DETECÇÃO DE BOCAVÍRUS HUMANO (HBoV) EM - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
TERESINHA TEIXEIRA DE SOUSA
DETECÇÃO DE BOCAVÍRUS HUMANO (HBoV) EM AMOSTRAS DE
FEZES DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA NA
REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL
Orientadora
Profa. Dra Divina das Dôres de Paula Cardoso
Dissertação de Mestrado
GOIÂNIA -GO
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
TERESINHA TEIXEIRA DE SOUSA
DETECÇÃO DE BOCAVÍRUS HUMANO (HBoV) EM AMOSTRAS DE
FEZES DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA NA
REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL.
Dissertação
de
Mestrado
submetida
ao
PPGMTSP/UFG como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em Medicina
Tropical, na área de concentração em Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Orientadora: Profa. Dra Divina das Dôres de
Paula Cardoso
GOIÂNIA -GO
2011
iii
“Ninguém pode marchar no caminho alheio, na
estrada que não é sua. Comparar o seu caminho
com a vereda do vizinho ou com a estrada do
amigo é tempo perdido. Cada qual tem a sua
jornada e deve chegar ao fim. Com a certeza da
missão cumprida”.
(Walcheron)
iv
DEDICATÓRIA
À minha mãe que um dia indagada, aos 60 anos de idade, sobre o seu interesse em cursar
letras na universidade e de seu empenho com os estudos dos filhos; ela escreveu:
“O tempo inexorável foi passando, os filhos crescendo e os sonhos também, principalmente, o
de ter um poeta na família. Mesmo com a perda de um filho, não esmoreci porque acho que
vale a pena. Os pendores manifestaram-se neles, voltados para as artes, música, literatura e
o meu entusiasmo e alegria aumentavam. Como não sou imediatista, pois as pequenas
frustrações ensinaram-me que, a paciência e o saber esperar, são atributos de pais, já que o
ser humano que põem no mundo, é o mais demorado para dar fruto, e se o quisermos
sazonados, alicerçados em bases seguras e estáveis, temos que nos enclausurarmos numa
espera muda e os anseios alojados no recôndito da alma. E confiar.“
Ernani J. Sousa (in memorian)
v
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha querida professora Divina das Dôres de Paula Cardoso pela confiança e carinho em
todos esses anos. Tive a oportunidade e o privilégio singular de sorver conhecimentos em
convívio maternal, atestando sua capacidade de ensino e dedicação. Toda minha gratidão e
amizade a você, uma pessoa de brilho tão próprio e intenso, que sempre fascina.
“Mestre não é quem sempre ensina, mas quem de repente aprende”
João Guimarães Rosa
vi
AGRADECIMENTOS
À Profa Dra Fabíola Souza Fiaccadori pelo acolhimento carinhoso, exemplo de
profissionalismo, amizade e apoio para a realização deste trabalho.
À Profa Dra Menira Borges de Lima Dias e Souza, pela atenção dispensada sempre
com sorrisos, competência e empenho na concretização deste trabalho.
À Profa Dra Ana Maria Tavares Borges, pela ajuda inestimável no laboratório de
virologia humana, de convivência sempre amigável e agradável.
À Profa Dra Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito, pela cordialidade e amizade de
tantos anos.
À Profa Dra Regina Maria Bringel Martins e Profa Dra Megmar Aparecida dos Santos
Carneiro pelas orientações e convivência.
À Tâmera, colega de pós-graduação, pela amizade, companheirismo e ajuda nos
momento de dificuldades, grata por cada dia de convívio.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ..........................................................................viii
ÍNDICE DE FIGURAS ...........................................................................................................x
ÍNDICE DE QUADROS .........................................................................................................xi
RESUMO................................................................................................................................xiii
SUMMARY............................................................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................1
1.1 Considerações Gerais........................................................................................................1
1.2 Bocavírus Humano (HBoV) .............................................................................................2
1.2.1 Histórico ................................................................................................................2
1.2.2 Classificação..........................................................................................................3
1.2.3 Estrutura morfológica, genômica e protéica..........................................................5
1.2.4 Replicação Viral ....................................................................................................7
1.2.5 Patogênese viral e sintomatologia .........................................................................9
1.2.6 Diagnóstico laboratorial ......................................................................................11
1.2.7 Epidemiologia......................................................................................................12
1.2.8 Imunidade ............................................................................................................14
1.2.9 Tratamento, prevenção e controle .......................................................................14
2. JUSTIFICATIVA ...............................................................................................................16
3. OBJETIVOS .......................................................................................................................17
3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................17
3.2 Objetivos Específicos .....................................................................................................17
4. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................18
4.1 Material de estudo...........................................................................................................18
4.2 Metodologia ....................................................................................................................19
4.2.1 Detecção de HBoV-1...........................................................................................19
4.3 Análise estatística ...........................................................................................................22
5. RESULTADOS ...................................................................................................................23
6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................27
7. CONCLUSÕES...................................................................................................................30
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................31
9. ANEXOS .............................................................................................................................41
viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AV – Aichi vírus
CnMV – Canine minute virus
BPV – Parvovírus bovino
HBoV 1-4 – Bocavírus humano tipos 1 a 4
Da - Daltons
DEPC – Dietilpirocarbonato
DNA – Ácido desoxirribonucléico
dNTP – Desoxirribonucletídeo trifosfato
EDTA – Ácido etilenodiainotetracético
g – Grama
g – Unidade Média de Força Relativa
HCL – Ácido clorídrico
IF – Imunofluorescência
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
Kb – Kilobases
KCl – Cloreto de Potássio
KDa – Kilodaltons
M – Molar
mg – miligrama
µg – micrograma
mL - Mililitro
µL - Microlitro
mM – milimolar
nm – Nanômetro
mRNAs – Ácido ribonucléico mensageiro
NS1/NP1 – Proteína não-estrutural 1
NLS – Sítios de localização nuclear
NES – Sequência de exportação nuclear
OH - Hidroxila
RLA – Região de leitura aberta
ix
PBS – Salina fosfatada tamponada
pb – Pares de bases
PCR – Reação em cadeia da polimerase
pH – Potencial hidrogeniônico
PLA2 – Fosfolipase A2
q.s.p. – Quantidade suficiente para
RNA – Ácido ribonucléico
RNAse – Ribonuclease
RVA – Rotavírus do grupo A
RT-PCR - Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
SRO – Soluçôes de re-hidratação oral
ST1 e ST2 – Amostras de bocavírus / Stockholm (amostras 1 e 2 )
TRIS – Tris (hidroximetil) aminometano
U – Unidade de atividade enzimática
UFG – Universidade Federal de Goiás
VP1/VP2 – Proteínas do capsideo 1 e 2
o
C – Graus Centígrados
% - Percentagem
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - A família Parvoviridae com seus principais representantes ..............................04
Figura 2 - Foto microscopia eletrônica de HBoV. Vírus de 25mm e presença de capsídeo
icosaédrico ..........................................................................................................05
Figura 3 - Reconstrução em 3D do capsídeo icosaédrico do bocavírus. .............................05
Figura 4 - Ilustração esquemática das estruturas 3’ e 5’ de fita simples de DNA e as
estruturas de “hairpins”. .....................................................................................06
Figura 5 - Esquema mostrando o genoma do bocavírus com aproximadamente 5,3 kb,
com as regiões codificadoras para a proteína não estrutural NS1, proteína NP1
e duas proteínas capsídeo VP1/VP2 ...................................................................06
Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose (1,5%). Linha 1. Padrão de peso molecular
(100pb DNA ladder). Linhas 2 e 3. Amostras positivas para HBoV-1. Linha 4.
Controle positivo e Linha 5. Controle negativo para HBoV-1. ........................23
xi
ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1- Sequência dos iniciadores utilizados para a PCR, para detecção do material
genômico de HBoV-1 ........................................................................................ 20
Quadro 2- Mistura de reação utilizada na reação de amplificação (PCR) para detecção de
HBoV-1 ............................................................................................................... 21
xii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – A prevalência do HBoV-1 em amostras fecais de crianças com
gastroenterite de acordo com a cidade de coleta (n=762). ................................23
Tabela 2 – Distribuição percentual de amostras fecais positivas para HBoV-1 coletadas
de crianças com gastroenterite da região Centro-Oeste do Brasil em relação
ao gênero. ..........................................................................................................24
Tabela 3 - Percentual de positividade para HBoV-1 em amostras fecais coletadas de
crianças com gastroenterite aguda em três cidades da região Centro-Oeste
em relação à faixa etária ....................................................................................24
Tabela 4 - Distribuição de amostras fecais positivas para HBoV-1 coletadas de crianças
com gastroenterite aguda da região Centro-Oeste em relação aos anos de
coleta – período de 1994 a 2004 ........................................................................25
Tabela 5 - Distribuição de amostras fecais positivas para HBoV-1 coletadas de crianças
de Goiânia, Campo Grande e Brasília com quadro clínico de gastroenterite
aguda em relação aos meses do ano – período de 1994 a 2004 .........................25
Tabela 6 - Distribuição da co-infecção do HBoV-1 em ocorrência simultânea a outros
agentes virais causadores de gastroenterite aguda em crianças de cidades da
região Centro-Oeste nos anos de 1994, 1998, 1999 e 2003 ..............................26
xiii
RESUMO
A gastroenterite aguda é uma das doenças mais comuns em todo o mundo e afeta
particularmente crianças menores de cinco anos de idade. Os vírus são os agentes etiológicos
mais prevalentes, principalmente os rotavírus do grupo A, seguido por calicivírus, adenovírus
entéricos e astrovírus. Não obstante, uma grande parte dos casos de gastrenterite considerada
de origem viral permanece sem a definiçao do agente. Neste contexto, um novo vírus tem sido
tentativamente incluido como agente de gastroenterite denominado bocavírus humano
(HBoV). Com esse estudo objetivou-se avaliar a frequência de detecção do HBoV-1 em 762
crianças menores de cinco anos de idade provenientes de três cidades da região Centro-Oeste,
as quais apresentavam quadro de gastroenterite aguda no periodo de 1994 a 2004. Para tal,
foram analisadas amostras de fezes utilizando como metodologia de detecção viral a reação
em cadeia pela polimerase com iniciadores específicos desenhados para a região codificante
da proteína não estrutural 1 (NS1). Foi observado que 5,7% das amostras foram positivas para
HBoV-1 não havendo diferença no índice nas três cidades do estudo. A
análise da
positividade global em relação ao gênero das crianças estudadas mostrou índice de 5,7% e
5,8% para o sexo masculino e feminino, respectivamente, o que não foi estatísticamente
significativo. Considerando a faixa etária da população do estudo foi observado detecção do
vírus em crianças de até 48 meses, sem haver diferença significativa entre as faixas etárias.
