitocondrial pode produzir Óxido Nítrico (NO), através da ativação da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS) (GRIFFITH et al., 1995). Estes subprodutos são chamados espécies reativas de nitrogênio (RN S) (PATERSON et al., 2000). Em mamíferos, o NO participa de diversas funções biológicas que vai desde a regulação da pressão sanguínea (formado a partir da isoforma eNOS) e o processo da neurotransmissão (à partir da isoforma nNOS); até a formação de um mecanismo de proteção contra diversos micro-organismos (à partir da isoforma iNOS) (ALDERTON et al., 2001). Apesar de evidenciado, o papel do NO na malária ainda é bastante controverso, principalmente no que diz respeito às várias isoformas de enzima e às diferentes locais de produção de NO. No entanto, a produção de NO pela iNOS parece ter um papel de destaque na infecção (MACCHI et al, 2010; MACHI et al, 2013). O NO produzido pelo sistema imunológico em resposta a infecção leva a uma maior ativação endotelial o que resulta na liberação de citocinas e outros mediadores inflamatórios, incluindo IL-12 e IFN que permitem às células ativar respostas imunes (HAN et al., 2009). Outras manifestações da doença como distúrbios respiratórios e malária placentária, têm sido relacionadas com as alterações no estado redox (BECKER et al., 2004), mas a relação entre o estresse oxidativo e a malária placentária necessita de mais investigações. A presença de estresse oxidativo leva a danos nas macromoléculas celulares e promove a morte celular (CIRCU & AW, 2010). A apoptose celular é iniciada por sinais intracelulares e extracelulares por duas vias principais: via mitocondrial (intrínseca) e receptores de morte de membrana (extrínseca). A via extrínseca é mediada por receptores de morte através da membrana celular, incluindo a superfamília dos receptores do TNF, entre eles o TNFR-1, TRAIL e CD95 Fas. Esse último, quando ligado ao ligante específico, Fas-L, sinaliza a agregação e formação de um complexo indutor de morte que recruta a caspase-8 e após ativa as caspases efetoras (caspase-3) (CIRCU & AW, 2010). A infecção com Plasmodium falciparum causa apoptose das células mononucleares através da participação dos receptores CD95 (Fas/APO-1) e linfocinas (ARIBOT et al., 1996). A literatura descreve que a diminuição dos linfócitos do sangue 31 periférico é observada em pacientes portadores da malária aguda causada por P. falciparum e P. vivax. E que os processos que podem estar envolvidos são: o de sequestro pelos nódulos linfáticos e também pela morte dessas células por apoptose (RICCIO et al, 2003). O aumento dos níveis de apoptose foi observado em linfócitos de pacientes com P. falciparum e P. vivax, quando estas células foram cultivadas por 24 horas, sendo que as células T CD4+ foram mais susceptíveis que os linfócitos T CD8 + (RICCIO, et al., 2003). Esta ocorrência da morte por apoptose das células imunes tem sido mostrada em vários estudos realizados em humanos e modelos animais com vários efeitos sobre a gravidade da doença (KASSA et al., 2006). Contudo, a contribuição do estresse oxidativo para o dano no DNA e morte celular em pacientes infectados com malária causada pelo P. vivax foram pouco investigadas e necessitam ser caracterizadas. 1.4 MALÁRIA GESTACIONAL Na vivência prática a malária associada à gravidez (PAM) é utilizada para definir qualquer infecção pelo parasita durante a gestação, que pode ocorrer em três manifestações: malária gestacional, placentária e/ou congênita. Nesse contexto, a malária gestacional é definida como a evidência de infecção por Plasmodium durante a gravidez ou a presença do plasmódio no sangue periférico detectado por microscopia (ATAÍDE et al., 2015), através da confirmação feita pelo exame de gota espessa, que é o teste recomendado para o diagnóstico em locais endêmicos (CAMPOS et al., 2011). A malária placentária é a presença do parasita, encontrado por testes específicos (incluindo histopatologia) na placenta e malária congênita, é a detecção do Plasmodium no sangue periférico ou cordão umbilical do recém-nascido. A malária placentária provoca alterações tais como inflamação, deposição de fibrina e infarto interviloso, que podem persistir até o parto e consequentemente afetar a função materno-placentária, contribuindo para resultados adversos no nascimento e aumento da mortalidade e morbidade perinatal (WALTER et at., 1982). A presença do Plasmodium, assim como seus produtos leva ao acúmulo de células e produtos inflamatórios na microvasculatura placentária, danificam a integridade da mesma e interferem com sua capacidade de transportar nutrientes e oxigênio para o feto. Estudos mostram que isso leva a anemia materna, um aumento da 32 chance de aborto, diminuição do crescimento intra-uterino e baixo peso ao nascer e natimortos principalmente em infecções pelo P. falciparum. (ROGERSON et al., 2007; DESAI et al., 2007). Em relação ao P. vivax, com o aumento de casos graves da Ásia e da América do Sul (LACERDA et al., 2012; NURLEILA et al., 2012), as consequências da infecção durante a gravidez ainda precisam ser elucidadas, mas estudos também têm demonstrado que eritrócitos infectados por P. vivax aderem no espaço interviloso, embora em menor grau se comparado com P. falciparum (CARVALHO, 2010; MARIN-MENENDEZ, 2013) e sequestro de glóbulos vermelhos infectados foram encontrados na circulação sanguínea profunda (ANSTEY, 2007; ANSTEY, 2009). Sendo assim, infecções pelo P. vivax também podem exercer seus efeitos adversos sobre o feto através da anemia materna ou indução de uma potente resposta inflamatória com a produção abundante de citocinas, o que vai interferir nos mecanismos uteroplacentários (ANSTEY, 2009; BRABIN, 2004). A literatura reforça que as alterações histológicas placentárias na infecção pelo P. vivax podem ser relacionadas aos efeitos periféricos, como anemia, febre e liberação de citocinas isso porque as interações do P. vivax com os eritrócitos infectados não são consideráveis como as interações com o P. falciparum. (MAYOR 2012; SOUZA et al, 2013). Isto porque o P. vivax tem raros receptores placentários quando comparado ao P. falciparum (MCLEAN et al, 2015). Após a fecundação, citocinas pró-inflamatórias contribuem com a implantação e remodelação das artérias para garantir o fornecimento de sangue adequado para o embrião (PICCINNI, 2010). Após a implantação do embrião ocorre a produção de citocinas predominantemente do perfil Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) por linfócitos T CD4+, que garantem a manutenção de um ambiente que tolere bem o feto e o desenvolvimento de uma gravidez saudável (WEGMANN, et al., 1993). Por outro lado, durante a infecção malárica há a produção de citocinas como TNF-α (SUGUITAN et al., 2003; ROGERSON et al., 2003), IFN-γ (FRIED et al., 1996; MOORE et al., 1999), IL-1β (MOORMANN et al., 1999) e IL-2 (FRIED et al., 1998), no sangue periférico que promovem a proliferação de células T e aumentam a atividade fagocitária de macrófagos pela produção de óxido nítrico (TAYLORROBINSON E SMITH, 1999). Altos níveis de citocinas inflamatórias circulantes durante os paroxismos de P. vivax no sangue periférico (KARUNAWEERA, 2003) 33 podem ser suficientes para prejudicar o crescimento fetal e causar anemia materna (NOSTEN, 2004). Na infecção malárica a anemia é a mais comum complicação em gestantes, sendo agravada pela anemia provocada pela própria gestação, tendo uma etiologia multifatorial. Durante a gestação as concentrações de hemoglobina (Hb) e hematócrito (Ht) reduzem drasticamente por conta do aumento da vascularização pela necessidade de uma maior perfusão sanguínea útero-placentária. Na infecção pelo Plasmodium, há aumento na destruição das hemácias devido à ruptura de eritrócitos, fagocitose e febre; além da diminuição na produção de hemácias e alterações na produção de citocinas (SOUZA et al., 2002) como já discutido anteriormente. Além disso, a formação de rosetas é um fenótipo de citoaderência encontrado frequentemente em infecções P. vivax e tem sido associado com um aumento do risco para a anemia (MARÍNMENÉNDEZ, 2013). A sintomatologia da malária nas gestantes é semelhante aos demais grupos acometidos, com episódios de febre, calafrios, sudorese, anemia e mal estar geral. Nos casos graves as pacientes apresentam-se em coma com convulsões, choque circulatório, pressão sistólica baixa (<50mmHg), anemia grave (Hb <5g/dl), insuficiência renal, baixa produção de urina (<400ml/dia), angústia respiratória e hipoglicemia (<40mg/dl) (RUBIO, 2000). A gravidade das manifestações clínicas é determinada pelo grau de imunidade pré-gestacional o que depende da intensidade e da estabilidade da transmissão local de malária. Estudos revelam que em áreas em que ela é baixa ou instável, o grau de imunidade é baixo, e tanto a mãe como o feto podem apresentar doença grave. (CHAGAS, 2009). Pesquisas também apontam que a imunidade adquirida contra a malária é menor em mulheres primigestas infectadas pelo P. falciparum por não terem imunidade às proteínas específicas do Plasmodium que conferem citoaderência na placenta. Em gestações subsequentes, com o desenvolvimento da imunidade contra as proteínas do parasita na placenta, há redução de efeitos adversos da malária para a mãe e o feto (DUFFY, 2007). O processo de aquisição da imunidade contra a malária durante a gravidez só começa quando a mulher residente em área endêmica fica grávida, uma vez que a imunidade adquirida previamente em infecções anteriores, não a protege contra a infecção placentária (BEESON E DUFFY, 2005; DUFFY E FRIED, 2005). Portanto, a 34 exposição repetida a determinados fenótipos de parasitas ao longo de várias gestações, pode resultar em algum grau de proteção. Os níveis de anticorpos contra antígenos presentes na superfície dos eritrócitos placentários infectados são baixos antes da gravidez e aumentam com gestações sucessivas em mulheres expostas ao P. falciparum (FOWKES et al., 2012). Apesar das alterações ocasionadas pela malária serem comuns em qualquer época da gestação, estudos realizados em áreas de transmissão ativa de malária na Amazônia Legal, como