universidade federal do rio grande do norte centro de
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL THAIS ALINE OLIVEIRA MACIEL ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE LINFÓCITOS TCD-8 E DAS CÉLULAS NK EM CASOS DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR SEM METÁSTASE E COM METÁSTASE E SUA RELAÇÃO COM A PROGRESSÃO DA LESÃO NATAL/RN 2014 THAIS ALINE OLIVEIRA MACIEL ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE LINFÓCITOS TCD-8 E DAS CÉLULAS NK EM CASOS DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR SEM METÁSTASE E COM METÁSTASE E SUA RELAÇÃO COM A PROGRESSÃO DA LESÃO Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Patologia Oral. Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto NATAL-RN 2014 Dedicatória Com todo amor do mundo Dedico este trabalho... Aos meus pais, Hélio e Eliete, que durante todos esses anos estiveram sempre ao meu lado como base forte passando os mais sublimes valores para minha formação como pessoa e profissional... Aos meus irmãos, Hélio Junior e Tatiana Vanessa, pela união e cumplicidade, fazendo desse trio um só coração! “As nossas melhores ideias ficam adormecidas em tempos favoráveis. Se tivermos paciência, elas vão evoluir em meio as nossas piores dificuldades”. (Bianca Toledo) Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus.... Meus eternos agradecimentos ao professor Leão Pereira Pinto, meu orientador, pelo carinho, paciência e ensinamentos a mim conferidos durante todos esses anos. Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, onde cada um com sua contribuição, tornaram-me capacitada para desenvolver a pesquisa científica de forma plena. Aos funcionários Lurdinha, Sandrinha, Hével, Gracinha, Idelzuíte e Ricardo, que também foram de fundamental importância na realização desse trabalho. Aos meus amigos do mestrado pelos sorrisos e angústias partilhadas. Chegar ao fim desse ciclo ao lado de cada um de vocês tornou tudo mais alegre e leve. Amigos da patologia, amigos por toda Vida. Ao meu namorado Alexandre, que acompanhou de perto os momentos mais difíceis dessa jornada. Obrigada pela companhia constante, pelos cuidados e tantas palavras de incentivo. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro, tornando essa pesquisa possível. Resumo RESUMO A presença de células inflamatórias dentro do microambiente tumoral exerce um papel dual podendo contribuir tanto para a progressão como para a inibição do crescimento do tumor. Estudos recentes sugerem que a qualidade, e não a quantidade, do infiltrado inflamatório é o determinante mais importante para o prognóstico. Portanto, as células TCD8 e as células natural killer (NK), são as principais células efetoras no combate do câncer. O objetivo desse trabalho foi avaliar, através do estudo imunoistoquímico, a expressão dos linfócitos TCD8 e das células NK em carcinoma epidermóide (CE) de lábio inferior e sua relação com a progressão da lesão. A amostra foi composta por 32 espécimes de CE de lábio inferior, dos quais 16 apresentavam metástase linfonodal regional, e os 16 restantes, livres de metástase. O total de células positivas no front de invasão foram avaliados de forma quantitativa e os resultados obtidos foram relacionados com estadiamento clínico TNM, gradação histopatológica de malignidade e fatores prognósticos. Observou-se para o grupo com metástases, prevalência dos estágios III e IV (p<0,0001). A maioria dos casos com metástase, apresentava alto grau de malignidade (p=0,006). A maioria dos casos classificados como de alto grau de malignidade apresentava estágios III e IV (p=0,032). Do total da amostra, houve três casos com recidiva e cinco com óbito, no entanto essas variáveis não apresentaram diferença estatisticamente significativa quando associadas a parâmetros clinico-patológicos. A imunoexpressão do CD8 e do CD57, respectivamente, não apresentaram associação estatisticamente significativa com nenhum dos parâmetros clínico –patológicos estudados, metástases (p=0,346; p=0,622); estadiamento clínico TNM (p=0,146; p=0,576) gradação histopatológica de malignidade (p=0,936; p=936); recidiva (p=0,075; p=0,075) e óbito (p=0,897; p=0,856). Acreditando na função que o sistema imunológico possui frente a células malignas, conclui-se que os linfócitos TCD8 e as células NK, estariam atuando no controle da progressão de neoplasias malignas, mas não de forma isolada. Palavras-chave: Carcinoma de Células Escamosas. Células Matadoras Naturais. Linfócitos. Radiação Solar. Abstract ABSTRACT The presence of inflammatory cells within the tumor microenvironment plays a dual role that may contribute both to the progression and for inhibition of tumor growth. Recent studies suggest that the quality, not the quantity, of the inflammatory infiltrate is the most important determinant for prognosis. Therefore, TCD8 cells and natural killer cells are the main effector cells in combating cancer. The aim of this study was to assess, through the immunohistochemical study, the expression of TCD8 lymphocytes and NK cells in epidermoid carcinoma (EC) of the lower lip. The sample consisted of 32 specimens of EC of the lower lip, of which 16 had regional lymph node metastasis, and the 16 remaining, free of metastases. The total number of positive cells at the front of invasion were evaluated quantitatively and the results were related to clinical TNM staging, histological grade of malignancy and prognostic factors. It was observed for the group with metastasis, prevalence of stages III and IV (p<0.0001). Most patients with metastasis, had a high grade of malignancy (p=0.006). Most cases classified as high grade of malignancy had stages III and IV (p=0.032). Of the total sample, there were three cases of recurrence and five with death, however these variables were not statistically significant when associated with clinicopathological parameters. The immunostaining of CD8 and CD57, respectively, showed no statistically significant association with any of the clinicopathological parameters studied, metastasis (p=0.346, p=0.622), TNM classification (p=0.146, p=0.576), histological grade of malignancy (p=0.936, p=936), recurrence (p=0.075, p=0.075) and death (p=0.897, p=0.856). Believing in the function of the immunological system against malignant cells, it is concluded that the TD8 lymphocytes and NK cells, would be acting in the control of the progression of malignant neoplasms, but not in isolated manner. Lista de Ilustrações LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Fotomicrografia mostrando aspectos morfológicos do CE de alto grau de malignidade. (HE/ Barra=100µm) ....................................... Figura 2 Fotomicrografia mostrando aspectos morfológicos do CE de baixo grau de malignidade (HE/ Barra=100µm) .................................... Figura 3 Figura 5 63 Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão do CD57 em CE de lábio inferior com metástase (Barra= 50µm) ................................ Quadro 1 62 Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão do TCD8 em CE de 62 lábio inferior com metástase (Barra= 50µm) ................................. Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão do CD57 em CE de lábio inferior sem metástase (Barra= 50µm) ................................. Figura 6 61 Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão do TCD8 em CE de lábio inferior sem metástase (Barra=50µm) .................................. Figura 4 61 63 Sistema de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por Sobin, Wittekind (2002)........................................... 46 Quadro 2 Categorias de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por Sobin, Wittekind (2002)........................................... 47 Quadro 3 Sistema de gradação de malignidade proposto por Bryne (1998)........ 48 Quadro 4 Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos a serem utilizados....................... 50 Lista de Tabelas LISTA DE TABELAS Tabela 1 Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de acordo com a metástase linfonodal e o estadiamento clínico. Natal, RN – 2014.............................................. 53 Tabela 2 Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de acordo com a gradação histológica de malignidade, metástase linfonodal e o estadiamento clínico. Natal, RN –2014........................................................................................... Tabela 3 54 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão tumoral em relação à presença ou ausência de metástase linfonodal. Natal, RN – 2014................................................................................ 55 Tabela 4 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão tumoral em relação ao estadiamento clínico. Natal, RN – 2014............................. 56 Tabela 5 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão em relação à gradação histológica de malignidade (Bryne, 1998). Natal, RN – 2014........................................................................................... 56 Tabela 6 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão em relação à ausência e presença de recidiva. Natal, RN – 2014.............. Tabela 7 57 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão em relação à ausência e presença de óbito. Natal, RN – 2014................... 57 Tabela 8 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão tumoral em relação à presença ou ausência de metástase linfonodal. Natal, RN – 2014................................................................................ 58 Tabela 9 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão tumoral em relação ao estadiamento clínico. Natal, RN – 2014............................. 58 Tabela 10 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão em relação à gradação histológica de malignidade (Bryne, 1998). Natal, RN– 2014........................................................................................... Tabela 11 59 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão em relação à ausência e presença de recidiva. Natal, RN – 2014.................................................................................................... 59 Tabela 12 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão em relação à ausência e presença de óbito. Natal, RN – 2014................... 60 Lista de Siglas e Abreviaturas LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS APCs Do inglês, antigen-presenting cells, Células apresentadora de antígeno. CE Carcinoma epidermóide. CEO Carcinoma epidermóide oral. CO Câncer oral. CD57 Molécula de hidrato de carbono expressa na superfície de células NK. DNA Do inglês, deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleioco. FAZ Membro da família do TNF expresso na superfície celular (CD95). FOXp3 Fator de trasncrição forkhead Box P3. FTN Do inglês, Transforming growth factor, traduzido como fator de necrose tumoral. GM-CSF Do inglês, Granulocyte Mono-cyte-Colony Stimulating Factor, Fator de estimulação de colônias de macrofágos granulócitos. G-CSF Do inglês, Granulocyte colony-stimulating fator, Factor de estimulação de granulócitos colónia. KIR Do inglês, Killer Immunoglobulin-like Receptors, Família dos receptores imunoglobulina-símile de células natural killer. HLA Do inglês, Humam leukocyte antigen, antígeno de leucócito humano. HPV Do inglês, Humam papilomavirus, Papiloma vírus humano. IL-2 Do inglês, Interleukin 2, interleucina 2. IL-10 Do inglês, Interleukin 10, interleucina 10. INCA Instituto Nacional do Câncer. IFN- alfa Do inglês, natural interferon alpha, interferon alfa. IFN-gama Do inglês, natural interferon gama, interfom gama. iNOS Do inglês, Inducible nitric oxide synthase, enzima geradora de óxido nítrico. ITAMs Do inglês, immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ILTs Do inglês, família dos transcritos semelhante à Ig. LTC Linfócito T citotóxico. NER Do inglês, Nucleotide excision route, traduzido como via de excisão de nucleotídeo. NKT Pequena população de células T que expressam uma molécula de superfície tipicamente encontrada em célula natural killer. NKG2 Do inglês, receptor de ativação de células NK. OMS Organização Mundial de Saúde. TCD8 Referente ao linfócito CD8. TNM Do inglês Tumor-Node-Metastasis, refere-se ao sistema de estadiamento clínico que avalia o tamanho do tumor, envolvimento do linfonodo regional e envolvimento por metástases à distância. TCR Do inglês, T cell receptor, receptor de célula T. UV Termo referente à radiação ultravioleta. UVA Radiação ultravioleta tipo A. UVB Radiação ultravioleta tipo B. UVC Radiação ultravioleta tipo C. Sumário SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................... 26 2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL........................................................ 26 2.2 23 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO E CONSIDERAÇÕES CLÍNICO – PATOLÓGICAS........................................................................ 28 2.3 LINFÓCITOS TCD-8 E CÉLULAS NK........................................................ 32 2.3.1 Linfócitos TCD-8.......................................................................................... 2.3.2 Células NK..................................................................................................... 35 2.4 32 A INFLUÊNCIA DO TCD-8 E DAS CÉLULAS NATURAL KILLER (CD-57) NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL................................... 38 3 PROPOSIÇÃO............................................................................................. 