potencial de samambaias para fitorremediação de arsênio

LETÚZIA MARIA DE OLIVEIRA
POTENCIAL DE SAMAMBAIAS PARA
FITORREMEDIAÇÃO DE ARSÊNIO
LAVRAS-MG
2012
LETÚZIA MARIA DE OLIVEIRA
POTENCIAL DE SAMAMBAIAS PARA FITORREMEDIACAO DE
ARSÊNIO
Tese apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação em Ciência do Solo, área de
concentração em Química do solo, para
a obtenção do título de Doutor.
Orientador
Dr. Luiz Roberto Guimaraes Guilherme
LAVRAS-MG
2012
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca da UFLA
Oliveira, Letúzia Maria de.
Potencial de samambaias para fitorremediação de arsênio /
Letúzia Maria de Oliveira. – Lavras : UFLA, 2012.
116 p. : il.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2012.
Orientador: Luiz Roberto Guimarães Guilherme.
Bibliografia.
1. Pteris vittata. 2. Química do solo. 3. Arsenato. 4. Arsenito. 5.
Absorção. 6. Fitotoxidez. I. Universidade Federal de Lavras. II.
Título.
CDD – 631.41
LETUZIA MARIA DE OLIVEIRA
POTENCIAL DE SAMAMBAIAS PARA FITORREMEDIAÇÃO DE
ARSÊNIO
Tese apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação em Ciência do Solo, área de
concentração em Química do Solo, para
a obtenção do título de Doutor.
APROVADA em 28 de fevereiro de 2012.
Dr. Jorge Antônio Gonzaga Santos
UFRB
Dr. Cláudio Roberto Fonseca Sousa Soares
UFSC
Dr. Antônio Chalfun Júnior
UFLA
Dra. Ana Rosa Ribeiro Bastos
UFLA
Dr. Luiz Roberto Guimarães Guilherme
Orientador
LAVRAS-MG
2012
A Deus, criador de uma belíssima e complexa natureza.
Aos meus pais, João Batista e Maria Helena, pelo amor e apoio, que me
permitiram chegar até aqui.
A Luzinaldo, Leonardo, Lavoizier, Batista, Márcio, Luzia, Lêda e Maria, meus
irmãos, pelo apoio, amizade, carinho e compreensão.
DEDICO
A todos os mestres e doutores desta vida que possuem simplicidade, sinceridade,
humildade, respeito e amor ao próximo.
OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
Nada na vida conquistamos sozinhos. Muitas vezes, um simples gesto pode
mudar a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso. Os resultados de um
trabalho de pesquisa são adquiridos pela cooperação e pelo esforço de outros
antes de nós.
Este trabalho não é só meu, portanto, algumas pessoas merecem agradecimentos
especiais.
À Deus, por todas as oportunidades e bênçãos recebidas.
Ao meu orientador, professor Luiz Roberto Guimarães Guilherme, pelo
profissionalismo, oportunidade e orientação.
À professora Lena Ma pelos conhecimentos transmitidos e constante motivação.
Aos professores Cláudio Roberto Fonseca Sousa Soares, Jorge Antônio Gonzaga
Santos e Antônio Chalfun Júnior, pelo profissionalismo, valiosas sugestões e
colaboração.
Às pesquisadoras Ana Rosa Ribeiro Bastos e Teresa, pela disponibilidade em
analisar este material e contribuições.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA), pela oportunidade e estrutura
disponibilizadas,
Ao Departamento de Ciência do Solo, que proporcionou um ambiente para o
desenvolvimento do trabalho. Agradeço, em especial, aos técnicos de laboratório
João Gualberto, Roberto e Carlinhos, que auxiliaram na execução das práticas
deste trabalho e à secretária da pós-graduação, Dirce, pelo profissionalismo,
paciência e amizade.
Gostaria de mencionar a importância da amizade e convívio com pessoas que me
ajudaram durante todo esse tempo, em especial, Alba, Cândido, Daniela, Euzi,
Évio, Evanise, Enio, Fábio Ono, Fabrício, Geila, Guilherme Lopes, Karine,
Regla, Silvio, Veridiana, Vitória, Wesley e a todos que, de alguma forma, me
auxiliaram, Muito obrigado.
Aos excelentes professores do Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo,
pelos ensinamentos e exemplo de dedicação.
Ao pessoal da limpeza, em especial Eliane, Cleusa e Fabiana, pela amizade, bom
humor contagiante, risadas e momentos de descontração.
À FAPEMIG, o órgão financiador da pesquisa, provedor da bolsa de estudos,
respaldando financeiramente minha pesquisa com a aprovação do projeto.
RESUMO GERAL
A contaminação por arsênio (As) tem provocado sérios problemas em
várias regiões do mundo, visto que este elemento apresenta elevada toxicidade
para os seres humanos. Uma das alternativas para restaurar a funcionalidade
e a diversidade dos ecossistemas impactados pela contaminação por As é
a técnica de fitorremediação, na qual se utilizam plantas associadas com
microrganismos para remover os poluentes do ambiente ou reduzir sua
toxicidade. O presente trabalho foi composto por três experimentos. No
primeiro, avaliou-se o potencial fitoextrator de Thelypteris salzmannii e
Dicranopteris flexuosa cultivadas em solução nutritiva contendo concentrações
crescentes de As. No segundo experimento, avaliou-se o efeito do cromato e do
sulfato na absorção e na translocação de As por Pteris vittata. No terceiro
ensaio, selecionaram-se bactérias presentes na rizosfera de Pteris vittata,
crescida em solução nutritiva, avaliando-se a tolerância dos isolados ao arsenato
e ao arsenito, bem como a capacidade de redução do arsenato e oxidação do
arsenito durante o crescimento celular em meio líquido. As concentrações de As
utilizadas afetaram o crescimento das duas espécies vegetais do primeiro
experimento, alterando a atividade das enzimas SOD e APX. A translocação do
As da raiz para a parte aérea foi baixa em ambas as espécies, sendo as plantas
consideradas exclusoras ao elemento. No segundo experimento, a adição de
sulfato aumentou a absorção e a translocação do arsenato em Pteris vittata. No
entanto, a presença de cromato inibiu a translocação de arsenato, retendo o As
nas raízes da planta. Foram isoladas no terceiro experimento as bactérias
resistentes C1- Comamonas testosteroni, C2- Flavimonas orhzihabitans, C3Staphylococcus sp. e C4- Pseudomonas alcaligenes. Os isolados C1, C3 e C4
foram resistentes a elevadas concentrações de arsenato e arsenito, sendo
eficientes em reduzir e oxidar acima de 7,5 mg L-1, AsIII ou AsV, em quatro
horas.
Palavras-chave: Fitotoxidez, Pteris vittata, Arsenato, Arsenito, absorção
GENERAL ABSTRACT
The contamination by arsenic has caused serious problems in several
regions of the world, since this element has high toxicity to humans. An
alternative to restore functionality and diversity of ecosystems impacted by the
contamination is the technique of phytoremediation, in which plants are used in
association with microorganisms to remove pollutants from the environment or
reduce their toxicity. The aim of this study was to evaluate: a) the potential for
As phytoextraction in Thelypteris salzmannii and Dicranopteris flexuosa grown
in nutrient solution containing increasing concentrations of arsenic and to
investigate the activity of antioxidant enzymes to neutralize the effect of the
element; b) the effect of chromate and sulfate in absorption and translocation of
As by Pteris vittata; c) arsenite and arsenate resistance of four microbial isolates
recovered from the rhizophere of Pteris vittata as well as their ability to express
As(III)-oxidizing and As(V)-reducing capabilities under aerobic conditions. The
results of first experiment show that the arsenic accumulation in fronds and roots
increased with an increase in arsenic concentration in the growth medium. In
addition, arsenic accumulation was highest in the roots as compared to it is
detection in the fronds of both species. Moreover, both ferns responded
differently to arsenic exposure in terms of anti-oxidative defense. Higher levels
of superoxide dismutase and ascorbate peroxidase were observed in Thelypteris
salzamannii than in Dicranopteris flexuosa, showing their active involvement in
the arsenic detoxification mechanism. In the second experiment, P. vittata
effectively took up Cr but was ineffective in Cr translocation. Unlike chromate
and arsenate, addition of sulfate increased the uptake and translocation of both
chromate and arsenate. However, the presence of chromate inhibits the
translocation of arsenate, which was retained in the roots of the plant. This work
demonstrated that chromate and arsenate inhibited the uptake of each other,
whereas sulfate enhanced uptake and translocation of both chromate and
arsenate by P. vittata. Four bacteria, C1- Comamonas testosteroni, C2Flavimonas orhzihabitans, C3- Staphylococcus sp. and C4- Pseudomonas
alcaligenes were isolated in the third experiment. The isolates C1, C3 and C4
were resistant to high concentrations of arsenite and arsenate All microbial
isolates displayed resistance up to 1 mM As(III) and 40 mM As(V) as well as an
ability to oxidize As(III) and reduce As(V) in aerobic conditions.
Keywords: Dicranopteris flexuosa, Thelypteris salzamannii, antioxidative
enzymes, arsenic
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ………………………………..………………...
11
1
INTRODUÇÃO GERAL ……………………………….........
11
2
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
3
REFERENCIAL TEÓRICO ………………………………..
Arsênio e a saúde humana .......................................................
Disponibilidade do arsênio no meio ambiente .......................
Comportamento do arsênio no solo e fitodisponibilidade .....
Arsênio nas plantas ..................................................................
Resposta das plantas ao estresse do arsênio............................
Fitorremediação de As por samambaias hiperacumuladoras .
Resposta antioxidativas das plantas ao estresse do arsênio ..
REFERÊNCIAS .......................................................................
CAPÍTULO II- ABSORÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DE
ARSÊNIO EM DUAS ESPÉCIES TROPICAIS DE
PTERIDÓFITAS ......................................................................
INTRODUÇÃO ........................................................................
MATERIAL E MÉTODOS .....................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................
CONCLUSÕES ........................................................................
REFERÊNCIAS .......................................................................
CAPÍTULO III- EFFECTS OF CHROMATE AND
SULFATE ON ARSENIC UPTAKE AND
TRANSLOCATION BY PTERIS VITTATA L. …………….
INTRODUCTION ……………………………………………
MATERIALS AND METHODS …………………………….
RESULTS AND DISCUSSION ……………………………...
CONCLUSIONS ……………………………………………...
ACKNOWLEDGEMENTS ………………………………….
CAPÍTULO IV- ARSENIC RESISTANT BACTERIA
ISOLATED FROM THE RHIZOSPHERE OF ARSENIC
HYPERACCUMULATOR PTERIS VITTATA L ………….
INTRODUCTION ……………………………………………
MATERIALS AND METHODS …………………………….
RESULTS ……………………………………………..………
DISCUSSION …………………………………………………
REFERENCES ………………………………………………
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
10
CAPÍTULO I
1 INTRODUÇÃO GERAL
A alta toxicidade do arsênio (As) para homens, plantas e animais tem
tornado crescente a preocupação com a contaminação do meio ambiente
provocada por este elemento. É neste contexto que a remediação de solos e
corpos d'água contaminados com As tem se tornado de grande interesse, como
ferramenta de proteção da vida humana e do meio ambiente. Existe hoje
necessidade de adequar tecnologias para amenizar esse passivo ambiental dentro
de uma concepção de desenvolvimento sustentável. A fitorremediação, que é
uma técnica emergente, simples, de baixo custo e que gera o mínimo de
perturbação ao solo e na paisagem, quando comparada com técnicas de
tratamento físico e químico, é uma alternativa promissora. A fitorremediação
utiliza plantas (ao necessariamente e os microrganismos associados) para
remover os poluentes do ambiente ou reduzir sua toxidade.
A descoberta de plantas com capacidade de acumular grandes
quantidades de elementos-traço (hiperacumuladoras) resultou em avanços para o
emprego desta técnica na remediação de solos contaminados (BAKER et al.,
1994). Para ser hiperacumuladora de As, a planta deve ter habilidade para
absorver e reter, na parte aérea, no mínimo, 1.000 mg As kg-1 (GONZAGA et
al., 2006; MA et al., 2001). Poucas plantas são capazes de translocar grande
quantidade de As das raízes para a parte aérea (RAHMAN; HASEGAW, 2011).
A primeira espécie vegetal descrita como hiperacumuladora de As, a samambaia
Pteris vittata L. (MA et al., 2001), tem grande potencial fitoextrator
(GONZAGA et al., 2006), acumulando alta quantidade de As na parte área e boa
produção de biomassa. Algumas outras samambaias foram descritas como
hiperacumuladoras de As, como Pteris biaurita, P. cretica e P. logifolia
(SRISVASTAVA et al., 2006). Entretanto, a maioria das espécies estudadas é de
11
clima temperado, sendo escassas e necessárias as informações a respeito desta
característica para espécies tropicais. Estudos que identifiquem espécies
tolerantes e ou hiperacumuladoras de As, que se adaptem às áreas contaminadas
encontradas em regiões tropicais; o entendimento dos mecanismos fisiológicos
relacionados com a acumulação de As e as interações do As com outros
elementos são de grande importância para o aperfeiçoamento da técnica de
fitorremediação.
2 RENFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Arsênio e a saúde humana
A cada dois anos, a Agência para Substâncias Tóxicas do Departamento
de Saúde dos Estados Unidos (AGENCY FOR TOXIC SUBSTANCES AND
DISEASE REGISTRY - ATSDR, 2012) classifica as substâncias mais perigosas
para a saúde humana. Desde 1997, o arsênio (As) é o primeiro da lista. De
ocorrência natural, normalmente ocorre em baixas concentrações nos solos e
rochas, não representando, em condições naturais, risco para os seres humanos.
Concentrações elevadas de As no solo e na água são normalmente
resultante de fontes antropogênicas (GONZAGA et al., 2006). Concentrações
aceitáveis de As em águas potáveis situam-se entre 10 e 50 µg de As L-1
(UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY - USEPA,
2002). No entanto, valores cerca de dez vezes superiores a estes têm sido
reportados em águas de superfície no entorno de áreas de mineração no Brasil
(MATSCHULLAT, 2000) e em diversos estudos realizados em países do sul da
Ásia (SMITH et al., 2000), principalmente Índia e Bangladesh, os quais
apresentam os problemas mais sérios de contaminação de As, em âmbito
mundial, com milhares de pessoas intoxicadas, apresentando hiperqueratoses e
desenvolvimento de cânceres.
12
Assim como no caso da água, a contaminação do solo por As representa
também um risco ecológico e ou para a saúde humana, podendo ainda
comprometer a produtividade agrícola e a sustentabilidade do ecossistema.
2.2 Disponibilidade do arsênio no meio ambiente
2.2.1 Comportamento do arsênio no solo e fitodisponibilidade
O As é um metaloide de ocorrência natural, componente de mais de 245
minerais (MANDAL; SUZUKI, 2002). Elemento calcofílico, tem grande
afinidade por sulfetos (ALLOWAY, 1990) e, nesses, aparece juntamente com
cobre, níquel, chumbo, cobalto e outros elementos-traço (MANDAL; SUZUKI,
2002). A concentração média na crosta terrestre é de 2 mg de As kg -1 (WORLD
HEALTH ORGANIZATION - WHO, 2003).
