universidade federal do tocantins campus universitário de

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
BIOPROSPECÇÃO DE ÓLEOS E DE FUNGOS ENDOFÍTICOS COM
POTENCIAL ANTIFÚNGICO.
EVILANNA LIMA ARRUDA
GURUPI-TO
JANEIRO DE 2014
EVILANNA LIMA ARRUDA
BIOPROSPECÇÃO DE ÓLEOS DE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS COM
POTENCIAL ANTIFÚNGICO.
Trabalho de Dissertação apresentado à
Universidade Federal do Tocantins junto ao
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
como requisito para obtenção do título de Mestre
em Biotecnologia.
Orientador: Dr. Manoel Mota dos Santos.
GURUPI-TO
JANEIRO DE 2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca da Universidade Federal do Tocantins
Campus Universitário de Palmas
L732b
Lima Arruda, Evilanna
Bioprospecção de óleos e de fungos endofíticos com potencial
antifúngico / Evilanna Lima Arruda - Palmas, 2014.
85f.
Dissertação de Mestrado – Universidade Federal do Tocantins,
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, 2014.
Linha de pesquisa: Controle Biológico.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Mota dos Santos.
1. Controle biológico 2. Metabólitos secundários. 3. Auxinas I. Mota
Santos, Manoel. II. Universidade Federal do Tocantins. III. Bioprospecção
de óleos e de fungos endofíticos com potencial antifúngico.
CDD 633.88
Bibliotecária: Emanuele Santos
CRB-2 / 1309
TODOS OS DIREITOS RESERVADOS – A reprodução total ou parcial, de qualquer forma
ou por qualquer meio deste documento é autorizado desde que citada a fonte. A violação
dos direitos do autor (Lei nº 9.610/98) é crime estabelecido pelo artigo 184 do Código
Penal.
iii
Trabalho realizado junto ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal do Tocantins, sob a orientação do Profº Dr. Manoel Mota
dos Santos.
Banca examinadora:
____________________________________________
Prof. Dr. Manoel Mota dos Santos
Universidade Federal do Tocantins (Orientador)
____________________________________________
Prof. Dr. Aloísio Freitas Chagas Júnior
Universidade Federal do Tocantins – Campus de Gurupi
____________________________________________
Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar
Universidade Federal do Tocantins – Campus de Gurupi
____________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro Fidelis
Universidade Federal do Tocantins – Campus de Gurupi
iv
Dedico esse trabalho à minha
família, em especial, a minha
querida mãe e a todos os
meus amigos.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por ser meu guia e sustento me dando força e coragem para
seguir sempre em frente.
À minha mãe Raimunda Lima Arruda e irmã Rejanne Lima Arruda, pelo apoio,
compreensão e companheirismo.
Ao Prof. Dr. Manoel Mota dos Santos pela orientação, amizade, ensinamentos e
compreensão.
Ao Prof. Dr. Aloísio Freitas Chagas Junior e Líllian França Borges Chagas por
cederem o laboratório de Microbiologia, além do apoio, incentivo e amizade,
contribuições indispensáveis para realização desse trabalho.
Ao professor Dr. Eduardo Andrea Lemus Erasmo pelo Laboratório de Plantas
Daninhas.
Ao professor Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar pelo laboratório de Controle
de Pragas.
Aos professores
ensinamentos.
do
Programa
de
Pós-graduação
pela
dedicação
e
A Nathalia Silva Oliveira pelo auxilio em várias etapas desse trabalho, e Jefferson
Costa, pela ajuda, indispensável, na execução desse trabalho.
Aos amigos de curso pelo companheirismo e amizade nesses dois anos de
convivência, pelo momentos divertidos e agradáveis compartilhados.
A todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para realização desse
trabalho.
vi
SUMÁRIO
RESUMO GERAL .............................................................................................. xi
ABSTRACT ....................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 13
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 14
2.1 Óleos essenciais ..................................................................................... 14
2.2 Negramina (Siparuna guianensis) ........................................................... 15
2.3 Pinhão-manso (Jatropha curcas) ............................................................ 17
2.5 Microrganismos endofíticos e controle biológico ..................................... 19
2.6 Microrganismos e promoção do crescimento de plantas ........................ 20
2.7 Doenças radiculares ............................................................................... 21
Capítulo I .......................................................................................................... 24
RESUMO.......................................................................................................... 25
ABSTRACT ...................................................................................................... 26
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 27
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 29
2.1 Locais do experimento ............................................................................ 29
2.2 Coleta e extração dos óleos .................................................................... 29
2.3 Obtenção dos Fitopatógenos .................................................................. 29
2.4 Ensaios Microbiológicos .......................................................................... 30
2.4.1 Atividade antifúngica dos óleos isolados .......................................... 30
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 32
4. CONCLUSÃO............................................................................................... 40
Capítulo II ......................................................................................................... 41
RESUMO.......................................................................................................... 42
ABSTRACT ...................................................................................................... 43
1.INTRODUÇÃO .............................................................................................. 44
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 47
2.1 Material vegetal utilizado ......................................................................... 47
2.2Desinfecção e Isolamento ........................................................................ 47
2.3 Purificação e preservação dos isolados .................................................. 47
2.4 Antagonismo in vitro por confronto direto ................................................ 48
2.5 Extração de metabolitos secundários do meio de cultura ....................... 49
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 51
vii
3.1 Antagonismo in vitro por confronto direto ................................................ 51
3.2 Extração de metabólitos secundários ..................................................... 55
4. CONCLUSÃO............................................................................................... 56
Capítulo III ........................................................................................................ 57
RESUMO.......................................................................................................... 58
ABSTRACT ...................................................................................................... 59
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 60
2. METODOLOGIA ........................................................................................... 62
2.1 Seleção das estipes com potencial para produção de AIA ..................... 62
2.2 Produção de ácido indolacético .............................................................. 62
2.3 Curva de calibração AIA ......................................................................... 63
2.4 Solubilização de fosfato de cálcio ........................................................... 63
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 65
3.1 Produção de ácido indolacético .............................................................. 65
3.2 Solubilização de Fosfato de Cálcio ......................................................... 68
4. CONCLUSÕES ............................................................................................ 68
CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................... 70
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 71
viii
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Folhas de negramina (Siparuna guianensis).......................................16
Figura 2. Sementes de Pinhão-manso ..............................................................17
CAPITULO II
Figura 1. A. exibe a coloração amarela na zona de confronto formada pela
amostra UFT.P 2.4.3 e B. mostra coloração amarelo claro em todo meio formada
pelo fungo UFT.P 2.6.2. ....................................................................................52
Figura 2. Atividade antagônica de isolados endofíticos. A porcentagem de
inibição do patógeno Rhizoctonia solani é expressa como média com uma barra
de erro que representa o intervalo de confiança a 95%.....................................53
Figura 3. Atividade antagônica de isolados endofíticos. A porcentagem de
inibição do patógeno Sclerotium rolfsii é expressa como média com uma barra
de erro que representa o intervalo de confiança a 95%.....................................54
CAPITULO III
Figura 1. Curva padrão do AIA ..........................................................................63
Figura 2. Produção de AIA na presença e ausência de L-triptofano, expressa
como média com uma barra de erro que representa o intervalo de confiança a
95%....................................................................................................................66
Figura 3. A seta indica presença de AIA revelada pelo reagente de salkowski na
amostra UFT.P 1.5.2 após 168 horas de crescimento do fungo..........................67
ix
LISTA DE TABELAS
CAPITULO I
Tabela 1. Resumo da análise de variância do crescimento micelial (mm) de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii submetidos a diferentes concentrações de
óleos avaliados em quatro épocas.....................................................................32
Tabela 2. Efeito in vitro dos óleos essenciais de Eucalyptus globulus e Siparuna
guianensis, e do óleo de Jatropha curcas em diferentes concentrações sobre o
crescimento micelial de Rhizoctonia solani, em diferentes períodos de
avaliação............................................................................................................34
Tabela 3. Efeito in vitro dos óleos essenciais de Eucalyptus globulus e Siparuna
guianensis, e do óleo de Jatropha curcas em diferentes concentrações sobre o
crescimento micelial de Sclerotium rolfsii, em diferentes períodos de
avaliação............................................................................................................36
Tabela 4. Principais constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais de
Siparuna guianensis, Eucalyptus globulus e no óleo fixo da semente de Jatropha
curcas................................................................................................................38
Tabela 5. Comparação das medias dos halos de inibição (mm) obtidos para os
óleos sozinhos em relação às combinações sobre o crescimento micelial de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii...............................................................39
CAPÍTULO II
Tabela 1. Interações entre fungos endofíticos isolados de Jatropha curcas e
Corymbia citriodora e os fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii
utilizados nos testes de antagonismo in vitro após 14 dias de
crescimento........................................................................................................51
CAPÍTULO III
Tabela 1. Curva de calibração para o AIA......................................................... 63
x
BIOPROSPECÇÃO DE ÓLEOS E DE FUNGOS ENDOFÍTICOS COM
POTENCIAL ANTIFÚNGICO.
RESUMO GERAL
O objetivo desse trabalho foi buscar alternativas para controle de fitopatógenos
através de biocompostos menos agressivos ao meio ambiente. Para isso,
produtos naturais derivados de plantas e microrganismos foram investigados. A
atividade antifúngica de óleos essenciais de Siparuna guianensis e Eucalyptus
globulus e do óleo bruto de sementes de Jatropha curcas foram avaliados pela
incorporação dos mesmo no meio de cultura BDA nas doses de 0 µl.ml-1; 0,5
µl.ml-1; 1,0 µl.ml-1; 1,5 µl.ml-1; 2,0 µl.ml-1 a cada 24 horas de crescimento. O efeito
sinérgico da associação desses óleos na concentração de 1:1 foi investigado
utilizando as doses de 0 µl.ml-1; 0,5 µl.ml-1; 1,0 µl.ml-1; 1,5 µl.ml-1; 2,0 µl.ml-1 no
meio de cultura BDA. Foram isolados fungos endofíticos de Corymbia citriodora
e Jatropha curcas e avaliado a capacidade antagônica desses microrganismo
contra fitopatógenos por confrontação direta em placa. Extratos orgânicos de
acetato de etila provenientes dos metabólitos secundários lançados no meio de
cultura BD foram ressuspendidos em solução de tween 80 a 2% e filtrados em
membrana de 22 µm. A capacidade de promoção de crescimento da planta
desenvolvida por esses fungos foram analisada pela síntese de AIA e
solubilização de fosfato, o reagente de salkowski foi utilizado na detecção de
substâncias indólicas produzidas pelos fungos endofíticos e fosfato de cálcio foi
formado em meio sólido para avaliação da capacidade solubilizadora desses
fungos. O óleo essencial de Eucalyptus globulus teve efeito fungicida em doses
acima de 1,0 µl.ml-1 inibindo o crescimento total dos fitopatógeno Rhizoctonia
solani e Sclerotium rolfisii. O óleo bruto da semente de Jatropha curcas não
apresentou efeito fungitóxico diante os fitopatógenos. Dos fungos isolados
UFT.E 1.1, UFT.E 2.11.2, UFT.E 2.2, UFT.E 3.3, UFT.P 1.5.2, UFT.P 1.6, UFT.P
3.1.2, UFT.P 3.2, UFT.P 5.13, UFT.P 2.4, UFT.P 2.4.3, UFT.P 2.4.7, UFT.P 2.6.2,
UFT.P 3.1, UFT.P 3.5 que foram submetidos ao teste de antagonismo direto em
placas de petri, os isolados UFT.P 3.1.2, UFT.P 3.2, UFT.P 5.13 inibiram 100%
o crescimento micelial de Rhizoctonia solani. Os matebólitos secundários
produzidos pelos fungos não apresentaram atividade antifúngica. Os isolados
UFT.P 1.5.2 e UFT.P 1.6 foram capazes de sintetizar AIA alcançando
concentrações de 57,00 µg.ml-1 e 73,26 µg.ml-1, respectivamente, na presença
de L-triptofano no meio de cultura. Nenhum dos isolados foram capazes de
solubilizar fosfato de cálcio.
Palavras-chave: controle biológico; metabólitos secundários, auxinas, fungicida
xi
BIOPROSPECTING OILS Siparuna guianensis AUBLET, Eucalyptus
globulus AND Jatropha curcas L. AND OF Corymbia citriodora
ENDOPHYTIC FUNGI AND Jatropha curcas L. WITH POTENTIAL
ANTIFUNGAL.
ABSTRACT
The aim of this work was to seek alternatives to control phytopathogens through
less aggressive biocompounds to the environment. For this reason, natural
products derived from plants and microorganisms were investigated. The
antifungal activity of essential oils of Eucalyptus globulus and Siparuna
guianensis and crude oil from Jatropha curcas seeds were evaluated by
incorporating the same in PDA culture medium at doses of 0 µl.ml-1; 0.5 µl.ml-1;
1.0 µl.ml-1; 1.5 µl.ml-1; 2.0 µl.ml-1 every 24 hours of growth. The synergistic effect
of the combination of these oils at a concentration of 1:1 was investigated using
doses of µl/ml; 0.5 µl.ml-1; 1.0 µl.ml-1; 1.5 µl.ml-1; 2.0 µl.ml-1 in PDA culture
medium. Endophytic fungi Corymbia citriodora and Jatropha curcas were isolated
and assessed the ability of these antagonistic microorganisms against
phytopathogens by direct confrontation on board. Organic extracts of ethyl
acetate from the secondary metabolites released in the culture medium of PD
(Potato Dextrose) were resuspended in 2 % Tween 80 and filtered at 22 µm
membrane. The ability of plant growth-promoting of these fungi have been
developed for synthesis analyzed by AIA and phosphate solubilization, salkowski
reagent was used to detection of indolic compounds by endophytic fungi and
calcium phosphate was formed on solid medium to assessment solubilizing ability
of these fungi. The essential oil of Eucalyptus globulus had fungicidal effect at
doses above 1.0 µl.ml-1 inhibiting the total growth of the plant pathogen
Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfisii. The crude oil from Jatropha curcas
seeds showed no antifungal effect on phytopathogens. Fungal isolates UFT.E
1.1, UFT.E 2.11.2, UFT.E 2.2, UFT.E 3.3, UFT.P 1.5.2, UFT.P 1.6, UFT.P 3.1.2,
UFT.P 3.2, UFT.P 5.13, UFT.P 2.4, UFT.P 2.4.3, UFT.P 2.4.7, UFT.P 2.6.2,
UFT.P 3.1, UFT.P 3.5 that have undergone the test of direct antagonism in petri
dishes, the UFT.P 3.1.2, UFT.P 3.2, UFT.P 5.13 100 % isolates inhibited the
mycelial growth of Rhizoctonia solani. Secondary metabólitos produced by fungi
showed no antifungal activity. The isolated UFT.P 1.5.2 and UFT.P 1.6 were able
to synthesize AIA increasing concentrations of 57,00 µg.ml-1 and 73.26 µg.ml-1,
respectively, in the presence of L- tryptophan in the culture medium. None of the
isolated were able to solubilize calcium phosphate.
Keywords: biological control, secondary metabolites, auxin, fungicide
xii
1. INTRODUÇÃO
Os prejuízos causados por pragas e doenças na produção agrícola
estimulam a busca por recursos que reduzam a perda de produtividade. Para
isso, a aplicação de defensivos agrícolas na lavoura tem sido uma alternativa
adotada pelo agricultor para evitar perdas de produção. No entanto, sabe-se que
a composição química presente nesses produtos são tóxicas não apenas para
os organismos alvos, como também para o homem e o meio ambiente.
Em consequência, a busca por produtos alternativos no combate de
pragas e doenças de plantas tem ganhado destaque em diversas pesquisas, que
buscam moléculas ativas com reduzida toxicidade em derivados de plantas,
animais e microrganismos.
Entre essas substâncias, os óleos essenciais extraídos de plantas
aromáticas tem mostrado uma rica fonte de compostos ativos de ação isolada
ou sinérgicas. Os compostos originários do metabolismo de microrganismos,
também tem chamado a atenção de pesquisadores, por apresentarem um
arsenal de substâncias, além de vantagens sobre vegetais como a obtenção de
biomoléculas sem a necessidade de grandes espaços para produção da matéria
prima.
Além disso, junto ao controle biológico, estudos demostram a capacidade
desses microrganismos em disponibilizar nutrientes do solo e produzir moléculas
que auxiliam no crescimento da planta.
Dessa forma, o presente trabalho buscou avaliar a atividade antifúngica
de produtos de origem vegetal, como óleos essenciais e óleos fixos, assim como
a capacidade de fungos endofíticos em combater fitopatógeno de importante
interesse agronômico, além de investigar a capacidade desses em promover o
crescimento de plantas.
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Óleos essenciais
Os óleos essenciais, etéros ou essências, são misturas de substâncias
voláteis, lipofílicas, geralmente líquidas incolores e de odores característico
(SIMÕES e SPIDER, 2007). Possuem vasta aplicação em setores da
agroindústria, indústria farmacêutica, de cosmético e perfumarias, de alimentos,
entre outros segmentos. O Brasil tem ganhado destaque na produção mundial
de óleo essencial, no entanto a falta de padrão dos óleos e os baixos
investimentos governamentais no setor abalam o desenvolvimento na produção
dessa matéria prima (SOUZA, et al 2010).
Visto o leque de aplicações que esses compostos estão inseridos, o
potencial de produção de óleos essenciais apresenta-se promissor em seus
aspectos econômicos. Em alguns seguimentos, como no de alimentos, a
preocupação do consumidor frente a produtos sintéticos tem estimulado o uso
de produtos naturais (SCOLLARD et al, 2013). Isso somado a outras aplicações
contribuem para o incentivo em novas pesquisas, uma vez que, a produção em
países com grande biodiversidade os óleos essenciais surgem como um recurso
viável e bastante rentável. Atualmente, pesquisas brasileiras vêm tomando
repercussão internacional sobre o desenvolvimento de biotecnologias,
principalmente na agricultura, por gerarem riquezas através do uso adequado de
componentes da biodiversidade (MMA 2013).
Os metabolitos secundários produzidos pelas plantas são compostos
orgânicos que por muito tempo pareciam não ter função direta no seu
desenvolvimento. Atualmente sabe-se que muitos produtos desse metabolismo
possuem funções ecológicas importantes como: proteção da planta contra
microrganismos patogênicos e herbívoros, proteção contra raios UV, além de
agir como atrativos para animais polinizadores e dispersores de sementes. São
divididos em três grupos: terpenos, compostos fenólicos e compostos
nitrogenados (CUNHA et al 2005; TAIZ e ZEIGER, 2009).
No século dezenove, iniciou-se a investigação da composição química
destes óleos, levando a descoberta de alguns hidrocarbonetos isoméricos,
C6H16, denominando-os, terpeno. Mais tarde, após determinação da estrutura de
alguns terpenos, percebeu-se que eles poderiam ser múltiplos de uma unidade
14
estrutural básica pentacarbonada chamada isopreno (2-metil-1,3-butadieno)
(ALLINGER et al 2009; TAIZ e ZEIGER, 2009). Os terpenos apresentam-se
como o maior grupo de metabólitos secundários de origem vegetal. São
hidrocarbonetos e quando contém oxigênio são denominados terpenóides.
Várias plantas possuem misturas de monoterpenos, sesquiterpenos voláteis e
fenilpropanos, que podem ser geralmente acrescidos de moléculas menores,
como álcoois, ésteres, aldeídos e cetonas de cadeia curta, caracterizados como
óleos essenciais (CUNHA et al, 2005; ZEIGER e TAIZ, 2009; SOLOMOS e
FRYHLE, 2009).
Os óleos essenciais podem ser encontrados em pelos glandulares,
células parenquimáticas diferenciadas, canais oleíferos, ou em bolsas lisígenas,
além de flores, folhas, ou nas cascas dos caules, madeiras e frutos (CASTRO et
al 2005). São solúveis em solventes orgânicos apolares como éter e voláteis na
água apresentando limitada solubilidade, contudo, suficiente para aromatizar as
soluções aquosas sendo denominadas de hidrolatos (SIMÕES e SPIDER, 2007).
