universidade federal da paraiba centro de ciencias

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA
CENTRO DE CIENCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ANALISE MORFOLÓGICA, QUÍMICA E MOLECULAR DE DIFERENTES
TÁXONS DE MANIHOT COM ÊNFASE NA MANIÇOBA (Manihot pseudoglaziovii
PAX E HOFFMANN.) DE INTERESSE FORRAGEIRO
FABIANA AUGUSTA SANTIAGO BELTRÃO
AREIA – PB
FEVEREIRO - 2006
ii
FABIANA AUGUSTA SANTIAGO BELTRÃO
ANALISE MORFOLÓGICA, QUÍMICA E MOLECULAR DE DIFERENTES
TÁXONS DE MANIHOT COM ÊNFASE NA MANIÇOBA (Manihot pseudoglaziovii
PAX E HOFFMANN.) DE INTERESSE FORRAGEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Zootecnia,
da
Universidade Federal da Paraíba, como
parte das exigências para a obtenção do
titulo de Mestre em Zootecnia.
Comitê de Orientação:
D.Sc Divan Soares da Silva – Orientador Principal
D.Sc. Patrícia Mendes Guimarães Beelen
D. Sc. Rômulo Marinho LLamoca Zárate
AREIA – PB
FEVEREIRO - 2006
iii
Ficha catalográfica elaborada na Seção de Processos Técnicos da Biblioteca
Setorial de Areia -PB, CCA/UFPB.
Bibliotecária: Elisabete Sirino da Silva CRB-1409
B453c Beltrão,Fabiana Augusta Santiago.
Analise Morfológica, Química e Molecular de Diferentes Táxons de
Manihot com Ênfase na Maniçoba (Manihot Pseudoglaziovii|Pax e
Hoffmann.) de interesse forrageiro. Fabiana Augusta Santiago
Beltrão- – Areia, PB: CCA/UFPB, 2006 85 f.:il.
Dissertação (Mestrado em Zootecnia) pelo Centro de Ciências Agrárias,
da Universidade Federal da Paraíba.
Orientador: Divan Sares da Silva
1. Maniçoba- Maninhot pseudglaziovii Pax e Hoffm. 2.
Maniçoba-morfologia 3. Maniçoba-caracterização química.
I.Silva, Divan Sares da (Orientador.) . II. Título.
2.
CDU:633.912.7 (043.3)
iv
FABIANA AUGUSTA SANTIAGO BELTRÃO
ANALISE MORFOLÓGICA, QUÍMICA E MOLECULAR DE DIFERENTES
TÁXONS DE MANIHOT COM ÊNFASE NA MANIÇOBA (Manihot pseudoglaziovii
PAX E HOFFMANN.) DE INTERESSE FORRAGEIRO
Dissertação Aprovado pela Comissão Examinadora em:20/02/2006
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Prof. Dr.Divan Soares da Silva
Orientador
Universidade Federal da Paraíba/CCA
_____________________________________________________
Prof. Dr. Glesser Porto Barreto
Examinador
Universidade Federal de Pernambuco/UAG
__________________________________________________________
Prof. Dr.Leonardo Pessoa Feliz
Examinador
Universidade Federal da Paraíba/CCA
AREIA – PB
FEVEREIRO- 2006
v
A Deus, pelo milagre da vida.
Aos meus pais, Edvaldo Beltrão e Annie Elizabeth, pelo grande apoio em todas as fases da
minha vida;
As minhas filhas Annie e Adriana com muito carinho;
Aos meus irmãos, Sandra, Edvaldo, Eduardo, Adriana, Annie e Danilo pela nossa
amizade;
DEDICO
vi
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal da Paraíba, em especial, ao Programa de Pós-graduação em
Zootecnia, pela oportunidade de realização deste curso.
Á CAPES, pela concessão de bolsa de estudos, no transcorrer do curso.
Ao professor Divan Soares da Silva, pela orientação e confiança. Nosso
reconhecimento.
Ao professor Ariosvaldo Nunes de Medeiros, pela compreensão e amizade; Nossa
gratidão.
Ao professoror Leonardo P. Felix pela colaboração na condução deste trabalho.
Aos professores Rômulo Marino Llamoca Zarate e Patrícia Mendes Guimarães
Beelen pela colaboração na condução deste trabalho.
Aos professores Severino Gonzaga Neto e Edgard Cavalcanti Pimenta Filho pela
valiosa colaboração:
Ao Prof. Dr. Walter Esfrain Pereira pelas análises estatísticas e sugestões para a
melhoria deste trabalho;
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Zootecnia, pelos
ensinamentos.
Aos funcionários do PPGZ: Graça, Dona Carmem e Damião, pelos momentos de
descontração.
Aos funcionários do Laboratório de Nutrição Animal na condução das análises
Aos funcionários do Laboratório de Biologia Molecular na condução das análises;
Aos amigos da minha turma da pós-graduação;
Aos demais amigos conquistados durante nossa jornada acadêmica:Verônica, Maria
do Socorro, Merilândia, Marcos Jacob, Janete. Enfim, a todos, que por motivo de
esquecimento deixei de mencionar, mas que contribuíram na concretização deste sonho.
Em especial a Lourielton Alves da Fonseca pela ajuda junto ao trabalho;
Agradeço ao tempo... Mesmo tendo-o como principal inimigo pude vencê-lo.
Muito obrigado!
vii
SUMÁRIO
Página
Revisão de literatura................................................................................................................. 4
Referências Bibliográficas.......................................................................................................
Capítulo 1 – Morfométria de acessos de Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax e
Hoffmann.) e de duas Espécies Afins de Interesse Forrageiro.................................................
Resumo....................................................................................................................................
Abstract...................................................................................................................................
Introdução...............................................................................................................................
Material e Métodos..................................................................................................................
Resultados e Discussão............................................................................................................
Conclusões...............................................................................................................................
Referências Bibliográficas.......................................................................................................
Capítulo 2 – Analise Química da Maniçoba (Manihot pseudglaziovii Pax e Hoffmann.) e
de duas Espécies Afins de Interesse Forrageiro.......................................................................
Resumo.....................................................................................................................................
Abstract...................................................................................................................................
Introdução...............................................................................................................................
Material e Métodos.................................................................................................................
Resultados e Discussão..........................................................................................................
Conclusões................................................................................................................................
Referências Bibliográficas.....................................................................................................
Capítulo 3 - Variabilidade Genetica de Acessos De Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii
Pax & Hoffmann.) e de duas Espécies Afins de Interesse Forrageiro Através De
RAPd......................................................................................................................................
Resumo.....................................................................................................................................
Abstract....................................................................................................................................
Introdução................................................................................................................................
Material e Métodos..................................................................................................................
Resultados e Discussão............................................................................................................
Conclusões..............................................................................................................................
Referências Bibliográficas.......................................................................................................
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84
viii
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Página
Tabela 1 –
Relação dos 20 caracteres das folhas avaliados em dezesseis acessos de
plantas Manihot pseudglaziovii.......................................................................... 28
Analise de variância para os 20 caracteres morfométricos nos acessos de M.
Tabela 2 -
esculenta, M. pseudoglaziovii e do híbrido (pornuncia)..................................... 30
Tabela 3 -
Médias em cm para os 20 caracteresmorfometricos analisados em 14 acessos
de Manihot pseudoglaziovii, M. esculenta e do híbrido (pornuncia)................. 33
Capítulo 2
Página
Tabela 1 -
Analise de variância para os 13 caracteres químicos nos acessos de M.
esculenta, M. pseudoglaziovii e do híbrido (pornuncia).................................... 50
Tabela 2 -
Médias das analises de MS, PB, FDN, FDA, DIVMS, MM, MO, HEM, LIG,
EE, CEL, TT e HCN nos14 acessos de Manihot pseudoglaziovii, M.
esculenta e do híbrido (pornuncia).................................................................... 55
Capítulo 3
Página
Tabela 1 -
Identificação dos acessos de maniçoba e de duas espécies afins...................... 70
Tabela 2 -
Iniciadores (primers) com suas correspondentes seqüências de nucleotídeos. 71
Tabela 3-
de absorbância e quantificação das amostras de DNA dos acessos de 76
maniçoba e de duas espécies afins extraídos pelo método de Dellaporta et,
al.(1983)............................................................................................................
Tabela 4-
Leituras de absorbância e quantificação das amostras de DNA dos acessos de 77
maniçoba e de duas espécies afins extraídos pelo método de CTAB (Doyle &
Doyle,1987)........................................................................................................
Tabela 5-
Produtos da amplificação RAPD - PCR da extração de DNA dos acessos de 78
maniçoba e de duas espécies afins, usando 10 iniciadores...............................
ix
Tabela 6-
Distribuição e tamanho das bandas polimórficas, obtidas dos produtos de 79
amplificação RAPD – PCR usando os 10 iniciadores....................................
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Página
Figura 1 -
Mapa do Estado da Paraíba com os locais de coleta dos acessos das
plantas avaliadas....................................................................................... 27
Figura 2 -
Analise discriminante canônica entre os acessos de M. esculenta, M.
pseudoglaziovii e do híbrido (pornuncia)................................................. 31
Capítulo 2
Página
Figura 1
Gráfico obtido da analise discriminante canônica entre os acessos de
M. esculenta, M. pseudoglaziovii e do híbrido (manipeba)...................... 47
Capítulo 3
Página
Figura 1 Produtos de amplificação de eletroforese em gel de agarose, obtidos com o
iniciador OPD2 (5’- ACC GCG AAG G –3’). Sendo indicadas as bandas
polimórficas
pelas
setas
pretas.
Marcador
molecular
(M),
de
1kb...........................................................................................................
80
Figura 2 Produtos de amplificação de eletroforese em gel de agarose, obtidos com o
iniciador OPD3 (5’- GTC GCC GTC A –3’). Sendo indicadas as bandas
polimórficas
pelas
setas
pretas.
Marcador
1kb.............................................................................
molecular
(M),
de
...........................
Figura
Produtos de amplificação de eletroforese em gel de agarose, obtidos com o
3.
iniciador OPD8 (5’-TCT GGT GAT G–3’). Marcador molecular (M), de
81
1kb................................................................................................................... 82
Referencial Teórico
__________________________________________________________________________
ANÁLISE MORFOLÓGICA, QUÍMICA E MOLECULAR DE DIFERENTES
TÁXONS DE MANIHOT COM ÊNFASE NA MANIÇOBA (Manihot pseudoglaziovii
Pax & Hoffmann.) DE INTERESSE FORRAGEIRO
2
Análise Morfológica, Química e Molecular de Diferentes Táxons de Manihot com Ênfase na
Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) de Interesse Forrageiro
RESUMO – A maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) tem sido considerada
um recurso forrageiro de uso estratégico para o semi-árido Nordestino, apresentando-se como
alternativa alimentar para os rebanhos da região. Com o objetivo de caracterização
morfológica, química e molecular em populações naturais, foram estudados catorze acessos
de Manihot pseudoglaziovii, coletados no Estado da Paraíba, na microrregião Curimataú
Paraibano, além de um acesso de M. esculenta Cranz (mandioca) e de um híbrido natural
entre essas duas espécies popularmente conhecida como pormuncia. Cinco plantas de cada
acesso foram multiplicadas através de estaquia e em seguida cultivadas em uma área
experimental no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, em
condições padronizadas. Para as análises morfométricas foram utilizados 20 caracteres da
morfologia a partir dos quais foram realizadas análises de variância e teste t para cada caráter
isoladamente. Para as análises químicas foram determinados os teores de matéria seca,
matéria mineral, matéria orgânica, proteína bruta, fibra em detergente neutro, fibra em
detergente ácido, lignina, extrato etéreo, ácido cianídrico, tanino e digestibilidade "in Vitro".
Para a caracterização molecular foi realizado a extração do DNA vegetal e a análise de PCR.
Na caracterização morfológica o acesso de mandioca diferiu em relação aos acessos de
maniçoba e manipeba, porém para os valores das análises químicas estes variaram apenas em
alguns acessos das plantas do gênero manihot. Para as análise de DNA as plantas foram
caracterizadas como Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann., apresentando algumas
variedades dentro da espécie.
Palavras-chave: Composição química, Manihot, forrageira nativa, variabilidade genética
3
It analyzes morphologic, chemical and molecular of different accesses of maniçoba
(Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) of forage interest
ABSTRACT - The search for foods that take care of the necessities of the animals that are
adjusted to the climate and ground of the half-barren region and low cost for the producer
comes increasing. An alternative is the forage plants that compose the vegetation of the halfbarren one, found in the Coating. Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax and Hoffmann.),
has been considered a forage resource of half-barren strategically use for, presenting itself as
alternative the alimentary one for the flocks. With the objective of morphologic
characterization, chemical and molecular in natural populations, accesses of Manihot had
been studied fourteen pseudoglaziovii, collected in the State of the Paraíba in the microregion
Curimataú Paraibano, beyond an access of esculent M. Cranz (cassava) and a natural hybrid
between these two species. Five plants of each access had been multiplied through statue and
after that cultivated in an experimental area of the Federal university of the Paraíba in the
Center of Agrarian Sciences in standardized conditions. For the morphologic analyses 20
characters of the morphology from which had been used had been carried through variance
analyses and test t for each character separately, for them you analyze chemistries had been
made you analyze of dry matter, mineral matter, organic matter, rude Protein, Fiber in neutral
detergent, Fiber in acid detergent, Lignin, stereo Extract, acid cianídrico, Tanino and
Digestibilidade "in Vitro". For the molecular caracterização the extraction of the vegetal DNA
was carried through and it analyzes it of PCR. In the characterizations morphologic the
cassava access differed in relation to the accesses from maniçoba and manipeba, to put for the
values of them you analyze chemistries these had varied only in some accesses of the plants
of the sort manihot studied.
Key Word: Maniçoba, Manihot sort, native forage, characterization
4
1.Revisão de Literatura
Apesar da produção animal ser considerada uma vocação natural do semi-árido
nordestino, em função das condições edafo-climáticas da região, a necessidade de
complementação alimentar no período seco do ano constitui a principal limitação da atividade
(Soares, 1995). A estação seca da caatinga corresponde ao período de dormência do estrato
forrageiro da vegetação, que normalmente varia de seis a oito meses, quando o pasto
remanescente perde rápida e progressivamente seu valor nutricional e a produção de fitomassa
cai para níveis muito baixos (Mesquita et al., 1988; Araújo et al., 2000). Em conseqüência
disso, é imperiosa a conservação de forragem barata, de preferência aquela nativa e já
adaptada às condições regionais, com o intuito de estabilizar a disponibilidade de volumosos
durante todo o ano.
A maniçoba (Manihot spp.), tem sido considerada um recurso forrageiro de uso
estratégico para o semi-árido (Salviano & Nunes, 1991), apresentando-se como alternativa
alimentar para os rebanhos, essencialmente caprinos e ovinos, sendo preferencialmente
utilizada na forma de feno. É considerada uma excelente planta forrageira, tanto pelo seu alto
valor nutritivo, como pelo seu alto grau de palatabilidade, podendo ser cultivada de forma
sistemática para essa finalidade, além de possuir grande resistência à seca. Após o ínicio do
período chuvoso, é uma das espécies componentes do extrato arbustivo-arbóreo da caatinga
que primeiro inicia o desenvolvimento da folhagem, estando com uma razoável
disponibilidade de folhagem em apenas 15 a 20 dias (Soares, 2001).
O nome maniçoba tem sido usado para designar algumas espécies do gênero Manihot.
Existe uma certa discrepância nas informações dos estudiosos com relação à classificação
botânica das plantas como espécies ou variedades de uma mesma espécies (Salviano e Nunes,
1991). No Nordeste há um grande número de espécies do gênero Manihot, que recebem o
nome vulgar de “maniçoba” ou mandioca brava, sendo as principais a maniçoba (Manihot
5
glaziovii Muell Arg e M. pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.), a maniçoba do Piauí (M.
piauhyensis Ule) e a maniçoba da Bahia (M. dichotoma Ule e M. caerulescens Pohl). Também
é conhecida regionalmente como maniçobeira, maniçoba de cinco folhas, maniçoba de Jequié,
maniçoba do São Francisco, maniçoba mirim, maniçoba roxa, maniçoba beira da caatinga e
maniçoba de Maracá (Soares, 1995).