O As está presente em rochas magmáticas em concentrações que variam
de 0,5-2,6 mg kg-1 e em sedimentares de 1,0-13 mg kg-1 (KABATA-PENDIAS;
PENDIAS, 2001). O intemperismo das rochas converte o sulfeto de As em
trióxido de As, o qual entra no ciclo geoquímico na forma de pó ou pela
dissolução em águas pluviais, fluviais ou de subsuperfície (MANDAL;
SUZUKI, 2002).
O As no solo pode ser originário de fontes naturais, como intemperismo
de rochas, atividade vulcânica, aerossóis de água do mar e volatilização
microbiana (NRIAGU; PACYNA, 1988); de fontes antropogênicas, como
pesticidas, herbicidas, fertilizantes e de fundição do ouro, chumbo, cobre e
níquel, além da produção de ferro e aço e da combustão de carvão (BAIRD,
2002; SMITH et al., 1998), sendo liberado no ambiente durante a exploração
mineradora e a irrigação com água contaminada (ROYCHOWDHURY et al.,
2002).
13
O As tende a concentrar-se nos horizontes superficiais, devido à
deposição atmosférica e à reciclagem da vegetação (ALLOWAY, 1990), bem
como à presença de óxidos e da matéria orgânica. A concentração de As em
solos ditos não contaminados pode variar entre 1 a 20 mg kg-1 (COMPANHIA
ESTADUAL DE TECNOLOGIA E SANEAMENTO BASICO DO ESTADO
DE SAO PAULO - CETESB, 2005; FITZ; WENZEL, 2002), mas, em solos
agrícolas contaminados, esse valor pode chegar a 600 mg kg-1 (KABATAPENDIAS; PENDIAS, 2001).
No Brasil, tem sido relatada a ocorrência de contaminação de As em
águas (até 0,36 mg L -1), solos (até 860 mg kg-1) e sedimentos (até 3.200 mg kg-1)
nas proximidades de áreas industriais ou de mineração (CANTONI, 2010;
MAGALHÃES
et
al.,
2001;
MAGALHÃES;
PFEIFFER,
1995;
MATSCHULLAT et al., 2000). Os primeiros registros de análise da
concentração de As em solos brasileiros foram efetuados por Curi e Franzmeier
(1987). Esses autores encontraram teores de As em Latossolo Roxo variando de
6 a 10 mg kg-1, enquanto, para Latossolo Ferrífero, o teor foi de 36 mg kg-1. Em
outro estudo (MARQUES, 2000), por meio do uso de uma microssonda de raios
X, uma técnica semiquantitativa, foram detectados teores de até 38 mg As kg-1
em Latossolos sob vegetação de Cerrado.
O comportamento biogeoquímico e a toxicidade de As no solo e na água
são dependentes das espécies prevalecentes de As, os quais são influenciados
pelo pH e o potencial redox do ambiente (Figura 1). Em condições óxicas, o As
é encontrado na forma arsenato As (V), enquanto o arsenito As (III) é
encontrado em condições anóxicas e consiste na forma reduzida (HAYES;
TRAINA, 1998; MCBRIDE, 1994; SMITH et al., 1998). O controle da
solubilidade do As na solução do solo em condições aeróbias é feita pelas
formas Ca3(AsO4)2, Mg3(AsO4)2 e As2O5; já em condições anaeróbias, esse
controle é feito pelas formas As, As2S3 e As2O3 (HAYES; TRAINA, 1998).
14
O comportamento do arsenato no solo assemelha-se ao do fosfato e do
vanadato (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2011). O arsenato é adsorvido por
óxidos de ferro e alumínio, aluminossilicatos não cristalinos e, em menor
extensão, em argilossilicatos. O arsenato é o ânion do ácido H 3AsO4, que tem
valores de pKa de 2,24, 6,94 e 11,5, sendo adsorvido efetivamente em pH entre
4 e 7 (MCBRIDE, 1994). Os ânions AsO2-, AsO4-3, HAsO4-2 e H2AsO3- são
formas móveis de As, sendo sorvidos em pH entre 7 e 10 (KABATA-PENDIAS;
PENDIAS, 2011).
Figura 1 Diagrama Eh/pH para as várias formas de arsênio (SMEDLEY;
KINNIBURG, 2002).
15
A concentração total de As no solo não necessariamente determina sua
disponibilidade para as plantas (ADRIANO, 2001), pois, à semelhança do
fósforo, o As é altamente adsorvido a óxidos e hidróxidos de ferro, alumínio e
manganês, bem como à matéria orgânica. Vários parâmetros do solo afetam a
biodisponibilidade de As, como as características físicas, químicas e biológicas,
porém, a textura do solo, associada à fonte de As (se inorgânica ou orgânica), é a
principal (SHEPPARD, 1992).
No Brasil, ainda são poucos os relatos de contaminação de solo e corpos
d’água por As, no entanto, isso pode estar ligado à ausência de um programa de
levantamento das possíveis áreas contaminadas no território nacional. A
contaminação antropogênica está principalmente associada à mineração de ouro,
ferro, cobre e zinco. Considerando a produção histórica desses minerais no
Brasil, existe grande probabilidade de muitas áreas no território nacional terem
sido contaminadas, colocando em risco a saúde de muitas comunidades e a
qualidade ambiental.
2.2.2 Arsênio nas plantas
As plantas comportam-se de forma diferenciada sob condições de
estresse, como na presença de metais e metaloides, como o As, não essenciais às
plantas, e que possuem altíssima toxicidade. Plantas altamente sensíveis, como
as leguminosas, em contato com o As, apresentam vários sintomas de fitotoxidez
(DIAS et al., 2010; KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001), podendo chegar à
morte, enquanto outras espécies vegetais dispõem de mecanismos que lhes
permitem se adaptar a diferentes condições do meio (HARTLEY; LEPP, 2008),
a exemplo das samambaias Pteris vittata e Pitirograma calomelanos, entre
outras que são hiperacumuladoras de As. A maioria das plantas tolera
concentrações de As no solo na faixa de 1 a 50 mg kg-1 (KABATA-PENDIAS;
16
PENDIAS, 2001; MASCHER et al., 2002), enquanto hiperacumuladoras
crescem em solo com até 1.000 mg As kg-1 (TU; MA, 2003).
A capacidade das plantas em absorver o As varia em função da
concentração, da disponibilidade e da especiação desse elemento no solo
(BURLÓ et al., 1999), bem como da presença de outros elementos, como o
fosfato (Figura 2). Na solução do solo, o As é absorvido pelas raízes das plantas
por fluxo de massa (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001), sendo pouco
translocado para a parte aérea, após a absorção pelas raízes (MARIN et al.,
1993).
Espécie de Planta
Biomassa
Concentração do Contaminante
Disponibilidade do Contaminante
Fitorremediação
Absorção
Características do solo
Processos na Rizosfera
Disponibilidade de Nutrientes
Figura 2 Fatores que influenciam a absorção de As pelas plantas. Adaptado de
GONZAGA (2006).
Espécies hiperacumuladoras e tolerantes absorvem preferencialmente As
na forma dominante em solos aeróbicos, arsenato (FRANSCESCONI et al.,
2002; TU et al., 2004). Devido à sua similaridade com o fosfato, supõe-se que o
arsenato compete pelo mesmo sistema de transporte do fosfato no plasmalema
das raízes (MEHARG; MACNAIR, 1992). A absorção do arsenito ocorre
passivamente via aquagliceroporinas, ou canais que permitem o movimento de
água e solutos neutros, nas raízes. No entanto, o fósforo não compete com a
17
absorção do arsenito, logo, o arsenito não compartilha o mesmo sistema de
transportadores de fosfato (WANG et al., 2002).
A fitotoxicidade do As ocorre devido a atuação do elemento na inibição
do metabolismo das plantas (DIAS et al., 2010; MEHARG; MACNAIR, 1992).
Mais especificamente, o arsenato pode prejudicar a fosforilação oxidativa e a
produção de ATP (GONZAGA et al., 2006; MEHARG; MACNAIR, 1992), bem
como competir com o fósforo em várias reações (ZHANG et al., 2002). Sob
altas concentrações de As disponível no solo, a maioria das plantas apresenta
sintomas de fitotoxicidade, que são: murchamento e necrose das folhas,
crescimento lento das raízes e parte aérea e cor arroxeada, podendo chegar à
morte (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001).
O As tende a se concentrar mais nas raízes das plantas e nas folhas mais
velhas (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001), encontrando-se em menores
concentrações nas folhas mais novas e caules e em concentrações ainda mais
baixas nas sementes e frutos (HARTLEY; LEPP, 2008). A toxicidade provocada
por As tem sido identificada em várias espécies de plantas, incluindo Eucalyptus
grandis, Ricinus communis e Brachiaria decumbens (ARAUJO et al., 2011;
MELO, E. et al., 2009; MELO, R. et al., 2009).
As espécies vegetais que apresentam tolerância ao As, mesmo quando
expostas a altas concentrações, possuem mecanismos que reduzem a sua
absorção (SHAW, 1989). A diminuição da absorção do elemento pode ser
devido às modificações nos mecanismos de transporte de fósforo/arsênio, visto
que o metaloide entra nas plantas pelo mesmo sistema de transporte do fósforo
(MEHARG; MACNAIR, 1992). Em plantas tolerantes e hiperacumuladoras,
quando as necessidades da planta ao fósforo são satisfatórias, o funcionamento
deste mecanismo é reduzido, impedindo a assimilação de As (BURLÓ et al.,
1999). Uma vez absorvido, existem espécies vegetais capazes de metabolizá-lo a
formas menos tóxicas, promovendo o seu sequestro pela planta. sem apresentar
18
sintomas de fitotoxicidade (MEHARG; HARTLEY-WHITAKER, 2002), como
ocorre, por exemplo, com as hiperacumuladoras de As (TRIPATHI et al., 2007).
Os mecanismos de destoxificação usados por espécies de samambaia
hiperacumuladoras
de
As
incluem
quelação,
compartimentalização,
biotransformação e reparo celular (SALT et al., 1998). Há evidências de que a
maior facilidade de redução do arsenato para arsenito dentro da planta seja uma
estratégia das hiperacumuladoras para acumular grande quantidade de As sem
desenvolver sintomas de toxidez (TRIPATHI et al., 2007; TU et al., 2004;
ZHANG et al., 2002). Embora o arsenito seja mais tóxico do que o arsenato,
uma vez ocorrida a redução, o arsenito torna-se menos tóxico, devido à
complexação por complexos arsenito-tiol (-SH) e ou fitoquelatina-As
(MEHARG, 2003), e posterior sequestro vacuolar (PICKERING et al., 2000).
Em experimento de especiação de As, conduzido por Tu et al. (2004), na
biomassa da P. vittata L., 90% do As nas raízes estavam na forma de arsenato,
enquanto nas folhas predominou o arsenito (94%) e nenhum composto orgânico
contendo As foi detectado. Francesconi et al. (2002) encontraram que 95% do
As na raiz da P. calomelanos estava na forma de arsenato, enquanto na parte
aérea, de 60% a 72% do As estava na forma de arsenito, o que se assemelha ao
relatado para P. vittata, por Tu et al. (2004).
2.3 Resposta das plantas ao estresse do As
2.3. 1 Fitorremediação de As por samambaias hiperacumuladoras
O uso de plantas e da microbiota associada para remover, imobilizar ou
tornar os contaminantes inofensivos ao ecossistema é conhecido como
fitorremediação. Essa técnica tem sido reconhecida como emergente para
descontaminação ambiental (LINDBLOM et al., 2006; SUN et al., 2011), devido
19
ao seu baixo custo e por causar menos mobilização do solo, quando comparada
com outras técnicas (HENRY, 2000).
A fitorremediação prevê vários mecanismos de despoluição, sendo que
para áreas contaminadas com As destacam-se a fitoestabilização e a fitoextração.
A fitoestabilização é o ramo da fitorremediação em que as plantas são utilizadas
para diminuir a mobilidade e a disponibilidade do contaminante no solo. Esse
mecanismo é aplicado em situações em que o solo possui elevada contaminação
e apenas plantas tolerantes são capazes de se estabelecer. As espécies tolerantes,
geralmente, possuem raízes com grande biomassa, capazes de adsorver,
precipitar e acumular os elementos-traço na raiz sem translocá-los para a parte
aérea. Apesar de os contaminantes não serem removidos do local, a
fitoestabilização permite a redução do risco de erosão e a lixiviação dos
poluentes, evitando a contaminação dos lençóis freáticos, além de reduzir o risco
da entrada do As na cadeia alimentar, evitando, assim, possíveis contaminações
ao homem e ao meio ambiente (ZHAO et al., 2009).
A fitoextração consiste na absorção e na acumulação do elemento-traço
na parte aérea das plantas (SANTOS et al., 2010). A planta ideal para a
fitoextração de arsênio deve ser tolerante a elevadas concentrações na parte
aérea planta, ter alta taxa de crescimento, boa produção de biomassa e ter
sistema radicular abundante (GARBISU; ALKORTA, 2001). A obtenção de
plantas com capacidade de hiperacumulação de metais e metaloides é,
provavelmente, o maior desafio a ser vencido dentro da técnica de
fitorremediação (ZHAO et al., 2009). A hiperacumulação de metais e metaloides
é um fenômeno raro em plantas terrestres superiores. Até o ano de 2011, foram
identificadas 450 plantas hiperacumuladoras (RASCIO; NAVARI-IZZO, 2011).
Para ser considerada hiperacumuladora de As, a planta deve ter
habilidade para absorver e reter na parte aérea (caule e folhas), no mínimo, 1.000
mg As kg-1 (GONZAGA et al., 2006; MA et al., 2001). É desejável, ainda, que
20
tais plantas possuam alta taxa de acumulação, mesmo em baixas concentrações
do contaminante, acumulem diversos contaminantes concomitantemente,
apresentem alta taxa de crescimento e produção de biomassa, resistência a
pragas e doenças e tolerância ao contaminante (ACCIOLY; SIQUEIRA, 2000;
SUNDARAM et al., 2008). Outros fatores também são utilizados para
caracterizar a hiperacumulação de As por plantas, como o fator de translocação
(FT) e o fator de bioacumulação (FB). O FT demonstra a eficiência da planta em
transportar um elemento da raiz para a parte aérea. Já o FB avalia a eficiência da
planta em acumular o elemento, levando em consideração a concentração deste
no meio. Quanto maior o FB, maior será a transferência do elemento do solo ou
da solução nutritiva para a planta e, consequentemente, maior será também a
capacidade do vegetal em retirar o As do meio. Ambos os fatores, quando
superiores a 1, confirmam a característica de hiperacumulação da planta (MA et
al., 2001).
Poucas plantas têm a habilidade de translocar grande quantidade de As
das raízes para a parte aérea (RAHMAN; HASEGAW, 2011). A primeira planta
descrita como hiperacumuladora de As, a samambaia Pteris vittata L. (MA et
al., 2001), tem grande potencial como fitoextratora (GONZAGA et al., 2006),
acumulando alta quantidade de As na parte área e boa produção de biomassa. Tu
e Ma (2003) relataram concentração na biomassa de 2,3%, quando a Pteris
vittata L. foi cultivada em solo com 500 mg de As kg-1. Zhao et al. (2002)
identificaram outras samambaias da ordem Pteridales com características
semelhantes quanto à absorção de As, como Pteris cretica, Pteris longifolia e
Pteris umbrosa. Srivastava et al. (2006) observaram que uma nova espécie de
samambaia, Pteris biaurita L., acumulou uma quantidade de As semelhante
àquela de P. vittata, quando as duas espécies foram cultivadas em 50 μg As L-1.