A obtenção desses compostos é alcançada, principalmente, pelo
processo destilação a vapor (SOLOMOS e FRYHLE, 2009).
2.2 Negramina (Siparuna guianensis)
Conhecida como, negramina, mata-cachorro e castigoso (ALVINO et al.,
2005), a Siparuna guianensis Aublet é um arbusto ou arvoreta monóico, que
pertence à família Monimiaceae, com aproximadamente 5 metros de altura,
alcançando um diâmetro na altura do peito de 20 cm; possui casca cinza e lisa
com pequenos ramos jovens cilíndricos, achatados nos nós, o sumo extraído das
folhas é popularmente aplicado no tratamento de alergias e ressecamento da
pele (ZANDONÁ, 2009; VALENTINI et al, 2010).
Segundo Renner e Hausner (2005) citado por Valentini et al (2010) o
gênero Siparuna envolve espécies de arbustos e arvoretas, com exceção para
15 espécies que são árvores de 20 a 40 metros de altura, com troncos com
diâmetros maiores que 120 cm, que ocorrem frequentemente na Amazônia. Os
frutos se apresenta como capsulas elipsóides deiscentes, de cor verde quando
15
jovens e quando maduros vinhos, que se abrem mostando o interior róseoavermelhado com as sementes (MONTANARI, 2010).
Figura 1. Folhas de negramina (Siparuna guianensis) (VALENTINI et al, 2010)
Em relação à produção de óleo essencial a planta apresenta alteração do
rendimento da composição volátil em função da sua fenologia e variações
meteorológicas locais, mostrando maior rendimento no período reprodutivo
(VALENTINI et al., 2010). Estudos como de Rangel (2010), avaliaram outras
espécies do gênero, como a Siparuma cubaja, onde foi possível apontar a
atividade antifúngica do extrato em leveduras de Candida ssp. e Cryptococcus
ssp. No Brasil, extratos de S. guianensis é utilizada na medicina popular como
inseticida (VALENTINI et al, 2010), em banhos contra espamos musculares,
dores de cabeça, febres e gripe (MONTANARI, 2010), comunidades do jalapão
no Tocantins, fazem o uso de infusão para analgesia (ROCHA-COELHO, 2012;
SANTOS, 2008a). Avaliando a composição química do óleo extraído das folhas
e frutos dessa planta coletados no cerrado brasileiro descobriram como
principais constituintes da folha o ácido decanoíco na proporção de 46,6% e o 2undecanona na de 31,7% (FISCHER et al., 2005).
16
2.3 Pinhão-manso (Jatropha curcas)
O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma espécie perene e monóica,
pertencente à família das Euforbiáceas, a mesma da mamona, é um arbusto ou
árvore com até quatro metros de altura, possivelmente nativo do Brasil.
(MARTINS
et
al,
2007;
LAVIOLA
e
DIAS,
2008).
Apresenta
bom
desenvolvimento em diversas regiões como nas tropicais secas, nas zonas
equatoriais úmidas, também em solos áridos e pedregosos, sendo capaz de
suportar extensos períodos de secas (PEIXOTO, 1973 apoud ARRUDA et al.,
2004). Essa oleaginosa tem sido utilizada em cultivo tanto para proteção do solo
contra erosão como para estabelecimento de cercas vivas, e suas folhas, seu
látex, sua casca e seu óleo são bem conhecidos da medicina tradicional
(SPINELLI, 2010). O pinhão manso tem chamado atenção em diversos estudos
por ser uma planta com um grande potencial como matéria-prima na produção
de biodiesel (PEREIRA, 2009).
A amêndoa e a semente do pinhão - manso são ricas em óleo (figura 2),
onde na amêndoa pode-se encontrar até 61% de óleo (SILVEIRA, 1934 apoud
ARRUDA et al., 2004). Spinelli et al (2010) em seu trabalho aponta maior
rendimento de óleo em plantas de maior produtividade de grãos e de maior
volume de copa.
Figura 3. Sementes de Pinhão-manso (ARRUDA, 2013)
17
A extração de óleo de sementes e tradicionalmente baseada no uso de
solventes orgânicos. O método mais utilizado e o processo de extração por
hexano (PEREIRA, 2009). O Pinhão manso (Jatropha curcas L.) está sendo
considerado uma opção agrícola para o semi-árido nordestino por ser uma
espécie nativa, exigente em insolação e com forte resistência a seca (ARRUDA
et al, 2004).
Até 1939, o principal emprego do óleo de pinhão manso era na saboaria
e na fabricação de estearina, mas devido, às necessidades militares, na segunda
Guerra Mundial, outras possíveis utilizações começaram a ser analisadas.
Também é utilizado em vários seguimentos da indústria como na fiação de lã, de
tinta para escrever, de impressão e para pintura, podendo ser utilizado como
óleo de lustrar e após tratamento, utilizado para envernizar móveis, no entanto
seu maior emprego ainda é nas saboarias (ARRUDA et al., 2004).
2.4 Gênero Eucalyptus
Membros do gênero Eucalyptus e Corymbia pertencem à família
Myrtaceae são originários da Austrália, mas tem sido naturalizadas na maioria
dos continentes, sendo representado por mais de 600 espécies e uma grande
diversidade
de
variedades,
incluindo
híbridos
naturais
e
artificiais
(MULYANINGSIH et al, 2010; GARCIA et al, 2013).
São conhecidas cerca de 400 espécies de Eucalyptus que apresentam
óleos voláteis de composições bastante diversificadas (SIMÕES; SPITZER,
2007). Existem muitas atividades biológicas atribuídas a certas espécies de
eucaliptos, como por exemplo, óleos essenciais das espécies E. citriodora, E.
globulus e E. staigeriana que apresentaram efeito acaricida contra o carrapato
de bovinos, Boophilus microplus, em concentrações de 17,5%, 15% e 12,5%
(CHAGAS et al., 2002).
Grande parte das plantações de eucaliptos no Brasil estão destinados a
produção de papel e carvão, porém tem aumentado o uso dessas espécies para
madeira, na construção civil e para extração de essências (SILVA; BRITO;
SILVA, 2006).
Devido a sua atoxicidade para o homem e para o meio ambiente o
óleo essencial de eucalipto torna-se um produto de baixo impacto ambiental
18
(PIATI et al, 2011) além do efeito toxico sobre muitos microrganismos diversas
pesquisas tem avaliado o efeito antifúngico do óleo essencial de espécies de
Eucalyptus (SOUZA et al, 2004; VILELA, 2007; PIATTI et al, 2011).
2.5 Microrganismos endofíticos e controle biológico
A microbiota existente no interior dos tecidos e órgãos vegetais que
aparentemente não causam danos a seu hospedeiro recebe a denominação de
endofítica. Como não existe um limite claro entre os grupos, mas sim um
gradiente entre eles, os conceitos de microrganismos endofíticos, epifíticos e
patogênicos são apenas distinções de natureza didática. Logo, um fungo
endofítico, conforme as condições do ambiente pode tornar-se um patógeno;
assim como um microrganismo epifítico pode, entrar em uma planta
permanecendo por certo período sem causar danos à mesma (AZEVEDO,
1999). Geralmente, os microrganismos endofíticos penetram nas plantas por
meio de aberturas naturais ou ferimentos. Eles penetram principalmente pelas
raízes, pelo fato de apresentarem abrasoes durante a emergência de raízes
secundarias laterais (ROCHA, 2007). Da relação simbiótica entre esses fungos
e a planta hospedeira funções relevantes para sanidade vegetal são
desempenhadas,
protegendo
as
plantas contra
pragas
e
patógenos,
aumentando o crescimento, enraizamento, resistência a estresses, além de
produzir compostos químicos como enzimas, alcalóides, hormônios e
antibióticos (PEIXOTO NETO et al., 2002).
As espécies de fungo envolvidas na colonização de plantas podem variar
de acordo com o hospedeiro, distribuição geográfica, idade da planta, condições
ecológicas e sazonais, incluindo-se a altitude e precipitação (PIMENTEL et al,
2010).
Microrganismos endofíticos têm sido estudados no controle biológico de
pragas e doenças (LI et al, 2012; SBRAVATTI JÚNIOR et al, 2013; YANG et al,
2013). Muitas das abordagens para controle biológico de doenças de plantas
usam apenas um agente de controle, no entanto a aplicação de um único
endofítico pode está sujeito a um declínio acentuado da população durante as
diferentes fases de crescimento da planta (HARDOIM et al, 2012).
19
Os microrganismos endofíticos habitam um nicho ecológico semelhante
aos habitados por fitopatógenos, dessa forma, podendo controlá-los por
competição de nutrientes, produção de substâncias antibióticas, parasitando o
patógeno ou até mesmo utilizando mecanismos que induzam a planta
desenvolver mecanismos de resistência (AZEVEDO et al, 2002).
2.6 Microrganismos e promoção do crescimento de plantas
Os microrganismo endofíticos são capazes de produzir metabólitos que o
auxiliam na colonização, adaptação e propagação no hospedeiro. Esses
compostos atuam tanto na competição com outros microrganismos como
também na promoção do crescimento vegetal (AZEVEDO et al, 2002). Diversos
mecanismos estão envolvidos na capacidade de estimular o crescimento vegetal
apresentada por esses organismos, que podem ser diretos tais como fixação do
nitrogênio e produção de fitohormônios, e indiretos como antagonismo a
fitopatógeno (LUZ et al, 2006).
Entre os fitohormônios produzidos por endofíticos, uma auxina
denominada ácido indol-3-acético é a mais estudada.
O termo auxina é usado para compostos que apresentam capacidade de
induzir a elongação celular nos vegetais (CHITARRA; CHITARRA, 2005). O
ácido indol-3-acético (AIA) é a auxina mais abundante e de maior relevância
fisiológica em vegetais superiores (TAIZ; ZEIGER, 2009). Dependendo da
espécie, da idade da planta e da estação do ano, outras auxinas naturais podem
ser encontradas como o ácido-4-cloroindolil-3-acético (4-cloro AIA), o ácido
fenilacético e o ácido indol-3-butírico (AIB) (MERCIER, 2004).
O Catabolismo do AIA pode ser mediado pela ação enzimática da IAAoxidase, ou de forma não enzimática por oxidação direta pelo peróxido de
hidrogênio, luz e radiação ultravioleta (CHITARRA; CHITARRA, 2005).
Perspectivas na aplicação de microrganismos capazes de sintetizar essas
substâncias tem ganhado destaque em trabalhos que buscam alternativas para
promoção de crescimento de plantas de maneira sustentável e menos
agressivas ao meio ambiente (LUZ et al, 2006).
20
Além da produção de hormônios vegetais, os microrganismos endofíticos
também podem atuar na disponibilização de nutrientes essenciais para o
desenvolvimento da planta. Entre esses, destaca-se o fosforo.
No Brasil, devido à baixa fertilidade do solo, a demanda por recursos
corretivos e fertilizantes como os fosfatados, é bastante expressiva, fazendo do
fósforo um recurso estratégico para o país, pois sem esse a produção agrícola é
limitada (MARRA, 2012)
O fósforo é essencial para o desenvolvimento da planta, uma vez que
satisfaz os dois critérios da essencialidade, que podem ser diretamente pela
participação de compostos e reações vitais para as plantas, e indiretamente
porque na sua ausência a planta não completa seu ciclo de vida, não podendo
ser substituído por outro elemento (ALMEIDA JUNIOR, 2009).
2.7 Doenças radiculares
Os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, são fungos causadores
de diversas doenças como trombamento, podridão de raízes, podridões de colo
e murchas, eles não produzem esporos e apresentam micélio e estruturas de
sobrevivência como esclerócios e estão diretamente envolvidos em doenças
originárias do solo como as doenças radiculares (MICHEREFF et al, 2005)
Quando comparadas com as doenças foliares as doenças radiculares
recebem pouca atenção principalmente quando os sintomas ficam confinados às
raízes, isso acontece devido à dificuldade de detecção dos sintomas abaixo do
solo, além de fatores que envolvem a interação hospedeiro-patógeno-ambiente,
onde o desenvolvimento da doença pode ser influenciado de maneira direta e/ou
indireta por características bióticas e abióticas (MICHEREFF et al, 2005). A
melhor medida para o controle dessas doenças em áreas extensivas é a rotação
de culturas. Contudo, quando os fungos apresentam habilidade de competição
saprofítica, ou desenvolvem estruturas de resistência, medidas como a rotação
de culturas não é economicamente viável (TOLÊDO-SOUZA, 2009).
O fungo Rhizoctonia solani, comum nas regiões de altas temperaturas,
chuvosas e com alta umidade, é o principal agente causador da mela, ou murcha
da teia micélica. Essa enfermidade está associada geralmente a fase
21
teleomófica do fungo, Thanatephorus cucumeris, apresentando-se como um
fator limitante do cultivo do feijoeiro nos trópicos (NECHET; HALFELD-VIEIRA,
2007; SARTORATO et al, 1994; SARTORATO et al, 1996). Esse fungo vive no
solo na forma de esclerócios, uma estrutura de resistência, e não gera esporos
assexuados (HUANG et al. 2011). A mela afeta toda a parte aérea da planta
caracterizada principalmente por dois tipos de sintomas, um produzido pelo
micélio e escleródio e o outro por basidiósporos que podem ser observados
principalmente na folha. No início os sintomas se manifestam por pequenas
lesões circulares de crescimento rápido que coalescem formando manchas
viscosas e de aspecto aquoso em grande área do folíolo, podendo provocar
queda das folhas e às vezes até morte das plantas. É uma doença de difícil
controle, e os fungicidas usados no controle químico, apesar de caros, nem
sempre apresentam resultados satisfatórios (SATORATO et al, 1994;
SOBRINHO et al, 2005). As principais medidas de controle recomendadas para
a mela do feijão encontradas na literatura são evitar o plantio em áreas de
elevada umidade e a eliminação dos restos de cultura (SOBRINHO et al., 2005;
NECHET; HALFELD-VIEIRA, 2007).
No feijoeiro, R. solani pode apresentar diversos sintomas, como
tombamento pré ou pós emergente, podridão de raízes e colo e podridão de
vagens (TOLÊDO-SOUZA et al, 2009).
O fitopatógeno Sclerotium rolfsii Sacc. é um fungo com capacidade de
afetar um grande número de hospedeiros, principalmente em regiões tropicais.
Ele pode causar tombamento de mudas e podridão do coleto e raízes resultando
em murcha, o que, na maioria das vezes, culmina com a morte da planta
(DUARTE et al, 2006; MARTINS et al, 2010).
hifas
ou
escleródios
infectam
a
Em condições favoráveis,
planta
e,
posteriormente,
colonizam e invadem a raiz e o caule com o típico micélio branco sedoso
(MULLEN, 2001).É uma da doença de difícil controle porque as estruturas de
resistência do patógeno capaz de infectar o hospedeiro, mesmo em condições
ambientais desfavoráveis, conseguem permanecer viáveis no solo por longo
tempo (DUARTE et al, 2006). Diversos métodos tem sido utilizado para o
controle de S. rolfsii como o tratamento químico que atualmente encontra-se
como o principal método de controle para reduzir a incidência desse patógeno,
22
onde o brometo de metilo é o principal defensivo utilizado mundialmente para a
desinfestação do solo (MICHEREFF et al, 2005).
23
Capítulo I
ATIVIDADE
ANTIFÚNGICA
DE
NEGRAMINA
(Siparuna
guianensis
AUBLET), EUCALIPTO (Eucalyptus globulus) E PINHÃO MANSO (Jatropha
curcas L.) SOBRE OS FITOPATÓGENOS Rhizoctonia solani E Sclerotium
rolfsii
24
Atividade antifúngica de negramina (Siparuna guianensis AUBLET),
eucalipto (Eucalyptus globulus) e pinhão manso (Jatropha curcas L.)
sobre os fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii
RESUMO
Objetiva-se avaliar as propriedades antifúngicas de três espécies vegetais:
Eucalyptus globulus, Siparuna guianensis e Jatropha curcas, contra os
fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerottium rolfsii encontrando a
concentração ideal para inibição do crescimento micelial desses fungos e
investigar possíveis efeitos sinérgicos na combinação desses óleos testados em
diferentes concentrações. Nos ensaios de inibição do crescimento micelial foram
testados 5 concentrações (0 µl.ml-1, 0,5 µl.ml-1, 1 µl.ml-1 e 1,5 µl.ml-1, 2,0 µl.ml-1)
em 4 períodos (24, 48, 72, 96 horas) do óleo bruto de pinhão – manso, negramina
e eucalipto. Os óleos foram inseridos em meio BDA acrescido de 1% de tween
80. Discos de 5,0 mm de diâmetro contendo micélio do patógeno foram
transferidos para o centro de cada placa que foram incubadas por 4 dias e a
cada 24 horas o crescimento micelial do patógeno foi avaliado. O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 6 (doses) x 4
(tempos), com 3 repetições. O óleo essencial de Eucalyptus globulus inibiu
totalmente o crescimento micelial de R. solani nas doses de 1,0 µl.ml-1, 1,5 µl.ml1, 2,0 µl.ml-1 em todos os períodos de avaliações de S.rolfssii períodos de 24 h,
72 h e 48h, com exceção da dose de 2,0 µl.ml-1 que inibiu o crescimento micelial
em todos os tempos. O óleo de Siparuna guianensis possui como componente
marjoritario o mirceno (74,93%), e nas concentrações de 1,5 µl.ml-1 e 2,0 µl.ml-1
reduziram o cresciemento dos fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. As
associações 1 e 2 nas concentrações 1,5 µl.ml-1 e 2 µl.ml-1 inibiram totalmente o
crescimento micelial dos fitopatógenos. O óleo de Jatropha curcas não
apresentou atividade antigúngica.
Palavras-chave: fungitoxidade, controle alternativo, crescimento micelial
25
Antifungal activity of plant species Negramine (Siparuna guianensis
Aublet), Eucalyptus (Eucalyptus globulus) and Jatropha (Jatropha curcas
L.) on plant pathogens Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii
ABSTRACT
The objective is to evaluate the antifungal properties of three plant species:
Eucalyptus globulus, Siparuna guianensis and Jatropha curcas, against plant
pathogens Rhizoctonia solani and Sclerottium rolfsii finding the optimal
concentration for inhibition of mycelial growth of these fungi and to investigate
possible synergistic effects of the combination of these oils tested in different
concentrations. In inhibition assays of mycelial growth five concentrations (0,0
μl.ml -1 , 0,5 μl.ml -1, 1,0 μl.ml -1, 1,5 μl.ml -1, 2,0 μl.ml -1) in 4 periods (24, 48, 72,
96 hours) of crude oil of Jatropha - Jatropha , negramine and eucalyptus. The
oils were placed on PDA plus 1 % Tween 80. Disks 5,0 mm in diameter containing
mycelium were transferred to the center of each plate were incubated for 4 days
and every 24 hours mycelial growth of the pathogen was evaluated. The
experimental design was completely randomized factorial 6 (doses) x 4 (time)
with 3 replications. The essential oil of Eucalyptus globulus completely inhibited
the mycelial growth of R. solani in doses of 1,0 μl.ml -1, 1,5 μl.ml -1 , 2,0 μl.ml -1 in
all periods of reviews S.rolfsii periods of 24 h, 48 and 72 h, with except for the
dose of 2,0 μl.ml -1 that inhibited mycelial growth at all times. The oil Siparuna
guianensis has the marjoritario as myrcene (74.93 %) component, and at 1 μl.ml
-1, 1,5 μl.ml -1, and 2,0 μl.ml -1 reduced the fungal growth Sclerotium rolfsii and
Rhizoctonia solani. Associations 1 and 2 at concentrations 1,5 μl.ml -1 and 2,0
μl.ml -1 completely inhibited the mycelial growth of pathogens. The oil from
Jatropha curcas antifungal showed no activity.
Keywords: fungitoxic, alternative control, mycelial growth.
