LC/MS

Introdução à LC/MS
Introdução
n LC
provém a separação, em fase líquida, de
misturas complexas, porém dificilmente fornece a
identificação positiva de componentes
individuais.
n MS
é uma técnica que auxilia na elucidação
estrutural de compostos em fase gasosa, porém
dificilmente é apropriado para a análise de
misturas.
n LC opera em fase líquida enquanto que MS opera
em fase gasosa, sob alto vácuo.
1
Introdução
n O
uso de uma interface é necessário para ter
compostos seqüencialmente separados em LC e
introduzidos para análise no MS.
n  U m
bom sistema LC/MS pode fornecer
informações quali e quantitativas, geralmente
com diminutas quantidades de material.
Cromatografia Líquida
2
Espectrometria de Massas
Misturas em MS
3
Combinando LC com MS
Aquisição dos Dados
Velocidade de varredura
4
Aquisição dos Dados
Número de espectros por pico
Melhorando os Resultados
Obter a maior eficiência possível
5
Melhorando os Resultados
Apresentação de cromatograma de
íon selecionado
Melhorando os Resultados
Monitoramento de íon selecionado (SIM)
6
Sumário
n O
interfaceamento de LC com MS resulta em um
instrumento poderoso de LC/MS que pode ser
usado para análises de misturas complexas,
originada de fontes mais variadas.
n Aplicações
de interesse nas áreas de meio
ambiente, arqueologia, medicina e forense, além
de química e bioquímica.
Cromatografia Líquida
Acoplada à Espectrometria
de Massas —LC/MS
n  Espectrometria de Massas
n  Interfaces
n  Analisadores de Massas
7
I. Espectrometria de Massas (MS)
n  A espectrometria de massas é uma técnica
analítica instrumental utilizada para a análise, em
fase gasosa, de átomos ou moléculas de uma
amostra que são ionizados e separados de
acordo com a razão massa/carga quando
submetidos a condições específicas de um
campo elétrico e/ou magnético.
I. Espectrometria de Massas (MS)
n  A determinação da massa molecular;
n  A caracterização estrutural;
n  O estudo da reatividade em fase gasosa;
n  A análise qualitativa e quantitativa dos
componentes de uma mistura complexa;
n  A estrutura de compostos inorgânicos, orgânicos
e biológicos;
n  A estrutura e composição de superfície sólida;
n  A razão isotópica de átomos na amostra.
8
II. O Espectrômetro de Massas
n  Processo de ionização e/ou fragmentação
n  Separação dos íons
n  Detecção e análise
Amostra
Sistema de
introdução
de amostra
Fonte
de íons
Analisador
de massas
Sistema
de vácuo
Detector
Proc. de
dados
Etil benzeno: MM = 106 Da
C6H5CH2CH3 + e- → C6H5CH2CH3• + + 2e-
9
Informações do Espectro de
Massas
n  Separação dos íons pela razão massa/carga
n  Pico do íon molecular
n  Pico do íon base (100%)
n  Padrão de fragmentação
n  Razão isotópica
III. Fontes (Processos) de
Ionização
Tipo
Nome e Sigla
Básico
Fase Gasosa Impacto Eletrônico (EI)
Ionização Química (CI)
Ionização de Campo (FI)
Dessorção
Dessorção de Campo (FD)
Ionização electrospray (ESI)
Ionização/dessorção à laser
assistido por matriz
(MALD/I)
Bombardeamento de átomos
rápidos (FAB)
Ionização termospray (TS)
Agente Ionizante
elétrons energéticos
íons gasosos
eletrodo alta voltagem
eletrodo alta voltagem
alto campo elétrico
feixe de laser
feixe átomos
acelerados
alta temperatura
10
Impacto Eletrônico ou Ionização
por Eletrons
n  A amostra passa por uma “cortina” de elétrons
acelerados por um campo de 70 eV
E = 70 eV ≈ 7 × 103 kJ mol-1
n  Energia de ligação típica ≈ 200 - 600 kJ mol-1
Fragmentação
Impacto Eletrônico
11
Ionização por Elétron
J  Alta produção de íons - boa sensibilidade
J  Fragmentação auxilia na identificação
K  Requer amostra volátil
L  Pico íon molecular nem sempre é evidente
⇒  Uso de Ionização Química (CI):
⇒ 
produção de íon molecular e a
fragmentação é mais amena
Reprodutibilidade de fragmentação
12
Ionização à Pressão Atmosférica (API)
n  Ionização Electrospray (ESI)
n  Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)
Vantagens API
n  Informação sobre a massa molecular (MM) dos
compostos, inclusive grandes biopolímeros.
n  Sensível; MM obtida com concentrações baixas de
analitos.
n  A técnica é compatível com moléculas voláteis, não
voláteis, polares e apolares.
n  Excelente para confirmação de compostos
conhecidos.