Houve detecção viral em todos os meses do ano e considerando a sazonalidade foi observado
percentual de positividade de 5,4% e 6,3% para as estações de chuva e seca respectivamente.
A co-infecção foi observada em 14 (31,8%) das 44 amostras positivas para HBoV-1. Das 14
amostras, nove também eram positivas para o Rotavírus grupo A e cinco com o Aichi vírus.
Este estudo é o primeiro realizado na região Centro-Oeste visando detecção do HBoV em
amostras de fezes de crianças com gastrenterite e o segundo no Brasil, o qual mostrou
ocorrência do agente com índice semelhante a de outros estudos. Não obstante torna-se
necessário a realização de outros estudos inclusive de maior abrangência para a definição de
seu papel como agente etiológico na gastroenterite.
xiv
SUMMARY
Acute gastroenteritis is one of the most common diseases around the world, affecting mainly
children under five years of age. Viruses are the most prevalent etiological agents, especially
the Rotavirus A, followed by caliciviruses, enteric adenoviruses, and astroviruses. However,
in a considerable number of the gastroenteritis cases considered of viral origin, the etiological
agent remains undefined. A new virus has been tentatively included as the etiological agent of
gastroenteritis and was designated Human Bocavirus (HBoV). Therefore, this study aimed at
the evaluation of the detection rate of HBoV-1 in 762 children less than five years of age,
from three cities in the Central-West Region, who presented acute gastroenteritis symptoms,
during the period from 1994 to 2004. For this, the samples were tested by polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of viral DNA, using specific primers designed for the region
coding for the Non-structural protein 1 (NS1). It was observed that 5.7% of the samples were
positive for HBoV-1, with no difference in the positivity rate being observed when the three
cities were compared. The analyses of the global positivity rate regarding the children’s
gender showed detections rates of 5.7% and 5.8% for males and females, respectively, with
no statistical significance observed. Considering the age of the population of the study it was
observed that the virus was detected in children up to 48 months old, with no statistically
significant differences among the age groups. Viral detection occurred all year round, and
considering viral seasonality it was observed a positivity rate of 5.4% and 6.3% for the rainy
and dry season, respectively. Co-infection was observed in 14 (31.8%) of the 44 HBoV-1
positive samples. From the 14 samples, nine were also positive for Rotavirus A and five for
Aichi virus. This is the first study conducted in the Central-West region aiming at HBoV-1
detection in fecal samples of children with acute gastroenteritis and the second conducted in
Brazil, which showed similar detection rates to other studies. It is important to conduct more
comprehensive studies to define the role of HBoV as gastroenteritis etiological agent.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
A gastroenterite aguda permanece como uma das infecções que mais frequentemente
acomete a população mundial (Glass et al. 2001). É considerada uma causa comum e
importante de morbidade e mortalidade, em todo o mundo. A associação de mortes devido à
gastroenterite aguda e suas complicações causam de quatro a seis milhões de óbitos na
população mundial, sendo considerada como a quinta causa de morte no mundo (Clark &
McKendrick 2004, Lorgelly et al. 2007, WGO 2008).
A doença afeta todas as faixas etárias, acometendo principalmente crianças menores
que cinco anos de idade. A incidência de morte por gastroenterite aguda é elevada em
crianças menores de um ano e tende a diminuir em outros grupos de idade (Stein et al. 2004).
Nos países em desenvolvimento, outras consequências diretas da gastroenterite aguda infantil
incluem a desnutrição, retardo do crescimento e comprometimento do desenvolvimento
cognitivo (WGO 2008). Em países desenvolvidos é uma doença caracterizada por surtos,
acometendo a população em todas as faixas etárias, onde as crianças e os idosos apresentam a
maior severidade pela síndrome, com pelo menos um episódio por ano levando a elevados
índices de hospitalizações (Glass et al. 2001, Black et al 2003, King et al 2003, Clark &
Mckendrick 2004).
A etiologia da gastroenterite aguda é presumivelmente infecciosa, causada por
bactérias, vírus, fungos e parasitas. Sendo que, os vírus representam o agente causal mais
frequente em todo o mundo. Na grande maioria, os episódios de diarréia viral apresentam-se
na forma de surtos onde a transmissão é principalmente fecal- oral ou pessoa-pessoa (Clark &
Mckendrick 2004).
Dentre os vírus, os rotavírus do grupo A (RVA) são os principais agentes etiológicos,
responsabilizados por 29 a 45% das internações, com 111 milhões de episódios a cada ano e
tendo como conseqüência 600.000 óbitos entre crianças abaixo de cinco anos (Parashar et al.
2006). Adicionalmente estima-se que estes sejam responsáveis por 1,5 a 2,5 milhões de
mortes por ano entre as crianças menores de cinco anos, a maioria ocorrendo em países em
desenvolvimento (Parashar et al. 2003, Wilhelmi et al. 2003, Clark & Mckendrick 2004).
Outros vírus também se destacam como responsáveis pela síndrome como os
astrovírus, adenovírus entéricos, norovírus e sapovírus (Atmar et al. 2001, Parashar et al.
2003). Adicionalmente, graças às novas técnicas de caracterização molecular tem sido
2
possível o reconhecimento de novos vírus como possíveis agentes das gastroenterites como o
Aichi vírus (AV), coronavírus, torovírus e picobirnavírus (Wilhelmi et al. 2003).
Em 2005, um novo vírus foi descrito na Suécia por Allander e colaboradores
utilizando a técnica de clonagem, sequenciamento e análise filogenética de amostras do trato
respiratório de crianças com infecções do trato respiratório inferior. O vírus foi chamado
inicialmente de bocavírus humano (HBoV) considerando sua semelhança filogenética com os
outros dois vírus, representantes do gênero Bocavirus, família Parvoviridae: “canine minute
virus” (CnMV) e parvovírus bovino (BPV) (Allander et al. 2005).
Em estudos subsequentes, observando pacientes com febre e diarréia associados ou
não com sintomas respiratórios, o HBoV foi detectado em fezes de crianças, numa frequência
semelhante à que foi relatada em amostras respiratórias (Albuquerque et al. 2007, Arnold et
al. 2006, Lau et al. 2007, Lee et al. 2007, Monteny et al. 2007, Neske et al. 2007 , Qu et al.
2007 , Vicente et al. 2007). Não obstante, embora os achados, a confirmação de seu
envolvimento etiológico na gastroenterite ainda não está completamente estabelecida,
indicando que mais estudos são necessários para este esclarecimento (Lee et al. 2007, Campe
et al. 2008).
1.2 Bocavírus Humano (HBoV)
1.2.1 Histórico
O bocavírus humano (HBoV) foi identificado pela primeira vez em 2005, em
Estocolmo, Suécia (Allander et al. 2005). Duas amostras com sequência similares (amostras
ST1 e ST2) foram detectadas e a análise do genoma completo confirmou sua relação com os
parvovírus de animais CnMV e BPV. A identificação se deu aleatoriamente a partir da análise
de 540 amostras de aspirados respiratórios visando investigar a presença de possíveis agentes
etiológicos. Estas amostras eram provenientes de crianças hospitalizadas devido infecções
respiratórias no período de novembro de 2003 a outubro de 2004.
A detecção viral ocorreu quando da análise por triagem molecular não rotineira de
amostras por imunofluorescência (IF), que incluíam a pesquisa para vírus influenza e/ou
respiratório sincicial. As amostras foram submetidas à técnica de extração de ácidos
nucléicos, os quais foram amplificados por reação em cadeia pela polimerase. Os produtos da
amplificação foram purificados e ligados ao vetor E. coli TOP-10 ( Blunt PCR Cloning Kit,
invitrogen), cujos produtos foram clonados e seqüenciados (Allander et al. 2005).
3
Utilizando-se da bioinformática houve a classificação e formatação das sequências de
leituras e, ao final, foram encontradas sete sequências virais, das quais quatro eram vírus RNA
e três de vírus DNA. Dentre estas, foram encontradas sequências de parvovírus que não
apresentavam similaridades com amostras depositadas no banco de dados (Allander et al.
2005). A análise filogenética mostrou presença de um vírus semelhante à dos parvovírus, e
que era próxima do CnMV e ao do BPV, ambos pertencentes ao gênero Bocavírus, família
Parvoviridae.
O vírus foi chamado bocavírus humano (HBoV), e definido como de DNA de fita
simples. É o segundo representante da família Parvoviridae envolvido com infecções em
seres humanos, considerando que o único até então reconhecido era o parvovírus B19, agente
etiológico do eritema infeccioso (Berns & Parrish 2007).
Adicionalmente, desde que o HBoV foi identificado, vários estudos se seguiram em
todo o mundo demonstrando a detecção do agente em amostras do trato respiratório, de
pacientes que apresentavam sintomas de bronquiolite, pneumonia e asma (Chung et al. 2006,
Ma et al. 2006, Manning et al. 2006, Sloots et al. 2006, Wieissbrich et al. 2006, Qu et al.
2007, Regamey et al 2007), o vírus também foi detectado em pacientes com gastroenterite
aguda com uma frequência entre dois a 25% dos pacientes (Albuquerque et al. 2007, Vicente
et al. 2007, Arthur et al. 2009).
1.2.2 Classificação
O HBoV pertence à família Parvoviridae, subfamília Parvovirinae, gênero Bocavírus
(ICTVdB 2008). A família Parvoviridae é composta por duas subfamílias (Figura 1), a
Densovirinae a qual comporta vírus que infectam invertebrados e que apresenta quatro
gêneros assim denominados: Densovirus, Iteravirus, Brevidensovirus e Pefudensovirus, e a
subfamília Parvovirinae, que contém vírus que infectam vertebrados, composta por cinco
gêneros: Bocavirus, Parvovirus, Eritrovirus, Dependovirus e Amdovirus (Berns & Parrish
2007).