Wang et al. (2007) encontraram outra samambaia, Pteris fauriei, que acumulou
mais de 1.000 mg As kg-1 na parte aérea. Xie et al. (2009) listaram várias
21
espécies de plantas que hiperacumulam As. A maioria das espécies estudadas é
de clima temperado, sendo escassas e necessárias as informações a respeito de
estudos relacionados à tolerância de espécies de clima tropical.
2.3.2 Resposta antioxidativas das plantas ao estresse do arsênio
As plantas possuem dois sistemas antioxidantes de defesa e proteção
(ODJEGBA; FASIDI, 2007), sendo um enzimático e outro não enzimático.
Esses mecanismos permitem, de maneira eficiente, o controle das espécies
reativas de oxigênio (EROs), evitando a produção e a degradação dessas
moléculas (LYUBENOVA et al., 2009; NOUAIRI et al., 2009; SCHICKLER;
CASPI, 1999), como o radical superóxido (O-2), o peróxido de hidrogênio,
(H2O2) e o radical hidroxila (OH), que são produzidos continuamente pelo
metabolismo vegetal (FOYER; NOCTOR, 2005) por diferentes tipos de
estímulos, e.g., devido à presença de elementos tóxicos (MOLLER, 2007).
Os antioxidantes não enzimáticos incluem, entre outros, ascorbato,
glutationa (GSH), flavonoide, alcaloides, compostos fenólicos, aminoácidos não
proteicos, tocoferois e carotenoides. A glutationa, um tripeptídeo hidrofílico,
além de participar do ciclo ascorbato-glutationa, é capaz consumir, quando
reduzida, alguns EROs (HIDEG, 1996), bem como participar da síntese de
fitoquelatinas (PC). As PCs constituem três aminoácidos cisteínas, glicina e
glutamato arranjados, geralmente, na mesma conformação, que podem ser
rapidamente sintetizadas em respostas a níveis tóxicos de metais pesados
(SCHMOGER et al., 2000).
Além do sistema de defesa não enzimático, o sistema enzimático é de
fundamental importância para as células, o qual é composto por enzimas
antioxidantes que atuam em sincronia, como superóxido dismutase (SOD),
22
catalase (CAT), glutationa redutase (GR), peroxidase (POD), ascorbato
peroxidase (APX) e glutationa peroxidase (GPX) (RADIC et al., 2010).
Dentro da célula, a superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) é a
primeira linha de defesa contra as EROs (VALKO et al., 2006), sendo
responsável pela redução de O2 nas plantas pela conversão do O2- em H2O2
(Equação 1). O peróxido de hidrogênio produzido é facilmente difundido, mas
tóxico para as células, sendo então degradado por CAT, GPX e APX
(LYUBENOVA et al., 2009).
2O2- + 2 H+
O2 + H2O2
Equação 1
Três tipos de isoformas da SOD são encontrados nas plantas, os quais se
distinguem pelos diferentes cofatores (Mn, Fe e Cu/Zn). O Mn atua em
mitocôndrias e peroxissomos, Fe em cloroplastos e Cu/Zn no citosol,
peroxissomos e cloroplastos. A resposta da SOD a elementos-traço varia com a
espécie, o tecido, o tipo de metal, a concentração e o tempo de exposição
(GRATÃO et al., 2005; LYUBENOVA et al., 2009).
A enzima catalase (CAT, EC 1.11.1.6) é uma enzima importante no
processo de fotorrespiração, pois promove a conversão do H2O2 em água e
oxigênio molecular (Equação 2) e está localizada, principalmente, nos
peroxissomos (MITTLER, 2002), sendo produzida por plantas sob condições de
estresse oxidativo na presença de metais pesados e metaloides (GRATÃO et al.,
2005). A CAT, assim como a SOD, também é eficiente no sistema antioxidante,
pois suas ações combinadas reduzem a ação tóxica e altamente reativa dos
radicais hidroxil (OH-) (SCANDALIOS, 1993).
O2 + H2O2
H2O + 1/2O2
Equação 2
As enzimas peroxidases (POX, EC 1.11.1.7) degradam o H2O2 em água
e em um composto oxidado, que depende do tipo de peroxidase atuante. São
23
encontradas no citossol, nos vacúolos, nos cloroplastos, na parede celular, no
apoplasto, nas mitocôndrias e nos peroxissomos (MITTLER, 2002). A POX
predominante é a ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.11), que catalisa a
oxidação do ascorbato em peróxido de hidrogênio, gerando o desidroascorbato.
A APX está presente no citosol, nas mitocôndrias, nos peroxissomos, no
apoplasto e nos cloroplastos (MITTLER, 2002). A APX participa, juntamente
com a glutationa redutase, do ciclo ascorbato-glutationa.
Sob
altas
concentrações
de
elementos-traço
as
espécies
hiperacumuladoras mantêm seu sistema antioxidante ativo, o que as protege de
possíveis danos causados por elementos que podem estar disponíveis em suas
formas iônicas (ZHOU et al., 2010). O aumento das doses de elementos-traço na
planta promove o aumento da atividade de pelo menos uma enzima antioxidante,
o que não ocorre em espécies não hiperacumuladoras (WOJCIK et al., 2006).
Apesar de muitos estudos sobre a tolerância de plantas ao As, ainda não
existem informações suficientes para entender os mecanismos de absorção e
transporte deste elemento nas plantas, bem como a interação do As com outros
metais.
Diante desse conhecimento, destaca-se a importância de estudos para a
identificação de espécies hiperacumuladoras de As, assim como seus
mecanismos fisiológicos relacionados à acumulação deste elemento nas plantas.
24
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32
CAPÍTULO II- ABSORÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DE ARSÊNIO EM DUAS
ESPÉCIES TROPICAIS DE PTERIDÓFITAS
33
RESUMO
A fitoextração é uma técnica remediadora importante para áreas contaminadas
por arsênio (As). Estudos da tolerância de espécies vegetais tropicais cultivadas
em níveis crescentes de contaminação, relacionados com a sua fisiologia,
apresentam grande relevância para o emprego da fitoextração em áreas
contaminadas. Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar o potencial
fitoextrator de As das espécies Thelypteris salzmannii (Fée) C. V. Morton e
Dicranopteris flexuosa (Schrader) e investigar a atividade de enzimas
antioxidantes para neutralização do efeito do As nessas espécies. As plantas
foram cultivadas em solução nutritiva, em casa de vegetação. Testaram-se as
concentrações 0, 10, 25, 40 e 50 mg As L-1. Os experimentos foram instalados
em delineamento inteiramente casualizados, com quatro repetições. Os
resultados mostraram que o aumento das concentrações na solução nutritiva
afetou a produção de matéria seca e a atividade enzimática da SOD e APX, de
maneira distinta entre as espécies. O aumento das concentrações de As testadas
proporcionou um maior teor de As nas raízes. A proporção da concentração de
As da parte aérea pela concentração do elemento em solução foi maior que 1 em
todos os tratamentos. Já o índice de translocação para parte aérea foi, no
máximo, de 77% na espécie Dicranopteris flexuosa.
Palavras-chave: arsênio, fitorremediação, samambaia
34
ABSTRACT
Phytoextraction is an important technique used for decontamination of areas
polluted by arsenic. Consequently, an understanding of the physiological
responses to tolerance of tropical species subjected to increasing levels of
contamination is fundamental before considering their use as phytoextractors in
contaminated areas. The objective of this study was to assess the arsenic (As)
uptake and the tolerance of Thelypteris salzmannii (Fée) C. V. Morton e
Dicranopteris flexuosa (Schrader) and to investigate the activity of antioxidant
enzymes to neutralize the effect of the element. The plants were cultivated in
nutrient solution in a greenhouse under controlled conditions. Arsenic was tested
at concentrations of 0, 10, 25, 40 and 50 mg L-1. The experimental set-up was a
block design, with four replicates. The results showed that increasing As
concentrations in the nutrient solution affected the dry matter production and the
activity of the enzymes superoxide dismutase and ascorbate peroxidase.
Increasing concentrations of As provided greater content of this element in the
roots. The ratio of As shoot concentration over the available concentration was
greater than 1 in all treatments. Nevertheless, the rate of translocation to shoots
was at a maximum of 77% in Dicranopteris flexuosa.
Key words: arsenic, phytoremediation, fern
35
1. INTRODUÇÃO
A poluição do solo tem merecido atenção especial, nos últimos anos, por
apresentar sérios riscos à saúde humana e à qualidade do ambiente. Isso ocorre
devido ao crescente desenvolvimento da agricultura, dos centros urbanos, das
atividades industriais e de mineração, que promovem o aumento na produção de
resíduos, os quais podem vir a constituir fontes de contaminação ambiental,
devido à possível presença de elevadas concentrações de elementos-traço, como
o arsênio (As), que é introduzido no ambiente por meio de processos geológicos
e antropogênicos.
O As encontra-se exposto à superfície do solo sofrendo alterações em
sua forma, podendo ser disseminado pela água e pelo ar, entrando na cadeia
trófica. A acumulação do As por plantas é uma maneira promissora removê-lo,
em ambientes poluídos. Nos últimos anos, o acúmulo e a redistribuição de As
nas plantas têm sido investigados, bem como os mecanismos fisiológicos
relacionados a essa acumulação (KERTULLIS-TARTAR et al., 2009). A
fitorremediação tem sido reconhecida como uma técnica promissora para
descontaminação ambiental (LINDBLOM et al., 2006; SUN et al., 2011), de
baixo custo e que gera o mínimo de perturbação ao solo, quando comparada com
outras técnicas (HENRY, 2000). Consiste no uso de plantas para remover,
imobilizar ou tornar os contaminantes inofensivos ao ecossistema.
A planta adequada para o processo de fitoextração de As deve ser
tolerante a altos níveis deste elemento, acumular grandes quantidades na parte
aérea, em relação às raízes ter alta taxa de crescimento, sistema radicular
abundante e produzir muita biomassa (GARBISU; ALKORTA, 2001).
Infelizmente, a maioria das plantas hiperacumuladoras de elementos-traço tem
baixa produção de biomassa (REEVES; BAKER, 2000).
A descoberta de plantas com capacidade de acumular grandes
quantidades de elementos-traço resultou em avanços no uso de plantas na
36
remediação de solos contaminados (BAKER et al., 2000). Logo, muitos estudos
têm sido conduzidos para identificar plantas capazes de acumular elevadas
concentrações de As em sua biomassa.
Ma et al. (2001) identificaram a primeira planta hiperacumuladora de
As, a samambaia Pteris vittata L., cuja concentração de As na parte aérea
alcançou de 23 a 1000 mg As kg-1. Zhao et al. (2009) identificaram outras
samambaias da ordem Pteridales com características semelhantes quanto à
absorção de As, como Pteris cretica, Pteris longifolia e Pteris umbrosa.
Srivastava et al. (2006) observaram que uma nova espécie de samambaia, Pteris
biaurita L., acumulou quantidade de As semelhante àquela de P. vittata, quando
as duas espécies foram cultivadas em 50 μg As L-1. Wang et al. (2007)
encontraram outra samambaia, Pteris fauriei, que acumulou mais de 1.000 mg
As kg-1 na parte aérea. Depois disso, Xie et al. (2009) listaram várias espécies de
plantas que hiperacumulam As. A maioria das espécies estudadas é de clima
temperado, sendo escassas as informações a respeito desta característica para
espécies tropicais.
Apesar da existência de pesquisas em que tem sido demonstrada a
atuação das enzimas antioxidantes no processo de tolerância vegetal ao As, são
desconhecidas informações destes mecanismos em samambaias tropicais a este
metaloide. Sabe-se que as plantas exibem várias respostas bioquímicas para
proteção contra agentes oxidantes. O As, assim como metais e outros
metaloides, parecem estimular a produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs) que tendem a potencializar os efeitos tóxicos dos poluentes (MASHER
et al., 2002). O sistema antioxidativo em plantas inclui a ação de mecanismos
enzimáticos, como aumento na atividade das enzimas superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX), entre outras.
A capacidade de absorção e acumulação de As dessas novas espécies
vegetais cultivadas sob elevados teores de As ainda é desconhecida, bem como
37
sua produção de biomassa e adequabilidade para uso em projetos de
fitorremediação. Este estudo foi conduzido com o objetivo de determinar o
efeito do arsenato (As +5) no crescimento, na absorção e na translocação do As
por Thelypteris salzmannii e Dicranopteris flexuosa, bem como o efeito do As
sobre as enzimas antioxidantes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado em casa de vegetação, no Departamento de
Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras (UFLA). As espécies de
samambaias utilizadas nesse estudo Thelypteris salzmannii (Fée) C.V. Morton e
Dicranopteris flexuosa (Schrader) foram coletadas no Parque Quedas do Rio
Bonito, nos municípios de Carrancas e Lavras, MG, respectivamente. Estas
espécies foram multiplicadas em casa de vegetação por meio da germinação in
vivo, utilizando-se vasos plásticos contendo um extrato composto por 1/3 da
capacidade total, em sua porção inferior, de pedras de aquário, 1/3 de areia
grossa lavada e 1/3 de substrato (pó de xaxim). Após a germinação, as
samambaias foram transferidas para vasos plásticos contendo substrato
Plantmax. Nestes, as plantas permaneceram até o momento de serem utilizadas
em experimentos para avaliar o potencial fitorremediador.
As plantas com peso semelhantes (5 g) foram utilizadas para o
transplantio em sistema hidropônico. Os experimentos para fitoextração de As
por Thelypteris salzmannii (Fée) C.V. Morton e Dicranopteris flexuosa
(Schrader) foram realizados em diferentes períodos.
As plântulas permaneceram, por duas semanas, em solução de Hoagland
e Arnon (1950) 20% da forca iônica para adaptação sob aeração constante. As
soluções foram trocadas semanalmente, mantendo-se o pH da solução em 5,5,
com adição de NaOH ou HCl 0,1 mol L -1, quando necessário e renovando-se as
concentrações de As.
38
Cinco tratamentos constituídos de concentrações crescentes de As, 0, 10,
25, 40 e 50 mg L-1 foram dispostos em delineamento inteiramente casualizado
com quatro repetições, totalizando 20 parcelas para cada espécie vegetal. O As
foi fornecido como Na2HAsO4.7H2O.
As plantas foram coletadas 15 dias após a exposição às doses de As e a
parte aérea e as raízes foram separadas. As raízes foram lavadas
abundantemente, em água de torneira, depois imersas em solução 0,1 mol L -1 de
HCl e, por fim, lavadas em água destilada para a remoção do As aderido
superficialmente às raízes (TU et al., 2004). As raízes e a parte aérea foram
secas em estufa com circulação forçada de ar, a 70°C, até peso constante. Após o
registro das massas da matéria seca da parte aérea (MSPA) e da raiz (MSR), o
material vegetal foi triturado em moinho tipo Wiley.