26
1. INTRODUÇÃO
O uso abusivo de produtos químico no controle de fitopatógenos vem
provocando graves consequências ambientais. Esse consumo é efeito da busca
por benefícios imediatos encontrados na aplicação de defensivos químicos como
aumento da lucratividade e a rápida paralisação ou eliminação dos sintomas da
doença (BENCHIMOL et al, 2008). Uma importante fonte de defensivos agrícolas
no combate a doenças de plantas são os produtos naturais de origem vegetal e
seus análogos (SILVA e BASTOS, 2007). Assim, diversos óleos têm sido
largamente investigados contra fitopatógenos de diversas culturas como, por
exemplo, de mamão, maracujá e cacau (SILVA e BASTOS 2007; CARNELOSSI
et al, 2009; SOUZA JUNIOR et al, 2009).
O metabolismo das plantas pode ser dividido em metabolismo primário e
secundário. O primário sempre foi considerado essencial a todas as espécies, e
é responsável pelo desenvolvimento e manutenção celular, participando desse
processo substâncias como carboidratos, lipídeos, proteínas, clorofila e ácidos
nucleicos (PROBST, 2012).
Nas últimas décadas, com o esclarecimento das centenas de
componentes dos óleos essenciais, foi possível compreender a complexidade e
a enorme diversidade que existe neste grupo de produtos naturais (FRANZ,
2010). A variabilidade das quantidades e dos perfis dos componentes de óleos
essenciais aponta que a sua atividade antimicrobiana não se atribua a um único
mecanismo, mas sim, a diversos locais de ação a nível celular (DJILANI e
DICKO, 2012).
Estudos que investigam a atividade de óleos essências, ou compostos
derivados do metabolismo primário de planta como óleos extraídos de sementes,
tem ganhado força em pesquisas que busca controle de agentes causadores de
doenças em vegetais que, muitas vezes, levam a significativas perdas de
produção, contaminação de grãos durante a estocagem, diminuição dos valores
nutritivos além da produção de micotoxinas prejudiciais ao homem e aos animais
(SANTOS et al, 2010; VELLUTI et al, 2004). A ação antimicrobiana de óleos
essenciais em diversas pesquisas como a de Silva e Bastos (2007) que
avaliaram a atividade fungitóxica de espécies de Piper spp. em Crinipellis
perniciosa, Phytophthora palmivora e Phytophthora capsici, mostram resultados
significativos de algumas espécies contra esses fitopatógenos contribuindo na
27
busca de defensivos agrícolas. Além disso, a exportação de essências de
interesse industrial estimula o cultivo de culturas produtoras desses compostos.
Os métodos preliminares para avaliação de interações de substâncias
foram desenvolvidos para a detecção de sinergismo de drogas, portanto, não há
método padronizado desenvolvido para avaliar a interação entre óleos
essenciais ou seus componentes (MACKAY et al, 2000).
Entende-se por sinergismo quando a ação de uma droga é facilitada ou
aumentada por outra, ocorrendo sinergismo aditivo quando o efeitos das duas
drogas se somam e sinergismo potenciador quando o efeito da associação é
maior do que os efeitos individuais dos componentes ou da soma dos mesmos.
Já o efeito antagônico caracteriza-se pela inibição ou redução de uma droga por
outra (SILVA, 2010). A ausência de interações é definida como indiferença
(BASSOLÉ e JULIANI, 2012).
Na busca do controle alternativo de microrganismos causadores de
doenças em culturas importantes, objetivou-se com esse trabalho avaliar as
propriedades antifúngicas de três óleos: Eucalyptus globulus, Siparuna
guianensis e Jatropha curcas, contra os fitopatógenos Rhizoctonia solai e
Sclerottium rolfsii encontrando a concentração ideal para inibição do crescimento
micelial desses fungos e investigar possíveis efeitos sinérgicos na combinação
desses óleos testados em diferentes concentrações.
28
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Locais do experimento
A extração do óleo essencial de Siparuna guianensis e Jatropha curcas
foram conduzidas no laboratório de Malerbologia da Universidade Federal do
Tocantins (UFT), Campus de Gurupi.
Os ensaio de inibição de crescimento micelial dos experimentos foram
realizados no Laboratório de Microbiologia da UFT, Campus de Gurupi.
2.2 Coleta e extração dos óleos
As folhas de Siparuna guianensis foram obtidas na Fazenda Floresta,
coordenadas geográficas 10°37’10’’S e 49°27’59’’O e altitude de 290, e
armazenadas no laboratório de Malerbologia da UFT. A obtenção do óleo de
Siparuna guianensis, foi feita por meio de hidrodestilação por arraste a vapor
pelo método de Clevenger. O óleo extraído foi conservado em ampolas de vidro
âmbar a temperatura de 4 °C.
As sementes de Jatropha curcas L. foram obtidas na UFT pelo laboratório
de Malerbologia. O óleo foi extraído, pela técnica extração contínua via extrator
de soxhlet, das sementes trituradas de pinhão- manso, utilizando como solvente
hexano e álcool na proporção de 1:8 em um tempo de extração de três horas.
Após a destilação o produto foi levado a um evaporador rotativo para retirada
dos solventes e óleo obtido armazenado em frasco âmbar a 4 °C. (PEREIRA,
2009).
O óleo essencial de Eucalipto (Eucalyptus globulus), extraído por arraste
a vapor foi fornecido pela empresa JUMP Florestal localizada no município de
Dueré-TO.
2.3 Obtenção dos Fitopatógenos
A amostra dos patógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii foram
obtidas do laboratório de Fitopatologia da UFT.
29
2.4 Ensaios Microbiológicos
2.4.1 Atividade antifúngica dos óleos isolados
Nos ensaios de inibição do crescimento micelial foram testados 5
concentrações (0 µl.ml-1, 0,5 µl.ml-1, 1 µl.ml-1, 1,5 µl.ml-1, 2,0 µl.ml-1) em 4
períodos (24, 48, 72, 96 horas) do óleo bruto de pinhão – manso (Jatropha curcas
L.), negramina (Siparuna guianensis Aublet), eucalipto (Eucalyptus globulus
Labill) seguindo a metodologia usada por Silva e Bastos (2007). Como referência
uma placa controle contendo os fungos desenvolvendo-se apenas no meio de
cultura sem óleo e o controle positivo contendo 1,11 µl.ml-1 do fungicida APRON
RFC® no meio cultura, segundo a dosagem sugerida na bula do fungicida que
indicava uma concentração de 100 ml pra cada 100 kg de semente, sendo os
valores ajustados para as condições do experimento.
Os óleos analisados foram inseridos em meio BDA (batata Agar dextrose)
acrescido de 1% de tween 80 e vertidos em placas de 80 mm de diâmetro. Após
solidificação do meio, discos de 5,0 mm de diâmetro contendo micélio do
patógeno foram transferidos para o centro de cada placa que foram incubadas
em estufa B.O.D a 28 °C por 4 dias. A cada 24 horas o crescimento micelial do
patógeno foi avaliado através da medição do diâmetro da colônia (média de duas
medidas diametralmente opostas com auxílio de um paquímetro).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema
fatorial 6 (doses) x 4 (tempos), com 3 repetições sendo as médias comparadas
pelo teste Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se como instrumento
estatístico o programa ASSISTAT versão 7.7 beta (SILVA; AZEVEDO, 2009).
2.5.2 Atividade antifúngica das combinações dos óleos
Foi avaliado o efeito da associação entre os óleos, obtendo-se assim três
tratamento constituídos de: eucalipto + negramina (associação 1), eucalipto +
pinhão manso (associação 2) e pinhão-manso + negramina (associação 3)
preparados na proporção de 1:1 como concentração inicial. Essas associações
foram submetidas à seguidas diluições no meio de cultura obtendo-se as
concentrações de 0,0 µl.ml-1, 0,5 µl.ml-1, 1 µl.ml-1; 1,5 µl.ml-1 e 2,0 µl.ml-1 assim
como os óleos isolados. Como referência foi ultilizado uma placa controle
contendo os fungos desenvolvendo-se apenas no meio de cultura sem óleo e o
30
controle positivo contendo 1,11 µl.ml-1 do fungicida APRON RFC® no meio
cultura. Os óleos analisados foram inseridos em meio BDA (batata Agar
dextrose) acrescido de 1% de tween 80 fundente e vertidos em placas de 80 mm
de diâmetro. Após solidificação do meio, discos de 5,0 mm de diâmetro contendo
micélio do patógeno foram transferidos para o centro de cada placa que foram
incubadas em estufa B.O.D a 28° C por 4 dias. A cada 24 horas o crescimento
micelial do patógeno foi avaliado através da medição do diâmetro da colônia
(média de duas medidas diametralmente opostas com auxílio de um
paquímetro).
Para análise do tipo de interação apresentada pelas associações, utilizouse como critério a metodologia utilizada por Zhou et al. (2007) com modificações
e adequações para crescimento de fungos filamentosos. Nesse método o efeito
sinérgico ou antagônico das associações foram conceituados de acordo com as
diferenças significativas submetido à análise de variância.
O delineamento experimental nos ensaios foi inteiramente casualizado em
esquema fatorial 3 (tratamentos) x 6 (doses) x 4 (tempos) comparando-se o
desempenho das associações com os óleos isolados, sendo as médias
comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se como
instrumento estatístico o programa ASSISTAT versão 7.7 beta (SILVA e
AZEVEDO, 2009).
31
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi possível observar a atividade antifúngica dos óleos analisados em
diferentes períodos de crescimento. Onde a análise de variância (Tabela 1)
mostrou que as variações em função da dose e do tempo de avaliação e as
interações entre eles foram significativas a 1% de probabilidade para os
fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
Tabela 1. Resumo da análise de variância do crescimento micelial (mm) de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii submetidos a diferentes concentrações de
óleos avaliados em quatro épocas.
Rhizoctonia solani
Fontes de
Eucalyptus globulus
Siparuna guianensis
Jatropha curcas
variação
GL1
QM2
QM
QM
Doses
5
2773,33**
2121,96**
1998,72**
Tempo
3
561,26**
2856,69**
9699,62**
Doses x tempo
15
404,61**
293,09**
443,91**
Tratamentos
23
939,98**
1025,05**
1989,18**
Resíduo
48
5,91**
18, 03**
86,18**
Coeficiente de
35,59 %
variação
27,13 %
40,24 %
Sclerotium rolfsii
Fontes de
Eucalyptus globulus
Siparuna guianensis
Jatropha curcas
variação
GL1
QM2
QM
QM
Doses
5
3677,67**
3083,52**
4768,65**
Tempo
3
1401,01**
10923,45**
11804,51**
Doses x tempo
15
480,48**
449,65**
487,67**
Tratamentos
23
1295,59**
2388,38**
2894,43**
Resíduo
48
5,82**
8,97**
9,79
Coeficiente de
variação
22,89%
9,63%
7,77%
**Significativo a 1% de probabilidade; ¹G.L.: Grau de liberdade; ²Q.M.:Quadrado médio.
.
Observa-se que o óleo essencial de Eucalyptus globulus exerceu
atividade inibitória sobre o Rhizoctonia solani nas concentrações de 1 µl.ml-1, 1,5
µl.ml-1 e 2 µl.ml-1, a partir de 24 h de crescimento inibindo todo o crescimento
micelial do fungo, não apresentando diferença estatística com o tratamento com
o fungicida comercial Apron RFC. O óleo essencial de Siparuna guianensis
apresentou efeito sobre Rhizoctonia solani na concentração de 2 µl.ml-1 nos
32
períodos de 24 h, 48 h e 72 h, já as concentrações de 1 µl.ml-1, 1,5 µl.ml-1 e 2
µl.ml-1 nos períodos de 48 h, 72 h e 96 h apesar de não demostrarem a mesma
eficiência que o princípio ativo comercial apresentaram ação inibitória sobre o
fungo quando comparados com o tratamento contendo a concentração de 0
µl.ml-1 (Tabela 2).
Quanto à ação inibitória no crescimento micelial do fungo Rhizoctonia
solani sob efeito do óleo extraído da semente de Pinhão manso (Jatropha
curcas) foi observado que o mesmo não apresentou atividade antifúngica sobre
os patógenos.
O fungo Rhizoctonia solani é um fitopatógeno que afeta inúmeras culturas
em todo o mundo. Estudos que relatam a fungitoxicidade de extratos e óleos
essenciais de plantas sobre o fungo R. solani, como o de Brum (2012) mostram
que a utilização de tais compostos são promissores para o controle alternativo
deste patógeno, já que é possível perceber a variação do crescimento do fungo.
No trabalho de Piati et al (2011), concentrações maiores que 2,5 µl.ml-1
do óleo de Eucalyptus globulus demonstraram efeito inibitório sobre Penicillium
sp. um agente causal de doença pós-colheita em citros. Quando comparado com
a atividade inibitória de outros óleos essenciais sobre Rhizoctonia solani,
Pragadheesh et al (2013) observaram completa inibição no crescimento desse
fitopatógeno sob efeito do óleo essencial de Ocimum canum (manjericão).
Outros estudos também demostram a ação de óleos essenciais sobre R.
solani e S. rolfsii. Benini et al. (2010) testaram concentrações de 20, 40 e 60 µL
do óleo essencial de Ocimum gratissimum sobre esses patógenos, e observaram
inibição total do crescimento dos fungos em todas as concetrações testadas.
Hillen et al. (2012) relata que o óleo essencial de candeia (Eremanthus
erythropappus) inibiu o crescimento micelial de Rhizoctonia solani nas
concentrações 20, 40, 60, 100, 200, 500 e 1000 μL em 20 ml de meio.
As tabelas 2 e 3 revelam que o não houve diferença significativa no
crescimento micelial dos fitopatógenos sob efeito do óleo extraído da semente
de Pinhão manso (Jatropha curcas). Guedes (2009) em seu trabalho não
encontrou efeito fungicida do óleo de Jatropha curcas L. contra fungos
patogênicos de sementes de Bauhinia forticata nas concentrações de 30, 50, 70
e 100%.
33
Tabela 2. Efeito in vitro dos óleos essenciais de Eucalyptus globulus e Siparuna
guianensis, e do óleo de Jatropha curcas em diferentes concentrações sobre o
crescimento micelial de Rhizoctonia solani, em diferentes períodos de avaliação.
Concentração
(µl.ml-1)
0,0
0,5
1,0
1,5
2
Fungicida
24 h
Eucalyptus globulus
Tempo
48 h
72h
96 h
6.71 Ad
22.14 aC
50.86 aB
71.29 aA
0.00 Bb
0.00 bB
2.06 bB
10.87 bA
0.00 Ba
0.00 bA
0.00 bA
0.00 cA
0.00 bA
0.00 bA
0.00 bA
0.00 cA
0.00 bA
0.00 bA
0.00 bA
0.00 cA
0.00 bA
0.00 bA
0.00 bA
0.00 cA
Siparuna guianensis
0,0
0,5
1,0
1,5
2
Fungicida
6.71 aD
22.14 aC
50.86 aB
71.29 aA
7.20 aC
16.27 abC
26.43 bB
40.53 bA
0.00 aC
8,70 bcBC
17.22 bcB
32.43 bA
0.00 aC
7,10 bcBC
14.53 cB
30.55 bA
0.00 aB
4.82 cB
4.12 dB
14.78 cA
0.00 aA
0.00 cA
0.00 dA
0.00 dA
Jatropha curcas
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Fungicida1
6.71 aC
22.14 aC
50.86 aB
71.28 aA
0.00 aB
4.39 aB
18.33 bcB
56.85 aA
0.00 aC
15.26 aC
44.25 aB
66.16 aA
0.00 aC
7.75 aC
31.49 abB
60.00 aA
0.00 aC
4.38 aC
29.71 abB
64.12 aA
0.00 aA
0.00 aA
0.00 cA
0.00 bA
1
Apron RFC: 100 ml/100 kg
*Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e médias seguidas da mesma letra
maiúscula na linha não diferem entre si significativamente a 5% de probabilidade, pelo teste de
Tukey.
O óleo essencial de Eucalyptus globulus demosntrou ação inibitória sobre
o crescimento micelial de Sclerotium rolfsii a partir da concentração de 0,5 µl.ml1
em todos os tempos de avaliação onde nas concentrações de 1,0 µl.ml-1, 1,5
µl.ml-1, 2,0 µl.ml-1 o crescimento do fitopatógeno foi totalmente inibido nos
períodos de 24 h, 48 h e 72 h. A concentração de 2,0 µl.ml-1 foi a de maoir ação
fungicida, uma vez que impediu o desenvolvimento do fungo em todas os tempos
testados obtendo resultados similares ao fungicida comercial (Tabela 3).
34
O óleo essencial de Siparuna guianensis inibiu o cresciemento micelial do
fitopatógeno Sclerotium rolfsii nas concrentrações de 1,0 µl.ml-1, 1,5 µl.ml-1 e 2,0
µl.ml-1 com 24 h de crescimento, contudo, a partir de 48 h de incubação foi
possível observar o desenvolvimento do patógeno. Uma explicação para o não
desenvolvimento do fungo no período 24 h pode ser o devido o tempo de
adaptação do fungo ao meio com a presença do óleo, interferindo assim no seu
tempo de crescimento. As concetrações de 1,5 µl.ml-1 e 2,0 µl.ml-1 não inibiram
totalmente o crescimento micelial do patógeno, no entanto, foi observado
redução no seu crescimento quando comparados com a concetração 0,0 µl.ml-1
(Tabela 3).
O óleo de Jatropha curcas não apresentou ação fungitóxica contra S.
rolfsii e observando as concentrações de 0,5 µl.ml-1, 1,0 µl.ml-1, 1,5 µl.ml-1 e 2,0
µl.ml-1 nos períodos de 48 h e 72 h o diâmetro da colônia fúngica apresentou-se
maior que na dose 0,0 µl.ml-1.
Outros trabalhos avaliaram a eficiências de óleos essenciais na inibição
desse fitopatógeno. Benini et al. (2010) testaram doses de 20, 40 e 60 µL do óleo
essencial de Ocimum gratissimum sobre S. rolfsii, e observaram inibição total do
crescimento dos fungos em todas as doses testadas.
Avaliando o efeito do óleo essencial de espécies de Copaifera sobre
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, Oliveira et al (2006) demonstraram maior
efeciencia desses extratos na redução do crescimento micelial sobre Rhizoctonia
solani. A diferença dos constituintes da parede celular desses fitopatógenos
podem admitir maior resistência do Sclerotium rolfsii aos tratamentos químicos
que o Rhizoctonia solani, uma vez que, segundo Fukuda et al (2009) a
composição química da parede celular dos fungos é bastante complexa,
constituída principalmente por polissacarídeos, ligados ou não a proteínas ou
lipídeos, polifosfatos e íons inorgânicos formando a matriz de cimentação. Tendo
tambem quitina, glucanas, galactomananas, manoses e proteínas como
compostos mais freqüentes, embora suas quantidades variem entre as
diferentes espécies de fungos.
35
Tabela 3. Efeito in vitro dos óleos essenciais de Eucalyptus globulus e Siparuna
guianensis, e do óleo de Jatropha curcas em diferentes concentrações sobre o
crescimento micelial de Sclerotium rolfsii, em diferentes períodos de avaliação.
Eucalyptus globulus
Tempo
Concentração
(µl.ml-1)
24 h
48 h
72h
96 h
0,0
8.17 aD
30.83 aC
57.83 aB
79.33 aA
0,5
0.00 bD
7.16 bC
18.33 bB
38.33 bA
1,0
0.00 bB
0.00 cB
0.00 cB
8.00 cA
1,5
0.00 bA
0.00 cA
0.00 cA
5.16 cdA
2,0
0.00 bA
0.00 cA
0.00 cA
0.00 dA
Fungicida1
0.00 bA
0.00 cA
0.00 cA
0.00 dA
Siparuna guianensis
0,0
8.16 aD
30.83 aC
57.83 aB
79.33 aA
0,5
5.66 abD
28.50 abC
57.50 aB
73.33 abA
1,0
0.00 bD
24.91abC
52.50 abB
71.66 bcA
1,5
0.00 bD
21.33 bcC
49.66 bcB
64.75 cdA
2,0
0.00 bD
17.50 cC
44.16 cB
58.83 dA
Fungicida1
0.00 bA
0.00 dA
0.00 dA
0.00 eA
Jatropha curcas
0,0
8.16 aD
30.83 bC
57.83 cB
79.33 aA
0,5
9.33 aD
34.16 abC
62.66 bcB
77.33 aA
1,0
13.00 aD
39.33 aD
68.33 abB
80.00 aA
1,5
12.66 aC
40.25 aB
73.50 aA
80.00 aA
2,0
11.16 aD
38.33 abC
70.20 abB
80.00 aA
Fungicida1
0.00 bA
0.00 cA
0.00 dA
0.00 bA
1
Apron RFC: 100 ml/100 kg
*Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e médias seguidas da mesma letra
maiúscula na linha não diferem entre si significativamente a 5% de probabilidade, pelo teste de
Tukey.