Achados recentes mostram que mais de uma espécie de HBoV infecta humanos os
quais estão provisoriamente denominados de HBoV-1 (Allander et al. 2005), HBoV-2
(Kapoor et al. 2009), HBoV-3 (Arthur et al. 2009) e HBoV-4 (Kapoor et al. 2010). Não
obstante não se tem ainda informações que permitam classificá-los em tipos ou genótipos
(Chow et al.
2009). Com mais de 100 estudos baseados na análise filogenética e no
alinhamento dos aminoácidos do HBoV existentes até agora, observa-se a presença de quatro
espécies de bocavírus geneticamente caracterizadas HBoV-1, HBoV-2, HBoV-3 e HBoV-4.
4
Foi observado um elevado grau de diversidade genética entre os bocavírus identificados até o
momento. Kapoor e colaboradores sugerem a possibilidade que o HBoV-1 possa ter evoluído
de um bocavírus entérico após adquirir um tropismo favorecido pelo trato respiratório,
questão que exigirá mais estudos epidemiológicos. Outros estudos compararam a diversidade
intra-espécies do HBoV-1, 2 e 3 (Kapoor et al . 2010, Chieochansin et al 2010).
A análise genômica do HBoV-2 têm entre 67% a 80% de homologia em relação ao
HBoV-1, a do HBoV-3 mostra homologia próxima do HBoV-1 com 87% de similaridade na
codificação de proteínas não-estruturais NS1 e NP1, mas é mais semelhante, em torno de
77%, ao HBoV-2 nas regiões que codificam VP1/VP2. (Chow et al. 2009, Cheng et al. 2011).
Análises filogenéticas futuras são necessárias para determinar a taxonomia correta
desses vírus (Arthur et al. 2009) aliadas a estudos também de natureza epidemiológica e
clínica o que poderá vir a confirmar o envolvimento do bocavírus humano como patógeno
humano (Schildgen et al. 2008, Chow et al. 2009).
Densovirus
Densovirinae
(Membros que infectam artrópodes)
Iteravirus
Brevidensovirus
Pefudensovirus
Parvovírus canino (CPV)
Minute vírus de camundongo (MVM)
Parvovirus
Vírus da panleucopenia felina (FPV)
Parvovírus de galinha (ChPV)
Parvoviridae
Parvovírus de hamster (HaPV)
Parvovirus B19
Eritrovirus
Simian parvovirus (SPV)
Dependovirus
Parvovirinae
Amdovirus
Adeno-associado vírus
Aleutian mink disease virus
Parvovírus Bovino (BPV)
Canine minute vírus(CnMV)
Bocavirus
Bocavírus Humano (HBoV-1, HBoV-2, HBoV-3 e HBoV-4)
Bocavírus de Gorilas (GBoV)
Bocavírus de Suíno (PBoV)
Figura 1 - A família Parvoviridae com seus principais representantes
Fonte: Foulongne 2009 (modificada)
5
1.2.3 Estrutura morfológica, genômica e protéica
Os vírus pertencentes à família Parvoviridae são vírus pequenos e não possuem
envoltório lipídico. Apresentam nucleocapsídeo de simetria icosaédrica com diâmetro de 18 a
26 nm (Figura 2).
Figura 2 - Foto microscopia eletrônica de HBoV. Vírus de 25mm e presença de capsídeo
icosaédrico
Fonte: Santos, 2010.
Os capsídeos destes vírus apresentam pequenas protuberâncias e grandes depressões
circundando o eixo central, que são admitidos serem essenciais para a sua biologia.
Provavelmente como determinantes de tropismo no hospedeiro, ligantes de receptores e
importantes sítios de ligação de anticorpos, como também para o desenvolvimento de
inibidores estruturais específicos (Figura 3) (Berns & Parrish 2007).
Figura 3 - Reconstrução em 3D do capsídeo icosaédrico do bocavírus.
Fonte: Gurda, 2010
6
O genoma do vírus da família Parvoviridae é uma molécula de DNA de fita simples.
O genoma completo apresenta aproximadamente entre 4000 a 6000 nucleotídeos. Possuem
em suas duas extremidades estruturas complexas que formam “harpins” resultantes de várias
sequências palindrômicas presentes nestas regiões do genoma (Astell et al. 1985, Módena
2009). Estas são formações da fita simples de DNA essenciais na replicação do genoma viral
dos membros da família Parvoviridae, mas que ainda não foram caracterizadas no bocavírus
humano (Figura 4). (Schildgen et al. 2008).
Figura 4 - Ilustração esquemática das estruturas 3’ e 5’ de fita simples de DNA e as estruturas
de “hairpins”.
Fonte: Astell 1985 (modificada)
Figura 5 - Esquema mostrando o genoma do bocavírus com aproximadamente 5,3 kb, com as
regiões codificadoras para a proteína não estrutural NS1, proteína NP1 e duas proteínas
capsídeo VP1/VP2.
Fonte: Foulongne 2009.
7
Embora não completamente caracterizado, o genoma do bocavírus humano é
composto também por uma única fita de DNA, linear de polaridade positiva ou negativa
(Allander et al. 2005, Schildgen et al. 2008). Estudos da polaridade do bocavírus confirmam
sua replicação em fita simples de DNA e com 87,5% das amostras investigadas tiveram
sentido negativo em suas montagens (Böhmer et al. 2009). Seu tamanho está estimado em
5.293 nucleotídeos (Schildgen et al. 2008).
O genoma do HBoV apresenta três regiões de leitura aberta (RLA), sendo semelhante
a dos BPV e CnMV (Figura 5). A primeira e a terceira RLA codificam para as proteínas não
estruturais NS1 e NP1, respectivamente e a segunda para as duas proteínas do capsídeo (VP1
e VP2) (Allander et al. 2005). Outros parvovírus ainda codificam para uma terceira proteína
estrutural, a VP3, o que não foi observado para os bocavírus humanos (Chow & Esper 2009).
A função da NS1 no HBoV ainda é desconhecida, mas no CnMV a NS1 é uma
proteína multifuncional, essencial para a replicação do DNA viral (Sun et al. 2009).
Embora também não elucidado para o HBoV, para outros parvovírus a VP1 possui
peso molecular de 80.000 daltons (Da). Possui uma região com atividade enzimática de
fosfolipase A2 (PLA2) considerada essencial na replicação dos parvovírus como visto para o
B19, fazendo a liberação do vírus do lisossomo após sua entrada na célula (Qu et al. 2008).
Similarmente, para outros parvovírus, a VP2 tem sido estimada com peso molecular de
60.000 Da. A sequência que codifica a VP2 está alojada dentro do gene para a VP1, sendo
que as duas apresentam a sequências idênticas na região 3’ (Allander et al. 2005). A VP1
também contém sequências em sua região N-terminal que são aminoácidos básicos, que
comportam como um sinal para a localização do núcleo para o genoma viral (Berns & Parrish
2007).
As proteínas NS1 e NP1 com 75.000 e 28.000 daltons, respectivamente, apresentam
funções desconhecidas no bocavírus humano. Nos outros membros da família Parvoviridae, a
NS1 é essencial para a replicação do DNA. A função da proteína NP1 foi definida no CnMV
tendo papel importante na replicação do DNA viral (Manteufel et al. 2008, Módena 2009,
Sun et al. 2009).
1.2.4 Replicação Viral
Os parvovírus geralmente precisam de células proliferativas para a sua replicação. Até
o momento, no entanto, o HBoV não foi replicado in vitro e nem reproduzido em animais e
assim, o que se infere para este é o modelo do ciclo de replicação dos outros parvovírus
8
(Schildgen et al. 2008). Este é um problema enfrentado no estudo desses novos vírus, pois
como ainda não estão esclarecidas quais são as células permissíveis e nem como se dá
totalmente a sua replicação, continuam sendo indetectáveis pelos métodos clássicos de
virologia (Allander et al. 2008).
Em relação aos demais vírus do gênero Bocavirus, estudos relatam que estes utilizam
para a sua replicação células com origem respiratória, intestinal e linfática (Durhan et al.
1985). Para o HBoV há indícios de replicação em células do epitélio brônquico com a
presença do efeito citopático (Lin et al. 2008). Nas células, admite-se que os parvovírus se
liguem em receptores da membrana da célula hospedeira e que penetrem na célula por
endocitose, porém ainda não se conhece receptores para o HBoV (Schildgen et al. 2008).
Após a penetração, o vírus permanece dentro do endossoma por várias horas até
alcançar o núcleo. O transporte envolve os micro-túbulos e proteínas motores de dineínas o
que é fundamental para os parvovírus completarem a sua replicação (Santos 2008). Admite-se
que esta fase também seja similar para o bocavírus humano. No núcleo, o DNA é liberado,
embora com mecanismo desconhecido de tal liberação, mas, considera-se que de 20 a 30
nucleotídeos da região 5´, sirvam como molde para o início da replicação do DNA viral
através de uma DNA polimerase celular (Berns & Parrish 2007).
A replicação do genoma dos parvovírus é singular, pois o material genético, uma
molécula de DNA fita simples, favorece uma replicação mais conservada. Estes vírus não
codificam para uma DNA polimerase, assim utilizam a DNA polimerase da célula hospedeira
utilizando-se da célula em seu período S da divisão celular. Desta forma replicam seu material
genético dependendo dos mecanismos oferecidos pela célula hospedeira (Astell et al. 1985),
sendo mais eficaz quando os parvovírus replicam em células de maior renovação (Berns
1990, Módena et al. 2009).