13
Ionização por Electrospray (ESI)
n  Ionização à pressão atmosférica e temperatura
ambiente
n  Aplicação de campo elétrico de vários kV
promove a ionização das gotículas do spray
n  Um contra fluxo de gás secante reduz o tamanho
das gotículas até o seu colapso eletrostático
n  Produção de íons com elevado número cargas
Interface ESI
14
Processo de Ionização
Aplicações do ESI
q  Análise de compostos polares e com elevada massa
Molecular. Por Exemplo: Saponinas
H3C
CH3
OH
CH3
CH3
OH
O
O
H3C
HO
O
O
O
O
H
H3C
OH
H
HO
H
O
O
O
OH
O
H
OH
H
O
15
sep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9))
100
%
411.3 473.4
528.6
605.5 645.3 689.7
sep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9))
0
100
sep1124Fs
8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
Scan ES2.24e5
1288.0
1246.2
1203.8
1246.9 1289.0 1330.0
1204.5
1290.0 1330.6
1162.1
1205.7 1247.8
1387.9 1402.1
745.9
1445.2
Scan ES1288.0
2.24e5
1246.2
Scan ES1203.8
1350.1
4.20e5
1246.9 1289.0 1330.0
1204.5
1349.6 1351.2
1391.9
1290.0 1330.6
1308.1
1162.1
1352.2
1205.7 1247.8
1387.91394.0
1271.9
1402.11434.1
1395.1 1445.2
1230.1
1187.7
1470.0
Scan ES1350.1
4.20e5
Scan ES1349.6 1351.2
1314.1
2.21e5
1391.9
1272.2
1308.1
1352.2
1394.0
1271.6
1356.1 1392.0 1434.1
1230.1 1271.9 1272.9
1395.1
1230.1
1230.8
1187.7
1188.0
1398.0 1470.0
1436.0 1488.1
1146.0
100
%
605.5 645.3 689.7
745.9
% 411.3 473.4 528.6
0 447.5
691.9 727.6 769.8
sep1124Fs 8 463.5
(0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
0
100
sep16rFs
9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
882.0
896.0 909.4
Monitoramento da composição de frações
obtidas de extratos de Sapindus saponaria
100
%
691.9 727.6 769.8
% 447.5463.5
499.7 520.7
0
603.9
sep16rFs
9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
0
100
sep1162Fs
13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49))
896.0 909.4
966.1 1002.1
881.9 923.9
1041.8
882.0
749.4
966.1
924.0 965.6 966.5
100
%
499.7 520.7
%
603.9
0
603.4
471.4
sep1162Fs
13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49))
0
sepFreu2026Fs
10 (0.494) Cm (7:13)
100
100
%
%
471.4
503.5
455.3
603.3
749.6
450
550
600
749.4
745.9
750
800
650
463.5
499.7
411.3 473.4 520.7
528.6
1146.0
1141.0
1141.0
1097.3 1154.6
1265.3 1298.9
1338.7
1407.4
1338.7
1407.4
1436.0 1488.1
Scan ES1.81e5
Scan
ES3.90e5
1468.4
Scan ES3.90e5
Scan
ES3.46e5
Scan ES2.24e5
966.1
945.1 966.6
864.0 882.0
700
750
800
691.9 727.6 769.8
850
882.0
0
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
sep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9))
100
100
%
%
1.81e5
1398.0
966.1
965.7
1288.0
882.0
1246.2
945.1 966.6
863.9 883.1 945.0 967.6
1289.0 1330.0
1019.9 1041.8 1097.3 1154.6 1203.8 1265.3
1246.91298.9
1468.4
864.0 882.0
1204.5
1004.1 1037.9 1080.0
1386.8 1407.4
1290.0 1330.6
1162.1
1205.7 1247.8
Scan ESm/z
1387.9
924.1
1445.23.46e5
850
900
950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 14001402.1
1450
749.6
665.4
749.4
500
Scan ES2.21e5
Scan
ES-
1392.0
924.0
923.6924.1
924.5
440.7471.8
447.5
924.6 967.1
923.6 924.5
863.6 881.9
965.7 1008.0 1042.2
882.0
836.9
863.9 883.1 945.0 967.6 1019.9 1041.8
749.5
750.5
0
%
440.7471.8
sepha1149Fs
0 411.3 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8))
605.5 645.3 689.7
450473.4500 528.6550
600
650
700
100400
0
sep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
%
100
0
%
400
1272.2 1314.1
1271.6
1356.1
