Lourival de Almeida Silva - 2015 - IPTSP
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA LOURIVAL DE ALMEIDA SILVA Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum Goiânia 2015 TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Lourival de Almeida Silva E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Dissertação [ x ] Tese [ ] Não Vínculo empregatício do autor Professor do Ensino Básico, Técnico e Tecnológico do IF Goiano, campus Ceres. Agência de fomento: Sigla: País: UF: CNPJ: Título: Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum. Palavras-chave: Reposicionamento de fármacos, Metabolismo Energético, Leishmania spp; Apicoplasto; Plasmodium falciparum. Título em outra língua: In silico drug repositioning for neglected tropical diseases with emphasis on energy metabolism of Leishmania spp and Plasmodium falciparum apicoplast. Palavras-chave em outra língua: Drug Repositioning; Energy metabolismo, Leishmania spp; Apicoplast; Plasmodium falciparum. Área de concentração: Parasitologia Data defesa: 27/02/2015 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical Orientador (a): Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra E-mail: [email protected] Co-orientador (a):* Prof. Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo e Prof. Dra. Ana Maria de Castro E-mail: *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ x ] SIM [ ] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. _____________________________________ Assinatura do (a) autor (a) 1 Data: ____ / ____ / _____ Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo. LOURIVAL DE ALMEIDA SILVA Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás como requisito para a obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientador: Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra Co-orientadores: Profº. Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo e Profª. Dra. Ana Maria de Castro Goiânia 2015 ii Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG. Silva, Lourival de Almeida Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum [manuscrito] / Lourival de Almeida Silva. - 2015. xvi, 96 f. Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra; co-orientador Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo; co-orientador Dr. Ana Maria de Castro. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) , Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública, Goiânia, 2015. Bibliografia. Apêndice. Inclui siglas, mapas, abreviaturas, tabelas, lista de figuras, lista de tabelas. 1. Reposicionamento de fármacos. 2. Metabolismo Energético. 3. Leishmania spp. 4. Apicoplasto. 5. Plasmodium falciparum. I. Barreto Bezerra, José Clecildo , orient. II. Lemos Cravo, Pedro Vítor , co orient. III. Título. Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO Aluno: Lourival de Almeida Silva Orientador: Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra Co-orientadores: Profº. Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo e Profª. Dra. Ana Maria de Castro Membros: 1. Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra – IPTSP/UFG 2. Profº. Dr. Cláudio Carlos da Silva – PUC/GO 3. Profª. Dra. Carolina Horta Andrade – FF/UFG 4. Profª Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda – ICB/UFG 5. Profº Dr. Clayton Luiz Borges ICB/UFG Data: 27/02/2015 iii Dedico esse trabalho a minha fiel companheira, esposa e amiga Jucilene de S. R Almeida que sempre me apoiou e me auxiliou em tudo. Sem ela eu não teria conseguido. Dedico também as minhas filhas, Beatriz R. Almeida e Júlia R. Almeida que me alegraram e me incentivaram nos momentos difíceis. iv AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pelo privilégio do recomeço e por me ensinar que os acontecimentos não são precoces ou se atrasam, eles ocorrem no tempo Dele. Ao professor Dr. José Clecildo Barreto Bezerra pela confiança e lealdade de sua orientação nesse trabalho, e por não ter sido apenas um orientador, mas um amigo e uma inspiração para mim. Ao professor Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo pela paciência, presteza e cumplicidade no auxílio para realização desse trabalho. A professora Dra. Ana Maria de Castro pela solicitude, gentileza e doçura ao responder os pedidos de ajuda. A professora Dra. Marina Clare Vinaud pelo apoio, sugestões e críticas feitas ao trabalho. A biomédica Dra. Tatiane Luiza da Costa pelo imenso esforço empregado na realização dos testes com os fármacos. Aos secretários da pós-graduação José Clementino e Kariny Soares pela gentiliza e presteza no atendimento de minhas solicitações. Ao programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública por me oportunizar esse feito. Ao diretor geral Hélber Souto Morgado e ao diretor de ensino Cleiton Mateus do Instituto Federal Goiano, campus Ceres por terem apoiado a realização desse trabalho. v SUMÁRIO AGRADECIMENTOS ..................................................................................................... v SUMÁRIO ....................................................................................................................... vi FIGURAS E TABELAS ................................................................................................ viii FIGURAS E TABELAS DOS ARTIGOS ...................................................................... ix SIGLAS E ABREVIATURAS ......................................................................................... x RESUMO ....................................................................................................................... xii ABSTRACT .................................................................................................................. xiii 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1 1.1 Doenças Tropicais Negligenciadas ........................................................................ 1 1.2 As Leishmanioses .................................................................................................. 5 1.2.1 Ciclo Biológico de Leishmania spp. ................................................................... 5 1.2.2 Formas clínicas .................................................................................................. 7 1.2.3 Epidemiologia e controle .................................................................................... 7 1.2.4 Tratamento e resistência ..................................................................................... 9 1.2.5 Metabolismo energético como alvo de fármacos antileishmania ..................... 14 1.3 Malária ................................................................................................................. 21 1.3.1 Ciclo biológico do Plasmodium sp ................................................................... 21 1.3.2 A doença ........................................................................................................... 24 1.3.3 Epidemiologia e controle .................................................................................. 