Manaus, Belém, Rio Branco, Macapá e Porto Velho, indicam que o risco de sinais gravidade ocorre com maior frequencia no último trimestre devido as modificações fisiológicas do corpo materno, como aumento do volume plasmático, retenção de líquidos, entre outras (ALMEIDA, 2008). Sendo que a instalação da infecção malárica nesse período gestacional pode contribuir para a acometimento de outras doenças vasculares (CALVOSA, 1995; JARUDE, 2003; SANTOS, 2011; SIMÕES, 2006). Há um grande interesse no estudo pela malária, entretanto, vários mecanismos imunológicos associados a essa doença em indivíduos gestantes ou não ainda precisam ser compreendidos. Sendo assim, esse estudo realiza a descrição de aspectos epidemiológicos e a caracterização imunológica de indivíduos gestantes ou não infectados pelo Plasmodium vivax residentes no município de Cruzeiro do Sul (AC). Através da análise dados hematológicos, da presença de marcadores de ativação, apoptose, de células virgens, de memória ou regulatórias presentes nos leucócitos do sangue periférico dos infectados. Além disso, avalia mediadores inflamatórios em amostras de plasma de indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax. Nesse contexto, a importância desse trabalho se relaciona com aspectos relevantes da resposta imunológica em especial em gestantes quando da infecção pelo P. vivax. Poucos estudos existem na literatura que abordam essa temática e neste sentido, os resultados aqui apresentados podem propiciar um maior entendimento dos mecanismos de regulação do sistema imunológico durante processos infecciosos. Além disso, alguns marcadores de ativação e regulação do sistema imune foram estudados pela primeira vez em pacientes infectados pelo Plasmodium vivax, inclusive gestantes. Estas informações poderão auxiliar o desenvolvimento de novas estratégias de controle da infecção por este parasita, permitindo assim uma melhora na qualidade de vida das pessoas acometidas. 35 2 OBJETIVOS 2.1 GERAL Realizar um levantamento epidemiológico e a caracterização imunológica de indivíduos gestantes ou não, infectados pelo Plasmodium vivax no município de Cruzeiro do Sul (AC) em comparação com indivíduos sadios. 2.2 ESPECÍFICOS Caracterizar os aspectos epidemiológicos e hematológicos durante a malária causada pelo Plasmodium vivax. Analisar as alterações das populações de leucócitos do sangue periférico de indivíduos gestantes e não gestantes infectados pelo Plasmodium vivax e sadios; Investigar a ativação de leucócitos de amostras de sangue periférico de indivíduos gestantes e não gestantes infectados pelo Plasmodium vivax e sadios; Avaliar a produção de mediadores inflamatórios em amostras de plasma de indivíduos gestantes e não gestantes infectados pelo Plasmodium vivax e sadios. 36 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 POPULAÇÃO ESTUDADA E ASPECTOS ÉTICOS Os indivíduos que participaram deste estudo foram provenientes do município de Cruzeiro do Sul (AC), maiores de 18 anos e de ambos os gêneros. Amostras de todos os indivíduos foram submetidas ao exame de gota espessa para identificação da espécie de plasmódio e análise da parasitemia. As amostras foram coradas com Giemsa usandose o método tradicional (Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária, 2005, Ministério da Saúde) e a contagem de parasitos foi realizada em microscópio óptico. Para a estimativa dos níveis de parasitemia foi usado o método tradicional semiquantitativo (método de cruzes). Foram analisados 33 indivíduos acometidos pela malária, sendo 25 não gestantes (homens e mulheres) e 8 gestantes. Todos os pacientes foram analisados na fase aguda da doença (antes do tratamento). Participaram do estudo também 20 indivíduos sadios e que nunca contraíram qualquer tipo de malária anteriormente, 10 não gestantes (homens e mulheres) e 10 gestantes residentes no Estado do Maranhão. Por tratar-se de uma pesquisa que envolve seres humanos a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Ceuma (protocolo 00879/09, de 17/12/2009 ANEXO B) e pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Acre (protocolo 136622/12). 3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO Integraram o estudo indivíduos de ambos os gêneros, com idade acima de 18 anos, com exame da gota espessa (método de Giemsa) positiva para Plasmodium vivax, que aceitaram participar do estudo, assinaram um Termo de Consentimento Livre e esclarecido (APÊNDICE A) e que responderam ao questionário clínico-epidemiológico (ANEXO A). Como controles participaram indivíduos sem histórico de infecção recente, que passaram por uma entrevista e realização de hemograma. 37 3.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Indivíduos que fazem uso de anti-inflamatórios não esteróides e/ou esteróides, que se negaram a participar do estudo e a assinar o termo de esclarecimento livre e esclarecido, ou que apresentavam outras co-morbidades. 3.4 COLETA E ESTOCAGEM DE MATERIAL Em tubos com heparina, cerca de 3 ml de sangue foram coletados de cada indivíduo após a identificação da doença realizada por meio do exame de gota espessa, feito por técnicos treinados em indivíduos com suspeita de malária. Foram coletadas amostras de sangue total, por punção venosa periférica. No momento da coleta as lâminas de gota espessa e esfregaço do sangue foram preparadas para posterior confirmação da parasitemia e captura de imagens utilizando microscópio óptico (Axio imager Z2, Carl Zeiss) da Universidade Ceuma. Todo o material obtido no campo foi acondicionado e mantido sob refrigeração por no máximo 6 horas até o processamento laboratorial. As amostras foram encaminhadas para o Centro de Estudos e Pesquisas em Doenças Infecciosas – CEPDI/ Instituto da Biodiversidade/Universidade Federal do Acre (UFAC) – Campus Floresta, para serem então utilizadas para os experimentos obtendo-se amostras de sangue para realização de hemograma, separação de plasma para os estudos do perfil de produção citocinas, anticorpos séricos, óxido nítrico e peróxido de hidrogênio e separação leucócitos para os experimentos de caracterização fenotípica e funcional através de citometria de fluxo. 3.5 HEMOGRAMA, SEPARAÇÃO DE PLASMA E ISOLAMENTO DE CÉLULAS DO SANGUE PERIFÉRICO COM TAMPÃO DE LISE Um total aproximado de 1 ml do sangue coletado foi processado no analisador automático (ABX Micros 60 - HORIBA) para realização de hemograma. O restante das 38 amostras (2 ml) foram então centrifugadas (Centrifuga refrigerada, CT-500R) a 1200 rpm por 5 minutos, o plasma foi separado em eppendorfs para quantificação de citocinas plasmáticas e estresse oxidativo. As células foram isoladas por tampão de lise de hemácias, cuja formulação para 1 litro, foi: 8 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 1,8ml de uma solução de EDTA. Em tubos falcon de 15 ml foi adicionado 10 ml de tampão de lise de hemácias e as amostras foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos. Após o isolamento, as células foram transferidas para uma placa de fundo redondo (1x106 células por poço) e marcadas com os anticorpos específicos. 3.6 FENOTIPAGEM DE LEUCÓCITOS POR CITOMETRIA DE FLUXO Dentre as populações celulares foram analisados leucócitos totais, células virgens (naive) e de memória; marcadores de ativação; moléculas coestimulatórias; marcadores de apoptose e células regulatórias. A avaliação fenotípica e funcional de células CD4 +, CD8+ e CD14+ foi feita por citometria de fluxo com 49 amostras, sendo 20 indivíduos sadios (10 não gestantes e 10 gestantes) e 29 infectados (25 não gestantes e 4 gestantes – as outras 4 amostras de gestantes infectadas foram utilizadas para os experimentos de avaliação da produção de mediadores inflamatórios). As células do sangue purificadas com tampão de lise foram incubadas por um período de 30 minutos a 4°C com anticorpos anti-CD4 (linfócito T CD4), CD8 (linfócito T CD8), HLA-DR (ativação e apresentação de antígeno), CD69 (ativação), CD14 (monócitos), CD25 (ativação), CD127 (ativação e regulação), CD45Ra (virgens) , CD45Ro (memória ou ativadas), CD19 (linfócito B), GITR (coestimulatória), ICOS (coestimulatória), CD95 (Fas) (apoptose) e OX40 (coestimulatória) marcados com diferentes fluorocromos, todos adquiridos da BD Biosciences (Pharmingen). Após a marcação, as células foram lavadas com 100 µL de solução salina com fosfato-PBS (Sigma-Aldrich, Brasil), e transferidas para tubos de FACS contendo aproximadamente 400 µL de solução salina. As células foram analisadas utilizando o aparelho de BD FACSCalibur com o software CellQuest (BD Biosciences). Células T CD4+ e T CD8+, bem como monócitos e granulócitos foram estimadas baseados em marcadores fenotípicos e/ou na distribuição por tamanho e granulosidade (FSC-A vs. SSC-A). Os resultados são expressos na porcentagem do 39 número total de células viáveis ou intensidade de fluorescência. A distribuição dos anticorpos foi realizada conforme a Tabela 1: Tabela 1 - Distribuição das marcações dos anticorpos nas amostras de indivíduos sadios e infectados pelo Plasmodium vivax. FITC PE PECy5 CD45RA CD45RO CD4 CD127 CD25 CD4 CD69 CD8 CD19 CD69 GITR CD4 CD4 ICOS CD8 CD4 CD8 CD95 (Fas) CD4 CD14 HLA-DR OX40 CD8 CD4 Fonte: elaborada pela autora. 3.7 ANÁLISE DE CITOCINAS DO PLASMA DE PACIENTES UTILIZANDO O KIT CBA As citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF, TNF e IL-17) foram quantificadas em amostras de plasma dos pacientes com malária e indivíduos sadios, obtidas através do kit CBA (Cytometric Bead Array) da BDBiosciences, utilizando citometria de fluxo, conforme as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos em picogramas/mililitro (pg/ml). Para esse experimento foram utilizados 10 indivíduos sadios não gestantes (homens e mulheres), 10 gestantes sadias, 25 indivíduos infectados (homens e mulheres) e 8 gestantes infectadas pelo P. vivax, totalizando 53 amostras. 