A identificação da composição química de extratos naturais é uma
importante ferramenta na prospecção de novos produtos (LORENZETTI et al,
2011). De acordo com Valentini (2010), a composição dos óleos essenciais da
Siparuna guianensis Aublet sofre alterações de acordo com a região ou até com
36
as estações do ano. Na composição química do óleo essencial dessa espécie,
foram encontrados monoterpenos, sesquiterpenos, álcoois sesquiterpenos e
duas cetonas alifáticas, 2-undecanona e 2- tridecanona. O α- pineno, mirceno,
γ-cadineno, epi- α - cadinol estavam presentes em todas as amostras, mas o epiα -cadinol (39,9%) foi sempre o maior componente, exceto para óleos das cascas
e frutos, cujos maiores componentes foram respectivamente terpinoleno (33,4%)
e 2-undecanona (52,7%) (VIANA, 2002).
Ainda quanto à função dos constituintes da planta, a presença de mirceno
pode estar relacionada às propriedades medicinais contidas na mesma (SILVA,
2006). O mirceno é um monoterpeno encontrado em muitos óleos essenciais
exercendo importante papel na atividade expressada pelo óleo das folhas, além
disso, a ação sinérgica associada à outros componentes químicos presentes no
óleo essencial não deve ser desprezada, normalmente os efeitos sinérgicos
podem ser observados facilmente em compostos fenólicos e não fenólicos
(SANTOS et al, 2008a).
A atividade fungitóxica dos óleos essenciais que inibem ou reduzem o
crescimento micelial, se dá devido à ação das substâncias presentes em sua
composição (tabela 4), onde esses compostos podem afetar a integridade das
membranas celulares, causando o derramamento do conteúdo celular
(PEREIRA et al., 2011). Pesquisas descrevem a completa supressão do
crescimento de R. solani pelo monoterpeno fenólico, carvacrol, a uma
concentração de 100 mg.ml
-1
e pelo seu isómero estrutural, timol, a uma
concentração ligeiramente mais elevada (150 mg.ml -1) (GWINN et al., 2010).
A análise obtida por cromatografia relatado no trabalho de Macedo et al
(2009) indicou os principais constituintes e concentrações encontrados no óleo
essencial de Eucalyptus globulus, onde entre esses compostos destacaram-se
a presença do α-pineno (4,15%), o-cimeno (2,93%), (+) -limoneno (8,16%), e terpineno (0,87%), tendo o eucaliptol (1,8 cineol) (83,89%) como componente
marjoritário. Os constituintes que incidem com mais frequência em óleos
essenciais manifestando elevada atividade antifúngica são: D -limoneno, cineol,
α -pineno, β -pineno, β - mirceno e cânfora (MARTINEZ, 2012). Assim o efeito
inibitório encontrado neste trabalho pelo óleo de Eucalyptus globulus pode ser
explicado pela presença de compostos com conhecido efeito antifúngico
presente em sua composição química.
37
Tabela 4. Principais constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais de
Siparuna guianensis, Eucalyptus globulus e no óleo fixo da semente de Jatropha
curcas.
Planta
Siparuna guianensis
Aublet
Jatropha curcas L.
Eucalyptus globulus
Principais Componentes
Referências
2-undecanona, humuleno,
óxido cariofileno,
espatulenol,
aromadendreno,
siparunona, acetato de dihidrocarvil, dióxido de
Valentini et al, 2010.
limoneno, ledol, viridiflorol,
Montanari, 2010.
ácido 1,2 benzenodioico, αpineno, β-micerno, αterpineno, α-terpinoleno, αbisaboleno, β-bisaboleno, bisaboleno, α-bisabolol,
Ácido mirístico, ácido
palmítico, ácido
palmitoléico, ácido
esteárico, ácido oleico,
Sarin et al, 2007.
ácido linoleico, ácido
Akbar et al, 2009.
araquídico, ácido
eicosenoico, ácido beénico,
ácido lignocérico.
α-pineno, o-cimeno,
limoneno, eucaliptol e γterpineno, α-tuhujene, 3careno, canfeno, trnsMacedo et al, 2009.
thujenol, β-felandreno, βKaremu et al, 2013.
pireno, β-mierceno, αfelandreno, linalool, pmenth-2-en-1-ol, terpinen-4ol, cruptone, 4-careno, citral,
espatulenol, isoborneol
Isoladamente, cada óleo essencial apresenta diversos compostos, e
quando dois óleos são combinados, a interação entre as diversas substâncias
químicas pode provocar sinergismo ou efeitos antagônicos (PROBST, 2012).
Existem poucos relatos sobre mecanismos de ação da combinação de
óleos essências assim como o efeito dessas associações em fungos
filamentosos.
Na tabela 5 observa-se o efeito das associações sobre o crescimento
micelial do fungo Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Onde as diferenças
38
estatísticas encontradas entre os tratamento com óleos isolados e a combinação
dos mesmos indicam o possível tipo de interação entre seus componentes.
Tabela 5. Comparação das medias dos halos de inibição (mm) obtidos para os
óleos sozinhos em relação às combinações sobre o crescimento micelial de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
Óleo
Rhizoctonia solani
0 µl.ml-1
0,5 µl.ml-1
1,0 µl.ml-1
1,5 µl.ml-1
2,0 µl.ml-1
Fungicida1
E. globulus
43.00 aA
3.23 cB
0.00 cB
0.00 bB
0.00 bB
0.00 aB
S. guianensis
43.00 aA
22.61 bB
14.58 aC
13.04 aC
5.93 aD
0.00 aE
Assoc. 1(1:1)
43.00 aA
26.35 aB
5.00 bC
0.00 bD
0.00 bD
0.00 aD
E. globulus
43.00 aA
3.23 bB
0.00 cB
0.00 bB
0.00 bB
0.00 aB
J. curcas
43.00 aA
19.89 aC
31.42 aB
24.81 aBC
24.55 aBC
0.00 aD
Assoc. 2(1:1)
43.00 aA
25.87 aB
10.25 bC
0.00 bD
0.00 bD
0.00 aD
S. guianensis
43.00 aA
22.61 bB
14.58 cC
13.04 cCD
5.93 cDE
0.00 aE
J. curcas
43.00 aA
19.89 bC
31.42 bB
24.81 bBC
24.55 bBC
0.00 aD
Assoc. 3(1:1)
43.00 aB
60.75 aA
58.33 aA
56.70 aA
46.41 aB
0.00 aC
Óleo
Sclerotium rolfsii
E. globulus
41.04 aA
15.95 cB
2.00 cC
1.29 bC
0.00 bC
0.00 aC
S. guianensis
41.04 aA
41.25 aA
37.27 aB
33.93 aB
30.12 aC
0.00 aD
Assoc. 1(1:1)
41.04 aA
33.54 bB
20.70 bC
0.00 bD
0.00 bD
0.00 aD
E. globulus
41.04 aA
15.95 cB
2.00 cC
1.29 cC
0.00 bC
0.00 aC
J. curcas
41.04 aC
45.87 aB
50.16 aA
51.60 aA
49.92 aA
0.00 aD
Assoc. 2(1:1)
41.04 aA
29.02 bB
20.56 bD
6.00 bD
2.37 bDE
0.00 aE
S. guianensis
41.04 aA
41.25 bA
37.27 bB
33.93 bB
30.12 bC
0.00 aD
J. curcas
41.04 aC
45.87 aB
50.16 aA
51.60 aA
49.92 aA
0.00 aD
Assoc. 3(1:1)
41.04 aA
40.37 bA
26.39 cD
35.56 Bb
30.52 bC
0.00 aE
1
Apron RFC: 100 ml/100 kg
*Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e médias seguidas da mesma letra
maiúscula na linha não diferem entre si significativamente a 5% de probabilidade, pelo teste de
Tukey.
Observa-se que o efeito dos óleos combinados na proporção de 1:1
disposto na concentração de 0,5 µl.ml-1 não apresentou nenhum efeito sinérgico,
podendo-se notar uma interação antagônica nas associações 1 e 3 justificada
pelo aumento do crescimento micelial do Rhizoctonia solani.
Já em relação ao fitopatógeno Sclerotium rolfsii apesar de não apresentar
sinergismo, observa-se que na associação 1 e 2 há diferença significativa no
diâmetro de crescimento do fungo, denotando melhor atividade inibitória que os
óleos isolados de S. guianensis e J. curcas, respectivamente. Tal efeito pode ser
39
explicado pela presença do óleo de E. globulus que isoladamente mostrou-se
mais efetivo na redução do crescimento micelial do fungo.
Buscando a associação mais efetiva na inibição do crescimento micelial
dos fitopatógenos, as associações 1 e 2 nas concentrações 1,5 µl.ml-1 e 2 µl.ml1
exibiram efeito similar ao fungicida comercial.
Em muitos casos a atividade resulta de uma interação complexa entre as
diferentes classes de compostos, tais como éteres, aldeídos, cetonas, álcoois,
ésteres, éteres ou hidrocarbonetos encontrados nos óleos essenciais
(BASSOLÉ e JULIANI, 2012).
A competição de várias substâncias por uma mesma molécula alvo pode
resultar em atividade antagônica, diminuindo o efeito antibiótico dos óleos
essenciais misturados em grandes proporções (D’ARRIGO et al., 2010).
Diversos trabalhos descrevem o efeitos de óleos essenciais e outros
extratos naturais no controle de doenças de plantas, no entanto, observa-se que
não há um padrão quanto à metodologia adotada o que dificulta a comparação
dos resultados assim como sua discussão.
4. CONCLUSÃO
O óleo essencial de Eucalyptus globulus inibiu totalmente o crescimento
micelial de R. solani nas concentrações de 1,0 µl.ml-1, 1,5 µl.ml-1, 2,0 µl.ml-1 em
todos os períodos de avaliações. Para S.rolfssii a concentração de 2,0 µl.ml-1
inibiu o crescimento micelial do fitopatógeno em todos os tempos.
O óleo de Siparuna nas concentrações de 1,5 µl.ml-1 e 2,0 µl.ml-1
reduziram o cresciemento dos fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
O óleo de Jatropha curcas não apresentou atividade antifúngica sobre os
fitopatógenos testados.
As associações 1 e 2 nas concentrações 1,5 µl.ml-1 e 2,0 µl.ml-1 inibiram
totalmente o crescimento micelial dos fitopatógenos.
40
Capítulo II
ISOLAMENTO, ATIVIDADE ANTAGÔNICA E EXTRAÇÃO DE METABÓLITOS
COM POTENCIAL ANTIBIÓTICO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE PINHÃOMANSO (Jatropha curcas L.) E EUCALÍPTO (Corymbia citriodora).
41
Isolamento, atividade antagônica e extração de metabólitos com potencial
antibiótico de fungos endofíticos de pinhão-manso (Jatropha curcas L.) e
eucalípto (Corymbia citriodora).
RESUMO
Objetiva-se com este trabalho isolar fungos endofíticos de folhas de Jatropha
curcas e Corymbia citriodora além de avaliar o potencial dos mesmos para
controle biológico dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.
Fungos endofíticos foram isolados de folhas sadias de Corymbia citriodora e
Jatropha curcas L. onde após desinfecção das folhas fragmentos de
aproximadamente 1 cm foram recortados com o bisturi e transferidos para placas
contendo meio BDA com clorafenicol (100 mg.L-1) suplementado de 0,2 % de
extrato de levedura. Os fungos isolados foram preservados em ultrafreezer a 80°C em microtubos contendo glicerol 10%. Quinze fungos foram submetidos ao
teste de antagonismo in vitro por confronto direto onde a capacidade antagônica
de cada organismo fúngico foi determinada usando uma escala de classificação
para os três tipos principais de reações (A, B, C) e quatro sub-tipos (CA1, CB1,
CA2 e CB2). Também foi determinada a porcentagem de inibição. Para extração
de metabólitos secundário de meio de cultura foram 11 fungos que apresentaram
melhor desempenho na inibição dos fitopatógeno onde os fungos foram
inoculados em 200 de meio BD (batata dextrose) acrescido de 1ml de uma
solução contendo os fitopatógeno inativos e incubados por 10 dias a 28°C a 120
r.p.m.. Após o crescimento o micélio foi separado do meio de cultura por filtração
simples. O meio com o metabólito foi submetido a partição líquido/líquido com
acetato de etila e o extrato obtido rotoevaporado. Os extratos ressuspendidos
solução de Tween 80 a 2% foram pipetados em discos de papel filtro esterilizado
para os testes de antibiose colocados em placas de petri contendo meio BDA a
1 cm da borda As placas. Foram isolados 31 fungos endofíticos entre os fungos
purificados 22 foram isolados de Jatropha curcas e 9 de Corymbia citriodora. Dos
15 isolados selecionados 12 apresentaram interação com pelo menos um dos
patógenos. As amostras UFT.P 3.1.2. UFT.P 3.2 e UFT.P 5.13 inibiram 100% o
crescimento de Rhizoctonia solani após 14 dias de crescimento. Não houve
efeito inibitório dos metabólitos extraído do meio de cultura.
Palavras-chave: controle biológico, antibiose, isolamento.
42
Isolation, antagonistic activity and extraction of metabolites with
antibiotic potential of endophytic fungi of jatropha (Jatropha curcas L.)
and eucalyptus (Corymbia citriodora).
ABSTRACT
Objective of this work is to isolate endophytic fungi from leaves of Jatropha curcas
and Corymbia citriodora addition to assessing the potential of these pathogens
for biological control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. Endophytic fungi
were isolated from healthy leaves of Corymbia citriodora and Jatropha curcas L.
where after disinfection of leaf fragments of approximately 1 cm were cut with a
scalpel and transferred to plates containing PDA medium with chloramphenicol
(100 mg.l- 1) supplemented with 0,2 % yeast extract. The isolates were preserved
at -80 °C ultrafreezer in microtubes containing 10% glycerol. Fifteen fungi were
subjected to test in vitro antagonism by direct confrontation where the
antagonistic capacity of each fungus body was measured using a rating scale for
the three main types of reactions (A, B, C) and four sub- types (CA1, CB1 ,CB2
and CA2). The percentage of inhibition was also determined. For extraction of
secondary metabolites from culture medium were 11 fungi performed better in
inhibiting the pathogen where fungi were inoculated in 200 BD medium (potato
dextrose) plus 1 ml of a solution containing inactive pathogen and incubated for
10 days 28 °C at 120 rpm. After growth the mycelium was separated from the
culture medium by simple filtration. The medium with the metabolite was
subjected to liquid/liquid partition with ethyl acetate and the extract obtained
rotoevaporado. The extracts resuspended solution of 2% Tween 80 was pipetted
on sterile filter paper discs for the tests antibiosis placed in petri dishes containing
PDA medium 1 cm from the edge of the plates. 31 endophytic fungi were isolated
from the purified 22 fungi were isolated from Jatropha curcas and 9. 12 of 15
selected isolates showed interaction with at least one of the pathogens. The
samples UFT.P 3.1.2, UFT.P 3.2 and UFT.P 5.13 inhibited 100% the growth of
Rhizoctonia solani after 14 days of growth. There was no inhibitory effect of the
metabolites extracted from the culture medium.
Keywords: biological control, antibiosis, isolation.
43
1.INTRODUÇÃO
Os microrganismos endofíticos podem ser encontrados em órgãos e
tecidos vegetais como as folhas, ramos e raízes (AZEVEDO et al, 2002;
PEIXOTO NETO et al, 2002). As relações não patogênicas entre microrganismos
endofíticos e seus hospedeiros, desenvolvem associações que quando
benéficas podem conferir importantes benefícios como estimular o crescimento
das plantas, aumentar a resistência a doenças e às condições adversas do
ambiente (SILVA et al, 2006b).
Nos últimos anos, tem-se aumentado o interesse na aplicação de
microrganismos em práticas agrícolas, e isso se deve a benefícios fornecidos
por eles na promoção de crescimento vegetal, no controle biológico de pragas e
doenças de plantas entre outros motivos, assim como se estabelecerem como
substitutos de produtos químicos, contribuindo para preservação do meio
ambiente (PEIXOTO NETO, 2002). Esses microrganismos possuem grande
potencial na agricultura, onde diversas espécies têm apresentado promissor
emprego na produção de defensivos agrícolas, e em outros seguimentos
industriais como farmacêutica e alimentos (VERZIGNASSI et al, 1998; SOUZA
et al., 2004).
Com a descoberta da penicilina a partir do fungo Penicillium notatum, o
aparecimento dos antibióticos sintetizados por microrganismos despertou uma
atenção tanto da indústria farmacêutica como de outros setores industriais,
desencadeando uma intensa pesquisa de compostos ativos oriundos de
microrganismos (BARREIRO, 2009). Tal interesse tem se destacado com os
avanços
da
biotecnologia
acompanhados
de
técnicas
modernas
de
fracionamento químico e elucidação estrutural que tem mostrado o enorme
potencial de diversos microrganismos como fungos e bactérias em fornecerem
novas entidades químicas ativas e com padrões moleculares novos e originais
(VIEGA JR et al, 2006; BARREIRO, 2009).
Ao mesmo tempo, têm-se demonstrado que a identificação de genes que
controlam a produção dos metabólitos por alguns microrganismos podem
proporcionar uma alternativa para o aumento da produção dos principais
produtos naturais bioativos (GONDON e NEWMAN, 2013). Fungos endofíticos
também podem ser uma importante fonte de produtos naturais. Pesquisadores
acreditam que metabólitos secundários bioativos produzidos por esses
44
microrganismos estejam diretamente associados com a planta hospedeira
através da recombinação gênica entre as espécies em um processo co-evolutivo
(CONTI et al, 2012). Bons exemplos na utilização de microrganismos endofíticos
na produção de compostos biologicamente ativos podem ser vistos em diversas
pesquisas, onde substâncias como a citocalasina, um inibidor da polimerização
de actina, produzida por Xylaria sp. isolado de Piper aduncum (SILVA et al,
2010), hipericina por Hypericum perforatum (KUSARI et al, 2008),
a
camptothecine, um alcaloide inibidor da topoisomerase I em eucariotos
produzida por endofíticos (SHWETA et al., 2013), confirmam o potencial do
emprego desses microrganismos na produção de substancias biologicamente
ativas em escala industrial.
A busca por alternativas para o controle de doenças mostra-se uma
prática necessária, onde produtos agrícolas mais saudáveis e com menor
impacto ao meio ambiente vem despertando grande interesse no mundo. O
controle biológico, a indução de resistência e o uso de produtos com atividade
antimicrobiana e/ou indutora de resistência, apresentam-se como uns dos
mecanismos de controle alternativo (OLIVEIRA et al, 2011a). O uso do controle
biológico natural torna-se essencial na redução de problemas causados por
agrotóxicos (FERNANDES et al, 2010). A tendência do mercado internacional é
a procura por produtos de melhor qualidade, além da preservação ambiental,
desta forma intensificando a necessidade de métodos e produtos para controles
alternativos, que substituam os insumos poluentes, mantendo a qualidade do
produto, reduzindo os resíduos de produtos químicos nos produto final, assim
como aumentando a segurança e a saúde do consumidor (PIATI et al, 2011).
Os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, são fungos causadores
de diversas doenças como trombamento, podridão de raízes, podridões de colo
e murchas, eles não produzem esporos e apresentam micélio e estruturas de
sobrevivência como esclerócios e estão diretamente envolvidos em doenças
originárias do solo como as doenças radiculares (MICHEREFF et al, 2005).