25 1.3.4 Tratamento e resistência ................................................................................... 27 1.3.5 O apicoplasto e terapia antimalárica ................................................................. 45 1.4 O reposicionamento in silico de fármacos para as leishmanioses e malária ....... 48 2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 52 3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 53 3.1 Geral..................................................................................................................... 53 3.2 Específicos ........................................................................................................... 53 4 MÉTODO(S) ............................................................................................................... 54 4.1 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo energético de Leishmania ........................................................................................... 54 4.2 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo do apicoplasto de Plasmodium falciparum ...................................................................... 56 vi 5 RESULTADOS ........................................................................................................... 60 5.1 Artigo 1 – In Silico Search of Energy Metabolism Inhibitors for Alternative Leishmaniasis Treatments .......................................................................................... 60 5.2 Artigo 2 – A Systematic in Silico Search for Target Similarity Identifies Several Approved Drugs with Potential Activity against the Plasmodium falciparum Apicoplast ................................................................................................................... 60 6 DISCUSSÃO GERAL................................................................................................ 75 6.1 Fármacos que atuam no metabolismo energético de Leishmania spp ................. 75 6.2 Fármacos que atuam no apicoplasto de P. falciparum ........................................ 77 7 CONCLUSÕES GERAIS .......................................................................................... 80 8 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 81 9 APÊNDICE ................................................................................................................. 94 Bases de dados consultadas ....................................................................................... 94 vii FIGURAS E TABELAS Figura 1 Estádios evolutivos de Leishmania amazonensis. Forma promastigota (×1000; A) e amastigota (B). Amastigotas estão infectando um macrófago ......................... 5 Figura 2 Ciclo de vida de Leishmania spp. causador da leishmaniose............................ 6 Figura 3 Distribuição geográfica das leishmanioses no mundo. A) Leishmanioses cutânea e cutânea mucosa no Novo Mundo. B) Leishmaniose visceral no Velho e no Novo Mundo. ....................................................................................................... 8 Figura 4 As principais vias do metabolismo energético em Leishmania major. Reações da glicólise, que ocorrem no glicossomo no citosol e ciclo de Krebs, na mitocôndria.. ........................................................................................................... 16 Figura 5 Metabolismo do carbono de Leishmania mexicana nas formas promastigotas (A) e amastigotas (B).............................................................................................. 20 Figura 6 Ciclo biológico do Plasmodium spp.. .............................................................. 24 Figura 7 Mapa da população mundial sob-risco de contrair malária. ............................ 26 Figura 8 Fórmulas moleculares da artemisinina e seus derivados.................................. 30 Figura 9 Esquema para a origem de todos os plastídeos por endossimbiose primária e secundária.. ............................................................................................................. 46 Tabela 1 DALYs estimadas (em milhões de dólares) das DTNs resultantes da sobrecarga global de doença, estudo de 2010. ......................................................... 2 Tabela 2 Principais fármacos antimaláricos. World Health Organization. Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010. ................................................ 28 Tabela 3 Terapia combinada baseada em artemisinina. World Health Organization. Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010. .......................... 32 Tabela 4 Fármacos reposicionados com êxito para novas indicações. ........................... 49 viii FIGURAS E TABELAS DOS ARTIGOS Artigo 1 Figure 1. Flowchart depicting the overall strategy and results of this work...................62 Table 1. New drug-target associations disclosed in the present study...........................63 Artigo 2 Figure 1. Distribution of the expected apicoplast targets according to their predicted metabolic function in the apicoplast...............................................................................68 Figure 2. Flowchart summarizing the work pipeline and corresponding results (*denotes the targets that were discarded on the basis of having chemical affinity to dietary supplements/nutraceuticals)............................................................................................69 Table 1. Examples of drug-target associations previously determined, that were correctly identified in the present study..........................................................................70 Table 2. New drug-target associations disclosed in the presente study..........................71 ix SIGLAS E ABREVIATURAS AA Ácido Azelaico ABCD Anphoterecin B Coloidal Dispersion ABLC Anphotericin B Lipid Complex AKT Protein Kinase Threonine ADP Adenosine Diphosphat AnA Anphotericin A AnB Aphotericin B ATP Adenosine Triphosphat DesA3 Stearoyl-CoA 9-desaturase DNA Desoxirribonucleic acid DALY Disability-Adjusted Life-Years DTN Doenças Tropicais Negligenciadas ED50 Half Efective Dose EUPATHDB Eucariotic Pathogene DataBase Resources FDA Food and Drug Administration GBD Global Burden of Disease G6PD Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase GENE DB Gene DataBase HIV/AIDS Human immunodeficiency Virus/ Acquride Immunodeficiency Syndrome HAP Histo Aspartic Protease IC50 Half maximal inhibitory concentration ISO Isonoxil IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública k-DNA Knetoplastid DNA LD50 Half maximal Lethal Dose logP logarithm partition coefficient LND Lonidamina LTA Leishmaniose tegumentar americana LV Leishmaniose Visceral L-AnB Liposomal Anphotericin B x NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotíde Phosphate Hydrogen N86Y asparagine 86 tyrosine ONG Organização Não Governamental OMS Organização Mundial da Saúde PABA Para-aminobenzoic acid PfATPase Plasmodium falciparum Adenosine Triphosphatase PfCYTB Plasmodium falciparum cytochrome b PfCRT Plasmodiu falciparum chloroquine resistance transporter