O material vegetal foi digerido pelo protocolo do método 3051 A
USEPA (2002), utilizando-se 0,5 g de material vegetal em 10 mL de HNO 3
concentrado em forno de micro-ondas com tubos de Teflon® PTFE, à pressão de
0,76 MPa por dez minutos, à temperatura de, aproximadamente, 175°C e à
pressão de 0,76 MPa. Após a digestão, o material digerido foi filtrado e seu
volume completado para 20 mL, com água destilada. Para fins de controle da
precisão e exatidão das análises, para cada grupo de 10 amostras analisadas,
havia uma amostra de material de referência do NIST (SRM 1547 - Peach
Leaves) com teor de As conhecido e uma amostra em branco. O teor de As foi,
então, determinado por espectrofotometria de absorção atômica com forno de
grafite, em equipamento Perkin Elmer AAnalyst 800. A recuperação média
obtida para As no material de referência foi de 89%.
O fator de translocação (FT) e o fator de bioacumulação (FB) foram
estimados da seguinte maneira (MA et al., 2001; SRIVASTAVA et al., 2005):
39
FT 
concentração do elemento na parte aérea
concentração do elemento na raiz
FB 
concentração do elemento na planta
concentração do elemento na solução
Para verificar os efeitos da absorção do As nos mecanismos bioquímicos
das plantas, foram analisadas enzimas do estresse oxidativo vegetal, sendo
catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e ascorbato peroxidase (APX).
A CAT foi determinada segundo método de Havir e McHale (1987), em
que uma alíquota do extrato enzimático foi adicionada ao meio de reação
contendo fosfato de potássio 200 mmol L -1 (pH 7,0) e peróxido de hidrogênio
12,5 mmol L-1, incubado a 28°C. A atividade desta enzima foi determinada pelo
decréscimo na absorbância a 240 nm, a cada 15 segundos, por 3 minutos,
monitorado pelo consumo de peróxido de hidrogênio.
A atividade da SOD foi determinada pela capacidade da enzima em
inibir a fotorredução do azul de nitrotetrazólio (NBT) (GIANNOPOLITIS;
RIES, 1977). O meio de reação adicionado ao extrato enzimático foi composto
por: tampão fosfato de potássio 50 mmol L-1 (pH 7,8) metionina 14 mmol L -1,
EDTA 0,1 μmol L-1, NBT 75 μmol L -1 e riboflavina 2 μmol L -1. Os tubos
contendo o meio de incubação mais a amostra foram iluminados com lâmpada
fluorescente de 20 W, por 10 minutos. Foi utilizado o mesmo meio de reação
sem a amostra como controle. As leituras foram realizadas a 560 nm e o cálculo
da enzima foi feito com a seguinte equação: % de inibição = (A560 amostra com
extrato enzimático – A560 controle sem enzima)/(A560 controle sem enzima) x
100. Uma unidade da SOD foi definida pela quantidade de enzima necessária
para inibir em 50% a fotorredução do NBT nas condições do ensaio.
A atividade da APX foi realizada pela adição de 0,1 mL do extrato
enzimático bruto a 2,9 mL de um meio de reação constituído de tampão fosfato
40
de potássio 50 mmol L-1, pH 6,0, ácido ascórbico 0,8 mmol L-1 e H2O2 1 mmol-1.
O decréscimo na absorbância, no primeiro minuto de reação, foi medido a 290
nm, a 25°C. A atividade enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de
extinção molar de 2,8 mmol-1 L cm-1 e expressa em µmol de ácido ascórbico
min-1 g-1 MF.
Os resultados foram submetidos à análise de variância, por meio do uso
do programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 2003). As equações de regressão
foram determinadas pelo melhor ajuste, por meio do programa SigmaPlot
(version 12.0).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3. 1 Efeito do arsenato no crescimento e na atividade enzimática das plantas
Durante o experimento, as plantas apresentaram lesões e necroses
marginais a partir da primeira semana de exposição a 50 mg As L–1 (Figura 1).
As plantas toleraram o estresse causado pelo As durante todo o período
experimental, pois não foi observada a morte das plantas.
41
A
B
Figura 1 Crescimento da parte aérea da Thelypteris salzmannii (A) e
Dicranopteris flexuosa (B), na concentração de 50 mg As L -1. Foto
obtida no 10° dia após a exposição ao As
A adição de As influenciou a produção de matéria seca da raiz (MSR) e
da parte aérea (MSPA), em ambas as espécies vegetais (Figura 2A e 2B). A
42
MSPA da D. flexuosa do tratamento controle (3g vaso-1) reduziu cerca de 50%,
comparada com a do tratamento 50 mg As L-1 (1,6 g vaso-1). Nenhuma variação
significante da MSPA foi observada além da dose de 50 mg As L-1 (Figura 2A).
Em contraste, a MSR reduziu linearmente do controle (1,4 g vaso-1) para a dose
40 mg As L-1 (0,6 g vaso-1) (Figura 2A). As plantas de D. flexuosa apresentaram
redução de 62% e 57%, para MSPA e MSR, respectivamente (Figura 2A), em
relação às plantas-controle, na maior dose de As. A redução do sistema radicular
da D. flexuosa, devido à presença de doses crescentes de As, limitou a absorção
de água e nutrientes com reflexo no crescimento da MSPA, um dos principais
componentes na seleção de plantas para a fitorremediação de As.
A MSPA T. salzmannii variou de 2,7 (controle) para 2,3 (10 mg As L-1),
para 1,8 g vaso (nos tratamentos 25, 40 e 50 mg As L -1), redução de 15% e 33%,
respectivamente, quando comparada com a do controle. Essa redução mais
gradual observada para a MSPA de T. salzmannii pode, em grande parte, ser
explicada pela redução gradual da MSR (Figura 2B). A MSR variou de 0,9
(controle) para 0,7 (10 mg As L-1), para 0,6 g vaso (nos tratamentos 25, 40 e 50
mg As L-1). O menor efeito do As no sistema radicular de T. salzmannii resultou
em redução mais gradual de MSPA e MSR da planta. T. salzmannii apresentou
redução na MSPA em 55% e na MSR, em 22% (Figura 2B).
O resultado deste estudo indica que as duas espécies estudadas
reduziram a produção de biomassa com o aumento da dose de As na solução de
crescimento. Resultados semelhantes foram encontrados por outros autores,
demonstrando que o aumento na concentração de As no meio de crescimento
pode diminuir o crescimento e o desenvolvimento da planta (LIU et al., 2007).
43
3.5
Y= MSR 1,4162 - 0,0344x + 0,0004x2 R2= 0,97
Y= MSPA 2,7704 + 0,1019x + 0,0016x2 R2= 0,93
3.0
A
Matéria seca (g)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
10
25
40
50
[As] mg L-1
Concentração de As (mg kg -1 MS)
B
Y= MRA 0,9102 - 0,0168x + 0,0003x2 R2= 0,89
Y= MSPA 2,6119 + 0,0517x - 0,0007x2 R2= 0,99
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
10
25
40
50
[As] (mg L-1)
Figura 2 Produção de matéria seca de raiz (MSR) e da parte aérea (MSPA) de
Dicranopteris flexuosa (A) e de Thelypteris salzmannii (B) cultivadas
em solução nutritiva contendo concentrações crescentes de arsênio
44
3.2 Teor de As nas raízes e parte aérea
A concentração de As na raiz e na parte aérea das duas espécies vegetais
aumentou com o aumento das doses de As em solução (Figuras 3 A-B). Ambas
as espécies apresentaram maior concentração de As nas raízes do que na parte
aérea. Resultados semelhantes foram encontrados com outras espécies vegetais
não acumuladoras, como Brassica juncea (SRIVASTA et al., 2010), Thelypteris
palustris e Boston fern (TU; MA, 2003), aveia e azevém (MELO, E. et al., 2009;
MELO, R. et al., 2009). Esses resultados são opostos àqueles relatados para as
espécies hiperacumuladoras, como a Pteris vittata (MA et al., 2001) e
Pityrogramma calomelanos (FRANCESCONI et al., 2002), as quais apresentam
maior concentração de As na parte aérea. Isso demonstra que as espécies
vegetais utilizadas neste estudo não possuem a estratégia de hiperacumulação
(Figuras 3A e 3B), evidenciando, assim, pouca translocação da raiz para a parte
aérea. Esse comportamento também foi constatado por outras samambaias do
gênero Pteris (TU; MA, 2003). Essa diferença de comportamento entre as
espécies pode ter base genética ou fisiológica, como a possível existência de
fitoquelatinas nas raízes, capazes de complexar e transportar o As para o
vacúolo, evitando, assim, a translocação para a parte aérea (MA et al., 2001).
Em solos não contaminados, teores entre 0,009 e 1,0 mg As kg-1 de
matéria seca são comumente apresentados por plantas (KABATAS-PENDIAS;
PENDIAS,
2001).
Wang
et
al.
(2007)
observaram que a
espécie
hiperacumuladora de As Pteris vittata apresentou concentrações superiores a
2.000 mg As kg-1, quando exposta a 50 mg As kg-1, em solo. Já Pteris ensiforms,
espécie não hiperacumuladora de As, apresentou a concentração de
aproximadamente 100 mg As kg-1 de As na matéria seca, quando exposta à
mesma concentração de As.
45
A espécie Dicranum flexuosa utilizada neste trabalho, apesar de não ser
hiperacumuladora, apresentou teor elevado de As na parte aérea, sendo de
780,76 mg As kg-1, quando exposta a 50 mg As L-1 em solução nutritiva, em
comparação a Pteris ensiforms, que acumulou, na parte aérea, 377 mg As kg-1,
quando exposta à mesma concentração de As em solução nutritiva
(SRIDOKCHA et al., 2005).
Acredita-se que a capacidade que algumas plantas apresentam de
sobreviver em locais contaminados com As esteja relacionada a alguns
mecanismos de tolerância ao metaloide e ou de destoxificação desse elemento,
mecanismos estes que incluem produção de quelatos, compartimentalização,
biotransformação e reparo celular (GONZAGA et al., 2006).
46
1400
A
Y = [As]MSR 83,2182x + 9,6729x + 0,2642x2 R2 = 0,85
Y= [As]MSPA-13,0985 + 14,5636x R2 = 0,95
Concentração de As (mg kg-1)
1200
1000
800
600
400
200
0
0
10
25
40
50
[As] mg L-1
Y = [As]MRA 43,4393 + 19,2630x - 0,2035x2 R2= 0,93
600
B
Concentração de As (mg kg -1 MS)
Y = [As]MSPA 12,9477 + 2,2166x + 0,0627x2 R2= 0,96
500
400
300
200
100
0
0
10
25
40
50
[As] (mg L-1)
Figura 3 Concentração de As na parte aérea e raízes de As em Dicranum flexuosa (A)
e Thelypteris salzmanni (B) cultivadas sob concentrações crescentes de As
em solução nutritiva
47
3. 3 Efeito do arsênio na atividade enzimática das plantas
A exposição das plantas ao As pode perturbar a homeostase celular e
aumentar a produção de diversas espécies ativas de oxigênio, designadas como
espécies reativas de oxigênio (EROS), como o radical superóxido (O -2), o
peróxido de hidrogênio, (H2O2) e o radical hidroxila (OH), que são produzidos
continuamente pelo metabolismo vegetal (FOYER; NOCTOR, 2005). As plantas
têm um sistema de defesa antioxidante enzimático e não-enzimático que permite
a detoxificação das EROs e a proteção das células vegetais de danos oxidativos
(GRATÃO et al., 2005). A exposição das plantas ao As pode prejudicar ou
estimular as enzimas envolvidas nos processos de detoxificação. Baixos níveis
de EROS sugerem respostas adaptativas, enquanto altas concentrações de EROS
causam danos severos, iniciando a morte celular (BENAVIDES et al., 2005).
A destruição eficiente das EROs requer a ação de diversas enzimas
antioxidantes atuando em sincronia, como a superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e o ascorbato peroxidase (APX).
Em experimentos envolvendo tolerância de samambaias a estresse com
As em solução nutritiva, tem-se observado aumento na atividade de enzimas do
sistema antioxidativo, devido ao aumento na produção de EROs (SINGHE et al.,
2006; SRIVASTAVA et al., 2006, 2010). A SOD é uma enzima que faz parte de
um grupo responsável pela eliminação destes radicais livres formados. A SOD é
a primeira linha de defesa contra o estresse oxidativo nas células. Essa enzima
catalisa a formação de peróxido de hidrogênio (H 2O2) a partir do radical
superóxido (O-2) (GRATAO et al., 2005). A elevação dessa atividade indica ter
ocorrido aumento na produção de O2-, após exposição das plantas ao As.
A exposição das plantas ao As aumentou a atividade da SOD. Em
Dicranopteris flexuosa, a atividade da SOD variou de 0,40 U g-1 MF (controle) a
0,80 U g-1 MF (50 mg As L-1). A atividade da SOD aumentou 35%, 65%, 95% e
100%, nos tratamentos 10, 25, 40 e 50 mg As L-1, respectivamente, quando
48
comparado com o controle (Tabela 1). Em T. salzmannii, a atividade da SOD
variou de 0,63 U g-1 MF (controle) a 1,59 U g-1 MF (40 mg As L-1). O aumento na
atividade da SOD na parte aérea foi de 33%, 95%, 152% e 17%, nos tratamentos
10, 25, 40 e 50 mg As L-1, respectivamente, comparado ao controle (Tabela 1).
A maior eficiência da T. salzmannii em eliminar radicais livres explica, em
parte, por que a redução da MSR e MSPA foi mais gradual nessa espécie do que
em Dicranopteris flexuosa. Esses resultados confirmam a importância dessa
enzima como parte do mecanismo de defesa antioxidante, o que confere às
plantas maior tolerância ao As.
De modo semelhante ao observado neste trabalho, o aumento da
atividade da SOD tem sido relatado por diversas espécies vegetais expostas ao
As. Pteris vittata, hiperacumuladora de As. Cultivada com 0, 150 e 300 µmol As
L-1 (0, 11,25 e 22,5 mg As L-1) em solução nutritiva, aumentou a atividade da
SOD, com a elevação da concentração de As no meio (SRIVASTAVA et al.,
2006). Felipe et al. (2009), em estudo com Crotalaria spectabilis, obtiveram o
mesmo comportamento.
A atividade isolada da SOD não é suficiente para a manutenção da
homeostase celular frente à produção de EROS, já que o subproduto de sua ação
é o H2O2, também considerado tóxico as plantas. Portanto, faz-se necessária a
participação conjunta de outras enzimas capazes de degradar o H2O2 (APEL;
HIRT, 2004). A CAT, enzima antioxidante produzida por plantas sob condições
de estresse oxidativo na presença de metais pesados e metaloides, é responsável
pela metabolização do H2O2 em H2O e O2 (GRATÃO et al., 2005).
A concentração da CAT nos tratamentos 10, 25, 40 e 50 mg As L -1 foi
79%, 655%, 302% e 47% maior do que a do controle em D. flexuosa; e 26,0 e
37,4 maior e 7,6% e 54% menor do que o controle em Thelypteris salzmannii,
respectivamente. Como a atividade da CAT é complementar à da SOD,
esperava-se que, nos tratamentos em que houve maior produção de SOD,
49
também houvesse maior concentração de CAT e isso não aconteceu, para as
duas espécies avaliadas.