1272.9
1230.8
966.1
965.6 966.5
924.0
924.0
0
455.3
603.3
665.4
sepFreu2026Fs
10 (0.494) Cm (7:13)
0
sepha1149Fs
28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8))
100
100
sep1112Fs
14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9))
%
100
%
1188.0
924.6966.1967.1
1002.1
881.9 923.9
1041.8
863.6 881.9
1008.0 1042.2
836.9
749.4
749.5
750.5
603.4
503.5
1230.1
Scan ES-
1004.1 1037.9 1080.0
900
950
896.0
909.4
1000
1050
1100
1308.1
1150
1271.9
12001230.1
1250
1187.7
1350.1
4.20e5
1349.6 1351.2
1407.4
1386.81391.9
1352.2
1394.0
m/z
1395.1 1434.1
1300
1350
1400
1450
1470.0
Scan ESScan ES-
603.9
605.5
645.3 689.7
0
0
sep1162Fs
13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49))
sep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23))
100
100
2.21e5
1272.2 1314.1
1288.0
2.24e5
1271.6
1246.2
1356.1 1392.0
1230.1
1272.9
1203.8
1246.9 1289.0 1330.0
1204.5 1230.8
1188.0
1398.0
1290.0 1330.6
1162.1
1436.0 1488.1
1146.0 1205.7 1247.8
1387.9 1402.1
1445.2
966.1 1002.1
881.9 923.9
1041.8
749.4
745.9
966.1
924.0 965.6 966.5
Scan ESScan ES1.81e5
4.20e5
1350.1
1349.6 1351.2
1391.9 2O (1:1).
Figura
18: Conjunto de espectro de massas
1308.1 MeOH/H
924.6 das
1352.2
967.1 frações eluídas com
1394.0
%
749.5
1271.9
%
863.6
1008.0 1042.2
1395.1 1434.1
Debaixo
para cima:
12,750.5
24, 49
e 881.9
62.
603.4 fração
1230.1
1407.4
447.5 471.4
836.9 896.0 909.4
1338.7
1141.0
691.9 727.6 769.8
1187.7
882.0
463.5
0
0
sepFreu2026Fs 10 (0.494) Cm (7:13)
sep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5)
100
100
%
%
503.5
455.3499.7 520.7
603.3
603.9
%
%
%
455.3
503.5
603.3
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1392.0
1398.0
1386.8 1407.4
1407.4
1338.7
1200
1250
1300
1350
965.7
882.0
863.9 883.1 945.0 967.6 1019.9 1041.8
749.6
665.4
1097.3 1154.6
1265.3 1298.9
864.0 882.0
749.4
440.7471.8
550
600
650
m/z
1468.4
Scan ES3.46e5
966.1
945.1 966.6
%
500
1450
Scan ES3.90e5
924.1
Ionização Química à Pressão
Atmosférica (APCI)
450
1400
924.0
923.6 924.5
0
sepha1149Fs 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8))
100
0
400
1436.01468.4
1488.1
ScanScan
ES- ES3.46e5
1.81e5
924.1
966.1
966.5
924.0 965.6 966.1
945.1 966.6
924.6
967.1
864.0
882.0
1004.1 1037.9 1080.0
863.6 881.9
1008.0
1042.2
836.9
1141.0
749.5
750.5
749.4
603.4
471.8
440.7471.4
Scan ESScan ES3.90e5
2.21e5
1272.2 1314.1
1271.6
1356.1
1230.1
1272.9
1230.8
1188.0
1097.3 1154.6
1265.3 1298.9
1146.0
965.7
882.0
945.0 967.6 1019.9 1041.8
863.9 883.1
966.1 1002.1
881.9 923.9
1041.8
749.6
749.4
665.4
00
sepha1149Fs
28 (1.336)
(9:41-(35:44+1:8))
sep1162Fs
13 (0.635)
CmCm
(5:28-(2:5+28:49))
100
100
00
400
450
500
550
600
sepFreu2026Fs 10 (0.494) Cm (7:13)
100
1470.0
924.0
923.6 924.5
700
750
800
850
900
1004.1 1037.9 1080.0
950
1000
1050
1100
1386.8 1407.4
1150
1200
1250
1300
1350
1400
1450
m/z
n  Bastante similar a ESI
n  Indicado para obtenção de MM de compostos
conhecidos (confirmação de síntese de biblioteca
combinatória), porém indução de fragmentação
também é possível
n  Compatível com grande faixa de fluxos de fase
móvel
n  Robusto para desenvolvimento de método
16
Interface APCI
Principais Diferenças entre
APCI e ESI
n  Mecanismo de Ionização:
n 
Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta
do spray, APCI apresenta um nebulizador
aquecido e pneumaticamente assistido. A
voltagem (~3 kV) é aplicada a uma agulha de
metal na saída do spray.