PfDHFR Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase PfDHPS Plasmodium falciparum dihydropteroate synthase PfMDR Plasmodium falciparum multidrug resistance PfNHE1 Plamodium falciparum sodium/proton exchanger 1 pH Potencial Hidrogeniônico PMI Phosphomanose Isomerase PQB Proteína Quinase B PvMDR Plsmodium vivax Multidrug Resistance RNA Ribonucleic Acide PLASMODB Plasmodium Genomics Resource DataBase SinanNET Sistema de informação agravos de notificação SNP Single Nucleotide polymorfism STITCH Search Tool for Interactions of Chemicals TCA Terapia de Combinação baseada na artemesinina TDR TARGETS Tropical Disease Research Targets TRITRYpDB Trypanosomatidae DataBase TTDB Therapeutic Targets DataBase WHO World Health Organization Y184F Tyrosine 184 phenylalanine D1246Y Aspartic acid 1246 Tyrosine xi RESUMO As leishmanioses são parasitoses negligenciadas responsáveis por prejuízos físicos, econômicos e sociais. A malária, embora não seja classificada como negligenciada, é responsável por altos índices de morbidade e mortalidade, principalmente nos países africanos. Ao longo dos anos, o tratamento dos infectados tem sido a forma mais eficaz de controle dessas endemias. Entretanto, os efeitos tóxicos, o alto custo dos fármacos e a resistência dos parasitos têm sido os maiores desafios enfrentados pela terapêutica das leishmanioses e da malária. Sendo assim, é urgente a necessidade de desenvolver novos fármacos que minimizem esses transtornos e contribuam para erradicação dessas parasitoses. Diante disso, laboratórios acadêmicos, governos e organizações não governamentais têm apoiado projetos voltados para o reposicionamento de fármacos aprovados com vistas a reduzir custos e tempo de produção de novos antiparasitários. No presente trabalho, utilizamos a bioinformática para identificar, buscar e analisar alvos moleculares do metabolismo energético de Leishmania spp e do apicoplasto de P. falciparum, visando o reposicionamento in silico de fármacos. Utilizando a base de dados TDR Targets, identificamos 94 genes e 93 alvos do metabolismo energético de Leishmania. Em seguida, utilizando a sequência peptídica de cada alvo, interrogamos as bases de dados Drug Bank e TTD na busca de fármacos. Nossa busca resultou em 44 alvos positivos, dos quais 11 interagiam com 15 fármacos aprovados para uso em humanos. Utilizamos estratégia semelhante para identificar fármacos antimaláricos que atuassem especificamente contra o metabolismo do apicoplasto. A base de dados GeneDB do genoma de P. falciparum foi usada para compilar uma lista de cerca de 600 proteínas com peptídeos sinais do apicoplasto. Cada uma dessas proteínas foi tratada como potencial alvo de fármaco e sua sequência prevista foi usada para interrogar três diferentes bases de dados de acesso livre (TT DB, DrugBank e STITCH ) Identificamos fármacos com potencial de interagir com 47 peptídeos supostamente envolvidos na biologia do apicoplasto do P. falciparum. Quinze desses alvos hipotéticos são previstos interagir com fármacos já aprovados para uso clínico, mas que nunca foram avaliados contra os parasitos da malária. Os nossos resultados sugerem que os fármacos aqui identificados apresentam potencial para tratamentos das leishmanioses e da malária, mas que necessitam de validação experimental para confirmar sua eficácia. xii ABSTRACT Leishmaniasis is a neglected tropical disease responsible for physical, economic and social damages. Even though malaria is not classified as a neglected tropical disease, is responsible for high morbidity and mortality, especially in African countries. Current treatments for both diseases face several drawbacks, including the evolution of drugresistant parasites, the high cost of major drugs and the high toxicity of others. For these reasons, there is an urgent need to develop new drugs that minimize these downsides and, consequently, help eradicate these diseases. To overcome these difficulties, both academics and pharmaceutical companies are increasingly employing the so-called “drug repositioning strategy”. Drug repositioning aims to find new applications for drugs approved for other indications, and has proven valuable for decreasing research costs as well as to decrease the time required to market the "new" drug. In the present study, we used bioinformatics to identify and analyze molecular targets of the energy metabolism of Leishmania spp and of the P. falciparum apicoplast. The energy metabolism of Leishmania and the apicoplast metabolism have various enzymes that can be targeted by specific drugs, leading to lower toxicity and more promising therapies for humans. Using the TDR Targets database, we were able to identify 94 genes and 93 Leishmania energy metabolism targets. We identified 44 positive targets in these databases, and for 11 of these targets we found drugs already approved for use in humans. We used a similar strategy to identify antimalarial drugs that acted specifically against the apicoplast metabolism. The GeneDB database of the P. falciparum genome was used to compile a list of 600 proteins with apicoplast signal peptides. Each of these proteins was treated as a potential drug target and its predicted sequence was used to interrogate three different open access databases (DB TTD, DrugBank and STITCH ). We identified many drugs with the potential to interact with 47 peptides allegedly involved in apicoplast biology in P. falciparum. Fifteen of these hypothetical targets are predicted to interact with drugs are already approved for clinical use, but were never evaluated against malaria parasites. Our results suggest that the drugs identified here show potential activity against leishmania parasite and malaria, but need experimental validation to confirm their effectiveness. xiii 1 INTRODUÇÃO 1.1 Doenças Tropicais Negligenciadas As Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) afetam populações de baixa renda, politicamente marginalizada e que vivem em zonas rurais e urbanas, cujas condições de moradia, saneamento e de serviços médicos são muito precárias (DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, 2010). Essas doenças são causadas por cerca 17 diferentes tipos de parasitos, incluindo as helmintíases: esquistossomose, filariose linfática, oncocercose, teníase e cisticercose, ancilostomíase, ascaridíase e tricuríase; protozooses: leishmaniose, doença de Chagas, tripanossomíase africana; bacterioses: lepra, tuberculose e tracoma e as viroses dengue e raiva (HOTEZ et al., 2014; HOTEZ PJ, MOLYNEUX DH, FENWICK A, 2007). Essas doenças se distribuem principalmente em regiões tropicais e afetam cerca de um bilhão de pessoas, provocando prejuízos econômicos e à saúde das comunidades afetadas. As DTNs são as principais causas de morbidade e mortalidade nos países da África, Ásia e América Latina, nos quais se concentram os maiores bolsões de pobreza do mundo. Todas essas doenças caracterizam-se por apresentar enorme impacto individual, familiar e comunitário nos países pobres e em desenvolvimento no que diz respeito à qualidade de vida, perda da produtividade, agravamento