Diversos estudos sobre microrganismos endofíticos com potencial
antagônico sobre fitopatógenos tem sido executados para emprego no controle
biológico, entre esses fungos com capacidade antagônica os mais estudados
são do gênero Trichoderma (OLIVEIRA, 2011a). Assim, objetiva-se com o
trabalho isolar fungos endofíticos de folhas de Jatropha curcas e Corymbia
45
citriodora além de avaliar o potencial dos mesmos para controle biológico dos
fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii por confrontação direta em
placa e pela atividade antimicrobiana de extratos contendo substâncias ativas
lançadas no meio de cultivo por esses fungos.
46
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal utilizado
As folhas sadias de Corymbia citriodora e Jatropha curcas L. foram
coletadas na vegetação na área experimental da Universidade Federal do
Tocantis – Campus de Gurupi, coordenadas geográficas 11°44’52.34’’ S e
49°2’54.84’’ O, 11°44’52.49’’ S e 49°3’7.08’’ O, com o auxílio de uma tesoura.
2.2Desinfecção e Isolamento
As folhas foram lavadas em água corrente e detergente líquido para
retirada do excesso de impurezas superficiais. Em condições assépticas o
material foi imerso em álcool 70% (1 minuto), em seguida hipoclorito 3% (4
minutos) e novamente em álcool 70% (30 segundos), após esse processo as
folhas foram lavadas em água estéril, sendo retirado 100 µL da água de lavagem
(ARAÚJO, 2002) para validar o protocolo de assepsia, sendo incubados em
placas contendo BDA (Batata dextrose agar), com cloranfenicol (100 mg.L-1),
suplementado com 0,2% de extrato de levedura a 28 ºC em BOD por 15 dias. As
folhas foram secas em papel filtro esterilizado. Após a última lavagem foram
retirados o ápice e a base das folhas em meio asséptico, com auxilio de um
bisturi asséptico, deixando apenas a parte central do folíolo. Fragmentos de
aproximadamente 1 cm foram recortados com o bisturi e transferidos para placas
contendo meio BDA com clorafenicol (100 mg.L-1) suplementado de 0,2 % de
extrato de levedura, cada placa recebeu 6 fragmetos de folha dispostos
equidistantes entre si. As placas foram vedadas e incubadas em BOD a 28 ° C,
com fotoperíodo de 12 horas.
2.3 Purificação e preservação dos isolados
Com o surgimento das colônias que emergiam do material vegetal,
fragmentos eram transferidos para placas contendo BDA a 28 ºC em B.O.D.,
sendo o processo repetido até completa purificação do endofítico.
Para preservação das colônias puras, foi empregada a metodologia usada
por Deshmukh (2013) com modificações, onde as culturas purificadas foram
incubadas em meio líquido Czapek sob agitação de 100 r.p.m., em temperatura
ambiente por sete dias. Cinco repetições com um ml do caldo acompanhado de
estruturas fúngicas foram pipetados, em condições assépticas, em tubos de 2 ml
47
(eppendorf), sendo seus volumes completado com solução de glicerol 10% (v/v)
e armazenada em ultrafreezer a -80°C.
2.4 Antagonismo in vitro por confronto direto
O antagonismo de 15 fungos endofíticos isolados da folha de Jatropha
curcas e Corymbia citriodora foram selecionados aleatoriamente e submetidos
ao teste de cultura pareada. Em placas de Petri contendo meio BDA, foram
inseridos dois fragmentos de cinco milímetros do meio de cultura contendo os
fungos endofíticos e o fitopatógeno, previamente incubados em câmara BOD a
28 °C por 7 dias, a uma distância de um centímetro da borda paralelos entre si.
As placas foram incubadas por 14 dias a 28°C. Como controle apenas o fungo
fitopatogênico foi colocado na placa. Todos os ensaios foram realizados em
triplicata (MARIANO, 1993). Para avaliação das interações foi utilizada a escala
de Innocenti et al (2002). Onde a capacidade antagônica de cada organismo
fúngico foi determinada usando uma escala de classificação para os três tipos
principais de reações (A, B, C) e quatro sub-tipos (CA1, CB1, CA2 e CB2). Tipo
A e B será de impasse (inibição mútua, em que nenhum organismo era capaz de
crescer demais o outro) em contacto micelial (A), ou a uma distância (B);
substituição tipo C, o crescimento excessivo sem impasse inicial. Os subtipos
intermédios marcados serão: CA1 parcial, CA2 e completa, substituição após o
impasse inicial com contato micelial; CB parcial, e CB2 completa, após a
substituição inicial bloqueio, a uma distância.
Resumindo, nessa escala serão avaliadas três interações possíveis A, B
e C. Sendo:

A (deadlock) crescimento com contato micelial;

B (deadlock) crescimento a distancia e;

C crescimento do endofítico sobre o fitopatógeno sem “deadlock”
inicial;
A interação do tipo C é subdividida em 4 onde:

CA1 e CA2 = crescimento parcial e completo, respectivamente, do
endofítico sobre o fitopatógeno depois de “deadlock” inicial com
contato micelial;

CB1 e CB2 = crescimento parcial e completo, respectivamente, do
endofítico sobre o fitopatógeno depois de “deadlock” inicial a distância.
48
Ao mesmo tempo, foi determinada a porcentagem de inibição calculada
pela equação abaixo (EDGINTON et al, 1971), onde essa avaliação foi realizada
por meio da medida do diâmetro da colônia de crescimento dos fitopatógenos.
Todo experimento foi conduzido em três repetições.
𝑃𝐼 =
(𝐷𝑐 − 𝐷𝑡)
𝑥 100
𝐷𝑐
Onde:
Dc = diâmetro médio da colônia do patógeno no controle
Dt= diâmetro médio da colônia do patógeno nos tratamentos testados
Os resultados obtidos foram dispostos em gráficos de médias com uma
barra de erro que representa o intervalo de confiança a 95%.
2.5 Extração de metabolitos secundários do meio de cultura
A partir do teste de antagonismo em placa foram selecionados 11 fungos
que apresentaram melhor desempenho na inibição dos fitopatógeno, os isolados
UFT.P 3.1, UFT.P 3.1.2, UFT.P 5.13, UFT.P 2.4.7, UFT.E 3.3, UFT.P 3.2, UFT.P
2.6.2, UFT.P 2.4.3, UFT.P 2.4, UFT.P 3.5 e UFT.E 2.11.2, foram inoculados em
um erlenmeyer de 250 contendo 200 de meio BD (batata dextrose) acrescido de
1ml de uma solução contendo os fitopatógeno inativos e incubados por 10 dias
a 28°C a 120 r.p.m. O inoculo foi padronizado em uma concentração de 106 de
esporos e para os fungos que não esporularam após 7 dias de crescimento foi
inoculado 1 ml de uma solução de micélio. Para inativação dos fitopatógeno, 15
discos de 5 mm contendo o micélio de cada fungo foram transferidos para um
erlenmeyer contendo 100 ml de meio BD e em seguida submetidos a duas
autoclavagens de 40 minutos. Após o crescimento o micélio foi separado do meio
de cultura por filtração simples. O meio filtrado com o metabólito foi transferido
para um balão de titulação de 1 L, onde foi acrescentado 200 ml de acetato de
etila e submetido a partição líquido/líquido. Após a separação das fases foi
coletada a fase aquosa. A fração com acetato de etila foi misturada a mais 200
ml de acetato de etila novamente, repetindo-se o processo por mais duas vezes.
Ao final a fração aquosa foi descartada e a fração solúvel em acetato de etila
submetida a rotaevaporação para concentração da amostra (LÓPEZ, 2010).
49
Após
a
concentração
da
amostra,
os
extratos
obtidos
foram
ressuspendidos em 1 ml de uma solução de Tween 80 a 2%. Para avaliação da
atividade antibiótica dos extratos, discos de papel filtro esterilizado foram
colocados em placas de petri contendo meio BDA a 1 cm da borda e embebidos
com de 10 µl do extrato com Tween 80 a 2% filtrado em membrana millipore de
22 µm, na outra extremidade foi adicionado um disco de 5mm contendo o
patógeno. Como controle negativo foi usado disco com a solução de tween 80 a
2%. As placas foram incubadas em estufa B.O.D a 28°C por cinco dias.
50
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Antagonismo in vitro por confronto direto
Foram isolados 31 fungos endofíticos dos fragmentos de folhas da placa
de petri. Entre os fungos purificados 22 foram isolados de Jatropha curcas e 9
de Corymbia citriodora.
Por meio do teste de cultura pareada foram observadas as interações
entre os fungos endofíticos e os fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium
rolfsii onde dos 15 isolados 12 apresentaram (Tabela 1) interação com pelo
menos um dos patógenos.
Tabela 1. Interações entre fungos endofíticos isolados de Jatropha curcas e
Corymbia citriodora e os fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii
utilizados nos testes de antagonismo in vitro após 14 dias de crescimento.
Tipo de
interação/
Endofítico
Rhizoctonia solani
Sclerotium rolfsii
A
UFT.E 2.2, UFT.P 1.5.2
UFT.P 5.13, UFT.P 3.5,
UFT.P 2.6.2
Fitopatógeno
B
UFT.E 2.11.2, UFT.P 2.4,
CA1
UFT.P 3.1
UFT.P 2.4.3, UFT.P 3.5
UFT.P 3.2, UFT.P 3.1.2,
CA2
UFT.P 2.4.7, UFT.P 2.6.2,
UFT.P 5.13
CB1
CB2
* Os demais isolados que não estão listados, não apresentaram interações.
A interação do tipo CA2 foi a mais frequente desenvolvida pelos
endofíticos sobre o fungo R. solani seguida pela CA1, esses tipos de interação
caracterizam o crescimento do fungo endofítico sobre o patógenos, onde CA2
indica sobreposição total do endofítico sobre o patógeno após um contato inicial
e CA1 sobreposição parcial após o contato.
Ainda entre as amostras que proporcionaram algum tipo de interação o
isolado UFT.P 2.4.3 apresentou mudança de coloração do meio formando uma
faixa de cor amarela na zona de confronto (Figura 1). O mesmo foi notado no
isolado UFT.P 2.6.2 onde observou-se uma coloração amarelo claro no fundo da
placa tomando todo meio de cultura. Essa coloração pode indicar a produção de
51
metabólitos com efeito antibiótico lançados devido à competição por espaço ou
nutriente com o fitopatógeno.
Figura 1. Antagonismo por pareamento direto entre fungos endofíticos e
Rhizoctonia solani, onde A. exibe a coloração amarela na zona de confronto
formada pela amostra UFT.P 2.4.3 e B. mostra coloração amarelo claro em todo
meio formada pelo fungo UFT.P 2.6.2.
Ao mesmo tempo observou-se maior resistência do fitopatógeno
Sclerotium rolfsii aos endofíticos uma vez que poucos isolados apresentaram
alguma interação, além de, em algumas amostras o patógeno sobrepor o
endofítico. Tais interações sugerem que dependendo do grupo de fungos, tanto
do endofítico, quanto do fitopatógeno, diferentes modos de ação dos endofíticos
sobre o fitopatógeno podem ocorrer, podendo indicar um potencial para
produção de metabólitos ou competição direta pelo espaço e nutrientes, assim
como o que acontece dentro da planta hospedeira (BERNARDI-WENZEL et al,
2012). Sbravatti Júnior (2013) explica que os valores negativos além de não
serem eficazes como inibidores do patógeno, o endofítico pode ter produzido
alguma substância que estimulou o crescimento do fitopatógeno. Apesar da
sobreposição do patógeno sobre os endofíticos, no fundo da placa foi possível
observar que as amostras UFT.P 3.1.2. UFT.P 3.2 e UFT.P 5.13 demostraram
um avanço na inibição do fitopatógeno. Esses inibiram 100% o crescimento de
Rhizoctonia solani após 14 dias de crescimento (Figura 2).
52
Figura 2. Atividade antagônica de isolados endofíticos. A porcentagem de
inibição do patógeno Rhizoctonia solani é expressa como média com uma
barra de erro que representa o intervalo de confiança a 95%.
No trabalho de López (2010), um fungo endofítico isolado de Croton
urucurana (FCU 028) chamou a atenção por produzir um pigmento amareloesverdeado ao redor do fitopatógeno Guignardia citricarpa, o mesmo sugeriu que
o pigmento tratava-se de compostos antifúngicos produzidos pelo endofítico.
Em contraste aos resultados obtidos no presente trabalho, BernardiWenzel et al (2012) observou em seu estudo um rápido crescimento de R. solani,
o que impediu na maioria dos casos o crescimento do endofítico, sugerindo,
portanto, um fitopatógeno mais difícil de ser controlado pelos endofíticos
avaliados.
Outras pesquisas como a de Rocha et al (2009) relataram a atividade
antagônica de quatro fungos endofíticos (Trichophyton sp., Chrysosporium
sp, Candida pseudotropicalis e Candida tropicalis) isolados de Symphytum
officinale L. onde esses atingiram uma taxa de inibição que variou de 46,7% a
50%. Naik et al (2009) mostraram o potencial antagônico de três espécies
endofíticas isoladas de arroz contra os patógenos Rhizoctonia solani, Nigrospora
oryzae, Macrophomina phaseolina, Macrophomina phaseolina, Alternaria
53
alternata apresentando porcentagens de inibição que variaram de 49, 21% a
79,81%.
As figuras 2 e 3 mostram a atividade inibitória dos endofiticos sobre os
fitopatógenos R. solani e S. rolfsii, observando-se maior sensibilidade do fungo
Rhizoctonia solani aos endofíticos. Contudo, a amostra UFT.P 3.1 exibiu efeito
redutor no crescimento micelial de Sclerotium rolfsii (44, 57%) maior que no
patógeno R. solani (25,10%). O efeito demonstrado pelas amostras UFT.P 3.1.2,
UFT.P 3.2 e UFT.P 5.13 sobre R. solani pode ser explicado pela produção de
compostos com atividade antibiótica. Parreira et al (2009) explicaram que
quando ameaçados, os fungos podem desenvolver mecanismos que lhe
confiram resistência a produtos tóxicos, para assegurar a sobrevivência da
espécie. Tal resultado pode indicar a adoção de diferentes mecanismos de
resistências aos compostos liberados pelo endofítico empregados pelos
patógenos. Isso pode ser sugerido as amostras UFT.E 1.1, UFT.E 2.11.2, UFT.E
2.2, UFT.E 3.3, UFT.P 1.5.2, UFT.P 1.6, UFT.P 2.4, UFT.P 2.4.3, UFT.P 2.4.7,
UFT.P 2.6.2 e UFT.P 3.5 que obtiveram médias de inibição próximas e com
pouca ação inibitória aos fitopatógenos.
Figura 3. Atividade antagônica de isolados endofíticos. A porcentagem de
inibição do patógeno Sclerotium rolfsii é expressa como média com uma barra
de erro que representa o intervalo de confiança a 95%.
54
Estudos têm apontado fungos endofíticos capazes de controlar doenças
fúngicas ou bacterianas em culturas de interesse. Entre os gêneros promissores
o Neotyphodium, Fusarium e Trichoderma apresentam grande potencial para
controle biológico (AZEVEDO et al, 2002, PIMENTEL et al, 2006).
Pesquisas relatam a ocorrência de diferentes fungos endofíticos
encontrados em Jatropha curcas, entre elas Kumar e Kaushik (2013),
identificaram 9 fungos isolados da folha de J. curcas onde quatro foram
identificados com Colletotrichum truncatum e o outros Nigrospora oryzae,
Fusarium
proliferatum,
Guignardia
cammillae,
Alternaria
destruens
e
Chaetomium sp. Lichun et al (2009) isolaram 42 fungos do xilema e floema de J.
curcas, e entre os gêneros identificados foi encontrado Cephalosporium,
Trichoderma, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Aspergillus, Pestalotiopis, Phoma,
Acremonium e Fusarium.
Avaliando o potencial para controle biológico Trichoderma isolados do
solo sobre Sclerotinia sclerotiorum Chagas et al (2013) encontraram 5 isolados,
JCO-UFT 28, JCO-UFT 37, JCOUFT 45, JCO-UFT 63 e JCO-UFT 85,
significativamente eficientes como antagonistas obtendo respectivamente
porcentagens de inibição iguais a 63, 68, 63, 66 e 65%. Bettucci e Saravay
(1993) também relataram a ocorrências de espécies de Trichoderma isolados de
diferentes parte de Eucalyptus globulus, além de outros gêneros fúngicos como
Cytospora sp, Microsphaeropsis sp., Penicillium sp., Unidentified sp.
3.2 Extração de metabólitos secundários
Nenhum dos extratos testados mostraram atividade inibitória contra os
fitopatógeno Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Tal resultado pode ter
ocorrido devido à baixa solubilidade dos compostos no meio cultura testado, ou
no solvente acetato de etila utilizado para extratação das substâncias lançadas
no meio pelos fungos. Marasciulo et al (2006) afirma que o resultado obtido pode
ser devido à pouca solubilidade da substância antimicrobiana no meio de cultura
utilizado.
Outros trabalhos que utilizaram metodologia semelhante na obtenção
desses extratos como Rhoden et al (2012) observaram o efeito antimicrobiano
de extratos de acetato de etila de Cordyceps memorabilis isolado de Trichilia
elegans sobre as bactérias Enterococus hirae, Micrococcus luteus e Escherichia
55
coli. Cafêu et al (2005), identificaram os componentes encontrados nos extratos
brutos PDB-AcOEt e milho-MeOH, produzidos pelo fungo endofítico Xylaria sp.,
encontrando
ácido
2-hexilideno-3-metilbutanodióico,
citocalasina
D,
7-
declorogriseofulvina, citocalasina B e griseofulvina, onde extrato bruto obtido
após cultivo de Xylaria sp. em meio Potato Dextrose Broth (PDB) e os compostos
ácido 2-hexilideno-3-metilbutanodióico e citocalasina D apresentaram-se ativos
sobre
às
linhagens Cladosporium
cladosporioides e Cladosporium
spahaerospermum.
4. CONCLUSÃO
Os fungos endofíticos isolados de Jatropha curcas e Corymbia citriodora
mostraram atividades antagônicas contra os fitopatógenos Rhizoctonia solani e
Sclerotium rolfsii, destacando-se os isolados UFT.P 3.1.2, UFT.P 3.2 e UFT.P
5.13 que inibiram 100% o crescimento micelial de R. solani.
Os extratos obtidos do caldo fermentado não apresentaram atividade
antifúngica.
56
Capítulo III
CAPACIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE
Jatropha curcas L. E Corymbia citriodora NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO INDOL
ACÉTICO E CAPACIDADE DE SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO in vitro.
57
Capacidade de fungos endofíticos isolados de folhas de Jatropha curcas
L. e Corymbia citriodora na produção de ácido indol acético e capacidade
de solubilização de fosfato in vitro.
RESUMO
A microbiota endofítica têm proporcionado a capacidade de estimular o
crescimento das plantas por mecanismos diretos, pela fixação biológica de
nitrogênio e/ou produção de fitohormônios e por mecanismos indiretos, através
do antagonismo contra patógenos. Muitos microrganismos associados a plantas
são capazes de produzir fitohormônios, principalmente as auxinas. Objetivou-se
avaliar o potencial de solubilização de fosfato e a capacidade de sintetizar AIA,
in vitro, usando fungos endofíticos isolados das folhas de Jatropha curcas L. se
Corymbia citriodora. Foi realizada uma pre-seleção dos 15 isoladosfungicos
originados das folhas de Jatropha curcas e Corymbia citriodora, sendo
selecionado 8 isolados, que foram inoculados em 100 ml de meio Batata
Dextrose com e sem L-triptofano na concetração de 0,489 mM ao abrigo da luz,
a 120 r.p.m. Alíquotas das amostras foram coletadas nos períodos de 24h, 48h,
96h, 120h e 168h para avaliação da produção de AIA, em seguida as amostras
foram centrifugas a 10000 rpm por 10 min. O teste qualitativo foi feito com
reagente salkowski para posterior quantificação através de análise
colorimétricada produção de AIA. Para solubilização de fosfato de cálcio os 15
isolados foram avaliados medindo o diâmetro do halo de solubilização, foi
medido a cada 24 horas até que a colônia fúngica tomasse toda a placa. Os
isolados UFT.P 1.5.3 e UFT.P 1.6 foram os fungos que mais produziram AIA em
meio BD suplementado com L-triptofano a partir do primeiro de dia de avaliação
com uma medias de 13,28 µg.ml-1 e 44,61 µg.ml-1, respectivamente. Na ausência
do L-triptofano a síntese de AIA apresentou diferentes concentrações entre o
isolados, sendo a amostra UFT.P 1.6 a que obteve maior média com
concentração de 10,39 µg.ml-1 após 96 horas de crescimento. Nenhum dos
isolados testados apresentou capacidade de solubilizar fosfato de cálcio.
