universidade federal de sergipe centro de ciências

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDO DA FORMAÇÃO DE MICELAS E MICROEMULSÕES CONTENDO
NIFEDIPINA: INFLUÊNCIA DAS FASES NA ESTRUTURA DOS SISTEMAS
DAYANE XAVIER DE OLIVEIRA
SÃO CRISTÓVÃO-SE
2014
Dayane Xavier de Oliveira
ESTUDO DA FORMAÇÃO DE MICELAS E MICROEMULSÕES CONTENDO
NIFEDIPINA: INFLUÊNCIA DAS FASES NA ESTRUTURA DOS SISTEMAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal de Sergipe como parte
dos requisitos para a obtenção do Título de
Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento
Coorientadora: Prof.a Dr.a Rogéria de Souza Nunes
São Cristóvão-SE
2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
O48e
Oliveira, Dayane Xavier de
Estudo da formação de micelas e microemulsões contendo nifedipina :
influência das fases na estrutura dos sistemas / Dayane Xavier de Oliveira
; orientador Victor Hugo Vitorino Sarmento. – São Cristóvão, 2014.
92 f. : il.
Dissertação (mestrado em Química) – Universidade Federal de
Sergipe, 2014.
1. Físico-química. 2. Micelas. 3. Microemulsões. 4. Essências e óleos
essenciais. 5. Laranja. 6. Nifedipina. I. Sarmento, Victor Hugo Vitorino,
orient. II. Título.
CDU 544.77.051.62
Dayane Xavier de Oliveira
ESTUDO DA FORMAÇÃO DE MICELAS E MICROEMULSÕES CONTENDO
NIFEDIPINA: INFLUÊNCIA DAS FASES NA ESTRUTURA DOS SISTEMAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal de Sergipe como parte
dos requisitos para a obtenção do Título de
Mestre em Química.
Aprovada em ___/___/______
Comissão Examinadora:
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento (Orientador)
_____________________________________________________________________
Prof.a Dr.a Iara de Fátima Gimenez (DQI – UFS)
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Leandro Ramos Souza Barbosa (IF - USP)
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me privilegiado com a dádiva da vida, pela
oportunidade de poder conquistar mais essa vitória, por ser sempre o meu amparo e refúgio,
por está sempre ao meu lado me dando forças para não fraquejar e por ser a luz do meu
caminho.
Aos meus pais, Josefa e Francisco, que são os meus maiores professores e exemplo na escola
da vida, agradeço pelo amor, pelo carinho, pela confiança e pelos conselhos. Enfim, por terem
sempre acreditado na minha capacidade e me dado força na conquista de mais uma etapa de
minha vida. Por isso, dedico especialmente a vocês a concretização deste trabalho. A vocês
meu eterno agradecimento e amor.
Ao meu namorado e amigo de todas as horas, David, agradeço por ter me aguentado e me
ajudado durante este tempo. Sem você não sei se teria aguentado passar por tudo isso. Você
sempre me incentivou nos momentos de angústia, sempre me ouvindo, me acolhendo, me
dando boas opiniões. Obrigada pelo amor verdadeiro e incondicional e por sempre ter
acreditado em mim!
A todos os familiares e amigos que sempre estiveram comigo nessa jornada de 2 anos e que
acompanharam direta ou indiretamente a minha caminhada em busca desta vitória, agradeço
pelos conselhos, pelo grande afeto e pela torcida.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento, por me orientar sempre com
dedicação, paciência, incentivo e contribuição na ampliação dos meus conhecimentos. Pelas
valiosas lições que foram passadas no decorrer destes 2 anos e que certamente me
acompanharão para toda a vida. Obrigada por confiar no meu potencial e no nosso trabalho!
A minha coorientadora, Prof. Dr. Rogéria de Souza Nunes, por ter cedido o seu laboratório de
pesquisa (Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico - LADEF) para realização dos
experimentos e ter contribuído significativamente desde a ideia inicial do nosso projeto de
pesquisa até os resultados finais do nosso trabalho. Ao pessoal do LADEF não poderia deixar
de agradecer pelo acolhimento e ajuda dada durante o tempo que passei por lá, principalmente
Quênnia, Sarah, Joyce e Givalda que acompanharam mais de perto os encaminhamentos do
trabalho.
Aos professores componentes da banca de qualificação, Iara de Fátima Gimenez e Luiz
Carlos Lobato dos Santos, e aos professores componentes da banca de defesa da dissertação,
pelas contribuições dadas ao nosso trabalho.
Ao Prof. Dr. Leandro Ramos Souza Barbosa pelas contribuições dadas nos estudos de
espalhamento de raios-x a baixos ângulos (SAXS). Ao Prof. Dr. Marcelo Leite dos Santos
pelas contribuições dadas para a realização de alguns experimentos e pelas ideias
apresentadas para a conclusão de alguns resultados.
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pelas análises de SAXS. Ao
Departamento de Física (DFI) pelas análises de microscopia de luz polarizada (MLP),
espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espectrofotometria de absorção na região do
infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Ao Departamento de Química do
Campus de Itabaiana (DQCI) pela realização de alguns experimentos e medidas
espectrofotométricas na região do ultravioleta e visível.
Ao Programa de Pós-Graduação em Química, à Universidade Federal de Sergipe e ao CNPq
pelo suporte financeiro.
Meus sinceros agradecimentos a todos que participaram dessa minha jornada e que de muitas
formas contribuíram para a realização e concretização desta dissertação.
RESUMO
As micelas (MIs) e as microemulsões (MEs) são classificadas como sistemas estabilizados
por tensoativos e se assemelham bastante com relação a sua estrutura e propriedades físicoquímicas. Quanto a sua aplicabilidade, elas têm sido destacadas por serem capazes de veicular
fármacos que possuem uma biodisponibilidade sistêmica limitada por via oral. A formação
destes sistemas é dependente principalmente dos tipos de componentes utilizados, tornando-se
relevante o estudo da sua influência na estrutura. O objetivo do presente trabalho foi a
obtenção e caracterização de sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo
essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck como fase oleosa), estabilizados por um tensoativo
não iônico (Tween 80) e um cotensoativo de cadeia curta (álcool etílico), que possam ser
utilizados como sistema de liberação para a nifedipina (NFD, um fármaco modelo), buscando
verificar a influência das fases e a interação do fármaco na estrutura desses sistemas.
Diagramas de fase ternário e pseudoternário para MIs e MEs, respectivamente, foram obtidos
e a partir das regiões de formação, formulações foram selecionadas para caracterização físicoquímica e incorporação da NFD.
Os aspectos macro e microscópicos foram avaliados
utilizando microscopia de luz polarizada (MLP), medidas de pH, condutividade elétrica e
tensão superficial. O tamanho médio de gotículas foi avaliado por espalhamento dinâmico de
luz (DLS) e espalhamento de raios-x a baixos ângulos (SAXS). Os resultados demonstraram
que esses sistemas são estáveis, isotrópicos e opticamente transparentes na ausência e
presença de fármaco. O tamanho das gotículas diminuiu com o aumento da quantidade de
tensoativo para as MIs e de mistura de tensoativo/cotensoativo para as MEs. A influência do
cotensoativo nas MIs foi praticamente desprezível. O aumento da quantidade de fase oleosa
nas MEs ocasionou um aumento do tamanho das gotículas. A presença da NFD não exerceu
influência na estrutura das MIs, entretanto para as MEs aumentou o tamanho de gotículas,
sugerindo que a NFD se encontra na fase interna das MEs. Os modelamentos das curvas de
SAXS para as MIs e MEs mais diluídas foram realizados e mostraram a interação existente
entre a NFD e os sistemas, corroborando
com os resultados anteriores. Estudos por
espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR) comprovaram a interação das MIs e das MEs com o estrato córneo (EC), o que
possibilita o uso destes sistemas como promotores de permeação da NFD.
Palavras-chave: Micelas, microemulsões, Tween 80, álcool etílico, óleo essencial de Citrus
sinensis, nifedipina, SAXS.
ABSTRACT
Micelles (MIs) and microemulsions (MEs) are classified as stabilized systems by surfactants
and are very similar with respect to their structure and physico-chemical properties. As for the
applicability, they have been deployed by being able to carry drugs which have a limited
systemic bioavailability by oral route. The formation of these systems is mainly dependent on
the types of components used, making it important to study its influence on the structure. The
goal of this study was to obtain and characterize micellar and microemulsion systems
(containing essential oil of Citrus sinensis (L.) Osbeck as oil phase) stabilized by a nonionic
surfactant (Tween 80) and short-chain cosurfactant (alcohol ethyl) which may be used as a
delivery system for nifedipine (NFD a model drug) seeking to verify the influence of the
phases and the interaction of the drug in the structure of these systems. Ternary and
pseudoternary phase diagrams for MIs and MEs, respectively, and were obtained from the
formation regions, formulations were selected for physico-chemical characterization and
incorporation of NFD. The macro and microscopic aspects were evaluated using polarized
light microscopy (MLP), measures pH, electrical conductivity and surface tension. The
average droplet size was measured by dynamic light scattering (DLS) and small angle x-ray
scattering (SAXS). The results demonstrated that such systems are stable, optically isotropic
and transparent in the absence and presence of drug. The droplet size decreases with
increasing amount of surfactant to MIs and the mixture surfactant/cosurfactant to the MEs.
The influence of the cosurfactant in MIs was negligible. The increase of the amount of oily
phase in MEs caused an increase in the droplet size. The presence of NFD no influence on the
structure of MIs, but for the MEs increased droplet size, suggesting that the NFD is the
internal phase of the MEs. The modeling by SAXS curves for MIs and MEs most diluted
were made and showed the interaction between the NFD and systems, confirming the
previous results. Studies by Fourier Transformed Infra Red (FTIR) confirmed the interaction
between MIs and MEs with the stratum corneum (EC) , which allows the use of these systems
as permeation enhancers of NFD.
Keywords: Micelles, microemulsions, Tween 80, ethyl alcohol, essential oil of Citrus
sinensis, nifedipine, SAXS.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática dos diferentes tipos de fases formadas dependendo do
PEC, teor de água, temperatura, entre outros. .......................................................................... 21
Figura 2 - Representação esquemática dos dois tipos de MI (a) direta e (b) inversa.............. 23
Figura 3 - Representação esquemática dos três tipos de ME (1) O/A; (2) bicontínua e (3)
A/O. .......................................................................................................................................... 24
Figura 4 - Classificação de Winsor. ........................................................................................ 24
Figura 5 - Estrutura química dos Tweens. ............................................................................... 27
Figura 6 - Partes aéreas da planta Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja pêra). ........................ 29
Figura 7 - Estrutura química do D-limoneno. ......................................................................... 30
Figura 8 - Estrutura química da Nifedipina. ............................................................................ 33
Figura 9 - Representação esquemática de um triângulo equilátero em que cada lado é
representado por um dos componentes da mistura. O ponto D representa a concentração de
50% de A, 20% de O e 30% de T. ............................................................................................ 35
Figura 10 - Esquema do comportamento do tensoativo entre as fases fluida e superficial, em
função da tensão superficial, indicando a CMC. ...................................................................... 40
Figura 11 - Esquema de extração de OECS. ........................................................................... 44
Figura 12 - Esquematização da linha de SAXS (D11A) do LNLS de Campinas. .................. 51
Figura 13 - Esquematização da estrutura de um agregado micelar, o interior hidrofóbico e as
cabeças polares estão em cinza e vermelho, respectivamente. ................................................. 53
Figura 14 - Esquematização do modelo micelar ou microemulsionado tipo elipsoidal. Os
parâmetros de ajuste das curvas de SAXS para este elipsoide são: Rpar (raio parafínico), νRpar
(semi-eixo maior do elipsoide), assim como σpol e ρpol (espessura e densidade eletrônica da
camada polar, respectivamente), ρágua, e ρpar, são as densidades eletrônicas da água e da região
parafínica, respectivamente, mantidas constantes e iguais a 0.334 e 0.275 e/Å3. .................... 54
Figura 15 - Diagrama de fases ternário constituído por Tween 80 (T80), etanol (EtOH) e
tampão fosfato pH 5,0 (TF). Toda a área do diagrama representa Micela (MI). ..................... 58
Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternário constituído por mistura de Tween 80 e etanol
(T80/EtOH), óleo essencial de Citrus Sinensis (OECS) e tampão fosfato pH 5,0 (TF). As
áreas delimitadas representam: Microemulsão (ME), Emulsão (EM) e Separação de Fase (SF).
.................................................................................................................................................. 59
Figura 17 - Aspecto visual dos seguintes sistemas: MI fluida, MI gelatinosa, ME, EM e SF
(da esquerda para direita). ........................................................................................................ 60
Figura 18 - Fotomicrografias das formulações MI3 (A) e ME3 (B) por MLP. A bolha é
deixada para obter uma maior visualização do campo escuro.................................................. 62
Figura 19 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento
q para (a) MIs mantendo cotensoativo ( etanol) constante e (b) MEs mantendo fase oleosa –
OECS – constante. .................................................................................................................... 66
Figura 20 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento
q para (a) MIs mantendo tensoativo – Tween 80 – constante e (b) MEs mantendo a mistura de
tensoativo/cotensoativo – Tween 80/Etanol – constante. ......................................................... 67
Figura 21 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento
q para os sistemas micelares na ausência e presença de nifedipina (NFD). ............................. 68
Figura 22 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento
q para os sistemas microemulsionados na ausência e presença de nifedipina (NFD). ............. 69
Figura 23 - Representação da estrutura molecular da NFD com suas dimensões aproximadas,
destacadas em diferentes orientações. A figura do fármaco e suas dimensões foi preparada
usando o programa PyMOL (DeLano Scientific, San Carlos, CA, http://www.pymol.org). As
cores dos átomos representam: cinza (carbono), vermelho (oxigênio) e azul (nitrogênio). ..... 71
Figura 24 - Espetros de absorção na região do UV da NFD no tampão fosfato pH 5,0 (a), na
MI (b) e na ME (c). .................................................................................................................. 72
Figura 25 - Espectros de absorção na região do UV da NFD em cinco solventes de
polaridades diferentes. .............................................................................................................. 73
Figura 26 - Curvas de SAXS dos sistemas composto por MIs (A e C) e MEs (B e D) eu
ausência (A e B) e presença (C e D) de NFD. As linhas cheias indicam os melhores ajustes
obtidos com o modelo descrito anteriormente. ......................................................................... 75
Figura 27 - Representação esquemática em escala das MIs (A e C) e das MEs (B e D) em
ausência (A e B) e presença (C e D) de NFD. Os elipsoides internos representam as regiões
apolares, enquanto que os externos representam as regiões polares. ....................................... 77
Figura 28 - Espectros de FTIR da região de interesse do EC tratados com: (a) água destilada
(controle) e formulações de MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de
MEs........................................................................................................................................... 79
Figura 29 - Espectros de segunda derivada do EC tratados com: (a) água destilada (controle)
e formulações de MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de
MEs...........................................................................................................................................80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 1. ................................................................................................ 46
Tabela 2 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 2. ................................................................................................ 46
Tabela 3 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 3. ................................................................................................ 46
Tabela 4 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 4. ................................................................................................ 47
Tabela 5 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 5. ................................................................................................ 47
Tabela 6 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 6. ................................................................................................ 47
Tabela 7 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 7. ................................................................................................ 48
Tabela 8 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 8. ................................................................................................ 48
Tabela 9 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação
das 9 formulações do Ensaio 9. ................................................................................................ 48
Tabela 10 - Composição centesimal dos sistemas micelares e microemulsionados
selecionados a partir dos diagramas de fases............................................................................ 61
Tabela 11 - Valores de pH na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e
MEs........................................................................................................................................... 63
Tabela 12 - Valores de condutividade elétrica na ausência e presença de fármaco para as
formulações de MIs e MEs. ...................................................................................................... 64
Tabela 13 - Valores de tamanho de gotícula e IPD na ausência e presença de fármaco para as
formulações de MIs e MEs. ...................................................................................................... 65
Tabela 14 - Valores de tensão superficial na ausência e presença de fármaco para as
formulações de MIs e MEs. ...................................................................................................... 70
Tabela 15 - Polaridade relativa e valores do comprimento de onda do pico de absorbância
máxima de cada um solventes. ................................................................................................. 73
Tabela 16 - Valores do coeficiente de partição da NFD em octanol/água realizados em
triplicata. ................................................................................................................................... 74
Tabela 17 - Parâmetros de ajuste das curvas de SAXS dos sistemas compostos por MIs e
MEs em ausência e presença de NFD. ..................................................................................... 76
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA
Análise de variância “one-way”
A/O
Água em óleo
ATR
Modo de Atenuação de Refletância
CEASA
Centro de Abastecimento de Alimentos
CLAE
Cromatógrafo líquido de alta eficiência
CMC
Concentração micelar crítica
DFI
Departamento de Física
DLS
Espalhamento Dinâmico de Luz (do inglês, Dynamic Light Scattering)
DP
Desvio padrão
DSC
Calorimetria Exploratória Diferencial (do inglês, Differential Scanning
Calorimetry)
EC
Estrato córneo
EHL
Equilíbrio hidrófilo-lipófílo
EM
Emulsão
EtOH
Etanol (álcool etílico)
FTIR
Espectrofotometria
de
absorção
na
região
do
infravermelho
com
transformada de Fourier (do inglês, Fourier Transformed Infra Red)
IPD
Índice de polidispersividade
LABAM
Laboratório de Biotecnologia Ambiental
LADEF
Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico
LNLS
Laboratório Nacional de Luz Síncroton
ME
Microemulsão
MI
Micela
MLP
Microscopia de Luz Polarizada
MSA
Aproximação de Esfera Média (do inglês, Mean Spherical Approximation)
NFD
Nifedipina
O/A
Óleo em água
OECS
Óleo essencial de Citrus sinensis
OZ
Ornstein-Zernicke
PEC
Parâmetro de empacotamento crítico
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
SANS
Espalhamento de Nêutrons a Baixos Ângulos (do inglês, Small Angle
Neutron Scattering)
SF
Separação de fase
SI
Sistema Internacional de Unidades
SAXS
Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (do inglês, Small Angle X-Ray
Scattering)
TF
Tampão fosfato pH 5,0
T80
Tween 80
UV
Ultravioleta
LISTA DE SÍMBOLOS
a
Área ocupada pelo grupo polar
v
Volume da cadeia hidrofóbica
l
Comprimento da cadeia hidrofóbica
ΔG
Variação da energia livre de Gibbs
ΔA
Variação de área da interface
γ
Tensão interfacial
KB
Constante de Boltzmann
Ω
Número de configurações possíveis
ni
Número de mol em excesso na interface do componente i
µi
Potencial químico do componente i
A
Área da interface
R
Constante universal dos gases
ai
Atividade do componente i
f
Fugacidade
xi
Fração molar do componente i
Rh
Raio hidrodinâmico médio
η
Viscosidade do meio
D
Coeficiente de difusão das partículas
I(q)
Intensidade de espalhamento
k
Constante relacionada ao arranjo experimental
np
Densidade numérica das gotículas
P(q)
Fator de forma
F(q)
Amplitude de espalhamento
q
Módulo do vetor de espalhamento
λ
Comprimento de onda da radiação incidente
2θ
Ângulo de espalhamento
S(q)
Fator estrutura (fator de interferência)
g(r)
Função de distribuição radial
r
Centro de uma gotícula de referência
Rg
Raio de giro
I(0)
Intensidade de espalhamento extrapolada à q = 0
∆ρ
Contraste de densidade eletrônica da partícula em relação ao meio
V
Volume da gotícula espalhadora
p(r)
Função de distribuição de distâncias
ρ1
Densidade eletrônica constante
ρágua
Densidade eletrônica da água