Segundo Bastos et al. (1985), a maniçoba predominante no estado da Paraíba é a
maniçoba do Ceará (M. glaziovii). Contudo, na revisão do gênero para a Flora Neotropica
(Rogers & Appan, 1973), além dessa última também é citada para o Estado a espécie M.
pseudoglaziovii, que se diferencia por apresentar inflorescência com menos de 10,0 cm de
comprimento, poucas flores e folhas pentalobadas com lobo mediano oblongo. Apesar dessas
características aparentemente diagnósticas, tem sido evidenciado que essas espécies são
bastante variáveis e apresentam variações contínuas sem a formação de agrupamentos
morfológicos claros entre si. Essas espécies, além do seu uso como forrageira, apresentam um
potencial importante para a utilização em programas de melhoramento, seleção de cultivares,
e na obtenção de híbridos interespecíficos. Para esse fim, é necessário que se tenha uma idéia
clara da variabilidade genética nessas espécies e dos seus limites taxonômicos.
A maniçoba é uma árvore de grande porte, com até 20 m de altura, de tronco roxo
denegrido. Suas folhas são palmadas, ovais, glabras, verdes claras, cobertas de matéria cerosa
azulada, de limbo fosco e flores com inflorescência terminal. Seu fruto é uma cápsula,
globosa trilocular, com sementes obcordadas ou suborbiculares, brilhantes, duras, amarelas,
pintadas de castanho (Soares, 1995).
As espécies arbóreas de Manihot ocorrem exclusivamente na Região Nordeste e, assim
como as espécies herbáceas do Centro-Oeste, possuem fracas barreiras de isolamento
reprodutivo, o que tem levado a uma extensiva hibridização natural, dificultando a taxonomia
e delimitação dessas espécies (Nagib-Nassar, 2000). Observações de campo e em áreas
6
cultivadas com M. glaziovii e M. pseudoglaziovii têm evidenciado que as características
utilizadas na separação dessas duas espécies (Rogers & Appan, 1973) frequentemente estão
sobrepostas, o que da á idéia de que as populações estariam largamente constituídas por pools
gênicos, híbridos, formando, portanto, uma única espécie biológica a Manihot pseudoglaziovii
Pax & Hoffmann., que é encontrada nos Estados da Paraíba, Rio Grande do Norte e Ceará.
Segundo Rogers & Appan (1973) a Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann. É uma
espécie estreitamente relacionada a M. glaziovii Muell. Arg., da qual se diferencia
basicamente por apresentar folhas principalmente pentalobadas, enquanto esta última
apresentaria folhas trilobadas, além de diferenças no comprimento da inflorescência e do lobo
mediano. As similaridades vegetativas entre essas duas espécies fazem com que sejam
frequentemente confundidas e geralmente identificadas com M. glaziovii (Braga, 1960;
Forman, 2004). Para uma melhor identificação destas plantas é necessário fazer uma
identificação através de uma análise morfometrica, pois a aplicação desta metodologia
melhora a capacidade de caracterização das espécies estudadas (Teixeira et al., 2001).
A maniçoba (Manihot glaziovii), assim como muitas outras plantas nativas pode ser
considerada um recurso forrageiro de uso estratégico muito importante, não apenas para os
períodos de menor disponibilidade de forragens, mas para o ano inteiro, através de sua
conservação na forma de feno, que pode ser produzido com a trituração de ramas inteiras em
seguida pela secagem, e acondicionamento em sacos para armazenar (Barros et al., 1986;
Passos, 1990). A maniçoba é considerada uma excelente planta forrageira, tanto pelo seu
valor nutritivo como pelo alto grau de palatabilidade, podendo ser cultivada de forma
sistemática, para essa finalidade.
Resultados de trabalhos avaliando a composição química-bromatológica da maniçoba,
apresentaram valores médios de: proteína bruta (PB-20,9%); extrato etéreo (EE-8,3%); fibra
bruta (FB-13,9%); cinzas-6,9% e digestibilidade “in vitro” da matéria seca (DIVMS- 62,3%);
7
(Salviano e Carvalho Filho, 1982); PB-20,8 8%, EE-8,30 %, FB-13,96 %, cinzas-6,88 % e
digestibilidade “in vitro” da matéria seca DIVMS- 62,29%; (Soares, 2001); PB-20,89%, EE8,38 %, FB-13,9 %, cinzas-6,91% e digestibilidade “in vitro” da matéria seca DIVMS- 62,2%
( Lima, 1996). Barros et al, (1990) estudando o valor nutritivo da maniçoba encontraram
valores : MS- 93,30%, PB- 12,00%, FDN- 58,60%, CZ-7,50% e digestibilidade “in vitro” da
matéria seca (DIVMS- 47,40%). Araújo et al (2000) analisaram a composição química do
feno de maniçoba, que apresentou valores: MS-91,00%, PB-11,0%, FDN-58,00%. Barros
(1986) determinaram a composição química do feno da maniçoba com base na matéria seca;
MS-93,30%, PB-12,00%, FDN-58,60% .
Vasconcelos (2000) avaliou o feno da Maniçoba produzido com plantas em início de
frutificação, com secagem ao ar livre, durante dois dias consecutivos, e revolvimento
periódicos, obtendo os seguintes valores: MS-92,95%, PB-11,88%, FDN-48,05%, Tanino
0,90%. Os valores encontrados em outros trabalhos inferiores aos obtidos por estes autores:
Salviano e Carvalho Filho (1982), Soares (2001) e Lima (1996), poderiam estar expressando
distintas épocas de corte da planta ou técnica diferente de coleta de material. Os resultados
encontrados nestes estudos são iguais aos resultados encontrados em um feno de boa
qualidade nutricional, isto é, conter adequada quantidade de princípios nutritivos,
especialmente proteínas e sais minerais, demonstrar alta digestibilidade e boa composição
bromatológica.
As forrageiras podem apresentar, em sua composição não apenas substâncias nutritivas,
mas também elementos de metabolismo secundário, que podem compreender uma variedade
de compostos, incluindo alcalóides e fenóis. O metabolismo fenólico é complexo e produz
muitos componentes, variando desde o pigmento da florescência até o complexo fenol de
parede celular do vegetal. Os taninos fazem parte dos fenóis. Eles participam de várias
atividades biológicas e de proteção dos vegetais contra herbívoros e doenças (Hagerman,
8
2002). Taninos condensados, também denominado poliflavanóides ou proantocianidinas,
constituem aproximadamente metade do peso seco da maior parte da casca das árvores e dos
nós e são importantes constituintes da folhas das plantas (Hemingway, 1998). O tipo de tanino
condensado presente em leguminosas forrageiras pode ter um grande efeito sobre a nutrição
dos ruminantes, uma vez que o grau de polimerização dos taninos influencia a formação de
complexos tanino-proteínas (Lascano & Carull, 1992), afetando a digestibilidade e a
palatabilidade das forrageiras (Thadei et al., 2001).
A maniçoba, como as demais plantas de gênero Manihot, apresentam em sua composição
quantidades variáveis de determinadas substâncias que, ao hidrolisarem-se e mediante a ação
de uma enzima, dão origem ao ácido cianídrico. Que dependendo da quantidade ingerida por
um animal, pode provocar intoxicação (Soares, 1995).
O ácido cianídrico é produzido após a ocorrência de danos mecânicos ou fisiológicos no
tecido da planta, quando as principais substâncias cianogênicas, a linamarina e a lotaustralina,
em presença de água, entra em contato com a enzima linamarase, que se encontra separada
daquelas substâncias no tecido vivo e íntegro. A enzima localiza-se na parede celular e as
substâncias cianogênicas nos vacúolos. Numa primeira fase, são produzidas glucose e acetona
cianidrina e, na segunda fase, a enzima hidroxinitrilo liase catalisa a degradação da acetona
cianidrina para a produção de acetona e HCN. A enzima dessa segunda fase também se
encontra na parede celular e a reação pode ocorrer espontaneamente quando o pH é superior a
quatro e a temperatura superior a 30°C (Araújo et al., 2000). Em pesquisa realizada na
Embrapa Semi-Arido, em Petrolina-PE, Cavalcanti e Araujo (2000), avaliaram o nível de
toxicidade da parte aérea fresca pelo conteúdo de ácido cianídrico livre (HCN), em mg/kg de
matéria seca (MS), de vários acessos de manihot. Dentre as especies pesquizadas, as três
espécies mais tóxicas foram as: M. dichotoma var. dichotoma (1.289), M. carthaginensis
(1.104) e a M. epruinosa (1.002). As menos tóxicas foram as seguintes: M. glaziovii
9
procedência de Petrolina-PE (304), M .cearulescens (387) e M. glaziovii procedência de
Antas-BA (529). O acesso de M. Carthaginensis, apesar da alta produtividade de forragem,
apresentou elevado teor de HCN.
O organismo animal tem uma capacidade de eliminar de 0,5 a 3,5 mg de HCN por
quilograma de peso vivo, por meio da utilização de aminoácidos sulfurados (metionina e
cistina) que, sob a ação da enzima rodanase, produzem tiocianatos que são eliminados pela
urina.
Segundo Cavalcanti & Araújo (2000), animais monogástricos e ruminantes alimentados
com plantas cianogênicas têm necessidade de suplemento de metionina e cistina, sendo o
enxofre orgânico o suplemento nutricional que parece ser mais eficaz. È recomendável,
também, a suplementação com iodo, zinco, cobre e selênio, pois as deficiências desses
elementos são agravadas com a presença de cianetos. Logo, o uso de fontes e/ou ingredientes
ricos em aminoácidos sulfurados em dietas com altas proporções da parte aérea da mandioca,
pode reduzir a mobilização desses aminoácidos no organismo animal. De uma maneira geral,
pode-se observar que na planta verde, em início de brotação, a maniçoba apresenta um teor
médio de ácido cianídrico (HCN) de 1.000 mg/kg de matéria seca. Isso significa que se o
animal consumir uma grande quantidade, em poucos instantes pode sofrer intoxicação. Por
outro lado, quando esta planta é triturada e exposta para secar (fenada), o teor de HCN baixa
para menos de 300 mg/kg de matéria seca, quantidade insuficiente para provocar qualquer
sintoma de intoxicação em animais, mesmo que em grande quantidade e por muito tempo
(Salviano & Soares, 2000).
A identificação das diferentes variedades de maniçoba com características forrageiras
através da taxonomia tradicional é dificultada por varias razões: os fenótipos, com grande
variedade de acordo as condições ecológicas; a poliplóidia, que existe em grande número de
populações que se reproduzem vegetativamente e sexualmente; a existência de numerosos
10
híbridos, como por exemplo, em muitas das espécies que florescem durante o mesmo período
do ano e que não estão separadas por barreiras biológicas (Scheinvar, 1995). Além disso, a
maniçoba é predominantemente encontrada em forma silvestre e em áreas cultivadas por
pequenos agricultores que a selecionam e identificam. Dessa forma uma mesma variedade
pode receber mais que uma denominação, assim como também se pode dar um mesmo nome
para diferentes espécies. Até o momento, nenhum estudo tem sido publicado sobre o uso de
marcadores moleculares de DNA para estimar a diversidade genética na maniçoba. Este
marcador, baseado em variações de seqüências de DNA tem demonstrado ser uma ferramenta
extremamente efetiva para mapeamento e diagnósticos genéticos, taxonomia molecular,
análise de integridade genética, estudos evolutivos e estudos citológicos para confirmar o
modo de reprodução por apomixias versus autopolinização, haplóides por partenogênese ou
fertilização cruzada. As vantagens no uso desses marcadores residem no fato deles existirem
em número praticamente ilimitado, não estarem sujeitos a efeitos ambientais e poderem ser
determinados em qualquer tipo de tecido ou estagio de desenvolvimento da planta
(Michelmore & Hulbert, 1987). Esses marcadores, quando combinados a características
fenotípica fornecem um bom quadro para agrupamento de genótipos e para o planejamento de
cruzamentos. Alem disso, podem auxiliar na avaliação da redundância e deficiências das
coleções de germoplasma (Ferreira & Grattapaclia, 1996).
PCR e Marcadores moleculares
A técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) Foi descrita por Muller & Faloona em
1987, sendo um método de amplificação de DNA de segmentos específicos, podendo ser
facilmente detectado a olho nu em gel de eletroforese através de corantes específicos. A
reação baseia-se na síntese enzimática “in vitro” de milhões de cópias de um segmento
específico de DNA na presença da enzima DNA polymerase. Sua reação baseia-se no
anelamento e extensão enzimática de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita
11
simples) utilizados como indicadores (“primers”) que delimitam a seqüência de DNA de fita
dupla alvo da amplificação.
Para que tenha êxito o PCR depende justamente da habilidade das enzimas copiadoras de
DNA permanecerem estáveis em alta temperatura. Atualmente, é utilizada a DNA polimerase
isolada da bactéria hipertermofílica Thermus aquaticus (Saiki et al.,1998), sendo denominada
Taq polimerase.
O processo de PCR consiste em três etapas. A primeira é a desnaturação , onde a fita
dupla de DNA alvo é desnaturada pela elevação da temperatura para 96°C, sendo dividida em
duas fitas simples. Em seguida a temperatura diminua para 55°C aonde os primers vão se
anelar às seqüências complementares no DNA. Na terceira etapa a temperatura é novamente
elevada para 75°C para que a Taq polimerase trabalhe melhor, adicionando nucleotídeos a
partir dos primers fazendo uma cópia completa dos moldes.
Os segmento de DNA são sintetizados em uma progressão geométrica, pois a cada ciclo
origina-se um novo segmento a partir do inicial e de cada um dos segmentos já produzidos no
ciclo anterior (Borba, 2000). Este ciclo é repetido umas 30 vezes, onde depois de algumas
horas tem-se mais de um milhão de cópias de um determinado segmento de DNA. O resultado
da amplificação de ácidos nucléicos por PCR pode ser facilmente visualizado por eletroforese
em gel de agarose, o sucesso da amplificação depende das condições de reação, da pureza dos
reagentes utilizados e dos diferentes parâmetros da reação (Borba, 2000).
Marcadores Moleculares
Existem diferentes tipos de marcadores de acordo com o nível da expressão. Os
marcadores morfológicos, são observados no último nível da expressão do caráter. Já os
marcadores bioquímicos, ou isoenzimas, detectam o polimorfismo da molécula de DNA,
sendo importantes marcadores, pois são utilizados em todas as espécies de plantas. E os
marcadores moleculares, que operam no DNA são os sistemas mais diretos, onde a análise é
12
feita diretamente na macromolécula portadora de toda a informação genética. Então se pode
definir como marcador molecular a todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene
expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um segmento específico de DNA (Ferreira &
Grattapaclia, 1998).
Os marcadores moleculares têm demonstrado ser uma ferramenta efetiva para o
mapeamento e diagnósticos genéticos, taxonomia molecular, análises da integridade genética
e estudos evolutivos (Carneiro,1997). A tecnologia de DNA recombinante e o
desenvolvimento da amplificação de segmentos de DNA via PCR (Polimerase Chain
Reaction), ou reação de polimerase em cadeia, abriram o caminho para uma mudança no
paradigma genético básico. O estudo de genoma de plantas tem se beneficiado, sobretudo, dos
avanços obtidos na área de genética humana. Métodos estatísticos acompanham este
desenvolvimento, e tem permitido a manipulação de enormes quantidades de dados genéticos
(Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Há várias técnicas disponíveis, cada uma utilizando uma estratégia particular para
detectar polimorfismos de DNA (Lopes, et al., 2003.). Conforme a metodologia utilizada, os
marcadores podem ser classificados em dois grupos: os de hibridização ou amplificação de
DNA. Entre os identificados por hibridização estão os marcadores RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism; Boststein et al., 1980), e Minissatélites ou locos VNTR
(Variable Number of Tandem Repeats; Jeffreys et al.,1985). E os marcadores que trabalham
com a amplificação que são do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Williams
et al.,1993), STS (Sequence Tagged Sites; Paran & Michelmore, 1993), Microssatélite (Litt &
Lutty, 1989), e os AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), (Ferreira &
Grattapaglia, 1998).