4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 44 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ....................................................................... 44 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ............................................................ 44 4.3 POPULAÇÃO................................................................................................ 44 4.4 AMOSTRA.................................................................................................... 44 4.4.1 Critérios de inclusão da amostra................................................................. 45 4.5 ESTADIAMENTO CLÍNICO TNM PARA 42 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR...................................................... 45 4.6 ANÁLISE CLÍNICA E MORFOLÓGICA..................................................... 47 4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO ............................................................... 48 4.7.1 Análise imunoistoquímica ........................................................................... 50 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 51 5 RESULTADOS ............................................................................................ 53 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ........................................................ 53 5.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS ................................................................. 5.3 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS................................................... 55 5.3.1 Análise da expressão do TCD8..................................................................... 55 5.3.2 Análise da expressão do CD57..................................................................... 57 5.3.3 Correlação entre os marcadores.................................................................. 60 6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 7 CONCLUSÕES ............................................................................................ 73 53 65 REFERÊNCIAS ........................................................................................... 75 APÊNDICE .................................................................................................. 86 ANEXOS ....................................................................................................... 91 6 Introdução 23 1 INTRODUÇÃO O carcinoma epidermóide (CE) de lábio é uma neoplasia maligna que ocorre com certa frequência no vermelhão do lábio, uma zona de transição entre a mucosa labial interna e a região externa da pele do lábio (LEEUWEN et al., 2009). O principal fator de risco relacionado ao CE de lábio é a radiação solar (BRENER et al., 2007; VAN LEEWEN et al., 2009). Portanto, o Brasil assume uma expressiva importância epidemiológica pelo fato de ser um país tropical onde há grande incidência da radiação ultravioleta (SENA et al., 2010). O CE de lábio quando detectado em estágio precoce tem um melhor prognóstico com taxas de cura acima de 80% (ZITSCH et al., 1995). Este tipo de câncer, apesar de sua localização facilmente visível, é frequentemente diagnosticado em estágio avançado com alto índice de morbidade e mortalidade (ODEL; MORGAN, 1998). É bem verdade que, existe uma íntima associação entre a resposta imune e o câncer. Sendo assim, a inflamação pode contribuir tanto para a progressão como para inibição do crescimento tumoral (VISSER; COUSSENS, 2005; OLIVEIRA-NETO et al., 2007). Existem claras evidências de que a persistência da inflamação promove proliferação celular assim como pode induzir danos ao DNA da estrutura comprometida. Em estágios inicias da tumorigênese, fatores inflamatórios medeiam o desenvolvimento do tumor associado ao estroma (FELLER; ALTINI; LEMMER, 2013), promovendo a angiogênese, crescimento tumoral, metástases e evasão da resposta imune (MANTOVANI et al., 2010). As células cancerígenas podem ser detectadas e eliminadas pelo sistema imune, fenômeno este descrito como "vigilância imunológica", restrito, principalmente, à capacidade das células natural killer (NK) e dos linfócitos T (BOTTCHER et al., 2013). As células NK são capazes de eliminar células malignas sem prévia sensibilização de um antígeno específico, diferentemente dos linfócitos T. Estas células são ativadas em resposta a diversos estímulos, como citocinas produzidas por outros componentes do sistema imunológico e receptores de inibição e ativação específicos (COTRAN; KU MAR; COLLINS, 1999). Em contraste com as células NK, os linfócitos T possuem atividade antitumoral restrita ao reconhecimento do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (BOTTCHER et al., 2013). Estudos têm sido realizados na tentativa de elucidar o papel das células inflamatórias na patogênese do câncer. Nessa busca, os pesquisadores lançam mão do uso de marcadores imunológicos para quantificar e qualificar o infiltrado inflamatório presente no ambiente 24 tumoral. O anti-CD8 é um marcador específico utilizado para identificar a presença de linfócitos TCD-8, os quais estão associados a um melhor prognóstico em câncer de esôfago (SCHUMACHER et al., 2001). O CD57 é um hidrato de carbono expresso por uma variedade de tipos celulares no sistema nervoso dos vertebrados e sua expressão, também, é encontrada em células NK maduras (SHIBA, T et al., 2006; FOCOSI et al., 2010). Este marcador tem sido utilizado para avaliar a deficiência imune funcional em pacientes com câncer, doenças autoimunes e doenças infecciosas (FOCOSI et al., 2010). O propósito deste estudo foi avaliar o infiltrado inflamatório quantitativamente, através da imunoexpressão do anti-CD8 e do anti-CD57, nos casos de CE de lábio inferior sem metástase e com metástase regional linfonodal, relacionando os resultados obtidos com os parâmetros clínicos-patológicos em relação ao estadiamento clínico TNM, gradação histológica de malignidade e fatores prognóstico. 25 Revisão de Literatura 26 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1. CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL O câncer é considerado um problema de saúde pública mundial (INCA, 2014). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima, para o ano de 2030, vinte e sete milhões de casos incidentes de câncer. No Brasil, para os anos de 2012 e 2013, estima-se 518.510 novos casos desta doença, sendo que deste total 14.170 têm localização, primariamente, na cavidade oral (INCA, 2014). O câncer oral (CO) é o sexto tipo de câncer mais frequente e é um problema relevante em regiões onde o hábito do tabaco, com ou sem o consumo de álcool, são comuns (PARKIN et al., 2002; OMS, 2009; MAROCCHIO et al., 2010). O carcinoma epidermóide oral (CEO) é a neoplasia maligna mais comum na cavidade oral, também denominado de carcinoma de células escamosas ou carcinoma espinocelular, correspondendo cerca de 94% de todos os tumores malignos da região de cabeça e pescoço. (BRENER et al., 2007; NEVILLE; DAMM; ALLEN, 2009; WOLFF et al., 2012). Na América do Sul, o Brasil apresenta o maior índice de CEO, numa proporção de 8.3 para cada 100.000 habitantes (MAROCCHIO et al., 2010). Para o ano de 2014, de acordo com estimativas realizadas pelo Instituto Nacional do câncer (INCA), ocorreram cerca de 11.280 novos casos em homens e 4.010 em mulheres, totalizando 15.290 novos casos. Esses valores correspondem a um risco estimado de 11,54 novos casos a cada 100 mil homens e de 3,92 a cada 100 mil mulheres. Em relação à mortalidade, estima-se que chegará a uma faixa de 6.214 mortes em todo o país (INCA, 2014). As taxas de incidência e mortalidade para o CEO mudam de um país para outro e, até mesmo dentro de cada país, sobretudo pelas diferenças de hábitos, características socioeconômicas, expectativa de vida, fatores ambientais, raça, educação preventiva e qualidade da assistência médica nas diversas regiões (BRENER et al., 2007). O CEO tem predileção por homens acima dos 40 anos de idade, no entanto, sua prevalência entre indivíduos mais jovens e mulheres, tem aumentado (NEVILLE; DAMM; ALLEN, 2009; MAROCCHIO et al., 2010). O maior número de ocorrências para pacientes do gênero feminino é decorrente de mudanças comportamentais que sofreram ao longo dos anos. O consumo demasiado e crônico do tabaco e de destilados, que antes eram considerados hábitos essencialmente masculinos, foram incorporados pelas mulheres (FRANCIO et al., 2011). O CEO é uma neoplasia de natureza multifatorial (NEVILLE; DAMM; ALLEN, et al., 2009). A sua etiologia pode ser induzida por uma combinação de inúmeros fatores, dentre os 27 quais: hábitos pessoais, atividade profissional, local de residência, problemas nutricionais, radiação, exposição à luz ultravioleta, ativação de oncogenes, predisposição e susceptibilidade genética (MANNARINI et al., 2009; JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASAINGHE, 2011; WOLFF et al., 2012). No entanto, o consumo de fumo e álcool são os principais fatores de risco para o desenvolvimento dessa doença (MANNARINI et al., 2009; JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASAINGHE, 2011; WOLFF et al., 2012). A carcinogênese do tabaco é inquestionável, uma vez que cerca de 25% dos casos de câncer oral são atribuídos ao uso do tabaco (fumado e/ou mascado) (PETTI, 2008). A ingestão de álcool associado ao hábito de fumar aumenta em aproximadamente 5 vezes a chance do indivíduo desenvolver o câncer de cavidade oral. Contudo, o consumo de álcool, de forma isolada, não pode ser considerado como fator de risco para o câncer oral (ZNOAR, 2003). A apresentação clínica do CEO é bastante variada, podendo se mostrar como uma lesão exofítica ou endofítica, leucoplásica, eritroplásica ou eritroleucoplásica em estágios mais iniciais (SILVA; AMARAL; BULHOSA, 2010). Acomete principalmente língua e lábio, podendo afetar outros sítios, como assoalho, mucosa jugal, gengiva e palato (CANTO; DEVASSA, 2002). A localização anatômica do CEO reflete os diferentes fatores a que uma determinada população está exposta. Nos Estados Unidos e na Inglaterra, a língua é o sítio anatômico mais acometido, provavelmente em virtude do consumo de tabaco associado a ingestão do álcool (SASAKI et al., 2005; CHOI et al., 2006). Nos países com clima tropical como ocorre na região Nordeste do Brasil, o sítio mais acometido é o lábio inferior, que se deve principalmente à intensa exposição solar (COSTA et al., 2002). A localização anatômica foi considerada um fator de influência no prognóstico, haja vista que os tumores apresentam comportamento clínico diferente conforme a sua localização anatômica (COSTA et al., 2002). Costa et al (2008), realizaram estudo para investigar a existência da correlação entre o estadiamento clínico (TNM), localização anatômica e o prognóstico do CEO. Foi evidenciado que os pacientes com lesões localizadas em lábio inferior encontravam-se predominantemente em estágio I e, aquelas com lesões em língua, apresentavam-se em estágio III e IV. A maioria das lesões que acometiam o palato mole e assoalho bucal foram classificados como T4. Esses resultados sugerem que diferentemente dos tumores em lábio, àqueles em língua, palato mole e assoalho bucal tendem a ser mais agressivos e infiltrativos, possuindo, portanto, pior prognóstico (HORA, 2001). O potencial de agressividade do tumor está relacionado a varios fatores, como localização anatômica, tamanho 28 do tumor, nível de comprometimento dos tecidos vizinhos, presença de metástases no momento do diagnóstico e o grau histológico de malignidade (BRYNE, 1998). 2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO E CONSIDERAÇÕES CLÍNICO – PATOLÓGICAS O CE de lábio é uma neoplasia oral comum e um relevante problema de saúde pública em diversos países (SUGERMAN et al., 2002). Estas lesões correspondem a 15% de todas as neoplasias maliganas em região de cabeça e pescoço (VARTANIAN et al., 2003) e entre 25% e 30% de todos os carcinomas epidermóides orais (HASSON, 2008; SOUZA et al., 2011). O CE de lábio é mais frequente entre os homens, em uma proporção de 6:1 em relação às mulheres e acomete, principalmente, indivíduos com mais de 50 anos de idade, leucoderma e com atividade ocupacional relacionada a uma exposição crônica ao sol (OCHSENIUS et al., 2003; ROSSI et al., 2008). O CE de lábio acomete, predominantemente, o lábio inferior em 80 % dos casos e resulta principalmente da exposição crônica aos raios ultravioletas (UV) e da sua localização anatômica por favorecer uma maior exposição, quando comparado ao lábio superior (LUNA-ORTIZ et al., 2004; SOUZA et al., 2011). Souza et al. (2011) avaliaram os aspectos epidemiológicos do CE de lábio e sua associação com fatores clínicos em uma amostra de 30 casos. Observaram os autores que o lábio inferior foi o sítio mais acometido (83,3%) e a proporção homem/mulher foi de 5:1. A predileção pelo sexo masculino foi atribuída ao fato da maioria dos trabalhadores ao ar livre serem do gênero masculino. A baixa incidência nas mulheres está associada ao uso de protetor labial ou batom que, certamente, protege o lábio da ação dos raios solares . A radiação ultravioleta é o principal fator indutor de alterações no lábio (BRENER et al., 2007; VAN LEEWEN et al., 2009; SENA et al., 2010) e seu espectro solar pode ser dividido em três comprimentos de onda: UVA, UVB e UVC. Dependendo do tipo de radiação UV, da intensidade de exposição e da quantidade de melanina na pele, o paciente poderá ter um risco maior para o desenvolvimento de neoplasias malignas (VISSCHER; VAN DER WALL, 1998). A maioria dos malefícios causados pela radiação UV, especialmente a UVB é atribuida à formações de dímeros de pirimidina no DNA, principalmente os dímeros de timina (BOGLIOLO, 2011). Esta lesão ao DNA é corrigida pela via de excisão de nucleotídeos (NER). Quando o tecido é continuamente exposto à radiação ionizante, a capacidade da via NER de realizar reparo fica sobrecarregada , e parte da lesão do DNA danificado não será removida (ROBBINS; COTRAN, 2005). 