Razão axial
Ref
Raio efetivo

Ângulo formado entre o eixo longo do elipsoide
Rpar
Raio parafínico
Rpol
Raio da camada polar
νRpar
Semi-eixo maior do elipsoide
σpol
Espessura da camada polar
ρpol
Densidade eletrônica da camada polar
ρpar
Densidade eletrônica da região parafínica
tot
Razão axial da partícula inteira
h(r)
Função de correlação total
d
Diâmetro médio da partícula espalhadora
h(rij)
Função de correlação total da partícula i à partícula j
c(rij)
Correlação direta da partícula i com a partícula j (correlação de pares)
rij
Distância da partícula i à partícula j
Z
Carga na superfície da MI ou ME
e
Carga fundamental do elétron

Constante dielétrica do meio
NA
Número de Avogadro
T
Temperatura
kDB
Intervalo de atuação do potencial repulsivo
Nag
Número de agregação

Porcentagem de cargas na superfície da MI ou ME
log P
Coeficiente de Partição
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 18
2
REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 20
2.1
SISTEMAS ESTABILIZADOS POR TENSOATIVOS ........................................... 20
2.2
MICELAS (MIs) E MICROEMULSÕES (MEs) ...................................................... 22
2.2.1
Estrutura e Tipos de MIs e MEs ......................................................................... 23
2.2.2
Mecanismo de Formação de MIs e MEs ............................................................ 25
2.3
COMPOSIÇÃO DOS SISTEMAS ............................................................................ 26
2.3.1
Tensoativos ......................................................................................................... 27
2.3.2
Cotensoativos ..................................................................................................... 28
2.3.3
Fase Aquosa ....................................................................................................... 28
2.3.4
Fase Oleosa ........................................................................................................ 29
2.4
MICROEMULSÕES COMO SISTEMA DE LIBERAÇÃO TRANSDÉRMICA DE
FÁRMACOS ........................................................................................................................ 30
3
4
2.5
NIFEDIPINA (NFD) ................................................................................................. 32
2.6
DIAGRAMA DE FASES .......................................................................................... 34
2.1
MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS ...... 35
2.1.1
Microscopia de Luz Polarizada (MLP) .............................................................. 36
2.1.2
Condutividade Elétrica ....................................................................................... 37
2.1.3
Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) .............................................................. 37
2.1.4
Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) ......................................... 38
2.1.5
Tensão Superficial .............................................................................................. 39
OBJETIVOS .................................................................................................................... 42
3.1
OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 42
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 42
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 43
4.1
REAGENTES E SOLVENTES ................................................................................. 43
4.2
EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS ....................................................................... 43
4.3
EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL ..................................................................... 44
4.4
OBTENÇÃO DAS REGIÕES DE FORMAÇÃO DE MICELAS E
MICROEMULSÕES ATRAVÉS DE DIAGRAMAS DE FASES ...................................... 45
4.5
SELEÇÃO DAS FORMULAÇÕES .......................................................................... 49
4.6
CARATERIZAÇÃO DAS MICELAS E MICROEMULSÕES SELECIONADAS 50
4.6.1
Microscopia de Luz Polarizada (MLP) .............................................................. 50
4.6.2
Determinação do pH .......................................................................................... 50
4.6.3
Condutividade elétrica ....................................................................................... 50
4.6.4
Tamanho e distribuição de tamanho das gotículas ............................................ 50
4.6.5
Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) ......................................... 51
4.6.6
Determinação da Tensão Superficial ................................................................. 51
4.7
ESTUDOS DA INTERAÇÃO DA NIFEDIPINA COM AS MICELAS E AS
MICROEMULSÕES ............................................................................................................ 52
4.7.1
Estudos Computacionais .................................................................................... 52
4.7.2
Análises no Ultravioleta (UV) ............................................................................ 52
4.7.3
Determinação do coeficiente de partição ........................................................... 52
4.7.4
Modelamento das curvas de SAXS das MIs e MEs ............................................ 53
4.8
ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES
EM MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR ......................................................... 57
4.8.1
Preparação das amostras ................................................................................... 57
4.8.2
Espectrofotometria de Absorção na região do Infravermelho com Transformada
de Fourier e modo de atenuação de refletância (FTIR-ATR) ........................................... 57
4.9
5
ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 57
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 58
5.1
OBTENÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES ............................................................. 58
5.2
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MICELAS E MICROEMULSÕES
SELECIONADAS ................................................................................................................ 62
5.3
ESTUDOS DA INTERAÇÃO DA NIFEDIPINA COM AS MICELAS E AS
MICROEMULSÕES ............................................................................................................ 70
5.4
ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES
EM MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR ......................................................... 77
6
CONCLUSÕES ............................................................................................................... 81
7
PERSPECTIVAS FUTURAS......................................................................................... 83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 84
18
1
INTRODUÇÃO
Tensoativos são moléculas de natureza anfifílica caracterizadas pela presença em suas
estruturas moleculares de duas regiões: uma polar (hidrofílica) e outra apolar (hidrofóbica) [1,
2]. Estas moléculas de tensoativos podem se autoagregar na presença de água ou até mesmo
se situar na interface óleo/água quando uma fase oleosa está presente formando uma grande
variedade de estruturas de escala microscópica ou macroscópica. Dentre todas as estruturas
existentes, os sistemas micelares e microemulsionados são os que mais se assemelham com
relação a sua estrutura e propriedades físico-químicas. Entretanto, existem distinções entre
estes sistemas que podem levar a diferenças expressivas quanto a sua funcionalidade.
As micelas (MIs) correspondem a um conjunto de moléculas de tensoativos que se
encontram espontaneamente agregadas em água, cujo tamanho está compreendido na faixa de
1 a 100 nm [3, 4, 5, 6], enquanto que as microemulsões (MEs) são dispersões homogêneas
caracterizadas pela mistura de óleo, água, tensoativo e/ou cotensoativo, cujo tamanho é um
pouco maior do que as MIs, na faixa de 5 a 140 nm [7, 8, 9, 10].
Sistemas micelares e microemulsionados apresentam uma série de propriedades físicoquímicas em comum, como transparência, isotropia óptica, baixa viscosidade, estabilidade
termodinâmica, capacidade de solubilização de componentes em meios de baixa afinidade e
grande área interfacial específica [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Em contrapartida, existe uma
diferença básica entre estes dois sistemas, a qual está relacionada à presença da fase oleosa: as
MEs apresentam óleo como um dos seus componentes, enquanto que as MIs não o possuem
[17].
O ponto chave para a formação de MIs e MEs é a tensão interfacial, a qual deve ser
suficientemente baixa para que isso ocorra. A baixa tensão interfacial é normalmente atingida
com o uso de tensoativos. Para ampliar a região de formação desses sistemas, geralmente usase um cotensoativo que se posiciona na monocamada do tensoativo, aumentando a
flexibilidade e diminuindo ainda mais a tensão interfacial [12, 18]. Logo, a escolha do
tensoativo e/ou cotensoativo é de extrema importância para a formação de MIs e MEs, pois
diferenças na estrutura e na geometria molecular podem causar diferenças importantes na
formação do sistema.
Além disso, a escolha da fase aquosa e oleosa é de fundamental importância, pois a
elas são adicionados o tensoativo e/ou cotensoativo. Como fase aquosa, a própria água é uma
ótima representação de um componente polar e a substância mais comumente utilizada [19].
19
Quanto à fase oleosa (presente nas MEs) são bastante utilizados os óleos essenciais, os quais
são classificados como monoterpenos de origem natural e agem como promotores de
permeação para fármacos hidrofílicos e lipofílicos minimizando assim, a função barreira
estabelecida pela pele [20, 21].
Ao adicionar um fármaco nestes sistemas é importante conhecer a sua origem, para
que seja compatível com a fase interna. O fármaco modelo utilizado neste trabalho foi a
nifedipina (NFD). De natureza lipofílica, a NFD é usada no tratamento de hipertensão e
angina e apresenta uma biodisponilidade sistêmica limitada por via oral, pois sua
farmacodinâmica é complexa [22, 23]. Desta forma, surge a ideia de veicular a NFD em
sistemas estabilizados por tensoativos, tais como MIs e MEs para administração transdérmica.
Neste contexto, o presente trabalho tem como finalidade estudar os sistemas micelares
e microemulsionados (contendo óleo essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck como fase
oleosa), buscando verificar a influência das fases e do fármaco na estrutura desses sistemas,
além de estudar a interação da NFD com as MIs e MEs para entender os mecanismos de
liberação transdérmica deste fármaco.
20
2
2.1
REFERENCIAL TEÓRICO
SISTEMAS ESTABILIZADOS POR TENSOATIVOS
As moléculas de tensoativos podem se autoagregar na presença de água formando uma
grande variedade de estruturas. Além disso, estas moléculas podem se situar na interface
óleo/água quando são introduzidas em misturas imiscíveis de óleo e água, resultando em
diferentes estruturas de escala macroscópica ou microscópica.
Para entender a formação destas estruturas, deve-se considerar as composições do
sistema, tais como a fase oleosa, cotensoativos, presença de sais, temperatura e estrutura do
tensoativo, sendo esta última a principal responsável pela formação do sistema. A estrutura do
tensoativo está relacionada à sua geometria molecular, que constitui um parâmetro
conveniente para predizer a geometria preferencialmente formada por uma substância
anfifílica, ao passo que associa o formato da molécula com propriedades que intervêm na
curvatura da interface polar-apolar e consequentemente no tipo de agregado formado [24]. O
parâmetro de empacotamento crítico (PEC), mostrado na Equação 1, relaciona a capacidade
dos tensoativos em formar agregados específicos à geometria da própria molécula e é
dependente da área ocupada pelo grupo polar (a), do volume (v) e do comprimento (l) da
cadeia hidrofóbica [15, 25].
A área ocupada pelo grupo polar do tensoativo é comandada pelas forças repulsivas
entre outros grupos polares, pelas forças atrativas entre as cadeias apolares e pelas forças entre
estas cadeias apolares e as moléculas de óleo. Logo, o valor desta área é uma propriedade não
exclusivamente intrínseca do tensoativo, mas também dependente de fatores tais como,
concentração de íons na fase aquosa, composição do óleo da fase apolar do sistema e da
própria concentração do tensoativo que define a estrutura formada [26].
A Figura 1 mostra as possíveis estruturas que os tensoativos podem formar na
presença de água, óleo ou na combinação de ambos de acordo com o valor do PEC das
cadeias de tensoativo. Para formação de estruturas lamelares, o tensoativo geralmente
apresenta a forma cilíndrica e na formação da fase hexagonal e micelar, ele apresenta a área
de um cone. É destacável que a mistura de componentes de diferentes polaridades, como óleo
21
e água, na presença do tensoativo, agregam-se de maneira que possibilitem diferentes regiões
adicionais de solubilização [27].
Figura 1 - Representação esquemática dos diferentes tipos de fases formadas dependendo do PEC, teor de água,
temperatura, entre outros.
Fonte: CARVALHO (2009) [8].
Dentre todas as estruturas existentes, os sistemas micelares se assemelham muito aos
microemulsionados tanto com relação a sua estrutura quanto as suas propriedades físicoquímicas e por isso há uma grande confusão quanto as suas distinções. No entanto, existem
diferenças básicas entre estes sistemas estabilizados por tensoativos, as quais podem levar a
diferenças significativas quanto a sua funcionalidade. Dessa forma, torna-se importante o
conhecimento de seus conceitos, estruturas, características e possíveis diferenças.
22
2.2
MICELAS (MIs) E MICROEMULSÕES (MEs)
O termo MI foi introduzido pelo pioneiro na área J. W. McBain em 1913 para
descrever a formação de partículas coloidais de detergentes e sabões. Além disso, a palavra
MI tem também sido amplamente utilizada em biologia e na química coloidal de outros
fenômenos [11].
As MIs são agregados tipicamente coloidais nanoestruturados, definidos como um
conjunto de moléculas de tensoativos anfifílicos que se encontram espontaneamente
agregados em água [3, 4]. Elas são constituídas pela associação das moléculas até um
conjunto cujo tamanho esteja compreendido na faixa de 1 a 100 nm [5, 6].
Já o conceito de ME foi introduzido na literatura em 1943 por Hoar e Schulman [9,
10]. Eles a descreveram como sistemas transparentes ou translúcidos, formados
espontaneamente por titulação de uma emulsão comum de aspecto leitoso com um álcool de
cadeia média, como o hexanol [15].
As MEs são dispersões macroscopicamente homogêneas caracterizadas pela mistura
de óleo, água, tensoativo e/ou cotensoativo. Em nível microscópico, elas representam
microdomínios individuais de dois líquidos imiscíveis (óleo e água) separados e estabilizados
por um filme interfacial de tensoativo, em que as partes polares e apolares estão voltadas para
os respectivos meios de afinidade [7, 9, 25, 27, 28, 29]. Elas são geralmente determinadas
como agregados esféricos com tamanho de partículas muito pequeno, na faixa de 5 a 140 nm
[8, 9, 10].
MIs e MEs apresentam uma série de propriedades físico-químicas em comum, como
transparência, isotropia óptica, baixa viscosidade, estabilidade termodinâmica, capacidade de
solubilização de componentes (hidrofílicos e lipofílicos) em meios de baixa afinidade e
grande área interfacial específica [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Além disso, esses sistemas são
classificados como coloidais com tamanho de partícula menor que ¼ do comprimento de onda
da luz incidente, que é de 350 a 800 nm e portanto, não espalham luz visível. Isto explica
porque eles são opticamente transparentes [10, 30]. Eles normalmente são polidispersos,
sendo que a polidispersividade em geral, aumenta com o tamanho das gotículas [12].
No entanto, existe uma diferença básica entre estes dois sistemas, a qual está
relacionada à presença da fase oleosa [17]. Enquanto as MEs apresentam óleo como um dos
seus componentes, as MIs não o possuem.
23
2.2.1 Estrutura e Tipos de MIs e MEs
Diferentes formas de microestruturas tanto de MIs quanto de MEs são utilizadas para
diversas aplicações. Entretanto, o entendimento destas microestruturas e de como elas podem
ser influenciadas por diferentes aditivos se faz necessário para o uso eficiente deste tipo de
agregado [31].
Dependendo do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) do tensoativo e da polaridade do
meio de dispersão (hidrofílico ou hidrofóbico), as MIs podem ser diretas ou inversas (Figura
2). As MIs são ditas diretas quando dissolvidas em meio polar, os tensoativos se unem pelas
cadeias orgânicas apolares (hidrofóbicas) ficando com as cabeças polares (hidrofílicas) na
parte externa da MI, protegendo o núcleo apolar do contato com o meio de dispersão polar.