Na literatura são encontradas espécies que aumentam a atividade dessa
enzima, que a mantêm constante ou que diminuem na presença de elementostraço (GRATÃO et al., 2005). Em espécies hiperacumuladoras e não
hiperacumuladoras de As foram obtidos resultados semelhantes aos aqui
encontrados para o comportamento da CAT na parte aérea. Cao et al. (2004),
trabalhando com Pteris vittata exposta a cinco diferentes concentrações de As,
observaram que a atividade da CAT sofreu aumentos apenas em baixas
concentrações, tendo sua atividade reduzida em concentrações maiores do
metaloide. Assim, fica evidente que a CAT tem sua atividade aumentada em
espécies de samambaias em baixas concentrações de As.
Vários fatores podem afetar a atividade da CAT, como tipo de metal ou
metaloide, sua concentração, o tempo e a época de exposição e a espécie vegetal,
o que, de certa forma, pode fazer com que a atividade da enzima sofra grandes
variações (PATRA et al., 2004). Tais observações ficam evidentes em diversos
trabalhos, como no de Wu et al. (2003), em que houve aumento na atividade da
catalase quando quatro genótipos de cevada foram expostos ao cádmio. No
entanto, Carvalho (2010) não observou variações na atividade da CAT ao expor
Gomphrena elegans em diferentes concentrações de cádmio e zinco.
A destoxificação do H2O2 pelas plantas é realizada de forma mais
eficiente pelo ascorbato (NOCTOR; FOYER, 1998). A enzima ascorbato
peroxidase (APX) utiliza duas moléculas de ascorbato para reduzir o H2O2 a
H2O, gerando duas moleculas de desidroascorbato. Das muitas funções
atribuídas ao ascorbato, relativamente poucas são bem caracterizadas. Porém,
está claro que o ascorbato é o principal antioxidante primário reagindo
diretamente com o OH, H2O2 e O2-, assumindo importante função na
fitoproteção e na regulação da fotossíntese (NOCTOR; FOYER, 1998).
50
A atividade da APX aumentou significativamente com o aumento das
concentrações de As na solução de cultivo (Tabela 1). As espécies de plantas
utilizadas no estudo apresentaram padrão de resposta diferente (Tabela 1). A
atividade da APX nos tratamentos em que o As estava presente foi sempre maior
do que nas plantas controle, para ambas as espécies estudadas. A atividade de
APX na parte aérea de Dicranopteris flexuosa foi de 691,8; 2095,2; 2240; 7;
3.464,3 e 3,964,3(µmol ascorbato g-1 MF min-1), enquanto em Thelypteris
salzmannii, foi de 666,7, 976,2, 1.888,9, 1.982,1 e 2.577,4 (µmol ascorbato g-1
MF min-1), para as doses de 0, 10, 25, 40 e 50 mg As L-1, respectivamente. Essa
diferença de valores pode ser atribuída ao maior grau de estresse das raízes de D.
flexuosa, quando comparado ao de T. salzmanni. Há evidência da existência de
um sinal de estresse oxidativo transportado das raízes para as folhas (VITORIA
et al., 2001). Tal mecanismo de sinalização foi reportado, por Karpinski et al.
(1999), como sendo responsável pelo aumento da transcrição da APX em folhas.
Devido à importância dessa enzima na defesa antioxidante das plantas, o
aumento de sua atividade tem sido apresentado por várias espécies, quando
expostas a diferentes agentes tóxicos. Como observado em Dicranopteris
flexuosa e Thelypteris salzmannii, neste trabalho, Cajanus cajan e Crotalaria
spectabilis submetidas a diferentes doses de As apresentaram incremento na
atividade da APX, em todas as concentrações estudadas (FELIPE et al., 2009).
A atividade dessas enzimas é essencial em espécies hiperacumuladoras e
não hiperacumuladoras. A atuação dessas enzimas depende da espécie estudada,
dos elementos e de suas concentrações, bem como do tempo de exposição
(GRATÃO et al., 2005).
51
Tabela 1 Atividade específica das enzimas superóxido dismutase (SOD),
ascorbato peroxidase (APX) e catalase (CAT) (c) em Dicranopteris
flexuosa e Thelypteris salzmannii sob concentrações crescentes de As
(desvio padrão em parênteses)
Tratamentos
-1
As (mg L )
SOD
-1
(U g MF)
CAT
APX
(µmol H2O2 g-1
MF min-1)
(µmol Ascorbato g-1
MF min-1)
..............................Dicranopteris flexuosa..............................
0
0,40 (0,10)
33,33 (1,71)
691,80 (184,09)
10
0,54 (0,06)
59,90 (3,13)
2095,24 (291,85)
25
0,66 (0,07)
251,66 (4,01)
2240,74 (268,60)
40
0,78 (0,14)
134,00 (5,88)
3464,28 (303,57)
50
0,80 (0,15)
49,00 (7,93)
3964,29 (376,71)
..............................Thelypteris salzmannii..............................
0
0,63 (0,03)
105,98 (4,00)
666,67 (83,62)
10
0,84 (0,04)
134,00 (12,52)
976,19 (33,67)
25
1,23 (0,08)
145,66 (20,88)
1888,89 (172,31)
40
1,59 (0,35)
99.00 (16,03)
1982,14 (272,85)
50
0,74 (0,01)
48,76 (4,32)
2577,38 (244,12)
Os resultados de atividade enzimática permitem a concluir que a
atividade da SOD em T. salzmanntil, na ausência de As (0,63 (U g-1 MF)), é
157% maior do que a apresentada por D. flexuosa (0,40 U g-1 MF). Essa
concentração naturalmente mais alta de antioxidante SOD em T. salzmanntil
garante a essa espécie a capacidade de reduzir de oxigênio livre no tecido
52
vegetal, diminuindo o estresse da planta. A concentração de APX nas duas
espécies aumentou com a dose de As presente na solução. Contudo, a
concentração de APX na espécie mais estressada D. flexuosa foi maior do que na
espécie menos estressada T. salzmanntil.
3.4 Fator de translocação e de bioacumulação
As plantas diferem na sua habilidade em retirar, acumular e tolerar o As,
podendo ocorrer diferenças marcantes entre espécies, variedades de uma mesma
espécie e, também, nos tecidos da planta.
Plantas capazes de absorver e reter o metaloide na parte aérea e que
apresentam concentrações maiores que 1.000 mg As kg-1 são consideradas
hiperacumuladoras de As (GONZAGA et al., 2006; MA et al., 2001).
Para que uma espécie vegetal possa ser identificada como tolerante e ou
hiperacumuladora, além da concentração de As (SRIVASTANA et al., 2006;
WANG et al., 2007; WEI; WANG, 2006), são utilizados outros fatores que
caracterizam melhor este comportamento, como o fator de translocação (FT) e o
fator de bioacumulação (FB). O FT demonstra a eficiência da planta em
transportar um elemento da raiz para a parte aérea. Já o FB avalia a eficiência da
planta em acumular o elemento em relação à concentração do meio
(NASCIMENTO; XING, 2006). Ambos os fatores, quando superiores a 1,
confirmam a característica de hiperacumulação da planta (MA et al., 2001).
Os fatores de translocação e bioacumulação para Thelypteris salzmannii
e Dicranopteris flexuosa são apresentados na Tabela 2.
O FT de Thelypteris salzmannii e Dicranopteris flexuosa não foi
superior a 1 em nenhuma concentração, ou seja, houve certa restrição na
translocação do As para a parte aérea, pois a concentração de As na raiz foi
maior que na parte aérea.
53
Tabela 2 Fatores de translocação e bioacumulação (parte aérea e raiz) para As
em plantas de Thelypteris salzmannii e Dicranopteris flexuosa
expostas a concentrações crescentes de As em solução nutritiva
(desvio padrão em parênteses)
Tratamentos
As (mg L-1)
Fator
Translocação
Bioacumulação
Parte aérea
Raiz
.............................. Dicranopteris flexuosa..............................
10
0,580 (0,13)
19,210 (2,29)
33,120 (6,34)
25
0,450 (0,15)
8,282 (1,36)
21,314 (3,14)
40
0,770 (0,14)
11,156 (3,48)
17,413 (1,23)
50
0,586 (0,21)
15,615 (0,65)
26,614 (5,09)
.............................. Thelypteris salzmannii..............................
10
0,204 (0.01)
6,059 (0,56)
29,748 (0,41)
25
0,310 (0,06)
4,605 (1,06)
14,714 (0,42)
40
0,370 (0,08)
4,271 (1,00)
11.335 (0,8)
50
0,567 (0,06)
5,954 (0,53)
10,932 (0,35)
Srisvastava et al. (2006), em estudo com diferentes hiperacumuladoras
de As, verificaram que, em todas as concentrações estudadas, P. vittata, P.
biruata e P. cretica apresentaram maior concentração na parte aérea que nas
raízes, o que resultou em FT foi maior que 1. A alta concentração de As na parte
aérea indica eficiência em translocar As da raiz para a parte aérea, o que é uma
característica de plantas hiperacumuladoras.
Arsênio e fósforo (P) são análogos quimicamente no solo (SCHMÖGER
et al., 2000; TRIPATHI et al., 2007; TU; MA, 2003), porém, na planta, eles têm
54
comportamento diferenciado (TU; MA, 2003). Wang et al. (2002) observaram
que, com o aumento do suprimento de P, a absorção de As diminui bastante,
sendo esse efeito mais pronunciado na parte aérea. O mesmo aconteceu com o
aumento do suprimento de As, que ocasionou decréscimo na concentração de P
nas raízes, mas não na parte aérea. O efeito da inibição é mais aparente quando
as concentrações de P e As na solução nutritiva são comparáveis.
Os resultados mostram que, para Thelypteris salzmannii e Dicranopteris
flexuosa na maior concentração de As na solução de cultivo (50 mg L -1), o FT
foi de 0,57 e 0,59, respectivamente, ou seja, FT<1. Os resultados deste trabalho
encontram concordância com o de outros estudos, nos quais também de
observou FT abaixo de 0,99. Isso revela a grande capacidade dessas espécies em
reter o As absorvido nas raízes, o que está relacionado à restrita produção de
matéria seca de raízes observada (Figuras 2a e 2b).
As plantas desenvolveram algumas estratégias para sobreviver quando
expostas a altas concentrações de elementos-traços (MEMON et al., 2009). Por
meio da exclusão, por exemplo, a planta pode minimizar a absorção e, mesmo
que apresente alta concentração do elemento nas raízes, pode restringir a sua
translocação para parte aérea. Os vacúolos são os principais sítios de sequestro
de elementos-traço nas células das raízes.
De acordo com Padmavathiamma et al. (2009), a eficiência de plantas
para serem usadas como fitoestabilizadoras é determinada pela retenção do
metal nas raízes e uma menor translocação. Dessa forma, a planta continua
crescendo, produzindo biomassa e dificultando sua dispersão (ERNEST, 2005;
GARDEA-TORRESDEY et al., 2005; WONG, 2003), bem como a entrada na
cadeia trófica (FRANCESCONI et al., 2002; FRENCH et al., 2006).
O FB das raízes foi maior que o da parte aérea, em Thelypteris
salzmannii e Dicranopteris flexuosa. Em ambas as espécies, os fatores de
55
bioacumulação (raízes e parte aérea) foram maiores na menor concentração de
As.
A espécie Dicranopteris flexuosa, na dose de 50 mg As L-1, apresentou
elevada concentração de As na parte aérea (781 mg kg-1), com valores 150 vezes
maiores que as concentrações normalmente encontradas nas plantas. Essa
espécie também demonstrou alta capacidade de bioacumulação de As na parte
aérea. O conjunto dessas características permite a classificação dessa espécie
como tolerante ao As, assim como sua indicação para programas de
fitorremediação de áreas contaminadas com esse elemento.
4. CONCLUSÕES
1. As duas espécies de pteridófitas não apresentaram características de plantas
hiperacumuladoras de As, pois a concentração de As na parte aérea não excedeu
1.000 mg kg-1. Além disso, estas espécies apresentaram baixa eficiência em
translocar o As para a parte aérea.
2. O aumento na concentração de As na solução nutritiva reduziu a produção de
matéria seca de raízes e da parte aérea em Thelypteris salzmannii e
Dicranopteris flexuosa.
3. A adição de As em plantas de Thelypteris salzmannii e Dicranopteris flexuosa
resultou no aumento na atividade enzimática da SOD e APX.
56
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61
CAPÍTULO III- Effects of chromate and sulfate on arsenic uptake and
translocation by Pteris vittata L.
(Normas da revista Journal of Hazardous Materials)
62
ABSTRACT
The effects of chromate and sulfate on the uptake and translocation of arsenate
in Pteris vittata L. plants were investigated. P. vittata plants were grown in the
presence of arsenate and chromate or sulfate for two weeks in hydroponic
system. The concentrations of the three oxyanions were 0.05, 0.25 and 1.25
mmol L-1. P. vittata accumulated 4,598 and 1,159 mg kg-1 As in the fronds and
roots, in the presence of 0.05 mmol L-1 As respectively; however, addition of
0.05 mmol L-1 chromate significantly reduced As uptake and translocation, with
their concentrations being reduced to 330 and 1,394 mg kg-1. P. vittata
accumulated 234 and 12,631 mg kg-1 Cr in the fronds and roots in the presence
of 0.05 mmol L-1 Cr; however, addition of 0.05 mmol L-1 As significantly
reduced Cr uptake and translocation, with their concentrations being reduced to
46 and 8,073 mg kg-1 Cr. P. vittata effectively took up Cr but was ineffective in
Cr translocation. Unlike chromate and arsenate, addition of sulfate increased the
uptake and translocation of both chromate and arsenate. This work demonstrated
that chromate and arsenate inhibited the uptake of each other, whereas sulfate
enhanced uptake and translocation of both chromate and arsenate by P. vittata.
Keywords:
P.
vittata,
hyperaccumulator,
arsenic,
chromium,
sulfur
63
1 Introduction
Arsenic (As) and chromium (Cr) are highly toxic elements naturally
occurring in minerals and released into the environment through anthropogenic
sources, including industrial mining, agricultural and forestry activities [1,2].
Petroleum refineries [3] are also a major source of As and Cr, which can
accumulate to toxic levels in the environment [4].
Arsenic is a ubiquitous contaminant of global concern, because of its
persistency and toxicity at low concentration. It is classified as a Group A
carcinogen to humans by the USEPA. Approximately 52,000–112,000 t of
arsenic are released annually to soil from anthropogenic sources [5], as it is
widely used in the production of pesticides, herbicides, and wood preservatives
[6,7]. Chromium poses a significant risk to human health because of its
mutagenic and carcinogenic properties [8]. Cr compounds are used in chrome
plating, dyes, pigments, tanning of animal skins, dyes and wood preservatives
[9, 10]. It is estimated that a million ton of chromium is released into the
environment [11].
As and Cr are present in the environment in various chemical forms that
differ in biological properties and toxicity. Both elements predominate in
inorganic forms with different valence states. As (V) and Cr (III) are less soluble
and more stable in the environment, whereas As (III) and Cr(VI) are highly
soluble and mobile in the environment [12], posing a higher health risk to
humans. In addition, they can be bioaccumulated by plants, though not
necessarily causing phenotypic symptoms of toxicity [13,14]. Arseniccontaminated sites often include higher levels of other heavy metals such as Cr,
Cu, Pb, Cd and Zn [15,16]. Moreover, the use of chromate in the wood
preservative also results in widespread contamination of As and Cr in soil and
water.