Palavras-chave: fitohormônios; auxina; fósforo
58
Ability of endophytic fungi isolated from leaves of Jatropha curcas L.
Corymbia citriodora and production of indole acetic acid and phosphate
solubilization capability in vitro.
ABSTRACT
The endophytic microbiota have provided the ability to stimulate plant growth by
direct mechanisms, the biological nitrogen fixation and/or production of
phytohormones and indirect mechanisms through antagonism against
pathogens. Many microorganisms associated with plants are able to produce
phytohormones, particularly auxin. This study aimed to assess the potential for
phosphate solubilization and the ability to synthesize IAA in vitro, using
endophytic fungi isolated from the leaves of Jatropha curcas L. and Corymbia
citriodora. A pre-selection of 15 isolados fungics derived from the leaves of
Jatropha curcas and Corymbia citriodora, with 8 selected isolates were
inoculated in 100 ml Potato Dextrose medium with and without L- tryptophan
averaged concentration of 0.489 mM in the dark was performed, at 120 rpm
aliquots of the samples were collected during periods of 24 h, 48 h, 96 h, 120 h
and 168 h to evaluate the production of IAA, then the samples were centrifuge at
10000 rpm for 10 min. The qualitative test was done with Salkowski reagent for
quantification colorimetric of the analysis through production of IAA. To solubilize
calcium phosphate 15 isolates were evaluated by measuring the diameter of the
halo solubilization was measured every 24 hours until the fungal colony take the
whole plate. The UFT.P 1.5.3 and UFT.P 1.6 isolates were fungi that produced
more IAA in BD medium supplemented with L- tryptophan from the first day of
evaluation with a medium of 13,28 μg.ml - 1 and 44,61 μg.ml -1, respectively. In
the absence of L-tryptophan synthesis IAA showed different concentrations
between the isolates and the UFT.P 1.6 sample with highest average
concentration of 10,39 μg.ml – 1 with after 96 hours of growth. None of the isolates
tested showed the ability to solubilize calcium phosphate
Keywords: plant hormone, auxin, phosphorus
59
1. INTRODUÇÃO
A agricultura moderna tem enfrentado o grande desafio de aumentar a
produção das culturas gerando sustentabilidade, visando a proteção ambiental
onde, para atingir esse objetivo, uma das alternativas é a utilização de
microrganismos promotores de crescimento vegetal (SILVA et al, 2006)
A microbiota endofítica têm proporcionado a capacidade de estimular o
crescimento das plantas por mecanismos diretos, pela fixação de nitrogênio e/ou
produção de fitohormônios e por mecanismos indiretos, através do antagonismo
contra patógenos ou resistência a drogas (MARCHIORO, 2005). Muitos
microrganismos associados a plantas são capazes de produzir fitohormônios,
principalmente as auxinas (RODRIGUES et al, 2007).
As auxinas são hormônios que apresentam capacidade de induzir a
elongação celular nos vegetais (CHITARRA; CHITARRA, 2005).
O ácido indol-3-acético (AIA) é a forma prevalente natural e atua
promovendo o crescimento das raízes e a proliferação de pelos radiculares,
trazendo benefícios como a melhora da absorção de nutrientes e água do solo
e, consequentemente, estimular o crescimento da planta (CABALLEROMELLADO, 2006).
Os mecanismos de biossíntese e regulação do AIA ainda não foram
totalmente descoberto, sabe-se que ele é derivado do triptofano e pode ser
transportado tanto por mecanismo polar ativo, como de forma não-polar passiva
(CHITARRA; CHITARRA, 2005). A via mais conhecida envolve três passos,
onde, primeiro, o triptofano é desaminado do ácido indol-3-pirúvico, seguido pela
descarboxilação de IPA (Ácido indol 3-pirúvico) para indol-3-acetaldeído,
finalmente a AIA. O Indol-3-acetaldeido é um intermediário chave em duas vias
suplementares da biossíntese de IAA e pode ser gerado diretamente a partir de
triptofano ou após a conversão do triptofano em triptamina (ZHAO et al, 2002).
A produção de AIA por fungos tem sido reportada, evidenciando a capacidade
de fungos em sintetizar AIA na rizosfera de plantas, podendo proporcionar o
desenvolvimento radicular (OLIVEIRA, 2012).
Dependendo da informação desejada a quantidade e/ou a identificação
de auxinas em amostras biológicas podem ser detectadas por bioensaios,
espectrometria de massa ou ELISA (TAIZ; ZEIGER, 2009). O reagente de
Salkowsky tem sido largamente utilizado na detecção do AIA produzido por
60
microrganismos, devido à sua facilidade, rapidez, sensibilidade e custo
(STEENHOUDT; VANDERLEYDEN, 2000). A coloração rosa do teste em
amostras positivas para produção do AIA é obtida através do contato do reagente
de Salkowski com o AIA, desencadeando uma reação oxidativa de compostos
indólicos por sais férricos (MARCHIORO, 2005).
Os solos do Cerrado são naturalmente ácidos pela constituição do
material de origem e pelo elevado processo de intemperismo, normalmente
apresentam baixos teores de cátions básicos, além da acentuada deficiência de
cálcio, magnésio e fósforo e a elevada concentração de alumínio que constituem
inicialmente a maior limitação para seu cultivo, sendo necessário a aplicação de
corretivos e fertilizantes (SILVEIRA et al., 2000; FAGERIA, 2001).
O fósforo de solos com pH próximos à neutralidade ou ligeiramente
alcalinos como alguns do semiárido brasileiro, pode estar ligado, em grande
parte, ao cálcio formando compostos susceptíveis à solubilização por uma série
de microrganismos rizosféricos que produzem acidez (SOUCHIE et al, 2007).
O P no solo está estreitamente relacionada com as partículas do solo e
relativamente disponível para as plantas. Assim, a quantidade de P no solo pode
ser relativamente grande, mas apenas uma pequena parte está disponível para
as plantas. Em consequência, grandes doses de fertilizantes fosfatados são
aplicados para obter altos rendimentos de produção (FERREIRA et al, 2009).
Dessa forma, a inoculação de microrganismos benéficos em plantas tem
sido empregada para melhorar seu desenvolvimento, entre esses, fungos e
bactérias tem mostrado desempenho satisfatório na disponibilização desse
nutriente (CARAVACA et al., 2002; FERREIRA, 2009).
Diante do baixo nível de fósforo e baixa fertilidade dos solos do Cerrado
tocantinense, o presente estudo objetivou selecionar fungos endofíticos isolados
de folhas de Jatropha curcas L. e Corymbia citriodora quanto ao seu potencial
de solubilização de fosfato e capacidade de sintetizar AIA in vitro.
61
2. METODOLOGIA
2.1 Seleção das estipes com potencial para produção de AIA
Foi realizada uma triagem entre os 15 isolados previamente isolados das
folhas de Jatropha curcas e Corymbia citriodora para seleção dos
microrganismos com potencial para produção de AIA. Para isso, foi seguido a
metodologia de Santos et al (2008b) com modificações, onde os isolados foram
inoculados em meio BD, obtido do caldo de 200g de batata, 20 g de dextrose em
1L de água destilda, acrescido de 0,489 mM de L-triptofano, 120 r.p.m em
temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após 168 horas de crescimento as
amostras foram avaliadas quanto a produção de AIA para seleção das amostras
potenciais.
2.2 Produção de ácido indolacético
Os 8 isolados com potencial para produção de AIA foram inoculados em
meio Batata Dextrose com L-triptofano na concentração de 0,489 mM e sem Ltriptofano, para isso 5 discos com micélio dos fungos crescido por 7 dias foram
inoculados no meio, os frascos foram colocados em uma mesa agitadora ao
abrigo da luz, sob agitação de 120 r.p.m. Alíquotas de cada amostra foram
coletadas nos períodos de 24h, 48h, 96h, 120h e 168h para avaliação da
produção de AIA, onde cada amostra foi centrifugada a 10000 rpm por 10 min.
Foi adicionado na proporção 1:1 o reagente de salkovski (1 ml de FeCl3 . 6 H2O
a 0,5M em 50 ml de HClO4.a 35%) (GORDON; WEBER, 1951) para a análise
colorimétrica da produção de AIA. As amostras foram submetidas a um agitador
de tubos tipo vortex e mantidas no escuro por 25 minutos para a determinação
da produção de AIA em espectrofotômetro com comprimento de onde de 530
nm, onde os valores foram comparados com a linha de regressão da curva
(GRAVEL et al, 2007). O experimento foi conduzido em 3 repetições para cada
amostra.
Os resultados obtidos foram dispostos em gráficos de médias com uma
barra de erro que representa o intervalo de confiança a 95%.
62
2.3 Curva de calibração AIA
Para confecção da curva padrão (Figura 1) utilizou-se uma solução
padrão na proporção de 2 µg.ml-1 de AIA em água destilada dispostas nas
seguintes concentrações (Tabela 1) segundo a metodologia usada por Santos et
al (2008b) com modificações:
Tabela 1. Curva de calibração para o AIA
Quantidade
(µg)
AIA (µL)
Água destilada
(µL)
Reagente (µL)
Volume
final (µL)
0
0
1000
2000
3000
20
10
990
2000
3000
40
20
980
2000
3000
60
30
970
2000
3000
80
40
960
2000
3000
100
50
950
2000
3000
120
60
940
2000
3000
160
80
920
2000
3000
200
100
900
2000
3000
Figura 1. Curva padrão do AIA
2.4 Solubilização de fosfato de cálcio
Todos os 15 isolados foram submetidos ao teste de solubilização de
fosfato de cálcio. Para isso foi utilizado o meio de cultura desenvolvido por
Sylvester-Bradley et al. (1982), composto por 10 g de glicose, 2 g de extrato de
levedura e 18 g de ágar por litro. Separadamente foram preparadas duas
63
soluções denominadas A (com 5 g de K2HPO4em 50 mL de água) e B (com 10
g de CaCl2 em 100 mL de água). Essas soluções foram acrescentada ao meio
de cultura após autoclavagem para a formação do fosfato de cálcio precipitado.
Em seguida, ajustou-se o pH para 4,5 e 6,5. Os isolados fúngicos, crescido em
meio BDA (Ágar Batata Dextrose) por 7 dias, foram repicados para o meio de
solubilização com auxilio de uma alça de inoculação retirando-se uma pequena
porção do isolado, realizado um leve toque no meio.
O diâmetro do halo de solubilização, caracterizado pela área translúcida
em torno da colônia, foi medido a cada 24 horas, utilizando-se um paquímetro,
até que a colônia fúngica tomasse toda a placa. A partir dessas medidas, foram
obtidos os Índices de Solubilização (IS), para cada isolado, utilizando a seguinte
formula (BERRAQUERO et al., 1976):
𝐼𝑆 =
Diâmetro do halo de solubilização
𝐷𝑖â𝑚𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑎 𝑐𝑜𝑙ô𝑛𝑖𝑎
De acordo com os índices, os isolados foram classificados quanto a
capacidade de solubilização em baixa (IS<2), média (2≤IS<4) e alta (IS>4).
64
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Produção de ácido indolacético
Entres os isolados analisados foram selecionados 8 com potencial
para produção de AIA, sendo eles: UFT.E 2.2, UFT.E 3.1, UFT.P 2.6.2, UFT.P
1.6, UFT.P 3.1.2, UFT.P5.13, UFT.P 1.5.3 e UFT.P. 3.2.
As equações ŷ=0,0204*x+0,0037 (R² 0,9963) e ŷ =0,0222*x-0,2011 (R²
0,9956) foram obtidas a partir da curva de calibração. Foi necessário a produção
de duas curvas devido a produção de novo reagente de Salkowski.
Determinou-se então, a concentração de hormônio produzido por cada
isolado, observando-se a produção de AIA nas amostras UFT.E 2.2, UFT.P
1.5.3, UFT.P 1.6, UFT.P 5,13 e UFT.P 3.1.
Apesar das amostras UFT.P 3.1.2 e UFT.P 3.2 demonstrarem
concentrações expressivas de AIA, a coloração obtida após reação com
reagente de Salkowski não apresentava as características descritas na literatura,
onde segundo Marchioro (2005) a reação de uma solução de AIA com o reagente
de Salkowski resulta coloração amarelada para o teste negativo e rosa
avermelhado para o teste positivo. As amostras desenvolveram uma coloração
verde escuro, originada do próprio fungo, que em condições normais de
crescimento desenvolve essa coloração no micélio e nos metabólitos lançados
no meio.
Os isolados UFT.P 1.5.3 e UFT.P 1.6 produziram grandes concentrações
de AIA no meio suplementado com L-triptofano a partir do primeiro dia de
avaliação (24 horas de crescimento), com médias de 13,28 µg.ml-1 e 44,61 µg.ml1,
respectivamente (Figura 2).
Além disso, os isolados mostraram-se hábeis na produção do hormônio
em todas os períodos de avalição apresentando picos de produção com 48 horas
de crescimento para o isolado UFT.P 1.6 (média de 73,26 µg.ml-1) e com 120
horas de crescimento para o isolado UFT.P 1.5.3 (média de 57 µg.ml -1).
65
Figura 2. Produção de AIA na presença e ausência de L-triptofano,
expressa como média com uma barra de erro que representa o intervalo de
confiança a 95%.
Alguns trabalhos relatam a capacidade de síntese de AIA por
microrganismos, onde Assumpção et al (2009), obteveram a produção de 34,9
µg.ml-1 de AIA por uma bactéria endofítica isolada de semente de soja utilizando
reagente de salkowsk. Oliveira et al (2012) revelaram o potencial de fungos do
gênero Trichoderma spp. em sintetizar AIA, obtendo média de concentração de
18,7 µg.ml-1 em meio BD da amostra Tr-SMb.
Não se sabe qual concentração de substâncias indólicas produzidas pelos
microrganismos seria eficiente nas plantas (FERNANDES, 2012). Entretanto,
altas concentrações de moléculas com atividade auxinicas como o ácido 2-metil,
4-cloro fenoxiacético (AMCP) e o ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético (2,4,5-T)
possuem
propriedade
herbicida
(MARCHIORO,
2005),
destacando
a
importância do conhecimento de concentrações necessárias para promoção de
crescimento das plantas. Segundo Machado et al (2006) esses compostos, em
grandes quantidades, provocam alterações no metabolismo dos ácidos
nucleicos, aumento da atividade enzimática e destruição do floema, gerando
alongamento, turgescência e rompimento celular. Araújo e Guerreiro (2010)
isolaram bactérias de amostras de solo para avaliar o efeito de sua inoculação
66
em milho onde observaram que maioria dos isolados que promoveram
crescimento do milho não estão entre os maiores produtores de AIA em
laboratório. Patten e Glick (1996) explicam que a adição de AIA microbiano pode
alterar a auxina endógena para nível ótimo ou acima do ótimo, resultando na
indução ou inibição do crescimento da planta.
Microrganismos usam AIA para interagir com as plantas, como parte de
estratégia de colonização, incluindo fitoestimulação e evasão dos mecanismos
de defesa da planta (SPAEPEN et al, 2007). Os fungos que apresentaram
habilidade de produzir esse hormônio (UFT.P 1.5.2 e UFT.P 1.6) (figura 3) foram
isolados da folha adulta da planta Jatropha curcas.
Figura 3. A seta indica presença de AIA revelada pelo reagente de salkowski na
amostra UFT.P 1.5.2 após 168 horas de crescimento do fungo.
Na ausência do L-triptofano a síntese de AIA (Figura 2) apresentou
diferentes concentrações entre o isolados, onde a amostra UFT.P 1.6 obteve a
maior média alcançando a concentração de 10,39 µg.ml-1 com 96 horas de
crescimento. Os fungos UFT.P 3.1.2 e UFT.P 3.2 apesar de apresentarem
médias de até 16,74 µg.ml-1, não demonstraram capacidade de produção de AIA
durante as avaliações, tais resultados foram obtidos devido a produção de
metabólitos de coloração verde lançado no meio de cultura. Ainda que as
amostras UFT.P 1.5.2 e UFT.P 1.6 tenham obtido baixas concentrações de ácido
indolacético na ausência do indutor, observa-se que as mesmas foram as únicas
a produzirem o hormônio. O aminoácido L-triptofano é, preferencialmente,
utilizado pelos microrganismos como precursor na produção de AIA (PATTEN;
GLICK, 1996), assim comparando a produção do fitohormônio pelas linhagens
67
UFT.P 1.5.3 e UFT.P 1.6, na presença e ausência desse aminoácido no meio de
cultura, foi observado que esses isolados apresentaram um aumento na média
de produção de 37,09 µg.ml-1 e 53,94 µg.ml-1, respectivamente.
3.2 Solubilização de Fosfato de Cálcio
Nenhum dos 15 isolados demostraram capacidade de solubilizar fosfato
de cálcio através da metodologia utilizada tanto com pH 4,5 quanto 6,5.
A solubilização de fosfato pode ser avaliada por diversas metodologias
onde diferentes fontes de fosfato podem ser utilizadas. Exemplos de métodos e
meios utilizados para avaliar a capacidade de microrganismos em solubilizar
fosfatos estão relatados em trabalhos como o de Sperber (1958), Nautiyal (1999)
e Sylvester-Bradley et al. (1982).
Souchie et al (2007), avaliaram a habilidade de microrganismos
rizosféricos em solubilizar fosfato em seis meios diferente, onde algumas
linhagens de bactérias não apresentaram capacidade de solubilizar fosfato em
meio com Araxá enquanto conseguiam nos outros meios. Os autores verificaram
que, provavelmente, os íons fosfato estavam complexados em uma forma mais
cristalina no fosfato de Araxá tornando a sua solubilização mais difícil que a de
CaHPO4 formado artificialmente no meio sólido.
O P contido no material de origem do solo encontra-se totalmente na
forma
mineral,
predominando
os fosfatos
de
cálcio
(RHEINHEIMER;
ANGHINONI, 2001), tal fato encorajou a utilização de CaHPO4 para investigação
de fungos solubilizadores de fosfato nesse trabalho.
4. CONCLUSÕES
Os isolados UFT.P 1.5.2 e UFT.P 1.6 foram capazes de sintetizar AIA na
presença e na ausência de triptofano.
Na presença de triptofano esses isolados tiveram picos de produção de 57
e 73, 26 µg.ml-1
Os isolados não apresentaram capacidade de solubilização de fosfato.
68
69
CONCLUSÃO GERAL
Os óleos essenciais de Siparuna guianensis e Eucalyptus globulus
mostraram atividade antifúngica contra os fitopatógenos. As associações desses
óleos também mostraram capacidade de inibir o crescimento micelial desses
microorganismos.
Entre os fungos endofíticos isolados da folha de Jatropha curcas e
Corymbia citriodora, três foram capazes de controlar o crescimento dos fungos
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, in vitro, mas os metabólitos lançados no
meio não apresentaram atividade antifúngica.
Dos fungos isolados, dois isolados endofíticos foram capazes de sintetizar
hormônios indólicos, no entanto nenhum foi capaz de solubilizar fosfato, através
da metodologia testada.
Futuros trabalhos devem ser realizados para melhor avaliação da
atividade antifúngica dos óleos utilizados, além de estudos que avaliem o
desempenho dos mesmos em campo estabelecendo concentrações, veículos e
condições necessários para o a atividade antimicrobiana.
Quanto à atividade antifúngica demonstrada pelos fungos endofíticos,
sugere-se a utilização de outras metodologias na investigação da atividade
antimicrobiana dos metabólitos lançados no meio de cultura, além de testes de
patogenicidade e a avaliação da capacidade de microparasitismos desses
isolados.