Quando o meio for apolar, os tensoativos se unem pelas cabeças polares ficando com as
cadeias orgânicas apolares na parte externa das MIs, protegendo o núcleo polar do contato
com o meio de dispersão apolar formando assim MIs inversas [16, 32, 33].
Figura 2 - Representação esquemática dos dois tipos de MI (a) direta e (b) inversa.
a
b
Fonte: OLIVEIRA (2013)
Já para as MEs, do ponto de vista microestrutural, existem três tipos: MEs de água em
óleo (A/O), de óleo em água (O/A) e bicontínuas (Figura 3). As MEs A/O (quando o volume
de água é baixo) correspondem a nanogotículas de água dispersas em uma fase contínua de
óleo estabilizadas por um filme ou monocamada de tensoativo e na maioria dos casos um
cotensoativo também é utilizado. Já as MEs O/A (quando o volume de óleo é baixo) são o
contrário, ou seja, correspondem a nanogotículas de óleo que estão dispersas em uma fase
contínua de água e as moléculas de tensoativo e cotensoativo estão arranjadas de tal forma
que o grupo polar encontra-se posicionado na superfície das gotículas, direcionado para a
água [25]. Por último, as MEs bicontínuas são formadas quando as quantidades de água e óleo
são similares [15]. A representação mais geral para este tipo de ME é a de uma microestrutura
24
com infinitos canais encurvados de óleo e água, podendo as moléculas dos dois componentes
transitarem livremente por toda a fase.
Figura 3 - Representação esquemática dos três tipos de ME (1) O/A; (2) bicontínua e (3) A/O.
água
óleo
1
água
óleo
2
3
Fonte: BRITO (2011) [34].
Nos casos em que as MEs se encontram com quantidades insuficientes de tensoativo, a
fase dispersa pode não ser completamente solubilizada na ME e, então, uma fase do
componente em excesso puro pode surgir em equilíbrio. Isso corresponde a uma sequência de
equilíbrio entre a ME e as fases aquosas e oleosas, comumente conhecida como fases de
Winsor. Winsor (1948) propôs a formação de quatro sistemas dispostos em função dos
equilíbrios: Winsor I, II, III e IV (Figura 4). Um sistema tipo Winsor I ocorre quando apenas
uma pequena parcela da fase oleosa está em equilíbrio com a ME, apresentando um excesso
de óleo na porção superior, formando um sistema bifásico. No tipo Winsor II, também
bifásico, uma pequena parcela da fase aquosa está em equilíbrio com a ME, exibindo um
excesso de água na parte inferior. No tipo Winsor III, a ME está em equilíbrio com excesso
tanto de óleo quanto de água, formando um sistema trifásico. E por fim, o tipo Winsor IV
ocorre quando não há excesso de fase aquosa ou oleosa, formando um sistema homogêneo e
monofásico [35]. Ou seja, o sistema tipo Winsor IV corresponde a uma ME sem excesso de
nenhuma das fases.
Figura 4 - Classificação de Winsor.
Fonte: WINSOR (1948) [35].
25
2.2.2 Mecanismo de Formação de MIs e MEs
Para que as variadas microestruturas dos sistemas micelares e microemulsionados
possam ser obtidas se faz necessário o conhecimento do processo físico-químico de formação
destes sistemas. Com base em um tratamento termodinâmico, este processo está associado a
uma mudança de energia livre de Gibbs (G) de acordo com a Segunda Lei da Termodinâmica,
a qual diz que G deve ser tornar negativa para a formação espontânea de uma ME
termodinamicamente estável [25]. Em condições de temperatura constante, isso pode ser
expresso pela Equação 2, em que ΔG é a variação da energia livre de Gibbs, γ é a tensão
interfacial e ΔA é variação da área interfacial do sistema [9, 25].
Para que uma MI ou uma ME se forme é imprescindível o aumento da área interfacial
(A1 → A2), a qual leva em princípio a um aumento brusco da energia livre de Gibbs (G1 →
G2). Com isso, para garantir a estabilização do sistema em estudo, a tensão interfacial deve
reduzir a um ponto que proporcione a diminuição da energia livre [9, 25]. Nesta situação, a
variação da energia livre de Gibbs (ΔG) se torna zero ou negativa, que é a condição de
estabilidade termodinâmica desses sistemas [7, 9, 15, 25]. Logo, uma tensão interfacial muito
baixa é um pré-requisito para a formação e estabilidade de tais sistemas [36], que é
geralmente atingida com o uso de um, dois ou mais tensoativos.
A adição de tensoativo na fase polar (água) ou na fase apolar (óleo) causa uma
redução gradual de γ alcançando um valor limite, o qual é conhecido como concentração
micelar crítica (CMC). Qualquer acréscimo de tensoativo acima da CMC causa pequena ou
nenhuma diminuição no valor de γ [7].
Quando ocorre a adição de duas moléculas anfifílicas, uma agindo como tensoativo e a
outra como cotensoativo, a redução da tensão interfacial é dada pela equação de adsorção de
Gibbs para um sistema de multicomponentes (Equação 3), onde ni é o número de mol em
excesso na interface do componente i e µi é o potencial químico do componente i [7].
∑
Quando o equilíbrio entre as concentrações nas fases interfacial e interior é atingido,
tem-se:
26
em que ai é a atividade do componente i e é dada pela Equação 5, onde f é a fugacidade e xi é
a fração molar do componente i [7].
Portanto, a Equação 4 torna-se:
[
]
Substituindo esta equação na equação 3, obtém-se:
∑
[
]
Logo, para um sistema com um tensoativo (S1) e um cotensoativo (S2) adsorvidos na
interface, tem-se a Equação 8 [7].
[
]
[
]
[
]
Por fim, aplicando integral na equação acima, obtém-se:
∫
[
]
∫
A Equação 9 indica que a tensão interfacial é reduzida a dois termos, um para o
tensoativo e outro para o cotensoativo, que têm concentração interfacial de excesso
respectivamente iguais a nS1/A e nS2/A. É importante ressaltar que as duas moléculas
adsorvem-se simultaneamente e não interagem entre si para que as respectivas concentrações
não sejam diminuídas. Isso explica por que as duas moléculas devem variar em natureza, isto
é, uma predominantemente solúvel em água e a outra solúvel em óleo [7].
Logo, a propensão do sistema para formar uma MI direta ou inversa e uma ME de
O/A, A/O ou bicontínua é dependente de vários fatores, como o tipo de tensoativo,
cotensoativo e fase oleosa (em ME), a razão de água/óleo, a presença de íons na fase aquosa e
a temperatura [9]. Por isso, torna-se relevante o estudo da composição do sistema.
2.3
COMPOSIÇÃO DOS SISTEMAS
Um critério fundamental associado ao desenvolvimento de sistemas estabilizados por
tensoativos é a seleção dos componentes da formulação. Esta seleção deve ser bastante
cautelosa e atender alguns requisitos, tais como toxicidade, irritabilidade, capacidade de
27
solubilização de ativos que podem ser incorporados, bem como capacidade de formar o
sistema desejado [15, 27]. Os componentes das MIs são fase aquosa, tensoativo e/ou
cotensoativo, já os das MEs são os mesmos com o acréscimo da fase oleosa. A seguir são
analisadas as características destes componentes.
2.3.1 Tensoativos
Tensoativos ou surfactantes são moléculas de natureza anfifílica, ou seja, são
compostos caracterizados pela presença em suas estruturas moleculares de duas regiões, uma
polar (hidrofílica) e outra apolar (hidrofóbica ou lipofílica). A estrutura de um tensoativo de
uma maneira geral pode ser dita como R-X, em que R é uma cadeia de hidrocarboneto
geralmente linear (variando de 8-18 átomos de carbono) e X é o grupo ‘cabeça’ (polar).
Dependendo da estrutura de X, os tensoativos podem ser classificados como iônicos
(catiônicos, aniônicos ou anfóteros, também chamados de zwitteriônicos) ou não iônicos [1, 2,
37].
Quando relacionados aos outros tipos de tensoativos, os tensoativos não iônicos são os
mais aceitos, uma vez que são menos afetados pela presença de aditivos (tampão, eletrólitos e
conservantes) e mudanças de pH, além de serem mais seguros e menos susceptíveis em causar
irritação [27, 38]. Eles não fornecem íons em solução e são derivados do polioxietileno e
polioxipropileno ou polialcoóis, ésteres de carboidratos, amidas de alcoóis graxos e óxidos de
amidas graxas. Como exemplo de tensoativo não iônico, têm-se os Tweens que são ésteres de
ácidos graxos de sorbitano (Figura 5). Dentre os Tweens existentes, o Tween 80 é o
tensoativo utilizado neste trabalho com massa molar de 1310 Da.
Figura 5 - Estrutura química dos Tweens.
O
HO-(CH2CH2O)Y-CH-CH2-(OCH2CH2)Z-O
HO-(CH2CH2O)x
R
O
HO-(CH2CH2O)w
Tween 20
Tween 40
Tween 60
Tween 80
R = C11H23
R = C15H31
R = C17H35
R = C17H33
w + x + y + z = 20
w + x + y + z = 20
w + x + y + z = 20
w + x + y + z = 20
Monolaurato de Polioxietileno Sorbitano
Monopalmitato de Polioxietileno Sorbitano
Monoesterato de Polioxietileno Sorbitano
Monooleato de Polioxietileno Sorbitano
Fonte: OLIVEIRA (2013).
28
Devido a sua estrutura e propriedades, os tensoativos têm a capacidade de reduzir a
tensão interfacial e superficial dos líquidos aonde estes se encontram. Quando eles são
adicionados a misturas imiscíveis de óleo e água, a molécula de tensoativo forma um filme na
interface óleo-água estabilizando a mistura e tornando o sistema mais estável
termodinamicamente.
As regiões hidrofílicas e lipofílicas dos tensoativos são definidas principalmente pelo
equilíbrio adquirido entre a parte polar e a apolar do tensoativo utilizado, denominado
equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL). O EHL é numericamente apresentado em uma escala de
valores, que estão relacionados ao tamanho da cadeia polar do tensoativo. Valores de EHL
inferiores a dez revelam predominância da parte apolar nessas substâncias. Em contrapartida,
valores superiores a dez mostram a prevalência da região polar [2, 15].
2.3.2 Cotensoativos
O cotensoativo se posiciona na monocamada do tensoativo e apresenta a função de
aumentar a flexibilidade do sistema e diminuir a tensão interfacial e superficial entre a água e
o óleo proporcionando a redução máxima do tamanho das gotículas da fase interna e
ampliando as regiões de MIs e MEs [12, 18]. Entretanto, o uso de cotensoativos nem sempre é
necessário para a obtenção desses sistemas.
Os principais cotensoativos utilizados são alcoóis e glicóis, que apresentam massa
molecular pequena ou média e uma cadeia contendo entre dois e dez carbonos [19]. A
presença de um álcool como o etanol pode influenciar a solubilidade das fases aquosa e
oleosa, devido à sua partição entre ambas as fases [15].
2.3.3
Fase Aquosa
A água é a mais comumente utilizada para formação de sistemas estabilizados por
tensoativos, como as MIs e as MEs. Além de água, soluções salinas variadas também podem
ser adotadas como fase aquosa na preparação destes sistemas. De acordo com determinadas
aplicações, esta fase também pode conter aditivos, tais como tampões, antibactericidas e
agentes isotônicos [19].
29
2.3.4 Fase Oleosa
O tamanho das moléculas do óleo e a sua polaridade influenciam na formação de MEs.
Para elas serem formadas, as moléculas da fase oleosa têm que estar associadas e penetrar no
filme interfacial do tensoativo. Para facilitar a interação da fase oleosa com o filme interfacial
do tensoativo, o tamanho da molécula de óleo não deve ser muito grande ou pelo menos
conter ligações insaturadas [27]. Logo, óleos de tamanho menor são mais propícios para o
aparecimento deste tipo de estrutura microemulsionada.
Vários estudos têm sugerido o uso de óleos essenciais como a fase oleosa para a
formação de MEs, devido a estes agirem como promotores de permeação, por exemplo, para
fármacos hidrofílicos e lipofílicos, apresentando alta habilidade em promover a permeação de
maneira reversível e produzir baixo potencial de irritação cutânea [20, 21, 39, 40]. É
importante destacar que os promotores de permeação constituem um grupo de substâncias
capazes de minimizar a função barreira estabelecida pela pele através de vários mecanismos.
Dentre os óleos essenciais existentes, uma grande atenção tem sido dada ao óleo
essencial de Citrus sinensis (OECS - laranja pêra) (Figura 6) devido ser derivado de um
produto natural que vem sendo bastante exportado pelo Brasil, fazendo com que o nosso país
ocupe a quarta posição no ranking de exportação deste óleo para os EUA [41, 42, 43]. Ele é
obtido das cascas da laranja e apresenta um rendimento percentual em torno de 10%.
Figura 6 - Partes aéreas da planta Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja pêra).
Fonte: http://www.montedolaranjal.com/pt-pt/tag/laranja-pera/.
30
Além disso, o OECS constitui um sistema complexo que contém mais de 200
componentes, sendo o de maior predominância o D-limoneno (Figura 7), monoterpeno
utilizado em estudos de permeação de fármacos com o objetivo de aumentar a permeabilidade
destes através da pele [44, 45].
Figura 7 - Estrutura química do D-limoneno.
CH3
H3C
CH2
Fonte: OLIVEIRA (2013).
Em seus estudos, Williams e Barry (2004) destacam que os monoterpenos são muito
eficientes no sentido de aumento da permeação e que hidrocarbonetos ou terpenos apolares, a
exemplo do D-limoneno, ocasionam maior aumento para fármacos lipofílicos [46]. Logo,
pode-se concluir que os possíveis mecanismos de ação destes monoterpenos como promotores
de permeação estejam associados com a propriedade de solubilizar os lipídios do estrato
córneo, bem como aprimorar a divisão do fármaco nesta camada.
2.4
MICROEMULSÕES COMO SISTEMA DE LIBERAÇÃO TRANSDÉRMICA DE
FÁRMACOS
Nos últimos anos, MEs têm sido frequentemente empregadas na tentativa de aumentar
a liberação transdérmica de fármacos. As formulações de MEs mostram-se superiores para a
administração transdérmica devido ao seu alto potencial de solubilização de fármacos
particularmente lipofílicos, como também hidrofílicos, em comparação com os veículos
convencionais, tais como hidrogéis, emulsões e lipossomas [27, 47]. Além disso, permitem
liberação lenta do fármaco, a qual proporciona efeito prolongado evitando atingir
concentração plasmática acima do necessário [10] e oferecem benefícios que incluem o
aumento da solubilidade e absorção, o controle da biodisponibilidade de fármacos, a alteração
31
dos parâmetros farmacocinéticos, a elevação do índice terapêutico e consequentemente, a
diminuição da toxicidade e o aumento da eficácia clínica de fármacos [10, 48].
Zhong et al. (2012) preparam MEs-géis de naproxeno compostas por uma mistura de
Tween 80 e Tween 20 como tensoativo, carbitol como cotensoativo, peponida como fase
oleosa e água, a fim de obter alto teor de fármaco e adesividade. Os estudos de permeação in
vitro mostram um aumento significativo na permeção do fármaco através da pele, além de
obter alto teor de fármaco, absorção percutânea e adesividade favorável [49]. Hathout et al.
(2010) mostraram que MEs à base de ácido oleico/Tween 20/Transcutol®/água são veículos
potencialmente úteis para a administração transdérmica de testosterona ao apresentar um
fluxo transdérmico aumentado nos estudos de permeação in vitro em peles suínas [50].
Zhu et al. (2008) mostraram que a permeação de penciclovir na pele, fármaco antiherpético, em uma formulação de ME de ácido oleico/Cremophor EL/etanol/água era 3,5
vezes mais elevada em comparação com um creme comercial [51]. Changez et al.
(2006) estudaram o fluxo transdérmico de hidrocloridrato de tetracaína a partir de MEs de
lecitina/n-propanol/miristato de isopropila/água e mostraram que estas MEs aumentam a
permeabilidade do hidrocloridrato de tetracaína na pele do rato por 20 a 25 vezes, dependendo
da composição da ME [52]. Gupta et al. (2005) demonstraram que o fluxo transdérmico de 5fluorouracil, um fármaco anti-neoplásico, aumentou de 2 a 6 vezes a partir de uma ME de bis
(2-etil-hexil) sulfosuccinato de sódio/água/miristato de isopropila, em comparação com uma
solução aquosa do mesmo fármaco [53].
Já Gallarate et al. (1999) estudaram a estabilidade do ácido ascórbico em várias MEs.
Palmitato de isopropila ou octanoato de cetearila foram utilizados como fases oleosas, dodecil
glicosídeo e propil betaína cocoamida foram utilizados como tensoativos, e 2-etil-1,3hexanodiol foi escolhido como um cotensoativo. A estabilidade do ácido ascórbico contra a
oxidação mostrou-se superior em sistemas microemulsionados em comparação com as
formulações aquosas [54]. Sintov e Shapiro (2004) escolheram a lidocaína como um fármaco
modelo lipofílico. Para reduzir a irritação, eles sugeriram MEs à base de oleato de glicerol e
polietilenoglicol 40 (PEG 40) derivados de ácidos graxos (tensoativos)/tetraglicol
(cotensoativo)/palmitato de isopropila/água, às quais o fármaco foi solubilizado. Estudos de
permeação in vitro em pele de ratos foram realizados e demostraram que o fluxo transdérmico
de lidocaína era significativamente melhorado pelas MEs compostas de oleato de glicerol estearato de PEG-40 comparada com as de oleato de glicerol - óleo de mamona hidroxilado
PEG-40 [55].
32
Em estudos de caracterização físico-química dos sistemas microemulsionados com
fármacos, é possível observar que algumas propriedades do sistema podem se alterar um
pouco dependendo do fármaco, mas a estabilidade do sistema permanece a mesma. Por
exemplo, Djordjevic et al. (2004) investigaram MEs compostas de água, miristato de
isopropila, glicerídeo cáprico/PEG-8 caprílico (Labrasol®) e poligliceril-6 dioleato (Plurol
Oleique®), como potenciais veículos de liberação de dietilamina diclofenaco. Entretanto,