Inicialmente a utilização de enzimas de restrição permitiu a análise de polimorfismos de
comprimento de fragmentos obtidos por corte de fita dupla de DNA (RFLP), pela primeira
13
vez usado por Grodzicker et al. (1974). Os fragmentos hibridizados com sondas, que são
fragmentos de DNA de seqüência única marcados por radioatividade. O fragmento de DNA
que se hibridizar com a sonda pode, então ser visualizado na auto-radiografia e revelado como
uma banda no filme (Lopes, et al., 2003). Para que o polimorfismo seja detectado, é
necessário que as fitas seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais
indivíduos comparados sejam distintos (Ferreira & Grattapaglia,1998). Mas essa técnica não
permite a análise de grandes números de amostras em curto prazo e requer muito tempo
necessitando de 5-6 dias para a obtenção dos resultados. Além disso tem um custo
relativamente muito elevado e isto também tem limitado a sua aplicação e o uso de marcações
radioativas das sondas é necessário instalação adequada e licença para o uso de radioisótopos
(Lopes et al., 2003).
Diferentes experimentos no início dos anos 80 demonstraram que os genomas
eucarióticos são densamente povoados por diferentes classes de seqüências repetidas, uma
mais complexa e outra mais simples. Seqüências simples repetidas (“SSR – Simple Sequence
Repeats”), mais tarde denominadas também de “microssatélite’ consistem de pequenas
seqüências com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem (Litt & Luty, 1989).
Os marcadores microssatélite são constituídos de seqüências de 2 a 5 pares de bases repetidas
no genoma, constituindo marcas que podem ser detectadas por meio de hibridização com uma
sonda específica ou mesmo pela construção de “primers” específicos para a amplificação por
meio de PCR. Este tipo de marcadores são marcadores codominantes, possibilitam a distinção
entre o homo e heterozigoto, ou seja, é possível a distinção dos alelos.
Os marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism), se baseiam na
digestão do DNA com enzimas de restrição tipo III e amplificação destes fragmentos via PCR
(Lopes et al., 2003). é fundamental que a digestão seja completa, pois a digestão parcial pode
revelar falsos polimorfismos. Para obtenção da digestão total é necessário usar DNA de alta
14
pureza. Portanto, é preciso prestar atenção no método de extração e quantificação usado
(Lopes et al., 2003). AFLP reúne, a vantagem da PCR específica com a vantagem da RAPD
em se explorar seqüências arbitrárias. De forma análoga aos marcadores RAPD, a principal
limitação dos marcadores AFLP é o baixo conteúdo de informação genética por loco. Apenas
um alelo é detectado, ou seja, o fragmento que é amplificado. As demais variações alélicas
são classificadas como um alelo nulo. Marcadores AFLP são, portanto, marcadores
“dominantes” e os dados têm natureza binária (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
A técnica de RAPD, foi desenvolvida independentemente por dois grupos de
pesquisadores nos EUA. Williams et al. (1993) deram o nome mais comumente
utilizado,RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), este grupo de pesquisadores
descreveu a técnica no contexto da análise mendeliana, demonstrando a identificação de
marcadores genéticos para mapeamento. Welsh & McClelland (1990) chamando de AP-PCR
(“Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction”). E com alguns meses de publicação Peter
M.Gresshof desenvolveu o mesmo método (Carneiro,1997). O RAPD é baseado na reação de
“Polymerase Chain Reaction” (PCR), com duas características distintas: utiliza pequenas
seqüências de oligonucleotídeos de DNA de fita simples, “primers”, ao invés de um par de
“primers”; O primeiro tem seqüência arbitrária com cerca de 50-80% de G + C, e assim a
seqüência alvo é desenvolvida. As diferenças de apenas um par de bases (mutações de ponto)
são suficientes para causar a não complementaridade do “primer” com o sítio de iniciação e
assim impedindo a amplificação de um segmento (Weissbach,1990; Williams et al.,1993).
O polimorfismo genético detectado pelos marcadores RAPD tem natureza binária, isto
é, o segmento amplificado (banda no gel) está presente ou ausente. Devido a grande
quantidade de DNA produzido, podem ser visualizados diretamente na forma de uma banda
em gel de eletroforese, corados com brometo de etídio e observados na luz ultravioleta
(Williams et al., 1990; Ferreira & Grattapaglia, 1996).
15
A técnica de RAPD tem grandes vantagens em relação às outras técnicas
moleculares. É preciso de uma quantidade mínima de DNA necessária para a análise
genotípica de um individuo (da ordem de dezenas de nanogramas). Permite ainda gerar uma
grande quantidade de polimorfismo de segmentos de DNA, distribuídos por todo o genoma do
organismo, oferecendo a possibilidade de mostrar regiões de DNA repetitivos, uma vez que os
“primers” utilizados para a detecção da variação ao nível de DNA são arbitrários. RAPD
reúne, portanto, a simplicidade da visualização direta dos marcadores de DNA. È uma técnica
mais simples e rápida do que o RFLP, pois não necessita de informações sobre o DNA alvo
(Carneiro, 1997).
Nesse sentido, o presente trabalho objetiva prover os forragicultores e melhoristas com
uma ferramenta que possibilite não apenas a identificação taxonômica precisa de uma
importante forrageira nativa, como também aperfeiçoar a utilização dessas espécies.
16
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CAPITULO I
_____________________________________________________________________
MORFOMETRIA DE ACESSOS DE MANIÇOBA (Manihot pseudoglaziovii Pax
& Hoffmann.) E DE DUAS ESPÉCIES AFINS DE INTERESSE FORRAGEIRO
21
Morfometria de Acessos de Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) e de
duas Espécies Afins de Interesse Forrageiro
RESUMO – Com o objetivo de analisar a variabilidade morfológica de maniçoba em
populações naturais, foram estudados catorze acessos de maniçoba (Manihot pseudoglaziovii),
coletados no Estado da Paraíba na microrregião Curimataú Paraibano, além de um acesso de
M. esculenta Cranz (mandioca) e de um híbrido natural entre essas duas espécies (pornuncia).
Cinco plantas de cada acesso foram multiplicadas através de estaquia e em seguida cultivadas
em campo sob condições padronizadas, foram avaliados 20 caracteres da morfologia, a partir
dos quais foram realizadas análises de variância e teste t para cada caráter isoladamente.
Também foram realizadas análises de correlação de Pearson entre pares de caracteres, uma
vez que a presença de correlações significativas justifica o uso de análises multivariadas. O
acesso de mandioca
quanto aos
caracteres morfometricos diferiu em relação aos de
maniçoba e manipeba de acordo com o primeiro eixo canônico da análise de variância
multivariada. Por outro lado, o suposto híbrido entre a mandioca e a maniçoba diferiu em
relação aos demais de acordo com o segundo eixo canônico. Já os 14 acessos de maniçoba
apresentaram-se variáveis, porém não diferiram entre si, embora quatro desses acessos tenham
se mostrado distanciados em relação aos demais acessos dessa mesma espécie.
Palavras-chave: Acessost, forrageira nativa, folha, mandioca, peciolo
22
Morphometric Analisis of Accesses of Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax &
Hoffmann.) And Two Allied Cultivated Species Forage
ABSTRACT-With the objective to analyze the morphologic variability in natural
populations, accesses of Manihot had been studied fourteen pseudoglaziovii, collected in the
State of the Paraibano in the microregion Curimataú Paraibano, beyond an access of esculent
M. Cranz (cassava) and a natural hybrid between these two species. For the morphometric
analyses 20 characters of the morphology from which had been used had been carried through
analyses of variance and test t for each character separately. Also analyses of correlation of
Pearson between pairs of characters had been carried through, a time that the presence of
significant correlations justifies the use of multivariate analyses. The cassava access in
accordance with differed in relation to the accesses from maniçoba and manipeba the first
canonic axle from the analysis from multivariate variance. On the other hand, the hybrid
presumption between the cassava and maniçoba differed the excessively in accordance with in
relation to as canonic. Already the 14 accesses of maniçoba had been presented changeable,
however they had not differed between itself, even so accesses 1, 2, 8 and 13 have revealed
distantes in relation to the too much accesses of this same species.
Key words: Maniçoba, Manihot sort, native forage, characterization
23
1.Introdução
O semi-árido do Nordeste brasileiro ocupa uma área de 92,5 milhões de hectares, onde a
pecuária é uma das principais atividades da economia. Entretanto, esta atividade tem sido
limitada pela baixa disponibilidade de forragens, principalmente nos períodos de prolongadas
estiagens, além do manejo inadequado dos animais, má utilização dos recursos forrageiros
existentes na região, pouco aproveitamento de forragens conservadas em forma de feno e
silagem, e altos custos das rações.
Araújo Filho e Silva (1994) reforçam que a produção de alimentos para o rebanho
constitui, provavelmente, o maior desafio que enfrenta a pecuária da região semi-arida
Nordestina.
Ressalta-se que as alternativas de alimentação devam possuir o mínimo de concentrados
(insumos) e o máximo de ingredientes com alta possibilidade de serem produzidos ou
adquiridos pelos próprios criadores, nos mais distintos sistemas de produção.
Nesse contexto, estudos efetuados por diversas instituições de pesquisa demonstraram
que a maniçoba pode ser considerada como um recurso forrageiro de boa qualidade e que
pode ser cultivada de forma sistemática, para aumentar a oferta de forragem durante o período
crítico de falta de alimento.
A maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) é uma planta da família
Euforbiácea, Secção Glaziovianae, encontrada nas diversas áreas que compõem o Semi-árido
do Nordeste.
Normalmente é uma planta heliófila, vegetando em áreas abertas, e que se desenvolve
na maioria dos solos, tanto naqueles calcários e bem drenados, como também naqueles pouco
profundos e pedregosos, das elevações e das chapadas.
24
Na região Nordeste do Brasil há um grande número de espécies que recebem o nome
vulgar de maniçoba ou mandioca brava, sendo as principais a maniçoba do Ceará (Manihot
glaziovii Muell Arg.), a maniçoba do Piauí (M. piauhyensis Ule.) e a maniçoba da Bahia (M.
dichotoma Ule e M. caerulescens Pohl). A espécie M. pseudoglaziovii é encontrada nos
Estados da Paraíba, Rio Grande do Norte e Ceará, e além destes estados nordestinos, a
maniçoba também é encontrada em áreas da região Centro-Oeste, até o Estado de Mato
Grosso do Sul (Soares, 1995).
A maniçoba (M. pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) é uma espécie estreitamente
relacionada a M. glaziovii Muell. Arg., da qual se diferencia basicamente por apresentar
folhas principalmente pentalobadas, enquanto esta última apresentaria folhas trilobadas, além
de diferenças no comprimento da inflorescência e do lobo mediano (Rogers & Appan, 1973).
As similaridades vegetativas entre essas duas espécies fazem com que sejam frequentemente
confundidas e geralmente identificadas como M. glaziovii (Braga, 1960; Forman, 2004).
As espécies arbóreas de Manihot ocorrem exclusivamente na Região Nordeste e, assim
como as espécies herbáceas do Centro-Oeste, possuem fracas barreiras de isolamento
reprodutivo, o que tem levado a uma extensiva hibridização natural, dificultando a taxonomia
e delimitação dessas espécies (Nagib-Nassar, 2000). Observações de campo e em áreas
cultivadas com M. glaziovii e M. pseudoglaziovii têm evidenciado que as características
utilizadas na separação dessas duas espécies (Rogers & Appan, 1973), frequentemente estão
sobrepostas, suportando a idéia de que as populações estariam largamente constituídas por
pools gênicos híbridos, formando, portanto, uma única espécie biológica.
A falta de informações fenológicas dificulta os estudos sobre a biologia destas espécies
e a determinação de um manejo mais adequado, assim como da época de coleta das sementes.
Alvim (1964) cita que as espécies de regiões tropicais mostram oscilações periódicas de
crescimento e floração, e que há muitas dúvidas sobre os fatores que controlam esta
25
periodicidade. Portanto, o conhecimento fenológico é de grande importância no entendimento
da complexa dinâmica dos ecossistemas. De acordo com Frankie et al. (1974) esse tipo de
conhecimento não apenas permite explicar muitas das reações das plantas às condições
climáticas e edáficas, como também é importante no estudo das relações plantas/animais de
uma comunidade biótica.
No manejo de espécies arbustivas, devem ser levados em consideração vários
parâmetros como as respostas morfofisiológicas e a sobrevivência das plantas. Entre estas
respostas se destacam o estágio de crescimento e a altura de corte das plantas, que afetam o
rendimento e a qualidade da planta como forrageira (Costa et al., 2000).
A morfométria, atividade de medir estruturas anatômicas, pode ser efetuada utilizandose desde técnicas mais simples com o uso de instrumentos como o paquímetro e a fita métrica;
até aquelas mais sofisticadas, como a morfometria computadorizada. A finalidade das técnicas
de morfometria é de tornar mais objetiva e rápida a apresentação e a tabulação dos resultados
obtidos em pesquisas e mesmo na rotina diagnóstica. A aplicação desta metodologia melhora
a capacidade de caracterização das espécies estudadas (Teixeira et al., 2001).
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a variabilidade morfológica, através da
morfometria, em diversos acessos de M. pseudoglaziovii e de duas espécies afins com
interesse forrageiro, com vistas a identificar possíveis caracteres diagnósticos para a espécie.
26
2.Material e Métodos
O trabalho foi conduzido em condições de campo no Centro de Ciências Agrárias(CCA)
da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), em Areia –PB. O município localiza-se na
microrregião do Brejo Paraibano, a uma altitude de 618m, situando-se entre as coordenadas
geográficas 06o 57’48” de altitude sul e 35o 41’30” de longitude oeste de Greenwich, com
clima quente e úmido e precipitação anual de 1200 mm, com médias de temperaturas
máximas de 28oC e mínimas de 21oC.
Foram obtidos 14 acessos de Manihot pseudoglaziovii com diferenças visuais distintas,
coletados ao longo da rodovia Br 104 entre os Municípios de Remígio e Barra de Santa Rosa,
Estado da Paraíba. Também foram incluídos, para comparação, um acesso de M. esculenta
Cranz (Mandioca) e um híbrido natural entre essas duas espécies (pornuncia), ambos
provenientes do Município de Areia (Figura 1).
Cinco plantas de cada acesso foram multiplicadas através de estaquia e em seguida
cultivadas em uma área experimental em condições padronizadas de adubação e rega, para se
ter uma exteriorização homogênea de cada genótipo. De cada acesso foram preparadas
exsicatas que encontram-se depositadas no Herbário Prof. Jayme Coelho de Moraes
(CCA/UFPB).
Inicialmente foi realizada a produção de mudas de maniçoba, estas mudas foram
feitas através de estaquia, com tamanho de 30 cm e com corte em Bisel na parte inferior. As
estacas foram colocadas em sacos de polietileno preto (23 x 13 cm), onde permaneceram por
3 meses, sendo, em seguida, transplantadas para o campo de produção, em um solo
classificado como Latossolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, apresentando as seguintes
características químicas: pH- 5.0, P(mg/dm3)- 5,47, K(mg/dm3)- 42,08, Al+3(cmolc/dm3)0,25, Ca+2(cmolc/dm3)- 0,90, Mg+(cmolc/dm3)- 0,90, CTC (cmolc/dm3)- 4,23 e MO (g/dm3)10,39.
27
O solo foi preparado mediante limpa do terreno e preparo das covas, e aplicação de
1,0 T/ha de calcário dolomítico.
A adubação orgânica de fundação foi feita uma semana antes do plantio, de acordo
com a recomendação do Laboratório de Química e Fertilidade do Solo, aplicando-se 1,8 kg de
adubo orgânico por cova. O plantio foi realizado em covas num espaçamento de 1,5 m entre
plantas e 2,0 m entre blocos.
Foram realizados os tratos culturais como regas, capinas com auxílio de enxadas, e
aplicação de defensores agrícolas para o controle de formigas e ácaros.
O experimento foi conduzido em um delineamento de blocos casualizados com 16
tratamentos e cinco repetições.
Carvalho e Carvalho, 1985
Figura 1. Mapa do Estado da Paraíba com os locais de coleta dos acessos das plantas avaliadas.
Figure 1. Map of the State of the Paraiba with the places of collection of the accesses of the
evaluated plants.
Para as médias morfométricas foram retiradas de cada acesso três folhas adultas,
preferencialmente a quarta folha a partir do broto terminal dos ramos, das quais foram
28
aferidos 20 caracteres (Tabela 1). Após a coleta, todo o material foi acondicionado em sacos
plásticos que foram fechados para evitar a desidratação, sendo em seguida levados para o
laboratório, onde as medidas foram tomadas com o auxílio de paquímetro digital.