64
Phytoremediation employs plants to mine, transfer, stabilize and remove
heavy metal from polluted soils and water systems. It has received much
attention because it is cost-effective and environmentally friendly [17,18,19]. P.
vittata can accumulate large amounts of As in the biomass (up to 2%), with >
90% of the accumulated As in the fronds [20, 21]. Often soil and groundwater
are co-contaminated with several metals. The potential of P. vittata in
phytoremediation of multiple toxic metals has been investigated [22]. However,
the interactive effects of As and Cr on P. vittata has not been examined.
Sulfur is an essential nutrient for plants and is predominantly taken up by the
roots as sulfate [23]. After uptake, most of the inorganic sulfur is incorporated
into organic molecules via the sulfate assimilation pathway. It is activated by
ATP sulfurylase to form adenosine phosphosulfate, followed by a reduction by
APS reductase to form free sulfite, which is coupled to O-acetylserine to form
cysteine [24]. Cysteine can be incorporated into proteins, further metabolized to
methionine and its derivatives, or used for the production of the antioxidant
glutathione (GSH), and the phytochelatins (PCs) [25]. These compounds can
improve the tolerance of plants to metals and metalloids through complexation
and/or further sequestration of toxic forms inside cellular vacuoles [26, 27, 28].
Sulfate enhances arsenic accumulation by P. vittata [29, 30]. Wei and
Ma [30] examined the effects of sulfate on arsenic uptake by P. vittata. They
observed that sulfate at 15 or 30 mg L -1 As enhanced arsenic uptake and
translocation by P. vittata. . However, [30] tested the influence of sulfur on
arsenic accumulation in rice, and concluded that sulphur deprivation in rice
increased As translocation from roots to shoots. On the other hand, a competitive
uptake between sulfate and chromate has been shown in plants [31, 32, 33]. As
Cr is not an essential element, plants may not have evolved a specific uptake
system for it. While Cr(III) is supposed to passively enter into cells, the transport
of Cr(VI) is mediated by the sulfate carrier but with lower affinity [34] and
65
immediately converted to Cr (III) once in the roots, possibly by the Fe3+
reductase enzyme [35]. Kleinman [33] showed that strongly inhibited chromate
uptake by wheat plants, implying possible sharing of transporter. Furthermore,
chromate uptake was shown to be stimulated after pre-cultivation on plants in
sulfate-limited nutrient media.
The interactions between sulfate and chromium and/or arsenic must be
considered when plants are going to be employed for the remediation of metalcontaminated sites, as the accumulation of contaminants in plant tissues might
be altered by the sulfate concentration in the substrate where plants grow. The
objective of this study was to determine the effects of chromate and sulfate on
the uptake and translocation of arsenate by the arsenic hyperaccumulator P.
vittata. The results from this research will provide important information about
arsenate behavior in a hydroponic system and permit modeling of the uptake by
P. vittata in the presence of chromate and sulfate at environmentally realistic
concentrations.
2 Materials and methods
2.1. Experiment setup
P. vittata ferns cultivated in our lab were used. Efforts were made to
ensure that plants used in experiment were uniform and of similar size. The
plants were acclimatized in 0.2 strength Hoagland nutrient solution (HS) at pH
5.7 with 1 mM KOH-MES buffer for 4 weeks.
The acclimated plants were transferred to opaque containers containing
1 L of modified HS (S- and P-free) spiked with different concentrations of As,
Cr and S. Three sets of experiments were conducted: 1) with Cr at 0.05 mM and
arsenic concentrations at 0, 0.05, 0.25, and 1.25 mM (Na2HAsO47H2O); 2) With
As at 0.05 mM and Cr concentrations at 0, 0.05, 0.25, and 1.25 mM (K2Cr2O7);
and 3) with As or Cr at 0.05 mM and S concentrations at 0, 0.25 and 1.25 mM
(Na2SO4) (Sigma, St. Louis, MO). Each treatment was replicated four times. The
66
solution was aerated continuously and renewed twice a week during the
experiment. The water loss via transpiration was replenished by frequent
additions of deionized water to maintain a constant volume.
The plants were kept in a controlled room with 14-h light period at light
intensity of 350 µmol m-2 s-1, 25˚C/20˚C day/ night temperature and 60-70%
relative humidity. Plants were harvested 14 d after the treatments.
2.2 Arsenic, chromium and sulfur analysis in plants
The harvested plants after 2 weeks of growth were separated into fronds
and roots. To remove adsorbed arsenic on the roots, P. vittata roots were placed
under running distilled water, rinsed with ice cold phosphate buffer (1 mM
Na2HPO4, 10 mM MES and 0.5 mM Ca(NO3)2, pH 5.7) and washed once again
with distilled water. The samples were oven-dried (65˚C for 2 d), ground (20mesh), digested with concentrated HNO3 (1:1, v/v), and followed by 30% H2O2
(USEPA method 3050). Arsenic, chromium and sulfur in the solution were
determined by graphite furnace atomic absorption spectrophotometry (GFAAS;
AA240Z, Varian Inc., CS), atomic absorption spectrometry and inductivelycoupled plasma spectrometry (ICP; PerkinElmer 5300DV, Waltham, MA) via
EPA Method 2007.
To determine the amounts of Cr/As precipitating on root surfaces, plant
roots (0.2 g) were washed in 50 mL 1:1 v/v HNO3 and water for 20 min and the
Cr concentrations in the supernatants were determined using ICP.
2.3 Phosphorus analysis in plants
Plant samples were digested using the H2SO4/H2O2 method [36]. Because
arsenate interferes with P determination using the molybdenum blue method, P
was determined using a modified method of [37]. Briefly, the pH of the
digestion solution was adjusted to ~5 with NaOH and HCl. Ten milliliters of the
67
solution was pipetted into a 20-ml glass test tube, and to this 0.5 ml of Lcysteine (5% w/v in 0.6 M HCl) was added. The test tube was capped tightly to
allow arsenate reduction for 5 min at 80˚C. The solution was cooled to room
temperature, and P was determined by the molybdenum blue method.
2.4 Arsenic speciation in plants
For arsenic speciation, fresh samples were flash-frozen in liquid N2 and
stored at -80˚C. The samples were ground using liquid N2 and extracted twice
with methanol:water (1:1 v/v) under sonification for 4 h at 60˚C ([38] Zhang et
al., 2002). The two extracts were decanted into a 50-ml volumetric flask and
diluted to 50ml with deionized water. Arsenate and arsenite were separated
using an arsenic speciation cartridge (Waters SPE cartridge), which retains
arsenate. Arsenic analysis was determined by GFAAS. The accuracy of arsenic
speciation using the cartridges in plant tissues was determined by spiking 1.3
µM AsIII or AsV to plant methanol/water extract. There was no arsenic
complexation within the cartridge and no change in redox status, since recovery
of the spiked arsenic was 100% [39]. In addition, standard reference materials
from the National Institute of Science and Technology (Gaithersburg, MD) and
appropriate reagent blanks, internal standards and spikes were used to ensure
method accuracy and precision, which was within 100 ± 10% of the expected
quality control checks.
2.5. Lipid peroxidation
The amount of thiobarbituric acid reactive substances (TBAR) was
determined following the methods of [40] to determine lipid peroxidation in P.
vittata fronds and roots. About 0.3 g of frozen-tissues was cut into small pieces
and homogenized, using a cold mortar and pestle in ice bath with 1.5 ml of 5%
(wt/v) trichloroacetic acid (TCA) solution. The homogenate was transferred into
68
fresh tubes and centrifuged at 10,000 x g for 10 min at room temperature. To 1
ml of the aliquot of the supernatant, 1 ml of 20% (w/v) TCA containing 0.5%
(w/v) TBA and 100 µl 4% butylated hydroxytoluene in ethanol were added. The
mixture was heated at 95˚C for 30 min and then quickly cooled on ice. The
absorbance of the supernatant was measured at 532 nm and 600 nm. The
TBARS content was calculated using an extinction coefficient of 155 mM -1 cm-1.
2.6. Statistical methods
Treatments effects were determined by analysis of variance according to
the general linear model procedure of the Statistical Analysis System [41].
3 Results and Discussion
This study determined the effects of chromate (CrVI), arsenate (AsV)
and sulfate (S) on plant growth, and uptake and translocation of As and Cr by P.
vittata. The plants were grown for two weeks in 0.2-strength Hoagland solution
(S- and P-free) containing different levels of AsV (0, 0.05, 0.25, and 1.25 mM),
CrVI (0, 0.05, 0.25, and 1.25 mM) and sulfate (0, 0.25 and 1.25 mM). Biomass
and concentrations of As, Cr, S and P in P. vittata were determined.
3.1. Effects of arsenate, chromate and sulfate on P. vittata growth
After growing in 0.2-strength P- and S-free HS for 2 wks, P. vittata
accumulated 2.44 and 0.93 g in the fronds and roots (Table 1). The presence of
As or Cr significantly reduced the plant biomass. For instance, 0.05 mM Cr and
0.05 mM As reduced the frond biomass by 59 and 28% and root biomass and 64
and 52%. Apparently, Cr was more toxic to P. vittata (PV) than As at 0.05 mM.
The most likely explanation for the reduction on PV biomass is the decreased
the uptake of K, Mg, P, Fe and Mn in the roots as it has been reported for
soybean [42].
69
Uptake and accumulation of Cr by various crops indicate that Cr(VI)
uptake depends on metabolic energy [43]. The PV plants showed some degree of
toxicity, e.g., yellowing and falling of pinnea (data not shown). Cr(III) is
sparingly soluble and less toxic while Cr(VI) is more soluble, mobile in solution
and highly toxic to animals and plants due to its high solubility, mobility,
toxicity as well as carcinogenic and mutagenic properties [43]. The biotoxicity
of Cr(VI) to biological membranes due to its great oxidizing capabilities and its
interference with electron transport and respiration and photosynthesis.
Despite the reduced PV biomass in the presence of As or Cr at 0.05 mM
As, addition of 0.051.25 mM Cr improved the PV biomass, especially the
fronds from 1.01 to 1.25-1.71 g (Table 1). Since the presence of Cr(VI) in the
solution may inhibit the uptake of some ions, including K, the increment of K in
the solution may improve the plant biomass production. At 0.05 mM Cr,
addition of 0.051.25 mM As improved the PV biomass even more from 0.89 to
1.331.89 g for the fronds and from 0.45 to 0.670.88 g for the roots. There are
several studies showing that the presence of small concentration of As in the
growing solution improves the biomass production, which is in agreement with
the observed improvement of PV biomass in the co-presence of As and Cr.
The biomass of PV acclimated in S-free HS, responded to S, a plant
nutrient (Table 2). The typical S concentration in 0.2-strenght HS is 0.4 mM, but
S-free HS was used in the experiment. At 0.05 mM As, addition of 0.25 mM S
increased both frond (14%) and root (53%) biomass. Increase of S from 0.25 to
1.25 mM did not seem to help plant growth. This is consistent with that P.
vittata showed no visible toxicity symptoms when S was added to the growth
medium (data not shown). However, this is not the case when 0.20.8 mM
sulfate was added to HS containing 0, 0.2 and 0.4 mM AsV as PV biomass
remained the same[29].
70
Several parameters have been used to indicate the metabolic stress
caused by the uptake and translocation of Cr VI, such as activity of catalase,
peroxidase and superoxide dismutase [45]. In this study, thiobarbituric acid
reacting substances (TBAR) were used to determine the impact of As and Cr
stress on plants. In the absence of Cr or As, the TBAR in the fronds was 12.2
µmol g-1 fw (Fig. 5a). The presence of 0.05 mM As or Cr increased TBAR to
32.433.0 µmol g-1 fw, indicating both caused oxidation stress in PV fronds.
However, though under stress, the co-presence of As and Cr increased frond
biomass by 3249% (Table 1).
In the presence of 0.05 mM As and Cr, TBAR further increased to 40.9
µmol g-1 fw, again indicating additional stress to PV. However, addition of
0.251.25 mM Cr didn’t change TBAR. This may attribute poor Cr translocation
as most of the Cr remained in the roots (Fig. 2). Unlike Cr, addition of 0.251.25
As further increased TABR to 5461 µmol g-1 fw, As concentrations in the
fronds was positively correlated with TBAR (r=0.97).
At Cr = 0.05 mM, addition of 0.25 mM S increased the frond biomass
(127%) but addition of 1.25 mM S increased both frond (139%) and root (73%)
biomass compared to the control. Since Cr was more toxic to PV than As as
indicated by biomass reduction (Table 1), it seemed make sense that more S was
needed to alleviate Cr toxicity. However, the exact mechanism of how S
alleviated As and Cr were unknown.
3.2. Chromium effect on Cr and As uptake and translocation by P. vittata
In the absence of Cr, little Cr was accumulated by PV, being <20 mg kg1
(Fig. 1a). However, after exposing to 0.051.25 mM Cr for 2 weeks, PV
accumulated substantial amounts of Cr, with most of the Cr being concentrated
in the roots (>95%). The data indicate that PV was effective in taking up Cr, but
it was ineffective in translocating it to the fronds. For example, at Cr= 0.05 mM,
71
the roots accumulated 129 times more Cr than the fronds (6,040 vs. 47 mg kg-1).
The root concentrations increased to 19,18842,653 mg kg-1 when the external
Cr concentration increased to 0.251.25 mM. To determine if the Cr was
accumulated on the root surface, the roots were washed with dilute HNO3 for 20
minutes. It seemed that most of the Cr (8998%) was transported inside the
roots (Table 3). The fact that PV accumulated 19,18842,653 mg kg-1 Cr in the
roots indicates its effectiveness in Cr uptake. This was especially impressive
because it was achieved in the presence of 0.05 mM As. [46] also examined the
impact of Cr on As uptake by P. vittata. After growing for 2 wk in a hydroponic
solution containing 1.9 mM Cr(VI), PV accumulated 17,427 mg kg-1 Cr in the
roots 1,551 mg kg-1 Cr in the fronds, which was substantially less than Cr uptake
in our experiment. Compared to P. vittata and under similar condition, G.
pseudochina was less effective in Cr uptake, with 823 and 788 mg kg-1 being
accumulated in the leaves and stems [47]. Diwan [48] reported that Indian
Mustard accumulated 1,680 mg Cr kg-1 in the roots after growing in a
hydroponic system containing 0.1 mM CrVI 100 µg L-1). Hence, P. vittata was
more efficient in Cr uptake than other plants.
Cr is a toxic and nonessential element, hence plants may not possess a
specific mechanism for Cr transport. Low Cr translocation observed in our
experiment is consistent with literature [46, 49]. Zeng et al. [50] observed poor
Cr translocation in rice as most of the Cr remained in the roots. Vacuole has
been suggested to be the major site of heavy metal accumulation [51]. Zeng et
al. [50] working with subcellular distribution and chemical forms of Cr in rice,
suggested that vacuolar compartmentalization is an important detoxification
mechanism for rice plants. In our study, the reason for the high accumulation of
Cr observed in roots, could be due to the reduction of Cr(VI) to Cr(III) in roots,
and the consequent Cr(III) sequestration in the root cell vacuoles and/or
retention in the cell wall [52, 53, 54]. Additionally, many plants species have
72
low mobility of Cr (VI) due to barriers or lack of a suitable transport mechanism
for Cr [55].