A estrutura de “harpins” presente no DNA dos parvovírus é importante na replicação,
funcionando como iniciadores da replicação através da extremidade 3’ onde a hidroxila -OH
favorece a ligação da DNA polimerase celular (Astell et al. 1985). A replicação ocorre através
da passagem dos “harpins” formando intermediários que vão ao encontro da extremidade em
“harpin” 5’ da fita mãe. Ocorre uma fusão pela DNA-ligase formando uma estrutura quase
circular de DNA fita dupla. Essa estrutura é clivada por uma endonuclease viral,
provavelmente NS1, fornecendo um novo sítio livre de 3’–OH. Esses produtos de clivagem
podem servir como molde para o reinício do processo replicativo ou serem encapsidados para
a formação de novos vírus (Berns et al. 1990, Módena et al. 2009).
9
Os mecanismos de transcrição e tradução de proteínas do HBoV também ainda não
estão claros, mas admite-se que possam ser semelhantes aos outros parvovírus. Assim os
mRNAs virais produzidos no núcleo por uma RNA polimerase celular são exportados para o
citoplasma, onde são traduzidos em proteínas pelos ribossomos celulares (Berns & Parrish
2007, Santos 2008). A transcrição de mRNA e a produção das proteínas virais acontece sem
que a célula tenha entrado na fase S do ciclo celular, ou seja antes da replicação do genoma
viral, onde provavelmente já tenha capsídeos formados ou pré-formados. Esses mecanismos
ainda não foram totalmente elucidados para a família Parvoviridae (Berns & Parrish 2007).
Ao término da formação das proteínas VP1 e VP2 no citoplasma elas se agrupam em
capsômeros e são levadas ao núcleo. Os sítios de localização nuclear (NLS) presentes na
região exclusiva VP1 são essenciais neste processo (Berns & Parrish 2007). No núcleo, os
capsômeros ligam-se ao DNA fita simples viral, e o complexo é exportado para o citoplasma
através de um mecanismo que envolve a presença da fosforilação de uma sequência de
exportação nuclear (NES) presente na região N terminal de VP2. A saída da progênie viral
ocorre por lise celular ou exocitose, ainda não conhecida para o HBoV (Berns & Parrish 2007,
Módena 2009).
1.2.5 Patogênese viral e sintomatologia
Os parvovírus podem ser transmitidos por diferentes vias (Berns 1990) incluindo a via
fecal-oral, que é a principal via de transmissão nas doenças gastrointestinais, a respiratória
que pode ser por contato direto ou indireto com secreções, urina, além de superfícies
contaminadas (Chow & Esper 2009).
Embora as diferentes vias possíveis de transmissão de outros vírus da família
Parvoviridae, para o bocavírus o mecanismo de transmissão e a patogênese são ainda
desconhecidos. Estudos relatam a presença do DNA do HBoV em secreções respiratórias
associadas a elevada carga viral, consistentes com infecção do epitélio respiratório o que
sugere que a replicação viral possa ocorrer em células epiteliais respiratórias (Allander et al.
2007). Além disso, o vírus já foi identificado em amostras fecais, soro humano, tecido
linfático e urina (Allander et al. 2007, Schenk et al. 2007, Chow et al.2008, Pham et al. 2011).
A correlação, entre a ocorrência elevada e a não detecção de outros patógenos nas vias
respiratórias, tem sugerido o possível envolvimento do HBoV em infecções em humanos,
principalmente em crianças (Arnold 2010). Não obstante, até o momento, não há
comprovação do atendimento aos postulados de Koch uma vez que não se conhece um
modelo animal ou mesmo células em cultura que suportem a propagação viral de forma
10
rotineira, e desta forma que possam ser utilizados na tentativa do atendimento aos mesmos
(Allander 2008).
Foi observado que em pacientes que apresentavam elevada carga viral em amostras de
aspirados nasais também demonstravam sinais de viremia, além de apresentarem expressiva
resposta imune ao bocavírus com 49% de IgM e de 73% de IgG para o HBoV e que a maioria
dos adultos são soropositivos para o HBoV (Kantola et al. 2008, Kumar et al. 2011).
Estudo realizado por Lin et al. (2008) indicou a presença de efeito citopático em
linhagem de células brônquicas após a inoculação de amostras de secreções respiratórias
positivas para bocavírus. Neste caso foi observado também por microscopia eletrônica a
presença de partículas virais semelhantes a parvovírus no citoplasma destas células (Lin et al.
2008).
Neste mesmo foco, outros estudos também relataram in vitro um sistema de cultura
para do HBoV, muito embora tenha sido observado replicação viral após inoculação de
lavado de nasofaringe de paciente infectado com HBoV, as alterações morfológicas nas céulas
não foram tão óbvias como as vistas com o vírus respiratório sincicial (Dijkman et al 2009,
Lin et al. 2009). Esses modelos ajudam no conceito que o bocavírus esteja envolvido como
patógeno respiratório além de também elucidar seu papel na co-infecção com outros
patógenos respiratórios (Arnold et al. 2010), iniciando portanto um caminho para a
compreensão da patogênese do bocavírus humano.
Em reforço a estes estudos, o vírus tem sido repetidamente detectado no trato
respiratório de crianças com infecções respiratórias de vias aéreas superiores e inferiores, com
ou sem a presença de outros vírus respiratórios (Allander et al. 2005) as quais, em sua grande
maioria apresentam febre, rinorréia e tosse. Alguns indivíduos evoluiram para quadros de
bronquiolite, pneumonia, sibilância e exacerbações de doenças pulmonares crônicas, por
exemplo, a asma brônquica (Schildgen et al. 2008).
Considerando o achado do HBoV nas secreções respiratórias com outros patógenos
destaca-se a presença de outros vírus respiratórios como rinovírus, vírus respiratório sincicial,
parainfluenza, influenza, adenovírus e metapneumovírus humano além bactérias. A coinfecção observada oscila em torno de 42,5% dos casos. Outro estudo mostra a detecção do
HBoV de 50% em crianças com infecções respiratórias e a necessidade de testes sorológicos
para confirmação do diagnóstico (Chow & Esper 2009, Don et al. 2011).
Em adição às co-infecções com outros patógenos tem sido observadas co-morbidades
como em casos de doenças cardíacas, como a insuficiência cardíaca e as lesões cardíacas
congênitas, as quais têm sido responsabilizadas por mais da metade das co-morbidades
associadas ao HBoV, seguidas das doenças pulmonares crônicas (Allander et al. 2005, Arnold
11
et al. 2006, Chow & Esper 2009), além da gastroenterite (Chieochansin et al. 2008, Han et al.
2009, Huang et al. 2009, Santos et al. 2010).
Bocavirus e sintomas gastrointestinais
Como referido, o bocavírus humano, assim como outros parvovírus, está associado a
infecções do trato respiratório, mas também há relatos de seu envolvimento em infecções ou
mesmo um tropismo ao trato digestivo com possível similaridade ao tropismo de outros
parvovírus que provocam enterite e leucopenia, como visto em filhotes de cães (Durham et al.
1985, Carmichael et al. 1994).
No contexto, também quando da identificação do vírus em casos de doença
respiratória, sintomas gastrointestinais também foram relatados em até 25% dos casos
sugerindo uma disseminação ao trato digestivo pelo vírus (Foulongne et al. 2006). A
sintomatologia inclui náusea, vômito e diarréia (Chow & Esper 2009) a qual, também, tem
sido relatada com presença de sangue (Chieochansin et al. 2008, Schildgen et al. 2008).
Dados epidemiológicos vêm evidenciando e dando suporte para o papel do HBoV no
processo da gastroenterite em diferentes partes do mundo (Lee et al. 2007, Vicente et al. 2007,
Chow & Esper 2009, Han et al. 2009), incluindo o Brasil (Albuquerque et al. 2007, Santos et
al. 2010).
Por outro lado considerando que a diarréia é um sintoma, que também pode ser
encontrado na resposta sistêmica a uma infecção, a observação de HBoV em fezes diarréicas e
sua responsabilização como o agente etiológico requer maiores estudos (Allander et al. 2008).
Mesmo na ausência de co-infecção por agentes do trato respiratório, ocorre co-infecção
também com outros agentes do trato gastrointestinal com destaque para norovírus (Campe et
al. 2008, Han et al. 2009), mas também para rotavírus, astrovírus, adenovírus e bactérias
como Campylobacter, Salmonella e Clostridium dificili (Lee et al. 2007, Cheng et al. 2008,
Chieochansin et al. 2008, Chow & Esper 2009, Nakanishi et al. 2009). Os índices de coinfecção com diferentes patógenos ocorreram em torno de 21% a 77,6 %.
1.2.6 Diagnóstico laboratorial
A primeira identificação do bocavírus humano (HBoV) foi feita pela detecção do
DNA viral pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) convencional, feita por Allander e
colaboradores em 2005. Desde então esta tem sido a principal metodologia utilizada por
12
diferentes pesquisadores (Arden et al. 2006, Bastien et al. 2006, Kesebir et al. 2006, Kupfer et
al. 2006, Manning et al 2006, Sloots et al. 2006, Brieu et al. 2007).
Posterior e adicionalmente tem sido utilizada a PCR em tempo real. Esta técnica
oferece vantagem sobre a PCR convencional, por apresentar maior sensibilidade,
especificidade e ganho de tempo, além de permitir a quantificação viral no material analisado
muito embora ainda seja pouco acessível a um grande número de pesquisadores (Choi et al.
2006, Smuts et al. 2006, Allander et al. 2007, Manning et al. 2007, Qu et al. 2007, Esposito
et al. 2008).
Quando da utilização da PCR convencional, a pesquisa do vírus é feita frequentemente
via detecção dos genes para as proteínas NS1 e NP1 (Allander et al. 2008) enquanto que pela
PCR em tempo real a opção tem sido para pesquisa dos genes para NP1 e VP1 e também sua
utilização para detecção dos quatros tipos recentemente identificados (Tozer et al. 2009,
Kantola et al. 2010).
Os espécimes clínicos principalmente utilizados são amostras do trato respiratório
(aspirados ou swabs), bem como amostras de fezes (Allander et al. 2008) que pela PCR
convencional ou PCR em tempo real permitem portanto a detecção do DNA viral utilizando
iniciadores específicos de genes alvo. Como procedimento para melhor caracterização do
vírus tem sido utilizado o sequenciamento genômico (Sloots et al. 2006).