A definição de caracteres vegetativos está relacionada ao fato destes apresentarem-se
bastante variáveis no gênero, não obstante serem amplamente utilizados na separação de
espécies arbóreas de Manihot (Rogers & Appan, 1973).
Tabela 1 Relação dos 20 caracteres das folhas avaliados em dezesseis acessos de plantas Manihot
pseudoglaziovii.
Table 1. Relation of the 20 characters of leves evaluated in sixteen accesses of plants of the Manihot
pseudoglaziovii
Sigla dos caracteres
Comp P
Db P
Dm P
Ds p
Cor P F Vd
Cor P F V/v
Cor P F Vm
Comp LD
Dm LD
Sim LD
Assim LD
Comp LM
Dm LM
Ds LM
Sim LM
Assim LM
FL
FNL
Facum
Fred
Parâmetros morfológicos
Comprimento do pecíolo
Diâmetro da base do pecíolo da folha
Diâmetro médio do pecíolo da folha
Diâmetro secundário do pecíolo da folha
Cor do pecíolo da folha verde
Cor do pecíolo da folha verde e vermelha
Cor do pecíolo da folha vermelha
Comprimento do lóbulo direito
Diâmetro médio do lóbulo direito
Simetria do lóbulo direito
Assimetria do lóbulo direito
Comprimento do lóbulo mediano
Diâmetro médio do lóbulo mediano
Diâmetro Superior do lóbulo mediano
Simetria do lóbulo mediano
Assimetria do lóbulo mediano
Folha lobulada
Folha não lobulada
Folha acuneada
Folha redonda
Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o programa SAS (1997). Foram feitas
análises de variância e teste f para cada caráter isoladamente para contrastes entre as médias
das populações. O nível de significância considerado em todas as análises foi 5 %. A análise
discriminante canônica foi empregada para verificar como as populações relacionam-se entre
29
si. Esta análise foi utilizada por considerar as correlações residuais existentes entre as médias
das observações, o que se traduz numa vantagem em relação aos componentes principais.
Outra vantagem do método é que, mesmo não sendo o número de variáveis menor do que
o número de indivíduos dentro de cada população e que a multinormalidade não esteja
presente, a análise discriminante canônica pode ser aplicada de maneira exploratória,
produzindo gráficos das variáveis canônicas bastante úteis (Manly, 1994) e para o
agrupamento utilizou-se o método de Ferreira, (1996).
30
3.Resultados e Discussão
A análise de variância e teste f, revelou diferenças significativas (p <0,05) em apenas 13
dos caracteres analisados (Comp P, Db P, Ds P , Cor P F Vd, Cor P F V/v, Comp L D, Dm L
D, Assim L D , Comp L M , Dm L M , Sim L M, Assim L M e FNL) (Tabela 2) ,
evidenciando claramente a separação dos acessos em dois grupo: um formado pelo único
acesso de M. esculenta e outro composto pelos acessos de M. pseudoglaziovii e o híbrido
(pornuncia). As médias e desvios-padrões de todos os caracteres para contrastes entre as
médias das populações para os caracteres que apresentaram diferenças significativas pelo teste
f, encontram-se sumarizados na Tabela 2.
Tabela 2. Analise de variância para os 20 caracteres morfometricos nos acessos de M. esculenta, M.
pseudoglaziovii e do híbrido (pornuncia).
Table 2. It analyzes of variance for the 20 characters Morphometric in the accesses of M. esculent
M.pseudoglaziovii and of the hybrid (pornuncia).
FV
GL
Quadrado médio
Comp P Db P Ds P Cor PVD Cor P V/V Comp LD Dm LD Assim LD Comp LM DmL M SimLM ASssim L M FNL
Ace
15 27.89** 0,06** 0,04** 0,69**
Re
64 5,65
0,09
0,05
0,03
0, 99**
21,05**
7,72**
0,31**
30,45**
0,06
4,93
1,72
0,01
5,01
10,42 ** 0,34** 0,34**
1,88
0,05
0,05
NS-Não significativo, pelo teste t, * - Significativo a 5%, pelo teste t.
Not significant -NS, by test t, * - Significant 5%, for the test t.
A analise de variância entre os vários pares de caracteres (Tabela 1) justificou a realização
de análises multivariadas (Manly, 1994). Pela análise discriminante canônica verificou-se que
o primeiro eixo canônico, que representa 64,5 % da variação, separou o acesso 16 (M.
esculenta) dos demais acessos (Figura 2). As plantas estudadas formaram dois subgrupos que
não diferiram estaticamente entre si: um representado pelo híbrido e outro pelos acessos de M.
pseudoglaziovii. Estas duas últimas espécies diferiram em relação ao segundo eixo canônico
com 37,2% da variação observada. A M. esculenta, pelo fato de não ocorrer populações
naturalmente, sendo exclusivamente cultivada (Conceição, 1979), apresenta um padrão
morfométricos claramente distinto de M. pseudoglaziovii. Esse padrão diferenciado,
4,89**
0,46
31
provavelmente está relacionado ao trabalho de melhoramento e seleção genética, que foi
realizada para a M. esculenta (Nagib-Nassar, 2000).
Figura 2. Analise discriminante canônica entre os acessos de M. esculenta, M. pseudoglaziovii e do
híbrido (pornuncia).
Figure 2. Analyzes canonic discriminante enters the accesses of esculent M., M. pseudoglaziovii and
of the hybrid (pornuncia).
O híbrido pornuncia, originado a partir do cruzamento natural entre M. esculenta e M.
pseudoglaziovii, apresentou-se morfologicamente relacionado a espécie de maniçoba. Isto
sugere que M. pseudoglaziovii apresenta um pool gênico dominante em relação à espécie
cultivada M. esculenta, podendo ser utilizada em programas de melhoramento. A obtenção de
genótipos selvagens para o aporte de genes de resistência no melhoramento de plantas, tem
sido uma busca clássica entre os geneticistas e melhoristas, salientando-se nessa busca o
conhecimento dos centros de origens das plantas cultivadas (Vavilov, 1951), bem como das
espécies afins como no presente estudo. Nesse sentido, provavelmente M. pseudoglaziovii,
uma espécie amplamente encontrada no Nordeste, representa um potencial gênico importante
32
para o melhoramento da mandioca, tanto na produção de raízes como na sua utilização como
forrageira.
A soma do primeiro e do segundo eixos representam 99,7% da variação total observada. A
partir das distâncias de euclidianos médios, observa-se que o acesso 16 é o mais distante entre
os demais, em concordância com os dois eixos da análise discriminante canônica (Figura 2).
O método de agrupamento foi concordante com a analise de variância, indicando que os
acessos são pouco definidos e que o aumento do número de amostras e de características
analisadas poderá melhorar a definição da análise. A ampliação no número de caracteres em
análises morfométricas (MacNeill, 1984) tem melhorado a resolução em diversos grupos de
plantas.
Em recente análise para a subfamília Epidendroideae da família Orchidaceae, Van Den
Berg et al. (2005) conseguiram pelo aumento da amostragem de espécies e também do
número de caracteres analisados, uma significativa melhora na definição da análise e no
conhecimento das relações filogenéticas desse grupo de plantas, em relação a uma análise
anterior (Freudenstein e Rasmussen, 1999).
Observou-se a ocorrência de um gradiente no tamanho do pecíolo das folhas entre os
diferentes acessos (Tabela 3), onde o menor valor foi verificado no acesso dois, que também
foi o único que apresentou coloração do pecíolo verde, enquanto que o maior valor para o
tamanho do peciolo ocorreu no acesso 12 (híbrido), que assim como os demais acessos de M.
pseudoglaziovii apresenta um pecíolo bicolor. Já o acesso 16 (M. esculenta), caracterizou-se
principalmente por apresentar pecíolo vermelho. Todavia, a diferença observada na coloração
do pecíolo da mandioca deve ser encarada com cautela, uma vez que esta é uma espécie
bastante variável, inclusive em relação à coloração geral das folhas (Braga, 1960; Corrêa,
1974; Conceição, 1979).
33
Tabela 3. Médias em cm, para os 20 caracteres morfometricos analisados em 14 acessos de Manihot pseudoglaziovii, M. esculenta e do híbrido (pornuncia).
Table 3. Averages in cm, for the 20 characters Morphometric analyzed in 14 accesses of Manihot pseudoglaziovii, esculent M. and of the hybrid (pornuncia).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Comp P
10,28B
5,04C
8,38B
11.80B
10,46B
10,06B
8,72B
11,3B
10,72B
8,24B
10,14B
14,44A
12,42B
8,69B
10,59B
10,6B
Db P
0,55ABC
0,32BCD
0,57AB
0,54ABC
0,59ABC
0,48ABC
0,94AB
0,56AB
0,55AB
0,45D
0,48BCD
0,77A
0,58AB
0,44AB
0,56AB
0,35D
Dm P
0,40NS
0,27NS
0,40NS
0,43NS
0,36NS
0,36NS
0,45NS
0,50NS
0,51NS
0,47NS
0,43NS
0,69NS
0,58NS
0,37NS
0,55NS
0,55NS
Ds P
0,46AB
0,20BCD
0,47A
0,42ABC
0,44ABC
0,44 AB
0,61AB
1,01AB
0,40ABC
0,25DC
0,39ABC
0,41ABC
0,41ABC
0,27D
0,44ABC
0,16C
Cor P F vm
0B
0B
0B
0B
0B
0B
0,2B
01B
0B
0B
0B
1B
1B
0B
0B
1A
Cor P F vd
0B
1A
0B
0B
0B
0B
0B
0B
0B
1A
0B
0B
0B
0B
0B
0B
Cor P F v/v
1A
0B
1A
1A
1A
1A
0,8A
0B
1A
0B
1A
0B
0B
1A
1A
0B
ComP L D
10,92ABC
8,25BCD
13,5A
10,2ABC
8,40BCD
9,58ABC
12,5AB
11,02BC
10,98ABC
6,08NS
11,20AB
11,08ABC
8,52ABC
7,3DC
9,88ABC
06,85C
Dm L D
6,0AB
4,7ABC
6,48A
6,0AB
4,0ABCD
4,9ABCD
6,1AB
5,27ABC
5,44ABC
4,83ABC
5,32ABC
4,1ABCD
2,7DC
3,02DC
5,66ABC
2,75D
Sim L D
0A
0A
0A
0A
0A
0A
0A
1A
1A
0A
0A
0A
0A
0A
0A
0A
Assim L D
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
0A
0A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
Comp L M
12,1AB
6,74BC
14,52A
12AB
14,62ABC
11,98AB
13,6A
14,18A
13,48ABC
6,32ABC
12,8AB
15,22A
14,54AB
7,41BC
12,3AB
9,6BC
Dm L M
6,2B
3,78B
8,00B
6B
6,0B
6,7B
6,9B
6,6B
6,64B
1B
6,44B
6,18B
4B
3,81B
6,4B
2,3B
Ds L M
6,0B
3,6B
8,06B
6,3B
6,3B
6,6B
6,8B
6,5B
6,4B
1B
6,43B
6,28B
6B
3,83B
6,5B
2,9B
Sim L M
1A
1A
1A
0A
1A
1A
1A
1A
1A
0A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
Assim L M
0B
0B
0B
1B
0B
0B
0B
0B
0B
1B
0B
0B
0B
0B
0B
0A
FL
1A
1A
1A
0A
1A
1A
1A
1A
1A
0A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
FNL
3B
5B
5B
4B
5B
5B
5B
5A
3B
5B
5B
7B
5B
5B
5B
3B
Facum
1A
0A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
1A
0A
Fred
0B
1A
1B
0B
1B
0B
0B
1B
0B
0,35B
0B
1B
0B
0B
0B
1B
ns-não significativo, pelo teste f, * - significativo a 5%, pelo teste f.
significant NS-Não, for test f, * - Significant 5%, for the test f.
34
Observou-se na análise de agrupamento, que os acessos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
13,14 e 15 são os mais próximos entre si, formando um grupo, o que também é confirmado
pela análise canônica onde se nota a sobreposição desses acessos de acordo com os dois eixos
(Figura 2).
O acesso 12 mostrou-se intermediário entre acesso 16 e os demais (Figura 2). Estes dois
acessos (16 e 12) encontram-se separadas na análise discriminante pelo primeiro eixo
canônico. A partir dos resultados da análise de agrupamento, foi verificado que os acessos
formaram dois grupos: o primeiro formado pelo acesso 16, o segundo formado pelos demais,
que são mais próximos entre si. Esses resultados são concordantes com aqueles obtidos pela
análise discriminante canônica. Em uma análise morfométrica de flores de Oncidium
varicosum Lindl. (Orchidaceae), Cardim et al. (2001) observaram um comportamento
semelhante entre diferentes populações dessa espécie. Os autores verificaram que se
formaram grupos de populações tanto na análise de agrupamento como na análise
discriminante canônica.
No presente trabalho foi possível detectar a existência de variabilidade entre os acessos de
M. pseudoglaziovii. Por exemplo, os acessos 1, 2, 8 e 13, embora sem diferenças
significativas, apresentaram-se relativamente distanciados dos demais acessos dessa espécie
em relação a sua morfologia externa. Esta espécie é referida como notavelmente variável
(Rogers & Appple, 1973; Nagib-Nassar, 2000) e bastante relacionada à M. glaziovii Muell.
Arg., também de hábito arbóreo e amplamente distribuída no Nordeste Oriental (Braga, 1960;
Rogers & Apple, 1973; Corrêa, 1974). É provável que alguns acessos tenham sido
erroneamente identificados ou que essas duas espécies constituam uma mesma entidade
taxonômica. Uma maior amostragem associada a uma análise morfométrica mais extensa
voltada especialmente para essas duas espécies, talvez possa esclarecer definitivamente suas
relações taxonômicas.
35
4.Conclusões
O acesso de mandioca (Manihot esculenta) diferiu estatisticamente dos acessos de
maniçoba (Manihot pseudoglaziovii) e pornuncia, enquanto o suposto híbrido entre a
mandioca e a maniçoba diferiu em relação aos demais de acordo com o segundo eixo
canônico. Já os 14 acessos de maniçoba não diferiram entre si. Os dados obtidos nesse
trabalho indicam a necessidade de se ampliar a amostragem das populações estudadas, bem
como do número de caracteres avaliados, a fim de que se tenha uma idéia mais clara da
variabilidade morfológica e dos limites taxonômicos de M. pseudoglaziovii.
36
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CAPITULO II
_____________________________________________________________________
ANALISE QUÍMICA DA MANIÇOBA (Manihot pseudoglaziovii Pax e Hoffmann.) E
DE DUAS ESPECIES AFINS DE INTERESSE FORRAGEIRO
40
Análise Química da Maniçoba (Manihot Pseudoglaziovii Pax E Hoffmann.) e de duas
espécies afins de Interesse Forrageiro
RESUMO: O objetivo do trabalho foi caracterizar os taninos totais e o teor de HCN, e
determinar a composição bromatológica e a digestibilidade in vitro da MS (DIVMS) de
diferentes acessos de maniçoba (Manihot pseudoglazovii Pax & Hoffmann.) e duas espécies
afins (Mandioca e Pornuncia). As concentrações em tanino total (TT) dos diferentes
materiais foram determinadas pelo método butanol-HCL, e adstringência pelo método de
difusão radial. A DIVMS foi através do método de dois estágios. Foram observadas
diferenças entres as espécies (P<0,01) quanto à concentração dos taninos. As maiores
concentrações foram encontradas na mandioca e pornuncia (10,9% TT e 12,7%). Foi
detectado baixo teor de tanino na maniçoba ( 0,2% a 5,5%). O teor de PB dos acessos foi de
16%a 25 % em todas as espécies estudadas e o de FDA e lignina variaram de 15,8 %, a
37%, indicando um bom valor nutritivo destas espécies para a alimentação de ruminantes.
A DIVMS foi em média de 68%. As concentrações de taninos totais presentes nessas
espécies provavelmente não são suficientes para acarretar problemas de ordem nutricional
em ruminantes. O teor de HCN variou na maniçoba (97,2 a 291,6 mg/kg MS), na pornuncia
este valor foi de 324 mg/kg MS e na mandioca o valor de HCN foi de205,2 mg/kg MS
indicando baixo teor de HCN nestas espécies.