verificou-se que a condutividade e as propriedades reológicas foram influenciadas
significativamente pela incorporação do fármaco nas condições experimentais. Pelo contrário,
o fármaco não influencou significativamente tanto no valor do pH, quanto na estabilidade e
textura óptica dos sistemas examinados [56].
Quanto à NFD, fármaco modelo utilizado neste trabalho, também existem estudos que
revelam o potencial dos sistemas microemulsionados ao veicular este fármaco. Boltri et al.
(1994) estudaram a absorção transdérmica in vitro da NFD a partir de MEs compostas de
Tween 20, taurodesoxicolato, álcool benzílico e duas fases aquosas (ora água-transcutol, ora
água-propilenoglicol) [57]; enquanto Thacharodi e Rao (1994) prepararam MEs óleo/água de
seis promotores de permeação diferentes (óleo de ylang ylang, óleo de lavanda, óleo de
canela, eucalipto, mentona e mentol) contendo etanol como agente emulsificante, buscando
verificar também a absorção transdérmica da NFD [58]. Tais estudos mostraram uma ótima
eficiência na permeação cutânea da NFD. No entanto, nos últimos anos, não existem estudos
recentes que abordem o efeito promotor de permeação dos sistemas microemulsionados
contendo esse fármaco.
2.5
NIFEDIPINA (NFD)
A NFD, dimetil-1,4-di-hidro-2,6-dimetil-4 (2-nitro-fenil) piridina-3,5-dicarboxilato
(Figura 8) é um fármaco utilizado no tratamento de hipertensão arterial e angina e é
quimicamente classificada como uma diidropiridina [59, 60]. Ela é uma antagonista do cálcio,
sendo assim considerada bloqueadora de canais de cálcio [61]. Os canais de cálcio são seu
sítio de ação, em que eles se localizam na superfície de todas as células e principalmente, das
células musculares lisas e células do músculo cardíaco.
33
Figura 8 - Estrutura química da Nifedipina.
H3C
H
N
CH3
H3C O
O CH3
O
O
NO2
Fonte: OLIVEIRA (2013).
Este fármaco constitui um ácido fraco (pKa = 3,93) com massa molar de 346,33 Da e é
conhecido por sua fotosensibilidade e baixa solubilidade em água (≈ 10 µg mL-1 em água a
37°C) [62]. A maioria dos fármacos da classe das diidropiridinas apresenta propriedades
físicas e químicas semelhantes à NFD, tais como hidrofobicidade.
A NFD apresenta uma biodisponibilidade sistêmica limitada por via oral, pois sua
farmacodinâmica é complexa em decorrência de uma combinação dos efeitos enzimáticos ao
longo do trato gastrointestinal [22, 23]. Apesar de ser eficaz no alívio dos sintomas da
hipertensão grave, a concentração de NFD suficiente para atingir um efeito benéfico para o
coração pode causar efeitos colaterais indesejáveis, os quais incluem hipotensão pronunciada,
diarréia, hepatoxicidade, confusão mental e aumento na mortalidade em pacientes com
doenças coronárias [63]. Consequentemente, os efeitos colaterais são principalmente,
resultado de doses altas e excessivas ou de como o fármaco é solicitado para formulações
atuais.
Em decorrência disso, surge a ideia de veicular a NFD e outros fármacos que
apresentem o mesmo problema em sistemas estabilizados por tensoativos, tais como MIs e
MEs, para administração transdérmica. Alguns trabalhos têm mostrado resultados
satisfatórios, em virtude de uma maior permeação desse fármaco com relação ao aumento de
fluxo, uma maior solubilidade do mesmo e diminuição dos efeitos colaterais [22, 44, 58, 64,
65, 66].
Por isso, torna-se de extrema importância o conhecimento da interação existente entre
o fármaco e os sistemas aqui estudados (MIs e MEs) visando os possíveis estudos de
liberação. Todavia, para que o fármaco possa ser incorporado a tais sistemas, é necessário o
34
conhecimento de sua região de formação, a qual pode ser obtida a partir da construção de
diagramas de fases.
2.6
DIAGRAMA DE FASES
A construção do diagrama de fases é de fundamental importância para obtenção das
regiões de formação de sistemas micelares e microemulsionados. Sua interpretação retrata as
estruturas presentes, podendo-se escolher a região que considerar mais apropriada para o
fármaco ser incorporado. Os diagramas de fases ternários e pseudoternários são normalmente
produzidos em duas dimensões a partir de dados obtidos por titulação ou pela preparação de
um grande número de amostras de diferentes composições [67].
Estes diagramas são formados por um triângulo equilátero, em que os lados são
utilizados como eixos e estes representam os componentes do sistema. Na maioria das vezes,
a proporção de cada componente é exibida como porcentagem de peso total da formulação,
sendo que cada vértice corresponde a 100% do componente indicado [15]. A Figura 9
apresenta um triângulo equilátero em que cada lado (dividido em dez partes correspondentes à
composição centesimal de cada ponto) é composto por um dos componentes da mistura. Os
vértices do diagrama de fases (A, T, O) representam os componentes puros [25]. Para
determinar as concentrações de cada componente no ponto D, deve-se traçar sucessivamente
por este ponto as paralelas aos lados opostos aos vértices que representam 100% de cada
componente. Geralmente, o diagrama de fases que utiliza um triângulo equilátero com uma
mistura de três componentes é chamado de diagrama ternário. No entanto, no caso de MEs,
estes diagramas são chamados de pseudoternários, pois um dos vértices (normalmente T), que
representa
apenas
o
tensoativo,
passa
a
representar
a
mistura
binária
de
tensoativo/cotensoativo. Por isso, o diagrama é a representação da mistura de quatro
constituintes no triângulo equilátero [9, 25].
No interior do triângulo, regiões de MEs, MIs, cristais líquidos, emulsões ou separação
de fases (regiões de Winsor) são formadas, permitindo a visualização simultânea das
quantidades relativas de cada componente. Assim, os diagramas são como ferramentas
capazes de apontar as regiões em que ocorrem a formação de MIs e MEs e, através delas, os
pesquisadores podem selecionar as formulações de interesse apropriadas aos seus propósitos
[9]. Todavia, os diagramas de fases não determinam as propriedades físico-químicas desses
sistemas que são necessárias para o conhecimento de suas estruturas e da influência dos
35
componentes. Para isso, as formulações selecionadas são levadas a uma série de
caracterizações físico-químicas através de vários métodos.
Figura 9 - Representação esquemática de um triângulo equilátero em que cada lado é representado por um dos
componentes da mistura. O ponto D representa a concentração de 50% de A, 20% de O e 30% de T.
T
0
10
100
90
20
80
30
70
40
60
50
50
60
40
70
30
D
80
20
90
10
100
A
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
O
Fonte: OLIVEIRA (2013).
2.1
MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS
O conhecimento da dinâmica e estrutura de um sistema micelar e microemulsionado é
de fundamental importância e, em decorrência disso, diversas técnicas podem ser utilizadas
para este fim. Métodos como microscopia de luz polarizada (MLP) para averiguar a isotropia
do sistema [56], espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) [68] e espalhamento de
nêutrons a baixos ângulos (SANS) [69] para determinar o tamanho e a estrutura do sistema, e
ressonância magnética nuclear (RMN) para determinar a estrutura interna [70], têm sido
frequentemente usados. Além disso, métodos tais como comportamento reológico e
viscosidade [71], índice de refração, condutividade elétrica e potencial zeta, são
36
extremamente fundamentais para complementar o estudo estrutural, determinando o tipo de
MI e ME formada e sua caracterização físico-química [15].
2.1.1 Microscopia de Luz Polarizada (MLP)
Quando uma fonte de luz incide em um meio opticamente isotrópico, as propriedades
ópticas são as mesmas em todas as direções, ou seja, há apenas um único índice de refração.
Todavia, quando a luz se propaga em um meio anisotrópico independente do estado inicial de
polarização, a direção de oscilação do seu campo elétrico pode ser decomposta em duas
componentes denominadas como raio extraordinário (paralelo à direção do eixo óptico do
meio) e raio ordinário (perpendicular à direção do eixo óptico do meio). Estes por sua vez,
viajam com velocidades de propagação diferentes [72].
A MLP é uma técnica que permite averiguar a isotropia de um sistema e baseia-se em
um campo elétrico de raio luminoso polarizado que uma substância birrefringente pode
ocasionar. Este método permite classificar um sistema em isotrópico ou anisotrópico,
diferenciando microscopicamente os tipos de estruturas formadas. Os sistemas isotrópicos são
aqueles que não desviam luz sob o plano de luz polarizada e os anisotrópicos desviam luz sob
o plano de luz polarizada [73].
O microscópio de luz polarizada é um microscópio óptico comum, no qual o
polarizador, localizado junto ao condensador, orienta as ondas luminosas decorrentes da fonte
de luz em uma só direção, em um só plano. As modificações que um sistema birrefringente
provoca na direção da propagação da luz, em um equipamento desse tipo são realizadas
graças ao analisador, um segundo sistema de polarização que se encontra junto à ocular. O
máximo de luz é obtido quando o polarizador e analisador estão com eixos em paralelo e, ao
contrário, a luz extingue quando são perpendiculares [72, 73].
Para os sistemas que exibem estruturas anisotrópicas, imagens características do tipo
de fase formada são obtidas, por exemplo, estrias para fase hexagonal e cruzes de malta para
fases lamelares. No entanto, para sistemas com estruturas isotrópicas, como os micelares e
microemulsionados, por não desviarem a propagação da luz polarizada, são visualizados
como campo escuro [10].
37
2.1.2 Condutividade Elétrica
A condutividade elétrica é uma indicativa da facilidade com a qual o sistema é capaz
de conduzir corrente elétrica e é medida em Siemens por metro (S/m) no Sistema
Internacional de Unidades (SI). Ela é uma ferramenta sensível e frequentemente utilizada para
determinar, por exemplo, se um sistema microemulsionado possui domínio contínuo aquoso
ou oleoso [15, 55, 56, 74].
A condutividade de um sistema microemulsionado pode variar drasticamente
dependendo do tipo da ME (O/A, A/O ou bicontínua). MEs de O/A têm condutividade
próxima à do meio aquoso, ao contrário de MEs de A/O que apresentam valores de
condutividade muito baixos. Nas MEs bicontínuas, a condutividade também é
significativamente alta [12]. Logo, a condutividade das MEs pode ser muito importante na
determinação do tipo de microestrutura formada nestes sistemas.
2.1.3 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
O DLS consiste em uma técnica importante para a medição do tamanho das partículas,
com tamanho menor que 1 μm. O feixe de luz laser que incide nas partículas, passa por um
processo de espalhamento que varia em uma taxa dependente da velocidade de difusão da
partícula, sendo detectado em um determinado ângulo. Por sua vez, esta velocidade é
governada pelo seu tamanho, oferecendo informações diretas sobre o movimento translacional
das partículas e possibilitando o cálculo do tamanho destas através de relações empíricas
adequadas [75].
O método consiste em medir a função de auto-correlação da intensidade da luz
espalhada. Como para uma partícula essa função decai exponencialmente com o tempo, fica
visível que, para um conjunto de partículas, a função é uma soma de exponenciais. O valor
máximo desta função representa o coeficiente de difusão médio da partícula, o qual
corresponde à soma do espalhamento de luz dos elementos de volume. Comumente esses
valores são obtidos da diluição infinita da amostra, ou seja, mede-se o coeficiente de difusão
em função da concentração de partículas e extrapolam-se esses valores para a concentração
zero [7]. A partir do coeficiente de difusão médio, o raio hidrodinâmico médio (Rh) das
partículas micelares ou microemulsionadas é calculado pela equação de Stokes-Einstein
38
(Equação 10), em que KB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η é a
viscosidade do meio dispersante e D é o coeficiente de difusão das partículas [25].
Caso o sistema a ser analisado esteja em elevadas concentrações, a interpolação tornase dificultada em razão das interações interpartículas. Desta forma, se faz necessário realizar
uma diluição para facilitar a sua identificação [28] .
2.1.4 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS)
A técnica de SAXS é uma ferramenta muito útil no estudo de partículas coloidais,
como MIs e MEs, já que possibilita a medida do tamanho, da forma e de possíveis interações
entre as partículas espalhadoras [76].
Para um sistema de partículas idênticas com baixa polidispersividade, anisometria e
esfericamente simétrico, tais como sistemas micelares e microemulsionados, a intensidade de
espalhamento I(q) pode ser escrita da seguinte forma:
⟨
⟩{
∫
}
sendo k uma constante relacionada ao arranjo experimental e np a densidade numérica das
gotículas. O fator de forma da gotícula espalhadora é dado pela seguinte equação:
⟨
⟩
em que F(q) é a amplitude do espalhamento e q é o módulo do vetor de espalhamento
(
, λ é o comprimento de onda da radiação incidente e 2θ é o ângulo de
espalhamento). Enquanto que o fator estrutura é dado por:
∫
que é a função de interferência entre as gotículas espalhadoras, sendo g(r) a função de
distribuição radial, relacionada à probabilidade de se encontrar uma gotícula distante de r do
centro de uma gotícula de referência [77, 78, 79].
Para sistemas não interagentes (ou seja, S(q) ≈ 1), em uma curva de SAXS pode ser
obtido o valor do raio de giro (Rg) da gotícula em estudo. Segundo a lei de Guinier, a curva
39
de espalhamento para q → 0 pode ser aproximada por uma função exponencial, de tal forma
que:
onde I(0) é a intensidade extrapolada à q = 0. Esta relação torna-se válida na região em que
qRg ≤ 1 e logo, I(0) pode ser escrita como:
sendo que ∆ρ e V representam o contraste de densidade eletrônica da partícula em relação ao
meio e o volume da gotícula espalhadora, respectivamente [77].
A intensidade de espalhamento também pode ser escrita através da função de
distribuição de distâncias, p(r). Esta função está relacionada com a probabilidade de se
encontrar dois centros espalhadores distantes de r dentro da gotícula em estudo. Esta função
pode ser dita como [77, 78, 79]:
∫
∫
Através de p(r) é possível também obter o valor do raio de giro (Rg) da gotícula de
acordo com a relação:
∫
∫
Com isso, a partir dessas equações e de modelos que se adequem aos sistemas em
estudo é possível determinar parâmetros estruturais como o raio de giro (Rg) e a distância
entre as gotículas.
2.1.5 Tensão Superficial
O termo superfície indica uma interface onde uma fase é liquida e a outra é gasosa,
geralmente o ar. As moléculas na superfície de um líquido estão sujeitas a fortes forças de
atração das moléculas interiores. A resultante dessas forças atua de tal maneira que a
superfície líquida seja a menor possível. A grandeza desta força, atuando perpendicularmente
(por unidade de comprimento) ao plano na superfície é dita tensão superficial. Sua unidade no
SI é de mN.m-1 [80, 81].
40
A tensão superficial da maioria dos líquidos é afetada pela presença de moléculas de
tensoativos provocando a sua diminuição significativa mesmo em baixas concentrações. Até
que a CMC seja alcançada, à medida que a concentração do tensoativo aumenta, a tensão
superficial do líquido tende a diminuir [81]. Isso pode ser verificado pela Figura 10 que
mostra um esquema do comportamento do tensoativo na superfície do líquido e no meio da
solução, em função da tensão superficial [80].
Figura 10 - Esquema do comportamento do tensoativo entre as fases fluida e superficial, em função da tensão
superficial, indicando a CMC.
Fonte: SANTOS et al. (2007) [80].
Com isso, a partir da tensiometria busca-se verificar, por exemplo, o quanto o
tensoativo conseguiu baixar a tensão superficial de um líquido. Existem vários métodos para
a determinação de tensão superficial que podem ser estáticos ou dinâmicos. O método
utilizado neste trabalho é o da placa de Wilhelmy, que se caracteriza por ser dinâmico.
Tendo em vista todos estes pontos, o presente trabalho propõe um estudo da formação
de sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo essencial de Critus sinensis (L.)
Osbeck) que possam ser utilizados como veículo para um fármaco modelo (NFD) buscando
verificar a influência das fases e do fármaco na estrutura desses sistemas através de seu
41
desenvolvimento e caracterização físico-química. Além disso, busca estudar a interação da
NFD com as MIs e MEs para entender os mecanismos de liberação transdérmica deste
fármaco.
42
3
OBJETIVOS
3.1
OBJETIVO GERAL
Obter e caracterizar sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo essencial
de Citrus sinensis (L.) Osbeck) para incorporação da NFD, avaliar a influência das fases e do
fármaco na estrutura dos sistemas e estudar a interação da NFD com as MIs e MEs para
entender os mecanismos de liberação transdérmica deste fármaco.
3.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo essencial de Citrus
sinensis (L.) Osbeck como fase oleosa);