Além dos procedimentos moleculares tentativas de propagação do vírus em cultura de
linhagem de células padronizadas do epitélio brônquico tem sido realizados (Lin et al. 2009),
mas ainda não tem gerado a produção de antígenos e anticorpos com vistas à comercialização
(Allander et al. 2008).
1.2.7 Epidemiologia
Como referido, HBoV foi reconhecido mundialmente pela sua identificação em
amostras de pacientes com infecções do trato respiratório inferior, com diagnóstico clínico de
pneumonias e bronquiolites, na grande maioria crianças
abaixo de dois anos de idade
(Allander et al. 2005), em percentuais que variaram de 1,5% a 19,3%. Além disso, ele ocorre
em co-infecção com outros vírus respiratórios em índices de 17% a 55% (Bastien et al. 2006,
Bonzel et al. 2008, Lindner et al. 2008b, Lüsebrink et al. 2009).
Especificando, HBoV tem sido identificado em todos os continentes sugerindo uma
endemicidade mundial (Foulongne et al. 2006, Weissbrich et al. 2006, Regamey et al. 2007,
Vicente et al. 2007), na Ásia (Choi et al. 2006, Lin et al. 2007, Lu et al. 2006, Ma et al. 2006),
na África (Smuts et al. 2006), Oceania (Arden et al. 2006, Sloots et al. 2006, Arthur et al.
13
2009), nas Américas (Arnold et al. 2006, Bastien et al. 2006, Kesebir et al 2006, Albuquerque
et al. 2007, Gagliardi et al. 2009).
Em termos da circulação viral, estudos mostram a ocorrência do HBoV durante todo o
ano muito embora estudos indiquem ligeira predominância no inverno/primavera (Bastien et
al. 2007, Chow et al. 2008) ou mesmo no verão (Choi et al. 2006).
Nos casos de doença respiratória a infecção primária ocorre com maior frequência
entre crianças com seis a 24 meses (Ma et al. 2006, Manning et al. 2006, Endo et al. 2007,
Garcia-Garcia et al. 2007, Völz et al. 2007). Embora outros estudos relatem a ocorrência do
HBoV em crianças de maior idade, acima de 36 meses de idade, com uma positividade de
15% nesta faixa etária (Chung et al. 2006). Admite-se que a pequena ocorrência em recémnascidos se dê pela presença de anticorpos maternos (Ma et al. 2006).
No Brasil estudos
avaliando infecções respiratórias, demonstraram que o HBoV foi detectado em crianças
hospitalizadas e em unidades de pronto-socorro, com idades entre um mês a 12 anos com
taxas de ocorrência de 6,1% a 13,2% (Albuquerque et al. 2009, Gagliardi et al. 2009, Souza
et al. 2009, Durigon et al. 2010, Pilger et al. 2011).
Com adultos poucos estudos têm sido realizados e, não obstante, também tem sido
observada a positividade (Chow et al. 2008, Longtin et al. 2008). Outro dado que merece ser
mencionado é o de que o vírus tem sido detectado tanto em adultos quanto em crianças que
apresentam imunossupressão o que pode sugerir a possibilidade da persistência viral
(Manning et al. 2006, Smuts et al. 2006, Maggi et al. 2007).
Considerando a infecção do trato gastrointestinal, diferentes estudos vêm mostrando a
presença do vírus em casos de gastrenterite. Na Espanha, Vicente et al. (2007) analisaram 527
amostras de fezes de crianças menores de tres anos de idade com ou sem sintomas de infecção
respiratória, mas com sintomas de gastroenterite, e observaram uma positividade ao HBoV de
9,1% não obstante a associação de 58% a outros enteropatógenos virais. Na Coréia, embora
com percentual inferior (0,8%), estudo mostrou a presença do vírus em crianças
hospitalizadas por gastroenterite (Lee et al. 2007).
Estudos avaliando a associação de sintomas do trato respiratório e a presença do vírus
em amostras de fezes de casos não diarréicos mostraram que, de 31 amostras de fezes de
crianças com HBoV positivas no trato respiratório, 14 (45%) também foram positivas nas
amostras de fezes ( Neske et al. 2007).
No Brasil, pesquisadores relataram a detecção do HBoV em crianças com diarréia
aguda na ausência de sintomas respiratórios em 2% dos casos. A co-infecção com o rotavírus,
adenovírus e norovírus foi encontrada em 21,4% das amostras positivas para o HBoV
(Albuquerque et al. 2007).
14
Considerando a diversidade genética do HBoV, estudo realizado na Austrália tendo
como foco amostras de fezes de crianças com diarréia visando detecção de prováveis agentes
de gastroenterites, mostrou a presença dos diferentes tipos de HBoV- 1,- 2 e -3 somando
27,4% dos achados configurando-se no segundo agente detectado após os rotavírus com
37,1% de positividade (Arthur et al. 2009).
Tendo como dado importante a ocorrência do HBoV em indivíduos apresentando
imunossupressão, Arnold e colaboradores relataram dois casos de HBoV positivos em
pacientes transplantados (Arnold et al. 2006). Neste enfoque, no Brasil, estudo realizado
visando a detecção de HBoV-2 e HBoV-3 em pacientes com gastroenterite aguda, cinco
amostras de 807 (0,6%) foram positivas para HBoV-3, sendo três destas em pacientes com
diagnóstico de HIV/AIDS. Outro grupo de 144 amostras testadas para HBoV-2 e em 30
amostras (20,8%) foram positivas, dos quais 11 pacientes com HIV/AIDS. Outro estudo
avaliando a infecção gastrointestinal em pacientes HIV-positivos detectou HBoV somente em
co-infecção (Santos et al. 2010, Silva et al. 2010).
Deve-se adicionalmente mencionar que os estudos realizados têm mostrado que os
HBoV-3 e 4, até o momento, só foram encontrados em amostras de fezes, o HBoV-2 foi
detectado em amostras de fezes e soro humanos(Arthur et al. 2009, Chieochansin et al. 2009,
Kapoor et al. 2009) e em secreções respiratórias (Song et al. 2010).
1.2.8 Imunidade
Os estudos realizados com o HBoV têm gerado dados concernentes à prevalência
sendo que os relativos à resposta imunológica são desconhecidos. Não obstante importa
relacionar que a infecção apresentada pelo agente tanto nos casos de doença respiratória
quanto de gastroenterite ocorre principalmente em crianças, mas também em adultos e idosos
(Lindner et al. 2008a). Adicionalmente dados proveniente de estudo de Chung et al.(2008)
mostraram que o interferon gama, interleucina-2 e interleucina-4 estavam elevados em
espécimes respiratórias positivas de HBoV comparado com controles.
1.2.9 Tratamento, prevenção e controle
A grande maioria das gastroenterites agudas de origem viral não necessita de
tratamento específico. Em casos de desidratação, na forma severa e por vezes urgente, a
terapêutica inicial visa corrigir o distúrbio hidroeletrolítico, principalmente, nas faixas etárias
15
de maior comprometimento como as crianças e idosos bem como em populações de risco
como imunossuprimidos e desnutridos, que podem apresentar alterações circulatórias
importantes, com risco de morte devido ao choque hipovolêmico e das toxinas. A correção da
desidratação é feita, em geral, por via oral (nas formas leves ou moderadas) ou venosa nos
casos onde ocorrem vômitos repetidos ou com desidratação grave (King et al. 2003).
As medidas, que visam controlar e prevenir epidemias de gastroenterite viral, foram
assim preconizadas: detecção e diminuição das fontes de contaminação de água, alimentos,
profissionais em contato com a fonte do agente e isolamento, diminuindo o contato pessoapessoa.
Durante as últimas três décadas houve uma redução consistente da taxa de mortalidade
nos países em desenvolvimento, graças a fatores como: a distribuição e uso generalizado de
soluções de re-hidratação oral (SRO), maior frequência e/ou duração da amamentação, melhor
nutrição, melhor estado sanitário e higiene e um aumento na cobertura de vacinação contra
sarampo (WGO 2008). Para o bocavírus humano muito embora não se conheça ainda em sua
totalidade os mecanismos e as rotas de transmissão, bem como sobre sua biologia, admite-se
que assim como para as outras viroses cuja excreção se dê também pelas fezes, o diagnóstico
correto e as medidas de tratamento sintomático se impõe.
16
2. JUSTIFICATIVA
A gastroenterite aguda viral continua sendo reconhecida como a doença que mais
contribui para a morbidade e mortalidade em crianças abaixo de cinco anos de idade em todos
os continentes (Oh et al. 2003, Clark & Mckendrick 2004). Os vírus correspondem por mais
de 70% dos casos de gastroenterites, notadamente nos países desenvolvidos, sendo que os
mais freqüentemente encontrados e de maior importância são os rotavírus, astrovírus,
adenovírus e calicivírus (Cardoso et al. 2003, Parashar et al. 2003, Wilhelmi et al. 2003).
Apesar da elevada sensibilidade das atuais técnicas da biologia molecular na detecção do
ácido nucléico de vários patógenos, principalmente em casos de gastroenterites, um
percentual importante destas ainda permanecem sem diagnóstico etiológico, com estimativas
de 28 a 40% dos casos.
Neste sentido, estudos que visam complementar informações a respeito de novos
agentes responsáveis pela síndrome são importantes para a saúde pública tanto em termos de
morbidade quanto de mortalidade.
Até o momento, os resultados de estudos mostraram que o HBoV está presente no
trato gastrointestinal de crianças com gastroenterite que apresentam ou não sintomas de
infecção respiratória, sendo detectado em dois a 25% de pacientes com gastroenterite aguda
em várias regiões do mundo (Albuquerque et al. 2007, Vicente et al. 2007, Arthur et al. 2009,
Han et al. 2009). Adicionalmente, considerando que diferentes parvovírus causam diarréia
severa em animais como em cães, a sugestão importante de que o HBoV também possa ser
responsável por gastroenterite aguda em humanos.
No Brasil, um único estudo realizado por Albuquerque et al. (2007) relaciona a
detecção do bocavírus humano e gastroenterite aguda. O mesmo grupo também mostra que
amostras de HBoV 2 e 3 circulam no Brasil ( Santos et al. 2010).