Palavras-chave: Ácido cianídrico, bromatologia, tanino, mandioca, pornuncia
40
41
Chemical analyzes of Different Accesses of Maniçoba (Manihot Pseudoglaziovii Pax
and Hoffmann.) of Interest Forage
ABSTRACT: The objective of the work was to characterize total tanning barks and the
text of HCN, and to determine the bromatológic composition and the digestibilidade in
vitro of MS (DIVMS) of different accesses of maniçoba (Manihot pseudoglazovii Pax &
Hoffmann.) e two similar species (Mandioca and Pornuncia). The concentrations in total
tanning bark (TT) of the different materials had been determined by the method butanolHCL, and astringency for the method of radial diffusion. The DIVMS was through the
method of two periods of training. Differences had been observed enter species (P< 0,01)
how much to the concentration of tanning barks. The biggest concentrations had been found
in the cassava and pornuncia (10.9% TT and 12.7%). Low tanning bark text was detected in
maniçoba (0.2% 5.5%). The text of PB of the accesses was superior 16%a 25 % in all the
studied species and of FDA and the lignina they had varied of 15.8 %, 37%, indicating a
good nutritional value of these species for the feeding of ruminants. The DIVMS was in
68% average. The total tanning bark concentrations gifts in these species probably are not
enough to cause problems of nutricional order ruminants. The HCN text was varied in
maniçoba (97.2 the 291.6 mg/kg MS), in the pornuncia this value was of 324 mg/kg MS
and in the cassava the value of HCN was de205.2 mg/kg MS indicating low tero of HCN in
these species.
Words key: native foragers, protein, chemical Composition, Tanning bark, HCN
41
42
1.Introdução
O estudo das plantas xerófilas se reveste de importância, considerando que esses
vegetais formam um grande grupo de espécies, ocupando uma considerável área geográfica
do planeta sendo que muitas dessas plantas são de interesse forrageiro.
O grupo é
composto de inúmeras famílias botânicas de ervas, arbustos, árvores e cipós com diversas
caracterizações, todas com um aspecto de alta relevância que é o de persistir nas condições
semi-áridas do nordeste brasileiro, suportando baixas precipitações, apresentando uma
única estação de crescimento anual, correspondente à época das chuvas, fornecendo
biomassa, como fonte de energia, alimentando a fauna silvestre e os animais domésticos
dessa região (Araújo Filho et al., 1995).
Não são poucas as iniciativas de identificação e descrição das principais espécies
forrageiras nativas no semi-árido nordestino. Também existe uma razoável quantidade de
trabalhos realizados sobre a composição químico-bromatológica de várias dessas espécies.
No entanto, mais estudos precisam ser efetuados em função da grande variação concernente
ao material coletado, além da variação associada às diferenças entre regiões. O mais
importante, e que precisa ser enfatizado, é que a identificação e a determinação do potencial
como forrageira não são suficientes para fundamentar uma tecnologia de aproveitamento
racional dos recursos naturais (Pimenta Filho & Silva, 2002).
Na busca de soluções para uma exploração racional com fins de promover o
desenvolvimento sustentável da região, a fim de assegurar as produções indispensáveis ao
desenvolvimento sócio-econômico, surgem as plantas encontradas na caatinga como uma
opção bastante promissora para a alimentação de rebanhos.
42
43
Araújo Filho e Silva (1994) comentam que o semi-árido nordestino apresenta uma
grande diversidade em seu extrato herbáceo, arbustivo e arboreo. Nesse contexto, a
maniçoba (Manihot spp.) que rebrota rapidamente após as primeiras chuvas, florando,
frutificando e perdendo as folhas logo em seguida. Quando cultivada permite um a dois
cortes em um curto período de tempo e com produtividade de quatro a cinco toneladas de
matéria seca por hectare, aparecendo como mais uma alternativa alimentar para a produção
animal da região. Alem de apresentando elevado valor nutritivo, alto grau de palatabilidade,
resistência e pode ser cultivada de forma sistemática. Possui grande resistência à seca por
apresentar raízes com grande capacidade de reserva mais desenvolvida que as de mandioca.
A maniçoba assim como muitas outras plantas nativas pode ser considerada um
recurso forrageiro de uso estratégico muito importante, não apenas para os períodos de
menor disponibilidade de forragens, mas para o ano inteiro, através de sua conservação na
forma de feno, que pode ser produzido com a trituração de ramas inteiras em seguida pela
secagem, e acondicionamento em sacos para armazenar (Barros et al., 1986; Passos, 1990).
A composição bromatológica é o ponto de partida para se determinar o valor nutritivo
de um determinado alimento, avaliando-se sua proporção em MS (Matéria seca), PB
(Proteína Bruta), EE (Extrato etéreo), FDN (Fibra em detergente Neutro), FDA(Fibra em
detergente Acido), He (Hemicelulose), LIG (Liginina) e MM (Matéria mineral). A partir
daí pode-se avaliar o aproveitamento da fração do alimento pelo animal (digestibilidade) ou
pelos microrganismos do rumem do animal (degradabilidade) (Dornelas, 2003).
Resultados de trabalhos avaliando o valor nutritivo da maniçoba, revelaram valores
semelhantes aqueles apresentados pelas forrageiras quando fenadas: proteína bruta (PB20,9%); extrato etéreo (EE-8,3%); fibra bruta (FB-13,9%); cinzas-6,9% e digestibilidade
43
44
“in vitro” da matéria seca (DIVMS-62,3%); (Salviano e Carvalho Filho, 1982; Soares,
2001; Lima, 1996). Barros et al. (1990) estudando o valor nutritivo da maniçoba
encontraram: MS- 93,30%, PB- 12,00%, CZ-7,50% e digestibilidade “in vitro” da matéria
seca (DIVMS- 47,40 %). Araújo et al. (2000) analisaram a composição química do feno de
maniçoba, que apresentou valores: MS-91,00%, PB-11,0%, FDN-58,00%. Barros (1986)
determinou a composição química do feno da maniçoba com base na matéria seca; MS93,30%, PB-12,00%, FDN-58,60% .
Vasconcelos (2000) avaliou o feno da Maniçoba produzido com plantas em início de
frutificação, com secagem ao ar livre, durante dois dias consecutivos, e revolvimento
periodicos, obtendo os seguintes valores: MS-92,95 %, PB-11,88 %, FDN-48,05 %, Tanino
0,90%. Os valores encontrados em outros trabalhos inferiores aos obtidos por este autor
poderiam estar expressando distintas épocas de corte da planta ou técnica diferente de
coleta de material.
Os resultados encontrados nestes estudos são iguais aos resultados encontrados em
um feno de boa qualidade, isto é, conter adequada quantidade de princípios nutritivos,
especialmente proteínas e sais minerais, demonstrar alta digestibilidade e boa composição
bromatológica.
O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar a composição química,
digestibilidade “in vitro”, o teor de HCN da matéria seca e concentração de taninos totais
em plantas do gênero Manihot principalmente a maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax &
Hoffmann).
44
45
2.Material e Métodos
O trabalho foi conduzido em condições de campo no Centro de Ciências Agrárias
(CCA) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), em Areia –PB. O município localiza-se
na microrregião do Brejo Paraibano, a uma altitude de 618m, situando-se entre as
coordenadas geográficas 06o 57’48” de altitude sul e 35o 41’30” de longitude oeste de
Greenwich, com clima quente e úmido e precipitação anual de 1200 mm, com médias de
temperaturas máximas de 28oC e mínimas de 21oC.
Foram obtidos 14 acessos de Manihot pseudoglaziovii com diferenças visuais
distintas, coletados ao longo da rodovia Br 104 entre os Municípios de Remígio e Barra de
Santa Rosa, Estado da Paraíba. Também foram incluídos, para comparação, um acesso de
M. esculenta Cranz (Mandioca) e um híbrido natural entre essas duas espécies (pornuncia),
ambos provenientes do Município de Areia (Figura 1).
Cinco plantas de cada acesso foram multiplicadas através de estaquia e em seguida
cultivadas em uma área experimental em condições padronizadas de adubação e rega, para
se ter uma exteriorização homogênea de cada genótipo. De cada acesso foram preparadas
exsicatas que encontram-se depositadas no Herbário Prof. Jayme Coelho de Moraes
(CCA/UFPB).
Inicialmente foi realizada a produção de mudas de maniçoba, estas mudas foram
feitas através de estaquia, com tamanho de 30 cm e com corte em Bisel na parte inferior. As
estacas foram colocadas em sacos de polietileno preto (23 x 13 cm), onde permaneceram
por 3 meses, sendo, em seguida, transplantadas para o campo de produção, em um solo
classificado como Latossolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, apresentando as seguintes
características químicas: pH- 5.0, P(mg/dm3)- 5,47, K(mg/dm3)- 42,08, Al+3(cmolc/dm3)-
45
46
0,25, Ca+2(cmolc/dm3)- 0,90, Mg+(cmolc/dm3)- 0,90, CTC (cmolc/dm3)- 4,23 e MO (g/dm3)10,39.
O solo foi preparado mediante limpa do terreno e preparo das covas, e aplicação de
1,0 T/ha de calcário dolomítico.
A adubação orgânica de fundação foi feita uma semana antes do plantio, de acordo
com a recomendação do Laboratório de Química e Fertilidade do Solo, aplicando-se 1,8 kg
de adubo orgânico por cova. O plantio foi realizado em covas num espaçamento de 1,5 m
entre plantas e 2,0 m entre blocos.
Foram realizados os tratos culturais como regas, capinas com auxílio de enxadas, e
aplicação de defensores agrícolas para o controle de formigas e ácaros.
O experimento foi conduzido em um delineamento de blocos casualizados
com 16 tratamentos e cinco repetições.
As plantas foram cortadas e identificadas em sacos de papel e levadas ao
Laboratório de Análise de Alimentos. Foram as amostras referentes as
espécies de Maniçoba, com aproximadamente 90 dias, no período da floração.
Cerca de 300 g de folhas e ramos finos. Uma vez colhidas, as amostras foram
imediatamente seca em estufa a 40 oC.
Posteriormente todas as amostras foram moídas em moinho com peneiras
de 1 mm e armazenadas em frascos para o procedimento das análises
laboratoriais que foram realizadas nos Laboratórios de Nutrição Animal do
Centro de Ciências Agrárias da UFPB em Areia –PB.
Para as análises químicas foram utilizadas a metodologia descritas por Silva e
Queiroz (2002), onde foram determinadas a porcentagem de matéria seca (MS), matéria
orgânica (MO), matéria mineral (MM) e extrato etéreo (EE), pela metodologia de Weende;
46
47
os teores em proteína bruta (PB) pelo método Kjedahl; de fibra em detergente neutro
(FDN), fibra em detergente ácido (FDA), hemicelulose e lignina, pelo método de Van Soest
(1994); e o nitrogênio insolúvel em detergente ácido (NIDA), com o resíduo do FDA e sem
adição do sulfito de sódio. As determinações de FDN, FDA e lignina foram feitas de forma
seqüencial, acrescentando-se às amostras 0,5 g de sulfito de sódio anidro. O sulfito de sódio
misturado à solução de detergente neutro remove os taninos e os resíduos de proteína,
evitando problemas de superestimação do conteúdo em parede celular de plantas com altas
concentrações em taninos (Terril et al., 1994). Todas as análises envolvendo a
determinação de fibras foram feitas utilizando o analisador de fibras ANKOM (ANKOM
Technology Co., Fairport, Ny, USA).
A digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) foi determinado utilizando o
equipamento (DAISY; ANKOM technology Corp., Fairport, Ny), baseado na metodologia
de dois estágios de Terri et al. (1992). Para a obtenção do inóculo foram utilizados quatro
caprinos (fêmeas SRD) fistulados no rúmen, que foram adaptados, por um período de sete
dias antes da coleta do fluído ruminal, com o feno de maniçoba.
Para a determinação do teor de HCN foi utilizada a metodologia de AOAC,
estabelecida por Guignard (1917), onde 10 g de forragem fresca, foi cortada de forma
minúscula para o HCN ser produzido nas paredes do tecido da planta, colocando-se em
seguida em um tubo Kjedahl de 500ml de capacidade com 125 ml de H2O destilada. Em
seqüência colocou-se em erlemeyer 10 ml da solução de NaOH (para coletar o HCN ),
elevando-se a temperatura a 35o C a 38o C por 2 horas. Em seguida destilou-se a amostra,
em volume 5 até que o volume de liquido dentro do erlemeyer se eleve para 80ml,
elevando-se este volume para 125 ml com H2O destilada. Para titulação coletou-se 50 ml da
47
48
amostra e colocou-se no Backer, adicionando-se 4 ml de Nh4OH (Nitrato de prata), e 1 ml
de uma solução de kI (Iodeto de Potássio), mexer bem.
Para a determinação da concentração de tanino solúvel (TS), tanino ligado ao resíduo
sólido (TL) e tanino total (TT) foi utilizado o método butanol-HCl, descrito por Terrill et al.
(1992), onde uma alíquota de 10 mg das amostras, em duplicata, teve seus taninos
condensados solúveis extraídos por uma mistura de 2,5 ml de acetona aquosa a 70% com
ácido ascórbico a 0,1% e 2,5 ml de dietil éter. Após remoção dos solventes por evaporação,
o extrato foi ajustado para 5 ml com água destilada, centrifugado e separado do resíduo
sólido. Em seguida foi adicionado 1,8 ml de butanol-HCl a 5% em alíquotas de 0,3 ml do
extrato, levado-se a banho-maria a 95 0 C por 70 minutos. Os taninos condensados ligados
ao resíduo sólido foram determinados por adição de 0,7 mL de água destilada e 4,2 ml de
butanol-HCL a 5%, levado-se a banho-maria a 95 0 C por 70 minutos. Em ambos os casos,
as amostras tiveram suas absorbâncias lidas a 550 nm em espectrofotômetro (FENTO –
600PLUS) e o resultado convertido em % relativo ao tanino de jurema preta (Curva
padrão), com base na equação de regressão da curva-padrão feita a partir do tanino
condensado purificado de jurema preta (Beelen, 2002). Para a obtenção da curva padrão
requerida pelo método Butanol-HCL, utilizou-se o tanino purificado da Jurema Preta
(Mimosa hostilis) (Beelen, 2002), que é uma planta nativa do semi-árido do Nordeste, como
as forrageiras em estudo. Foram usadas alíquotas de 0,5 mg de concentrações conhecidas
do tanino condensado purificado de Jurema Preta. Essas reagiram em triplicata com
butanol-HCL a 5% e foram lidas em espectrofotômetro (FENTO – 600PLUS) a 550 nm
para a obtenção da curva-padrão. A equação de regressão da curva gerada pelo ensaio de
butanol-HCl foi Y = 1,18 + 0,022 (R2 = 0,94). A concentração em taninos total condensados
foi obtida pela soma das frações solúvel e ligada ao resíduo (Mupangwa et al., 2000). A
48
49
adstringência dos taninos foi medida pelo método de difusão radial (Hagerman, 1987). Os
taninos difundiram através de um gel de agarose contendo proteína sérica bovina 35 (BSA)
e formaram um precipitado em forma de anel, cujo diâmetro foi considerado proporcional a
sua capacidade de precipitar proteínas (adstringência).
Alíquotas de 8 μL de extrato das plantas foram colocadas em placas de petri contendo
9,5 mL de gel de uma mistura de agarose a 1% e BSA a 0,1% em solução tampão de ácido
acético a 0,3% com 0,001g de ácido ascórbico, ajustado a um pH= 5 com hidróxido de
sódio. A quantidade de taninos ativos presentes na solução que reagiu com o BSA foi
determinada pela medida do anel formado após 72 horas de incubação em estufa a 35oC e a
quantidade, em mg, de proteína precipitada foi calculada pela fórmula: volume (ml) x
concentração de proteína (mg/ml) / peso da amostra, onde o volume é determinado pela
altura do Agar e comprimento dos raios antes e após incubação.
Os dados obtidos foram submetidos a análise multivariada utilizando-se o programa
SAS (1997). Foram feitas análises de variância e teste f para cada analise química
isoladamente para contrastes entre as médias das populações. O nível de significância
considerado em todas as análises foi 5 %e 1%. A análise discriminante canônica foi
empregada para verificar como as populações relacionam-se entre si. Esta análise foi
utilizada por considerar as correlações residuais existentes entre as médias das observações,
o que se traduz numa vantagem em relação aos componentes principais. Outra vantagem do
método é que, mesmo não sendo o número de variáveis menor do que o número de
indivíduos dentro de cada população e que a multinormalidade não esteja presente, a
análise discriminante canônica pode ser aplicada de maneira exploratória, produzindo
gráficos das variáveis canônicas bastante úteis (Manly, 1994) e para o agrupamento
utilizou-se o método de Ferreira, (1996).