da pobreza, bem como o alto custo dos cuidados com a saúde de longo prazo dos afetados (DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, 2010). Assim, os impactos individuais mais comuns relacionados a algumas DTNs são: a esquistossomose diminui a capacidade cognitiva de crianças, produz má nutrição, perda de peso e, consequentemente, abandono da escola. A lepra provoca a perda de membros, discriminação e marginalização social. A tripanossomíase africana (doença do sono) produz debilidades severas e todos os casos não tratados evoluem para o óbito. A doença de Chagas compromete o coração, esôfago, estômago e intestinos diminuindo a qualidade de vida do paciente, incluindo a perda da capacidade de trabalho. A leishmaniose causa lesões na pele, deformações faciais e na sua variante clínica mais grave provoca a morte dos pacientes não tratados. A filariose linfática deforma membros e exclui os afetados do convívio social. A oncocercose produz cegueira e incapacita os afetados para o trabalho e vida social (DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, 2010). Esses efeitos das DTNs são reportados como perda de anos de vida ajustados à incapacidade (do inglês DALY, Disability-Adjusted Life-Years) e são usados para analisar o impacto dessas doenças sobre a saúde dos indivíduos. O DALY foi usado pelo Global Burden of Disease Study 2010 (GBD 2010) como instrumento para avaliar e comparar local e globalmente o impacto de um número relativo de doenças. A tabela 1 apresenta as DALYs estimadas pelas principais DTNs indicadas no GBD 2010. Tabela 1 DALYs estimadas (em milhões de dólares) das DTNs resultantes da sobrecarga global de doença, estudo de 2010. Doenças DALYs DTNs 26,06 (20.30–35.12) Esquistossomose 3.31 (1.70–6.26) Ancilostomíase 3.23 (1.70–5.73) Ascaridíases 1.32 (0.71–2.35) Leishmanioses 3.32 (2.18–4.90) Tripanossomíase Africana 0.56 (0.08–1.77) Doença de Chagas 0.55 (0.27–1.05) Tricuríase 0.55 (0.27–1.05) Lepra 0.006 (0.002–0.11) Filariose linfática 2.78 (1.8–4.00) Tracoma 0.33 (0.24–0.44) Oncocercose 0.49 (0.36–0.66) Cisticercose 0.50 (0.38–0.66) Amebíase 2.24 (1.73–2.84) Criptosporidiose 8.37 (6.52–10.35) Adaptada de : Hotez PJ, Alvarado M, Basáñez M-G, Bolliger I, Bourne R, et al. (2014) The Global Burden of Disease Study 2010: Interpretation and Implications for the Neglected Tropical Diseases. PLoS Negl Trop Dis 8(7): e2865. Alguns especialistas, entretanto, acreditam que os DALYs não são suficientes para expressar os prejuízos causados pelas DTNs. Eles alegam que os DALYs não levam em conta o impacto econômico, social e psicológico causados pelas DTNs (HOTEZ et al., 2014). Do ponto de vista econômico, os efeitos podem ser diretos ou 2 indiretos para os países endêmicos. Os efeitos diretos estão relacionados aos custos com programas de prevenção, diagnósticos, tratamento dos doentes e internação. Os efeitos indiretos são aqueles que diminuem produtividade, provocam afastamento temporário ou permanente do trabalho e geram desemprego (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010). Na América Latina, é estimado que a doença de Chagas cause a perda de 752.000 dias úteis de trabalho por ano devido as mortes pela doença. No Brasil, as faltas ao trabalho dos indivíduos afetados pela doença de Chagas provocam uma perda de 5-6 milhões de dólares por ano (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010). Assim, questiona-se qual o custo das DTNs para os países afetados e o custobenefício produzido pelo tratamento dessas doenças. Algumas DTNs possuem programas de controle baseados no tratamento preventivo. Os principais exemplos são a filariose linfática, a esquistossomose, a oncocercose e as geo-helmintíases (ascaridíase, ancilostomíase e tricuríase). Esses programas recebem apoio de governos locais, de agências técnicas, das indústrias farmacêuticas, organizações humanitárias e fundações. Os custos incluem: treinamento, educação em saúde, campanhas de prevenção, obtenção e distribuição de fármacos. Muitos estudos indicam que custo total para tratar as DTNs é menor do que aquele destinado aos programas de prevenção e tratamento do HIV/AIDS, da tuberculose e da e malária (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010). Vários fatores contribuem para os baixos custos do controle ou erradicação das DTNs, dentre eles destacam-se a doação de fármacos pelas indústrias farmacêuticas, a distribuição simultânea dos fármacos e o trabalho voluntário (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010). O custo benefício para evitar as DALYs é um dos mais baixos. Por outro lado, admite-se que algumas doenças poderiam apresentar um custo mais alto porque a identificação dos casos e a intervenção ambiental são as mais importantes ações. Por exemplo, a leishmaniose e triponossomíase africana têm um custo de 12-24 e 11-22 dólares, respectivamente, por DALY evitada. Mas isso só ocorre devido à contribuição do setor privado e ao baixo preço de alguns fármacos utilizados. Já o custo para gerenciamento de casos de dengue gira em torno de 716 a 1757 dólares por DALY evitada e se for voltado para o controle ambiental o custo sobe para 2440 dólares por DALY evitada (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010). Embora as DTNs provoquem um impacto tão grande sobre as populações pobres e marginalizadas do mundo, somente a partir do ano de 2000 que algumas medidas mais efetivas começaram ser implementadas. Ironicamente, quando as Nações Unidas 3 anunciaram os oito objetivos para o desenvolvimento do Milênio, as DTNs ficaram de fora. O sexto objetivo apregoava: “Combate ao HIV/AIDS, malária e outras doenças”. Essa omissão, no entanto, provocou um movimento de cientistas, organizações não governamentais (ONGs) e fundações no sentido de dar a merecida atenção as DTNs (BLAKE; ADAMS, 2012). Deste modo, um pouco mais de uma década, a Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou o Relatório Global de 2010, intitulado “Trabalhando para superar o impacto global das Doenças Tropicais Negligenciadas”. Essa publicação provocou uma série de encontros, envolvendo representantes dos governos, ONGs, OMS, cientistas, indústrias farmacêuticas e a fundação Bill & Melinda Gates num esforço conjunto para controlar ou erradicar, até 2020, as 11 mais importantes DTNs. As principais ações envolvem o financiamento de pesquisas para o desenvolvimento de novos fármacos, a doação de fármacos e as campanhas de prevenção. Esse esforço devem beneficiar cerca 1,4 bilhão de pessoas ao redor do mundo afetadas pelas DTNs.. (http://www.gatesfoundation.org/press-releases/Pages/combating-10-neglected-tropicaldiseases-120130.aspx). No caso particular da leishmaniose, a OMS pretende detectar 70% de todos os casos da forma cutânea e tratar pelo menos 90% dos casos detectados no Oeste do Mediterrâneo até 2015. Para o subcontinente indiano, a OMS deseja alcançar 100% de detecção e tratamento dos casos de leishmaniose visceral até 2020. Além disso, as estratégias globais da OMS para o controle da leishmaniose também envolvem os continente Europeu e as Américas, alcançando mais de 90 países afetados por essa parasitose (SAVIOLI, 2012). As DTNs são ainda graves problemas de saúde pública no mundo. Os efeitos dessas doenças são maiores nos países pobres e desenvolvimento, agravando a pobreza e reduzindo a esperança de vida. A erradicação ou o controle definitivo das DTNs deve ser resultado de um esforço coletivo no qual envolve o poder público, os centros de pesquisa acadêmicos, as indústrias farmacêuticas, bem como as agências de apoio humanitário. 