Em Goiânia e na região Centro-Oeste, estudos vêm sendo realizados desde a década
de 80 visando detecção e caracterização viral em casos de gastroenterite em diferentes
populações o que tem permitido visualizar o papel de RVA, adenovirus entérico, astrovirus e
calicivirus na síndrome (Cardoso et al. 1992, Souza et al. 2003, Borges et al. 2006, Andreasi
et al. 2008, Silva et al. 2009). Ainda assim, percentual importante, em torno de 40% dos
casos clínicos de gastroenterite permanece sem etiologia.
Desta forma a justificativa do presente estudo que visa a obtenção de dados relativos à
ocorrência do HBoV-1 em amostras de fezes provenientes de crianças da região Centro-Oeste
com quadro de gastroenterite aguda vem na tentativa de preencher, portanto, mais uma
lacuna do conhecimento no contexto da síndrome.
17
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho foi o de detectar a presença do genoma do HBoV-1 em
amostras de fezes coletadas de crianças que apresentavam quadro de gastroenterite aguda
atendidas em unidades de saúde de três cidades da região Centro-Oeste do Brasil: Goiânia,
Brasília e Campo Grande. No período de 1994 a 2004.
3.2 Objetivos Específicos
•
Estimar a prevalência de HBoV-1 em amostras de fezes de crianças com quadro de
gastroenterite aguda correlacionando à procedência, faixa etária e gênero das mesmas.
•
Determinar a ocorrência de HBoV-1 considerando o período de circulação viral, por
cidade estudada.
•
Determinar a co-infecção de HBoV-1 com outros vírus causadores de gastroenterite
por cidade estudada.
18
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material de estudo
Neste estudo retrospectivo, foram analisadas 762 amostras fecais de igual número de
crianças, todas com até 5 anos de idade, provenientes de três cidades da região Centro-Oeste:
Goiânia-GO, Brasília-DF e Campo Grande-MS.
Todas as crianças apresentavam, à época, quadro clínico de gastroenterite aguda, tendo
por base mínima a ocorrência de diarréia definida como três ou mais evacuações líquidas ou
semi-líquidas por dia.
Considerando a procedência das amostras, em Campo Grande-MS, estas foram
colhidas de crianças em duas unidades de Saúde Pública do Setor da Pediatria: Santa Casa de
Misericórdia e do Hospital Universitário/Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Em
Brasília-DF, as amostras foram provenientes de coletas do Instituto de Saúde
Pública/Laboratório Central do Distrito Federal – ISDF/LACEN e do Hospital Universitário
da Universidade de Brasília. Enquanto que em Goiânia-GO estas foram provenientes de
crianças atendidas no Hospital Materno Infantil/Secretaria de Saúde do Estado de Goiás e do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás.
Em termos do período de coleta, em Campo Grande esta ocorreu durante os anos de
2000 a 2004, em Brasília de 1994 a 1996, enquanto que em Goiânia a coleta ocorreu de 1998
a 2001. Todas as amostras foram previamente testadas visando detecção de RVA, adenovírus,
calicivírus e astrovírus. As amostras provenientes de Campo Grande foram também testadas
para Aichi vírus.
A coleta das amostras de fezes foi realizada após consentimento e autorização prévia
de pais (ou responsáveis) pelas crianças, com esclarecimento sobre a coleta e o preenchimento
de um questionário contendo informações sobre dados pessoais e epidemiológicos (ANEXO1).
As amostras coletadas, após transporte adequado, foram armazenadas no laboratório
de Virologia Humana do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás, a 4ºC até a realização do preparo das suspensões das amostras de fezes
quando então foram estocadas a -20ºC.
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em Pesquisa da Universidade Federal de
Goiás-UFG, sob número (nº 004/2000).
19
4.2 Metodologia
4.2.1 Detecção de HBoV-1
a) Preparo das suspensões fecais:
As amostras de fezes foram inicialmente processadas objetivando obter uma suspensão
fecal a 20% em tampão salina fosfato (PBS)
pH
7,4. As suspensões eram a seguir
homogeneizadas e clarificadas por centrifugação a 3000X g (Spin I, Incibrás) por 10 minutos
e os sobrenadantes estocados a -200 C até a sua análise.
b) Extração de DNA do bocavírus humano (HBoV).
A extração do DNA viral foi feita utilizando uma de duas metodologias: método do
TRIzol e o Kit de extração Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega).
b.1) Método utilizando o TRIzol ®.
Por este método as suspensões fecais eram trabalhadas utilizando o TRIzolR Reagent
(invitrogenTM / Life Technologies, USA). Para o procedimento em tubos tipo eppendorf eram
adicionados 300 µL da suspensão fecal juntamente com 900 µL de TRIzol. Procedia-se a
homogeinização por inversão e incubação a temperatura ambiente por 5 minutos. Após eram
adicionados 240 µL de clorofómio seguido de agitação em vórtex (Vertex QL-901) e
incubação a temperatura ambiente por 10 minutos. Após centrifugação a 12.000 X g (Micro
High Speed refrigerated centrifuge, VISION) por 5 minutos a 4o C transferia-se a fase aquosa
superior, sem a interface, para outro tubo e adicionava-se 600 µL de álcool isopropílico
seguido de incubação a temperatura ambiente por 10 minutos e nova centrifugação de 12.000
X g por 10 minutos a 4o C. Após removia-se o sobrenadante e ao sedimento era adicionado
1.200 µL de etanol a 70% gelado. Após, procedia-se a nova centrifugação a 7.500 X g por 5
minutos a 4o C, com descarte novamente do sobrenadante com re-suspensão do sedimento em
30 µL de água milli-Q tratada com DEPC (USB® Corporation/Amersham Biosciences) a
0,1%. As amostras eram então incubadas a 56o C por 10 minutos em banho-maria (BE-3100,
BIO ENG) e após, estocadas a -20o C até o momento do uso.
b.2) Método do Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA).
A extração do DNA viral por este Kit seguiu instruções do fabricante, com
20
modificações (Albuquerque et al. 2007). Para o procedimento em tubos tipo eppendorf de
1,5mL foram adicionados 300µL da solução de lise nuclear, 3µL da solução RNAse e 300µL
da suspensão fecal a 20% em PBS. Procedia-se então a homogeneização do material por
inversão do tubo e então se incubava em banho-maria a 37oc por 15-30 minutos, seguido de 5
minutos a temperatura ambiente. A seguir adicionado 200 µL da solução de precipitação de
proteínas, quando então, fazia-se agitação em vórtex seguida de incubação em gelo por 5
minutos.
Depois, a amostra era centrifugada a 13.000 X g por 4 minutos, o sobrenadante era
transferido para outro tubo contendo 600 µL de isopropanol. Então, procedia-se a
homogeneização por inversão e incubação a temperatura ambiente por 30 minutos seguido de
centrifugação a 13.00 X g por 1 minuto com posterior descarte do sobrenadante. A seguir
adicionado 600 µL de etanol a 70% seguida de centrifugação a 13.000 X g por 1 minuto.
Após novo descarte do sobrenadante o sedimento era deixado secar a temperatura ambiente
por 15-20 minutos quando então era re-suspendido em 100 µL da solução de re-hidratação de
DNA e incubado em banho-maria a 65o C por 1 hora. Finalmente este era estocado a 4o C até
o momento do uso.
c) Reação em cadeia pela polimerase (PCR).
Este protocolo amplifica o gene que codifica a proteína não-estrutural 1 (NS1) do
HBoV-1, seguindo especificações da metodologia aplicada por Sloots e colaboradores (Sloots
et al. 2006). Em todas as reações foram utilizadas duas amostras para controles repetidamente
positivas para o bocavírus humano, gentilmente cedida pela Dra. Norma Suely de Oliveira
Santos - Departamento de Virologia – Universidade Federal do Rio de Janeiro/RJ. A PCR foi
realizada utilizando os iniciadores específicos HBoV 01.2 e HBoV 02.2 (Quadro 1) que são
direcionados para a região RLA1 do genoma viral conforme Sloots et al. (2006).
Quadro 1 – Sequência dos iniciadores utilizados para a PCR, para detecção do material
genômico de HBoV-1.
Primer/iniciadores
Função
Seqüência
HBoV 01.2
1a
5´TAT GGC CAA GGC AAT AGT CCA AG 3’
HBoV 02.2
amplificação
5´GCC GCG TGA ACA TGA GAA ACA GA 3’
Tamanho
amplicon
291 pb
21
Foram utilizados para a PCR 5 µL do material de DNA extraído ao qual foi adicionado
em tubos tipo eppendorf a 20 µL da mistura de PCR (Quadro 2) contendo 5x tampão de
reação (PCR buffer – TRIS-HCL 20 mM pH 8,4/KCL 50mM), 10mM de cada dNTP (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), 25mM de MgCl2, iniciadores específicos (0,1µl HBoV 01.2 e 0,1µl
HBoV 02.2), 0,2 µL de Taq DNA polimerase.
Quadro 2 – Mistura de reação utilizada na reação de amplificação (PCR) para detecção de
HBoV-1.
Master mix para a 1a PCR
Volume para uma reação
10 mM dNTP (pool de dNTP)(Amersham Biosciences)
0,5µL
Tampão da enzima 5x (InvitrogenTM/LifeTechnologies)
4,0µL
25 mM MgCl2
2,4µL
Primer (1 e 2)
0,2µL
Taq DNA polimerase
0,2µL
dH2O (Água Milli-Q)
12,7µL
Volume total por reação
20,0µL
A seguir, as amostras foram levadas ao termociclador (Swift maxi, Esco/ Eppendorf
Mastercycler personal). Iniciando o ciclo com aquecimento a 95o C por 15 minutos, depois
para o procedimento da amplificação em 45 ciclos (94o C por 20 segundos, 56oc por 20
segundos e 72 oC por 30 segundos), seguidos por uma extensão final a 72oC por 5 minutos.