In the absence of Cr and 0.05 mM As, PV effectively took up As and
translocated it to the fronds, with translocation factor (TF) being 26 (Fig. 1b).
However, the presence of Cr significantly inhibited As translocation by PV,
reducing the frond As from 4,211 to 330439 mg kg-1, >90% reduction.
It is known that PV preferentially translocates AsIII over AsV from the
roots to fronds [38]. In the absence of Cr, PV translocated 1,217 mg kg-1 As (fw)
to the fronds, with 72% being AsIII (Fig. 4a). Addition of 0.251.25 mM Cr
significantly reduced As translocation, with 19294.8 mg kg-1 being in the
fronds and 5063% being AsIII. So Cr reduced not only the total As in the
fronds but also proportionally less AsIII was present in the fronds. Similar to
fronds data, Cr reduced root uptake of As, reducing from 111 to 72.191 mg kg-1
As. In the control, 82% of the As being AsV compared to 96% in the presence of
Cr. Again, Cr reduced total As uptake, but increased the concentration of AsV in
the roots, which may be partially responsible for low As translocation .
Different from the fronds, root As increased with Cr concentrations (Fig.
1b). In other words, as more Cr was accumulated in the roots (from 6,040 to
42,653 mg kg-1), so did As (from 1,394 to 3,615 mg kg-1). It was unclear why Cr
uptake would enhance As uptake. It was possible that As entered the roots
passively with Cr. Plants may passively take up large amounts of metal at
phytotoxic levels through broken cell membranes. It is reported that CrVI caused
plasmolysis in peripheral cells on root surfaces of bush beans, indicating that
CrVI damages the plasmalemma and resulting in an increase in Cr uptake[56].
73
3.3 Arsenic effect on As and Cr uptake and translocation by P. vittata
In the absence of As, little As was accumulated by PV, < 2.02 mg kg-1
(Fig. 2a). In the presence of 0.05 mM As, PV accumulated 4,211 and 160 mg
kg-1 As in the fronds and roots (Fig. 1b). The significant As transport of arsenic
to the fronds is typical of arsenic hyperaccumulators. As discussed previously,
addition of 0.05 mM Cr significantly reduced arsenic translocation, with As in
the fronds and roots being 330 and 1,394 mg kg-1 (Fig. 1b). The data indicates
that Cr reduced both As uptake and translocation, with the impact being more
significant on the latter.
With increasing external As, as expected both root and frond As
concentrations increased (Fig 2a). However, PV was ineffective in translocating
As in the presence of Cr. With As concentrations increasing from 0.05 to 1.25
mM, the frond (330 to 1,248 mg kg-1) and root (1,394 to 3,769 mg kg-1) As both
increased, with TF being 0.24 to 0.33 (Fig. 2a).
The presence of Cr significantly inhibited As uptake and translocation,
similarly As also reduced Cr uptake by PV (Fig. 2b). The presence of As at
0.051.25 mM reduced Cr from 234 to 47110 mg kg-1 in the fronds and from
11,370 to 4,9656,040 mg kg-1 in the roots.
Exposing to 0.05 mM As, PV accumulated 4,211 and 160 mg kg-1 As in
the fronds and roots (Fig. 1b), indicating that PV was effective in taking up and
translocating As (~96%). Exposed to 0.05 mM Cr, PV accumulated 234 and
11,370 mg kg-1 in the fronds and roots (Fig. 2b). Though PV was effective in
taking up Cr, it was ineffective in translocating it to the fronds (~2%). Taking
plant biomass into consideration (Table 1), PV accumulated 4.3 g As and 5.3 g
Cr per plant. On a unit root biomass basis, then PV accumulated 7.2 g As and
11.8 g Cr per g root, demonstrating that PV was more effective in taking up Cr
than As.
74
At 0.05mM Cr and As, PV accumulated 47 and 6,040 mg kg-1 Cr (Fig.
2b) and 330 and 1,394 mg kg-1 As in the fronds and roots, respectively (Fig. 1b).
On per plant basis (Table 1), PV accumulated 1.2 g As and 2.8 g Cr. The
reduced As (7.2 to 1.2 g or 83%) and Cr (11.8 to 2.8 g or 76%) uptake indicate
that As and Cr interfered with each other’s uptake by PV. However, increasing
Cr from 0.05 to 1.25 mM increased root As from 1,394 to 3,615 mg kg-1 (Fig.
1b). On the other hand, increasing As from 0.05 to 1.25 mM reduced root Cr
from 6,040 to 4,965 mg kg-1 (Fig. 2b).
This may be explained by the fact that chemical precipitation induced by
roots in P. vittata. The observation of roots of P. vittata with an electron
microscope revealed the formation of precipitates on the surface of roots treated
with 0.05mM As and 1.25 mM Cr. The SEM X-ray microanalysis of that area
showed that only elements present were: Al, S, K, Fe and Cr (Fig.5).
3.3 Sulfate effect on As and Cr uptake and translocation by P. vittata
As a nutrient, S helped with PV growth (Table 1). Similar to the study of
Wei and Ma [29], addition of S increased As uptake and translocation by PV
(Fig.3a). The S concentration in 0.2-strength HS is 0.2 mM. For example,
addition of 1.25 mM S enhanced As concentrations by 28% in the fronds and by
68% in the roots (Fig. 3a)
Similar data were obtained for Cr, i.e., S addition increased both root
and frond Cr concentrations (Fig. 3b). However, Schiavon et al. [31] observed
negative effect of sulfate on Cr uptake by B. juncea for 2 d in presence of 1mM
S and 2 mM Cr in hydroponic experiments. This difference indicated that uptake
of Cr not only depend on the genus and species of individual plant.
75
4 Conclusions
Chromate and arsenate inhibited the uptake of each other, whereas sulfate
enhanced uptake and translocation of both chromate and arsenate by P. vittata.
The addition of sulfate helped arsenic translocation from the roots to the fronds
without changing arsenic speciation.
P. vittata effectively took up Cr but was ineffective in Cr translocation.
5 Acknowledgements
This research is supported in part by University of Florida, FAPEMIG
and CNPq, Brazil.
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82
Cr concentration (mgkg-1)
Fig.1. Effects of chromium on chromium (A) and arsenic (B) uptake and
translocation by P. vittata after exposing to different concentrations of
chromium and arsenic for 2 weeks. As = 0.05 mM for all treatments.
45000
Fronds
40000
As= 0.05mM
35000
Roots
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
0
0.05
0.25
1.25
As concentration (mgkg-1)
Cr concentration (mM)
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
As= 0.05mM
Frond
Root
0
0.05
0.25
Cr concentration (mM)
1.25
83
Fig.2. Effects of arsenic on As and Cr uptake and translocation by P. vittata after
2 weeks of growth. Cr = 0.05 mM in all treatments.
As concentraion (mgkg-1)
4500
4000
3500
Frond
Cr= 0.05mM
Root
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
0.05
0.25
1.25
As concentration( mM)
Cr cocnentration (mgkg-1)
8000
Fronds
Cr= 0.05mM
7000
Roots
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
0.05
0.25
As concentration (mM)
1.25
84
Fig.3. Effects of sulfate on arsenic and chromium uptake and translocation by P.
vittata after exposing to different concentrations of chromium and arsenic for 2
weeks.
A
As concentration (mgkg-1)
7000
Frond
As= 0.05Mm
6000
Root
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
0.25
1.25
S concentration (mM)
Cr concentration (mgkg-1)
B
25000
Fronds
Cr= 0.05mM
20000
Roots
15000
10000
5000
0
0
0.25
S concentration (mM)
1.25
85
Fig. 4- Effect of arsenate and chromate on arsenic speciation in fronds and roots
of P. vittata. As = 0.05 mM in all treatments
Fronds As mg/Kg FW
1600
1400
A
As= 0.05 mM
As Total
1200
As III
1000
800
600
400
200
0
0
0.25 Cr
1.25 Cr
Cr cocentration (mg/Kg)
Roots As mg/Kg FW
160
140
As= 0.05mM
B
As Total
As III
120
100
80
60
40
20
0
0
0.25 Cr
1.25 Cr
Cr concentration (mg/Kg)
86
Fig.5- Effect of arsenate and chromate on lipid peroxidation (µmol
malondialdehyde g-1 fresh weight) in the fronds and roots of P. vittata. As=0.05
mM (A) and Cr=0.05 mM except for the control where both As and Cr = 0.
µmol/g fresh weight
70
Fronds
60
Cr = 005mM
A
Roots
50
40
30
20
10
0
control
0
0.05As
0.25As
1.25As
As concentration (mM)
50
As= 0.05mM
µmol/g fresh weight
45
40
Fronds
B
Roots
35
30
25
20
15
10
5
0
control
0
0.05Cr
0.25Cr
C r concentration (mM)
1.25Cr
87
Table 1
Dry biomass of P. vittata L. after 2-w of exposure to arsenic, chromium and/or
sulfate.
As
Cr
SO4
Roots
Fronds
0
0
0
0.93 ± 0.06
2.44 ± 1.58
0.05
0
0
0.60 ±0.07
1.01 ± 0.16
0.05
0.25
0
0.88 ± 0.29
1.33 ± 0.15
0.05
0.25
0
0.57 ± 0.10
1.25 ±0.21
0.05
1.25
0
1.06 ± 0.29
1.72 ± 0.41
0
0.05
0
0.45 ± 0.13
0.89 ± 0.13
0.05
0.05
0
0.88 ± 0.29
1.33 ± 0.30
0.25
0.05
0
0.67 ± 0.09
1.89 ± 0.06
1.25
0.05
0
0.77 ± 0.20
1.74 ± 0.26
0
0.05
0
0.45 ± 0.13
0.89 ± 0.13
0
0.05
0.25
0.44 ± 0.12
2.02 ± 0.47
0
0.05
1.25
0.78 ± 0.21
2.13 ± 0.56
0.05
0
0
0.60 ± 0.07
1.01 ± 0.16
0.05
0
0.25
0.92 ± 0.02
1.15 ± 0.32
0.05
0
1.25
0.72 ± 0.12
1.19 ± 0.42
Values are represented as means ± standard deviation
88
Table 2
Concentrations of Sulphur (S), potassium (K) and phosphate (P) in the P.vittata.
after 2-w of exposure to arsenic (As), chromium (Cr) and/or sulfate (SO4).
Elemental concentration (mg kg-1)
mM
Solution
concentration
S
K
P
As
Cr
SO4
Fronds
Roots
Fronds
0
0
0
6,494 ± 752
6,009 ± 501
14,825 ± 416
0.05
0
0
4,332 ± 79
3,449 ± 245 14,376 ± 1,234
7,647 ± 1,175
4,627 ± 421
0.05
0.05
0
3,304 ± 335
2,275 ± 901 17,653 ± 1,827
9,625 ± 1,080
2,875 ± 287 4,396 ± 387
0.05
0.25
0
3,605 ± 437
3,105 ± 238 15,809 ± 1,216
7,527 ± 762
1,071 ± 191
0.05
1.25
0
4,223 ± 396
3,373 ± 116
7,470 ± 839
4,761 ± 90 6,695 ± 1321
0
0.05
0
3,896 ± 273
3,125 ± 258 18,504 ± 1,186
10,401 ± 327
4,847 ± 198 6,028 ± 389
0.25
0.05
0
3,950 ± 95
3,285 ± 474 12,888 ± 1,232
8,283 ± 1,091
3,797 ± 284 6,283 ± 402
1.25
0.05
0
2,820 ± 44
2,688 ± 138
8,145 ± 853
2,621 ± 309 4,966 ± 638
0
0.05
0.25
3,467 ± 159
3,392 ± 147 14,893 ± 2,231 10,155 ± 1,574 3,339 ± 289 6,098 ± 398
0
0.05
1.25
3,777 ± 72
3,610 ± 205
0.05
0
0.25
4,481 ± 234
3,943 ± 198 14,841 ± 1,532 11,447 ± 1,732 3,972 ± 268 6,308 ± 866
0.05
0
1.25
4,633 ± 370
4,029 ± 255 17,323 ± 1,813
17,693 ± 808
13,250 ± 721
14,437 ± 636
Roots
Fronds
Roots
10,881 ± 2,296 7,040 ± 855 5,154 ± 398
13,884 ± 2,367 3,021 ± 175
9,255 ± 2,584
5,354 ±207
3649 ± 307
5,347 ±355
4,783 ± 667 5,345 ± 1287
89
Table 3
Concentrations of Cr in the P. vittata. after 2-w of exposure to arsenic,
chromium and/or sulfate.
Solution
Concentration (mM)
AsV CrVI
SO4
0
0
0
0
0.05
0
0
0.05
0.25
0
0.05
1.25
0.05
0.05
0
0.05
0.25
0
0.05
1.25
0
0.25
0.05
0
1.25
0.05
0
Frond
0.15
234 ± 21
280 ± 18
707 ± 3
47 ± 1
892 ± 76
1,645 ± 2.36
110 ± 9.82
58 ± 3.85
Chromium concentrations
(mg kg-1)
Roots External
Roots Internal
0.45
2.030
1,261 ± 243
11,370 ± 340
917 ± 113
8,764 ± 1,238
1,272 ± 108
19,326 ± 558
610 ± 62
5,430 ± 835
442 ± 62
18,746 ± 283
2,674 ±397
39,978 ± 2,02
438 ± 39
5,552 ± 294
208 ± 15
4,758 ± 518
Roots / Fronds
% internal
90.0
90.5
96.1
89.9
97.7
93.7
92.3
97.8
54
35
29
129
22
26
55
86
90
CAPÍTULO IV- Arsenic Resistant Bacteria Isolated from the rhizosphere
of arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L
( Normas da revista Microbiological Research)
91
ABSTRACT
This study was undertaken to investigate arsenite and arsenate resistance of four
microbial isolates recovered from the rhizophere of Pteris vittata as well as their
ability to express As(III)-oxidizing and As(V)-reducing capabilities under
aerobic conditions. The bacteria were isolated and grown with LB or PBM
media, inoculated with various concentrations of As(III) or As(V). All
incubation experiments were conducted using 20 mL cylindrical flasks with
aqueous media (LB media for C1, C3, & C4 and PBM media for C2 only)
containing 7.5 mg L-1 as As(III) or As(V). The results of these experiments
demonstrated that growth was generally better. In addition, the microbial isolates
C1, C3 and C4 displayed resistance up to 1mM As(III) and 40 mM As(V) as
well as an ability to oxidize As(III) and reduce As(V) in aerobic conditions.
Comparisons between the rates of As(III) oxidation and As(V) reduction
suggests a significant preference for the oxidation step as its rate was much
higher than As(V) reduction. The results therefore conclude that the microbial
isolates used in this study were resistant to high arsenic concentrations in
aqueous media. The tolerance and redox-manipulation of arsenic in laboratory
systems by microbial isolates may provide some insights for environmental
remediation of contaminated groundwater.
Keywords: arsenic-resistant bacteria, oxidation, reduction
92
1 Introduction
Arsenic, a toxic metalloid, is widely distributed in the environment,
which results from both natural and anthropogenic sources (Liu et al., 2007).