Caracterizar a estrutura das MIs e MEs obtidas;

Avaliar a incorporação da NFD nos sistemas obtidos;

Avaliar a influência das fases e do fármaco na estrutura dos sistemas obtidos;

Avaliar a interação dos sistemas com o estrato córneo (EC) por espectrofotometria de
absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR);

Estudar a interação da NFD com as MIs e MEs por meio de ajustes de modelos
estruturais das curvas de SAXS e estudos complementares.
43
4
MATERIAL E MÉTODOS
4.1
REAGENTES E SOLVENTES

Cascas de Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja pera);

Nifedipina (HENRIFARMA®);

Água ultra pura Milli-Q;

Óleo essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck;

Tween® 80 [Monooleato de Polioxietileno (20) Sorbitano, SYNTH®];

Álcool etílico (Etanol, 99,5%, NEON®);

Fosfato de potássio monobásico anidro (KH2PO4, NEON®);

Hidróxido de sódio micropérola (NaOH, SYNTH®);

Álcool isopropílico (Isopropanol, NEON®);

Clorofórmio (CHCl3, SYNTH®);

Acetato de etila (NEON®);

Álcool octílico (Octanol, NEON®);

Álcool metílico (Metanol, NEON®).
4.2
EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS

Estufa;

Moinho de facas;

Aparelho extrator do tipo Clevenger modificado;

Agitadores magnéticos (GOSTIRRER®, MARTE® e FISATOM®);

Barras magnéticas ou peixinhos;

Pipetas graduadas de 1,0 a 10,0 mL;

Micropipetas;

Pipetas de Pasteur;

Pipetadores;

Béqueres;

Balões volumétricos;
44
4.3

Bastões de vidro;

Provetas;

Espátulas;

Balança analítica (BIOPRECISA® FA-2104N);

Condutivímetro (ION® CON500);

Zetasizer Nano ZS (MALVERN®);

pHmetro (PHTEK®);

Microscópio de luz polarizada (OLYMPUS® BX51);

Tensiômetro Attension (SIGMA 700);

Espectrofotômetro Perkin-Elmer FTIR (System Spectrum BX);

Espectrofotômetro UV-vis (UV-1800 da SHIMADZU®);

Cromatógrafo líquido de alta eficiência com detecção no ultravioleta (Perkin Elmer).
EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL
O óleo essencial foi obtido das cascas de Citrus sinensis (laranja pêra) em único lote,
as quais foram secas em uma estufa de ar circulante, à temperatura de 40°C por um período de
72 horas. Após este período, as cascas foram trituradas em um moinho de facas e levadas a
um aparelho extrator do tipo Clevenger modificado por ± 3 h para obtenção do OECS (Figura
11). Resíduos de água foram removidos com a adição de sulfato de sódio [82].
Figura 11 - Esquema de extração de OECS.
Fonte: OLIVEIRA (2013).
45
O óleo foi acondicionado em frasco âmbar e armazenado sob refrigeração. As laranjas
foram adquiridas no Centro de Abastecimento de Alimentos (CEASA) em Aracaju-SE, sendo
procedentes do Município de Lagarto.
4.4
OBTENÇÃO DAS REGIÕES DE FORMAÇÃO DE MICELAS E
MICROEMULSÕES ATRAVÉS DE DIAGRAMAS DE FASES
As regiões de MIs e MEs foram determinadas através da construção de diagramas de
fase ternários e pseudoternários, respectivamente. Para isso, utilizou-se o método de
preparação de um grande número de amostras de diferentes composições.
Para os sistemas micelares, o diagrama de fases ternário foi composto pelos seguintes
componentes: Tween 80 como tensoativo não iônico, álcool etílico absoluto como
cotensoativo (álcool de cadeia curta) e tampão fosfato pH 5,0 como fase aquosa, buscando-se
o ajuste dos sistemas aqui estudados ao pH da pele para uma possível administração
transdérmica.
Para iniciar a construção do diagrama, uma proporção específica de Tween 80 e etanol
foi misturada por agitação magnética à temperatura ambiente nas seguintes proporções de
cotensoativo e tensoativo: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 e deixada sob agitação
durante 20 minutos. Estas proporções foram denominadas de ‘ensaios’ que variaram de 1 a 9.
Para cada um destes ensaios, foram criadas 9 formulações diferentes a fim de adicionar a fase
aquosa em proporções variadas de Tween 80/etanol e tampão fosfato pH 5,0. Após a adição
da fase aquosa, as misturas foram homogeneizadas em agitador magnético por 5 minutos a
temperatura ambiente. As tabelas 1 a 9 mostram as 81 formulações que foram preparadas e a
quantidade em volume utilizada de cada um dos componentes de acordo com o que foi
descrito anteriormente.
46
Tabela 1 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 1.
Ensaio 1
[1:9]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Tween 80
(mL)
8,1
7,2
6,3
5,4
4,5
3,6
2,7
1,8
0,9
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Tabela 2 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 2.
Ensaio 2
[2:8]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Tween 80
(mL)
7,2
6,4
5,6
4,8
4,0
3,2
2,4
1,6
0,8
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Tabela 3 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 3.
Ensaio 3
[3:7]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
Tween 80
(mL)
6,3
5,6
4,9
4,2
3,5
2,8
2,1
1,4
0,7
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
47
Tabela 4 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 4.
Ensaio 4
[4:6]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
Tween 80
(mL)
5,4
4,8
4,2
3,6
3,0
2,4
1,8
1,2
0,6
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Tabela 5 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 5.
Ensaio 5
[5:5]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Tween 80
(mL)
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Tabela 6 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 6.
Ensaio 6
[6:4]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
5,4
4,8
4,2
3,6
3,0
2,4
1,8
1,2
0,6
Tween 80
(mL)
3,6
3,2
2,8
2,4
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
48
Tabela 7 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 7.
Ensaio 7
[7:3]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
6,3
5,6
4,9
4,2
3,5
2,8
2,1
1,4
0,7
Tween 80
(mL)
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Tabela 8 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 8.
Ensaio 8
[8:2]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
7,2
6,4
5,6
4,8
4,0
3,2
2,4
1,6
0,8
Tween 80
(mL)
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Tabela 9 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações
do Ensaio 9.
Ensaio 9
[9:1]
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Etanol
(mL)
8,1
7,2
6,3
5,4
4,5
3,6
2,7
1,8
0,9
Tween 80
(mL)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Tampão Fosfato pH 5,0
(mL)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
Para os sistemas microemulsionados, o diagrama de fases pseudoternário foi composto
pelos mesmos componentes dos sistemas micelares, só que agora com a adição de uma fase
oleosa, o OECS. Inicialmente, Tween 80 e etanol foram combinados na razão fixa de 1:1,
49
misturados e deixados em agitador magnético durante o período de 12 horas. Na construção
do diagrama, uma proporção específica de Tween 80/etanol e OECS foi misturada por
agitação magnética à temperatura ambiente nas seguintes proporções de fase oleosa e
tensoativo/cotensoativo: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 e deixada sob agitação
durante 20 minutos. Como falado anteriormente para os sistemas micelares, estas proporções
foram denominadas de ‘ensaios’ que variaram de 1 a 9. Para cada um destes ensaios, foram
criadas 9 formulações diferentes a fim de adicionar a fase aquosa em proporções variadas de
Tween 80/etanol/OECS e tampão fosfato pH 5,0. Após a adição da fase aquosa, as misturas
foram homogeneizadas em agitador magnético por 5 minutos a temperatura ambiente.
Todas as formulações preparadas foram deixadas em repouso e as mudanças do
aspecto visual puderam ser observadas depois de 5 dias. Considerando as proporções dos
componentes, os pontos obtidos foram plotados no diagrama de fases, utilizando o software
SigmaPlot 11,0. Com isso, foi possível observar as possíveis transições dos sistemas
opticamente transparentes ou translúcidos líquidos (MIs e MEs) para sistemas opacos líquidos
ou semissólidos (emulsões), dispersões opacas ou ainda separação de fases.
4.5
SELEÇÃO DAS FORMULAÇÕES
Após a construção dos diagramas de fases, as MIs e MEs de escolha para a
caracterização físico-química e incorporação da NFD foram obtidas a partir de uma
determinada região do diagrama ternário e pseudoternário, respectivamente. A concentração
limite (0,15 mg/mL) foi selecionada e incorporada de forma ativa nas formulações escolhidas
durante a preparação, logo, foi necessário preparar novamente as MIs e MEs de escolha. É
importante ressaltar que estes sistemas micelares e microemulsionados foram preparados 5
dias antes dos testes para garantir a estabilização termodinâmica das gotículas em temperatura
ambiente.
50
4.6
CARATERIZAÇÃO DAS MICELAS E MICROEMULSÕES SELECIONADAS
4.6.1 Microscopia de Luz Polarizada (MLP)
A identificação de isotropia nos sistemas selecionados foi realizada por um
microscópio de luz polarizada (Olympus BX51), câmera digital (Evolution LC Color) e
software analisador de imagem (Pixel link) do Departamento de Física (DFI) da Universidade
Federal de Sergipe (UFS) em São Cristóvão-SE, depois de percorrido o tempo mínimo de 5
dias para o equilíbrio dos sistemas.
4.6.2 Determinação do pH
O pH das formulações selecionadas na presença e ausência do fármaco foi avaliado
utilizando um potenciômetro digital com eletrodo de vidro e sensor de temperatura da marca
PHTEK PHS-3B do Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico (LADEF) da UFS em
São Cristóvão-SE, previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 a uma
temperatura de 25 ± 0,5ºC.
4.6.3 Condutividade elétrica
Buscando comprovar o tipo de MI e ME formada, a condutividade elétrica dos
sistemas em estudo foi medida em um condutivímetro (ION CON500 Portable Conductivity
Meter), em temperatura de 25ºC. Foi medida a condutividade elétrica das amostras sem e com
fármaco. Estas medidas foram realizadas no LADEF da UFS em São Cristóvão-SE.
4.6.4 Tamanho e distribuição de tamanho das gotículas
Os sistemas isotrópicos selecionados foram submetidos sem diluições a medidas de
DLS utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano system ZS (Malvern-UK). Estas medidas
foram realizadas no DFI da UFS em São Cristóvão-SE. As amostras na presença e ausência
de fármaco foram colocadas em cela de vidro de 1 cm de caminho óptico e as medições feitas
à temperatura ambiente (25ºC). O equipamento realiza em média 10 determinações para cada
51
análise em triplicata. O diâmetro foi calculado por função de autocorrelação da intensidade
espalhada pelas gotículas.
O índice de polidispersividade (IPD) é uma medida da homogeneidade da dispersão
em relação ao diâmetro e varia de 0 a 1. Valores próximos de 0 indicam homogeneidade da
dispersão, enquanto valores que se aproximam de 1 indicam alta heterogeneidade.
4.6.5 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS)
As medidas foram realizadas na estação de medidas D11-A do Laboratório Nacional
de Luz Síncroton (LNLS) em Campinas-SP, cuja óptica pode ser apreciada na Figura 12. Ele
é equipado com um monocromador de silício (111), comprimento de onda de 1,499 Ǻ, uma
câmara de ionização, um detector vertical e um analisador multicanal para registrar a
intensidade do espalhamento. O espalhamento parasita (espalhamento de partículas existentes no
sistema sem amostra) do ar e das fendas foi subtraído da intensidade total da amostra. A
intensidade de espalhamento I(q) em função do módulo do vetor de espalhamento q de todas as
formulações na ausência e presença do fármaco foi expressa em unidades arbitrárias.
Figura 12 - Esquematização da linha de SAXS (D11A) do LNLS de Campinas.
Fonte: BARBOSA (2008) [76].
4.6.6 Determinação da Tensão Superficial
As medidas de tensão superficial das amostras na ausência e presença de fármaco
foram determinadas através do Tensiômetro Attension (SIGMA 700) do Laboratório de
52
Biotecnologia Ambiental (LABAM) da UFS em São Cristóvão-SE, à temperatura ambiente.
Durante a medição, a placa de Wilhelmy é submersa nas MIs e MEs e o tensiômetro mede a
força de empuxo sobre a placa, calculando assim, a tensão superficial através do tamanho da
placa conhecida [83].
4.7
ESTUDOS DA INTERAÇÃO DA NIFEDIPINA COM AS MICELAS E AS
MICROEMULSÕES
4.7.1 Estudos Computacionais
Para a avaliação das dimensões moleculares da NFD foi realizado um estudo de
modelagem deste fármaco empregando o programa computacional CAChe WorkSytem Pro
Versão 6.01. (CAChe) [84], sendo realizado ainda uma análise conformacional acompanhada
de otimização da geometria molecular pelo uso do método quântico semi-empírico AM1
(Austin Model 1) [85].
4.7.2 Análises no Ultravioleta (UV)
Análises de espectrofotometria de absorção na região do UV e visível foram realizadas
com o intuito de avaliar o ambiente químico da NFD nas MIs e MEs de modo a vislumbrar a
provável incorporação desta molécula por estas estruturas. Foram analisadas amostras de
NFD em tampão fosfato pH 5,0, MI, ME e alguns solventes, de diferentes polaridades, na
região do UV, utilizando um espectrofotômetro UV-vis (UV-1800 da SHIMADZU®) para
aquisição dos dados, localizado no laboratório de pesquisa do Campus Prof. Alberto Carvalho
da UFS em Itabaiana-SE.
4.7.3 Determinação do coeficiente de partição
O coeficiente de partição da NFD em octanol/água foi determinado a partir da
utilização de cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) com detecção no ultravioleta
composto por uma bomba Perkin Elmer e detector UV/VIS Perkin Elmer configurado para o
comprimento de onda de 350 nm.
53
A separação cromatográfica isocrática foi realizada com uma coluna em fase reversa
RP-18 (Agilent, USA) com pré-coluna RP-18 4 mm e tamanho de partícula de 5 µm, a
temperatura ambiente. A padronização analítica utilizada para determinação da NFD por
CLAE foi baseada no método proposto por Kamiya et al. (2008) [86]. A fase móvel foi
composta por metanol e água (80:20) sendo filtrada, sonicada e bombeada a um fluxo de 0,8
mL min-1. O volume de injeção foi de 20 L. As determinações foram realizadas em
triplicatas. As medidas foram realizadas no LADEF da UFS em São Cristóvão-SE.
4.7.4 Modelamento das curvas de SAXS das MIs e MEs
Os agregados micelares e microemulsionados são caracterizados por possuírem uma
densidade eletrônica não homogênea (Figura 13). A grande diferença entre MIs e MEs é que o
segundo é composto também pela adição da fase oleosa, junto aos demais componentes. Estes
agregados são compostos por um interior hidrofóbico, cuja densidade eletrônica (ρpar = 0.275
e/Å3) é menor que a da água (ρágua = 0.334 e/Å3) e que pode ser apenas composta de
tensoativos (no caso das MIs) ou de uma mistura de tensoativo e óleo (no caso das MEs) além
de uma camada polar (hidrofílica), cuja densidade eletrônica é maior que a densidade
eletrônica da água. A figura abaixo mostra uma esquematização geral da estrutura micelar.
Figura 13 - Esquematização da estrutura de um agregado micelar, o interior hidrofóbico e as cabeças polares
estão em cinza e vermelho, respectivamente.
Fonte: BARBOSA (2008) [76].
Neste trabalho foi utilizado o modelo de elipsoide prolato de revolução para o fator de
forma de MIs e MEs em solução. Abaixo segue uma breve descrição deste modelo.
A princípio, vamos considerar um elipsoide prolato, com densidade eletrônica
constante (ρ1) e contraste de densidade eletrônica em relação ao meio (que em nosso caso será
a água)  (= ρ1 - ρágua); os três semi-eixos do elipsoide são definidos por R, R e .R ( =
razão axial, também chamado de anisometria). Este elipsoide pode ser transformado em uma
esfera, de volume equivalente, cujo raio efetivo Ref é dado por [87]:
54