Para os isolados que não demonstraram capacidade soluilizadora de
fostato, a avaliação por outras metodologias pode ser indicada, uma vez que a
complexidade das moléculas de fosfato do meio podem influenciar na
capacidade soluilizadora dos microrganismos.
70
REFERÊNCIAS
AKBAR, E.; YAAKOB, Z.; KAMARUDIN, S.K; ISMAIL, M.; SALIMON, J.
Characteristic and composition of Jatropha curcas oil seed from Malaysia and its
potencial as biodiesel feedstock feedstock. European Journal of Scientific
Research, v. 29, n. 3, p. 396-403, 2009.
ALLINGER, N. L.; CAVA, M. P.; JONGH, D. C. DE; JOHNSON, C. R.; LEBEL, N.
A.; STEVENS, C.L. Química Orgânica. Rio de Janeiro: LTC, 2009.
ALMEIDA JUNIOR, A. B.; OLIVEIRA, F. de A.; MEDEIROS, J. F.; OLIVEIRA,
M.K.T.; LINHARES, P,C.F. Efeito de doses de fósforo no desenvolvimento inicial
da mamoneir. Revista Caatinga, v. 22, n.1, p. 217-221, 2009.
ALVINO, F.O.; SILVA, M. F. F. DA; RAYOL, B. P. Potencial de uso das espécies
arbóreas de uma floresta secundária, na Zona Bragantina, Pará, Brasil. Acta
Amazônica, v.35, n.4, p.413-20, 2005.
ARAUJO, F. F. DE; GUERREIRO, R. T. Bioprospecção de isolados de Bacillus
promotores de crescimento de milho cultivado em solo autoclavado e
natural. Ciência e Agrotecnologia, v.34, n.4, p.837, 2010
ARAÚJO,W.L.; LIMA, A. O. S.; AZEVEDO J.L.; MARCON, J.; KUKLINSKY
SOBRAL, J.; LACAVA, P.T. Manual isolamento de microrganismos
endofíticos. Piracicaba: CALQ, 2002. 86 p.
ARRUDA, F. P.; BELTRÃO, N. E. M.; ANDRADE, A. P.; PEREIRA, W. E.;
SEVERINO, L. S. Cultivo de Pinhão Manso (Jatropha Curca L.) como alternativa
para o semi-árido nordestino. Revista Brasileira de Oleaginosas e Fibrosas,
Campina Grande, v.8, n.1, p.789-799, 2004.
ASSUMPÇÃO, L. de C.; LACAVA, P. T.; DIAS, A. C. F.; AZEVEDO, J. L. de;
MENTEN, J. O. M. Diversidade e potencial biotecnológico da comunidade
bacteriana endofítica de sementes de soja. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v. 44, n.5, p.503-510, 2009.
AZEVEDO, J. L.; MACCHERONI JÚNIOR, W.; ARAÚJO, E. L.; PEREIRA, J. O.
Microrganismos endofíticos e seu papel em plantas tropicais. In: SERAFINI, L.
A.; BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia: avanços na agricultura e
na agroindústria. Caxias do Sul: EDUCS, 2002
71
AZEVEDO, J.L. Botânica: uma ciência básica ou aplicada? Rev. bras. bot. v. 22,
p. 225-229, 1999.
BARREIRO, E. J. Biodiversidade: Fonte potencial para a descoberta de
fármacos. Quím. Nova, v. 32, n.3, p. 679-688, 2009.
BASSOLÉ, I. H. N.; JULIANI, H. R. Essential Oils in Combination and Their
Antimicrobial Properties. Molecules, v. 17, p. 3989-4006, 2012.
BENCHIMOL, R. L.; SILVA, C. M. da; VERZIGNASSI, J.R. Utilização de
substâncias naturais para o controle de doenças de Plantas na Região
Amazônica. Belém, PA: Embrapa Amazônia Oriental, 2008. 27 p. (Documentos
346)
BENINI, P. C.; SCHWAN-ESTRADA, K. R. F.; KLAIS, E. C.; CRUZ, M. E. S.;
ITAKO, A. T.; MESQUINE, R. M.; STANGARLIN, J. R.; TOLENTINO JÚNIOR, J.
B. Efeito in vitro do óleo essencial e extrato aquoso de Ocimum gratissimum
colhido nas quatro estações do ano sobre fitopatógenos. Arquivos do Instituto
Biológico, São Paulo, v. 77, n. 4, p. 677-683, 2010.
BERNARDI-WENZEL, J.; SIQUEIRA, A. L.; GONÇALVES, F. A.; HEIN, D. P. R.;
SILVEIRA, J. A.; ROMANI, S. Isolamento e atividade antagonística de fungos
endofíticos de soja (Glycine max (L.) Merril. Sabios: Rev. Saúde e biol. v. 7,n.3,
p. 86-96, 2012.
BERRAQUERO, F.R.; BAYA, A.M.; CORMENZANA, A.R. Establecimiento de
indices para el estudio de la solubilizacion de fosfatos por bacterias del
suelo. Ars Pharmaceutica, v.17, n. 4, p. 399-406, 1976.
BETTUCCI, L.; SARAVAY, M. Endophytic fungi of Eucalyptus globulus: a
preliminary study. Mycological Research, v.97, p.679-682, 1993.
BRUM, R. B. C. 2012. Efeito de óleos essenciais no controle de fungos
fitopatogênicos. 135f. Dissertação (Mestrado em produção Vegatal)
Universidade Federal do Tocantins, Gurupi-TO, 2012.
CABALLERO-MELLADO, J. Microbiologia agrícola y interaciones microbianas
com plantas. Revista Latino Americana de Microbiología, v. 48, n. 2, p. 154161, 2006.
CAFÊU, M. C.; Silva, G. H.; Teles, H. L.; Bolzani, V. da S.; Araújo, A. R.; Young,
M. C. M.; Pfenning, L. H. Substâncias antifúngicas de Xylaria sp., um fungo
endofítico isolado de Palicourea marcgravii (Rubiaceae). Química Nova, v, 28,
n.6, pp. 991-995, 2005.
CARAVACA, F.; BAREA, J. M.;FIGUEROA, D.; ROLDAN, A. Assessing the
effectiveness of mycorrhizal inoculation and soil compost addition for
reafforestation with Olea europaea subsp. sylvestris through changes in soil
72
biological and physical parameters.. AppliedSoilEcology, v. 20, p. 107-118,
2002.
CARNELOSSI, P. R.; SCHWAN-ESTRADA, K. R. F.; CRUZ, M. E. S.; ITAKO, A.
T.; MESQUINI, R. M. Óleos essenciais no controle pós-colheita de Colletotrichum
gloeosporioides em mamão. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,
Botucatu, v. 11, n. 4, p. 399-406, 2009.
CASTRO, J. S. M.; CONFALONIERI, U. Uso de agrotóxicos no Município de
Cachoeiras de Macacu (RJ). Ciência e saúde coletiva, v. 10, n 2, p. 473-482,
2005.
CHAGAS, A. C. S.; PASSOS, W. M.; PRATES, H. T.; LEITE, R. C.; FURLONG,
J.; FORTES, I. C. P. Efeito acaricida de óleos essenciais e concentrados
emulsionáveis de Eucalyptus spp. em Boophilus microplus. Brazilian Journal of
Veterinary Research and Animal Science, v.39, n.5, p. 247-253, 2002.
CHAGAS, L. F. B.; CHAGAS JUNIOR, A. F.; GUILHON, H de C.; ARRUDA, E.
L.; SANTOS, G. R.; MILER, L.O. Trichoderma spp. isolated from soils from the
Southern state of Tocantins for controlo f Sclerotinia sclerotiorum in vitro. Global
Journal of Science Frontier Research Biological, v. 13, n. 5, p. 20-26, 2013.
CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A. B. Pós-colheita de frutas e hortaliças:
fisiologia e manuseio. 2 ed. Lavras: UFLA, 2005
CONTI, R.; GUIMARÃES, D.O.; PUPO, M.T. Aprendendo com as interações da
natureza: Microrganismos simbiontes como fontes de produtos naturais
bioativos. Cien. Cult., v. 64, n. 3, 2012.
CUNHA, A. P.; CAVALEIRO, C.; ROQUE, O. R. Lípidos: constituição química e
estudo dos fármacos gordos. In: CUNHA, A. P. Farmacognosia e fitoquímica.
Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005. p. 185.
D'ARRIGO, M., GINESTRA, G., MANDALARI, G., FURNERI, P. M., &
BISIGNANO, G. Synergism and postantibiotic effect of tobramycin and
Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against Staphylococcus aureus and
Escherichia coli. Phytomedicine, v. 17, n.5, 317-322, 2010
DESHMUKH, S.H. The maintenance and preservation of keratinophilic fungi end
related dermatophytes. Mycoses, v. 46, p. 203-207, 2013.
DJILANI, A.; DICKO, A. 2012. The Therapeutic Benefits of Essential Oils,
Nutrition, Well-Being and Health. In Tech: Croácia, 2012.
DUARTE, M. de L. R.; TABARANÃ, M. G. F.; ALBUQUERQUE, F. A. B.;
MORAES, A. J. G. Controle químico da podridão –das- estacas (Sclerotim rolfsii)
da pimenta do reino. Embrapa. Comunicado técnico, 2006
73
EDGINGTON, L.V.; KHEW, K.L. & BARRON, G.L. Fungitoxic spectrum of
benzimidazole compounds.Phytopathology, v.61, n.1, p.42-44, 1971.
FAGERIA, N. K. Efeito da calagem na produção de arroz, feijão, milho e soja em
solo de cerrado. Pesquisa Agropecária Brasileira, v. 36, n. 11, p. 1419-1424,
2001.
FERNANDES, A. O. Bactérias endofíticas e fungos micorrízicosarbuscular na
produção de mudas cítricas. 2012. 67 f. Dissertação. (Mestrado em Agicultura
Tropical e Subtropical) Instituto Agronômico, Campinas, 2012.
FERNANDES, F.L.; PICANÇO, M. C.; FERNANDES, M. E. de S.; XAVIER, V.
M.; MARTINS, J. C.; SILVA, V. F. Controle biológico natural de pragas e
interações ecológicas com predadores e parasitoides em feijoeiro.Bioscience
Journal, v. 26, n. 1, p. 6-14, 2010.
FERREIRA, R de F.; CARDOSO, I.C.M.; SILVA, C.F; SOUCHIE, E. L.;
CARNEIRO, M.A.C. Rice response toinoculationwith P-solubilizing
microorganisms from Brazilian cerrado. Biosci. J. v. 25, n. 5, p. 1-7, 2009.
FISCHER, D.C.H. et al. Essential oils from fruits and leaves of Siparuna
guianensis (Aubl.) Tulasne from Southeastern Brazil. Journal of Essential Oil
Research, v.17, n.1, p.101-4, 2005.
FRANZ, C. M. Essential oil research: past, present and future. Flavour
Fragrance Journal, v. 25, p. 112-113, 2010
FUKUDA, E. K.; VASCONCELOS, A. F. D.; MATIAS, A. C.; BARBOSA, A. de M.;
DEKKER, R. F. H.; SILVA, M. de L. C. Polissacarídeos de parede celular fúngica:
Purificação e Caracterização. Semina: Ciências Agrárias, v. 30, n.1, p. 117-134,
2009
GARCIA, M. N.; SANTOS, V. A. H. F.; DEMARTINI, W. F. B.; ROSALINO, W.;
VARGAS, R.; SANTOS, J. P. Potencial de Desenvolvimento, em Casa de
Vegetação, de Miniestacas do Híbrido de Eucalyptus grandis x Eucalyptus
camaldulensis/Development Potential, in a Greenhouse, of Cuttings of the Hybrid
Eucalyptus grandis x Eucalyptus cam. Scientific Electronic Archives, v.2, v.1,
p.10-14, 2013.
GONDON, M. C.; NEWMAN, D. J. Natural products: A continuing sourcer of novel
drung leads. Biochimica et biophysica acta- General Subjects, v. 1830, p.
3670-3695, 2013.
GORDON, S.A.; WEBER, R.P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant
Physiology, v. 26, p. 192-195, 1951.
74
GUEDES, F. F. S. Controle do fungo Aspergillus sp. em sementes de
Bauhinia forficata. 19f. Monografia ( Graduação do curso de Engenharia
Florestal). Patos, Universidade Federal de Campina Grande, 2009.
GWINN, K.D., OWNLEY, B.H., GREENE, S.E., CLARK, M.M., TAYLOR, C.L.,
SPRINGFIELD, T.N.TRENTLY, D.J., GREEN, J.F., REED, G.A. & HAMILTON,
S.L. Role of essential oils in control of Rhizoctonia damping-off in tomato with
bioactive monarda herbage. Phytopathology, v.100, p. 493-501, 2010.
HARDOIM, P. R.; HARDOIM, C. C.; VAN OVERBEEK, L. S.; VAN ELSAS, J. D.
Dynamics of seed-borne rice endophytes on early plant growth stages. PloS
one, v.7, n.2, p.30438, 2012.
HILLEN, T. SCHHWAN-ESTRADA, K. R.F.; MESQUINI, R.M.; CRUZ, M.E.S.;
STANGARLIN, J.R.; NOZAKI, M. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais
no controle de alguns fitopatógenos fúngicos in vitro e no tratamento de
sementes. Rev. bras. plantas med. v.14, n.3, p. 439-445, 2012
HUANG, X.; ZHANG, N.; YONG, X.; YANG, X.; SHEN, Q. Biocontrol of
Rhizoctonia solanidamping-off disease in cucumber with Bacillus pumilus SQRN43. Microbiol Res, v.167, p.135–43, 2011
INNOCENTI, G.; GARIBYAN, N. G.; BADALYAN, S. M. Antagonistic activity of
xylotrophic mushrooms against pathogenic fungi of cereals in dual
culture.Phytopathologia Mediterranea, v. 41, n. 3, p. 220-225, 2002.
KAREMU, C. K.; NDUNG’U, M.W. GITHUA, M. Repellent effects of essential oils
from selected eucalyptus species and their major constituents against Sitophilus
zeamais (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of tropical insecto,
v. 33, n. 03, p. 188-194, 2013.
KUMAR, S.; KAUSHIK, N. Endophytic fungi isolated from oil-seed crop Jatropha
curcas produces oil and exhibit antifungal activity. Plos One, v. 8, n. 2, p. 1-8,
2013.
KUSARI, S; LAMSHÖ, H.M.; ZUHLKE, S.; SPITELLER, M. An endophytic fungus
from Hypericum perforatum that produces hypericin. J. Nat. Prod, v.71, p. 159162, 2008.
LAVIOLA, B. G.; DIAS, L. A. S. Teor e acúmulo de nutrientes em folhas e frutos
de pinhão-manso. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v.32, n.5, p.
1969-1975, 2008
LI, C. H., SHI, L., HAN, Q., HU, H. L., ZHAO, M. W., TANG, C. M., & LI, S. P.
Biocontrol of verticillium wilt and colonization of cotton plants by an endophytic
bacterial isolate. Journal of applied microbiology, v.113, n.3, p.641-651, 2012.
LICHUN, Y.; QI, Z.; KEHUA, Z.; SHUNLIN, Y.; WENLIN, Q.; MINGZHONA, Z.;
JIE, J. LU, E.; XINYN, C.; YUANHONG, F. Isolation and identification of
75
endophytes from Jatropha curcas by ITS analysis. Southwest China Journal of
Agricultural Sciences, v. 22, n. 1, p. 95-98, 2009.
LÓPEZ, P. V. A. Bioprospecção de extratos de Croton urucurana BAILL e seus
fungos endofíticos. 138 f. Dissertação. (Mestrado em Microbiologia)
Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2010.
LORENZETTI, E.R., MONTEIRO, F.P., SOUZA, P.E., SOUZA, R.J., SCALICE,
H.K., DIOGO JR, R., PIRES, M.S.O. Bioatividade de óleos essenciais no controle
de Botrytis cinerea isolado de morangueiro. Rev. bras. plantas med., Botucatu,
v. 13, p. 619-62, 2011.
LUZ, J. S., DE OLIVEIRA SILVA, R. L., DA SILVEIRA, E. B., CAVALCANTE, U.
M. T. Atividade enzimática de fungos endofíticos e efeito na promoção do
crescimento de mudas de maracujazeiro-amarelo. Revista Caatinga, v.19, n. 2
p. 128-134, 2006.
MACEDO, I.T.F; BEVILAQUA, C.M.L.; OLIVEIRA, L.M.B.; CAMURÇAVASCONCELOS, A. L.F.; VIEIRA, L. da S.; OLIVEIRA, F. R.; QUEIROZJUNIOR, E.; PORTELA, B. G.; BARROS R. S.; CHAGAS, A. C. S. Atividade
ovicida e larvicida in vitro do óleo essencial de Eucalyptus globulus sobre
Haemonchus contortus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 18,
n. 3, p. 62-66, 2009.
MACHADO, R. F.; BARROS, A. C. S. A.; ZIMMER, P. D., AMARAL, A. dos S.
Reflexos do mecanismo de ação de herbicidas na qualidade fisiológica de
sementes e na atividade enzimática em plântulas de arroz. R. Bras. Sementes,
v. 28, n. 3, p. 151-160, 2006.
MACKAY, M.L.; MILNE, I.M.; GOULD, I.M. Comparison of methods for assessing
synergic antibiotic interactions. Int. J. Antimicrob. Agents, v. 15, p. 125–129,
2000.
MARASCIULO, C.; CAVINATTO, S.; STUKER, C.; MALDANER, G.; DALCOL, I.;
MOREL, A. Isolamento, caracterização e avaliação da atividade antimicrobiana
de um flavonóide glicosilado de Pavonia distinguenda St. Hill e
MARCHIORO, T.E.L. 2005. Produção de ácido indol acético e derivados por
bactérias fixadoras de nitrogênio. Tese de Doutorado, Pós-Graduação em
Microbiologia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2005.
MARIANO, R. L. R. Métodos de seleção in vitro para o controle microbiológico
de patógenos de plantas. Revisão Anual de Patologia de Plantas, v. 1, p. 69 409, 1993.
76
MARRA, L. M. 2012. Solubilização de fosfato por bactérias e sua contribuição no
crescimento de leguminosas e gramíneas. 142f. Tese (Doutorado em Ciência do
solo). Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, 2012.
MARTINEZ, J. A. Natural fungicides obtained from plants. In:
DHANASEKARAN, D.; THAJUDDIN, N.; PANNERSELVAM, A. fungicides for
plant and animal diseases. s/l:Intech, janeiro 2012. Disponível:
http://www.intechopen.com/books/fungicides-for-plant-and-animaldiseases/natural-fungicides-obtained-from-plants. Acesso em: 05 nov. 2013.
MARTINS, C. C.; MACHADO, C. G.; CAVASINI, R. Temperatura e substrato para
o teste de germinação de sementes de pinhão-manso. Ciência e
Agrotecnologia, Lavras, v.32, n.3, p. 863-868, 2007
MARTINS, M. V.V.; SILVEIRA, S.F.; MUSSI-DIOS, V.; VIEIRA, H.D. Efeito da
temperatura e umidade do substrato na viabilidade de Sclerotium rolfsii. Acta
Scientiarum Agronomy, v. 32, n. 2, p. 217-222, 2010.
MERCIER, H. Auxinas. In: KERBAUY, G. B. Fisiologia vegetal. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2004.
MICHEREFF, S. J. et al. Importância dos patógenos e das doenças radiculares
em solos tropicais. In: MICHEREFF, S. J.; ANDRADE, D. E.G. T.; MENEZES, M.
(Ed.). Ecologia e manejo de patógenos radiculares em solos tropicais.
Recife: Universidade Federal Rural de Pernanbuco, 2005.
MMA-MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE. 2013. Biodiversidade brasileira.
www.mma.gov.br/biodiversidade/biodiversidade-brasileira. Acesso em Janeiro
de 2013
MONTANARI, R. M. 2010. Composição química e atividades biológicas dos
óleos essenciais de espécies de Anacardiacea, Siparunaceae e
Verbenaceae. 173f. Tese. (Doutorado em Agroquímica). Universidade Federal
de Viçosa, Minas Gerais, 2010.