29 Embora a radiação solar seja o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de lesões no lábio, ela não é o único responsável pela carcinogênese nesta região anatômica. Outros fatores como o tabagismo associado a ingestão crônica de álcool, HPV, raça, predisposição genética e familiar, estado de imunossupressão, má alimentação e a situação sócio-econômica podem influenciar no desenvolvimento do CE de lábio (ABREU;KRUGER;TENNANT , 2009). Clinicamente, o CE de lábio inferior se apresenta como placas leucoplásicas ou eritroplásicas, com áreas atróficas mostrando fissuras persistentes, escamas ou crostas. (VIERA et al., 2012). A lesão também pode clinicamente se manifestar sob a forma de massa verrucosa, crescimento exofítico, sangrante e friável (OCHSENIUS et al., 2003). O CE de lábio histologicamente é caracterizado pela proliferação de ilhas e cordões de células epiteliais malignas, crescendo como entidades independentes invadindo o conjuntivo. Estas células apresentam individualmente hipercromatismo nuclear, alteração da relação núcleo-citoplasma, figuras de mitoses típicas e atípicas e pleomorfismo celular e nuclear. Pode ser observado ainda, disceratose, com ocasional formação de pérolas córneas. Em algumas áreas evidenciam-se a presença de degeneração basofílica das fibras colágenas, o que caracteriza a elastose solar em decorrencia da exposição crônica aos raios solares (NEVILLE; DAMM; ALLEN, 2009; VIEIRA et al., 2012). O sistema de estadiamento clínico TNM possibilita fazer uma avaliação das características principais do CEO: extensão local, disseminação regional e metástase à distância (COSTA et al., 2002). A classificação por esse sistema é realizada através da avaliação de três parâmetros: (T) tamanho do tumor, em centímetros; (N) envolvimento dos linfonodos e sua extensão; e (M) presença ou não de metástases distantes (KREPPEL, 2010). Porém, esse método vem apresentando algumas falhas em relação a predição do prognóstico do CEO (BETTENDORF et al., 2004). A utilização do sistema de gradação histológica de malignidade otimiza o estadiamento TNM e auxilia na escolha do tratamento, uma vez que fornece fatores prognósticos adicionais (LOURENÇO et al., 2007). Os sistemas de gradação histológica de malignidade tem sido objeto de inúmeros estudos e resultados mais satisfatórios vem sendo alcançados para predizer o prognóstico do CEO (BETTENDORF et al., 2004; KADEMANI et al., 2005; WOOLGAR, 2006; LARSEN et al.; 2009). Diversos autores, em diferentes épocas, propuseram novos sistemas de classificação histopatológica para CEO, na tentativa de esclarecer o comportamento biológico discrepante de tumores com caractrísticas clínicas similares (LOURENÇO et al., 2007). Em 1920, Broders sugeriu uma forma de classificação histológica quantitativa e propôs uma gradação baseada no 30 grau de diferenciação celular. Os tumores classificados em altamente diferenciados produziam muita ceratina e, aqueles pouco difereciados, apresentavam células anaplásicas com pouca ou nenhuma produção de ceratina. Muitos autores questionaram o valor dessa classificação, alegando que outras características histopatológicas devem ser analisadas para avaliar o comportamento biológico do CEO e propuseram novas classificações histopatológicas (LOURENÇO et al., 2007). Jakobsson et al. (1973) incluíram não só parâmetros morfológicos, mas também, uma avaliação da relação tumor-hospedeiro. Anneroth e colaboradores em 1984 propuseram um sistema de classificação multifatorial que não se limitava apenas à avaliação das células tumorais. Eles utilizaram o sistema proposto por Jakonnson et al., 1973, baseado em características histopatológicas das células tumorais e a sua relação tumor-hospedeiro. Foi omitido na classificação de Anneroth e colaboradores o parâmetro “invasão vascular”. Bryne (1989) inovou o sistema de classificação histopatólogica dos tumores quando avaliou apenas as áreas mais anaplásicas dos sítios de maior invasividade dos tumores. A autora observou que as células que se localizavam em regiões mais invasivas de um tumor, mostraram alterações mais parecidas com aquelas observadas em tumores com metástases. Sendo assim, essas células teriam a capacidade de predizer o comportamento clínico da lesão maligna. Para esta gradação o parâmetro estágio de invasão foi retirado e os seguintes parâmetros foram avaliados: grau de ceratinização, pleomorfismo celular, número de mitoses, padrão de invasão e infiltrado inflamatório. São designados escores numéricos de 1 a 4 para cada característica avaliada, priorizando a área mais invasiva do tumor. Depois da avaliação, os escores são somados e se obtém o grau de malignidade do tumor, onde quanto maior o escore, pior o prognóstico. Assim, o tratamento de escolha poderá ser guiado baseado no estágio de malignidade em que se encontra a lesão. Bryne et al. (1992) publicaram uma revisão de seus estudos anteriores, no qual aperfeiçoou o seu sistema de gradação histopatológica comparando o valor prognóstico do sistema com e sem a contagem de figuras de mitoses. Eles observaram que o valor prognóstico continuou sendo significativo e que houve um consenso maior entre os examinadores quando a contagem mitótica foi removida da gradação. Neste sistema os seguintes parâmetros morfológicos são analisados: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e a resposta inflamatória. Bryne (1998) propôs uma hipótese em que as características moleculares e morfológicas na zona do fronte invasivo de muitos CEOs podem refletir um melhor prognóstico do que as outras partes do tumor, já que diversos eventos moleculares de importância para a disseminação do tumor como ganhos e perdas de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas, 31 aumento da proliferação celular e início da angiogênese, ocorrem na interface tumorhospedeiro. A autora desenvolveu um sistema de classificação morfológico de malignidade que se restringe a avaliar a profundidade do front invasivo do tumor. Vários estudos realizados mostram que a classificação histopatológica de malignidade do front invasivo é um complemento importante para o estadiamento clínico. Sendo assim, esse sistema é consideravelmente melhor preditor de prognóstico. Silveira et al. (2007) ao utilizarem o sistema de gradação histopatológica de malignidade do front de invasão proposto por Bryne e colaboradores (1992) em seus casos de CE, sugeriram uma modificação do escore final de malignidade, uma vez que foi realizada a remoção do parâmetro número de mitose. Neste estudo, o grau de malignidade foi considerado baixo para os escores de 4 a 8 pontos e de alto grau de malignidade para os maiores que 8 pontos. O sistema de gradação da Organização Mundial da Saúde (OMS) revisto em 2005, é baseado na classificação proposta por Broders e analisa as diferenças histológicas entre o epitélio normal e o tecido tumoral. Atualmente, ela é baseada no grau de diferenciação celular, e a classificação do CEO é dividida em 3 categorias: bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pobremente diferenciado . Brandwein-Gensler et al. em 2005, elaboraram uma avaliação histológica de Risco que tinham como objetivo inicial examinar o impacto do limite de ressecção de margens, com margens positivas para células malignas ou não, em relação ao desfecho do CEO de cavidade oral. Além disso, analisaram a participação e a associação de outras variáveis histopatológicas e clínicas, como a sobrevida do paciente e a recorrência do tumor. Os pacientes foram classificados em baixo, intermediário e alto risco de acordo com a recorrência local e probabilidade de sobrevida global. O tratamento a ser realizado em pacientes com CE de lábio poderá ser guiado através do sistema de estadiamento clínico de tumores (TNM). No estágio I e II, é preconizado o uso da cirurgia ou radioterapia e o tratamento é baseado nos resultados funcionais e estéticos esperados. A presença de margens positivas ou uma profundidade de invasão tumoral superior a 5mm, sugere uma combinação das duas formas de tratamento para obtenção de melhores resultados. Já nos estágios III e IV, o tratamento consiste em cirurgia combinada com radioterapia, a quimioterapia combinada com a radioterapia ou a cirurgia. A excisão dos linfonodos regionais é realizada quando se suspeita do envolvimento dos linfonodos e rotineiramente em pacientes com lesões em estágios III e IV (VIEIRA et al., 2012). A recidiva para o CE de lábio inferior é de apenas 8% e as taxas de sobrevida de 5 anos são de 95 % a 100%. Quando o CE acomete a região do vermelhão do lábio superior, o seu 32 comportamento clínico tem um curso diferente. A taxa de sobrevida de 5 anos cai para 58%, e 25 % das lesões recidivam após o tratamento (NEVILLE; DAMM; ALLEN, 2009). O CE de lábio é considerado uma neoplasia maligna de baixa agressividade e prognóstico favorável, uma vez que possui tendência para progredir lentamente (VIEIRA et al., 2012) com baixa taxa de metástase em linfonodos regionais (VARTANIAN et al., 2003). Outra característica que possibilita um bom prognóstico é o diagnóstico precoce devido a fácil visualização direta das alterações na cavidade oral pelo profissional dentista e pelo paciente (SARGERAN et al., 2009). Mesmo com esta facilidade na visualização das lesões, o diagnóstico tardio é observado em 5% a 20 % dos casos e, no momento do diagnóstico, os pacientes já se encontram com metástases em linfonodos cervicais, reduzindo o índice de sobrevida dos mesmos (HASSON, 2008). A ocorrência de metástase a distância para o CE de lábio inferior é pequena e sua incidência varia de 0,5% a 2 %. Esses índices são esperados em pacientes com tumores em estágios avançados e com envolvimento de linfonodos regionais no momento do diagnóstico. Os pacientes com comprometimento linfonodal apresentam um risco de desenvolver metástase a distância de aproximadamente 10% (BETKA, 2001) 2.3 LINFÓCITOS TCD-8 E CÉLULAS NK 2.3.1 Linfócitos TCD-8 O sistema imunológico humano pode ser dividido em duas partes: imunidade inata e adaptativa. O sistema imune inato reage dentro de minutos após o encontro com os agentes patogenicos invasores. Já o sistema imune adaptativo emprega ferramentas mais novas e mais personalizadas, demora dias ou semanas para gerar anticorpos e células T especializadas no combate aos patógenos (HOBOHM, 2009). A imunidade inata é eficaz contra uma variedade de agentes infecciosos, que têm características comuns reconhecidas pelas células fagocíticas, mas não tem nenhuma memória imunológica contra a exposição anterior (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Ela é composta principalmente de células natural killer (NK), polimorfonucleares (PMN) e macrófagos e está diretamente envolvida na imunologia de tumores. Estas células também participam na resposta adaptativa e formam uma ponte importante e vital entre os dois ramos do sistema imune (RUSH; CUDRICI; NICULESCU, 2005). 33 A resposta imunológica adaptativa é caracterizada pela resposta imune humoral, mediada por anticorpos produzidos por linfócitos B, sendo que a resposta imune celular é mediada por linfócitos T, que reconhecem antígenos de microorganismos intracelulares, que são apresentados aos linfócitos por células apresentadoras de antígeno (APCs), por meio do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) , fazendo com que a célula infectada seja eliminada ou ativando células responsáveis por fagocitose. Os linfócitos constituem uma variada população, com especificidades na resposta imune adaptativa: células T auxiliares (CD4+), células T citotóxicas (LTC CD8+), células T reguladoras, Natural Killer (NK) e uma pequena população de células T que expressam uma molécula de superfície tipicamente encontrada em células NK (NKT) (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). As células T se subdividem em duas classes principais : linfócitos TCD4 e linfócitos TCD8, onde cada uma dessas moléculas irá possuir funções efetoras distintas. Essas moléculas diferem entre si na classe de moléculas de MHC que reconhecem. Dessa maneira, células TCD8 reconhecem moléculas de MHC de classe I que estão presentes em praticamente todas as células nucleadas e as células TCD4 reconhecem moléculas de MHC de classe II que estão presentes nas células dendríticas, linfócitos B, macrófagos e outros tipos celulares como células epiteliais e endoteliais do timo, reconhecendo células infectadas por vírus ou células com mutações que induzem neoplasias malignas, promovendo sua eliminação (HARARI et al. 2009; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Para que as células TCD4 ou TCD8 exerçam suas funções é necessário que haja a ativação da célula T virgem. Sendo assim, para que as células T CD4 ou TCD8 virgem se tornem ativadas é necessário que haja a formação de dois sinais: o primeiro sinal e o segundo sinal (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). O primeiro sinal é dado através da ligação da molécula de MHC com o TCR (receptor de superfície de célula T). O TCR tem a capacidade de reconhecer moléculas processadas e apresentadas através do MHC-I expresso em grande parte das células. Porém, somente o primeiro sinal não é necessário para ativar as células T, pois se somente ele existir vai haver a formação de células T anérgicas (YIN et al., 2011; STEWART-JONES et al., 2012). Portanto, se faz necessário um segundo sinal que se dará através da ligação de co-estimuladores, do receptor CD28, expresso em linfócitos T virgens a B7-1 ou B7-2 presentes nas APCs (KAUFMANN; WALKER, 2009). Após a ativação das células T, elas darão origem a células T de memória e a células T citotóxicas, que vão eliminar não somente as células alvo infectadas, mas também as células tumorais (MORISHIMA et al., 2010; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). 