Ref  R cos 2   2 sen 2 

1
2
(18)
sendo  o ângulo formado entre o eixo longo do elipsoide e a direção do vetor de
espalhamento q.
Se o elipsoide não tem orientação preferencial, obtém-se o fator de forma através da
média de todos os possíveis valores de , tal que [77]:
(19)
onde 1() = (cos2 + 2sen2)1/2 e:
(20)
Entretanto, como dito anteriormente, MIs e MEs são partículas heterogêneas com
respeito à densidade eletrônica, portanto, usaremos o modelo de dois níveis de densidade
eletrônica (Figura 14) para modelarmos o fator de forma de uma MI ou ME elipsoidal em
solução [87].
Figura 14 - Esquematização do modelo micelar ou microemulsionado tipo elipsoidal. Os parâmetros de ajuste
das curvas de SAXS para este elipsoide são: Rpar (raio parafínico), νRpar (semi-eixo maior do elipsoide), assim
como σpol e ρpol (espessura e densidade eletrônica da camada polar, respectivamente), ρágua, e ρpar, são as
densidades eletrônicas da água e da região parafínica, respectivamente, mantidas constantes e iguais a 0.334 e
0.275 e/Å3.
água
pol
par
Rpar
R
Rpar
par
pol
Apolar/hidrofóbica
Apolar/hidrofóbica
Polar/hidrofílica
Polar/hidrofílica
Solução aquosa
Fonte: BARBOSA (2008) [ 76].
Assim, este fator de forma pode ser escrito como:
55
(21)
1 ( )  (cos    sen  )
2
onde
2
2
1
2
1
2
 2 ( )  (cos 2    tot
sen 2 ) 2
e tot = (Rpar +pol)/Rpol é a razão axial da partícula inteira, onde Rpol = Rpar + pol; pol é a
espessura da segunda camada de densidade eletrônica pol.
Durante a execução deste trabalho, ficou evidenciado que alguns sistemas
apresentaram interações entre as partículas espalhadoras. A função de interferência S(q)
depende do potencial de interação entre as partículas e de suas posições relativas, via função
de distribuição radial g(r) (Equação 11). É bem conhecido que uma transformada de Fourier
conecta as funções de interferência S(q) e a função de correlação total h(r) (= g(r) - 1) [88]. Se
duas partículas não podem se interpenetrar, nenhuma partícula pode ser encontrada mais perto
que a distância máxima de aproximação D (= diâmetro médio da partícula), tal que g(r < D) =
0. No outro extremo, para distâncias muito maiores que o diâmetro médio da partícula, não
deve existir interação entre as mesmas, já que os potenciais de interação de longo alcance são
proporcionais a r-1. Assim, a densidade de partículas longe da partícula de referência é
indistinguível da densidade média das partículas e g(r  ) = 1.
O cálculo utilizado para a função de correlação total, h(r), é o mesmo da teoria
fundamental de líquidos [88]: resolve-se a equação de Ornstein-Zernicke (OZ) [89] (Equação
22), impondo algumas relações de fechamento (Percus-Yevick (PY), Aproximação de Esfera
Média (MSA), “Hipperneted Chain” (HNC), “Random Phase Approximation” (RPA), dentre
outras) [90]. A equação de OZ pode ser escrita como [88, 89]:
h(r12 )  c(r12 )  n p  c(r13 )h(r23 )dr3
(22)
onde h(rij) é função de correlação total da partícula i à partícula j, c(rij) é a correlação direta da
partícula i com a partícula j (também chamado de correlação de pares) e rij é a distância da
partícula i à partícula j.
As relações de fechamento nada mais são do que funções matemáticas que
correlacionam a função de correlação de pares, c(r), com a função de distribuição radial, g(r)
a fim de que a equação de OZ tenha uma solução. Dentre todos as metodologias citadas para
56
resolver (analiticamente ou não) a equação de OZ, destaca-se a relação de fechamento MSA,
desenvolvida por Hayter e Penfold [91] e Hansen e Hayter [92]. A relação de fechamento
MSA vem sendo amplamente utilizada por outros grupos de pesquisa ao redor do mundo [93,
94, 95].
Esta relação de fechamento supõe que as MIs ou MEs podem ser representadas como
esferas ”duras” efetivas (com volume equivalente e diâmetro ef = 2Ref) em solução, sendo
que o potencial mais comumente adotado para a interação de MIs ou MEs em solução é o
termo repulsivo do potencial DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) [96], uma vez
que não existem evidências de um termo atrativo em sistemas micelares ou
microemulsionados a baixas concentrações. O termo repulsivo deste potencial pode ser escrito
como:
(23)
k DB
onde
2
8 e2 N A I
 3
10  K BT , sendo Z a carga na superfície da MI ou ME, e a carga fundamental do
elétron,  a constante dielétrica do meio, NA o número de Avogadro, I a força iônica, KB a
constante de Boltzmann e T a temperatura. Neste modelo, kDB é o inverso do comprimento de
Debye, que descreve o intervalo de atuação do potencial repulsivo. No caso de MIs e MEs em
solução, é interessante substituir Z por αNag (Nag = Número de agregação). Deste modo,  está
relacionado com a porcentagem de cargas na superfície da MI ou ME. É importante salientar
que α, por ser um parâmetro de ajuste, pode suprir algumas deficiências do potencial adotado.
Assim, ele não pode ser interpretado diretamente como o coeficiente de ionização das MIs ou
MEs, mas sim como um valor efetivo. É interessante mencionar aqui que a força iônica foi
calculada utilizando-se as constantes de dissociação dos sais que compõem o tampão, por
isso, o valor da força iônica pode ser ligeiramente diferente do valor nominal.
Desta forma o ajuste de modelos por SAXS permite a obtenção de informações
quantitativas sobre a nanoestrutura dos sistemas micelares e microemulsionadas e quando
fármacos são incorporados permite ainda conhecer as suas interações com o sistema. Neste
trabalho foram estudadas as amostras mais diluídas de MI e ME preparadas e mantidas em
repouso por cerca de 6 meses para garantir a presença dos agregados coloidais mais estáveis e
minimizar os efeitos de interferência entre eles, diminuindo a contribuição de picos de
57
correlação à baixos valores de q. Estudos qualitativos por SAXS apenas para confirmar a
formação das MIs e MEs também foram realizados.
4.8
ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES EM
MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR
4.8.1 Preparação das amostras
A pele de cobra foi cortada em pequenos discos circulares com um diâmetro
aproximado de 3 cm e submersa em água destilada durante 12 h. Após esse período foi
retirado o excesso de água destilada com o auxílio de papel filtro e inserida as peles em
soluções contendo as MIs e as MEs selecionadas por um período de 12h. Logo depois, o
excesso de amostra contido na pele foi retirado com água destilada e com papel filtro [97]. As
peles hidratadas com água destilada foram utilizadas como controle.
4.8.2 Espectrofotometria de Absorção na região do Infravermelho com Transformada de
Fourier e modo de atenuação de refletância (FTIR-ATR)
Os espectros de FTIR-ATR de transmissão foram obtidos utilizando um
espectrofotômetro Perkin-Elmer FTIR System Spectrum BX do DFI da UFS em São
Cristóvão-SE. As amostras foram caracterizadas no FTIR-ATR com resolução 4 cm-1, 16
varreduras, faixa de frequência de 4000-700 cm-1, em temperatura ambiente [97].
4.9
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores foram expressos como a média ± desvio padrão (DP) e, quando necessário,
foi utilizada a análise de variância “one-way” (ANOVA) seguida do pós-teste de Tukey para
avaliar a significância das diferenças entre as médias.
58
5
5.1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
OBTENÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES
A relação entre o comportamento de fase de uma mistura e da sua composição pode
ser obtida com o auxílio de um diagrama de fases. O comportamento de fase dos sistemas
micelares que compreendem Tween 80, álcool etílico e tampão fosfato pH 5,0, pode ser
estudado com a ajuda de um diagrama de fases ternário. Já o comportamento de fase dos
sistemas microemulsionados que compreendem uma mistura de Tween 80 e álcool etílico na
razão fixa de 1:1, OECS e tampão fosfato pH 5,0, pode ser estudado com a ajuda de um
diagrama de fases pseudoternário [15]. Com isso, para determinar a faixa de formação de MIs
e MEs, dois diagramas de fases foram elaborados sendo um ternário (Figura 15) e outro
pseudoternário (Figura 16), respectivamente.
Figura 15 - Diagrama de fases ternário constituído por Tween 80 (T80), etanol (EtOH) e tampão fosfato pH 5,0
(TF). Toda a área do diagrama representa Micela (MI).
T80
0
100
10
90
20
80
30
70
40
60
50
50
MI
60
40
70
30
MI3 MI4
MI5
80
MI2
20
90
10
MI1
100
TF
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EtOH
59
Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternário constituído por mistura de Tween 80 e etanol (T80/EtOH), óleo
essencial de Citrus Sinensis (OECS) e tampão fosfato pH 5,0 (TF). As áreas delimitadas representam:
Microemulsão (ME), Emulsão (EM) e Separação de Fase (SF).
T80/EtOH
0
100
10
90
20
80
30
70
ME
40
60
50
50
60
40
70
ME3 ME4
80
ME5
TF
0
20
ME2
90
100
30
SF
10
EM
ME1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
OECS
Os dois diagramas construídos mostram as regiões comuns identificadas a partir de seu
aspecto visual, tais como: Micela (MI), Microemulsão (ME), Emulsão (EM) e Separação de
Fase (SF). A Figura 17 mostra o aspecto visual de cada um destes sistemas compostos por
Tween 80, álcool etílico, tampão fosfato pH 5,0 e OECS (nos sistemas que apresentam fase
oleosa). A região com predominância de sistemas líquidos homogêneos, translúcidos e de
baixa viscosidade é característica de MI e ME. A região EM corresponde aos sistemas com
aspecto leitoso que apresentam viscosidades baixas e altas dependendo da formulação. A
região SF compreende os sistemas que apresentam duas ou três fases separadas.
60
Figura 17 - Aspecto visual dos seguintes sistemas: MI fluida, MI gelatinosa, ME, EM e SF (da esquerda para
direita).
Na Figura 15, foi possível observar a formação de sistemas micelares em toda
extensão do diagrama de fases. É importante destacar que a região micelar vai desde MIs bem
fluidas até MIs muito viscosas que apresentam um perfil gelatinoso (Figura 17). Isso é
decorrente da grande quantidade de Tween 80 presente que acarreta um intumescimento da
MI [98].
Na Figura 16, foi observada a formação de três diferentes sistemas que correspondem
a ME, EM e SF. A região de ME foi obtida em baixas concentrações de fase oleosa (0-40%),
atingindo uma ampla gama de fase aquosa e da mistura de tensoativo/cotensoativo (0-100%).
No entanto, fica perceptível que a formação dos sistemas microemulsionados depende
diretamente da concentração da mistura de tensoativo/cotensoativo, pois nas regiões em que
há concentrações baixas e intermediárias não foi possível estabilizar a mistura dos
componentes e ocorreu a formação de EM ou SF. Com o aumento da concentração dessa
mistura, sistemas microemulsionados vão sendo formados em maior quantidade. Por isso, na
região de ME, em que as concentrações da mistura variam de 0-60%, sua formação tende a
diminuir. Assim, com a construção deste diagrama foram observadas transições de sistemas
microemulsionados ricos em fase oleosa para sistemas microemulsionados ricos em fase
aquosa.
Para avaliar a influência dos componentes na estrutura do sistema, foram selecionadas
5 formulações de MIs e 5 formulações de MEs para caracterização físico-química e
incorporação do fármaco modelo. Para as MEs, 3 destas formulações foram mantidas
constante a concentração da mistura de tensoativo/cotensoativo (Tween 80/Etanol) a 24% e as
61
outras 3 foram mantidas constante a concentração da fase oleosa (OECS) a 2%. Estas
composições foram escolhidas devido ao fato de se ter interesse nas regiões em que MEs do
tipo O/A pudessem ser obtidas (0-10% de fase oleosa e 20-50% de mistura) com a fase
interna hidrofóbica para solubilizar o fármaco.
Para efeito de comparação, 3 formulações com quantidade constante de tensoativo
(Tween 80) a 24% e outras 3 com quantidade constante de cotensoativo (etanol) a 2% foram
selecionadas. Destas formulações, espera-se obter MIs diretas, em que a fase interna também
é hidrofóbica. Todas essas formulações são representadas pelos pontos nos diagramas da
Figura 15 e 16 e suas respectivas composições estão apresentadas na Tabela 10.
Tabela 10 - Composição centesimal dos sistemas micelares e microemulsionados selecionados a partir dos
diagramas de fases.
Formulação
MI1
MI2
MI3
MI4
MI5
Formulação
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
MICELAS
Fase Aquosa
Cotensoativo
(% v/v)
(% v/v)
90
2
80
2
74
2
72
4
70
6
MICROEMULSÕES
Fase Aquosa
Fase Oleosa
(% v/v)
(% v/v)
90
2
80
2
74
2
72
4
70
6
Tensoativo
(% v/v)
8
18
24
24
24
Tensoativo/Cotensoativo
(% v/v)
8
18
24
24
24
Em relação ao aspecto macroscópico foi possível observar que tanto as MIs quanto as
MEs se mantiveram homogêneas, límpidas e translúcidas com o decorrer do tempo,
confirmando assim a estabilidade termodinâmica desses sistemas. Após a incorporação de
forma ativa de uma concentração fixa de NFD nestas formulações, os sistemas se mantiveram
com a mesma limpidez e transparência mostrando que a NFD não perturbou a estabilidade
termodinâmica dos sistemas micelares e microemulsionados.
62
5.2
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MICELAS E MICROEMULSÕES
SELECIONADAS
A Figura 18 mostra as fotomicrografias das formulações de MIs e MEs por MLP.
Estes sistemas foram visualizados como campo escuro, não desviando a propagação da luz e
sendo assim classificados como sistemas com estrutura isotrópica, os quais se apresentam
com as mesmas propriedades ópticas em todas as direções.
Figura 18 - Fotomicrografias das formulações MI3 (A) e ME3 (B) por MLP. A bolha é deixada para obter uma
maior visualização do campo escuro.
B
A
10 x
10 x
A Tabela 11 apresenta todos os valores de pH das formulações selecionadas. Na
ausência de NFD, os sistemas micelares apresentaram valores de pH que variam de 5,54 a
5,90, já os sistemas microemulsionados variam de 5,48 a 5,80. Na presença de NFD, os
valores de pH não mudaram muito, variando de 5,46 a 5,72 para as MIs e de 5,36 a 5,60 para
as MEs. Com isso, é possível perceber que o fármaco não influencia significativamente no pH
da formulação. Isso pode ser explicado pelo fato de a NFD não ser um ácido forte (pKa =
3,93) e se solubilizar facilmente em um meio pouco ácido, característico do sistema em
estudo. Além disso, estes resultados mostram que tanto as MIs quanto as MEs são apropriadas
para aplicação na pele, uma vez que a superfície da pele tem um pH de aproximadamente 4 a
5 e formulações aplicadas sobre ela devem possuir um pH entre 4 e 7 [99].
63
Tabela 11 - Valores de pH na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e MEs.
MICELAS
Formulação
MI1
MI2
MI3
MI4
MI5
Formulação
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
pH
Sem fármaco
5,54 ± 0,01
5,74 ± 0,01
5,90 ± 0,03
5,78 ± 0,01
5,83 ± 0,03
MICROEMULSÕES
Com fármaco
5,46 ± 0,03
5,66 ± 0,03
5,72 ± 0,03
5,55 ± 0,02
5,60 ± 0,02
pH
Sem fármaco
5,48 ± 0,01
5,71 ± 0,02
5,80 ± 0,01
5,80 ± 0,01
5,80 ± 0,01
Com fármaco
5,36 ± 0,01
5,60 ± 0,01
5,52 ± 0,01
5,55 ± 0,01
5,58 ± 0,03
média ± desvio padrão, n = 3
A Tabela 12 apresenta os valores de condutividade elétrica na ausência e presença de
fármaco para as formulações de MIs e MEs. A medida de condutividade é usada para
determinar o tipo de ME ou MI formada e estimar a fase predominante, resultante das
mudanças na composição ou na temperatura. Com isso, ela revela principalmente se uma fase
