Curso: Técnico Integrado de Alimentos Disciplina: Análise de alimentos Professora: Dayana do Nascimento Ferreira Roteiro 1 - Aula Prática: Determinação do teor de proteínas (Método de Kjeldahl) Princípio: Baseia-se na transformação do nitrogênio da amostra em sulfato de amônio através da digestão com ácido sulfúrico p.a. e posterior destilação com liberação da amônia, que é fixada em solução ácida e titulada. Podem-se expressar os resultados em protídeos, multiplicando-se a porcentagem do nitrogênio total por fator específico. Materiais e reagentes Aparelho ou bloco digestor e destilador micro-Kjeldahl; Balança analítica Tubo de Kjeldahl de 100 mL Béquer de 250 mL Buretas de 25 ou 50 mL Erlenmeyers de 125 ou 250 mL Espátula Pipeta graduada de 1 e 10 mL Provetas de 50, 100 e 250 mL Tenaz metálica Ácido sulfúrico (H2SO4) p.a. Anti-espumante (talco, parafina ou silicone) Indicador misto (vermelho de metila/azul de bromocresol) ou vermelho de metila Indicador fenolftaleína 1% Mistura catalítica (CuSO4.5H2O e K2SO4 1+10) Solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 50 % (m/v) Solução padrão de ácido clorídrico (HCl) 0,1 N Zinco metálico granulado Procedimento a) Digestão: Pesar em balança analítica amostras de 1g da amostra e transferir para tubo de Kjeldahl. Adicionar 0,5 g de mistura catalítica e 10mL de H2SO4. Aquecer em bloco digestor, a princípio, lentamente, mantendo a temperatura de 50 ºC por 1 (uma) hora ou dependendo das instruções do fabricante do bloco digestor. Em seguida, elevar gradativamente até atingir 400 ºC. Finaliza-se a digestão quando a solução estiver incolor ou levemente azulada. Quando houver precipitado no fundo do frasco, este deverá ser branco ou levemente cinza. As paredes do tubo não deverão apresentar resíduos carbonizados. Quando a digestão estiver terminada, desliga-se o aquecedor e deixa-se o tubo e a solução resfriarem completamente. Observação: Para produtos muito gordurosos, digerir a amostra com adição de um antiespumante. b) Destilação Inicialmente, liga-se o destilador na tomada e verifica-se o nível da água da caldeira, esta deverá encostar ao sensor. Abre-se a torneira de água do laboratório para que haja fluxo de água no condensador. Liga-se o aparelho e faz-se um pré-aquecimento da água da caldeira até ebulição. Em seguida, diminui-se a temperatura do destilador até a escala de 2. Fecha-se a torneira do copo superior do destilador. Transfere-se a solução de NaOH a 40% para o copo superior do destilador; esta solução deverá ser adicionada posteriormente ao tubo de Kjedahl contendo a amostra digerida. Adiciona-se um pouco de água destilada para lavar as paredes do tubo de Kjeldahl contendo a amostra digerida. Adiciona-se 1mL da solução de fenolftaleína a 1% à amostra digerida e conecta-se o tubo de Kjeldahl ao destilador de proteínas, verificando se este ficou bem fixo evitando assim qualquer vazamento. Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo 25mL de solução de ácido bórico a 4 % com 4 ou 5 gotas de solução de indicador misto (erlenmeyer receptor do destilado). Mergulha-se a saída do condensador de Kjeldahl no erlenmeyer contendo a solução de ácido bórico a 4%, tendo o cuidado de observar se a extremidade final do condensador está completamente mergulhada na solução de ácido bórico. Mantêm-se a temperatura de aquecimento do destilador na posição 2. Em seguida, adiciona-se a solução de NaOH a 40% lentamente até conseguir pH alcalino, com mudança de cor de alaranjado para marrom. Após a “viragem” da cor do tubo de Kjedahl, aumenta-se a temperatura do destilador para 8 a 10, a fim de promover a destilação até que o volume final de 3 vezes o volume inicial no erlenmeyer, isto é, o volume de 75 mL Quando este volume é atingido, retira-se primeiramente o erlenmayer (para evitar refluxo da solução) e depois diminui-se a temperatura para 2 e desliga-se o aquecedor.A solução receptora deve ser mantida fria durante a destilação. c) Titulação Titula-se a solução do erlenmeyer com ácido clorídrico 0,1N padronizado, até o aparecimento da coloração avermelhada. %𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 = (𝑉𝐴 − 𝑉𝐵)𝑥𝑓𝑥𝐹𝑥0,14 𝑚 Onde: VA = volume de ácido clorídrico 0,1N padronizado gasto na titulação da amostra. VB = volume de ácido clorídrico 0,1N padronizado gasto na titulação do branco. fa = fator de correção da solução de ácido clorídrico 0,1N. F = 6,38 para produtos lácteos (ANVISA, 2003); F = 6,25 para carnes ou misturas de proteínas, e proteínas de soja e de milho (ANVISA, 2003); Valor de F para diversos alimentos F F F F F F 6,25 6,38 5,55 5,83 5,70 5,74 Para os alimentos em geral, incluindo o pão de milho, soja e derivados. Para produtos lácteos. Para gelatina. Para biscoitos, cevada, aveia e pão integral. Para pão francês. Para pão doce, pão caseiro e pão de leite.