4 1.2 As Leishmanioses As leishmanioses formam um complexo de doenças que afetam mamíferos e são causadas por cerca de vinte espécies diferentes de protozoários do gênero Leishmania. A transmissão natural pode ser zoonótica ou antroponótica e ocorre pela picada de flebotomíneos. Esses insetos pertencem à família Psychodidae, sub-família Phlebotominae com dois gêneros epidemiologicamente importantes: Phlebotomus e Lutzomyia. O primeiro, tipicamente representa as espécies do Velho Mundo e, o segundo, as espécies do Novo Mundo (READY, 2010). 1.2.1 Ciclo Biológico de Leishmania spp. Leishmania spp. apresenta dois estádios morfofisiológicos distintos (figura 1). As formas promastigotas são encontradas nos insetos vetores e são alongadas, flageladas e móveis, enquanto que as formas amastigotas são esféricas, sem flagelo aparente e são encontradas no interior de macrófagos do sistema retículo-endotelial do hospedeiro vertebrado (SANTOS et al., 2008). A B Figura 1 Estádios evolutivos de Leishmania amazonensis. Forma promastigota (×1000; A) e amastigota (B). Amastigotas estão infectando um macrófago (×1000) (Santos et al. 2008) (domínio público) 5 O vetor adquire o protozoário ao ingerir macrófagos infectados com a forma amastigota. No intestino, as formas amastigotas se transformam em promastigotas procíclicas imaturas, que se multiplicam por divisão binária e, em seguida, transformam-se em promastigotas metacíclicas infectantes e migram para a probóscide do inseto. Durante o repasto sanguíneo, essas formas são transmitidas para o hospedeiro vertebrado. Nesse hospedeiro, as formas promastigotas são fagocitadas por macrófagos do sistema retículo-endotelial, mediada por receptores específicos. No interior do vacúolo digestório do macrófago, as formas promastigotas perdem o flagelo e se transformam em amastigotas (figura 2). Em seguida, se multiplicam e rompem os macrófagos, provocando novos episódios de fagocitose. Embora esse fenômeno esteja relacionado diretamente à patogenia das diferentes espécies de Leishmania, o estabelecimento da doença depende do sucesso da transformação sofrida pelo parasito, da resposta imunológica do hospedeiro e da virulência do parasito (ROSENZWEIG et al., 2008; SANTOS et al., 2008). Figura 2 Ciclo de vida de Leishmania spp. causador da leishmaniose. Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/. Página do Centro de Controle de Doenças, governo dos Estados Unidos. Conteúdo de domínio público, conforme política de acesso. 6 1.2.2 Formas clínicas As leishmanioses manifestam-se, clinicamente, de três formas. A forma cutânea caracteriza-se, inicialmente, pelo aparecimento de pápulas eritematosas no local da picada. Posteriormente, as pápulas aumentam e rompem-se, formando úlceras indolores com borda bem demarcada e elevada. Após a cura, uma cicatriz profunda toma o lugar da ferida (MASMOUDI et al., 2013). As principais espécies envolvidas na forma cutânea são: L. tropica e L. aethiopica. A forma cutaneomucosa é reconhecida pelo seu comportamento crônico, latente e metastático, caracterizado por lesões secundárias distantes produzidas pela disseminação do parasito. Essas lesões são encontradas especialmente na região oral e nasofaringea da face, desfigurando o rosto do paciente. Diferentemente da forma cutânea, as lesões da forma cutaneomucosa não são autoresolvidas e são mais resistente ao tratamento com antimoniais (RONET; BEVERLEY; FASEL, 2011). As espécies comumente relacionadas são L. (Viannia) braziliensis, L. mexicana e L. peruviana. Na forma visceral, considerada a mais grave, o parasito é levado do local de inoculação para o fígado, baço e medula óssea, resultando em perda de peso e imunossupressão. Sem tratamento adequado, a maioria dos pacientes evolui para o óbito. As espécies causadoras da leishmaniose visceral são: L. (leishmania) donovani e L. infantum (SANTOS et al., 2008). 1.2.3 Epidemiologia e controle As leishmanioses estão entre as endemias de maior impacto socioeconômico nos países subdesenvolvidos e em desenvolvimento. São prevalentes em 98 países, três territórios e cinco continentes (figura 3). Aproximadamente, 1,3 milhão de novos casos ocorrem anualmente no mundo, dos quais 300.000 são da forma visceral (LV). Mais de 90% dos casos de LV ocorrem em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão. Para a leishmaniose cutânea os países atingidos são Afeganistão, Algéria, Brasil, Colômbia, Iran, Paquistão e Peru, Arábia Saudita, Síria e Tunísia, enquanto leishmaniose cutaneomucosa afeta principalmente o Brasil, Peru e Bolívia, totalizando um milhão de casos. Dos 1,3 milhão de casos estimados, apenas 600.000 são atualmente relatados nesses países (ALVAR et al., 2012). 7 O número real de casos não é possível determinar, mas certamente supera os relatados e possivelmente o estimado (ALVAR et al., 2012). O número de mortes pela doença é também subestimado em vários desses países. Uma das razões é a morte do indivíduo antes da doença ser diagnosticada. Entretanto, baseando-se no relato de alguns países, estima-se que o número de mortes por leishmaniose visceral seja de 20.000 a 40.000 pessoas por ano (ALVAR et al., 2012). No Brasil, foram relatados 18.226 casos de leishmaniose cutânea em 2013, sendo que quase três mil casos ocorreram na região Centro-Oeste. Já para a leishmaniose visceral foram relatados 3.253 casos, com 278 casos notificados na região Centro-Oeste. O número de mortes por LV foi 233 e 33 no Brasil e no Centro-Oeste, respectivamente [http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/vigilancia-de-a-a-z]. As medidas de controle e prevenção ainda estão restritas ao controle vetorial e dos reservatórios e ao tratamento dos doentes (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). Vacinas antileishmania de segunda geração só devem estar disponíveis em 25 anos. A B Figura 3 Distribuição geográfica das leishmanioses no mundo. A) Leishmanioses cutânea e cutânea mucosa no Novo Mundo. B) Leishmaniose visceral no Velho e no Novo Mundo. WHO, 2010. Disponível em (http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/) Os vetores das leishmanioses são susceptíveis aos inseticidas usados contra outros vetores, incluindo malária e filariose. No passado, o uso de DDT reduziu drasticamente os casos de leishmaniose em várias partes do mundo. O uso de inseticidas é recomendado onde os flebotomíneos vivem próximo às residências, como ocorre em várias regiões da Índia e do Oeste da África (CHAPPUIS et al., 2007). O cão 8 doméstico é o reservatório de maior relevância na epidemiologia da leishmaniose visceral. Entretanto, as medidas adotadas para o controle da leishmaniose canina ainda são motivos de muitos debates. Essas medidas envolvem o sacrifício dos cães positivos, combatida pela sociedade protetora dos animais; o tratamento dos cães infectados, que induz resistência e é pouco eficaz; vacinação dos cães, também tida como efetiva (CHAPPUIS et al., 2007). Sendo assim, o tratamento dos indivíduos infectados é a alternativa mais comum empregada para o controle e erradicação dos diferentes tipos de leishmaniose. 