3.8 DOSAGEM DE NOX O conteúdo de NO2 -/NO3 – foi mensurado pelo ensaio de Griess, como um indicador da produção total de NO, em amostras de plasma de pacientes infectados pelo Plasmodium vivax ou indivíduos sadios. NO3 – foi reduzido para nitrito (NO2 -) por 40 incubação de 80µl de amostra com 20 µl de 1U/ml nitrato redutase e 10 µl de 1mM NADPH por 30 minutos a 37ºC em placa de 96 poços de fundo chato. Logo após, 100 µl de reagente de Griess (5% v/v H3PO4 contendo 1% de sulfanilamida/0,1% de dihidrocloreto de naftileno) foram adicionados e incubados por 15 min a 37ºC. As absorbâncias foram determinadas com filtro de 550 nm e mensuradas usando espectrofotômetro (MB-580/Heales). Após as subtrações das leituras (com e sem reagente), cada amostra foi comparada com a curva padrão de nitrito (0-300µM) e os resultados foram expressos em µM em relação ao controle (indivíduos sadios). Para este experimento foram utilizadas as amostras de mulheres, sendo 7 não gestantes sadias, 10 gestantes sadias, 10 não gestantes infectadas e 8 gestantes infectadas pelo P. vivax. 3.9 DOSAGEM DE H2O2 A produção de H2O2 no plasma foi mensurada usando o kit de ensaio H2O2/ peroxidase (Sigma-Aldrich). O ensaio foi realizado em placa de 96 poços de fundo chato, de acordo com as instruções do fabricante. Para isto, 50µL das amostras foram incubadas com 46µl do tampão de ensaio, 2µl do substrato fluorescente de peroxidase e 2µl do substrato de H2O2. Em seguida a placa foi incubada a 37ºC no escuro e após 5 min a absorbância inicial foi determinada em 550nm, medindo a cada 30 min, 60 min e 120 min. As leituras das absorbâncias foram feitas na presença e na ausência de Amplex Red, e foram comparadas com uma curva padrão de H2O2 (0-40 µM). Os resultados foram expressos pela diferença entre as amostras incubadas na presença e ausência do Amplex Red em µM em relação ao controle (indivíduos sadios). Para este experimento foram utilizadas as amostras de mulheres, sendo 7 não gestantes sadias, 10 gestantes sadias, 10 não gestantes infectadas e 8 gestantes infectadas pelo P. vivax. 3.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS Em todos os grupos analisados foi realizado teste de normalidade Shapiro-Wilk nas variáveis numéricas. Na comparação entre dois grupos com distribuição normal foi utilizado o Teste t de Student independente. Não havendo distribuição normal, a comparação entre dois grupos foi feita pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney. Para análise de quatro grupos foi usado Kruskal-Wallis, teste não paramétrico, seguido 41 pelo teste de comparação de Dunn. As diferenças obtidas foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. Para a confecção dos gráficos de barras com as médias e Box-plots com medianas dos grupos foi utilizado o programa Prism for Windows 5.0 (GraphPad). 42 4 RESULTADOS 4.1 DESCRIÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax Para a descrição epidemiológica da população em estudo foram analisados parâmetros como faixa etária, gênero, parasitemia, presença de infecções anteriores ocasionadas pela malária e sintomatologia. Os dados epidemiológicos estão sumarizados na Tabela 2. Em relação à faixa etária dos infectados pelo Plasmodium vivax, 18 indivíduos tinham entre 18 e 29 anos e 15 indivíduos tinham entre 30 e 59 anos. Neste estudo as mulheres foram mais infectadas pela malária que os homens. O gênero feminino representou 18 infectados e o masculino 15 infectados. Dentre as mulheres infectadas pela malária 8 eram gestantes. Algumas lâminas do esfregaço sanguíneo (preparadas no momento da coleta do material) foram fotografadas através de microscopia óptica (Figura 3). Em relação à parasitemia, 10 indivíduos tiveram parasitemia <+/2 (<200 parasitas/mm 3), 9 pacientes apresentaram parasitemia de +/2 (200 a 300 parasitas/mm 3) e 5 casos obtiveram parasitemia + (301 a 500 parasitas), ambas consideradas leves; 9 pacientes obtiveram infecção com ++ (parasitemia moderada com até 10.000 parasitas/mm 3). Nenhum indivíduo apresentou alta parasitemia (3 ou mais cruzes com >10.001 parasitas/mm3). No que diz respeito à quantidade de infecções causadas pela malária, apenas 1 paciente relatou ser primoinfectado. Dezenove pacientes afirmaram ter tido malária de 1 a 5 vezes na vida; 8 relataram terem sido infectados de 6 a 10 vezes e 5 pessoas disseram que foram infectadas mais de 10 vezes. Vale ressaltar que entre os que já foram infectados mais de 10 vezes, um afirmou ter tido malária mais de 35 vezes. Nos 33 pacientes os principais sintomas ocasionados pela infecção foram: hipertermia presente em 28 infectados, seguida de cefaleia com 25 indivíduos. Vinte e um infectados relataram mialgia/artralgia; calafrios foram identificados em 18 dos casos de malária; 10 pessoas apresentaram mal estar; 5 vômitos/náuseas, 3 indivíduos 43 relataram sudorese e tontura, 2 apresentaram dor abdominal e otalgia. Palidez, rubor cutâneo e cansaço foram sintomas relatados por 1 pessoa. Dois indivíduos infectados apresentaram-se assintomáticos. Tabela 2 - Descrição epidemiológica dos indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax gestantes ou não. Número absoluto Frequência relativa 18 - 29 anos 18 55% 30 - 59 anos 15 45% Masculino 15 45% Feminino 18 55% < +/2 10 30% +/2 9 27% + 5 16% ++ 9 27% Primoinfecção 1 3% 1 a 5 infecções 19 57% 6 a 10 infecções 8 24% > 10 infecções 5 16% Hipertermia 28 84% Cefaleia 25 75% Mialgia/Artralgia 21 63% Calafrio 18 55% Mal estar 10 30% Vômito/Naúsea 5 16% Assintomático 2 6% Parâmetros analisados Faixa Etária Gênero Parasitemia Infecções anteriores Sintomatologia Fonte: elaborada pela autora. 44 Figura 3 - Evidência do Plasmodium vivax em esfregaço de lâmina de sangue periférico em indivíduo positivo no exame de gota espessa coradas com Giemsa (A e B). Setas pretas apontam eritrócitos infectados pelo Plasmodium em forma de trofozoítos jovens (1) e lise eritrocitária com liberação de merozoítos na corrente sanguínea (2). Imagem capturada por microscopia óptica. Ampliação de 100x. Fonte: elaborada pela autora. Como já mencionado, 8 gestantes infectadas pela malária participaram do estudo, e foram classificadas quanto ao trimestre gestacional, quantidade de gestações, paridade, aborto e infecções anteriores pela malária (Tabela 3). Das 8 gestantes, 7 estavam no segundo trimestre e 1 no segundo. Não houve gestante infectada no primeiro trimestre gestacional. Quanto à quantidade de gestações, 4 eram primigestas, 2 secundigestas e outras 2 multigestas. Quanto à paridade, 4 gestantes eram nulíparas, 3 primíparas e 1 gestante multípara. Das gestantes, 7 negaram qualquer tipo de aborto e 1 afirmou ter tido 1 aborto. Em relação à infecção por malária na gestação atual ou em anteriores, 3 gestantes afirmaram terem sido infectadas 3 vezes pela malária, 1 foi infectada 2 vezes, 3 já foram infectadas uma vez e uma gestante declarou-se primoinfectada. 45 Tabela 3 - Descrição epidemiológica das gestantes infectadas pelo Plasmodium vivax. Número absoluto Frequência relativa Segundo 7 87,5% Terceiro 1 12,5% Primigesta 4 50% Secundigesta 2 25% Multigesta 2 25% Nulípara 4 50% Primípara 3 37,5% Multipara 1 12,5% Sim 1 12,5% Não 7 87,5% Sim 7 87,5% Não 1 12,5% Parâmetros analisados Trimestre Gestações Paridade Aborto Infecções anteriores Fonte: elaborada pela autora. 4.2 DADOS HEMATOLÓGICOS Os dados hematológicos dos indivíduos infectados foram analisados seguindo-se a divisão nos seguintes grupos: controles (C); infectados (I); gestantes sadias (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Na Tabela 4 têm-se o resultado do teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Podese verificar que as variáveis hematócrito, leucócitos totais, plaquetas, monócitos, linfócitos T CD4, linfócitos B, CD4+CD45RA, CD4+CD45RO, CD4+ICOS, CD8+ICOS, CD4+CD25+CD127hi e CD4+CD25+CD127low apresentam distribuição normal (p>0,05), entretanto, as variáveis linfócitos T CD8, CD4+CD69+, CD8+CD69+, CD19+CD69+, CD14+HLA-DR, CD4+HLA-DR, CD4+CD95Fas, CD8+CD95Fas, CD4+OX40, CD8+OX40, CD14+GITR, CD4+GITR, NOx e H2O2 não apresentam distribuição normal 46 (p<0,05). O grupo de gestantes infectadas (GI), apresentou número amostral menor que 5, sendo assim foi utilizado teste estatístico para variáveis sem distribuição normal para os grupos de gestantes. Em relação às citocinas, foi utilizado teste estatístico sem distribuição normal também por conta do pequeno número amostral em alguns grupos. Com isso as variáveis com distribuição normal foram avaliadas através do teste t de Student independente, enquanto que as variáveis sem distribuição normal foram avaliadas através dos testes de Mann-Whitney (2 grupos) e Kruskal-Wallis (3 ou mais grupos). Tabela 4 - Valor do teste de normalidade de Skapiro-Wilk das variáveis numéricas utilizadas no estudo. Controles (C); infectados (I); gestantes sadias (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Variáveis Hematócrito (%) Leucócitos totais (103/mm3) Plaquetas (103/mm3) Monócitos (%) Linfócitos T CD4 (%) Linfócitos T CD8 (%) Linfócitos B (%) CD4+CD45RA (%) CD4+CD45RO (%) CD4+CD69+(%) CD8+CD69+(%) CD19+CD69+(%) CD14+HLA-DR (MFI) CD4+HLA-DR (%) CD4+CD95Fas (MFI) CD8+CD95Fas (MFI) CD4+OX40 (MFI) CD8+OX40 (MFI) CD4+ICOS (%) CD8+ICOS (%) CD14+GITR (MFI) CD4+GITR (MFI) CD4+CD25+CD127hi (%) CD4+CD25+CD127low (%) NOx (µM) H2O2 (µM) Valor de p Controle (C) 0,83 0,57 0,32 0,06 0,25 0,009 0,23 0,54 0,92 0,07 0,009 0,01 0,50 0,88 0,45 0,04 0,009 0,02 0,41 0,09 0,90 0,32 0,009/G 0,008 0,46/ G 0,009 Infectado (I) 0,40 0,94 0,26 0,30 0,06 0,41 0,08 0,23 0,23 0,01 0,24 0,10 0,009 0,009 0,01 0,75 0,002 0,002 0,19 0,41 0,007 0,009 0,24 0,40 0,008/ GI 0,68 0,06/ GI 0,88 Fonte: elaborada pela autora. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre o percentual de hematócrito dos indivíduos infectados em relação ao grupo controle (Figura 4A). Da mesma forma, não foi verificada diferença estatística (p>0,05) no grupo de gestantes (Figura 4B). 47 Quanto aos leucócitos totais, os indivíduos infectados apresentaram leucopenia significativa (p<0,05) se comparados a pessoas sadias (Figura 4C). Entre as gestantes não foi verificada diferença estatística (p>0,05) em relação aos leucócitos totais (Figura 4D). Indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax (gestantes ou não) apresentaram plaquetopenia significativa (p<0,05) em relação aos respectivos controles (Figuras 4E e 4F). Figura 4 - Média dos valores de hematócrito (%) (A), leucócitos totais (103/mm3) (C) e plaquetas (103/mm3) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de hematócrito (%) (B), leucócitos totais (103/mm3) (D) e plaquetas (103/mm3) (F) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). *p< 0,05; ***p<0,0005. Fonte: elaborada pela autora. 