MULLEN, J. Southern blight, Southern stem blight, White mold. The Plant Health
Instructor,
2001.
Disponível
em:
http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/fungi/Basidiomycetes/Pages/So
uthernBlight.aspx. Acesso: 11 ago 2013.
MULYANINGSIH, S.; SPORER, F.; ZIMMERMANN, S.; REICHLING, J.; WINK,
M. Synergistic properties of the terpenoids aromadendrene and 1, 8-cineole from
the essential oil of Eucalyptus globulus against antibiotic-susceptible and
antibiotic-resistant pathogens. Phytomedicine, v.17, n.13, p.1061-1066, 2010.
77
NAIK, B. S.; SHASHIKATA, J.; KRISHNAMURTHY,Y.L. Study on the diversity of
endophytic communities from rice (Oryza sativa L.) and their antagonistic
activities in vitro. Microbiological Research, v. 162, n. 3, p. 290-296, 2009.
NAUTIYAL, C. S. An eficiente microbiological growth medium for screening
phosphate solubilizing microorganisms. FEMS MicrobiologyLetters,
Amsterdam, v .170, p. 265-270, 1999.
NECHET, K.L.; HALFELD-VIEIRA, B.A. Reação de cultivares de feijão-caupi à
mela (Rhizoctonia solani) em Roraima. Fitopatologia Brasileira. s.l., v.32, s.n.,
p. 424-428, 2007.
OLIVEIRA, C. T. Controle biológico: Fungos endofíticos com potencial
antagônico a antracnose da soja (Glycine max (L.) Merr). In: X Congresso de
Ecologia do Brasil, São Lourenço – MG. 2011a.
OLIVEIRA , J. S. B.; MAIA, A. J.; SCHWAN-ESTRADA, K. R.F. CARNEIRO, S.
M. T. P.G; BONATO, C. M. Indução de fitoalexinas em hipocótilos de feijoeiro
por preparados homeopáticos de Eucalyptus citriodora. In: Congresso Brasileiro
de Agroecologia, 7, 2011, Fortaleza. Resumos do VII Congresso Brasileiro de
Agroecologia. Fortaleza: Cadernos de Agroecologia ,v. 6, n. 2, 2011b.
OLIVEIRA, A. G. D.; CHAGAS JUNIOR, A. F.; SANTOS, G. R. D.; MILLER, L.
O.; CHAGAS, L. F. B. Potencial de solubilização de fosfato e produção de AIA
por Trichoderma spp. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento
Sustentável, v. 7, n. 3, p. 149-155, 2012.
OLIVEIRA, E. C. P.; LAMEIRA, O. A.; BARROS, P. L. C. de; POLTRONIERI, L.
S. Avaliação do óleo de copaíba (Copaifera spp) na inibição do crescimento
micelial in vitro de fitopatógenos. Ciências Agrárias, n. 46, p. 53-63, 2006
PARREIRA, P. F.; NEVES, W. dos S.; ZAMBOLIM, L. Resistência de fungos a
fungicidas inibidores de quinona. Revista trópica – Ciências agrárias e
biológicas, v. 3, n. 2, p. 24-34, 2009.
PATTEN, C.L.; GLICK, B.R. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic
acid. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v.42, p.207-230, 1996.
PEIXOTO NETO, P.A.S.; AZEVEDO, J.L.; ARAÚJO, W.L. Microorganismos
endofíticos: interação com plantas e potencial biotecnológico. Revista
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, n.29, p.62-76, 2002.
PEREIRA, C. S. S. Avaliação de diferentes tecnologias na extração do Óleo
do Pinhão-manso (Jatropha curcas L). 2009. 70f. (Dissertação de Mestrado
em Engenharia Química). Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
Seropédica, 2009.
78
PEREIRA, R. B.; LUCAS, G. C.; PERINA, F. J.; RESENDE, M. L. V.; ALVES, E.
Potential of essential oils for the control of brown eye spot in coffee plants.
Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 35, n. 1, p. 115-123, 2011.
PIATI, A.; SCHNEIDER, C. F.; NOZAKI, M. H. Efeito in vitro do óleo essencial de
Eucalyptus globulus sobre o crescimento e desenvolvimento de Penicillium
sp. Semina: Ciências Agrárias, v. 32, n. 3, p. 1033-1040, 2011
PIMENTEL, I. C.; FIGURA, G.; AUER, C. G. Endophytic fungi associated to Pinus
taeda needles. Summa Phytopathologica, v.36, n.1, p.85-88, 2010.
PIMENTEL, I. C.; KUCZKOWSKI, F.R.; CHIME, M. A.; AUER, C.G.;
GRIGOLETTI JÚNIOR, A. Fungos endofíticos em folhas de erva-mate ( Ilex
paraguarinsis A. St-Hil). Floresta, v. 36, n.1, 2006.
PRAGADHEESH, V. S., YADAV, A., SINGH, M., & CHANOTIYA, C. S.
Characterization of volatile components of Zingiber roseum essential oil using
capillary GC on modified cyclodextrins. Natural product communications, v. 8,
n. 2, p. 221-224, 2013.
PROBST, I. da S. Atividade antibacteriana de óleos essenciais e avaliação
de potencial sinérgico. 2012. 112 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Geral
e Aplicada) – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2012.
RANGEL, E. T. 2010. Ativida antiprotozoária, antifúngica e citotóxica de
extratos de plantas do bioma Cerrado, com ênfase em Leshmania
(Leschimania) chagasi. 128f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde)
Universidade de Brasília, Brasília, 2010.
RHEINHEIMER, D. S.; ANGHINONI, I. Distribuição do fósforo inorgânico em
sistemas de manejo de solo, Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 36,
n. 1, p. 151-160, 2001.
RHODEN, S.A.; GARCIA, A.; BONGIORNO, V. A.; AZEVEDO, J.L.; PAMPHILE,
J.A. Antimicrobial Activity of Crude Extracts of Endophytic Fungi Isolated from
Medicinal Plant Trichilia elegans A. Juss. Journal of Applied Pharmaceutical
Science, v. 02 n. 08, p. 57-59, 2012.
ROCHA, A.C.S. 2007.Antagonismo in vitro de fungos endofíticos, Isolados
de Hevea brasiliensis, contra o Microcyclus ulei (fungo causador do
maldas-Folhas na seringueira). 141f. Dissertação. (Mestrado em
Biotecnologia) Universidade Federal de Feira de Santana, Feira de Santana-BA,
2007.
ROCHA, R.; LUZ, D. E. DA; ENGELS, C.; PILEGGI, S. A. V.; JACCOUD FILHO,
D. DE S.; MATIELLO, R. R.; PILEGGI, M. Selection of endophytic fungi from
comfrey (Symphytum officinale L.) for in vitro biological control of the
phytopathogen Sclerotinia sclerotiorum (Lib.). Braz. J. Microbiol., São Paulo, v.
40, n. 1, p. 73-78, 2009.
79
ROCHA-COELHO, F.B.; SANTOS, M.G. Plantas medicinais utilizadas pela
Comunidade Mumbuca Jalapão - TO: Um estudo etnofarmacológico. Pesquisa
e
Conservação
do
Cerrado.
Disponível
em:
<http://www.pequi.org.br/Coelho_&_Santos.pdf.>. Acesso em: 28 out. 2012.
RODRIGUES, E. P.; OLIVEIRA, A. L. M.; VIDAL, M. S.; SIMÕES-ARAÚJO, J. L.;
BALDANI,
J.I.
Obtenção
e
seleção
de
Mutantes
Tn5
de
Gluconacetobacterdiazotrophicus( Pal 5) com alterações na produção de
auxinas. Seropédica: EMBRAPA Agrobiologia, 2007. (boletim de pesquisa e
desenvolvimento/ Embrapa Agrobiologia, ISSN 1516-2311, 27).
SANTOS, A, C, dos; ROSSATO, M.; SERAFINO, L. A.; BRUNO, M.; CRIPPA,
L.B., SARTORI, V. C.; DELLACASSA, E., MOYNA, P. Efeito fungicida dos óleos
de Schinus molle L. e Schinus terebinthifolius Roddi, Anacardiaceae, do Rio
Grande do Sul. Revista brasileira de farmacologia, v. 20, n. 2, p. 154-159,
2010.
SANTOS, R. P.; TREVISAN, M.T.S.; SILVEIRA, E.R.; PESSOA, O. P.; MELO,
V. M.M..Composição química e atividade biológica das folhas e frutos de
Triphasia trifolia. Quím. Nova v.31, n.1, pp. 53-58, 2008a.
SANTOS, R.P.; CARVALHO FILHO, M. R.; MARTINS, I. Avaliação de isolados
de Trichoderma spp. e Gliocladium virens na promoção de crescimento em
mudas de Eucalipto e na produção de ácido indolacético in vitro. Brasilia:
EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA, 2008b.
SARIN, R.; SHARMA, M.; SINHARAY, S.; MALHOTRA, R.K. Jatropha-Palm
biodiesel blends: na optimum mix for Asian. Fuel, n. 86, p. 1365-1371, 2007.
SATORATO, A.; RAVA, C. A.; CARDOSO, J. E. Mela ou murcha da teia micélica.
In: ARAUJO, Ricardo Silva et al. Cultura do Feijoeiro comum no Brasil.
Piracicaba: POTAFOS, 1996
SATORATO, A.; RAVA, C. A.; CARDOSO, J. E. Mela ou murcha do feijoeiro. In:
SATORATO, Aloisio; RAVA, Carlos A. Principais doenças do feijoeiro comum
e seu controle. Brasília: EMBRAPA –SPI, 1994.
SBRAVATTI JUNIOR, J. A. Seleção de fungos endofíticos para o controle
biológico de Botrytis cinerea Pers.: Fr em mudas de Eucalyptus benthamii
maiden et Cambage. 2013. Dissertação. (Mestrado em Engenharia Florestal) –
Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2013.
SBRAVATTI JUNIOR, J. A., AUER, C. G., PIMENTEL, I. C., DALZOTO, P. D. R.,
& SCHULTZ, B. Seleção in vitro de fungos endofíticos para o controle biológico
de Botrytis cinerea em Eucalyptus benthamii. Revista Floresta, v.43, n.1, p.145-
80
152, 2013.
SCOLLARD, J.; FRANCIS, G. A.; O’BEIRNE. Some conventional and latent antilisterial effects of essential oils, herbs, carrot and cabbage in fresh-cut vegetable
systems. Postharvest Biol Technol, v. 77, p.87-93, 2013.
SHWETA, S., GURUMURTHY, B.R., RAVIKANTH, G., RAMANAN, U.S.,
SHIVANNA, M.B. Endophytic fungi from Miquelia dentata Bedd., produce the
anti-cancer alkaloid, camptothecine. Phytomedicine, v.20, p. 337-342, 2013.
SILVA, D.M.H.; BASTOS, C.N. Atividade antifúngica de óleos essenciais de
espécies de Piper sobre Crinipellis perniciosa, Phytophthora palmivora e
Phytophthora capsici. Fitopatologia Brasileira, v 32, p.143-145, 2007.
SILVA, F. DE A.S.; AZEVEDO, C.A.V. Principal components analysis in the
software assistat-statistical attendance. In: WORLD CONGRESS ON
COMPUTERS IN AGRICULTURE, 7, Reno-NV-USA: American Society of
Agricultural and Biological Engineers, 2009.
SILVA, G. H.; OLIVEIRA, C.M.; TELES, H.L.; BOLZANI, V da S.; ARAÚJO, A.
R.; PFENNING, L.H.; YONG, M.C.M.; COSTA-NETO, C.M.; HADDAD, R.;
EBERLIM, M.N. Citocalasinas, produzidas por Xylaria sp. um fungo endfíticode
Piper aduncum (PIPERACEAE). Quim. Nova, v. 33, n. 10, p. 2038-2041, 2010.
SILVA, H.S.; BETTIOL, W.; TERRASAN, C. R. F.; TOZZI, J.P.L.; MELO, I. S.;
NUNES, F. V. Microrganismos endofíticos: pontencial de uso como agente de
biocontrole da ferrugem do cafeeiro. Jaguariúna: Embrapa Micro Ambiente,
2006b.
SILVA, N. A.; OLIVEIRA, F. F.; COSTA, L. C. B.; BIZZO, H. R.; OLIVEIRA, R. A.
Caracterização química do óleo essencial da erva cidreira (Lippia alba (Mill.) N.
E. Br.) cultivada em Ilhéus na Bahia. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,
Botucatu, v.8, n.3, p.52-55, 2006a.
SILVA, P. Farmacologia. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010.
SILVA, P.H.M. da; BRITO, J.O.; SILVA JUNIOR, F.G. da. Potencial of eleven
Eucalyptus species for the prodution of essencial oils. Scientia Agricola, v. 63,
n.1, p. 85-89, 2006.
SILVA, R. L. DE O.; LUZ, J. S.; DA SILVEIRA, E. B.; CAVALCANTE, U. M. T.
Fungos endofíticos em Annona spp.: isolamento, caracterização enzimática e
promoção do crescimento em mudas de pinha (Annonasquamosa L.). Acta bot.
bras, n. 20, v.3, p. 649-655, 2006.
SILVEIRA, P. M.; ZIMMERMANN, F. J. P.; SILVA, S. C.; CUNHA, A. A.
Amostragem e variabilidade espacial de características químicas de um latossolo
submetido a diferentes sistemas de preparo. Pesquisa Agropecuária
81
Brasileira, v. 35, n. 10, p. 2057-2064, 2000.
SIMÕES, C. M. O.; SPITZER, V. Óleos voláteis. In: SIMÕES, et al.
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6 ed. Porto Alegre: Editora da
UFRGS; Editora da UFSC, 2007. p.467.
SOBRINHO, C. A.; VIANA, F. M. P.; SANTOS, A. Doenças fúngicas e
bacterianas. In: FREIRE FILHO, Francisco Rodrigues; LIMA, José Ribeiro de
Araújo, RIBEIRO, Valdemir Queiroz. Feijão – Caupi: Avanços tecnológicos.
Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2005
SOLOMONS, T. W. G., FRYHLE, C B. Química orgânica. 9 ed. Rio de Janeiro:
LTC, 2009. 494p.
SOUCHIE, E. L; ABBOUD, A. C. de S.; CAPRONI, A. L. Solubilização de fosfato
in vitro por microorganismosrizosféricos de guandu. Bioscience Journal, v. 23,
n. 2, 2007.
SOUZA JÚNIOR, I.T.; SALES, N.L.P.; MARTINS, E.R. Efeito fungitóxico de óleos
essenciais sobre Colletotrichum gloeosporioides, isolado do maracujazeiro
amarelo. Revista Biotemas. v. 22, n.3, p. 77-83, 2009
SOUZA, A. Q. L.; SOUZA, A. D. L.; ASTOLFI FILHO, S.; PINHEIRO, M. L. B, ;
SARQUIS, M,I. M.; PEREIRA, J. O. Atividade antimicrobiana de fungos
endofíticos isolados de plantas tóxicas da amazônia: Palicourea longiflora (aubl.)
rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amazônica, v. 34, n. 2, p. 185-195,
2004.
SOUZA, S. A. M.; MEIRA, M. R.; FIGUEIREDO, L. S.; MARTINS, E. R. Óleos
essenciais: Aspectos econômicos e sustentáveis. Enciclopédia Biosfera, v.6,
p. 1-11, 2010.
SOUZA, S. M. C. de; PEREIRA, M. C.; ANGÉLICO, C. L.; PIMENTA, C. J.
Avaliação de óleos essenciais de condimentos sobre o desenvolvimento micelial
de fungos associados a produtos de panificação. Revista Ciência Agrotécnica,
Lavras, v. 28, n. 3, p. 685-691, 2004.
SPAEPEN, S., VANDERLEYDEN, J., REMANS, R. Indole‐3‐acetic acid in
microbial andmicroorganism‐plantsignaling. FEMS microbiologyreviews, v. 31,
n. 4, p. 425-448, 2007.
SPERBER, J. L. The incidence of apatite-solubilizing organisms in the rhizosphe
reand soil. Australian Journal of Agriculture Research. Collingwood, v. 9, p.
778-781, 1958.
SPINELLI, V.M.; ROCHA, R.B.; RAMALHO, A.R.; MARCOLAN, A.L.; VIEIRA
JUNIOR, J.R.; FERNANDES, C. de F.; MILITÃO, J.S.T.; DIAS, L. A. dos S.
Componentes primários e secundários do rendimento de óleo de pinhão-manso.
Ciência Rural, v. 40, n.8, p. 1752-1758, 2010
82
STEENHOUDT, O.; VANDERLEYDEN, J. Azospirillum, a free-living nitrogenfixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and
ecological aspects. FEMS Microbiology Reviews, v.24, p.487-506, 2000.
SYLVESTER-BRADLEY, R.; ASAKAWA, N.; LA TORRACA, S.; MAGALHÃES,
F.M.M.; OLIVEIRA, L.A.; PEREIRA, R.M. Levantamento quantitativo de
microrganismos solubilizadores de fosfato na rizosfera de gramíneas e
leguminosas forrageiras na Amazônia. Acta Amazonica, v.12, p15-22, 1982.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2009
TOLÊDO-SOUZA, E.D.; LOBO JÚNIOR, M.; SILVEIRA, P.M.; CAFÉ FILHO, A.
C. Interações entre Fusarium solani f. sp phaseoli e Rhizoctonia solani na
severidade da podridão radicular do feijoeiro. Pesquisa agropecuária tropical,
v. 39, n.1, p, 13-17, 2009.
VALENTINI, C.M.A; RODRIGUEZ-ORTIZ, C.E; COELHO, M.F.B. Siparuna
guianensis Aublet (negramina): uma revisão. Revista brasileira de plantas
medicinais, v.12, n.1, p. 96-104, 2010.
VELLUTI, A. et al. Effect of essential oils of cinnamon, clove, lemon grass,
oregano and palmarosa on growth of and fumonisin B-1 production by Fusarium
verticilloides in maize. Journal of Science of Food and Agriculture, v.84, n.10,
p.1141-6, 2004.
VERZIGNASSI, J. R.; HOMECHIN, M. VIDA, J. B. Fungos endofíticos. Semina:
Ciência Agrícola, v. 17, n. 1, p 93-98, 1998.
VIANA, F.A. et al. Essential oil of Siparuna guianensis Aublet from the Amazon
Region of Brazil. Journal of Essential Oil Research, v.14, p.60-2, 2002.
VIEGA JR, C.; BOLZANI, V. da S.; BARREIRO, E. J. Os produtos naturais e a
química medicinal moderna. Química Nova, v. 29, n. 2, 326-337, 2006.
VILELA, G. 2007. Efeito do óleo essencial de Eucalyptus globulus sobre
espécies produtoras de aflotoxinas. Dissertação (Mestrado em Ciências) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2007
YANG, P.; SUN, Z. X.; LIU, S. Y.; LU, H. X.; ZHOU, Y.; SUN, M. Combining
antagonistic endophytic bacteria in different growth stages of cotton for control of
Verticillium wilt. Crop Protection, v.47, p.17-23, 2013.
ZANDONÁ, G. L. Avaliação de estudos de atividades químicas e biológicas
em plantas medicinais da região de Dourados-MS. 2009. 36f. Monografia
83
(Gradação em Química) Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul,
Dourados. 2009.
ZHAO, Y., HULL, A. K., GUPTA, N. R., GOSS, K. A., ALONSO, J., ECKER, J.
R., CELENZA, J. L. Trp-dependentauxinbiosynthesis in Arabidopsis:
involvementofcytochrome
P450s
CYP79B2
and
CYP79B3. Genes
&Development, v.16, n.23, p. 3100-3112, 2002.
ZHOU, F.; JI, B.; ZHANG, H.; JIANG, H.; YANG, Z.; LI, Z.; LI, J.; YAN, W. The
antibacterial effect of cinnamaldehyde, thymol, carvacrol and their combinations
against the foodborne pathogen Salmonella typhimurium. Journal of food
safety, v. 27, p. 124-133, 2007.
84