34 Porém, a ativação completa da célula TCD8 virgem e sua diferenciação em célula T citotóxica (LTC), e célula TCD8 de memória pode exigir a participação de células TCD4+. O que ditará se a célula TCD4 participará ou não na diferenciação das células TCD8, será o tipo de exposição antigênica. Caso haja uma resposta acentuada do sistema imune inato ao microoganismo, ou caso a APC tenha sido infectada diretamente pelo patógeno ou se a apresentação cruzada do antígeno microbiano for eficaz, pode não ser necessário o auxílio das células TCD4. Entretanto, se há algo que tende a desencadear uma resposta imunológica fraca como por exemplo as células tumorais que tem a capacidade de ocultar ou até mesmo não expressar as moléculas de MHC, nesse caso há a necessidade do auxílio das células TCD4 para a ativação das células T citotóxicas. A ativação de células T CD8+ e sua diferenciação em linfócito T citotóxico (LTC) CD8+ requer a participação de diversas citocinas, principalmente a interleucina 2 (IL-2), liberadas por células T CD4+ (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Além disto, as células TCD8 fazem com que a resposta a infecções e contra tumores, sejam mais eficazes, por meio da secreção do fator de necrose tumoral (FNT) e do Interferon-γ (IFNγ), promovendo o aumento da expressão do MHC-I e facilitando a morte de células infectadas ou alteradas (HARARI et al. 2009). LTCs medeiam sua atividade lítica por meio de dois mecanismos: citotoxicidade dependente de grânulos e citotoxicidade dependente do receptor de morte célular. A via dependente de receptor de morte é ativado pela interacção entre CD95 (FAS), factor de necrose tumoral (FNT) e os ligantes expressos nas superfícies das células citotóxicas. O principal mecanismo citotóxico é representado pela citotoxicidade dependente do grânulo. Os grânulos citotóxicos contêm perforina (proteína formadora de poros) e várias proteases associadas aos grânulos, incluindo as granzimas. Após o reconhecimento da célula alterada pelo linfócito T CD8+, ocorre a indução da secreção de grânulos citotóxicos, conduzindo à morte célular (CHOWDHURY; LIEBERMAN, 2008). Grande parte dos tumores não são capazes de iniciar respostas imunes dos linfócitos T, por não apresentarem co-estimuladores (APCs que expressam moléculas além do antígeno exigido para ativação da célula T). Portanto, acredita-se que as APC do hospedeiro ingerem células tumorais, que então são capazes de apresentar peptídeos específicos por meio do MHCI, que são reconhecidos por células T CD8+. Autores têm sugerido que a presença de LTC CD8+ em tumores, pode estar relacionado com um melhor prognóstico (ZANCOPE et al. 2010; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Mlecnik et al. (2011) ao analisarem amostras de pacientes com câncer de coloretal, observaram que o crescimento do tumor primário e a propagação metastática foram associados a diminuição da densidade de células T intratumoral. 35 Slebioda et al. (2011) ao estudarem o receptor TNFRSF25, da família dos receptores FNT que liga-se à proteína TL1A, analisaram o efeito de desencadeamento TNFRSF25 em células T transgênicas OT-I TCR, e demonstraram que TNFRSF25 juntamente com TL1A solúvel promove a proliferação e acumulação de células T CD8+ antígeno-específicas, assim como sua diferenciação em LTCs, contribuindo para uma resposta antitumoral. Esses autores sugerem que agonistas TNFRSF25, tais como TL1A solúvel, poderia ser usado para melhorar a imunogenicidade das vacinas que visam obter células T CD8 + anti-tumorais em humanos . 2.3.2 Células NK Células natural killer (NK) são uma classe de linfócitos caracterizados por um largo espectro de funções efetoras que vão desde a morte de células alvo, principalmente células tumorais e infectadas por vírus, até a capacidade para influenciar várias fases da resposta imunitária (MORETTA et al., 2003; FERLAZZO, 2005; FINK et al., 2007; VIVIER et al., 2011; MORANDI et al., 2012) bem como o envolvimento na formulação de respostas imunes adaptativas através da produção de citocinas e quimiocinas (LANIER, 2008; VIVIER et al., 2008). A principal citocina produzida pelas células NK é o Interferon-γ (IFN-γ) em várias condições fisiológicas e patológicas. Essas células também produzem uma variedade de outras citocinas tanto pró-inflamatórias quanto imunossupressoras, como: fator de necrose tumoral-α (FNT-α) e interleucina 10 (IL-10), fatores de crescimento, tais como GM-CSF (Fator de estimulação de colônias de macrofágos granulócitos), G-CSF (factor de estimulação de granulócitos colónia) e IL-3. As Células NK também secretam vários tipos de quimiocinas como: CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP1-α), CCL4 (MIP-1 β), CCL5 (RANTES), XCL1 (lymphotactin) e CXCL8 (IL-8) (WALZER et al., 2005). As células NK são caracterizadas pela falta de expressão do receptor CD3 e pela expressão dos receptores CD56 e CD16, sendo, dessa forma, células CD3- CD56+ CD16+ (EAST; KENEDDY; WEBB, 2012). Estas células são fenotipicamente e funcionalmente heterogêneas podendo ser divididas de acordo com o nível de expressão de CD56 e CD16 em dois grandes subconjuntos: CD56high CD16low e CD56low CD16high. Células NK CD56high CD16low representam aproximadamente 10% das células NK encontradas no sangue e podem produzir grandes quantidades de citocinas e quimiocinas, dentro de minutos após a sua ativação, no entanto, possuem pouca ou nenhuma capacidade para matar células tumorais espontaneamente (COOPER et al., 2001). Por outro lado, as células NK CD56low CD16high, 36 representam 90- 95% de todas as células NK maduras possuindo menor capacidade de produção de citocinas em resposta à ativação e maior lise de células malignas (FERLAZZO; MUNZ, 2004; WALZER et al., 2007). Acredita-se que o equilíbrio entre os sinais de ativação e inibição que as células NK recebem dos seus receptores de superfície determina o seu destino funcional (JEWETT et al., 2011). A ativação depende de um balanço feito entre receptores de ativação e de inibição existentes nessas células (KRZEWSKI; COLIGAN, 2012). De modo geral, os receptores de ativação reconhecem ligantes em células infectadas e danificadas, e os receptores de inibição reconhecem ligantes que são normalmente expressos nas células saudáveis normais (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Entre os receptores de ativação o NKG2 é o mais comum e interage com vários ligantes que são expressos em baixos níveis na maior parte dos tecidos, mas são superexpressos no início do dano celular em resposta a danos ao DNA. Este receptor possui afinidade por uma família de proteínas semelhantes à MHC-I , que são encontradas em células infectadas por vírus e células tumorais (RAULET; GUERRA , 2009). O CD16, NKp46, NKp44, NKp30 são outros tipos de receptores de ativação conhecidos que se conectam a moléculas que têm em suas caudas citoplasmáticas os motivos de ativação à base de tirosina do imunoreceptor, baseados em tirosina (ITAMs) (EAST; KENEDDY; WEBB, 2012). Existem três famílias principais para os receptores de inibição. A família dos receptores imunoglobulina-símile de células killer (KIR), que reconhecem diferentes alelos de moléculas de HL-A, B e C. A família dos transcritos semelhante à Ig (ILTs), onde destaca-se o ILT-2, que têm especificidade variada para vários alelos MHC-I,e a família de receptores de inibição NK, que possuem função de vigilância para a não expressão de moléculas de HLA-E, MHC-I e HLA-G (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). A função efetora das células NK é matar células infectadas e ativar os macrófagos para destruição dos microrganismos fagocitados. O principal mecanismo efetor das células NK é a citólise da célula-alvo mediada principalmente pela liberação de serglicina, granzima e perforina (BERNARDINI; GISMONDI; SANTONI, 2012). A serglicina é um proteoglicano sulfatado que serve como arcabouço para conter granzimas e perforina em grânulos. Quando as células Nk são ativadas, a exocitose de seus grânulos liberam essas proteínas nas proximidades das células-alvo. Uma das proteínas presentes nos grânulos da célula NK, é a perforina que produz poros na membrana citoplasmática das células-alvo, facilitando a entrada das granzimas no citosol por meio desses poros. As granzimas são enzimas que iniciam a sequência de eventos de sinalização que provocam a morte das células-alvo por apoptose. A morte celular se dá através da geração de derivados reativos do oxigênio (iNOS), dano mitocondrial ou 37 fragmentação de DNA, e ainda através de mecanismos relacionados ou não a atividade das caspases (principalmente a família Bcl-2), bem como moléculas relacionadas a ativação de sinais de morte (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012; HAZELDINE et al., 2012; KRZEWSKI; COLIGAN, 2012). As células NK reconhecem a célula-alvo especialmente através de alterações na expressão de MHC-I. O MHC-I está constitutivamente presente nas células e sua interação com o receptor inibitório das células NK promove o reconhecimento da célula normal. Porém, por questões de ordem biológicas, algumas células tumorais se mostram com expressão reduza ou não expressam o MHC-I, razão de não serem reconhecidas pelas células T. Logo a célula NK receberá do seu receptor maior ativação ao seu ligante na célula tumoral (LOPEZ-VÉRGES et al., 2011). O antígeno CD-57 é uma molécula de hidrato de carbono também conhecida como beta1, 3-glucuroniltransferase 1 (B3GAT1), que foi descrito, pela primeira vez, em 1982, em células natural killer em humanos e que, também, é chamado de HNK-1, LEU-7 ou L2 (ABO; BALCH, 1982; LAI et al., 1998; SOLANA; PAWELEC; TARAZONA, 2006). É expressa em 15% a 20% das células mononucleares do sangue periférico, dentre as quais, cerca de 60% correspondem a células NK CD56lowCD16high e células T ativadas (SOLANA; PAWELEC; TARAZONA, 2006). A expressão de CD57 também é encontrado em linhagens de linfócitos T, sendo considerado como um marcador de senescência replicativa ou exaustão clonal, que resulta da estimulação contínua por antigenos e/ou citocinas em pacientes com estimulação crônica de células T (WOOD; TWIGG; DOSEFF, 2009). Embora o CD57 seja expresso geralmente como marcador de senescência em células T CD8 + estudos mostram que a sua expressão pode ser em resposta a outros estímulos (BRENCHLEY et al., 2003; FOCOSI et al., 2010). Logo, a expressão de CD57 está ligada à maturidade de células TCD-8 e a células NK. Células NK fetais e neonatais não expressam ou expressam pouca quantidade de CD57 (ABO et al., 1981; LOPEZ-VIRGÈS et al. 2010). A expressão do CD57 sobre as células NK aumenta com idade (MERINO et al., 1998). A expressão do CD57 na célula NK pode sugerir o seu estado de ativação já que este é um marcador de células em estágio de maturação avançado, que já passaram por inúmeras divisões, provavelmente em resposta a agentes patogênicos ou citocinas (SOLANA; PAWELEC; TARAZONA, 2006). Lopes-Vergès et al. (2010) com o objetivo de avaliar as diferenças fenotípicas, funcionais e de transcrição entre CD57+ e CD57- em células NK maduras, averiguaram que culturas de células NK CD57- CD56low ,após serem estimuladas por 38 IL-2, passariam a expressar CD57. Os resultados revelaram que após a estimulação com IL-2 por 5 dias cerca de 30% das células NK passaram a ser CD57+ CD56low. Portanto, as células NK passam a expressar CD57 após estimulação e marca a transição para estágios de maturação mais avançados das células NK. A capacidade proliferativa das células CD57+ também foram analisadas neste estudo e os autores concluíram que estas células possuíam uma menor capacidade proliferativa quando comparadas à CD57-. Além de possuir uma menor atividade citolítica e um menor poder de proliferação, as células NK CD57+ tem uma resposta diminuída a citocinas e também produzem uma menor quantidade destas. Essas características sugerem que essas células podem estar relacionadas a mecanismos imunorregulatórios do sistema imune (BJÖRKSTRÖM; JUNGGREN; SANDBERG, 2010; LUTZ et al., 2011). 