48 4.3 ANÁLISE FENOTÍPICA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax 4.3 1 População de monócitos, Linfócitos T (CD4+ e CD8+) e B A frequência relativa dos monócitos e linfócitos T CD4+ não apresentaram diferenças significativas entre os grupos infectados e os respectivos controles (p>0,05) (Figura 5A, 5B, 5C, 5D, respectivamente). Também não houve diferença entre o percentual de linfócitos T CD8+ entre o grupo de infectados (p>0,05) (Figura 5E). Entretanto, as gestantes infectadas apresentaram diminuição de células T CD8+ em relação às gestantes sadias (p<0,05) (Figura 5E). Quando observado o percentual de linfócitos B, constatou-se que nos indivíduos infectados essas células diminuíram significativamente (p<0,05) (Figura 5G), por outro lado, não houve diferença significativa (p>0,05) entre o grupo de gestantes ((Figura 5H). 49 Figura 5 - Média dos valores de monócitos (%) (A), linfócitos T CD4+ (%) (C), linfócitos B (%) (G) e mediana de linfócito T CD8+ (%) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de monócitos (%) (B), linfócitos T CD4+ (D), linfócitos T CD8+ (F) e linfócitos B (H) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (CG) e gestantes infectadas pela malária (GI). **p< 0,005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.2 Expressão de Marcadores de Células naive e de memória Diferentes isoformas da molécula CD45 são expressas na superfície dos linfócitos T durante o processo de diferenciação celular. Avaliou-se a expressão das isoformas CD45RA (presente em linfócitos T naive ou em células não ativadas) e CD45RO (presente em linfócitos T de memória ou em células ativadas) em linfócitos T CD4+. As populações de linfócitos T CD4+ foram divididas em uma janela de tamanho 50 e granulosidade, e posteriormente pela positividade do marcador CD45RA e CD45RO (Figura 6). Em termos percentuais não foram encontradas diferenças significativas (p>0,05) entre os grupos avaliados em relação ao marcador CD45RA (Figura 7A e 7B). Resultado parecido foi obtido com a isoforma CD45RO, onde não foi registrada diferença significativa (p>0,05) entre os grupos comparados (Figura 7C e 7D). Figura 6 - Expressão dos marcadores CD45RA e CD45RO em linfócitos T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 51 Figura 7 - Média dos valores de células T CD4+CD45RA (%) (A) e T CD4+CD45RO (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+CD45RA (%) (B) e T CD4+CD45RO (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 4.3.3 Expressão de marcadores de ativação na malária pelo Plasmodium vivax 4.3.3.1 Expressão de CD69 em Linfócitos T (CD4 e CD8) e B O CD69 é um marcador de ativação expresso por linfócitos T e outros tipos celulares no início da exposição a um estímulo. A expressão de CD69 em linfócitos T (CD4 e CD8) e linfócitos B (CD19) foi analisada e exemplos representativos podem ser observados nas figuras 8, 9 e 10, respectivamente. Os indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax (gestantes e não gestantes), apresentaram frequência significativamente maior (p<0,05) de células T CD4+CD69+ se comparados aos respectivos controles (Figura 11A e 11B). Da mesma forma, um aumento significativo (p<0,05) na frequência relativa de células CD69+ dentre linfócitos 52 T CD8+ também foi observado grupos infectados (gestantes e não gestantes) (Figura 11C e 11D). Resultado semelhante foi obtido nos linfócitos B, onde também houve um aumento significativo (p<0,05) na frequência desse marcador nos grupos de infectados, em relação aos respectivos controles (Figura 11E e 11F). Figura 8 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 53 Figura 9 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 54 Figura 10 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos B de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 55 Figura 11 – Mediana dos valores de células T CD4+CD69+(%) (A), T CD8+CD69+(%) (C) e CD19+CD69+(%) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores células T CD4+CD69+(%) (B), T CD8+CD69+(%) (D) e CD19+CD69+(%) (F) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). **p< 0,005; ***p<0,0005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.3.2 Expressão de HLA-DR em monócitos e linfócitos T CD4+ O HLA-DR é uma molécula apresentadora de antígeno em monócitos e marcador de ativação em linfócitos T CD4+. A expressão de HLA-DR em monócitos foi estimada através da mediana de fluorescência (Figura 12) e em linfócitos T CD4+ esta 56 molécula foi estimada através da frequência relativa de células T CD4 +HLA-DR+ (Figura 13) em indivíduos sadios e infectados. Figura 12 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. 57 Figura 13 - Expressão de células T CD4+HLA-DR de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. Não houve diferença significativa (p>0,05) na mediana de intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos nos grupos de infectados (gestantes ou não) (Figura 14A e 14B). Em relação à expressão de HLA-DR em linfócitos T CD4+ houve aumento significativo (p<0,05) dessa molécula no grupo de infectados (Figura 14C), mas não foi detectada diferença estatística significativa (p>0,05) entre os grupos de gestantes infectadas pela malária (Figura 14D). 58 Figura 14 - Mediana da intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos (A) e mediana dos valores de células CD4+HLA-DR (%) (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos (B) e mediana dos valores de células CD4+HLADR (%) (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). **p<0,005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.4 Expressão do marcador de apoptose (CD95 Fas) em linfócitos T O CD95 (Fas) é um marcador de apoptose presente nas células T e foi avaliado a partir da mediana da intensidade de fluorescência em células T CD4+ (Figura 15) e CD8+ (Figura 16). A análise de CD95 (Fas) em células T CD4+ mostrou que os infectados apresentaram aumento significativo (p<0,05) na mediana de intensidade de fluorescência em relação ao controle (Figura 17A). Apesar das gestantes infectadas terem apresentado mediana de fluorescência maior que o grupo controle esse aumento não foi estatisticamente significante (p>0,05) (Figura 17B). Quando a análise de CD95(Fas) foi realizada em células T CD8+, os infectados pelo P. vivax tiveram mediana de fluorescência significativamente maior (p<0,05) comparados ao controle 59 (Figura 17C). As gestantes infectadas também apresentaram aumento significativo (p<0,05) na mediana de fluorescência de CD95 Fas em linfócitos CD8+ (Figura 17D). Figura 15 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. Figura 16 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. 60 Figura 17 - Mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ (A) e T CD8+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ (B) e T CD8+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). **p<0,005; ***p<0,0005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.5 Expressão de moléculas coestimulatórias 4.3.5.1 Expressão de OX40 em linfócitos T (CD4+ e CD8+) O OX40 é uma molécula coestimulatória presente na superfície de linfócitos e faz parte do grupo de receptores membros da família do TNF. Foi avaliado quanto à mediana da intensidade de fluorescência em células T CD4+ (Figura 18) e T CD8+ (Figura 19). 61 Figura 18 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. Figura 19 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. 62 Em células T CD4+ a mediana da intensidade de florescência de OX40 foi significativamente maior (p<0,05) em pessoas infectadas, se comparado ao respectivo controle (Figura 20A). No grupo das gestantes também houve aumento significativo (p<0,05) na mediana de fluorescência de OX40 em células T CD4+ nas gestantes infectadas (Figura 20B). Em células T CD8+ a mediana de fluorescência aumentou de forma significativa (p<0,05) entre os indivíduos infectados não gestantes (Figura 20C) e gestantes (Figura 20D) quando comparados com os respectivos controles. Figura 20 - Mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4 + (A) e T CD8+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4+ (B) e T CD8+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). *p< 0,05; **p<0,005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.5.2 Expressão de ICOS em linfócitos T (CD4+ e CD8+) O marcador ICOS é uma molécula coestimulatória presente nos linfócitos T, e foi avaliado quanto à expressão em células T CD4+ e T CD8+. 63 Na população de células T CD4+, os pacientes infectados tiveram um aumento significativo (p<0,05) na expressão e frequência do marcador ICOS, em relação ao controle (Figuras 21 e 23A). Da mesma forma, o grupo de gestantes infectadas apresentou expressão e frequência de ICOS significativamente maior (p<0,05) em relação às gestantes sadias (Figuras 21 e 23B). A expressão de ICOS na população de T CD8+ teve aumento significativo (p<0,05) no grupo de pacientes infectados (não gestantes e gestantes) (Figura 22). Indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax tiveram aumento significativo (p<0,05) da frequência de ICOS em linfócitos T CD8 + (Figura 23C), e resultado semelhante foi encontrado no grupo de gestantes (Figura 23D). Figura 21 - Expressão de células T CD4+ICOS de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 64 Figura 22 - Expressão de células T CD8+ICOS de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 65 Figura 23 - Média dos valores de células T CD4+ICOS (%) (A) e T CD8+ICOS (%) (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+ICOS (%) (B) e T CD8+ICOS (%) (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI).**p<0,005; ***p<0,0005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.5.3 Expressão de GITR em monócitos e linfócitos T CD4+ O GITR é um receptor presente em várias células da imunidade inata (como monócitos) e adquirida, sendo que nos linfócitos T seu papel está relacionado com ativação, atividade supressora e apoptose das células T. Esse marcador foi analisado a partir da mediana da intensidade de fluorescência em monócitos (Figura 24) e linfócitos T CD4+ (Figura 25). 66 Figura 24 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de GITR em células CD14 + de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. Figura 25 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de GITR em células CD4 + de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes). Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Linhas pretas: grupos controles; linhas vermelhas: grupos infectados pelo Plasmodium vivax. Fonte: elaborada pela autora. A mediana de fluorescência de GITR em monócitos (CD14 +) foi significativamente maior (p<0,05) nos indivíduos infectados (Figura 26A), entretanto 67 não houve diferença significativa (p>0,05) no grupo de gestantes (Figura 26B). Apesar do aumento da mediana de fluorescência de GITR em células T CD4+ nos indivíduos infectados, não houve diferença significativa (p>0,05) entre esse grupo (Figura 26C). Em células T CD4+ o grupo de gestantes infectadas apresentou aumento significativo (p<0,05) na mediana de intensidade de fluorescência de GITR em relação às gestantes controles (Figura 26D). Figura 26 - Mediana da intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ (A) e linfócitos T CD4+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ (B) e linfócitos T CD4+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). *p<0,05; **p< 0,005. Fonte: elaborada pela autora. 4.3.6 Análise da expressão de CD25 em células T CD4+: células T ativadas e regulatórias A molécula CD25 é o receptor de IL-2 (citocina que promove a proliferação celular), e é expressa em todas as células ativadas. As células regulatórias possuem o 68 fenotípico típico CD4+CD25+FOXp3. Por outro lado, estudos mostram que além da expressão do fator de transcrição (FOXp3), as células Tregs apresentam moléculas de superfície, como o CD127. As células T CD4+ ativadas são representadas pela alta expressão de CD25 e CD127. Sendo que as células T regulatórias possuem o fenótipo CD4+CD25+CD127low(Treg), pela baixa expressão de CD127 (Figura 27). Figura 27 - Expressão de células T CD4+CD25+CD127hi/low de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. Não houve diferença significativa (p>0,05) na expressão de CD4+CD25+CD127hi(células ativadas) entre os grupos deste estudo (Figura 28A e 28B). Em relação à expressão de CD4+CD25+CD127low (células regulatórias), os grupos de 69 indivíduos infectados não gestantes (Figura 28C) e gestantes (Figura 28D) apresentaram frequência significativamente maior (p<0,05) que os respectivos controles. Figura 28 - Média dos valores de células T CD4+CD25+CD127hi (A) e T CD4+CD25+CD127low (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+CD25+CD127hi (B) e T CD4+CD25+CD127low (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI).**p<0.005 ***p<0,0005. Fonte: elaborada pela autora. 4.4 DETECÇÃO DE CITOCINAS NO PLASMA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax A partir do plasma de pacientes (não gestantes e gestantes) e controles analisouse a presença de citocinas pró e anti-inflamatórias que foram quantificadas pelo método CBA. Nas amostras analisadas, os níveis das citocinas IL-2, IL-4, INF e TNF-não foram detectáveis em nenhum dos indivíduos, infectados ou sadios. Alguns infectados pelo P. vivax apresentaram detecção de IL-6 (Figura 29A) e algumas gestantes também apresentaram detecção de IL-6 (Figura 29B). No que diz 70 respeito à citocina anti-inflamatória IL-10, houve baixa detecção no plasma de infectados não gestantes (Figura 29C) e gestantes (Figura 29D). Entretanto, em relação à IL-17, os grupos infectados não gestantes (Figura 29E) e gestantes (Figura 29F) apresentaram diminuição significativa (p<0,05) dos níveis dessa citocina quando comparados aos respectivos controles. Figura 29 - Detecção da produção de citocinas (pg/ml) pró (A e E) e anti-inflamatórias (C) no plasma de controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Detecção da produção de citocinas (pg/ml) pró (B e F) e anti-inflamatórias (D) no plasma de gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax. Controles (C); infectados (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 71 4.5 PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO Foi quantificado os níveis circulantes de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio em amostras do plasma obtidas de mulheres sadias e infectadas pelo Plasmodium vivax. Como observado na figura 30A os níveis de NO apresentaram um discreto aumento nas mulheres infectadas (gestantes ou não) em relação aos grupos controles, porém esta diferença não foi significativa (p>0,05). Quanto à produção de peróxido de hidrogênio, também houve um discreto aumento na concentração nas mulheres infectadas, mas sem diferença estatística (p>0,05) entre os grupos comparados (Figura 30B). Figura 30 - Dosagem de Nitrito + Nitrato (NOx) (A) e H2O2 (B) no plasma de mulheres infectadas pelo Plasmodium vivax. As barras horizontais representam as médias do percentual de células em cada grupo. Controles (C); infectadas (I); gestantes (G) e gestantes infectadas pela malária (GI). Fonte: elaborada pela autora. 72 5 DISCUSSÃO A malária é uma doença infecciosa, parasitária endêmica na maioria dos ecossistemas tropicais e subtropicais do mundo. A transmissão natural da doença é variável em intensidade nas várias partes do mundo e depende de fatores locais como padrões climáticos principalmente nos períodos chuvosos, que dão condições que vida para a proliferação do mosquito vetor. As fontes de infecção humana para os mosquitos são pessoas doentes ou até assintomáticas que albergam formas sexuadas do parasita (OLIVEIRA-FERREIRA, 2010). No Brasil a região amazônica é endêmica para a malária, e as mulheres grávidas constituem um grupo susceptível a infecções pelo Plasmodium. Pesquisas relatam que em 2007, os casos de malária diagnosticados em mulheres grávidas compreendeu 6,7% das infecções confirmadas em mulheres em idade fértil em três municípios localizados na Região Amazônica (LUZ et al., 2013) e que o P. vivax foi a espécie mais predominante (80%) nas infecções. Essa espécie é descrita por causar danos como baixo peso ao nascer, anemia materna e parto prematuro, comprometendo assim a saúde materna e fetal (MCGREADY, 2004). Este trabalho ajuda a delinear aspectos epidemiológicos, hematológicos e imunológicos da infecção pelo Plasmodium vivax em indivíduos residentes em uma região de transmissão ativa de malária no país, o município de Cruzeiro do Sul (AC) uma vez que inclui indivíduos gestantes ou não cujo sangue periférico foi analisado antes do tratamento com antimaláricos, através de metodologias como a citometria de fluxo. A análise da distribuição dos casos por sexo acometido mostrou que a maior parte dos casos ocorreu em mulheres (55%), isto porque um dos focos do nosso trabalho são gestantes, mas de maneira geral os homens são mais acometidos pela malária, o que pode estar relacionado com o tipo de atividade econômica, normalmente de garimpo e agricultura, onde se encontram os criadouros do mosquito vetor, normalmente fora da área peridomiciliar. Neste sentido, Silva (2006) afirma que quando o mosquito penetra no interior dos domicílios as crianças e mulheres, por ficarem mais tempo em casa, são mais infectadas, porém quando a transmissão ocorre fora do domicílio os homens são os mais acometidos. Em uma região de transmissão ativa da doença, como o município de 73 Cruzeiro do Sul, as pessoas estão expostas a adquirir a infecção independente do lugar em que se encontram, seja dentro ou fora de suas moradias. Os adultos jovens foram os mais acometidos pela infecção, o que se justifica pelas condições de moradia e o tipo de trabalho dos acometidos. Baird (2007) afirma que a malária, por atingir os indivíduos em idade produtiva, incapacita-os para o trabalho e isso traz consequências econômicas diretas por conta da diminuição da produtividade. Neste estudo a maioria dos infectados apresentou baixa parasitemia. Esta observação pode estar relacionada ao fato de que a área estudada que é uma região endêmica, onde apenas 1 paciente relatou primoinfecção. Neste sentido a literatura indica que em áreas endêmicas, como o estado do Acre, a parasitemia dos infectados tende a ser baixa ou moderada (CHAGAS, 2009), o que está diretamente relacionado com a gravidade das manifestações clínicas que também são determinadas pela imunidade do indivíduo. Em áreas em que a transmissão da doença é baixa ou instável, a imunidade também é baixa e os indivíduos, inclusive as gestantes podem apresentar doença grave. Sendo assim, como a maioria dos pacientes deste estudo já tinham tido infecções anteriores isso pode justificar manifestações clínicas clássica da doença, sem nenhum sinal de gravidade. Por outro lado, em áreas onde transmissão de malária é alta ou estável, a imunidade específica contra o Plasmodium também é alta e as consequências são geralmente mais brandas. Nas gestantes a doença é mais grave nas primíparas que nas multíparas, o que indica que a aquisição de imunidade concorre para a atenuação das manifestações clínicas (CHAGAS, 2009). Neste estudo a maioria das gestantes infectadas eram primigestas, mas também declararam infecções anteriores o que contribui para a existência de imunidade contra. Apesar de eritrócitos infectados pelo P. vivax serem raramente encontrados na placenta, visto que são raros os receptores para P. vivax, as alterações histológicas são bem parecidas com as infecções pelo P. falciparum. Resultados recentemente publicados mostram que infecções por P. vivax e P. falciparum parecem ter efeitos similares na placenta em áreas de baixa transmissão da malária e onde o tratamento é facilmente disponível (SOUZA, 2013; CHAIKITGOSIYAKUL, 2014). Estudos na região amazônica brasileira mostram que a infecção pelo P. vivax durante a gravidez causa aumento na espessura da placenta com