Podendo ser estocados a 4o C.
d) Eletroforese em gel de agarose:
Após a amplificação, 10 µL da amostra do produto da PCR bem como o padrão
molecular de 100 pb DNA, foram misturados a 3 µL do tampão corante da amostra (azul de
bromefenol, xilenocianol, glicerol) e aplicados em gel de agarose (InvitrogenTM / Life
Technologies) a 1,5%, contendo 0,5 mg/mL de brometo de etídeo e submetido a uma
eletroforese a 80 volts (Hoefer mini VE / PW Sys) por aproximadamente 1 hora em tampão
1x TRIS/Borato/EDTA (TBE) a 0,5%. Para todas as reações foram utilizadas amostras
controles positivas e negativas. Após o procedimento da eletroforese e procedeu-se a leitura
do gel, feita em transiluminador; com luz ultravioleta para observação do amplicon com
tamanho esperado de 291 pares de bases.
22
4.3 Análise estatística
Para a análise estatística dos resultados foi utilizado o programa Epiinfo versão 3.5.1.
com utilização do teste qui-quadrado ( 2) com intervalo de confiança de 95% e quando
necessário, foi utilizado o teste exato de Fisher (Centeno 1990). Foram consideradas
diferenças significativas quando p<0,05.
23
5. RESULTADOS
Todas as 762 amostras fecais foram testadas para a presença de DNA de bocavírus
humano 1 (HBoV-1) por PCR, sendo consideradas positivas para HBoV-1 aquelas que
apresentaram, após amplificação, um fragmento de aproximadamente 291 pares de bases
(Figura 6). No presente estudo não foi realizado seqüenciamento das amostras para
confirmação se as positivas tratavam-se somente do HBoV-1.
1
2
3
4
5
300 pb
291 pb
200 pb
100 pb
Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose (1,5%). Linha 1. Padrão de tamanho molecular
(100pb DNA ladder). Linhas 2 e 3. Amostras positivas para HBoV-1. Linha 4. Controle
positivo e Linha 5. Controle negativo para HBoV-1.
A positividade encontrada para o HBoV-1 em relação a 762 amostras fecais analisadas
foi de 5,7% (44/762) (Tabela 1). Quando se considerou a procedência das crianças estudadas
observou-se que das 44 amostras positivas, 20 eram procedentes de Goiânia, 15 de Campo
Grande e 9 de Brasília. A análise estatística em termos da positividade por cidade estudada
não mostrou diferença estatisticamente significativa.
Tabela 1 – A prevalência do HBoV-1 em amostras fecais de crianças com gastroenterite de
acordo com a cidade de coleta (n=762).
Local
HBoV-1 - Pos/Total
%
Goiânia
Campo Grande
Brasília
20/401
15/231
9/130
5,0
6,5
6,9
Total
44/762
5,7
p = 0,60922. IC: Intervalo de confiança de 95%
24
A positividade das amostras quanto ao gênero das crianças revelou que 5,7% eram de
crianças do sexo masculino e 5,8% do feminino, não houve diferença significativa da
positividade para HBoV-1 em relação ao genêro (Tabela 2).
Tabela 2 – Distribuição percentual de amostras fecais positivas para HBoV-1 coletadas de
crianças com gastroenterite da região Centro-Oeste do Brasil em relação ao gênero.
Gênero
Masculino
Feminino
Total
Goiânia
Nº
Pos/Total (%)
13/226 (5,7)
7/175 (4,0)
C. Grande
Nº
Pos/Total (%)
9/141 (6,4)
6/90 (6,7)
Brasília
Nº
Pos/Total(%)
3/67 (4,5)
6/63 (9,5)
Total
Nº
Pos/Total (%)
25/434 (5,7)
19/328 (5,8)
20/401 (5,0)
15/231 (6,5)
9/130 (6,9)
44/762 (5,7)
p = 0,89032. IC: Intervalo de Confiança de 95%
Considerando a positividade para HBoV-1 em relação à faixa etária da população do
estudo foi observada detecção do vírus em crianças de até 48 meses e que não foi observada
diferença significativa entre as faixas etárias estudadas. Ressalta-se, não obstante, que na faixa
de 36 a 48 meses a positividade viral só foi observada para as crianças de Goiânia. Para as
crianças de Campo Grande e Brasília a faixa etária acometida foi até 24 meses (Tabela 3).
Tabela 3 - Percentual de positividade para HBoV-1 em amostras fecais coletadas de crianças
com gastroenterite aguda em três cidades da região Centro-Oeste em relação à faixa etária.
Faixa etária
(meses)
0-6
7-12
13-24
Goiânia
N0
%
5/91 (5,5)
8/159 (5,0)
4/84 (4,7)
C. Grande
N0
%
2/70 (2,8)
6/40 (15,0)b
7/73 (9,6)
Brasília
N0
%
3/45 (6,6)
2/33 (6,0)
4/31 (13,0)c
Total
N0
%
10/206 (4,8)
16/278 (5,7)
15/188 (8,0)d
25-36
37-48
> 48
SD*
1/37 (2,7)
2/18 (11,1)a
0/8 (0,0)
0/4 (0,0)
0/2 (0,0)
0/0 (0,0)
0/0 (0,0)
0/8 (0,0)
0/12 (0,0)
0/1 (0,0)
1/47 (2,1)
2/30 (6,6)
0/9 (0,0)
15/231 (6,5)
9/130 (6,9)
44/762 (5,7)
Total
20/401 (5,0)
a
b
c
d
* Sem dados. p =0,86612, p =0,13674, p =0,64999, p =0,58977. IC = 95%
A distribuição percentual de amostras positivas para HBoV-1 em crianças com
gastroenterite aguda procedentes das três cidades do Centro-Oeste pelos anos do estudo
(Tabela 4). Considerando que durante uma década, compreendendo os anos de 1994 a 2004
tivemos coletas de amostras fecais provenientes das cidades de Goiânia (1998 a 2001), de
Campo grande (2001 a 2004) e de Brasília (1994 a 1996); não houve coleta no ano de 1997.
25
Foi observado que ocorreu coleta de espécimes fecais em todos os meses do ano para as
cidades de Goiânia e Campo Grande, já para Brasília só ocorreu no período de outubro a
janeiro.
Tabela 4 - Distribuição de amostras fecais positivas para HBoV-1 coletadas de crianças com
gastroenterite aguda da região Centro-Oeste em relação aos anos de coleta – período de 1994
a 2004.
Ano
Goiânia
N.º %
1994
1995
1996
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
7/83 (8,4)
8/204 (3,9)
2/63 (3,1)
3/56 (5,3)
C. Grande
N.º %
Brasília
N.º %
8/91 (8,7)
1/27 (3,7)
0/13 (0,0)
0/2 (0,0)
1/26 (3,8)
14/186 (7,5)
0/8 (0,0)
Total
N.º %
8/91 (8,7)
1/27 (3,7)
0/13 (0,0)
7/83 (8,4)
8/204 (3,9)
2/65 (3,0)
3/64 (4,6)
1/26 (3,8)
14/186 (7,5)
0/8 (0,0)
Considerando a sazonalidade foi observado percentual de positividade de 5,4% e 6,3%
para as estações de chuva e seca, respectivamente, o que não foi estatisticamente significativo.
A análise considerando as cidades individualmente mostrou índices semelhantes de detecção
nas duas estações para as cidades de Goiânia e Campo Grande enquanto que em Brasília não
houve detecção do vírus na estação de seca, embora não estatisticamente significativo
(Tabela 5).
Tabela 5 - Distribuição de amostras fecais positivas para HBoV-1 coletadas de crianças de
Goiânia, Campo Grande e Brasília com quadro clínico de gastroenterite aguda em relação aos
meses do ano – período de 1994 a 2004.
Estação climática
Chuvosa
(setembro/março)
Seca
(abril/agosto)
Goiânia
Pos/Total (%)
Campo Grande
Pos/Total (%)
Brasília
Pos/Total (%)
Total
(%)
12/232 (5,1)
5/119 (4,2)
9/129 (6,9)
26/480 (5,4)
8/169 (4,7)
10/112(8,9)
0/1 (0,0)
18/282 (6,3)
p = 0,69556. IC: Intervalo de Confiança de 95%
26
A ocorrência da co-infecção de amostras fecais de crianças com gastroenterite foi
observada em 14 (31,8%) das 44 amostras positivas para o HBoV-1. Das 14 amostras, nove
também eram positivas para rotavírus do grupo A (RVA) e cinco com Aichi vírus.
Considerando as cidades do estudo observou-se que a associação com RVA foi vista em
amostras provenientes de todas elas enquanto que a associação para Aichi vírus só foi
encontrada em amostras de Campo Grande (Tabela 6).
Tabela 6 - Distribuição da co-infecção do HBoV-1 em ocorrência simultânea a outros agentes
virais causadores de gastroenteite aguda em crianças de cidades da região Centro-Oeste nos
anos de 1994, 1998, 1999 e 2003.
Ano
Vírus
Nº
Procedência
1994
Rotavírus
02
Brasília
1998
Rotavírus
01
Goiânia
1999
Rotavírus
04
Goiânia
2003
Rotavírus
02
Campo Grande
2003
Aichi vírus
05
Campo Grande
27
6. DISCUSSÃO
A detecção de HBoV em amostras fecais de casos de gastrenterite aguda tem assumido
importância desde que, a partir do seu reconhecimento em amostras fecais (Fry et al. 2007,
Lau et al. 2007, Lee et al. 2007, Monteny et al. 2007, Neske et al. 2007, Qu et al. 2007,
Schenk et al. 2007, Vicente et al. 2007) muitos estudos vêm confirmando o achado (Yu et al.
2008, Arthur et al. 2009, Chow et al. 2009, Han et al. 2009, Kapoor et al. 2009) com uma
concepção bastante atual de que possa também ser responsabilizado como agente etiológico
da síndrome (Arthur et al. 2009, Chow et al. 2009, Nakanishi et al 2009, Santos et al. 2010).
Na perspectiva de também agregar dados ao conhecimento relativo à etiologia das
gastrenterites virais na região Centro-Oeste é que se procedeu ao presente estudo. Neste
contexto foi observado que HBoV-1 também circula na região com índice que pode ser
considerando similar a de outros estudos realizados em diferentes partes do mundo (Lau et al.
2007, Lee et al. 2007, Vicente et al. 2007, Cheng et al. 2008, Yu et al. 2008) incluindo o
Brasil (Albuquerque et al. 2007). Adicionalmente, ele ocorreu em todos os anos respectivos a
cada cidade estudada sugerindo que sua ocorrência pode ser inclusive anterior em relação ao
tempo.