2.4 A INFLUÊNCIA DO TCD-8 E DAS CÉLULAS NATURAL KILLER (CD-57) NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL O Câncer surge a partir da disseminação descontrolada de clones de células transformadas , as quais devem ser reconhecidas pelo sistema imunológico antes de serem transformadas em um tumor . Embora tenha sido demonstrado que o sistema imune reage para muitos tumores e , pelo menos, retarda a progressão , não é ainda bem conhecido como reações imunológicas são usados para destruir tumores de uma forma específica . Além disso, é preciso levar em conta a capacidade das células tumorais de evadir ou superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (COUSSENS; WERB , 2001). A presença de células inflamatórias dentro do microambiente tumoral exerce um papel dual podendo contribuir tanto para a progressão ou para a inibição do crescimento do tumor (VISSER; COUSSENS, 2005; OLIVEIRA-NETO et al., 2007). Estudos recentes sugeriram que a qualidade, e não a quantidade, do infiltrado inflamatório é o determinante mais importante para o prognóstico (CURIEL et al., 2004). Para Zancope et al. (2009) as células T CD8+ e NK são as mais efetivas no combate ao câncer, contribuindo para um melhor prognóstico e maior sobrevida do paciente. Vários estudos demonstraram que a infiltração de linfócitos T correlaciona-se significativamente com um tempo prolongado de sobrevivência dos pacientes refletindo em um melhor prognóstico, pelo menos em certos tipos de câncer como o de ovário e colo-retal (SATO et al., 2005; GALON et al., 2006). O papel positivo das células TCD8 na imunidade antitumoral ocorre em estágios precoces do câncer, onde nessa fase o tumor poderia aumentar o repertório 39 de células T e promover mais células T estimuladas por antígenos dentro do tumor (YU; FU, 2006).No entanto, a capacidade dos linfócitos T como células efetoras pode ser afetada pelo microambiental tumoral (YU; FU, 2006; BOISSONNAS et al., 2007) Da mesma forma, a migração de linfócitos antitumorais para o local do tumor pode ficar comprometida uma vez dentro do ambiente tumoral, ou pode adaptar-se adversamente ao ambiente supressor para promover o crescimento em vez de regressão. Os tumores frequentemente formam uma barreira que limita a infiltração de células T e reduz a drenagem de antígenos tumorais para os linfonodos (YU; FU, 2006). Em carcinomas coloretais, a presença dos linfócitos TCD8 poderia estar correlacionada com um aumento da sobrevivência global (NAITO Y et al., 1998). Em contraste, a presença de LTCs ativados foi positivamente correlacionada com a agressividade da doença e com a redução da sobrevida global em pacientes que sofrem de linfomas de Hodgkin e não-Hodgkin (TEN BERGE et al., 1999). Schumacher et al (2001) em um estudo retrospectivo investigou se existia uma ligação entre a infiltração de células T CD8 + e o risco de morte para o câncer de esôfago. Os autores referidos concluíram que a presença das células T CD8 em carcinomas de esôfago está associada a um fator prognóstico favorável que deve ter implicações diagnósticas e terapêuticas. O papel das células NK no combate a disseminação de células neoplásicas tem sido demonstrado por muitos autores, que correlacionam inversamente a densidade e atividade citolítica das células NK, com a presença de metástase regional e à distância em CE. Quanto maior a presença de células NK circulantes , menores são as chances de desenvolver metástases (ZANCOPE et al., 2010). Nos pacientes com tumores livres de metástases regionais é observado uma redução em quase todas as células do sistema imunológico, exceto os linfócitos CD-57 (GIROLAMO et al., 2008). O sistema imune através das células NK tentam controlar o crescimento tumoral, porém uma série de fatores responsáveis pela supressão da citotoxicidade de células NK em tumores humano tem sido identificados. Muitos mecanismos foram propostos para a inativação funcional das células NK associados a tumores, incluindo o aumento da expressão do ligante do receptor de morte Fas, a perda de RNAm para a granzima B (MULDER et al., 1997), e diminuição de CD16 e da sua cadeia zeta associada (NAKAGOMI et al., 1993). Uma vez que a maioria das células NK perdem a atividade citotóxica em pacientes com câncer, podem eventualmente, contribuir em vez de interromper a progressão do câncer, permitindo o crescimento e expansão de células tumorais. 40 Türkseven e Oygür (2010) estudando uma amostra com 46 casos de CE tratados imunoistoquimicamente pelo CD57, selecionado como indicador de células NK, mostraram que a densidade de células CD57+ , foi menor em tumores gradados como sendo o de pior prognóstico,quando comparado com os casos de melhor prognóstico . Zancope et al. (2010) avaliaram as populações de células TCD8 e células NK, através da imunoexpressão do anti-CD8 e do anti-CD57 respectivamente, em amostras de CEO, CE de lábio, leucoplasias, queilite actínica e mucosa oral saudáveis. Em seus resultados os autores observaram que a quantidade de células TCD8 e células NK peritumoral e intratumoral, foram maiores em CE de lábio, quando comparado ao grupo controle, lesões pré-malignas e o CEO. A maior proporção de células TCD8 + peritumoral demonstraram correlação com um menor índice de proliferação neoplásica. Além disso, pacientes com CEO com elevada densidade de células T CD8 + peritumorais, mostraram uma tendência maior no tempo de sobrevida. Existe poucos estudos analisando a presença de células TCD8 e células NK em CE de lábio e sua relação com a progressão da lesão. Esta pesquisa contribuiu para um melhor entendimento da influencia dessas células inflamatórias no prognóstico de CE de lábio, muito embora reconhecendo a necessidade da realização de estudos mais aprofundados nessa área. 41 Proposição 42 3 PROPOSIÇÃO Este trabalho avaliou imunoexpressão dos linfócitos T CD8 e das células NK em uma série de casos de CE de lábio inferior metastático e não-metastático, com a finalidade de relacionar os resultados obtidos com os aspectos clínico-patológicos especificamente, em relação ao estadiamento clínico TNM, gradação histopatológica de malignidade e fatores prognósticos. Com o objetivo de compreender melhor a patogênese dessas células inflamatórias no microambiente tumoral. 43 Material e Métodos 44 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS O presente Projeto foi apreciado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob o Parecer de número 508.462 (ANEXO A), de acordo com a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (BRASIL, 1996). 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO Esta pesquisa foi constituída de uma avaliação retrospectiva e descritiva realizada pela observação, análise e registro da expressão imunoistoquímica do anti-CD-8 e do anti-CD57 em uma série de casos de CE de lábio inferior metastático e não-metástatico, seguida de correlção desses dados com parâmetros clínico-patológicos e prognósticos. 4.3 POPULAÇÃO Todos os casos de CE de lábio inferior diagnosticados e arquivados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio da Liga Norte-rio-grandense contra o câncer, Natal- RN. 4.4 AMOSTRA A amostra foi constituída de 32 espécimes de CE de lábio inferior, dos quais 16 apresentaram metástases linfonodal regional, confirmadas por exames histopatológicos e, os demais livres de metástases linfonodal regional, conforme dados contidos nos prontuários médicos. As informações a respeito do estadiamento clínico TNM dos tumores e de fatores prognósticos como a presença ou ausência de recidiva e a presença ou ausência de óbito, foram obtidos dos prontuários médicos, os quais continuaram no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, assim como, os espécimes teciduais resultantes da terapêutica cirúrgica instituída. Os dados foram registrados em fichas apropriadas (APÊNDICE 1). 45 4.4.1 Critérios de inclusão da amostra Foram incluídos na amostra casos com o diagnóstico histopatológico de CE de lábio inferior tratados por biópsias excisionais, sem radioterapia ou quimioterapia prévia. Os espécimes selecionados apresentaram quantidade suficiente de material biológico para análise da gradação histopatológica de malignidade e realização de estudos imunoistoquímicos, com os respectivos prontuários contendo todos os dados necessários para a realização do estudo clínico. Para o grupo dos tumores com metástase linfonodal regional, foram incluídos apenas os casos com metástases confirmadas por exame histopatológico. 4.5 ESTADIAMENTO CLÍNICO TNM PARA CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR Para o presente estudo foram utilizados os parâmetros listados na sexta edição da Classificação TNM dos Tumores Malignos para análise do estadiamento clínico da amostra selecionada. Os dados relativos ao estadiamento clínico TNM foram coletados dos prontuários médicos dos pacientes tratados no Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, e anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 1). Os parâmetros estão expostos no quadro 1 e 2 a seguir. 46 Quadro 1. Sistema de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por Sobin e Wittekind (2002). T – TUMOR PRIMÁRIO Tumor primário não pode ser avaliado TX Não há evidência de tumor primário T0 Carcinoma in situ Tis Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão T1 Tumor com mais de 2 cm e até 4 cm em seu diâmetro maior T2 Tumor com mais de 4 cm em sua maior dimensão T3 Tumor que invade estruturas adjacentes: cortical óssea, nervo alveolar inferior, T4a assoalho da boca ou pele da face (queixo ou nariz) Tumor que invade o espaço mastigador, lâminas pterigóides, base do crânio ou T4b artéria carótida interna N – LINFONODOS REGIONAIS Linfonodos regionais não podem ser avaliados NX Ausência de metástase em linfonodos regionais N0 Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3 cm ou menos em sua maior N1 dimensão N2a – Metástase em um único linfonodo homolateral com mais de 3 cm e até 6 cm N2 em sua maior dimensão N2b – Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão N2c - Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão Metástase em linfonodo com mais de 6 cm em sua maior dimensão N3 M – METÁSTASE À DISTÂNCIA Metástase à distância não pode ser avaliada MX Ausência de metástase à distância M0 Presença de metástase à distância M1 Fonte: Sobin e Wittekind (2002). 47 Quadro 2. Categorias de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por Sobin e Wittekind (2002). ESTÁGIO 0 I II III IVA IVB IVC CLASSIFICAÇÃO TNM Tis T1 T2 T1, T2 T3 T1, T2, T3 T4a Qualquer T T4b Qualquer T N0 N0 N0 N1 N0, N1 N2 N0, N1, N2 N3 Qualquer N Qualquer N M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 Fonte: Sobin e Wittekind (2002). 4.6 ANÁLISE CLÍNICA E MORFOLÓGICA A partir de fichas clínicas de requisições de biópsias excisionais arquivadas no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, foram obtidas as seguintes características clínicas: metástase linfonodal regional, estadiamento clínico (TNM), recidiva e óbito. Os dados referentes aos aspectos clínicos foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 1). O exame histopatológico foi realizado por dois examinadores, em estudo duplo-cego, que, antes do início do período experimental, receberam treinamento referente à uniformização das variáveis investigadas. Em caso de discordância entre os avaliadores, o caso foi submetido a uma nova avaliação até se chegar a um consenso. Os espécimes foram analisados sob microscopia de luz, por meio de cortes histológicos com 5μm de espessura, corados pela técnica de rotina da Hematoxilina/Eosina para confirmação de diagnóstico e gradação histológica de malignidade. A análise da gradação histológica de malignidade dos espécimes, no “front” de invasão tumoral, foi de acordo com o sistema proposto por Bryne (1998) (QUADRO 3). 48 Quadro 3. Sistema de gradação de malignidade proposto por Bryne (1998). Grau de ceratinização Pleomorfismo nuclear Padrão de invasão Infiltrado inflamatório ESCORES DE MALIGNIDADE 1 2 3 4 Altamente Moderadamente Mínima Nenhuma ceratinização ceratinizado (+ ceratinizado (de ceratinização (0 a 5% das células) de 50% das 20 a 50% das (de 5 a 20% células) células) das células) Pouco Moderado Pleomorfismo Pleomorfismo extremo pleomorfismo pleomorfismo intenso (25(0-25% de células (+ de 75% de (50-75% de 50% de células maduras) células células maduras) maduras) maduras) Bordas Cordões, Pequenos Dissociação celular infiltrativas bandas e/ou grupos ou espraiada e bem trabéculas cordões de pronunciada em delimitadas sólidas células pequenos grupos e/ou infiltrativas infiltrativas células individuais (n>15) (n<15) Intenso Moderado Escasso Ausente Fonte: Bryne (1998). Os escores obtidos em cada um dos parâmetros foram somados, obtendo-se o escore final de malignidade do caso. Os casos que obtiveram pontuação de 4 a 8 foram classificados em baixo grau de malignidade e, aqueles com pontuação total superior a 8, em alto grau de malignidade (SILVEIRA et al., 2010). Os dados referentes à gradação histológica de malignidade foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 2). 