presença de células mononucleares no espaço interviloso comparadas a placentas não infectadas (SOUZA et al, 2013; 74 ATAÍDE et al, 2015) e que o P. vivax é capaz de aderir a glicosaminoglicanos placentários, como o sulfato de condroitina A (CSA) e ácido hialurônico (HA). CHOTIVANICH et al., 2012; CARVALHO et al., 2010). Acredita-se que tais alterações placentárias em infecções pelo P. vivax estão relacionadas às respostas imunes periféricas, anemia e outras alterações causadas pelo protozoário e isso pode acarretar complicações para a mãe e feto. Avaliamos os parâmetros hematológicos dos infectados, que mostraram uma leucopenia periférica durante a fase aguda da doença no grupo de não gestantes. Entretanto no grupo de gestantes não houve diferenças significantes. Alterações induzidas pela malária na contagem das células brancas do sangue incluem a leucopenia, mas os resultados descritas na literatura são diferentes e contraditórios (WICKRAMASINGHE E ABDALLA, 2000). Estudos afirmam que na gestação ocorre a expansão do volume plasmático e as concentrações de hemoglobina e hematócrito diminuem (SOUZA, 2002). Os valores de hematócrito encontrados no presente estudo sugerem uma prevalência de anemia nas gestantes infectadas. Entretanto,a ausência de anemia acentuada nestes pacientes com malária, gestantes ou não, pode ser devido ao diagnóstico precoce e tratamento imediato, de forma gratuita, fornecida pelo programa de controle da malária no Brasil. Na malária a anemia é descrita como alteração hematológica (ANSTEY et al., 2009; BASHAWRI et al., 2002), e acontece devido à própria patobiologia do parasita, que invade as células eritrocíticas e aí realiza parte do seu ciclo biológico. Além disso, a resposta imune do hospedeiro, que é mediada pela liberação de citocinas e pelo aumento do estresse oxidativo, contribui para o processo anêmico (HANDAYANI et al., 2009). Neste estudo houve plaquetopenia durante a infecção pelo P. vivax em gestantes e não gestantes. A trombocitopenia já foi descrita na literatura como alteração nos pacientes maláricos (HIDEMI et al.,1989; BASHAWRI et al., 2002 e SINGH et al., 2011) e é atribuída ao sequestro esplênico, redução da sobrevida das plaquetas e diminuição na sua produção (SINGH, et al., 2011), bem como às reações imunológicas (YAMAGUCHI et al., 1997) ocasionadas pela doença. A literatura descreve que indicadores de estresse oxidativo, especificamente da peroxidação de lipídios, como o malondialdeído (MDA), estão aumentados em amostras de sangue de pacientes trombocitopênicos infectados com P. vivax, demonstrando que as EROS exercem importante papel nas alterações funcionais e estruturais das plaquetas e no mecanismo da trombocitopenia da malária (ARAUJO et al., 2008). Por outro lado, 75 trabalhos que avaliaram os níveis de IFN e a citocina anti-inflamatória IL-10 na infecção pelo Plasmodium berghei mostraram que no plasma de camundongos gestantes infectadas houve aumento significante da produção de NO pela produção de IFN em comparação com camundongos gestantes sadias (INOUE et al., 2013). Apesar deste estudo não ter detectado diferença estatística entre os indicadores do estresse oxidativo (óxido nítrico e peróxido de hidrogênio) nos grupos analisados, o que talvez tenha ocorrido pelo pequeno número amostral que se deu pela curta estadia em Cruzeiro do Sul, principalmente no grupo de gestantes infectadas. Erel e colaboradores (2001) mostraram que há um aumento do estresse oxidativo durante a malária, o que pode está relacionado com a redução de plaquetas nos pacientes (EREL et al., 2001). Em relação à caracterização fenotípica dos leucócitos totais, não foram observadas diferenças significativas entre a população de monócitos e linfócitos T CD4. Estudos relatam que apesar da frequência de monócitos e linfócitos totais não se alterar durante a infecção malárica existem uma grande ativação de subpopulações de leucócitos durante a infecção (KASSA, 2006). Inicialmente, acreditava-se que ocorria uma completa supressão dos leucócitos durante a gestação (KUHNERT, 1998), entretanto com a evolução das pesquisas nessa área se verificou mudança no status de ativação bem como na frequência destas células. Pesquisas demonstram que existe uma leucocitose periférica total de células a partir do estágios iniciais de gravidez, sem qualquer alteração na contagem de T CD4+ e CD8+ Nossos resultados apontam que as gestantes infectadas apresentaram diminuição de linfócitos T citotóxicos, o que contradiz a literatura, que afirma que há um aumento de células T CD8+ efetoras durante infecção por P. vivax (SALWATI et al., 2011). As células T CD8+ desempenham um papel protetor contra o parasita, especialmente na fase pré-eritrocítica, em experimentos de malária em camundongos (TSUJI, 2010). A observação de pacientes em área endêmica, assim como o Estado do Acre, sugere que a imunidade à infecção por malária se desenvolve de uma maneira incompleta e vagarosa (LANGHORNE, 2008; GUPTA, 1999). Portanto, espera-se que a exposição regular ao P. vivax possa manter células T citotóxicas em controle nos indivíduos não infectados expostos à malária. Entre os infectados não gestantes não houve diferença significativa no percentual total de linfócitos T CD8+. As células T possuem um papel fundamental no desenvolvimento da resposta imune, por exemplo, na ativação de células B (MOUNT, 2004) para consequente 76 produção de anticorpos (WIPASA, 2010) e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), que na maioria das vezes controla, mas não é capaz de eliminar de o parasita (BOUHAROUN-TAYOUN, 1995). Neste estudo as gestantes não apresentaram diferença em relação ao percentual de linfócitos B, mas o grupo de infectados não gestante teve diminuição significante de linfócitos B. Na malária, os linfócitos B, responsáveis pelas respostas imunes humorais, produzem anticorpos específicos resultantes da exposição natural ao parasita, e são importantes para conferir proteção contra as formas sanguíneas do parasita. Os anticorpos anti-Plasmodium podem impedir merozóitos de infectar novas hemácias do sangue (RBC) e promover a fagocitose por células mononucleares (TAYLORROBINSON, 2010; WIPASA et al., 2002; BEESON et al., 2008). No entanto, a persistência de níveis significativos de anticorpos contra a malária baseia-se na exposição contínua à infecção (LANGHORNE et al., 2008). Estudos afirmam que os níveis de linfócitos diminuem durante a infecção malárica e tal alteração ocorre ou pela presença células linfóides em órgãos centrais ou mesmo pela apoptose induzida em células mononucleares humanas (HVIID et al., 1997; BALDE et al., 2000; XU, 2002). O que justificaria a diminuição de linfócitos T CD8 e linfócitos B nos indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax. Em relação ao marcador de apoptose CD95 (Fas) nossos pacientes apresentaram aumento na expressão em células T CD4+ e T CD8+, em ambos os grupos infectados. A apoptose mediada pela interação Fas (CD95)/FasL (CD95L ou CD178) é bem caracterizada em células T efetoras. A molécula Fas é altamente expressa em células T naive, mas nessa fase as células apresentam grande resistência à morte através desta molécula. No entanto, após a ativação, as células T CD4+ e CD8+ tornam-se sensíveis a apoptose mediada por Fas e aumentam a expressão FasL quando reestimuladas através do TCR, tornando-se sensíveis ao fenômeno denominado AICD (morte celular induzida por ativação), fenômeno esse observado em pacientes gestantes ou não (FRITZSCHING et al., 2005; KRAMMER et al., 2000; SCHMITZ et al., 2004). Dessa forma, marcadores com o CD95 (Fas) são associados a células T ativadas, indutores de morte celular através da ligação entre eles. Em células T efetoras e células T regulatórias a expressão de Fas aumenta após ativação (STRAUSS et al., 2009), mas na presença de IL-2 (citocina que promove proliferação de células efetoras) as células T regulatórias adquirem resistência a apoptose mediada por Fas, enquanto que em baixos níveis dessa citocina as Tregs 77 tornam-se sensíveis à morte mediada por células T CD4+ efetoras. Em nosso trabalho não foi detectada produção de IL-2, o que pode estar relacionado ao aumento do marcador de apoptose nos grupos infectados. Também avaliamos a expressão de duas isoformas da molécula CD45 (CD45RA/CD45RO), expressa em todas as células de origem hematopoietica. O CD45 é uma tirosina fosfatase envolvida na transmissão de sinais entre células T e B (TROWBRIDGE & THOMAS, 1994). Diferentes isoformas desse antígeno são expressas na superfície dos linfócitos T durante o processo de diferenciação celular. A expressão da isoforma CD45RA é típica de linfócitos T naive, enquanto que a isoforma CD45RO está associada aos linfócitos T de memória (MICHIE et al., 1992). No presente estudo, não houve diferença significativa entre os grupos analisamos quanto à expressão de CD45RA e CD45RO. Por outro lado a literatura descreve que o aumento dessas células na infecção pela malária pode se dar durante a hiperativação de células T ou, mais provavelmente, durante a transição natural do fenótipo naive para fenótipo de memória (PEAKMAN et al., 1994). Um estudo realizado na China demonstrou que pacientes infectados por P. vivax apresentaram aumento do número de células T CD4+ de memória (JANGPATARAPONGSA et al., 2012). Em outro realizado na Tailândia (JANGPATARAPONGSA et al., 2006) foi demonstrado que durante a infecção aguda e também na fase de convalescência, níveis elevados de células T CD4+ de memória estavam presentes. Vale ressaltar que países como China e Tailândia apresentam condições demográficas e sociais diferentes das do Brasil, o que pode influenciar nessas mudanças de resposta imune. Para avaliar a ativação do sistema imunológico durante a infecção, utilizamos marcadores como o CD69 e o HLA-DR. O CD69 é uma molécula expressa em linfócitos logo no início da exposição a um estímulo. Nos três grupos celulares analisados (Linfócitos T CD4+, T CD8+ e B), houve aumento na frequência de CD69 nos indivíduos infectados, e as gestantes infectadas seguiram a mesma dinâmica, com aumento significante na expressão dessa molécula de ativação em relação às gestantes sadias. Os infectados pelo P. vivax apresentaram significativo aumento na frequência de HLA-DR em linfócitos T CD4+, células onde o HLA-DR se apresenta como molécula de ativação. O que corrobora com achados referentes à infecção pelo P. falciparum, onde também foi observado um aumento significativo na expressão de HLA-DR por células T CD4+. 