1.2.4 Tratamento e resistência Embora tenha ocorrido avanço nas pesquisas em leishmaniose nos últimos anos, a terapêutica para essa parasitose permaneceu a mesma nas últimas cinco décadas. Ao longo dos anos, os antimoniais pentavalentes têm sido os fármacos de escolha. Outros fármacos, como anfotericina B e miltefosina foram introduzidos, visando contornar o problema de resistência dos parasitos aos antimoniais. Entretanto, esses fármacos são de alto custo, o que inviabiliza seu uso em saúde pública. Além desses fármacos citados anteriormente, também são utilizados pentamidina, aminosidina (paromicina), aluprurinol e itraconazol (AMATO et al., 2007; MASMOUDI et al., 2013; MINODIER; PAROLA, 2007). Antimoniais Pentavalentes Os antimoniais pentavalentes estibogluconato de sódio e antimoniato de meglumina, nomes genéricos para Pentostam® e Glucantime®, respectivamente, são os fármacos de escolha para o tratamento das leishmanioses, quando não há relatos de resistência (MASMOUDI et al., 2013; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). O estibogluconato de sódio é administrado por via intravenosa ou intramuscular obedecendo aos seguintes esquemas terapêuticos: 20 mg/kg/dia por 30 dias para leishmaniose visceral causada por espécies do Velho Mundo; 100-500 mg intralesional por sessão (1-5 sessões) por 3 a 7 dias para leishmaniose cutânea requerendo terapia local; 20mg/kg/dia por 20 dias para leishmaniose cutânea requerendo terapia sistêmica e 9 leishmaniose cutâneo-mucosa. O antimoniato de meglumina possui esquema terapêutico semelhante (MASMOUDI et al., 2013). Os efeitos colaterais mais comuns aos antimoniais são náusea, vômitos, diarreia, dor abdominal, anorexia, mialgia, cefaleia e letargia. Esses sintomas são inerentes ao tratamento e são dose-independente. Por outro lado, as manifestações tóxicas cardíacas, hepáticas, pancreáticas e renais aos antimoniais são dose-dependente e surgem na segunda semana do tratamento (MASMOUDI et al., 2013). Embora o exato mecanismo de ação desses fármacos seja pouco conhecido, alguns efeitos dos antimoniais são bem relatados. Essas moléculas são administradas na forma pentavalentes de pró-fármaco e convertida na sua forma trivalente ativa (SHAKED-MISHAN et al., 2001; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). A redução mediada pelo parasito é atribuída à ação de uma redutase, que também está relacionada à resistência ao fármaco. Essa evidência é corroborada pela observação de que amastigotas de L. donovani resistentes aos pentavalentes têm baixa atividade de redutase (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). Ambas as formas pentavalentes e trivalentes são ativas contra as espécies de Leishmania e parecem atuar na fragmentação do DNA, na β-oxidação de ácidos graxos e na fosforilação do ADP. Além disso, parece atuar na inibição da glicólise e da tripanotiona redutase, uma enzima responsável pela proteção do parasito contra espécies ativas de oxigênio e nitrogênio (OPPERDOES; MICHELS, 2008; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). Anfoterecina B A Anfotericina B (AnB) é um antibiótico macrolídeo obtido a partir da cultura Streptomyces nodosus e comercializado com os nomes de Abelcet®, AmBisome®, Amphocil®, Fungizone®. Esse fármaco é largamente utilizado para o tratamento de infecções fúngicas, atuando como fungistático ou fungicida, dependendo da dose administrada. A anfotericina A, produzida pela mesma cultura de bactérias, não é utilizada em tratamento clínico de infecções fúngicas em razão de sua alta toxicicidade. Os efeitos colaterais tóxicos observados na terapia com a anfotericina B são atribuídos à contaminação por anfoterecina A, que não são completamente removidos durante o 10 processo de purificação (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). A AnB é utilizada para tratamento das leishmanioses em regiões onde os parasitos são resistentes aos antimoniais. No estado de Bihar, conhecida região endêmica na Índia, a AnB é o fármaco de escolha devido à resistência aos antimoniais. A AnB atua sobre o ergosterol da membrana celular dos fungos, que também é encontrado no parasito Leishmania. A membrana celular dos macrófagos também é afetada devido à presença de colesterol. Entretanto, a AnB possui maior afinidade pelo ergosterol e, portanto, maior efeito letal. O mecanismo de ação da AnB consiste em se ligar ao ergosterol da membrana celular do parasito e provocar alterações osmóticas que culminam na lise celular (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). A AnB tem baixa absorção gastrointestinal e por isso é administrada via parenteral com injeções intravenosas. As doses recomendadas pela Organização Mundial da Saúde são 1mg/kg em infusões diárias por 20 dias ou infusões em dias alternados por 30 dias. Os efeitos colaterais agudos comumente observados são calafrios, febre, anorexia, náuseas, vômitos, cefaleias, mialgia, artralgia e hipotensão. Efeitos tóxicos graves são observados em infusões rápidas do fármaco, que não são recomendadas (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). A AnB possui também formulações lipossomais criadas para minimizar os efeitos colaterais e aumentar a eficácia do fármaco. Essas formulações lipossomais são L-AnB ( Ambisome®), AnB dispersão coloidal: ABCD (Amphocil®) e AnB complexo lipídico: ABLC (Abelcit®). Solomon e colaboradores (2013), demonstraram que a LAnB é mais eficaz, melhor tolerada e mais custo efetiva para o tratamento da leishmaniose cutânea do que os antimoniais (SOLOMON et al., 2013). Miltefosina A miltefosina é o fármaco antileishmania mais eficaz atualmente, podendo ser empregado para o tratamento de todos os tipos de leishmaniose. A miltefosina foi primeiramente aprovada para uso tópico no tratamento de metástase cutânea do câncer de mama, embora sua alta efetividade antitripanossomal já tivesse sido demonstrada. Formulações orais de miltefosina foram também avaliadas para o tratamento de tumores 11 sólidos, mas foram abandonadas em razão dos fortes efeitos colaterais apresentados (DORLO et al., 2012). A miltefosina é comercializada com os nomes de Miltex®, líquido para uso tópico em humanos; Milteforan®, líquido para uso oral em animais e Impavido®, formulação sólida para uso humano. Esse último foi recentemente aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento das três formas clínicas de leishmaniose. O Impavido® foi o primeiro fármaco aprovado pelo FDA para tratamento das leishmanioses(http://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/). Miltefosina (hexadecylphosphocholine) pertence à classe dos alquilfosfocolina, que são ésteres de fosfocolina de álcoois alifáticos de cadeia longa. Esses compostos são estruturalmente relacionados ao grupo dos alquil-lisofosfotidilcolinas, que são análogos sintéticos dos lisofosfatidilcolinas ou lisolecitinas, mas sem seu grupo glicerol. A miltefosina atua como inibidor Akt, também conhecida como Proteína Quinase B (PQB) (DORLO et al., 2012). Embora seja o fármaco mais eficaz no tratamento das leishmanioses, a miltefosina ainda custa muito caro para os países subdesenvolvidos que enfrentam endemias de leishmaniose. Na Índia, por exemplo, o custo para o tratamento de um paciente do sexo masculino, com massa corporal de 39 kg é em torno 200 dólares. Nos países desenvolvidos o valor pode chegar a 3000 euros (DORLO et al., 2012). A miltefosina age de modo semelhante nas células tumorais e em Leishmania. Os efeitos atribuídos são apoptose e perturbação da via de sinalização celular dependente de lipídios, embora o mecanismo preciso seja pouco claro. Nas formas intracelulares de Leishmania, após a absorção do fármaco, ele atua no metabolismo de lipídios e na composição da membrana, provoca fragmentação do DNA, induzindo apoptose e inibe a citocromo c oxidase da mitocôndria (DORLO et al., 2012; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). Quanto à resistência dos parasitos Leishmania à miltefosina ainda não há relatos clínicos ou laboratoriais. Indução de cepas resistentes in vitro já foi obtida, mas não in vivo. Além disso, o mecanismo no qual o parasito adquire resistência ainda não está claro. Alguns autores, entretanto, alertam para o risco do surgimento de formas resistentes de Leishmania à miltefosina em regiões endêmicas, onde o tratamento por via oral pode induzir a seleção de formas resistentes (DORLO et al., 2012; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). 12 Pentamidina A pentamidina tem sido usada para o tratamento das diferentes formas clínicas da leishmaniose. Durante muitos anos foi usada para tratamento da LV na Índia, mas abandonada após o surgimento de cepas resistentes (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). Entretanto, para o tratamento da leishmaniose cutaneomucosa, a pentamidina demonstrou excelentes resultados, superando a eficácia do estibogluconato e apresentando eficácia equivalente à meglumina (AMATO et al., 2007). Esses resultados, no entanto, não são os mesmos para todas regiões endêmicas, podendo variar entre as diferentes espécies causadoras. A pentamidina (Pentacarinat®) é usada em esquemas terapêuticos que dependem da forma clínica da leishmaniose. Para a forma visceral é usado 4mg/kg de isetionato de pentamidina, em dias alternados, até um máximo de 10 injeções, preferencialmente por via intramuscular. Para a forma cutânea emprega-se 4mg/kg de isetionato de pentamidina, por via intramuscular, a cada três dias (um dia sim, dois não), num total de 3 injeções. Para a leishmaniose mucocutânea utiliza-se 4mg/kg de isetionato de pentamidina, por via intramuscular, a cada três dias (um dia sim, dois não), num total de 5 injeções. Os efeitos colaterais mais comuns são: hipotensão, hipoglicemia, pancreatite, arritmia cardíaca, leucopenia, trombocitopenia, insuficiência renal aguda, hipocalcemia e taquicardia ventricular (MASMOUDI et al., 2013; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). A pentamidina é uma diamina aromática denominada 4-[5-(4- carbamimidoylphenoxy) pentoxy] benzenecarboximidamide. Originalmente, foi usada para tratamento da tripanossomíase africana, mas tem sido usada desde a década de 1930 para o tratamento das leishmanioses (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007). A redução de sua eficácia e o alto risco de resistência tem diminuído seu uso em algumas regiões endêmicas, todavia algumas combinações com outros fármacos têm sido propostas. O mecanismo de ação permanece pouco claro, mas há evidências de que a pentamidina entra no protozoário Leishmania utilizando transportadores argininina e poliamina. Sun & Zhang (2008) demonstraram que a pentamidina atua inespecificamente sobre RNA-t, impedindo a aminoacilação e a tradução gênica (SUN; ZHANG, 2008). 13 Paromomicina A paromomicina é um antibiótico aminociclitol-aminoglicosídeo empregado para tratamento de infecções bacterianas. Utilizado em terapia combinada ou isolada demonstrou alta eficácia no tratamento da leishmaniose visceral. Entretanto, era conhecida por apresentar eficácia reduzida para as formas cutâneas de leishmaniose. Recentemente, um estudo feito com 31 pacientes com leishmaniose cutânea pós kalazar tratados com paromomicina demonstrou ser altamente tolerada pelos pacientes, apresentando efeitos colaterais insignificantes. A eficácia, no entanto, permaneceu baixa, em torno de 37% de cura (SUNDAR et al., 2014). A paromomicina foi comparada com anfotericina B para o tratamento de leishmaniose visceral em estudo multicêntrico de fase 3, realizado em Bihar, Índia. A paromomicina foi administrada por via intramuscular em doses diárias de 11 mg/kg por 21 dias. Os resultados demonstraram que a paromomicina foi tão eficaz quanto à anfotericina B (SUNDAR; JHA; THAKUR, 2007). Outro estudo de fase 3 testou a paromomicina isolada ou combinada com gentamicina em pacientes com leishmaniose cutânea, causada por Leishmania major na Tunísia. Os resultados comprovaram que aplicação de creme contendo 15% de paromomicina com ou sem 0,5% de gentamicina conferiu cura em até 82% dos casos (BEN SALAH et al., 2013). 1.2.5 Metabolismo energético como alvo de fármacos antileishmania O processo de geração de energia nos seres vivos pode ocorrer na presença ou na ausência de oxigênio. O processo aeróbico consiste na completa oxidação da glicose em gás carbônico e água, mediante reações do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória, ambas de ocorrência mitocondrial. Nessa via, o oxigênio age como aceptor final de elétrons durante o processo chamado de fosforilação oxidativa, no qual ocorre a maior produção de ATP. Já nos processos fermentativos, a geração de energia não envolve a participação do oxigênio e as reações não quebram a glicose por completo, o que resulta em intermediários com potencial energético, tais como etanol e lactato. As fermentações alcoólicas e lácticas são antecedidas pelas reações de glicólise, que consistem na quebra 14 da glicose em piruvato. A glicólise ocorre no citosol e é composta de dez reações que quebram a molécula de glicose em duas moléculas de piruvato. Nos kinetoplastideos, incluindo o genêro Leishmania, o processo de geração de energia apresenta algumas peculiaridades, que os tornam diferentes dos demais organismos. Nos kinetoplastídeos existem três locais onde as reações geradoras de ATP ocorrem: no citosol, no glicossomo e na mitocôndria (figura 4) (HANNAERT, 2003). O glicossomo é uma organela membranosa exclusiva dos kinetoplastídeos, semelhante ao peroxissomo das células animais. Embora apresente outras enzimas ou sistemas enzimáticos, o glicossomo está intimamente relacionado à