é aquosa ou oleosa ou ambas as fases são contínuas [74, 100].
Sistemas microemulsionados do tipo O/A e bicontínuos possuem valores de condutividade
elétrica relativamente elevados quando comparados aos sistemas microemulsionados do tipo
A/O [101].
Isso é confirmado para os valores de condutividade elétrica das formulações de MEs,
para as quais é verificado valores a partir de 3840 µS.cm-1 (Tabela 12) que diminuem com a
diminuição da quantidade de fase aquosa. Estes resultados sugerem que a fase oleosa é a fase
interna e a fase aquosa é a fase dispersante, característica de MEs do tipo O/A. O mesmo pode
ser verificado para os sistemas micelares que apresentam valores de condutividade elétrica
elevados e em faixas similares às formulações de MEs. Entretanto, por não terem um fase
oleosa característica, os resultados sugerem a formação de MIs diretas.
64
Tabela 12 - Valores de condutividade elétrica na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e
MEs.
Formulação
MI1
MI2
MI3
MI4
MI5
Formulação
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
MICELAS
Condutividade (µS.cm-1)
Sem fármaco
Com fármaco
3690
3250
2700
2510
2300
2040
2080
1882
1863
1778
MICROEMULSÕES
Condutividade (µS.cm-1)
Sem fármaco
Com fármaco
3840
3250
2640
1867
2160
2000
2100
1916
2080
2020
A Tabela 13 apresenta os valores de tamanho médio das gotículas das MIs e MEs
obtidos por DLS. Os valores mostram que, na ausência de fármaco, o tamanho das gotículas
diminui com o aumento da quantidade de tensoativo (MI1, MI2 e MI3) e da mistura de
tensoativo/cotensoativo (ME1, ME2 e ME3). Este resultado é esperado uma vez que as
cadeias de Tween 80 e etanol promovem um rearranjo do filme interfacial do sistema. À
medida que o número de moléculas desse tensoativo e cotensoativo aumenta por unidade de
área, elas começam a se comprimir, umas ao lado das outras, diminuindo a tensão superficial
na interface, levando a uma redução do tamanho das gotículas com o aumento espontâneo da
área interfacial do sistema [9].
A mesma diminuição do tamanho de gotícula foi observada conforme a quantidade de
cotensoativo aumentou para as MIs (MI3, MI4 e MI5). No entanto, esta diminuição não é
significativa, podendo ser devido a pequena variação na quantidade de etanol em relação à
quantidade de Tween 80.
Para as MEs, o aumento da quantidade de fase oleosa influenciou no tamanho das
gotículas promovendo o seu aumento, conforme observado para ME3, ME4 e ME5. Estes
resultados confirmam os obtidos pelo estudo de condutividade, sugerindo que a fase oleosa é
a fase interna, pois aumentando a quantidade de OECS aumenta o tamanho das gotículas.
Para os sistemas com o fármaco, apenas as MEs apresentaram um aumento no
tamanho das gotículas enquanto, para as MIs, a variação é pouco significativa. Para confirmar
estes resultados, os dados da Tabela 13 foram tratados estaticamente utilizando a ANOVA
65
seguida do pós-teste de Tukey (não mostrado). A partir deste tratamento foi possível concluir
que há uma diferença significativa (p < 0,05) para o tamanho de gotículas das MEs sem e com
fármaco, mas o mesmo não pode ser observado para MIs, sugerindo que a adição de NFD não
influenciou no seu tamanho das gotículas.
Outra importante informação que pode ser obtida a partir dos resultados da Tabela 13
é que os tamanhos das gotículas para os sistemas micelares em estudo (entre 2 e 7 nm) foram
menores do que para os sistemas microemulsionados (entre 6 e 10 nm) tanto na ausência
quanto na presença de NFD. Os valores de IPD demonstraram que todas as formulações de
MI e ME apresentam distribuição de tamanho menor do que 0,5 garantindo assim, a
homogeneidade dos sistemas.
Tabela 13 - Valores de tamanho de gotícula e IPD na ausência e presença de fármaco para as formulações de
MIs e MEs.
Formulação
MI1
MI2
MI3
MI4
MI5
Formulação
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
MICELAS
Tamanho (nm)
IPD
Sem fármaco
Com fármaco
Sem fármaco
Com fármaco
6,31 ± 0,17
6,53 ± 0,21
0,07 ± 0,01
0,10 ± 0,01
4,30 ± 0,35
4,85 ± 0,45
0,26 ± 0,01
0,18 ± 0,07
3,16 ± 0,26
3,28 ± 0,33
0,23 ± 0,02
0,37 ± 0,01
2,94 ± 0,42
2,96 ± 0,23
0,31 ± 0,09
0,34 ± 0,01
2,80 ± 0,37
3,36 ± 0,50
0,20 ± 0,03
0,32 ± 0,01
MICROEMULSÕES
Tamanho (nm)
IPD
Sem fármaco
Com fármaco
Sem fármaco
Com fármaco
7,41 ± 0,05
9,01 ± 0,46
0,26 ± 0,01
0,09 ± 0,05
7,02 ± 0,24
7,93 ± 0,40
0,26 ± 0,01
0,29 ± 0,03
6,19 ± 0,34
8,15 ± 0,58
0,27 ± 0,02
0,19 ± 0,02
6,72 ± 0,34
8,11 ± 0,42
0,25 ± 0,07
0,24 ± 0,11
7,73 ± 0,16
9,42 ± 0,40
0,26 ± 0,04
0,17 ± 0,03
média ± desvio padrão, n = 3
Informações qualitativas a respeito da influência dos componentes e da incorporação
do fármaco sobre a nanoestrutura das MIs e MEs foram obtidos pela técnica de SAXS. Nesta
técnica, o perfil de dispersão registrado em ângulos baixos e a aplicação de modelos
adequados permitem a obtenção de informações acerca do tamanho, forma e nanoestrutura de
sistemas tais como MIs e MEs [74].
A Figura 19 mostra as curvas de intensidade de espalhamento (I(q)) em função do
vetor de espalhamento (q) para as MIs mantendo a quantidade de cotensoativo constante (a) e
para as MEs mantendo a fase oleosa constante (b) na ausência de fármaco.
66
As curvas exibem um pico largo centrado em q, característico de sistemas micelares e
microemulsionados [14, 76]. Como se pode observar, o aumento da quantidade do tensoativo
promove um pequeno deslocamento dos picos para valores maiores de q tanto para as MIs
quanto para as MEs. Isso indica que, segundo a equação d = 2π/q (sendo d o diâmetro das
partículas espalhadoras), o tamanho de gotículas dos sistemas está diminuindo (Figura 19).
Estes resultados são confirmados com os de tamanho obtidos por DLS (Tabela 13). Para
valores menores de q (q  0) pode se observar a presença de um pico largo que pode ser
atribuído a contribuição de interferência ou interação entre as partículas espalhadoras (neste
caso as MIs).
Figura 19 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para (a) MIs
mantendo cotensoativo ( etanol) constante e (b) MEs mantendo fase oleosa – OECS – constante.
ME1
ME2
ME3
Intensidade (u. a)
Intensidade (u. a)
MI1
MI2
MI3
0,01
0,01
1E-3
1E-3
0,1
(a)
a
(b)
1
0,1
-1
-1
q (nm )
1
q (nm )
A Figura 20 mostra as curvas de I(q) em função de q para as MIs mantendo a
quantidade de tensoativo constante (a) e para
as MEs mantendo a mistura
tensoativo/cotensoativo constante (b) na ausência de fármaco.
Para os sistemas micelares, pode-se observar que os picos das curvas de SAXS não se
deslocam com o aumento da quantidade do cotensoativo (Figura 20(a)). Estes resultados
sugerem que o etanol não influenciou na nanoestrutura das MIs, confirmando os resultados de
tamanho de gotícula obtidos por DLS, aonde praticamente não foi observada a variação do
tamanho com o aumento da quantidade de etanol.
Perfil
de curvas
semelhantes das
MIs
foram
obtidas
para
os
sistemas
microemulsionados. Ao manter o conteúdo da mistura de tensoativo/cotensoativo constante, o
aumento do conteúdo da fase oleosa contribui para o deslocamento dos picos para valores de
67
q menores, o que indica que o tamanho das gotículas está aumentando (Figura 20(b)),
confirmando a influência do OECS no tamanho das gotículas de MEs também observados nos
resultados de tamanho da Tabela 13.
Figura 20 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para (a) MIs
mantendo tensoativo – Tween 80 – constante e (b) MEs mantendo a mistura de tensoativo/cotensoativo – Tween
80/Etanol – constante.
0,01
ME3
ME4
ME5
Intensidade (u. a)
Intensidade (u. a)
MI3
MI4
MI5
(b)
(a)
a
1E-3
0,01
1E-3
0,1
1
-1
q (nm )
0,1
1
-1
q (nm )
A influência da NFD na nanoestrutura dos sistemas micelares e microemulsionados
também foi estudada por SAXS. As Figuras 21 e 22 apresentam as curvas de I(q) em função
de q para as MIs e MEs, respectivamente.
Para os sistemas micelares (Figura 21) pode-se verificar que a presença do fármaco
não altera os perfis das curvas de espalhamento, pois elas apresentam a mesma forma e
intensidade. Este resultado sugere que a NFD não influencia na nanoestrutura das MIs. Para
os sistemas microemulsionados (Figura 22), os picos são deslocados para menores valores de
q indicando que a presença do fármaco aumenta o tamanho das gotículas. No entanto,
surpreendentemente, na ME5 ocorre o contrário, novos estudos serão realizados para
confirmar estes resultados.
Os resultados de SAXS confirmam as medidas de tamanho por DLS e sugerem que a
NFD, no caso das MEs, esteja incorporada na sua fase interna (oleosa), enquanto para as MIs,
devido a ausência de uma fase oleosa, não há interação do fármaco, uma vez que ele é
lipofílico. Este resultado também indica que os sistemas micelares, apesar de potenciais
sistemas permeadores, podem não ser um bom sistema de liberação de fármacos lipofílicos.
68
É interessante salientar novamente que, nas curvas de SAXS das Figuras 19 a 22, fica
visível um significante ‘ombro’ a baixos valores de q atribuído às interações entre as MIs (ou
entre as MEs), que gera uma função de interferência S(q). Este perfil de curva se apresenta
mais perceptível em sistemas recentes que não se encontram totalmente estabilizados.
Figura 21 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para os sistemas
micelares na ausência e presença de nifedipina (NFD).
MI1
MI1 (NFD)
Intensidade (u. a)
0,01
Intensidade (u. a)
MI2
MI2 (NFD)
1E-3
0,01
1E-3
0,1
1
0,1
1
-1
-1
q (nm )
q (nm )
MI4
MI4 (NFD)
Intensidade (u. a)
0,01
0,01
1E-3
1E-3
0,1
1
0,1
-1
1
q (nm )
-1
q (nm )
MI5
MI5 (NFD)
Intensidade (u. a)
Intensidade (u. a)
MI3
MI3 (NFD)
0,01
1E-3
0,1
1
-1
q (nm )
69
Figura 22 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para os sistemas
microemulsionados na ausência e presença de nifedipina (NFD).
ME2
ME2 (NFD)
Intensidade (u. a)
Intensidade (u. a)
ME1
ME1 (NFD)
0,01
1E-3
0,01
1E-3
0,1
1
0,1
-1
1
-1
q (nm )
q (nm )
ME4
ME4 (NFD)
Intensidade (u. a)
0,01
0,01
1E-3
1E-3
0,1
-1
1
0,1
1
-1
q (nm )
q (nm )
ME5
ME5 (NFD)
Intensidade (u.a)
Intensidade (u. a)
ME3
ME3 (NFD)
0,01
1E-3
0,1
-1
1
q (nm )
A Tabela 14 apresenta os valores de tensão superficial das formulações de MIs e MEs.
No geral, é possível perceber, tanto para os sistemas micelares quanto os microemulsionados,
uma diminuição significativa da tensão superficial à medida que aumenta a quantidade de
70
tensoativo ou da mistura de tensoativo/cotensoativo no sistema. Ao manter a concentração de
cotensoativo constante (MI1, MI2 e MI3), quando a concentração de tensoativo aumenta, a
tensão superficial diminui significativamente, corroborando com os resultados de tamanho das
gotículas (Tabela 13). O mesmo perfil é observado para as MEs ao manter a concentração de
fase oleosa constante e variar a concentração da mistura de tensoativo/cotensoativo (ME1,
ME2 e ME3).
Logo, pode-se sugerir que tanto os sistemas micelares quanto os microemulsionados
apresentaram tensões superficiais suficientemente baixas em relação ao seu controle (água
destilada), o qual apresentou uma tensão superficial de 71,14 ± 0,18. Isso é decorrente das
cadeias do Tween 80 (tensoativo) e do etanol (cotensoativo) que promovem um rearranjo do
filme interfacial como já explicado anteriormente.
Tabela 14 - Valores de tensão superficial na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e MEs.
Formulação
MI1
MI2
MI3
MI4
MI5
Formulação
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
MICELAS
Tensão Superficial (mN/m)
Sem fármaco
Com fármaco
35,08 ± 0,38
35,65 ± 0,39
34,04 ± 0,18
34,20 ± 0,12
33,16 ± 0,06
33,32 ± 0,10
33,09 ± 0,03
33,42 ± 0,10
32,41 ± 0,02
33,03 ± 0,05
MICROEMULSÕES
Tensão Superficial (mN/m)
Sem fármaco
Com fármaco
33,68 ± 0,54
32,06 ± 0,35
32,72 ± 0,19
31,53 ± 0,28
31,75 ± 0,21
30,89 ± 0,30
30, 78 ± 0,04
30,21 ± 0,18
29,32 ± 0,08
29,56 ± 0,23
média ± desvio padrão, n = 3
5.3
ESTUDOS DA INTERAÇÃO DA NIFEDIPINA COM AS MICELAS E AS
MICROEMULSÕES
Na tentativa de comprovar e entender melhor a localização da NFD nos sistemas
micelares e microemulsionados, estudos complementares tais como, estudos computacionais,
análises no UV e determinação do coeficiente de partição do fármaco em octanol/água foram
realizados.
71
Nos estudos computacionais, a estrutura da NFD foi construída no programa
computacional CAChe. Esta molécula teve sua geometria ajustada, incluindo um estudo
conformacional, empregando o método quântico semi-empírico AM1, com intuito de avaliar
as dimensões aproximadas desse fármaco. As dimensões finais avaliadas variam entre 5 a 12
Å de dimensões mínimas e máximas, respectivamente, mesmo após a realização de estudo
conformacional (Figura 23).
Figura 23 - Representação da estrutura molecular da NFD com suas dimensões aproximadas, destacadas em
diferentes orientações. A figura do fármaco e suas dimensões foi preparada usando o programa PyMOL (DeLano
Scientific, San Carlos, CA, http://www.pymol.org). As cores dos átomos representam: cinza (carbono), vermelho
(oxigênio) e azul (nitrogênio).
Nas análises no UV, foram realizadas medidas da NFD em tampão fosfato pH 5,0, MI
e ME, para a visualização dos espectros de absorção do fármaco e acompanhamento dos
deslocamentos dos comprimentos de onda máximos como parâmetro de avaliação do
ambiente químico ao seu redor. Foi possível observar que no tampão fosfato pH 5,0 (Figura
24(a)), o fármaco mostra uma significativa absorção, apresentando uma banda característica
em torno de 340 nm, o que viabiliza o uso desta técnica para este fim. No entanto, o perfil
característico da NFD não pode ser observado no sistema micelar e microemulsionado (Figura
24(b) e (c)), pois tanto a MI quanto a ME espalham fortemente a radiação nessa região.
72
Figura 24 - Espetros de absorção na região do UV da NFD no tampão fosfato pH 5,0 (a), na MI (b) e na ME (c).
Tampão Fosfato pH 5,0 + NFD
(a)
4
Absorbância (u. a)
0,10
0,05
0,00
200
MI + NFD
(b)
2
0,15
0
-2
-4
250
300
350
400
450
500
200
250
Comprimento de Onda (nm)
2
Absorbância (u. a)
Absorbância (u. a)
0,20
300
350
400
450
Comprimento de Onda (nm)
ME + NFD
(c)
0
-2
-4
200
250
300
350
400
450
500
Comprimento de Onda (nm)
Com isso, surgiu a ideia de avaliar os espectros de absorção da NFD em solventes de
diferentes polaridades para verificar o que acontece em cada um deles e tomá-los, se possível,
como parâmetros de polaridade para os sistemas. Inicialmente, foi construída uma escala de
oito solventes de polaridades relativas à água e capazes de solubilizar o fármaco. Destes oito
solventes, três foram descartados por espalharem na região do UV. A Figura 25 mostra os
espectros de absorção da NFD na região do UV em cinco solventes de diferentes polaridades.
500
73
Figura 25 - Espectros de absorção na região do UV da NFD em cinco solventes de polaridades diferentes.
Água + NFD
Etanol + NFD
Isopropanol + NFD
Clorofórmio + NFD
Acetato de Etila + NFD
Absorbância (u. a)
0,4
0,2
0,0
250
300
350
400
450
500
Comprimento de Onda (nm)
Na Tabela 15 estão as polaridades relativas e os valores aproximados do comprimento
de onda do pico de absorbância máxima para cada um dos solventes. É possível observar que,
à medida que a polaridade relativa diminui, ocorre um deslocamento do pico de absorbância
máxima para menores comprimentos de onda e que estes valores se mantêm os mesmos para
aqueles solventes que apresentam polaridades muito próximas. Este deslocamento