4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina foi submetida a cortes histológicos de 3 µm de espessura, os quais foram estendidos em lâminas histológicas, previamente limpas, preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltrietoxysilano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). No método imunoistoquímica foi empregado a técnica do complexo estreptoavidina-biotina (Kit LSAB + HRP, Dako, Carpinteria, CA, USA), utilizando os anticorpos primários monoclonal anti-CD8 e anti-CD57 (QUADRO 4), seguindo os passos laboratoriais descritos abaixo: Desparafinização: 2 banhos em xilol, cada um por 10 minutos à temperatura ambiente (TA); Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis: Álcool etílico absoluto I (5 minutos) em TA; 49 Álcool etílico absoluto II (5 minutos) em TA; Álcool etílico absoluto III (5 minutos) em TA; Álcool etílico 95°GL (5 minutos) em TA; Álcool etílico 80°GL (5 minutos) em TA; Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°, à temperatura ambiente durante 10 minutos; Lavagem em água corrente (10 minutos) Duas passagens em água destilada (5 minutos cada); Recuperação antigênica (QUADRO 4); Lavagem em água corrente (10 minutos); Duas passagens rápidas em água destilada cada uma por 5 minutos; Bloqueio da peroxidase endógena tecidual com solução de 0,3% de peróxido de hidrogênio em metanol a 10 volumes (dupla passagem de 10 minutos cada); Lavagem em água corrente (10 minutos); Duas passagens rápidas em água destilada por 5 minutos cada; Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HClpH 7,4 (5 minutos cada); Incubação dos cortes com anticorpos primários (QUADRO 04), em solução diluente (Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA); Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HClpH 7,4 (5 minutos cada); Incubação com anticorpo secundário (Biotinylated link universal, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos); Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl, pH 7,4 (5 minutos cada); Incubação com complexo estreptoavidina-HRP (Streptavidin-HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos); Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl, pH 7,4 (5 minutos cada); Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (7 minutos); Lavagem em água corrente (10 minutos); Passagens rápidas em água destilada (2 trocas); Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5 minutos); Lavagem em água corrente (10 minutos); Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: 50 Álcool etílico 80°GL (2 minutos); Álcool etílico 95°GL (2 minutos); Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Diafanização em três banhos do xilol: xilol 1(2 minutos), xilol 2 (2 minutos) e xilol 3 (2 minutos); Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA). Como controle positivo foram utilizados cortes de espécimes de linfonodo e como controle negativo, o anticorpo primário foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA – bovine serum albumin) em uma solução tampão. Quadro 04. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos a serem utilizados. Especificidade Clone Fabricante Diluição CD57 TB01 DAKO 1:100 DAKO 1:500 CD8 C8/144 B Recuperação Tempo de antigênica incubação Tris/EDTA pH 9,0 60 Pascal, 3 min minutos Tris/EDTA pH 9,0 60 Pascal, 3 min minutos 4.7.1 Análise Imunoistoquímica Após o processamento dos cortes histológicos e tratamento imunoistoquímico, cada espécime foi analisado à microscopia de luz (Olympus BX41, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN), por dois examinadores previamente treinados. Destaca-se que a análise foi realizada sem que o pesquisador tivesse conhecimento se o caso em questão refere-se a uma lesão com ou sem metástase linfonodal regional. Posteriormente as lâminas foram escaneadas (Panorâmic MIDI, 1.15 SPI , 3D HISTECH , Budapest , Hungria) e obtidas imagens por meio do programa Panoramic Viwer 1.15.2 (3D HISTECH , Budapest , Hungria). A análise dos linfócitos T CD8 e das células NK foi realizada de forma quantitativa, no “front” de invasão, adaptando-se a metodologia utilizada no estudo de Zancope et al (2010). 51 Sob aumento de 100µm (Panorâmic MIDI, 1.15 SPI , 3D HISTECH , Budapest , Hungria), foram selecionados 5 campos alternados em cada caso, nos quais o infiltrado inflamatório no estroma tumoral apresente maior imunorreatividade aos anticorpos anti-CD8 e anti-CD57. As imagens obtidas foram transferidas para um computador através do sistema Olympus MasterTM. Com auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA), em cada um dos cinco campos, foram contadas as células que exibiram coloração acastanhada em membrana e/ou citoplasma, independente da intensidade de imunomarcação (APÊNDICE 3). Os valores obtidos em cada um desses campos foram somados, estabelecendo-se o número total de células positivas para os anticorpos anti-CD8 e anti-CD57. Com este último dado, foi calculada a média de células T CD8 (anti-CD8-positivas) e NK (anti-CD57-positivas) por campo, para cada caso. Os dados obtidos com essa avaliação foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 3). 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA Uma vez realizada a coleta dos dados clínicos, histopatológicos e imuno-histoquímicos, os resultados obtidos foram organizados em um banco de dados informatizado com o auxílio do programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 20.0 e submetidos à análise descritiva. A análise dos aspectos clínicos e morfológicos do CE de lábio inferior, foi feito através do teste não-paramétrico exato de Fisher. Para análise de células imunopositivas em relação aos aspectos clínicos-patológicos, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. O teste de correlação de Spearman, foi realizado para avaliar possíveis correlações entre as imunoexpressões de TCD8 e CD57, levando-se em consideração todos os casos de carcinomas epidermóides de lábio inferior incluídos na presente pesquisa.Para todos os testes utilizados, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05). 52 Resultados 53 5 RESULTADOS 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA A amostra da presente pesquisa foi constituída por 32 casos de CE de lábio inferior, distribuídos em dois grupos intencionais: um grupo com metástase linfonodal regional (n= 16; 50%) e, o outro grupo, sem metástase linfonodal regional (n = 16; 50%). Conforme a classificação clínica TNM, para os casos de CE de lábio inferior, houve uma maior ocorrência dos estágio II (n=13; 40,6%) e IV (n=13; 40,6%), seguidos do estágio III (n= 5; 15,6%) e I (n=1; 3,2%). Ao agrupar-se o estadiamento duas categorias, foram observados predomínio dos estágios III e IV (n= 18; 56,25%) em relação aos estágios I e II (n=14; 43,75). Ao associar a presença de metástase com o estadiamento clínico TNM, observou-se para o grupo com metástase, maior prevalência dos estágios III e IV (n=15;97,7%), quando comparados ao grupo sem metástase, com diferença estatisticamente significativa (p <0,0001). (Tabela 1). Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de acordo com a metástase linfonodal e o estadiamento clínico. Natal, RN-2014. Estadiamento Clínico Metástase Linfonodal TOTAL Ausente Presente n (%) n (%) Estágios I e II 14 1 15 Estágios III e IV 2 15 17 p(1) n (%) <0,0001 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral-UFRN (1) Teste Exato de Fisher Do total da amostra, foram observados três casos com recidiva e cinco casos tendo como desfecho da lesão o óbito. A recidiva e o óbito não apresentaram diferença estatisticamente significativa quando associadas a metástases, estadiamento clínico TNM e a gradação histológica de malignidade. 5.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS Após analise morfológica detalhada dos casos de CE de lábio inferior, observou-se a invasão em ilhas, lençóis e cordões de células epiteliais malignas, crescendo como entidades independentes dentro do tecido conjuntivo. Estas células apresentavam individualmente, hipercromatismo nuclear, alteração da relação núcleo-citoplasma, figuras de mitoses típicas e 54 atípicas, pleomorfismo celular e nuclear, disceratose e ocasional formação de pérolas córneas. O infiltrado inflamatório variou de escasso a intenso. Dos 32 casos de Carcinoma epidermóide de lábio inferior avaliados pela gradação proposta por Bryne (1992), 16 (50%) enquadraram-se no grupo de alto grau de malignidade (Figura 1) e 16 (50 %) no grupo de baixo grau de malignidade (Figura 2). Ao relacionar a gradação histológica de malignidade (BRYNE et al., 1992) com a presença/ausência de metástase, foi evidenciado que a maioria dos casos com metástases apresentaram alto grau de malignidade (n=12;75%) enquanto que a maioria dos casos sem metástase apresentaram baixo grau de malignidade (n=12;75%). O teste exato de Fisher mostou uma diferença estatisticamente significativa em relação a essas duas variáveis (p=0,006) (Tabela 2). Foi associada a gradação histológica de malignidade ao estadiamento clínico TNM, a maioria dos casos nos estágios I e II (n=11;73,3%) foram classificadas em baixo grau de malignidade, enquanto que, a maiora dos casos classificados nos estágios III e IV (n=12;72,2%) apresentavam alto grau de malignidade (p=0,032) (Tabela 2). Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de acordo com a gradação histológica de malignidade, metástase linfonodal e o estadiamento clínico. Natal, RN-2014. Gradação Histológica Parâmetros TOTAL Alto Grau Baixo Grau n (%) n (%) Ausente 4 12 16 Presente 12 4 16 Estágios I e II 4 11 15 Estágios III e IV 12 5 17 n (%) p(1) Metástase Linfonodal 0,006 Estadiamento Clínico Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral-UFRN (1) Teste Exato de Fisher 0,032 55 5.3 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS Todos os casos demonstraram positividade para os anticorpos CD8 e CD57 utilizados respectivamente para detecção de linfócitos TCD8 e células Natural Killer, através da imunomarcação acastanhada em intensidade variável em nível citoplasmático e, por vezes, nuclear. Foi observado também marcação imunoistoquímica em outras células inflamatórias, como plasmócitos, macrófagos e mastócitos. Fascículos nervosos, células endoteliais e epiteliais também exibiram imunopositividade na maioria dos espécimes de CE de lábio inferior avaliados 5.3.1 Análise da expressão do TCD-8 A análise da expressão do TCD-8 no “front” de invasão tumoral revelou, para o grupo dos carcinomas sem metástase, uma média de imunopositividade que variava de 21,6 a 465,6 com uma mediana de 140,7 (Figura 3). Nos tumores com metástase, estes valores variavam de 26,0 a 565,20, com uma mediana de 115,30 (Figura 4). O teste não-paramétrico de MannWhitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do TCD-8 entre as lesões com e sem metástase linfonodal regional (p = 0,346) (TABELA 3). Tabela 3. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no “front” de invasão tumoral em relação à presença ou ausência de metástase linfonodal. Natal, RN – 2014. Metástase n Mediana Q25-Q75 Média Soma dos dos postos postos U p 103,00 0,346 Front de invasão Ausente 16 140,70 70,35-246,60 18,06 239,00 Presente 16 115,30 84,50-183,15 14,94 289,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Em relação ao estadiamento clínico TNM, a análise da expressão do TCD-8 revelou, para o grupo dos carcinomas com estadiamento clínico I/II, uma média de imunopositividade que variava de 21,6 a 465,60, com uma mediana de 192,4. Para os tumores com estadiamento III/IV, os valores variaram de 26 a 565,20, com uma mediana de 115,20. O teste nãoparamétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos 56 valores de imunoexpressão do TCD-8 entre o estadiamento clínico TNM I/ II e III/IV (p =0,146) (Tabela 4 ). Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão tumoral em relação ao estadiamento clínico. Natal, RN – 2014. Estadiamento N Mediana Q25-Q75 Média Soma dos postos dos U p 89,00 0,146 postos Front de invasão Estágio I/II 15 192,4 63,4-250,4 19,07 286,00 Estágio III/IV 17 115,2 84,8-144,1 14,24 242,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Levando-se em consideração a gradação histológica de malignidade (BRYNE et al., 1992), a análise dos valores de células imunomarcadas para o TCD-8, no front de invasão tumoral, revelou para o grupo dos carcinomas com baixo grau de malignidade, valores de positividade que variaram de 21,60 a 465,60, com uma mediana de 127,1. Para as lesões de alto grau de malignidade, estes valores variaram de 26 a 565,20, com uma mediana de 117,4. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do TCD-8 entre as lesões de baixo e alto grau de malignidade (p =0,936) (Tabela 5). Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão em relação à gradação histológica de malignidade (Bryne, 1998). Natal, RN – 2014. Gradação n Mediana Q25-Q75 Histológica Média Soma dos dos postos postos U p 102,50 0,936 Front de invasão Baixo grau Alto grau 16 127,1 95,5-246,6 18,09 289,50 16 117,4 59,2-183,15 14,91 238,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. A avaliação dos valores de células imunopositivas para o TCD-8 no front de invasão tumoral, para os casos sem recidiva, variaram de 21,60 a 565,20, com mediana de 131,60. Para os casos com recidiva, estes valores variaram de 26 a 120,6, com uma mediana de 38,20. O 57 teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do TCD-8 entre os casos com ausência e presença de recidiva. (p = 0,075) (Tabela 6). Tabela 6. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão em relação à ausência e presença de recidiva. Natal, RN – 2014. Recorrência n Mediana Q25-Q75 Média Soma dos dos postos postos U p 16,00 0,075 Front de invasão Ausência 29 131,6 88,3-225,20 17,45 506,00 Presente 3 38,2 26,0-79,40 7,33 22,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Em relação ao desfecho da lesão, a análise dos valores de células imunomarcadas do TCD-8, para os casos com óbito do paciente, variaram de 26 a 250,6, com mediana de 115,20. Para os casos com remissão da doença, estes valores variaram de 21,60 a 565,20, com mediana de 120,6. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do TCD-8 entre os casos com óbito do paciente ou remissão da doença. (p = 0,897)(Tabela 7). Tabela 7. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o TCD-8 no front de invasão em relação à ausência e presença de óbito. Natal, RN – 2014. Desfecho n Mediana Q25-Q75 Média Soma dos postos dos U p 65,00 0,897 postos Front de invasão Remissão 27 120,6 84,2-213,6 16,59 448,00 Óbito 5 115,2 69,6-232,9 16,00 80,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. 5.3.2 Análise da expressão do CD-57 A análise da expressão do CD57 no “front” de invasão tumoral revelou, para o grupo dos carcinomas sem metástase, imunopositividade que variaram de 44,4 a 156,5, com uma 58 mediana de 156,5 (Figura 5). Nos tumores com metástase, estes valores variaram de 27,4 a 281,20, com uma mediana de 140,7(Figura 6). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do TCD-8 entre as lesões com e sem metástase linfonodal regional (p = 0,622) (Tabela 8). Tabela 8. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no “front” de invasão tumoral em relação à presença ou ausência de metástase linfonodal. Natal, RN – 2014. Metástase n Mediana Q25-Q75 Média Soma dos dos postos postos U p 111,50 0,622 Front de invasão Ausente 16 156,5 76,95-209,20 17,53 280,00 Presente 16 140,7 78,35-163,55 15,47 247,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Quando avaliamos o estadiamento clínico TNM, a análise da expressão do CD57 revelou, para o grupo dos carcinomas com estadiamento clínico I/II, valores de imunopositividade que variaram de 44,4 a 227,6, com uma medianana de 167,0. Para os tumores com estadiamento III/IV, os valores variaram de 27,4 a 281,20, com uma mediana de 137,4. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do CD57 entre o estadiamento clínico TNM I/ II e III/IV (p =0,576) (Tabela 9). Tabela 9. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão tumoral em relação ao estadiamento clínico. Natal, RN – 2014. Estadiamento n Mediana Q25-Q75 Clínico Média Soma dos postos dos U p 112,50 0,576 postos Front de invasão Estágio I/II 15 167,0 76,4-213,0 17,50 262,50 Estágio III/IV 17 137,4 82,3-175,5 15,65 265,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Conforme a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1992) a análise dos valores de células imunomarcadas para o CD57, no front de invasão tumoral, revelou para 59 o grupo dos carcinomas com baixo grau de malignidade, valores de positividade que variaram de 58,0 a 227,60, com uma mediana de 158,9. Para as lesões de alto grau de malignidade, estes valores variaram de 27,0 a 281,20, com uma mediana de 136,4. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do CD57 entre as lesões de baixo e alto grau de malignidade (p =0,936) (Tabela 10). Tabela 10. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão em relação à gradação histológica de malignidade (Bryne, 1998). Natal, RN– 2014. Localização/ n Mediana Q25-Q75 Gradação Média Soma dos postos dos U p 102,50 0,936 postos Front de invasão Baixo grau 16 158,9 81,5-209,2 18,09 289,50 Alto grau 16 136,4 67,2-163,5 14,91 238,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. A avaliação dos valores de células imunopositivas para o CD57 no front de invasão tumoral, para os casos sem recidiva, variaram de 44,4 a 281,2 , com mediana de 146,4. Para os casos com recidiva, estes valores variaram de 27,4 a 144,0, com uma mediana de 78,6. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do CD57 entre os casos com ausência e presença de recidiva. (p = 0,075) (TABELA 11). Tabela 11. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão em relação à ausência e presença de recidiva. Natal, RN – 2014. Recorrência n Mediana Q25-Q75 Média Soma dos dos postos postos U p 21,00 0,146 Front de invasão Ausência 29 146,4 83,3-205,4 17,28 501,00 Presente 3 78,6 27,4-111,30 9,00 27,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. 60 Em relação ao desfecho da lesão, a análise dos valores de células imunomarcadas do CD57, para os casos com óbito do paciente, variaram de 27,4 a 167,0, com mediana de 150,4. Para os casos com remissão da doença, estes valores variaram de 44,4 a 281,2, com mediana de 137,4. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos valores de imunoexpressão do CD57 entre os casos com óbito do paciente e remissão da doença. (p = 0,856)(Tabela 12). Tabela 12. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para os valores de imunopositividade para o CD57 no front de invasão em relação à ausência e presença de óbito. Natal, RN – 2014. Desfecho n Mediana Q25-Q75 Média Soma dos postos dos U p 64,00 0,856 postos Front de invasão Remissão 27 137,4 76,4-213,0 16,63 449,00 Óbito 5 150,4 86,9-160,1 15,80 79,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. 5.3.3 Correlação entre os marcadores Foram analisadas, ainda, possíveis correlações entre as imunoexpressões de TCD8 e CD57, levando-se em consideração todos os casos de CE de lábio inferior incluídos na presente pesquisa. O teste de correlação de Spearman (r) demonstrou existir correlação positiva, estatisticamente significativa, entre células imunomarcadas para TCD8 e CD57 (r = 0,761; p < 0,001). 61 Figura 1.Fotomicrografia mostrando aspectos morfológicos do CE de lábio inferior de alto grau de malignidade.(H/E,;Barra=100 µm) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Figura 2. Fotomicrografia mostrando aspectos morfológicos do CE de lábio inferior de baixo grau de malignidade. (H/E,;Barra=100 µm) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. 62 Figura 3.Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão dos linfócitos TCD8 em CE de lábio inferior sem metástase. (Barra=50µm) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Figura 4. Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão dos linfócitos TCD8 em CE de lábio inferior com metástase. (Barra=50µm) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. 63 Figura 5. Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão das céulas natural killer em CE de lábio inferior sem metástase. (Barra=50µm). Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. Figura 6. Fotomicrografia monstrando a Imunoexpressão das células natural killer em CE de lábio inferior com metástase. (50µm) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN. 64 Discussão 65 6 DISCUSSÃO Globalmente, o câncer oral é a oitava causa mais comum de morbidade entre as neoplasias malignas. De todos os cânceres da cavidade oral, mais de 90% são CEO que surgem na mucosa da boca e da orofaringe (JONHSON et al., 2011). O CEO é uma neoplasia epitelial invasiva, com graus variados de diferenciação escamosa e uma aptidão para o desenvolvimento de metástases linfonodais precoces (JOHNSON et al., 2005). O CE de lábio inferior se desenvolve lentamente e apenas 3%-29% das lesões apresentam metástase em linfonodos cervicais (SALGARELLI et al., 2009). Quando a metástase linfonodal é detectada, há uma significativa queda no índice de sobrevida do paciente (HASSON, 2008). Desta forma, o CE de lábio inferior tem geralmente um bom prognóstico, possivelmente como resultado de um diagnóstico precoce, em decorrência da baixa taxa de metástase em linfonodos regionais (VARTANIAN et al., 2003). Essa lesão é, ainda, mais facilmente percebida pelo paciente, motivando uma intervenção mais precoce (OLIVEIRA; SILVA; ZUCOLOTO, 2006; MORSELLI et al., 2008). Adicionalmente, a taxa reduzida de mortalidade em pacientes com CE de lábio inferior pode ser explicada pela reduzida rede de vasos sanguíneos e linfáticos que se apresentam nessa localização anatômica, podendo influenciar numa evolução menos agressiva do tumor (OLIVEIRA; SILVA; ZUCOLOTO, 2006; BATISTA et al., 2010). Para o CE de lábio inferior, o tamanho do tumor, gradação histopatológica de malignidade, metástase em linfonodo regional e recidiva da lesão são os principais fatores relacionados a sobrevida dos pacientes (SOUZA et al., 2011). Dentre estes fatores, a metástase linfonodal regional em estudos, realizados por Lim et al. (2004), revelaram que a presença dessa variável é considerada um dos principais indicadores para predizer o prognóstico de pacientes com carcinoma epidermóide oral. A metástase à distância relacionada ao CE de lábio inferior é rara e pode ser esperada em casos de tumores avançados e com comprometimento de linfonodos regionais no momento do diagnóstico. A incidência é de 0,5%-2% e costuma ser mais frequente nos pulmões, nos ossos e no fígado. O estágio clínico IV é o grupo com maior risco de ocorrência da lesão (BETKA, 2001). Quando foram avaliados os aspectos clínicos do câncer, foi importante utilizar o estadiamento clínico TNM por se tratar de um dos melhores indicadores clínicos para predizer o prognóstico do CEO. Esse sistema possibilita a avaliação das características fundamentais de um câncer: extensão local, disseminação regional e metástase á distância (COSTA et al., 2005; 66 COSTA et al., 2002). Na presente pesquisa, o estadiamento clínico TNM foi agrupado em duas categorias, onde se observou um predomínio dos estágios III e IV correspondendo a 56,25% dos casos em relação aos estágios I e II que representavam 43,75 %. Luna –Ortiz et al (2004) mostraram resultados semelhantes aos achados do presente estudo, onde 50% da sua amostra se encontravam nos estágios III e IV. A prevalência dos estágios III e IV pode ser justificada pela amostra intencional composta por 16 casos de CE de lábio com metástase e 16 casos de CE de lábio sem metástase linfonodal regional, onde a maioria dos tumores em estágio avançado apresentavam metástase linfonodal regional. Logo, observa-se uma associação estatisticamente significativa entre essas variáveis analisadas (p=0,000). Portanto, os achados estão em concordância com os estudos de McCombe et al.(2000) os quais observaram para os estágios clínicos mais avançados do tumor, há uma importante associação com o surgimento de metástases regionais. Abreu et al. (2004) constataram em suas pesquisas uma correlação entre o aumento do tamanho tumoral e a ocorrência de metástase e recidiva. Os sistemas de gradação histopatológica de malignidade vem sendo vastamente utilizados nos estudos e resultados mais satisfatórios vem sendo obtidos (BETTENDORF et al., 2005; KADEMI et al., 2005; LARSEN et al., 2009). A associação do sistema de gradação com o estadiamento clínico TNM, fornece um melhor prognóstico do tumor e a escolha de um tratamento mais adequado (SAWAIR, 2003). Bryne et al (1998) propuseram um sistema de gradação histológica de malignidade baseado no front de invasão tumoral, porque acreditava que as características moleculares e morfológicas dessa área ,em muitos carcinomas de células escamosas, podem refletir as características de comportamento biológico mais real do que as outras partes do tumor; já que diversos eventos moleculares de importância para a disseminação do tumor como ganhos e perdas de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas, aumento da proliferação celular e início da angiogênese, ocorrem na interface tumor-hospedeiro. Nesta pesquisa optouse por usar a gradação histológica proposta por Bryne (1998),por estarmos de acordo com a autora a respeito da importância do front de invasão para predizer o prognóstico do tumor e,também, por se tratar de um metódo rápido e de facil realização, e com valor prognóstico demonstrado por diversos estudos (BRYNE ,1998; BÁNKFALVI; PIHHKO,2000). No presente estudo a analise da gradação histopatológica de malignidade em relação a prensença ou ausência de metástase evidenciou que 75 % das lesões com metástases em linfonodos cervicais foram classificadas como tumores de alto grau de malignidade, enquanto 67 que 75% das lesões com ausência de metástase linfonodal , foram classificadas como tumores de baixo grau de malignidade.Esse resultado revelou uma relação estatísticamente significativa em relação a presença e ausência de metástase com a gradação histopatológica de malignidade (p=0,006 ). Abreu et al.(2004) encontraram resultados semelhantes com os expostos nesta pesquisa, onde a presença de recidiva e metástase foram mais frequentes nas lesões com alto grau de malignidade ,concluindo que a gradação histopatológica de maliginidade é um fator de prognóstico importante em CE de lábio inferior. Estudos relataram haver associação entre a gradação histopatológica de malignidade e o estadiamento clínico TNM ( NETO; QUADROS, 1998). Nesta pesquisa ao associar a gradação histopatológica de malignidade proposta por Bryne (1998) com o estadiamento clínico TNM, pode-se observar que a maioria dos tumores de alto grau de malignidade foram classificados nos estágios III e IV, enquanto que a maioria dos tumores de baixo grau de malignidade foram classificados em estágios menos avançados (I e II), mostrando, assim, associação significativa entre esses achados (p=0,0032). Costa et al. (2005) associando as variáveis histopatológicas com os estágios I/II e III/IV, constataram haver correlação significativa dos referidos estágios com os parâmetros infiltrado linfoplasmocitário e o pleomorfismo nuclear. Estes resultados fornecem subsídios para concluir que existe um possível reflexo do estadiamento clínico TNM sobre o comportamento histopatológico do tumor, já que pacientes com estadiamento clínico TNM III/IV apresentaram um comportamento histopatológico mais agressivo (COSTA et al., 2005). Seguindo essa mesma linha, Cardesa et al.