Arsenate (AsV) and arsenite (AsIII) are the two most abundant inorganic arsenic
forms in terrestrial and aquatic environments. They are both highly toxic to most
living organisms including microbes, plants, and mammals. Compared to AsV,
AsIII is more bioavailable and toxic due to its greater hydrologic mobility and
high affinity to bind with reactive sulfhydryl groups of many enzymes involved
in crucial cellular metabolism (Quéméneur et al., 2010).
Arsenic is widely involved in microbial metabolism via biochemical
detoxification or energy acquisition for growth (Quéméneur et al., 2010;
Quéméneur et al., 2008). Microbial transformations of AsV into AsIII and viceversa are important in controlling arsenic biogeochemistry in various
ecosystems. On one hand, AsV can be used as electron acceptor in anaerobic
respiration for energy gain. In aerobic conditions, AsV can be reduced to AsIII
followed by extrusion from cytoplasm via specific AsIII transporters, which
represents a typical resistant pathway for microbes to cope with high AsV in the
environment (Quéméneur et al., 2010). On the other hand, AsIII can be oxidized
to AsV by both heterotrophic and chemoautotrophic oxidizing bacteria, which
have been identified from a wide range of ecosystems and exhibit phylogenetic
diversity (Kertulis-Tartar, 2005). By transforming AsIII to AsV, AsIII oxidizers
attenuate AsIII bioavailability and toxicity in the environment.
Arsenic hyperaccumulator Pteris vittata Chinese brake fern (Ma et al.,
2001) has a potential to be used to remediate arsenic-contaminated soils (Liu et
al., 2007) and water (Oremland et al., 2005). Efficient arsenic uptake by P.
vittata is closely associated with root-microbe symbiosis where microbial
transformation and root absorption of arsenic occur continuously.
93
Microbial AsIII oxidation has application in bioremediation technology
by transforming more mobile and toxic AsIII to less toxic AsV, which can be
immobilized and removed more easily (Quéméneur et al., 2010). Although a
wide range of AsIII oxidizers have been reported (Liu et al., 2007; Quéméneur
et al 2008; Silver et al., 2005), no information is available regarding microbial
AsIII oxidizers in the rhizosphere of P. vittata. Our goals were to (1) isolate
arsenic resistant bacteria (2) To test AsIII -oxidizing and AsV-reducing abilities
for bacteria under aerobic conditions.
2 Materials and Methods
Sodium arsenite and sodium arsenate (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA
and Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) were used to prepare AsIII and AsV
stock solutions. Microbial media components were purchased from Fisher
Scientific. Primers for PCR were custom-ordered from Integrated DNA
Technologies (Coralville, IA).
2.1 Spent growth solution of P. vittata.
Four-month old P. vittata plants, of uniform size, with 4-5 fronds
growing in potting media were transferred to 0.2-strength Hoagland solution
(Hoagland and Arnon, 1938). They were grown in a controlled environment
with 8-h photoperiod at light intensity of 350 µE m−2 s−1, 28/23 ˚C day/night
temperature and 60% relative humidity. The nutrient solution was aerated
continuously and changed weekly. After two-week of acclimation, the growth
solutions were collected without ferns and called “spent growth media”
94
2.2 Isolation of culturable bacteria
Three media prepared to isolate culturable bacteria from the spent
growth media were: (i) minimal medium, with the following composition (1 L,
pH ~ 6.4): 5.00 g peptone; 0.15 g ferric ammonium citrate; 0.098 g MgSO4;
0.066 g CaCl2· 2H2O; 0.05 g MnSO4 ·H2O, ; 0.006 g FeCl3; and 12 g agar (24),
(ii) Luria Bertani (LB) medium, and (3) Hoagland agar medium (1.5% agar)
(Hoagland and Arnon, 1938), which was prepared from 0.2 µm-filtrated spent
Hoagland solution with 0.4% (w/v) glucose added as the carbon source. Spent
medium (200 µL) was poured onto the three types of media and the solution was
spread evenly over the surface of each plate, which was then incubated at 30˚C.
Isolated colonies were obtained by continuous sub-streaks and incubation at
30˚C.
2.3Arsenic tolerance of bacterial isolates.
To measure arsenic tolerance, cultures were inoculated to an initial
turbidity of 0.05 OD600nm, in LB liquid medium (for C1, C3 and C4) or
Pseudomonas basal mineral medium PBMM (Atlas, 2004) (for C2)
supplemented with indicated levels of sodium arsenate or sodium arsenite.
Growth was measured following incubation at 30˚C, 200 rpm for 12 h.
2.4 Measurement of AsIII oxidation and AsV reduction.
To test AsIII-oxidizing and AsV-reducing abilities of the isolated
strains, pure cultures were inoculated into liquid LB medium (for C1, C3 and C4)
or PBMM (for C2) containing 7 mg L -1 AsIII or 7 mg L-1 AsV with cells from an
early log phase growth. Control treatment was included by adding 7 mg L -1AsIII
or 7 mg L-1 AsV to sterilized media. After 4 h growth at 30˚C with 200 rpm,
OD600nm of the cultures were measured. Cells were collected by centrifugation at
14,000 g for 2 min. Arsenic speciation and estimation of concentration were
carried out in the supernatant fluids of different cultures and the corresponding
95
extracts of cell pellets following breaking the cells using ultrasonication and
extraction into 50% methanol using As-speciation cartridge and GFAAS.
2.5 Identification of bacteria using fatty acid methyl ester (FAME) analysis
using MIDI Sherlock (Midi Inc., Newark, DE
Fatty acids were extracted in xylene and saponified in dilute sodium
hydroxide/methanol solution followed by treatment with dilute HCl/methanol
solution to derive respective methyl esters (FAMEs). The FAMES extracted
from the aqueous phase was analyzed by a gas chromatograph and interpreted
using MIDI Sherlock software (Kunitsky et al., 2006).
2.6 Data analysis
All values were expressed as means ± SE (n=3). The treatment effects
were determined by analysis of variance according to the linear model procedure
of the Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 1986). Treatment means
were separated by Duncan’s multiple range tests using a level of significance of
p < 0.05.
3 Results
Isolation of culturable AsIII oxidizers from spent growth media.
Following plating of the spent media, after 2 d of incubation at 30˚C,
four colonies with different morphologies appeared on the mineral and LB
medium. Purified cultures were obtained by continuous sub-streak and were
named C-1, C-2, C-3 and C-4. Among the four strains, C-2 displayed yellow
color with others being white or tan and none exhibited fluorescence under UV.
Three of the four bacterial isolates grew well in LB medium but C-2 grew best
in Pseudomas basic mineral medium (Roland, 2004).
Carbon utilization assay using Biolog plates showed that C1, C2, and C3
had high similarity indices
to Comamonas
testosterone,
Flavimonas
96
oryzihabitans and Staphylococcus epidermidis respectively, and C4 had
relatively lower similarity index to Pseudomonas alcaligenes (Table 2). Fatty
acid methyl ester analyses were consistent with these identifications – matching
C1 to Comamonas testosterone and C2 to Flavimonas orhzihabitans (Table 2).
C3 matched with both Staphylococcus capitis and S. epidermidis with close
similarity indices and C4 with P. alcaligenes (Table 2).
All the four isolates were resistant to 50µM sodium arsenite with only
about 10% growth reduction compared to no arsenite controls (Fig. 1). When
tested up to 1 mM sodium arsenite, C-2 was significantly more sensitive to
sodium arsenite than C-1, C-3 and C-4 (Fig. 1). All the four isolates including C2 had significantly higher degrees of tolerance to arsenate as revealed by growth
in media containing 40 mM sodium arsenate (Fig. 1).
To test their ability in AsIII oxidation, the four strains were inoculated
into flasks with liquid medium containing 7 mg L -1 AsIII. Control flasks had
media with AsIII, but no cells. After 4 h incubation under 200 rpm, about 5 to
10% of the total arsenic in the medium was oxidized in LB medium and 3.5% in
the minimal medium in the control flasks. In media where C-1 was inoculated
significantly more arsenite was oxidized (27% of the total) (Fig 2A). The spent
medium where C-2, C-3 and C-4 were cultured did not have significantly greater
AsV compared to controls of medium without cells (Fig 2B). AsIII oxidation in
the control media (sterilized LB or MM), could be caused by the strong aeration
under 200 rpm shaking conditions. When cell pellets of these four isolates
grown in media containing As(III) were analyzed, 34%, 55%, 24% and 70% of
the total arsenic was AsV in C-1, C-2, C-3 and C-4 respectively (Fig.2B).
Together these results suggest that the four isolates had differing abilities to
oxidize arsenite.
When tested for AsV reduction by providing AsV in the medium, there
was no detectable AsV reduction in the control media, but a small but detectable
97
fraction of AsV was reduced in the spent media inoculated with C-1, C-2, C-3
and C-4 (Fig 2A). In the media, 5.6%, 0.5%, 2.6% and 1.6% of the total arsenic
was AsIII (Fig 2A). Analysis of the cell pellet extracts showed that C-1 cells
contained significantly greater AsIII levels (17% of the total arsenic) than C-2
(4.2%), C-3(4.5%) and C-4 (12.6%) (Fig 2B). Together these results show that
the four isolates had differing abilities to reduce arsenate.
4.0 Discussion
Multiple methods were used to identify the four isolates as Comamonas
sp., C-1, Flavobacterium C-2, Staphylococcus C-3 and Pseudomonas C-4
(Tables 1). These four isolates exhibited remarkable tolerance to sodium
arsenate and arsenite (Fig 1). All four isolated bacteria oxidized AsIII (Fig 4)
and also reduced AsV (Fig 2), although AsV reduction rates were much lower
than that for AsIII oxidation (Fig 2 and Fig 3). In our experiment, Comamonas
sp. C-1 induced significant oxidation of AsIII after 4 h of incubation with AsIII
but reduced AsV when provided with AsV (Fig. 2). To investigate whether AsIII
oxidation by C-1 was by the cells or by enzymatic and non-enzymatic factors
released from the cells, we tested AsIII oxidation in spent media where C-1cells
were cultured initially. AsIII oxidation in such a spent medium was no more
than background control AsIII oxidation rates (data not shown), suggesting that
AsIII oxidation by C-1 was mediated by the cells. Consistent with our results we
propose that C-1 cells tolerate high levels of AsV by reducing AsV within the
cells and exporting AsIII out. We hypothesize that an arsenite oxidase spatially
separated from arsenate reductase, oxidizes the AsIII as it escapes out or after its
export outside the cells. This is consistent with our observation that only a small
fraction of the arsenic outside the cells is AsIII (Fig 2A). Both Commamonas
and Flavobacterium isolates have been previously identified from the
rhizosphere of some plants and exhibited potential for the accelerated
degradation of a diverse organic contaminants in the environment (Daane et al.,
98
2001; Liu et al., 2007; Lu et al., 2006; Narasimhan et al., 2003; Xu et al., 2010).
Whether the rhizosphere system of P. vittata can play a role in degrading toxic
organic pollutants present in AsIII-contaminated water is raised as a new issue,
which deserves further study.
Regarding phytofiltration technology using P. vittata to remove AsIII
and AsV from contaminated water, the oxidizers in the rhizosphere can
significantly affect arsenic speciation and thus root uptake dynamics. In the
presence of the oxidizing bacteria, AsIII uptake by P. vittata will be impacted by
phosphorus (P) levels because AsV and P are chemical analogs and they
compete for root uptake. In the absence of P, AsV uptake rate by P. vittata was
up to 9-20 times higher than AsIII (Tu et al., 2004). This suggests that with low
P content, AsIII removal efficiency could be increased by synergic function of
microbial AsIII oxidation in the rhizosphere followed by root uptake of AsV at a
higher rate.
This study provides the platform for future research to verify the
application of AsIII oxidizers including four culturable isolates from the
rhizosphere of P. vittata to improve phytofiltration of arsenic contaminated
water.
99
5 References
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removal of polychlorinated biphenyls from alfalfa rhizosphere soil in a field
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101
Fig 1. Arsenic resistance of bacterial isolates C1, C2, C3 and C4. Late log phase
cultures of C1 (A), C2(B), C3(C) and C4(D) were inoculated to 0.05 OD 600
density in LB medium (C1, C3 and C4) or Pseudomonas Basal Mineral medium
(C2) containing indicated concentrations of sodium arsenate (filled bars) or
sodium arsenite (striped bars) or no arsenic (open bars) and incubated for 12 h at
200 rpm at 30oC. Optical density at 600 nm was measured using a
spectrophotometer. Bars represent means and standard errors for three replicates.
A
a
4
Growth (OD600)
2.5
a
b
a
b
a
As III
As V
c
3
a
2
a
As III
As V
b
1.5
1.0
c
c
0.5
1.0
0.5
1
0.0
0
Control
0.05
0.5
1.0
0.1
1.0
Control
40.0
0.05
5
5
4
b
As III
As V
a
b
b
C
a
a
a
4
b
b
3
c
2
1
b
Growth (OD600)
a
0.1
1.0
40.0
Arsenic Concentration (mM)
Arsenic Concentration (mM)
Growth (OD600)
a
2.0
b
Growth (OD600)
5
B
b
D
b
c
3
2
1
0
0
Control
0.05
0.5
1.0
Arsenic Concentration (mM)
0.1
1.0
40.0
Control
0.05
0.5
1.0
0.1
Arsenic Concentration (mM)
1.0
40.0
102
Fig. 2. Arsenite oxidation by bacterial isolates C1, C2, C3 and C4. Sodium
arsenite was provided in the culture medium for four hours. Total arsenic (open
bars) and arsenate (filled bars) were determined in the spent medium (A) and
corresponding extracts of cells expressed per unit cell density (B). Bars represent
means and standard errors for three independent cultures. Bars denoted with
different letter codes are significantly different at p=0.05.
A
As Total
8
a
6
As (mgL-1)
As V
ab
cd
cd
d
bc
4
2
a
b
b
b
b
C-2
C-3
C-4
c
0
Control- ControlLB
MM
C-1
B
100
a
As Total
As ( µgL A600-1)
80
As V
b
60
c
40
a
b
b
20
d
b
0
C-1
C-2
C-3
C-4
103
Fig 3. Arsenate reduction by bacterial isolates C1, C2, C3 and C4. Sodium
arsenate was provided in the culture medium for four hours. Total arsenic (open
bars) and arsenite (filled bars) were determined in the spent medium (A) and
corresponding extracts of cells, expressed per unit cell density (B). Bars
represent means and standard errors for three independent cultures. Bars denoted
with different letter codes are significantly different at p=0.05.
As (mgL -1 )
8
A
a
b
c
6
As Total
a
As III
b
d
4
2
c
a
b
b
0
Control-LB ControlMM
As (µgA600 -1 )
160
C-1
C-2
C-3
C-4
B
a
As Total
As III
120
b
b
80
b
40
a
b
b
b
0
C-1
C-2
C-3
C-4
104
Table 1. Identification of bacterial isolates based on fatty acid methylester
analyses (FAME). Similarity index (SIM) calculated by MIDI Sherlock
microbial identification system is given. Two values are given if SIMs for the
top two matches did not differ by 0.1.
Bacterial
isolate
C1
C2
C3
C3
C4
Identification
Comamonas testosteroni
Flavimonas orhzihabitans
Staphylococcus capitis
Staphylococcus epidermidis
Pseudomonas alcaligenes
SIM
0.554
0.877
0.659
0.651
0.684