49
50
3.Resultados e Discussão
Na análise química das plantas do gênero Manihot observou-se diferenças significativas
(p <0,05) e (p <0,01) entre os acessos, a partir da análise de variância e do teste f, para 11
dos caracteres analisados (FDA, MS, PB, FDN, CZ, MM, TT, HCN, HEM, DIVMS), que
separaram claramente três grupo: o primeiro formado pelos acessos 10 e 15, o segundo
formado pelos acessos 1,3,5,6,11,12 e 16, onde se encontram o acesso de M. esculenta e
alguns acessos de M. pseudoglaziovii e o híbrido (manipeba) e o terceiro grupo formado
pelos acessos 2, 4,7,8,9,13 e 14.
As médias de todos os caracteres bem como o teste t, para contrastes entre as médias
das populações para os caracteres que apresentaram diferenças significativas pelo teste f,
encontram-se na Tabela 2.
Tabela 1. Analise de variância para os 13 caracteres químicos nos acessos de M. esculenta, M.
pseudoglaziovii e do híbrido (pornuncia).
Table 1. It analyzes of variance for the 13 chemical characters in the accesses of M.esculenta , M.
pseudoglaziovii and of the hybrid (pornuncia).
FV
GL
Quadrado médio
FDA
FDN
MS
Acessos 15
17,9**
60,7** 176,7*
Resíduo 64
90,4
3,8
86,2
PB
11,5*
21,2
CZ
MM
1,2 ns 11,8ns
8,9
3,8
EE
TN
HCN
CE
LG
HM
DIV
0,24 ns 13,0* 202,3ns 0,32ns 14,2* 53,2** 65,4*
4,2
3,9
81,0
29,7
8,1
76,0
1,7
NS-Não significativo, pelo teste t, * - Significativo a 5%, pelo teste t, ** - significativo a 1%, pelo teste t
significant NS-Não, for test t, * - Significant 5%, for the test t, ** - significant 1%, for test t
Pela análise discriminante canônica verificou-se que o primeiro eixo canônico, que
representa 54 % da variação, separou os acessos em três grupos distintos. Embora as
espécies de M. esculenta e o hibrido natural sejam espécies diferentes da maniçoba, estas
50
51
estão inseridos no segundo grupo, sem qualquer diferença na sua composição
bromatológica, em relação ao segundo eixo canônico com 44 % da variação observada
(Figura 1).
Somados, o primeiro e o segundo eixos representam 98 % da variação total observada.
A partir das distâncias de euclidianos médios, observa-se que em relação a analise química
a maniçoba se divide em três grupos distintos, em concordância com os dois eixos da
análise discriminante canônica (Figura 1).
O método de agrupamento foi concordante, indicando que os grupos são bem
definidos.
Figura 1. analise discriminante canônica entre os acessos de M. esculenta, M. pseudoglaziovii e do híbrido
(pornuncia).
Figure 1. Analyzes canonic discriminante enters the accesses of M. esculenta, M. pseudoglaziovii and of the
hybrid (pornuncia).
51
52
Pela análise de agrupamento observou-se, que o grupo 1, que contém os acessos 10 e
12, é o que possui os menores valores para o teor de HCN além do acesso 10 também
possuir os menores valores para tanino, o que também é confirmado pela análise canônica
onde se nota a sobreposição desses acessos de acordo com os dois eixos.
O grupo 2 formado pelos acessos 1, 3, 5, 6, 11, 15 e 16 possuem os maiores valores nas
analises de PB, DIV, MO e MM.
O grupo 3 formado pelos acessos 2, 4, 8, 9, 13 e 14
Observou-se a ocorrência de médias diferentes nas análises químicas de todos os
acessos de maniçoba (Tabela 2). Os valores de MS encontrados na maniçoba variaram de
79,9% a 91,3%, enquanto que na mandioca e na pornuncia foram de 76,1% e 90,9%
respectivamente. Estes resultados são concordantes com vasconcelos (2000) que avaliou o
feno da Maniçoba em início de frutificação com valores de química para MS de 92,95%.
Os acessos de maniçoba analizados neste trabalho apresentaram valores variaveis
de PB de 16 a 25%. O acesso de mandioca analizado apresentou valores: PB-22,8, já o
acesso de pornuncia apresentou valores: PB-19,8%. Os valores encontrados neste trabalho
são semelhantes aos encontrados por Salviano & Carvalho Filho (1982) que encontrou
valores de 20,9% para PB.
Os acessos de maniçoba analizados neste trabalho apresentaram valores variaveis de
de 47,3 a 31,2%para FDN e 25,4 a 36,5% para FDA . O acesso de mandioca analizado
apresentou valores: FDN-40,2% e FDA-33,0%, já o acesso de pornuncia apresentou
valores:FDN-41,7% e FDA-34,1%. Quanto a FDN os valores observados abaixo do
encontrado por Araújo et al, (2000) que foi de 58,00%.
Os acessos de maniçoba analizados neste trabalho apresentaram valores variaveis de
DIVMS de 64,6% a 66,1%. Já o acesso de mandioca apresentou valor de 62,2% para
52
53
DIVMS, e a pornuncia apresentou valor de 68,6%. Os valores encontrados neste trabalho são
semelhantes aos encontrados na maniçoba por Salviano e Carvalho Filho (1982): DIVMS 62,3%. Barros et al. (1990), avaliando o feno de maniçoba, determinou a composição
química com base na matéria seca; MS-93,30%, PB-12,00%, FDN-58,60, também são
valores acima dos encontrados neste trabalho.
Os acessos de maniçoba analizados neste trabalho apresentaram valores variaveis de
de 49,6% a 75,3% para MO e 8,6% a 20,7% para MM. O acesso de mandioca analizado
apresentou valor de MO-46,9% e MM-23,8%, já o acesso de pornuncia apresentou valor de
MO-95,8 e MM-9,8 %. Resultados de trabalhos avaliando o valor nutritivo da maniçoba,
revelaram valores semelhantes aqueles apresentados pelas forrageiras quando fenadas: CZ6,88 (Lima, 1996).
Os acessos de maniçoba analizados neste trabalho apresentaram valores variaveis de
de 5,1% a 17,9% para HEM, 12,5% a 15,8% para LIG, o acesso de mandioca analizado
apresentou valores de 7,3% para HEM, 15,8% para LIG e 5,5%, para EE, já o acesso de
pornuncia apresentou valores de 7,6% para HEM, 15,8% para LIG e 5,2% para EE.
Segundo Soares (2001) o valor nutritivo da maniçoba, revelaram valores superiores aos
encontrados neste trabalho para : etéreo (EE-8,3%); fibra bruta (FB-13,9%); cinzas-6,9%.
Valores diferentes obtidos aos relatados neste trabalho, poderiam estar expressando
distintas épocas de corte da planta ou técnica diferente de coleta de material ou mesmo
variedades diferentes de uma mesma espécie. Em todos os trabalhos os resultados se
aproximam do esperado de um feno de boa qualidade, isto é, conter adequada quantidade
de princípios nutritivos, especialmente proteínas e sais minerais, demonstrar alta
digestibilidade e boa composição bromatológica.
53
54
Os resultados observados para os teores de HCN foi de 205,2 mg/kg de MS, enquanto
que na pornuncia foi de 324,0 mg/kg de MS, já os resultados obtidos para os acessos de
maniçoba variam de 97,2 à 291 mg/kg de MS (Tabela 2), confirmando que as plantas
estudadas são pouco toxicas de acordo com resultados obtidos por Cavalcanti e Araujo
(2000), em que o nível de toxicidade da parte aérea fresca pelo conteúdo de ácido
cianídrico livre (HCN) em mg/kg de matéria seca (MS) e :M.dichotoma var. dichotoma
(1.289), a M.carthaginensis (1.104) e a M.epruinosa (1.002), menos tóxicas :M.glaziovii
procedência de Petrolina-PE (304), aM.cearulescens (387) e a M.glaziovii procedênte de
Antas-BA (529).
De uma maneira geral, pode-se observar que na planta verde, em início de brotação, a
maniçoba apresenta um teor médio de ácido cianídrico (HCN) de 1.000 mg/kg de MS,
entretanto quando fenada o teor de HCN baixa para menos de 300 mg/kg de MS,
quantidade insuficiente para provocar qualquer sintoma de intoxicação em animais, mesmo
que em grande quantidade e por muito tempo (Cavalcanti e Araujo, 2000). A maniçoba
apresentou valores de tanino ligado ao resíduo variando de 0,90% a 5,3%, enquanto que a
mandioca e pormuncia apresentaram valores de 12,7% e 10,9% respectivamente. Santa
Cruz (2005)observou que o teor de tanino ligado ao resíduo na maniçoba foi de 1,1% valor
inferior aos encontrados na maioria dos acessos de maniçoba avaliados neste trabalho.
54
55
Tabela 2. Médias das analises de MS, PB, FDN, FDA, DIVMS, MM, MO, HEM, LIG, EE, CEL, TT e HCN nos13 acessos de
Manihot pseudoglaziovii, M. esculenta e do híbrido (pornuncia).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
MS
PB
FDN
FDA
DIVMS
(%MS)
(%MS)
(%MS)
(%MS)
(%MS)
82,8CD
81,4CD
86,8AB
86,6AB
85,9AB
85,2AB
86,9AB
82,6CD
79,9D
91,3A
83,8AB
86,9AB
88,7AB
90,7A
90,9A
76,1D
24,8A
14,4C
25,0A
18,5BC
22,0BC
23,2AB
21,9BC
23,6AB
18,3BC
22,3AB
22,5AB
16,0C
22,1AB
22,3AB
19,8BC
22,3AB
31,2A
44,2A
41,6A
40,4A
43,7A
40,2A
47,3A
33,6A
46,7A
44,7A
32,7A
42,7A
33,7A
36,9A
41,7A
40,2A
32,7ABC
29,6ABC
25,4C
36,5AB
29,0BC
26,4C
30,8ABC
25,8C
33,8BC
34,7BC
25,8C
37,6A
27,3BC
26,2C
34,1BC
33,0BC
65,9AB
64,8BC
66,1AB
64,6BC
66,1AB
65,4B
65,4B
65,4B
65,0BC
65,9AB
64,8BC
65,4B
64,6C
66,1AB
68,6A
62,2C
Caracteres analisados
MO
MM
(%MS)
44,9C
54,3BC
57,3BC
60,8BC
58,5BC
55,2BC
60,2BC
49,9BC
49,6BC
75,3AB
48,2BC
66,6BC
62,3BC
73,7BC
95,8A
46,9BC
(%MS)
17,1BC
18,5BC
13,1CD
13,3CD
14,0CD
14,7CD
13,0CD
17,4BC
20,7AB
8,6D
16,1CD
13,0CD
11,2D
9,2D
9,8D
23,8A
HEM
LIG
EE
CEL
TT
HCN
(%MS)
(%MS)
(%MS)
(%M
S)
(%MS)
(mg/kg)
13,9A
12,7A
15,2A
15,8A
12,6A
12,9A
15,6A
12,6A
15,7A
12,5A
13,2A
12,7A
13,5A
13,9A
15,8A
15,2A
4,4E
5,0BC
4,1E
3,5E
3,6E
4,6E
4,9CD
4,0E
3,4E
3,8E
4,9DE
3,7E
3,6E
3,3E
5,2AB
5,5A
23,1ª
23,6ª
23,1ª
23,6ª
23,1ª
23,6ª
23,1ª
23,6ª
23,1ª
23,6ª
23,1ª
23,1ª
23,1ª
23,6ª
23,6ª
23,6ª
2,8BC
4,2BC
3,9BC
1,9C
4,0BC
1,5C
2,9BC
0,2C
3,0BC
0,9C
2,8BC
3,3BC
1,9C
5,3BC
10,9AB
12,7 A
237,6D
291,6B
194,4E
273,3BC
194,4E
194,4E
273,3BC
207,5E
273,3BC
97,2E
172,8E
108,0E
259,2C
273,6BC
324,0A
205,2E
6,3A
12,6A
16,1A
12,0A
15,4A
14,7A
17,9A
9,1A
12,8A
10,0A
6,9A
5,1A
6,4A
10,7A
7,6A
7,3A
ns-nãosignificativo, pelo teste t, * - significativo a 5%, pelo teste t, ** - significativo a 1%, pelo teste t
significant NS-Não, for test t, * - Significant 5%, for the test t, ** - significant 1%, for test t
55
56
Os resultados observados para os teores de HCN foi de 205,2 mg/kg de MS, enquanto
que na pornuncia foi de 324,0 mg/kg de MS, já os resultados obtidos para os acessos de
maniçoba variam de 97,2 à 291 mg/kg de MS (Tabela 2), confirmando que as plantas
estudadas são pouco toxicas de acordo com resultados obtidos por Cavalcanti e Araujo
(2000), em que o nível de toxicidade da parte aérea fresca pelo conteúdo de ácido
cianídrico livre (HCN) em mg/kg de matéria seca (MS) e : M. dichotoma var. dichotoma
(1.289), a M. carthaginensis (1.104) e a M. epruinosa (1.002), menos tóxicas: M. glaziovii
procedência de Petrolina-PE (304), a M. cearulescens (387) e a M. glaziovii procedênte de
Antas-BA (529).
De uma maneira geral, pode-se observar que na planta verde, em início de brotação, a
maniçoba apresenta um teor médio de ácido cianídrico (HCN) de 1.000 mg/kg de MS,
entretanto quando fenada o teor de HCN baixa para menos de 300 mg/kg de MS,
quantidade insuficiente para provocar qualquer sintoma de intoxicação em animais, mesmo
que em grande quantidade e por muito tempo (Cavalcanti e Araujo, 2000). A maniçoba
apresentou valores de tanino ligado ao resíduo variando de 0,90% a 5,3%, enquanto que a
mandioca e pormuncia apresentaram valores de 12,7% e 10,9% respectivamente. Santa
Cruz (2005) observou que o teor de tanino ligado ao resíduo na maniçoba foi de 1,1% valor
inferior aos encontrados na maioria dos acessos de maniçoba avaliados neste trabalho.
56
4.Conclusões
Os acessos de mandioca e pornuncia diferiram estatisticamente dos acessos de maniçoba
em relação à análise química. Os resultados obtidos nos acessos de maniçoba diferiram
acessos em três grupos distintos.
Os dados obtidos nesse trabalho indicam a existência de variabilidade entre os acessos de
M. pseudoglaziovii em relação a composição química, embora sem diferenças significativas
para que estes acessos sejam identificados como espécies diferentes.
5. Referências Bibliográficas
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43
44
44
CAPÍTULO III
________________________________________________
VARIABILIDADE GENETICA DE ACESSOS DE MANIÇOBA (Manihot
pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.) E DE DUAS ESPÉCIES AFINS DE INTERESSE
FORRAGEIRO ATRAVÉS DE RAPD
64
Variabilidade Genética de Acessos de Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffm.)
e de duas Espécies Afins de Interesse Forrageiro Através De RAPd
RESUMO: Com o objetivo de analisar a variabilidade genética em populações naturais,
foram estudados 14 acessos de Manihot pseudoglaziovii, coletados no Estado da Paraíba
na microrregião Curimataú Paraibano, além de um acesso de M. esculenta Cranz
(mandioca) e de um híbrido natural entre essas duas espécies. Cinco plantas de cada
acesso foram multiplicadas através de estaquia e em seguida cultivadas em uma área
experimental em condições padronizadas, para se ter uma exteriorização homogênea de
cada genótipo. A otimização do protocolo de extração do DNA de alguns acessos de
maniçoba e de duas espécies afins de interesse forrageiro e verificar a variabilidade
genética através da amplificação com marcadores moleculares RAPD via PCR. Foram
testados dois métodos de extração do DNA. O protocolo de extração usando o
detergente CTAB possibilitou obter produtos limpos, menos viscosos e oxidados. Na
análise de variabilidade genética foram usados em um total de 10 iniciadores (Primers),
e apenas 3 produziram bandas OPD2, OPD3 e OIPD8, o iniciador OPD2 apresentou
maior percentagem de polimorfismo seguido do OPD3, com valores de 30,7% e 42,8%,
respectivamente. Estes iniciadores podem discriminar diferenças moleculares entre os
acessos de maniçoba e de duas espécies afins.