78 Moléculas de HLA-DR são importantes na geração de respostas imunitárias a micro-organismos, uma vez que a sua principal função em monócitos é apresentar peptídeos para ativação e a diferenciação de células T CD4 +. Entre os vários subconjuntos de células T CD4+ (Th1, Th2, e Th17) tem como papel orquestrar respostas celulares e/ou humorais necessário para combater infecções (HANANANTACHAI et al., 2005). Nesta pesquisa o HLA-DR em monócitos não mostrou diferença significativa entre os grupos analisados. O aumento na expressão e frequência de moléculas de ativação na superfície de linfócitos durante a infecção pelo Plasmodium vivax se justifica pela grande resposta imune decorrente da infecção malárica, que leva a um recrutamento de células inflamatórias e produção de citocinas a fim de eliminar o patógeno. Estes dados corroboram com os dados da literatura que constatam grande ativação do sistema imune em indivíduos infectados pelo Plasmodium, inclusive em gestantes, o que acarreta o aumento da expressão marcadores de ativação como HLA-DR, CD69 e CD71 em células efetoras (ROETYNCK et al., 2006). No presente trabalho também avaliamos a expressão de moléculas coestimulatórias, que atuam de diferentes maneiras frente a uma infecção e estão presentes em várias células. Os indivíduos infectados apresentaram aumento significativo na mediana de fluorescência de OX40 em células T CD4+ e T CD8+. Apesar de não haver dados na literatura que relatem a presença dessa molécula na malária gestacional, este trabalho constata que a mediana de fluorescência desse marcador foi semelhante em grupos gestantes ou não infectados pelo P. vivax. O OX40 está relacionado com células regulatórias e efetoras. Nas células Treg, é expressa constitutivamente, enquanto nas T efetoras está expressa apenas após a ativação (GRAMAGLIA et al., 1998). Estudos demonstram que células T CD4+CD25FOXp3- podem se diferenciar em células positivas, e que o OX40 está relacionado com esse mecanismo (SO e CROFT, 2007). Camundongos deficientes de OX40 apresentam redução de células regulatórias, enquanto que a presença desse marcador nos animais acarreta um aumento da frequência de Tregs (XIAO et al, 2012). Pesquisas mostram que a inibição da molécula OX40 em camundongos infectados pelo P. chabaudi causa drástica redução da proliferação das células T CD4+ convencionais e Treg (ALVES, 2013). 79 O ICOS é uma molécula pertencente à família de coreceptores como o CD28, e desempenha um papel importante na estimulação, proliferação e sobrevivência de células T (KORNETE et al., 2012). Essa molécula é induzida no período de 48 h após a ativação com a coestimulação da molécula CD28 nas células T CD4 + e CD8+, entretanto o ICOS e o CD28 tem finalidades diferentes. Enquanto o CD28 é responsável por primar a célula, o ICOS regula a ação efetora (HARADA et al., 2003). Neste trabalho os linfócitos T CD4+ e T CD8+ de infectados, tiveram aumento significante da frequência de ICOS, resultado semelhante foi encontrado por Costa (2013), onde pacientes em fase aguda da infecção pelo P. vivax tiveram aumento na expressão de ICOS. Não há registros na literatura que associem essa molécula à malária gestacional, mas nossos resultados sugerem que durante a malária a expressão de ICOS aumenta também nos linfócitos T de gestantes. O ICOS é expresso em baixos níveis nas células naive, porém sua expressão é elevada após sinalização via TCR e CD28 (MCADAM, 2000). Apesar de ser expresso em células T ativadas do tipo Th1, Th2, Th17 e Treg, a expressão de ICOS é mais acentuada em respostas com perfil Th2, quando comparadas àquelas que polarizam para o perfil Th1 (KORNETE et al., 2012). Seu ligante, o ICOS-L, é encontrado em células B, T, monócitos e células dendríticas (GREENWALD, 2005). A literatura descreve que o ICOS é uma molécula importante na interação entre a célula T CD4+ e célula B. E que os níveis de expressão desse marcador está relacionado com citocinas produzidas; células T CD4+ com baixa expressão de ICOS estariam relacionadas à produção de IL-2, IL-3 e IL-6, citocinas produzidas nas fases iniciais da resposta imune. Células com níveis intermediários de ICOS estariam relacionadas com a produção de citocinas pró-inflamatórias de perfil Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13); níveis altos de ICOS relacionariam com síntese de IL-10, citocina antiinflamatória. Neste trabalho observamos uma baixa detecção de IL-6 e IL-10 no plasma de indivíduos infectados, mas não foi possível classificar o nível da expressão de ICOS. Marks e colaboradores (2007), identificaram que na presença de IL-10 as Treg mostram ser dependentes da expressão de ICOS para a supressão in vitro e in vivo frente a uma infecção (MARKS et at., 2007). A importância da molécula ICOS para a proliferação de células Treg foi relatada em camundongos, onde animais na presença de antígeno tiveram aumento na expressão de ICOS e proliferação de células regulatórias, por outro lado, camundongos nockout 80 para ICOS não apresentam aumento da proliferação de células Treg após estímulo (BUSSE et al., 2012). Neste trabalho a molécula GITR foi avaliada em monócitos e linfócitos. Estudos mostram que estímulos pró-inflamatórios são capazes de induzir a expressão do ligante GITR (GITRL) nas superfícies de células APCs, macrófagos e células endoletiais (KIM, et al., 2010). Em monócitos o GITR aumenta após a ativação celular e durante processos inflamatórios (SHEVACH, 2006; CUZZOCREA et al., 2006; SANTUCCI et al., 2007; NAKAE et al., 2006) e estimula a produção de fatores pró-inflamatórios. Neste estudo o aumento da mediana de fluorescência de GITR em monócitos foi significativo entre os indivíduos não gestantes infectados pelo P. vivax. Por outro lado, estudos utilizando anticorpos agonistas anti-GITR, ou GITRL solúvel demonstraram que a via GITR-GITRL induz sinais de coestimulação ativando células T regulatórias, CD4+ efetoras e CD8+, mesmo estas células apresentando funções diferenciadas (KAMIMURA et al., 2009). Em linfócitos T CD4+ a mediana de fluorescência de GITR, foi maior em ambos os grupos de infectados, mas o resultado foi significativo no grupo das gestantes. Nocentini (2007) afirma que o GITR desencadeia atividade efetora em células T, pois é expresso em altos níveis nas células regulatórias, tendo um papel importante na modulação da atividade supressora das Tregs, sendo regulada positivamente em células T CD4+ convencionais após ativação , atuando na proliferação e produção de citocinas em células T efetoras (NOCENTINI et al., 2007). Pesquisas iniciais relacionadas com os efeitos de GITR em células Treg indicaram que a interação deste receptor com seu ligante conduz a atividade supressora das Tregs (MCHUGH, 2002; SHIMIZU, 2002; SHEVACH, 2006), a valorização do potencial da sua função supressora (SHEVACH, 2006) além da proliferação das células T regulatórias (NISHIOKA, 2008; NOCENTINI, 2007). Estudos demonstram que durante a infecção pelo P. vivax ocorre o aumento de GITR em células regulatórias de infectados (BUENO, 2010). E experimentos de malária em camundongos sugerem que a infecção altera a sinalização GITR via Tregs, suprimindo o sistema, e assim a resposta imune, o que eventualmente, contribui para a fuga de parasitas da imunidade da célula T do hospedeiro (HISAEDA, 2005). Os marcadores coestimulatórios interagem com diferentes populações celulares, tais como APC, células efetoras ou regulatórias, e dessa forma trazem diferentes respostas que podem resultar na estimulação ou inibição do sistema imune. As 81 moléculas coestimulatórias apresentadas neste trabalho, até então não tinham sido analisadas em gestantes infectadas pelo Plasmodium vivax, necessita-se então de mais investigações sobre a interação das moléculas OX40, ICOS e GITR e a malária gestacional. No entanto, os resultados semelhantes entre os grupos infectados sugerem que o sistema imunológico periférico na gravidez se comporta de forma parecida com o sistema de pessoas não grávidas durante a infecção malárica, ao menos no que diz respeito à expressão dessas moléculas. Como já discutido anteriormente as moléculas coestimulatórias apresentam relação com as células regulatórias, uma população de 5 a 10% de linfócitos CD4 + periféricos em humanos que são fundamentais para a manutenção da tolerância imunológica (ALLAN; PASSARINI; BACCHETTA, 2005), porque atuam como supressoras das respostas imunes através do contato direto com células imunes efetoras e/ou pela produção de citocinas regulatórias, como TGF e IL-10 (BELKAID, 2007). Estudos demonstram que a utilização do CD25 em conjunto com o CD127 poderia fornecer resultados fidedignos da frequência de Tregs no sangue periférico. Por meio da utilização do CD127, pode-se distinguir populações de células efetoras recémativadas pela alta expressão desse marcador (CD4+CD25+CD127hi), além de células Tregs que apresentam baixa expressão de CD127 (CD4 +CD25+CD127low) (SEDDIKI et al., 2006; LIU et al., 2006). Liu e colaboradores observaram que a maioria das células CD4+FOXp3+, fator de transcrição interno de células regulatórias, expressavam CD25hiCD127low. Neste estudo as células regulatórias aumentaram em frequência e expressão em ambos grupos de indivíduos infectados (gestantes ou não). Na gravidez existem evidências do aumento de células T regulatórias (ALUVIHARE, 2004), através de potentes propriedades imuno supressoras que fazem as células regulatórias desempenharem um papel essencial na manutenção da tolerância imunológica periférica (JOSEFOWICZ, et al. 2012, LITTMAN e RUDENSKY 2010; WING E SAKAGUCHI, 2010). Em humanos, ainda existem poucos estudos sobre o papel das Tregs e a imunidade antimalárica, porém trabalhos tem mostrado que ocorre um aumento significativo da