n 
A descarga Corona ioniza as moléculas do
solvente que por sua vez ionizam os analitos
por transferência de prótons formando [M+H]+
ou [M-H]-
17
Principais Diferenças entre
APCI e ESI
n  Razão de Fluxo:
n 
APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0 mL/
min, enquanto que ESI opera no máximo até
1,0 mL/min.
n 
ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos
quanto 5 µL/min, compatível com
acoplamentos capilares (µLC ou CZE).
Principais Diferenças entre
APCI e ESI
n  Fragmentação:
n 
Devido ao uso de aquecimento, APCI pode
produzir alguma fragmentação, enquanto que
ESI pode até formar alguns íons pseudomoleculares.
n 
APCI não produz cargas múltiplas, portanto
não é adequado para compostos de alta MM.
n  Sensibilidade:
n 
Sem ser uma regra, APCI tende a render
melhor sensibilidade para solutos menos
polares.
18
Dessorção/Ionização à Laser
Assistida com Matriz (MALD/I)
n  Processo de ionização branda.
n  Apropriado para biomoléculas de elevado peso
molecular.
n  Pulso de laser incide sobre uma amostra co-
cristalizada com uma matriz apropriada derivados de ácidos benzóicos.
n  Análise proteômica.
Dessorção/Ionização à Laser
Assistida com Matriz (MALD/I)
19
Espectro MALD/I
IV. Analisadores de Massas
n  Setor magnético (B)
n  Duplo foco (EB ou B2)
n  Quadrupolo (Q)
n  Tempo de vôo (TOF)
n  Captura de íons (MSn)
n  Ciclotron de íons (ICR)
20
Resolução em MS
Nome
Fórmula
Nominal Exata
Média
Methyl
C19H38O2
298
298.2872 298.5114
Stearate
Ubiquitin C378H630N105O118S 8556
8560.6254 8565.873
RS =
m
Δm
RS = 4000 ⇒ 400,0 e 400,1 (40,00 e (40,01)
Resolução em MS
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Resolução em MS
A resolução necessária depende da aplicação
Analisador tipo Setor Magnético
m B 2r 2e
=
z
2V
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Analisador Quadrupolar (Q)
n  Analisador de varredura
n  Normalmente é mais barato e robusto que setor
magnético
n  Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que
alternam sinais de radiofreqüência entre pares,
permitindo que apenas um íon atinja o detetor de
cada vez
Analisador Quadrupolar (Q)
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Analisador Quadrupolar (Q)
Analisador Quadrupolar (Q)
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Analisador Quadrupolar (Q)
Experimentos de MS/MS com triplo quadrupolo
Analisador Quadrupolar (Q)
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Tempo de Vôo (TOF)
n  Íons são produzidos em pulsos e injetados no
tubo de deslocamento
Tempo de Vôo (TOF)
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Tempo de Vôo (TOF)
n  Separação dos íons é temporal e depende da
energia cinética dos fragmentos
t f = d = d (1 2)V ⋅ m
v
z
m
= 1,9 ×V t 2 d 2
z
Analisador Trap Iônico (ion trap)
n  Compacto & robusto
n  Funcionamento similar ao
quadrupolo
n  Capacidade de efetuar MS
tandem temporal
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Analisador Trap Iônico (ion trap)
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