Palavras Chaves: Polymerase Chain Reaction, protocolo, DNA, Maniçoba,
extração
63
Genetic variability of Accesses de Maniçoba (Manihot pseudoglaziovii Pax & Hoffmann.)
e of two Similar Species of Forager Interest Through RAPd
ABSTRACT: With the objective to analyze the genet variability in natural populations, five
accesses of Manihot had been studied pseudglaziovii, collected in the State of the Paraíba in
the microregion Curimataú Paraibano, beyond an access of esculenta M. Cranz (cassava) and
a natural hybrid between these two species. Five plants of each access had been multiplied
through statue and after that cultivated in an experimental area in standardized conditions, to
have a homogeneous exteriorizacion of each genotype. The otimização of the protocol of
extraction of the DNA of some accesses of maniçoba and of two similar species of forager
interest and to verify the genetic variability through the amplification with molecular markers
RAPD saw PCR. Two methods of extraction of the DNA had been tested. The extraction
protocol using detergent CTAB made possible to get clean products, less viscous and
oxidized. In the analysis of genetic variability they had been used in a total of 10 starters
(Primers), and only 3 had produced bands, starter OPD2, OPD3 and OPD8 presented greater
percentage of polymorphism followed of the OPD2, with values of 30,7% and 42,8%,
respectively. These starters can discriminate molecular differences between the accesses of
maniçoba and two similar species.
Key words: Maniçoba, Manihot sort, native forager, characterization, DNA
64
Introdução
O nome maniçoba tem sido usado para designar algumas espécies do gênero Manihot,
existe uma certa discrepância, nas informações, dos estudiosos, com relação à classificação
botânica das plantas como espécies ou variedades de uma mesma espécies (Salviano e Nunes,
1991), identificação das diferentes variedades de maniçoba com características forrageiras
através da taxonomia tradicional é dificultada por varias razões: os fenótipos, com grande
variedade de acordo as condições ecológicas; a poliplóide, que existe em grande número de
populações que se reproduzem vegetativamente e sexualmente; a existência de numerosos
híbridos, como por exemplo, em muitas das espécies que florescem durante o mesmo período
do ano e que não estão separadas por barreiras biológicas (Scheinvar, 1995). Além disso, a
maniçoba é predominantemente encontrada em forma silvestre e em áreas cultivadas de
pequenos agricultores que a selecionam e identificam, dessa forma uma mesma variedade pode
receber mais que uma denominação, assim também se pode dar um mesmo nome para
diferentes espécies.
Até o momento, nenhum estudo tem sido publicado sobre o uso de marcadores
moleculares de DNA para estimar a diversidade genética na maniçoba. Este marcador, baseado
em variações de seqüências de DNA tem demonstrado ser uma ferramenta extremamente
efetiva para mapeamento e diagnósticos genéticos, taxonomia molecular, análise de
integridade genética, estudos evolutivos e estudos citológicos para confirmar o modo de
reprodução por apomixias versus autopolinização, haplóides por partenogênese ou fertilização
cruzada. As vantagens no uso desses marcadores residem no fato deles existirem em número
praticamente ilimitado, não estarem sujeitos a efeitos pleitrópicos, epistáticos ou ambientais e
poderem ser determinados em qualquer tipo de tecido ou estagio de desenvolvimento da planta
(Michelmore & Hulbert, 1987). Esses marcadores, quando combinados a características
fenotípica fornecem um bom quadro para agrupamento de genótipos e para o planejamento de
65
cruzamentos. Além disso, podem auxiliar na avaliação da redundância e deficiências das
coleções de germoplasma (Ferreira & Grattapaclia, 1996).
A técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) foi conhecida por Muller & Faloona
(1987), sendo um método de amplificação de DNA de segmentos específicos, podendo ser
facilmente detectado a olho nu em gel de eletroforese através de corantes específicos. A
reação baseia-se na síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento
específico de DNA na presença da enzima DNA polymerase. Sua reação baseia-se no
anelamento e extensão enzimática de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita
simples) utilizados como indicadores (“primers”) que delimitam a seqüência de DNA de fita
dupla alvo da amplificação.
Para que tenha êxito o PCR depende justamente da habilidade das enzimas
copiadoras de DNA permanecerem estáveis em alta temperatura. Atualmente, é
utilizada a DNA polimerase isolada da bactéria hipertermofílica Thermus aquaticus
(Saiki et al.,1998), sendo denominada Taq polimerase.
O processo de PCR consiste em três etapas. A primeira é a desnaturação , onde a fita
dupla de DNA alvo é desnaturada pela elevação da temperatura para 96°C, sendo
dividida em duas fitas simples. Em seguida a temperatura diminua para 55°C aonde os
primers vão se anelar às seqüências complementares no DNA. Na terceira etapa a
temperatura é novamente elevada para 75°C para que a Taq polimerase trabalhe melhor,
adicionando nucleotídeos a partir dos primers fazendo uma cópia completa dos moldes.
Os segmento de DNA são sintetizados em uma progressão geométrica, pois a cada
ciclo origina-se um novo segmento a partir do inicial e de cada um dos segmentos já
produzidos no ciclo anterior (Borba, 2000). Este ciclo é repetido umas 30 vezes,onde
depois de algumas horas tem-se mais de um milhão de cópias de um determinado
segmento de DNA. O resultado da amplificação de ácidos nucléicos por PCR pode ser
66
facilmente visualizado por eletroforese em gel de agarose, o sucesso da amplificação
depende das condições de reação, da pureza dos reagentes utilizados e dos diferentes
parâmetros da reação (Borba, 2000).
Existem diferentes tipos de marcadores de acordo com o nível da expressão. Os
marcadores morfológicos, são observados no último nível da expressão do caráter. Já os
marcadores bioquímicos, ou isoenzimas, detectam o polimorfismo da molécula de
DNA, sendo importantes marcadores, pois são utilizados em todas as espécies de
plantas. E os marcadores moleculares, que operam no DNA são os sistemas mais
diretos, onde a análise é feita diretamente na macromolécula portadora de toda a
informação genética. Então se pode definir como marcador molecular a todo e qualquer
fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de
um segmento específico de DNA (Ferreira Grattapaclia, 1998).
Os marcadores moleculares têm demonstrado ser uma ferramenta efetiva para o
mapeamento e diagnósticos genéticos, taxonomia molecular, análises da integridade
genética e estudos evolutivos (Carneiro,1997). A tecnologia de DNA recombinante e o
desenvolvimento da amplificação de segmentos de DNA via PCR (Polimerase Chain
Reaction), ou reação de polimerase em cadeia, abriram o caminho para uma mudança
no paradigma genético básico. O estudo de genoma de plantas tem se beneficiado,
sobretudo, dos avanços obtidos na área de genética humana. Métodos estatísticos
acompanham este desenvolvimento, e tem permitido a manipulação de enormes
quantidades de dados genéticos (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
A técnica de RAPD, foi desenvolvida independentemente por dois grupos de
pesquisadores nos EUA. Williams et al. (1990) deram o nome mais comumente
utilizado, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), que é baseado na reação de
“Polymerase Chain Reaction” (PCR), com duas características distintas: utiliza
67
pequenas seqüências de oligonucleotídeos de DNA de fita simples, “primers”, ao invés
de um par de “primers”; O primeiro tem seqüência arbitrária com cerca de 50-80% de G
+ C, e assim a seqüência alvo é desenvolvida. As diferenças de apenas um par de bases
(mutações de ponto) são suficientes para causar a não complementaridade do “primer”
com o sítio de iniciação e assim impedindo a amplificação de um segmento (Williams et
al.,1993).
O polimorfismo genético detectado pelos marcadores RAPD tem natureza binária,
isto é, o segmento amplificado (banda no gel) está presente ou ausente. Devido a grande
quantidade de DNA produzido, podem ser visualizados diretamente na forma de uma
banda em gel de eletroforese, corados com brometo de etídio e observados na luz
ultravioleta (Williams et al.,1990 ; Ferreira & Grattapaglia, 1996).
A técnica de RAPD tem grandes vantagens em relação às outras técnicas
moleculares. Nesta técnica é necessário de uma quantidade mínima de DNA necessária para a
análise genotípica de um individuo (da ordem de dezenas de nanogramas). Permite ainda gerar
uma grande quantidade de polimorfismo de segmentos de DNA, distribuídos por todo o
genoma do organismo, oferecendo a possibilidade de mostrar regiões de DNA repetitivos, uma
vez que os “primers” utilizados para a detecção da variação ao nível de DNA são arbitrários.
RAPD reúne, portanto, a simplicidade da visualização direta dos marcadores de DNA. È uma
técnica mais simples e rápida do que o RFLP, pois não necessita de informações sobre o DNA
alvo (Carneiro, 1997).
Nesse sentido, o presente trabalho objetiva prover os forragicultores e melhoristas
com uma ferramenta que possibilite não apenas a identificação taxonômica precisa de
uma importante forrageira nativa, como também aperfeiçoar a utilização dessas espécies
68
2.Materiais e Métodos
2.1.Material Vegetal
O trabalho foi conduzido em condições de campo no Centro de Ciências Agrárias(CCA)
da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), em Areia –PB. O município localiza-se na
microrregião do Brejo Paraibano, a uma altitude de 618m, situando-se entre as coordenadas
geográficas 06o 57’48” de altitude sul e 35o 41’30” de longitude oeste de Greenwich, com
clima quente e úmido e precipitação anual de 1200 mm, com médias de temperaturas
máximas de 28oC e mínimas de 21oC.
Foram obtidos 14 acessos de manihot pseudglaziovii com diferenças visuais distintas,
coletados ao longo da rodovia Br 104 entre os Municípios de Remígio e Barra de Santa Rosa,
Estado da Paraíba. Também foram incluídos, para comparação, um acesso de M. esculenta
Cranz (Mandioca) e um híbrido natural entre essas duas espécies (pornuncia), ambos
provenientes do Município de Areia (Figura 1).
Cinco plantas de cada acesso foram multiplicadas através de estaquia e em seguida
cultivadas em uma área experimental em condições padronizadas de adubação e rega, para se
ter uma exteriorização homogênea de cada genótipo. De cada acesso foram preparadas
exsicatas que encontram-se depositadas no Herbário Prof. Jayme Coelho de Moraes
(CCA/UFPB).
Inicialmente foi realizada a produção de mudas de maniçoba, estas mudas foram
feitas através de estaquia, com tamanho de 30 cm e com corte em Bisel na parte inferior. As
mudas foram transplantadas para sacos de polietileno preto (23 x 13 cm), onde permaneceram
por 3 meses, sendo, em seguida, transplantadas para o campo de produção, em um solo
classificado como Latossolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, apresentando as seguintes
características químicas: pH- 5.0, P(mg/dm3)- 5,47, K(mg/dm3)- 42,08, Al+3(cmolc/dm3)-
69
0,25, Ca+2(cmolc/dm3)- 0,90, Mg+(cmolc/dm3)- 0,90, CTC (cmolc/dm3)- 4,23 e MO (g/dm3)10,39.
O solo foi preparado mediante limpa do terreno e preparo das covas, e aplicação de
1,0 T/ha de calcário dolomítico.
A adubação orgânica de fundação foi feita uma semana antes do plantio, de acordo
com a recomendação do Laboratório de Química e Fertilidade do Solo, aplicando-se 1,8 kg de
adubo orgânico por cova. O plantio foi realizado em covas num espaçamento de 1,5 m entre
plantas e 2,0 m entre blocos.
Foram realizados os tratos culturais como regas, capinas com auxílio de enxadas, e
aplicação de defensores agrícolas para o controle de formigas e ácaros.
O experimento foi conduzido em um delineamento de blocos casualizados com 16
tratamentos e cinco repetições.
De cada planta estudada foram retiradas 2 folhas jovens para extração do DNA no
Laboratório de Biologia Molecular de plantas do DBM/CCEN/UFPB.
Tabela 1. Identificação dos acessos de maniçoba e de duas espécies afins.
Table 1. Identification of the accesses of maniçoba and two similar species.
Identifi
cação da
amostra
2.amos
tra
3.amos
tra
6.amos
tra
9.amos
tra
10.am
ostra
13.am
ostra
14.
amostra
Espéci
e
Mandi
oca
Maniç
oba
Maniç
oba
Maniç
oba
Maniç
oba
Maniç
oba
Manip
eba
70
Tabela 2. Iniciadores (primers) com suas correspondentes seqüências de nucleotídeos.
Table 2. Starters (primers) with its corresponding sequences of nucleotídeo
Iniciador (primer)
Seqüência
OPD1
5’ -ACC GCG AAG G – 3’
OPD2
5’ - GCA CCC AAC C – 3’
OPD3
5’ - GTC GCC GTC A – 3’
OPD4
5’ -TCT GGT GAG G – 3’
OPD5
5’ - TGA GCG GAC A – 3’
OPD6
5’ -ACC TGA ACG G _ 3’
OPD7
5’-TTG GCA CGG G _3’
OPD8
5’-GTG TGC CCC A _3’
OPD9
5’-CTC TGG AGA C_3’
OPD10
5’-GGT CTA CAC C_3’
2.2.Extração de DNA
Foram utilizados dois diferentes protocolos na extração de DNA.
Primeiramente foi seguido o Protocolo definido por Dellaporta et al
(1983). Amostras de 250 mg de tecido vegetal, foi transferido para o pilão e
adicionado 300 µl da Solução 1- (mais 2-ßmecaptoetanol, na quantidade de
7 µl/ 10ml) – As folhas foram maceradas, e a mistura foi transferida para
eppendorf de 2 ml e incubada à temperatura ambiente por 5 minutos. Em
seguida foi adicionado 20 µl da Solução 2 e a mistura foi homogeneizada e
levada par banho-maria a 65°C por 10 minutos. Depois de retirada do
banho–maria foi adicionado 200 µl da Solução 3 e a mistura foi agitada
vigorosamente e incubada no gelo por 20 minutos. Decorrido este tempo à
71
mistura foi centrifugada a 14000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi
retirado e transferido para
novos eppendorfs (1,5 ml) e o DNA foi
precipitado pela adição de 800 µl de isopropanol a 20 °C, a mistura foi
homogeneizada vagarosamente e incubada a –20°C por 30 minutos. O
precipitado foi lavado com 1 ml de etanol 70% e imediatamente
centrifugado a 14000 rpm por 3 minutos. Sendo então o precipitado seco à
temperatura ambiente, com os eppendorfs invertidos em papel toalha. A
continuação o precipitado foi ressuspendido em 300 µl de tampão TE, e
centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido
para novos eppendorfs (1,5 ml) e foi adicionado 33 µl da Solução de
acetato de sódio à 3M e 900 µl de etanol absoluto (gelado) e foi
homogeneizado vagarosamente. A seguir a mistura foi centrifugada a
14000 rpm por 5 minutos e o precipitado foi lavado com 1 ml de etanol
70% (gelado). Por último o precipitado foi colocado para secar a
temperatura ambiente por 15-30 minutos e ressuspendido em 50 µl de
tampão TE e foi armazenado a –20°C até sua utilização.
O segundo protocolo é baseado na utilização do detergente CTAB (Doyle &
Doyle, 1987). Amostras de 250 mg de tecido vegetal, foi transferido para o pilão e
adicionado 700 µl da solução de extração CTAB (mais 1 % de 2-βmecaptoetanol). A
folhas foram maceradas e em seguida a mistura foi transferida para eppendorf (2ml), e
levada para o banho – maria a 65°C por 30 minutos. Depois de retirada do banho –
maria esperou-se esfriar por 5 minutos a temperatura ambiente. Foi adicionado 700 µl
de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), invertendo cuidadosamente durante 5 minutos.
72
A mistura foi centrifugada a 14000 rpm por 5 minutos, e o sobrenadante foi retirado
(430 µl) para novo eppendorf (1,5 ml).