hipsocrômico ou deslocamento para o azul ocorre devido às diferenças do solvente. Se os
espectros de MI e ME não tivessem espalhado, esperava-se um deslocamento hipsocrômico
também para a NFD nas MIs e MEs e logo, poderíamos ter uma ideia em que escala de
polaridade dentre os solventes estudados estes sistemas se encontravam.
Tabela 15 - Polaridade relativa e valores do comprimento de onda do pico de absorbância máxima de cada um
solventes.
Solventes
Água
Etanol
Isopropanol
Clorofórmio
Acetato de Etila
* Extraída de Reichardt (2003) [102].
Polaridade Relativa*
1,000
0,654
0,546
0,259
0,228
λ (nm)
340
329
329
321
321
74
Na determinação do coeficiente de partição, a Tabela 16 mostra os valores do
coeficiente de partição (log P) da NFD em triplicata, que em média corresponde a 4,263 ±
0,024. Este valor indica que a concentração do fármaco em octanol é cerca de 18000 vezes
maior que em água, o que garante que a NFD é muito mais solúvel em solvente orgânico que
mimetiza a fase oleosa e reforça mais ainda a ideia de "preferência" desse fármaco pela fase
hidrofóbica.
Tabela 16 - Valores do coeficiente de partição da NFD em octanol/água realizados em triplicata.
Amostras
1
2
3
MÉDIA ± DP
log P
4,235
4,274
4,280
4,263 ± 0,024
Todos estes resultados reforçam a ideia de que o fármaco provavelmente se encontra
na fase interna das MEs (fase oleosa) e o mesmo não ocorre com as MIs como já previsto
anteriormente, mas não a comprovam como esperado, e portanto novos estudos deverão ser
realizados.
Visando obter informações estruturais quantitativas e avaliar o grau de interação do
fármaco nas MIs e MEs, novas medidas de SAXS foram realizadas para os sistemas
compostos por MI e ME com e sem NFD incorporada e as curvas analisadas mediante o
ajuste por modelos adequados. Para isto, foram selecionadas duas amostras com maior
quantidade de água na sua composição (MI1 e ME1 ambas com 90% de fase aquosa) e
mantidas sob repouso durante 6 meses para garantir a presença dos agregados mais estáveis
no meio. Estes procedimentos foram efetuados para minimizar os efeitos de interferência
causados pela interação entre as partículas espalhadoras e com isto diminuir a contribuição a
baixos valores de q, como visualizado anteriormente (Figura 19 a 22).
A Figura 26 mostra as curvas de SAXS com os melhores ajustes obtidos utilizando a
metodologia descrita anteriormente. Podemos observar que o ajuste do modelo está de acordo
com os dados experimentais principalmente para valores de q < 0,20 Å. Nesse estudo, foi
possível obter que a MI em ausência de NFD, tem as dimensões internas de: 16,39 Å, 16,39 Å
e 40,37 Å indicando uma forma de elipsoide prolato além da presença de uma camada polar
cujo comprimento é de 19,75 Å. É interessante mencionar que, em presença de NFD, esses
valores são levemente alterados para 17,43 Å, 17,43 Å e 41,67 Å, para as dimensões internas
e a cabeça polar diminui levemente para cerca de 18,37 Å. Essas informações indicam que o
75
fármaco altera de forma apenas marginal a estrutura da MI. Esse fato corrobora com dados
anteriores de que o fármaco interage pouco com a MI.
Figura 26 - Curvas de SAXS dos sistemas composto por MIs (A e C) e MEs (B e D) eu ausência (A e B) e
presença (C e D) de NFD. As linhas cheias indicam os melhores ajustes obtidos com o modelo descrito
anteriormente.
Considerando as MEs, foi obtido um resultado ligeiramente diverso. Nesse caso, em
ausência de fármaco, a estrutura pode ser analisada também como uma elipsoide prolato de
dimensões 14,79 Å, 14,79 Å e 33,97 Å, enquanto que a parte polar obtida dentro deste
modelo foi de 22,34 Å. Em presença de fármaco, ocorre uma maior alteração da estrutura das
MEs, passando para cerca de 19,79 Å, 19,79 Å e 43,93 Å e além disso, a espessura da cabeça
polar diminui para 19,54 Å. Todos os parâmetros de ajuste estão descritos na Tabela 17.
É importante perceber a diferença significante obtida em cada um dos sistemas
estudados. Obteve-se que as MEs são menores que as MIs em ausência do fármaco, ou seja,
para uma mesma concentração de tensoativo existe um maior número de MEs formados do
que de MIs. Este fato é muito importante pois está diretamente relacionado a concentração de
cada uma das espécies em solução. A concentração de MIs e MEs em solução é 4.9x10-4 e
6.5x10-4 mol/L, respectivamente (Tabela 17).
76
Tabela 17 - Parâmetros de ajuste das curvas de SAXS dos sistemas compostos por MIs e MEs em ausência e
presença de NFD.
Parâmetros
Tween 80 (mM)
Óleo - D-Limoneno (mM)
Semi-eixo A (Å)
Semi-eixo B (Å)
Semi-eixo C (Å)
Espessura da Cabeça Polar (Å)
Dens. eletrônica apolar (e/Å3)
Dens. eletrônica polar (e/Å3)
Raio Esfera-dura (Å)
Número de agregação
tensoativo/MI
Concentração (mol/L)
Micelas
Sem NFD
Com NFD
65.40
65.40
0.00
123.00
16.39
17.43
16.39
17.43
40.37
41.67
19.75
18.37
0.28
0.28
0.37
0.37
44.44
46.32
Microemulsões
Sem NFD Com NFD
65.40
65.40
0.00
123.00
14.79
19.37
14.79
19.37
33.98
43.92
22.34
19.54
0.28
0.28
0.36
0.37
39.32
41.84
132.62
145.41
100.90
170.07
4.9E-04
4.5E-04
6.5E-04
3.9E-04
Considerando a presença da NFD, podemos perceber um efeito interessante nos
sistemas estudados. A NFD pouco altera a MI, mantendo seus parâmetros estruturais
praticamente inalterados. Já para as MEs, a presença do fármaco induz um aumento
significativo do raio parafínico (parte interna da estrutura) de cerca de 30%, passando de
14,79 para 19,37 Å.
Em ambas as estruturas estudadas, ficou evidenciado que a NFD não altera de forma
significativa a espessura da cabeça polar. Este fato sugere fortemente que o fármaco deve se
localizar dentro (integralmente ou parcialmente) da interface apolar, de modo que a região
polar não sofre alterações muito significativas.
De posse dessas informações, é possível propor um modelo para a interação do
fármaco em cada uma das estruturas estudadas. A figura abaixo mostra uma esquematização,
em escala, de todos os sistemas estudados em ausência (Figura 27 (A) e (B)) e presença de
NFD (Figura 27 (C) e (D)). É perceptível pelas Figuras 27 (B) e (D) que existe um grande
aumento da região apolar nessa esquematização representados pelo inchaço no elipsoide
menor (região apolar) e pouca alteração na região externa (polar).
77
Figura 27 - Representação esquemática em escala das MIs (A e C) e das MEs (B e D) em ausência (A e B) e
presença (C e D) de NFD. Os elipsoides internos representam as regiões apolares, enquanto que os externos
representam as regiões polares.
5.4
ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES EM
MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR
O FTIR é considerado uma poderosa ferramenta para a determinação das vibrações
moleculares de materiais em modelo de EC no nível do grupo funcional. Devido à
composição complexa do EC, incluindo lipídios, proteínas, minerais e aminoácidos, muitas
bandas de absorção do FTIR aparecem no espectro obtido do EC. Todavia, numerosas bases
de dados já têm sido estabelecidas para se determinar a origem de cada vibração. Além disso,
a utilização desta técnica assegura que as vibrações obtidas experimentalmente reflitam
diretamente as características do EC. Usando FTIR com ATR pode ser possível observar a
organização dos lipídios na superfície e em regiões mais profundas do EC [103].
Em um espectro de FTIR, as cadeias de hidrocarbonetos dos lipídios apresentam
vibrações assimétricas e simétricas de CH2 em aproximadamente 2920 e 2850 cm-1,
respectivamente [97, 103, 104, 105]. A intensidade de um pico (altura e área) é proporcional à
quantidade de lipídios presentes no EC. Com isso, qualquer extração dos lipídios por uma MI
ou ME, por exemplo, resulta na diminuição da altura e/ou da área do pico. No entanto, pode
ocorrer também a fluidificação dos lipídios do EC por algumas MIs ou MEs, a qual pode ser
78
decorrente da mudança dos picos do estiramento CH2 a um menor ou maior número de onda
[97, 105, 106].
Os espectros de FTIR do EC tratados com água destilada (controle) e com as
formulações dos sistemas micelares e microemulsionados em estudo são apresentados na
Figura 28. Na região em que vibrações assimétricas de CH2 ocorrem (≈ 2920 cm-1), os
espectros de FTIR tratados tanto com as MIs quanto com as MEs apresentaram um nítido
deslocamento do pico do lipídio para um menor número de onda em relação ao espectro sem
tratamento (controle). Este resultado sugere que possivelmente ocorreu uma fluidificação dos
lipídios do EC pelas MIs e MEs. Entretanto, na região em que ocorrem vibrações simétricas
de CH2 (≈ 2850 cm-1), não foi possível observar deslocamento dos picos para números de
onda menores ou maiores, mas os espectros de FTIR do EC tratados com as MIs e as MEs
apresentaram uma ligeira diminuição da área do pico do lipídio em relação ao espectro sem
tratamento (controle). Logo, nesta região, sugere-se que as MIs e as MEs extraíram os lipídios
do EC, mas não as fluidizaram.
Tanto a fluidificação quanto a extração dos lipídios do EC pelas MIs e MEs mostram o
potencial destes sistemas como promotores de permeação à medida que minimizam a função
barreira estabelecida pela pele quando ocorre a entrada de qualquer substância. Neste caso,
estes sistemas mostram ser capazes de promover a entrada de fármacos na pele ao interagir
bem com o modelo de EC.
79
Figura 28 - Espectros de FTIR da região de interesse do EC tratados com: (a) água destilada (controle) e
formulações de MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de MEs.
50
45
Controle
(a)
a
MI2
Transmitância (%)
40
MI1
MI3
MI4
MI5
35
30
25
20
15
10
3000
2980
2960
2940
2920
2900
2880
2860
2840
2820
2800
-1
Número de Onda (cm )
Controle
50
ME5
(b)
ME4
ME2
45
ME1
ME3
Transmitância (%)
40
35
30
25
20
15
3000
2980
2960
2940
2920
2900
2880
2860
2840
2820
2800
-1
Número de Onda (cm )
Apesar do espectro de FTIR ser uma poderosa ferramenta para estudar a interação
destes sistemas com o EC, as variações estruturais são muitas vezes sutis entre uma amostra e
outra o que dificulta a análise. A segunda derivada do espectro ou espectrofotometria de
segunda derivada é um tratamento matemático que aumenta a separação de picos sobrepostos,
apresentando certas vantagens que levam a visualização e identificação mais específica dos
picos não tão bem resolvidos ou com diferenças muito pequenas [107]. A Figura 29 mostra os
espectros de segunda derivada do EC tratados com água destilada (controle) e com os
sistemas micelares e microemulsionados estudados. É possível visualizar com maior clareza
80
as diferenças dos espectros de FTIR do EC tratados com as MIs e as MEs em relação ao
espectro de FTIR do EC sem tratamento (controle). Com isso, pode-se sugerir que realmente
houve uma interação, tanto das MIs quanto das MEs com o modelo de EC, confirmando o que
foi dito anteriormente.
Figura 29 - Espectros de segunda derivada do EC tratados com: (a) água destilada (controle) e formulações de
MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de MEs.
(a)
a
Controle
2ª Derivada da Transmitância
MI1
MI2
MI3
MI4
MI5
3000
2980
2960
2940
2920
2900
2880
2860
2840
2820
2800
-1
Número de Onda (cm )
(b)
Controle
2ª Derivada da Transmitância
ME1
ME2
ME3
ME4
ME5
3000
2980
2960
2940
2920
2900
2880
2860
-1
Número de Onda (cm )
2840
2820
2800
81
6
CONCLUSÕES
O emprego dos diagramas de fases ternário e pseudoternário se mostrou um simples e
bem sucedido método que possibilitou a obtenção e escolha das formulações de MIs e MEs
para caracterização físico-química e incorporação do fármaco. Por meio dos diagramas, foi
também possível determinar e identificar as várias regiões obtidas, tais como MIs, MEs,
emulsões e separação de fase em função das quantidades dos componentes.
A caracterização físico-química das MIs e MEs selecionadas por medidas de MLP,
pH, condutividade e tamanho das gotículas por DLS mostraram que estes sistemas são
estáveis, isotrópicos e translúcidos com IPD menor que 0,5. Quanto à microestrutura, ficou
comprovada que as MIs são do tipo direta e as MEs do tipo O/A, estando de acordo com o
esperado. Quanto ao tamanho médio de gotículas, as MIs (2 a 7 nm) se mostraram menores do
que as MEs (6 a 10 nm), corroborando assim com os dados da literatura. Além disso, a
presença do fármaco modelo nos sistemas micelares e microemulsionados selecionados não
alterou as suas características, mantendo a estabilidade termodinâmica dos sistemas.
As medidas de tamanho obtidas por DLS e por SAXS demonstraram a influência das
fases nas MIs e MEs, em que o tamanho das gotículas diminui com o aumento da quantidade
de tensoativo e mistura de tensoativo/cotensoativo. A influência do cotensoativo nas MIs foi
praticamente desprezível provavelmente devido a sua quantidade ser muito pequena em
relação a do tensoativo. Nas MEs, o aumento da quantidade de fase oleosa ocasionou um
aumento do tamanho das gotículas, confirmando que a fase interna é oleosa.
A presença da NFD não alterou o tamanho de gotículas das MIs, mas aumentou o
tamanho das MEs, o que sugere que a NFD esteja na fase interna da ME favorecendo um
aumento no tamanho de gotículas ao interagir com a fase oleosa. Já para as MIs, a ausência de
uma fase oleosa consequentemente não permite a interação com fármacos lipofílicos tais
como a NFD.
Os resultados de tensão superficial das MIs e MEs complementaram o estudo de
caracterização físico-química desses sistemas, mostrando que eles apresentaram tensões
superficiais suficientemente baixas e que diminuem com o aumento da quantidade de
tensoativo no sistema.
O modelamento das curvas de SAXS para as MIs e MEs mais diluídas mostra que as
MIs apresentaram poucas alterações com a presença do fármaco, sugerindo que a NFD não
interage nestes sistemas. Para as MEs, a interação com a NFD é alta e houve um considerável
aumento de tamanho da ME, principalmente do raio parafínico (parte interna da estrutura). Além
82
disso, em ambos os sistemas estudados, ficou evidenciado que a NFD não altera de forma
significativa a espessura da cabeça polar, o que sugere fortemente que o fármaco deve se
localizar dentro (integralmente ou parcialmente) da interface apolar.
Os estudos complementares buscaram comprovar e entender melhor a localização da
NFD nas MIs e nas MEs. Todavia, os seus resultados reforçam a ideia de que o fármaco
provavelmente se encontra na fase interna das MEs e o mesmo não ocorre com as MIs como
já previsto anteriormente, mas não a comprovam como esperado.
As medidas de FTIR do estrato córneo (EC) tratados com MIs e MEs demostraram
que é possível a utilização desses sistemas como promotores de permeação, a partir das
interações observadas com o modelo de EC.
Dessa forma, tanto os sistemas micelares quanto os microemulsionados apresentaram
estabilidade e capacidade de agirem como promotores de permeação. Entretanto, apenas as
MEs são potenciais sistemas de liberação e administração transdérmica da NFD in vitro, em
decorrência de sua capacidade de solubilização e incorporação deste fármaco na fase interna.
83
7
PERSPECTIVAS FUTURAS
- Estudo do efeito das influências das fases sobre as propriedades reológicas das MIs e
MEs;
- Estudo quantitativo por SAXS de MIs e MEs com fase aquosa acima de 90%;
- Medidas de DSC para o estudo das interações existentes entre as MIs e entre as MEs
em modelo de EC;
- Ensaios in vitro de permeação cutânea.
84
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