população de células Treg nas infecções com P. falciparum e P. vivax (BUENO, 2011). A expansão das células Tregs durante a infecção malárica humana e experimental parece estar relacionada com o aumento da carga parasitária (GONÇALVES, 2010), inclusive em infecções pelo Plasmodium vivax em indivíduos 82 de áreas endêmicas (BUENO, 2010); isto porque uma supressão da resposta do padrão Th1 na malária leva o parasito a ter condições favoráveis para seu desenvolvimento sanguíneo. Durante a gestação o acúmulo Tregs não está restrita apenas a órgãos reprodutores femininos (WINGER, 2011). A importância das Tregs maternas na tolerância fetal foi sugerida pela primeira vez por sua expansão progressiva na gravidez humana saudável e menor expansão nos casos aborto espontâneo se comparado ao aborto provocado (SASAKI, et al. 2004, SOMERSET, et al. 2004), sendo assim falha do sistema imune materno em aumentar os níveis de T regs circulantes está relacionada com a perda da gravidez (ROWE, 2013). Em gestantes, ocorre a supressão sistêmica de respostas pró-inflamatórias a partir de células T auxiliares (Th1), dessa forma a produção de IL-10, citocina anti-inflamatória produzida por células regulatórias pode estar presente no plasma das gestantes (RAGHUPATHY, 1997), entretanto neste estudo não foi verificada detecção de IL-10 nas gestantes sadias. A produção de citocinas antiinflamatórias, como a IL-10, relacionada com a supressão das células regulatórias (BELKAID, 2007), bloqueia a síntese de INF e modula negativamente a expressão de moléculas de MHC I e II, o que impede o desenvolvimento de respostas Th1 exacerbadas, envolvidas com a patogênese da malária. Neste estudo a detecção de IL-10 foi baixa, mas esteve presente no plasma dos indivíduos infectados, inclusive nas gestantes. Outros trabalhos também realizados em pacientes infectados pelo P. vivax apresentam níveis aumentados de IL-10 no sangue de infectados não gestantes (LEORATTI, 2012) e gestantes (ATAÍDE et al, 2015). Além do aumento de marcadores de ativação e de células regulatórias, durante a infecção pelo P. vivax há aumento de citocinas pró-inflamatórias (LEORATTI, 2012; ANDRADE, 2010; LYKE, 2004). A resposta imune na malária causada por P. vivax é caracterizada, portanto, pela participação de citocinas do perfil Th1, as quais são importantes para o controle do número de parasitas circulantes (SIDDIQUI et al., 2007). Estudos mostram que dentre as citocinas produzidas por macrófagos, linfócitos T ativados, células de Kupffer, células NK e células endoteliais, se destacam a INF, TNF e IL-6 que participam da inibição do desenvolvimento do estágio hepático e sanguíneo do parasita através da ativação de células e mediadores inflamatórios que visam eliminar o parasita. A IL-6 tem a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica e iniciar a síntese de prostaglandina E2 no hipotálamo, por isso ocorre 83 mudança na temperatura corporal causando a febre (BANKS, 1994), a hipertermia foi um sinal constatado em boa parte dos nossos pacientes. Neste estudo não houve detecção de INF e TNF e a detecção de IL-6 no sangue periférico dos infectados (gestantes ou não) foi baixa. Outros trabalhos também já relataram a presença dessa citocina no sangue periférico de pacientes de áreas endêmicas infectados pelo Plasmodium (LEORATTI, 2012; IBITOKOU, 2014), inclusive em gestantes infectadas pelo P. vivax, residentes em áreas endêmicas, que tiveram maior detecção de IL-6 no sangue da placenta que no sangue periférico (ATAÍDE et al. 2015). Outra citocina investigada em nosso trabalho foi a IL-17, produzida por células T (Th17), e contribui largamente para a inflamação por neutrófilos e indução da secreção de vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo IL-1, IL-6 e quimiocinas (KOLLS E LINDEN, 2004; KORN et al, 2009). Na verdade, pouco se sabe sobre a função dessa citocina em infecções por protozoários, sugerindo que o papel das células Th17 em doenças parasitárias continua a ser elucidado. Além disso, a associação deste subconjunto de células T na infecção por Plasmodium ainda é pouco compreendida. Em nossos achados, os pacientes infectados apresentaram diminuição significativa de IL-17 em relação aos controles. Bueno (2012), por sua vez observou aumento de IL-17 em infectados pelo Plasmodium vivax. Nesse mesmo trabalho houve uma correlação positiva entre a IL-17 e células produtoras de citocinas antiinflamatórias, como IL-10 e TGF A produção de IL-17 por células T CD4+ foi anteriormente descrita durante a infecção pela malária em células regulatórias (BUENO et al., 2010; SCHOLZEN et al., 2009). De fato, pode existir uma relação entre Th17 e Treg, como já foi demonstrado in vitro (KIMURA E KISHIMOTO, 2010) e o saldo entre estas células podem conduzir a susceptibilidade ou resistência contra o parasita na infecção por malária. Pesquisas sobre as alterações imunológicas durante a malária podem contribuir para o entendimento da reação dos indivíduos frente a esta infecção parasitária de grande magnitude. Assim, neste trabalho evidenciamos a presença de plaquetopenia, bem como aumento de marcadores de ativação, como o CD69 e de moléculas coestimulatórias em pacientes gestantes e não gestantes infectadas pelo P. vivax. Houve também um aumento de células regulatórias na população infectada pelo P. vivax. Observamos um aumento da produção de citocinas inflamatórias e antiinflamatórias, mesmo que em baixos níveis, em indivíduos infectados. Este trabalho é um dos 84 primeiros no Brasil a realizar caracterização imunológica em indivíduos gestantes infectadas pelo Plasmodium vivax em uma área de transmissão ativa da doença, com base nesses resultados, espera-se que esta pesquisa contribua para que mais estudos nessa temática sejam desenvolvidos para melhor entendimento da malária humana em indivíduos gestantes ou não. 85 5 CONCLUSÕES O presente estudo demonstra que a infecção pelo Plasmodium vivax ocasiona mudanças similares no sistema imunológico de indivíduos infectados, gestantes ou não gestantes. Os pacientes incluídos neste trabalho, residentes em uma área endêmica, não apresentaram sintomas de malária grave, sendo boa parte já havia sido infectado anteriormente, o que favorece uma baixa parasitemia e sintomas clássicos da infecção. A principal alteração no hemograma foi a plaquetopenia significativa entre os grupos de indivíduos infectados. A análise fenotípica dos leucócitos totais apontou que as gestantes infectadas apresentaram diminuição significativa de linfócitos T citotóxicos, e que os linfócitos B de infectados não gestantes também diminuíram durante a infecção, talvez essas alterações tenham ocorrido pelo processo de apoptose das células, visto que o marcador de apoptose CD95Fas apresentou um aumento de expressão quando avaliado em células T de indivíduos infectados. A infecção aumentou significativamente a frequência de marcadores de ativação em linfócitos, como CD69 e HLA-DR em pacientes gestantes e não gestantes, além disso induziu o aumento da expressão de moléculas coestimulatórias (ICOS, OX40 e GITR) em células T, fato que até o presente estudo não tinha sido avaliado na malária gestacional. Apesar do aumento da expressão e frequência de marcadores de ativação celular e produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e IL17) que promovem a ativação do sistema imunológico, este estudo também mostrou que ocorre um aumento de células regulatórias na malária em gestantes e não gestantes, o que acarreta a supressão da resposta imune, inclusive pela produção de citocinas como a IL-10 e evitam uma ativação exacerbada do sistema imunológico. Em suma, este estudo é um dos primeiros à analisar tanto aspectos de ativação como de regulação do sistema imune frente à infecção pelo Plasmodium vivax em dois grupos distintos de infectados: não gestantes e gestantes, que pode trazer novas informações relevantes para o tratamento e evolução desse enfermidade. 86 REFERÊNCIAS ALDERTON, W.; COOPER, C. E.; KNOWLES. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochemical Journal. vol. 357; p. 593-615, 2001. ALLAN, S E; PASSERINI L; BACCHETTA R. 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Existe um pequeno incômodo no momento da coleta do exame, pela picada da agulha. O risco de infecção é desprezível, pois a coleta de sangue será realizada por profissionais habilitados e com materiais descartáveis do próprio hospital. Você contará com a assistência do pesquisador se necessário, em todas as etapas de sua participação no estudo. Os benefícios que você deverá esperar com a sua participação, mesmo que indiretamente serão: auxiliar na classificação e melhor caracterização das formas clínico-epidemiológicas, possibilitando um tratamento mais adequado e avaliação de prognóstico. 104 Sempre que você desejar serão fornecidos esclarecimentos sobre cada uma das etapas do estudo. A qualquer momento, você poderá recusar a continuar participando do estudo e, também, poderá retirar seu consentimento, sem que para isto sofra qualquer penalidade ou prejuízo, ou seja sem qualquer prejuízo da continuidade do seu acompanhamento médico. Será garantido o sigilo quanto a sua identificação e das informações obtidas pela sua participação, exceto aos responsáveis pelo estudo, e a divulgação das mencionadas informações só será feita entre os profissionais estudiosos do assunto. Você não será identificado/a em nenhuma publicação que possa resultar deste estudo. Você será indenizado/a por qualquer despesa que venha a ter com sua participação nesse estudo e, também, por todos os danos que venha a sofrer pela mesma razão, sendo que, para essas despesas estão garantidos os recursos. ___________________________________________________ Pesquisador responsável Prof. Dr. Marcos Augusto Gregolin Grisotto Aluna: Thayanne França Muniz Pró-Reitoria de Pós-Graduação , Pesquisa e Extensão UNICEUMA Local e data, ______/_____/______ ____________________________________________________ Nome e Assinatura do paciente ou responsável 105 ANEXO A – QUESTIONÁRIO CLÍNICO E EPIDEMIOLÓGICO 106 ANEXO B – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA 107