Também neste foco vale lembrar que, na região Centro-Oeste, estudos têm indicado
presença de diferentes agentes virais em casos de gastroenterite com maior índice de detecção
para RVA, seguido de calicivírus, adenovírus e astrovírus (Cardoso et al. 2003, Souza et al.
2003, Santos et al. 2007, Silva et al. 2009). Ainda assim, percentual importante, em torno de
40% de casos da doença permanece sem achados etiológicos.
Com o presente estudo considera-se que mais um dado possa ter sido adicionado ao
conhecimento existente, inclusive pelo achado global de 5,7% de positividade para o
HBoV-1, com índices similares para cada cidade do estudo, o que pode vir a classificar o
agente como o terceiro na ordem de detecção viral na região. Em adição, no presente estudo
utilizou-se procedimento somente para detecção do HBoV-1 e estudos publicados
recentemente têm reportado maior índice de detecção em casos de gastrenterite pelo HBoV-2
(Arthur et al. 2009, Chow et al. 2009) o que pode também então sugerir que o índice de
positividade para o HBoV observado possa estar subestimado. Desta forma, estudos futuros
deverão ser realizados para confirmação desta sugestão.
Ainda na região Centro-Oeste, quando do estudo para os outros agentes virais
previamente mencionados, tem sido feito a análise da população infantil estudada em termos
demográficos relativos à positividade viral. Assim, tem sido observado não haver diferença
28
estatística em relação à idade da criança, a faixa principal de infecção é de até cinco anos de
idade. Para alguns vírus como o RVA a faixa principal é de até 24 meses (Cardoso et al. 1992,
2003) o mesmo ocorrendo também para astrovírus (Sakamoto et al. 2000, Silva et al. 2001,
Giordano et al. 2004) e adenovírus (Bon et al. 1999, Phan et al. 2004) mas ligeiramente
superior para calicivírus (Nakata et al. 2000, Gallimore et al. 2004, Hansman et al. 2004).
No presente estudo observou-se que HBoV-1 ocorreu similarmente em todas as faixas
etárias, embora não tenha sido detectado nas crianças com mais de 48 meses de idade. Este
dado, por outro lado, parece não merecer maior consideração em função do pequeno número
de crianças estudada nesta faixa etária.
Um estudo conduzido na Coréia do Sul mostrou maior positividade na faixa etária de
25-30 meses (Yu et al. 2008). Similarmente, os resultados deste estudo no que se refere à
faixa etária é concordante com outros estudos já realizados em diferentes partes do mundo
(Campe et al. 2008, Huang et al. 2009, Karalar et al. 2009, Tozer et al. 2009) bem como do
Brasil (Albuquerque et al. 2007).
A análise da positividade para o bocavírus em amostras de fezes de crianças da região
Centro-Oeste em relação ao gênero não apresentou diferença estatisticamente significativa. A
não diferença de positividade em relação a gênero também tem sido observada em outros
estudos o que desta forma confirma os resultados do presente estudo (Yu et al. 2008, Han et
al. 2009).
Outra característica que tem sido analisada aos agentes etiológicos detectados em
casos de gastrenterite na região Centro-Oeste é relativa à sua ocorrência no decorrer do ano.
Esta análise tem sido realizada considerando o fato de que a região é marcada por períodos de
seca e chuva condicionadas aos meses de abril-agosto e setembro-março, respectivamente,
não havendo demarcação das quatro estações de ano. Assim, para o RVA a ocorrência
principal na região Centro-Oeste é na estação de seca (Cardoso et al. 1992, Cardoso e al.
2003, Costa et al. 2004).
Mundialmente adenovirus, astrovirus e calicivírus embora ocorram ao longo de todos
os meses do ano apresentam tendência para a estação chuvosa (Mustafa et al 2000, Phan et al.
2004, Xi et al. 1990, Mounts et al. 2000) e para a região Centro-Oeste os estudos revelaram
um predomínio desses vírus para a estação de chuva (Cardoso et al. 2003, Borges et al. 2006,
Santos et al. 2007).
No presente estudo também se procedeu a esta análise e a observação foi a de que o
vírus ocorre similarmente em ambas as estações o fato de que na cidade de Brasília o vírus
não tenha sido detectado na estação de seca. Novamente, este dado deve ser relevado desde
29
que apenas uma amostra foi analisada na estação em pauta.
Poucos dados existem na
literatura que permitam comparação, ainda assim um estudo realizado no Japão observou
maior prevalência do vírus no inverno embora tenha havido circulação durante todo o ano
(Nakanishi et al. 2009). Outros estudos deverão ser realizados para melhor compreensão da
sazonalidade do HBoV na região.
Também como procedimento de análise das gastrenterites virais na região CentroOeste tem-se buscado identificar a ocorrência de mais de um agente viral no mesmo espécime
clinico. Esta metodologia foi também adotada no presente estudo onde se observou que 14
(31%) amostras positivas para HBoV-1 eram também positivas para outros agentes, RVA e
Aichi vírus. Deve ser lembrado que RVA (Iturriza-Gómara et al. 2000, Cardoso et al. 2003,
Parashar et al. 2006) é sobejamente reconhecido como agente da gastrenterite, mas para Aichi
vírus o seu papel como agente etiológico ainda permanece em estudo (Yamashita et al. 2000,
Oh et al. 2003).
Na região Centro-Oeste a análise de poucas amostras fecais provenientes de crianças
com gastroenterite mostraram a presença de Aichi vírus (Oh et al. 2006), contudo, sem ter o
reconhecimento da responsabilidade do agente na síndrome. Estudos em desenvolvimento
busca levantar esta possibilidade (Cardoso, D.D.P- comunicação pessoal).
Análise comparativa em termos de co-infecção do HBoV com outros enteropatógenos
mostra que esta parece ser característica comum conforme observado em estudo realizado no
Japão onde se observou presença também de RVA, adenovírus, astrovírus e calicivírus com
maior frequência de RVA e calicivírus (norovírus) (Nakanishi et al. 2009, Räsänen et al.
2010). Pesquisas realizadas na Austrália (Arthur et al. 2009) e Coréia do Sul (Han et al. 2009)
também identificaram os mesmos agentes.
Os resultados obtidos no presente estudo confirmam os dados disponíveis na literatura
da positividade de detecção do HBoV em amostras de fezes em crianças menores de cinco
anos de idade com diagnóstico de gastroenterite aguda das cidades de Goiânia-GO, Campo
Grande-MS e Brasília-DF o que sugere a possibilidade deste vírus ser responsável por uma
parcela substancial das gastrenterites na região Centro-Oeste.
Sob qualquer prisma atentado no presente estudo consideramos que outros estudos
devam ser realizados, levando em consideração população de diferentes faixas etárias e
estados de saúde com o aditivo de controles pareados além da caracterização dos “genótipos”
do vírus para uma melhor compreensão do vírus e da morbidade a ele atribuída.
30
7. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos, nas condições deste estudo, permitem concluir:
• A positividade global para o HBoV-1 de 5,7% para as três cidades de Campo GrandeMS, Brasília-DF e Goiânia-GO mostra que este vírus está presente na região CentroOeste, desde que nas três cidades estudadas houve detecção do agente nas amostras
das crianças estudadas.
• O gênero das crianças do estudo não foi um fator de diferença em relação à
positividade para o HBoV-1 o mesmo ocorrendo em relação ao sexo e faixa etária das
crianças de qualquer das cidades de origem.
• Dados sobre a ocorrência de bocavírus nas três cidades mostrou circulação do vírus ao
longo de todos os meses do ano o que sugere não haver sazonalidade para o vírus.
• Demonstração de co-infecção esteve presente neste estudo, onde foi observada a
ocorrência de positividade concomitante entre bocavírus e RVA e também entre
bocavírus e Aichi vírus o que leva a não identificação do agente etiológico principal
da infecção.
31
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
ANEXO 1. Modelo da Ficha Epidemiológica utilizada no estudo
INVESTIGAÇÃO CLÍNICA E EPIDEMIOLOGICA DE
DOENÇA DIARRÉICA – IPTESP/UFG.
DATA DE COLETA-----/------/-----/
LOCAL DE COLETA--------
1. DADOS DO PACIENTE:
HORÁRIO DE COLETA APÓS O ATENDIMENTO:
1h( )
2hs( ) 3hs( ) 4hs( ) 5hs( ) mais horas( )
NOME DO PACIENTE --------------------------------------------------------------------------------------------ENDEREÇO: ---------------------------------------------------------------------------------------------------------TELEFONE: ------------------------------------- FALAR COM:--------------------------------------------------PROFISSÃO DA MÃE: -------------------------------------- PROFISSÃO DO PAI--------------------------SEXO: MASCULINO ( )
FEMININO( )
DATA DE NASCIMENTO----/----/---- 1m( ) 1-3m( ) 4-6m( ) 7-9m( )
3a( )
10-12m ( ) 1a( ) 2a( )
4-5a( ).
HABITAÇÃO:
CASA PRÓPRIA ( ) ALUGADA ( ) INVASÃO ( ) OUTROS ( )
RENDA FAMILIAR (SALÁRIO MÍNIMO):
( ) <1 ( )1 ( )1-2 ( )2-3 ( )3-4 ( )4-5 ( )5-6 ( )>6
PREVIDÊNCIA: PRIVADA ( ) GOVERNAMENTAL ( ) NENHUM ( )
2. HISTÓRIA CLÍNICA:
NÚMERO DE DIAS DOENTE: ( )1 ( )2 ( )3 ( )4 ( )5 ( )>5
VÔMITO:-------------
NÃO( )
SIM( )
DIARRÉIA-----------
NÃO ( )
SIM( )
( ) LÍQUIDA
FEBRE:---------------- NÃO( )
( ) SEMI-LÍQUIDA
SIM( )
QUEIXA RESPIRATÓRIA:---- NÃO( )
SIM( )
DOR ABDOMINAL:------------- NÃO( )
SIM( )
OUTROS:----------------------------------ASSINATURA DOS PAIS OU RESPONSÁVEL:------------------------
( )PASTOSA