Em seguida foi adicionado a mistura 430 µl de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e
centrifugado a 14000 rpm por 5 minutos. Novamente foi retirado o sobrenadante e
transferido para novo eppendorf (1,5ml). A mistura então foi precipitada com 2/3 do
volume de isopropanol a –20°C, sendo homogeneizada vagarosamente e incubada a –
20°C por 30 minutos. A mistura foi centrifugada a 14000 rpm por 3 minutos. O
precipitado foi lavado com 1 ml de etanol 70% (gelado) no shaker por 20 minutos,e
centrifugado a 14000 rpm por 3 minutos, duas vezes consecutivas. Decorrido esse
tempo foi centrifugada a 14000 rpm por 5 minutos e o precipitado foi seco a
temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida foi adicionado 500 µl de NaCl a 1M.
O pellet foi dissolvido ao máximo, aquecendo o eppendorf em banho – maria a 65°C. A
mistura foi incubada por 30 minutos a 4 °C. Então foi centrifugada a 14000 rpm por 10
minutos, e o sobrenadante transferido para novo eppendorf e precipitado com 2/3 do
volume de isopropanol e incubado por 45 minutos a – 20°C. Em seguida a mistura foi
centrifugada a 14000 rpm por 3 minutos e o pellet foi lavado com 1 ml de etanol
(gelado) no shaker por 20 minutos, duas vezes. E por último o precipitado foi seco a
temperatura ambiente por 15-30 minutos e ressuspendido em 50 µl de tampão TE, e
armazenado a –20°C até sua utilização.
Foram efetuadas duas extrações do DNA/cultivar para que fosse utilizada a
extração de melhor resultado para a amplificação por PCR.
2.3.Quantificação por espectrofotometria
73
Para a determinação da concentração de DNA foi utilizada a leitura em
espectrofotômetro, medindo-se a absorbância em comprimento de onda de 260 nm
(A260), e a concentração foi determinada pela seguinte formula (Romano, 1998):
[DNA]= 50µg/ml x D x A260
Onde o D é o fator de diluição usado para fazer a leitura no espectrofotômetro.
Foi utilizado para a preparação da amostra 995 µl de água Mili-Q e 5 µl da amostra
de DNA (diluição 1: 200). Para se obter a concentração de DNA de cada amostra foi
feita à leitura primeiro na absorbância com comprimento de onda de 260 nm,que mede a
quantidade de ácidos nucléicos presente na amostra, em seguida a leitura foi feita na
absorbância de 280 nm, que mede a quantidade de polissacarídeos na amostra. E por
último a leitura feita no comprimento de onda de 310 nm, que estima a presença de
compostos fenólicos e/ou de proteínas. A leitura nessa absorbância tem que ser baixa
próxima de zero, mostrando assim que as amostras estão puras. A razão entre as leituras
A260 e A280 em um DNA puro deve estar entre 1,8 e 2,0. Razão menor significa
contaminação com proteínas, razão maior indica contaminação com fenol (Romano,
1998).
2.4.Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e eletroforese
A reação de amplificação foi baseada no protocolo estabelecido por
Kary Mullis (IQBAL et al., 1997). Cinco primers de fita única (Tabela 2),
foram utilizados para a reação em cadeia de polimerase (PCR).
Para a amplificação foi utilizado um volume final de 50µl, contendo os seguintes
componentes em suas concentrações finais: 5ng/µl da amostra de DNA; 25µl de PCR
Master Mix (0,5unitis/ml Taq polimerase (pH 8,5); 400µM de dATP, dGTP, dCTP,
dTTP e 3mM de MgCl2); 15µl de Nuclease- Free Water; 10µM de primer. A mistura
foi coberta com 50µl de óleo mineral para não ocorrer evaporação durante a reação.
74
As amplificações foram feitas em um termociclador (M J Research, Mini
CyclerTM) utilizando a seguinte programação: Primeiro ciclo com temperatura a 94°C
por 1 min, seguido de 40 ciclos a 94°C por 1 min, 36°C por 1 min e 72°C por 2 min
(desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente). A reação foi finalizada com
um ciclo a 72°C por 4 min, e mantida a 4°C por 15 minutos. A amostra foi armazenada
a –20°C até sua utilização.
Para a separação dos fragmentos de DNA amplificados por PCR, foi utilizado
cuba de eletroforese (85 x 60 mm) contendo 30 ml de gel de agarose a 1.2% em tampão
TBE 0,5X e 2µl de Brometo de etídio (10mg/ml). As amostras de corrida foram
preparadas utilizando-se 8 µl da amostra de PCR misturados com 3 µl do corante de
corrida (4,0 g de glicose, 0,025 g de azul de bromofenol, 0,025 g de xileno cianol e 10
ml de água destilada) e 4 µl do marcador de peso molecular 1Kb misturado com 2 µl do
corante de corrida. As amostras foram corridas a 70 volts, aproximadamente por 40
minutos.
75
3.Resultados e Discussão
3.1.Estabelecimento do protocolo de extração de DNA.
O protocolo proposto por Dellaporta et al (1983), para a extração de DNA
de plantas do genero Manihot, não obteve resultados satisfatórios. As amostras
(pellets) de DNA ficaram muito grandes, viscosas e com uma coloração
marrom, no final do processo. Um sinal de excesso de contaminantes (Ferreira
& Grattapaglia, 1998). Na quantificação das amostras por espectrofotometria
(Tabela 3), a razão entre as leituras de A260nm e A280nm, que mede a pureza das
amostras, mostrou valores abaixo do esperado. Uma provável explicação, para
esse resultado seria a contaminação das amostras por compostos fenólicos, nas
amostras em que a razão foi maior que 2,0, e nas amostras em que a razão foi
menor que 1,8 estavam contaminadas com proteínas (Romano, 1998). A
coloração marrom é devido à oxidação dos compostos fenólicos, em agentes
oxidantes que danificam o DNA.
Tabela 3. Leituras de absorbância e quantificação das amostras de DNA (Maniçoba), extraídos
pelo método de Dellaporta et, al (1983).
Table 3. Readings of absorbância and quantification of the samples of DNA (Maniçoba), extracted for
the method of Dellaporta et al (1983).
Amostra
A260
Absorbância (nm)
A280
A310
Razão
1.Amostra 1
12,600
8,700
0,0015
A260/A280
1,448
2.Amostra 2
4,095
2,018
0,0079
2,029
[DNA]µg/µl
0,732µg/µl
0,786µg/µl
76
O protocolo de extração de DNA usando o detergente CTAB possibilitou obter
produtos menos viscosos e oxidados. A quantificação das amostras de DNA por
espectrofotometria (Tabela 4), apresentaram valores próximo de zero na A310, e a
relação de A260/A280 apresentaram valores entre 1,8 – 2,0 indicando ausência de
compostos fenólicos, contaminação com proteínas e carboidratos (Romano, 1998).
A utilização de CTAB a 2% auxiliou no processo de remoção de polissacarídeos,
assim mesmo a utilização de PVP a 1% e 2-ßmecaptoetanol a 1% beneficiaram na
qualidade do DNA, reduzindo as ações de endonucleases e diminuindo a atividade
enzimática de peroxidases e polifenoloxidases (Carneiro, 1997). Para a obtenção de
DNA mais limpo foi utilizado também, uma lavagem com NaCl a 1M e duas lavagens
adicionais com álcool a 70% por 20 minutos. Isto é recomendado quando se observa um
pellet de DNA muito grande, viscoso e/ou escuro (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Tabela 4. Leituras de absorbância e quantificação das amostras de DNA extraídos pelo método
de CTAB (Doyle & Doyle,1987).
Table 4. Readings of absorbância and quantification of the samples of DNA extracted for the CTAB
method (Doyle & Doyle, 1987).
Amostra
Absorbância
A310
Razão
A260/A280
[DNA]µg
/µl
1,861
0,99µg/µl
A260
A280
2.mandioca
1,1285
0,6062
3.maniçoba
1,5712
0,7923
0,0129
1,983
1,0µg/µl
6.maniçoba
0,6791
0,3629
0,0001
1,871
0,96µg/µl
9.maniçoba
0,4087
0,2266
0,0049
1,803
0,95µg/µl
10.maniçoba
0,6059
0,3240
0,0018
2,001
0,95µg/µl
13.maniçoba
0,5843
0,3082
0,0090
1,895
0,95µg/µl
14.manipeba
0,6483
0,3509
0,0063
1,847
0,99µg/µl
0,0086
77
Análise de RAPD
A amplificação, através do PCR das amostras de DNA dos acessos de
maniçoba e de duas espécies afins com 10 diferentes iniciadores foram
corridas por eletroforese em gel de agarose a 1,2% e fotografada no Imager
Master, Pharmacia Biotech, e esta informação foi analisada para ver a
variação a nível molecular dos cultivares.
Tabela 5. Produtos da amplificação através de RAPD - PCR das amostras de DNA dos acessos
de maniçoba e de duas espécies afins, usando 10 iniciadores.
Table 5. Products of the amplification through RAPD - PCR of the samples of DNA of the accesses of
maniçoba and two similar species, using 10 starters.
Total de bandas
Número de
Seqüência 5’- 3’
amplificadas
polimorfismo
OPD1
5’-ACC GCG AAG G- 3’
-
-
-
OPD2
5’-GCA CCC AAC C- 3’
13
4
30,7%
OPD3
5’-GTC GCC GTC A- 3’
7
3
42,8%
OPD4
5’-TCTGGTGAG G- 3’
-
-
-
OPD5
5’-TGAGCGGAC A- 3’
-
-
-
OPD6
5’ _ACCTGAACG G _ 3’
-
-
-
OPD7
5’_ TTG GCACGG G _3’
-
-
-
OPD8
5’_GTGTGC CCC A _3’
2
1
50%
OPD9
5’_ CTC TGG AGA C_3’
-
-
-
OPD10
5’_ GGT CTA CAC C_3’
-
-
-
Iniciador
% de
polimorfismo
% de polimorfismo: n° de polimorfismo / total de bandas x 100.
Foram 10 iniciadores (primers) utilizados, e apenas 3 iniciadores (OPD2,
OPD3 e OPD8), produziram bandas. Os 3 iniciadores apresentaram um
total de 22 bandas, com uma média de 7,1 bandas por iniciador, incluindo 8
78
bandas polimórficas. O número de bandas por iniciador variou de 2 a 13
bandas. Os outros iniciadores não produziram fragmento amplificado,
enquanto que o iniciador OPD2 produziu o maior número de fragmentos
amplificados 13 e 4 bandas polimórficas. Enquanto que o iniciador OPD8
produziu 2 fragmentos amplificados e nenhuma banda polimórfica. O
iniciador OPD3 produziu 6 fragmentos amplificados e 1polimórficas.
Assim observamos, que o iniciador OPD2 apresentou maior percentagem
de polimorfismo seguido do OPD2, com valores de 42,8% e 30,7%,
respectivamente (Tabela 5). O tamanho e a distribuição das bandas
amplificadas usando os 10 iniciadores estão descritas na tabela 7 e são
observados na figura 1, 2 e 3. Foi observado que os iniciadores geraram
uma série de bandas polimórficas se estendendo de 450 pb até 1850 pb
(OPD2).
79
Tabela6. Distribuição e tamanho das bandas amplificadas através de RAPD – PCR das
amostras de DNA dos acessos de maniçoba e de duas espécies afins, usando os 10 iniciadores.
Tabela6. Distribution and size of the bands amplified through RAPD - PCR of the samples of DNA of
the accesses of maniçoba and two similar species, using the 10 starters.
Iniciad
Tamanho
or
das
Distribuição das bandas
1
2
3
4
5
6
7
bandas
amplificad
as
OPD1
-
-
-
-
-
-
-
-
OPD2
1850
-
+
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
+
1550
-
950
+
-
-
-
+
-
-
450
+
+
+
+
-
-
+
1850
-
+
+
+
-
-
-
1450
-
-
-
-
-
-
+
950
-
+
+
+
-
-
-
OPD4
-
-
-
-
-
-
-
-
OPD5
-
-
-
-
-
-
-
-
OPD6
-
-
-
-
-
-
-
-
OPD7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
OPD3
OPD8
950
OPD9
-
-
-
-
-
-
-
-
OPD10
-
-
-
-
-
-
-
-
+ se refere à presença de bandas, em relação ao marcador RAPD.
Com o iniciador OPD2 (Figura 1) obteve o resultado de duas bandas
polimórficas com pesos moleculares de 1850 pb, presentes nas amostras 2,
80
3,6,9,10 e 14, e uma banda de 450pb, que pouco visualizada na amostra
13.
Figura 1. Produtos de amplificação de eletroforese em gel de agarose, obtidos com o iniciador
OPD2 (5’- ACC GCG AAG G –3’). Sendo indicadas as bandas polimórficas pelas setas pretas.
Marcador molecular (M), de 1kb.
Figure 1. Products of amplification of eletroforese in gel of agarose, gotten with starter OPD2 (5 ' ACC GCG AAG G -3 '). Being indicated the polimórficas bands for the black arrows. Molecular
marker (M), of 1kb.
Usando-se o iniciador OPD2 foram encontradas 4 bandas polimórficas
com peso molecular de 1850, 1550, 950, 553 e 450 pb. As bandas
polimórficas de 1850 e 450 pb foram encontradas em todas as amostras
exceto na amostra 13. A amostra 14 (pormuncia) foi a única que apresentou
81
bandas com peso molecular de 1550 pb. As amostras 10 e 13 ( maniçoba )
apresentaram banda com peso molecular de 950 pb.
Figura2: Produtos de amplificação de eletroforese em gel de agarose, obtidos com o iniciador m
OPD3 (5’- GTC GCC GTC A –3’). Sendo indicadas as bandas polimórficas pelas setas pretas.
Marcador molecular (M), de 1kb.
Figura2: Products of amplification of eletroforese in gel of agarose, gotten with iniciador OPD3 (5 ' GTC GCC GTC the -3 '). Being indicated the polimórficas bands for the black arrows. Molecular
marker (M), of 1kb.
O iniciador OPD3 apresentou 7 bandas , sendo 3 polimorficas e com peso
molecular de 1850 e 950 nas amostras 3,6 e 9. A amostra 14 (pormuncia) foi
a única que apresentou peso molecular de 1450 pb.
82
Figura 3. Produtos de amplificação de eletroforese em gel de agarose, obtidos com o iniciador OPD8
(5’_GTGTGC CCC A _3’). Aparecendo bandas polimórficas. Marcador molecular (M), de 1kb.
Figure 3. Products of amplification of eletroforese in gel of agarose, gotten with starter OPD8
(5'_GTGTGC CCC _ 3 '). Appearing polimórficas bands. Molecular marker (M), of 1kb
Os resultados obtidos com o iniciador OPD8 que apresentou 2 bandas, sendo
1 polimórfica, com peso molecular de 950 pb nas amostras 3 e 10.
Com a separação dos fragmentos, amplificados via RAPD - PCR, em gel
de eletroforese revelaram diferenças entre os cultivares maniçoba,
mandioca e manipeba pois cada espécie apresentou peso especifico.
Com o aparecimento de bandas nas amostras 3,6,9 e 10 ( maniçoba) com
mesmo peso molecular , apresentando características semelhantes
comprovando ser uma única espécie Manihot pseudglaziovii Paz &
Hoffmann . Já as amostras 10 e 13 apresentaram variações no peso
molecular, podendo ser descritos como variedades diferentes de Manihot
pseudoglaziovii Paz & Hoffmann.
83
5. Conclusões
A adequação do protocolo de extração de DNA utilizando o detergente CTAB a
2%, PVP a 1%, 2-ß mecaptoetanol a 1%, NaCl a 1M e lavagens adicionais com álcool a
70%. Melhoraram a qualidade do DNA dos acessos de maniçoba e de duas espécies
afins extraído para reações de RAPD- PCR.
A utilização dos iniciadores OPD2 e OPD3 na amplificação através de
RAPD – PCR das plantas do gênero manihot, permitiu a visualização de
bandas polimórficas.
Com a separação dos fragmentos, amplificados via RAPD - PCR, em gel
de eletroforese revelaram diferenças entre os cultivares maniçoba,
mandioca e pornuncia pois cada espécie apresentou peso especifico.
Com o aparecimento de bandas nas amostras 3, 6, 9 e 10 (maniçoba)
com mesmo peso molecular , apresentando características semelhantes
comprovando ser uma única espécie Manihot pseudoglaziovii Paz &
Hoffmann. Já as amostras 10 e 13 apresentaram variações no peso
molecular, podendo ser descritos como variedades diferentes de Manihot
pseudglaziovii Paz & Hoffmann.
84
6. Referências Bibliograficas
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