(2005) observaram em seus estudos uma forte correlação entre a gradação histopatológica de malignidade, proposta por Bryne et al.(1992), e as seguintes variáveis: presença e ausência de metástases linfonodal regional, estadiamento clínico TNM e o desfecho dos tumores. Muitos pesquisadores têm buscado outros parâmetros como indicadores de agressividade e comportamento das neoplasias, tendo em vista que o uso de fatores clínicos associados a fatores histomorfológicos ainda são conflitantes no que diz respeito a predizer o prognóstico dessas lesões (SILVEIRA et al., 2004). A imunidade local em CEO pode contribuir para o desenvolvimento de novos marcadores moleculares, que auxiliarão a identificar o estado biológico e imunológico do paciente, predizer a progressão da doença e selecionar o tratamento apropriado individualizado. Portanto, a imunidade anti-tumoral tem sido sugerida para desempenhar um papel importante no desenvolvimento e proteção contra a malignidade. Porém, poucos estudos tem investigado o papel da resposta imune do hospedeiro no CEO. Estudos nessa vertente aumentariam o conhecimento sobre a interação entre resposta imunológica e desenvolvimento de CEO (SILVEIRA et al. 2010; SANTOS PEREIRA et al., 68 2013). Seguindo essa linha de pesquisa, o trabalho ora realizado avaliou a imunoexpressão de células TCD8 e células NK presentes no infiltrado inflamatório do front de invasão em amostras de CE de lábio inferior com metástases e sem metástases, com o objetivo de compreender o papel que essas células inflamatórias assumem na patogênese do câncer. O desenvolvimento do câncer envolve uma gama de interações das células localizadas no front de invasão com as células inflamatórias impedindo o crescimento e desenvolvimento tumoral, porém o próprio tumor pode se beneficiar de alterações genéticas e assim modificar o seu microambiente imunológico, e consequentemente evadindo da resposta imune (WHITESIDE,2010). Portanto, sabe-se que as células do sistema inflamatório podem contribuir tanto para a inibição como para a progressão do crescimento tumoral (ZANCOPE et al., 2011). Neste contexto, as células T CD8, que representam uma subpopulação importante de linfócitos T citotóxicos e as células NK, são as mais prováveis células efetoras para uma resposta antitumoral eficiente (MANTOVANI et al., 2010; ZANCOPE et al., 2011; FELLER; ALTINI; LEMMER, 2013;). No presente estudo, as células TCD8 foram evidenciadas imunoistoquímicamente em todos os casos pesquisados, apresentando nítida variação na quantidade das mesmas quando da análise microscópica. Foi encontrado um maior número de células TCD8 no grupo com ausência de metástases (mediana= 140,7) quando comparado ao grupo com metástase (mediana=115,30), apesar de não existir uma relação estatisticamente significativa entre essas váriaveis(p=0,146). Silveira et al.(2010) analisando CEO e CE de lábio inferior também não evidenciaram uma diferença estatística entre esses pârametros. Já Suwa et al.(2006), diferentemente dos autores citados acima, constataram que a atividade proliferativa do linfócitos TCD8 tende a se correlacionar com a metástase linfonodal regional.Seguindo essa mesma linha, Sheu et al.(1999), investigaram o significado clínico do infiltrado linfocítico dentro do ambiente tumoral de carcinoma cervical humano, e concluíram que alterações na relação de linfócitos TCD4/TCD8 são inversamente proporcionais com o crescimento rápido do tumor e com surgimento de metástase linfonodal em câncer cervical. Mlecnik et al.(2011) em seus resultados observaram que o crescimento do tumor primário e a propagação metastática foram associados com a diminuição da densidade de células T intratumoral. Acredita-se que um dos motivos para a ausência de diferença estatística encontrada nessa pesquisa ocorra devido ao desenvolvimento de metástases envolver falhas no controle local e a distância. Logo acredita-se que apenas o infiltrado inflamatório não seria capaz de influenciar de forma determinante na disseminação metástatica (SANTOS et al., 2013). 69 A presença de um infiltrado inflamatório composto por linfócitos têm sido estudada em diversos tipos de câncer e vem sendo considerado como um fator de prognóstico importante (SILVEIRA et al., 2010). Schumacher et al. (2001) em seus estudos concluíram que a presença de linfócitos TCD8 foi um fator de prognóstico favorável. Contrariando esses achados, Grabenbauer et al.(2006) estudando células CD3+, Granzimas B+ e CD8+ em CE de canal anal, afirmaram que a presença de células do infiltrado inflamatório são fatores prognósticos negativos para evolução tumoral. Na presente pesquisa, ao associar células TCD8 com estadiamanto clíncio TNM, não houve uma diferença estatísticamente significativa (p=0,146), e resultados semelhantes foram constatados por Suawa et al.(2006). Algumas subpopulações de células T estão associadas com um resultado clínico mais favorável em câncer de colo retal, tais como as células TCD8 citotóxicas,células T helper Th17 e as células T reguladoras(FoxP3+) (MLECNIK et al.2011; SINICROPE et al.2009; TOSOLONI et al. 2011). Sendo assim, é possivel sugerir que a associação não siginificativa das células TCD8 e o estadiamento clínico TNM, se deve a presença da ação anti-tumoral de outras células no estroma ,além dos linfócitos TCD8. No que diz respeito à correlação entre imunoexpressão de TCD8 e grau histológico de malignidade, Pereira et al.(2013) evidenciaram que lesões de baixo grau apresentavam uma média maior de células positivas do que lesões de alto grau, resultando significância estatística ao achado. Na presente pesquisa não foi encontrada diferença estatística entre essas variáveis (p=0,936), assim como nos achados de Zancope et al.(2010). Uma imunovigilância eficaz se faz necessária para prevenção do início e da progressão do câncer (JEWETT;TSENG, 2011). Sendo assim,o sistema imunológico conta com a participação das células NK na tentativa de controlar o crescimento tumoral. A célula NK é um subtipo de linfócito que se caracteriza por um vasto espectro de funções efetoras contra microrganismos intracelulares, transformação celular precoce e crescimento tumoral, devido à sua habilidade para citotoxidade celular e produção de citocinas e quimiocinas (BERNARDINI et al., 2012; HAZELDINE et al., 2012). O papel das células NK no combate a disseminação de células neoplásicas tem sido demonstrado por muitos autores, que correlacionam inversamente a densidade e a atividade citolítica das células NK, com a presença de metástase linfonodal regional e à distância em CE (SCHANTZ et al., 1991; GONZALEZ et al.,1998). Zancope et al.(2010) em seus estudos mostraram que a quantidade de células NK foi significativamente maior em CE de lábio quando comparado a CEO metastático. Essa associação não foi evidenciada na presente pesquisa, visto que a associação da imunoexpressão da células NK com a presença de metástases, não resultou 70 em diferenças estatisticamente significativas (p=0,622). As células NK desempenham um papel importante em fases iniciais do desenvolvimento do tumor (WHITESIDE et al., 1998; SMYTH et al., 2002). Estudos mostram que, embora a imunidade inata representa a primeira linha de defesa contra o patógeno (ABBAS et al., 2012), a maioria das células tumorais em humanos são resistentes à lise celular de células NK mediada por perforina. Portanto, as células NK são raramente encontradas no infiltrado linfocítico tumoral em casos de câncer em estágio avançado (WHITESIDE et al., 1998). Sendo assim, lesões com metástase por se encontrarem em um estágio mais avançado do tumor, possuem uma quantidade menor de células NK. Gonzalez et al. (1998), insatisfeitos com o uso do estadiamento clínico TNM como guia de decisões terapêuticas ou para fornecer um prognóstico para sobrevida, sugeriram em suas pesquisas para atingir um sistema mais confiável, a incorporação de variáveis adicionais. Portanto, as células natural killer ativadas poderiam, provavelmente, ter uma função nessa nova abordagem. Eles constataram em seus resultados que o grau de comprometimento da atividade das células NK parece relacionar-se com o estado da doença, sendo mais acentuada em pacientes com câncer avançado. Sznurkowski et al.(2013), estudando o valor prognóstico de células NK em CE de vulva, averiguaram que pacientes em estágios avançados da doença tinham uma quantidade maior de células NK quando comparado aos pacientes em estágio mais inicial, com valores estatísticos significativos. Turkseven e Oygur (2010), em contraste com os autores citados anteriormente, mostraram que a densidade de células CD57 + (células NK), foi estatisticamente menor nos tumores classificados no grupo de pobre prognóstico em comparação com os casos no grupo bom prognóstico. Igualmente em resultados desta pesquisa, observou-se um maior número de células NK nos estágios I e II, já para o estágios III e IV a quantidade dessas células foi menor, porém não foi encontrada uma diferença estatística significativa entre a presença de células NK e o estadiamento clínico TNM das lesões (p=0,576). Estudos sugerem que o aumento da secreção de fator de necrose tumoral (FNT-alfa) nos tumores, pode ser um dos fatores facilitadores para um padrão de invasão tumoral mais agressivo e também responsável pela supressão de células NK. O FNT serve como um regulador do sistema imunológico, com efeitos biológicos diversos. Ele liga-se a receptores específicos (TNFR) nas células alvo, em seguida, pode levar a célula à apoptose ou pode promover sua sobrevivência (ROBBINS; COTRAN, 2005). FNT-alfa secretado por células inflamatórias mononucleares poderia estimular a destruição da matriz extracelular para além do seu efeito citotóxico facilitando o padrão de invasão de alto grau (TURKSEVEN; OYGUR, 2010). Então é esperado que em lesões de alto grau de malignidade, existe muita produção de 71 FNT–alfa que vai promover a destruição de células NK. No presente trabalho, houve uma menor quantidade de células NK para as lesões classificadas em alto grau de malignidade quando comparadas a lesões de baixo grau. Entretanto não houve uma significado estatístico para o achado (p=0,936). Botter et al. (2013) compartilha dos achados referentes a correlação dessas variáveis identificados no presente estudo. No atual trabalho, as variáveis recidiva e óbito, não tiveram associação com nenhum dos parâmetros imunoístoquimicos analisados (imunoexpressão de TCD8 e células NK). Este fato pode se associar às peculiaridades intrínsecas da localização do lábio inferior, sendo assim um local de fácil diagnóstico e melhor visibilidade para adequada ressecção ciurugica, quando comparada a outros sítios da cavidade oral. Portanto ,essas peculiaridades possibilitam que esse tumores sejam diagnosticados em estágios bem precoces, como também a realização da cirúrgia a tempo hábil, possibilitando maiores sucessos no que diz respeito a recidiva e ao desfecho da lesão (MASSANO et al., 2006). Pages et al.(2005),observaram que a presença de células do sistema imunológico estão relacionadas com melhor evolução do paciente e maior tempo de sobrevida. Um aumento da densidade de células T no infiltrado com uma alta proporção de células T CD8 foi associado com uma proteção significativa contra a recidiva tumoral em pacientes com adenocarcinoma primário colorretal (PAGES et al., 2005). Mlecnik et al.(2011) corroborando com os achados citados anteriormente, relataram que nas lesões com recidiva ocorria uma reação imunologica mais baixa. Schantz et al. (1999) encontraram uma relação estatística significativa de células NK inversamente com o óbito. Porém, eles não identificaram nenhuma relação entre a função das células NK e recorrência local. Bottchet et al.(2013) , de forma semelhante ao presente estudo verificaram que não houve correlações significativas da proporção de células T / NK para os casos livres de recidiva. Entendemos que existe uma relação dinâmica e complexa entre o sistema imune e a biologia do câncer. A presença de um infiltrado inflamatório rico em linfócitos TCD8 e células NK, pode refletir um microambiente tumoral com uma resposta imune citotóxica local contra células malignas. 72 Conclusões 73 7 CONCLUSÕES Conforme os resultados obtidos na presente pesquisa, pode-se concluir que: 1- No carcinoma de lábio inferior existe uma possibilidade que se estabelece entre o TNM e a ocorrência metastática, sob à influência de sua disseminação, enquanto que, as isentas de metástases, mesmo com as infiltrações que ocorrem, costumam ser menos letais, pelas suas limitações na área do envolvimento, de onde se supõe existir uma relação que se estabelece na repercussão dos seu efeitos com indiscutíveis reflexos no prognóstico da doença. 2- A ausência de relação estatisticamente significativa do TCD8 e das células NK, com as variáveis estudadas, quais sejam metástases, estadiamento clinico TNM, gradação histológica de malignidade, recidiva e óbito, sugerem que as células TCD8 e as células NK não exercem efetiva influências na indicação de prognóstico no CE de lábio inferior. 3- A imunomarcação positiva para células TCD8 e células NK, no infiltrado inflamatório tumoral, reflete, na dependência de sua densidade, um microambiente favorável a resposta imunocitotoxica a qual se mostra contrária ao crescimento das células do parênquima do CE de lábio inferior. 74 Referências Referências 75 . 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Caso Campos microscópicos 1 2 3 4 5 Total Média 90 Anexos Referências 91 92 93