geração de energia por meio da glicólise (HANNAERT, 2003; OPPERDOES; COOMBS, 2007). Nessa organela, ocorrem os sete primeiros passos da glicólise, que resultam na quebra da glicose em duas moléculas de 3-fosfoglicerato. As três últimas reações ocorrem no citosol e culminam na formação de piruvato (OPPERDOES; COOMBS, 2007). O piruvato, por conseguinte, é oxidado na matriz mitocondrial à acetil-CoA, que reage com oxaloacetato, iniciando o ciclo de Krebs. O processo é finalizado com cadeia transportadora de elétrons (BRINGAUD; RIVIÈRE; COUSTOU, 2006) (figura 4). Diferentemente dos mamíferos que possuem milhares de mitocôndrias, os kinetoplastídeos apresentam apenas uma mitocôndria. Este fato torna esses protozoários extremamente dependentes de sua mitocôndria (MEHTA; SHAHA, 2004). A mitocôndria dos kinetoplastídeos apresenta densidade da matriz, número e forma das cristas ligeiramente diferentes das mitocôndrias dos mamíferos. A matriz é ocupada principalmente por moléculas de DNA circulares, denominadas DNA do kinetoplasto ou k-DNA. O genoma contido nessas moléculas codificam proteínas participantes da cadeia respiratória e do mecanismo de tradução (FIDALGO; GILLE, 2011). Entretanto, essas proteínas representam apenas 5% do total encontrado na mitocôndria. Isso significa que a maioria das proteínas mitocondriais é codificada por genes nucleares, traduzidas no citoplasma e posteriormente transportadas para a mitocôndria (FIDALGO; GILLE, 2011) 15 Figura 4 As principais vias do metabolismo energético em Leishmania major. Reações da glicólise, que ocorrem no glicossomo no citosol e ciclo de Krebs, na mitocôndria. O fluxo de metabólitos entre as duas organelas também é apresentado. Metabólitos são substratos (cinza) ou produtos finais (preto) do metabolismo. Setas grossas representam fluxos metabólicos principais. Vias em azul acreditam-se ser mais importantes em promastiogotas e vias em vermelho acreditam-se ser mais importantes em amastigotas. Abreviações Fru, frutose; GAP, gliceraldeído 3 fosfato; Glc, glicose; H-5-P, hexose 5-fosfato; Man, manose; PEP, fosfoenolpiruvato; PGA, ácido fosfoglicérico; PPP. Enzimas da via pentose-fosfato: 1, hexoquinase; 2, fosfoglicose isomerase; 3, fosfofrutoquinase; 4, frutose bifosfato aldolase; 5, triofosfato isomerase; 6, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; 7, fosfoglicerato quinase; 8, glicerol-3-fosfato desidrogenase; 9, glicerol quinase; 10, adenilato quinase; 11, glicose-6-fosfato deaminase; 12, manose-6-fosfato isomerase; 13, fosfomanomutase; 14, GDP-manose pirofosforilase; 15, fosfoglicerato mutase; 16, enolase; 17, piruvato quinase; 18, fosfoenolpiruvato carboxinase; 19, malato desidrogenase; 20, fumarato hidratase; 21, NADHdependente fumarato redutase; 22, enzima málica; 23, alanina aminotransferase; 24, aspartato aminotransferase; 25, piruvato fosfato diquinasese; 26, citrato sintase; 27, 2-cetoglutarato desidrogenase; 28, succinil-CoA ligase; 29, succinato desidrogenase; 30, acetato–succinato CoA transferase; 31, piruvate desidrogenase; 32, citrato liase; 33, acetil-CoA sintetase; 34, via de oxidação prolina; 35, via de oxidação da treonina; 36, ribuloquinase; 37, riboquinase; 38, xiloquinase; 39, proteína amilase-semelhante; 40, proteína sucrase-semelhante. Baseado em Opperdoes e Coombs (2007). 16 O modo como a Leishmania produz energia a partir dos nutrientes disponíveis depende do estádio do parasito, portanto do ambiente onde se encontra. As diferenças morfológicas entre as formas amastigotas e promastigotas de Leishmania refletem, em essência, diferenças moleculares e bioquímicas. Essas diferenças são responsáveis pela adaptação do parasito ao mamífero hospedeiro e ao inseto vetor (ROSENZWEIG et al., 2008). O sequenciamento do genoma das principais espécies de Leishmania, bem como análise proteômica de alguns genes permitiram conhecer melhor essas diferenças e deduzir as adaptações de cada estádio no seu ciclo de vida (OPPERDOES; COOMBS, 2007; ROSENZWEIG et al., 2008). Sabe-se, por exemplo, que as condições físicoquímicas em que vivem ambos os estádios são muito diferentes. As formas promastigotas vivem no intestino dos flebotomíneos em condições de pH levemente ácido a neutro, enquanto que as formas amastigotas encontram-se em pH ácido no vacúolo parasitóforo. Outro aspecto importante é a disponibilidade de oxigênio e de carbono para ambas as formas. Assim, as diferenças metabólicas entre os dois estádios estão relacionadas, dentre outros fatores, ao tipo de nutriente disponível e como esse nutriente é utilizado para gerar energia (OPPERDOES; COOMBS, 2007). O conhecimento atual sobre o metabolismo energético das formas promastigotas de Leishmania foi obtido a partir de experimentos realizados in vitro e análise comparativa com as formas promastigotas de T. cruzi e T. brucei, com as quais guardam semelhanças (OPPERDOES; COOMBS, 2007). Nessas formas, o processo de geração de energia envolve a glicólise, ciclo de Krebs e cadeia transportadora de elétrons, embora haja dúvidas quanto ao ciclo de Krebs ser ou não ativo (OPPERDOES; COOMBS, 2007; VAN HELLEMOND; VAN DER MEER; TIELENS, 1997). As formas promastigotas utilizam glicose e aminoácidos, mas mudam para ácidos graxos durante a transição para formas amastigotas. Apesar de uma pequena quantidade de glicose ser completamente oxidada a CO2, a maior quantidade é fermentada gerando como produtos finais: acetato, L-alanina, piruvato e succinato (BRINGAUD; RIVIÈRE; COUSTOU, 2006; OPPERDOES; COOMBS, 2007). A mudança da predileção de glicose para ácidos graxos durante a transição não está relacionada à privação do glicídio no interior do vacúolo parasitóforo, mas às diferenças fisíco-químicas dos dois meios que provocam expressão diferencial de certos genes (SAUNDERS et al., 2014) 17 Os estudos relacionados ao metabolismo energético das formas amastigotas são escassos, portanto, muitos aspectos são ainda desconhecidos. Foi demonstrado, no entanto, que amastigotas obtidas de lesões apresentam baixo consumo de glicose e de prolina e aumento da β-oxidação de ácidos graxos (OPPERDOES; COOMBS, 2007). Rozenzweig et al (2008) confirmaram em estudos in vitro que durante diferenciação tardia de promastigota para amastigota, as enzimas glicolíticas glicossomais aumentam ligeiramente, enquanto que a expressão de genes codificadores das enzimas citosólicas: fosfoglicerato mutase, enolase e piruvato quinase sofrem regulação negativa (ROSENZWEIG et al., 2008). Por outro lado, as enzimas reguladoras da gliconeogênese, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e frutose 1,6 bifosfatase aumentam significativamente sua expressão, provando que a gliconeogênese é essencial para a sobrevivência das amastigotas no vacúolo parasitóforo (ROSENZWEIG et al., 2008). Além disso, tanto as amastigotas derivadas de lesão quanto às derivadas de cultura acumulam altos níveis de oligômeros de manose, que funcionam como reserva energética. A liberação desse material tem papel regulatório nos níveis de glicose-fosfato, no fluxo da glicólise e da via das pentoses-fosfato (SAUNDERS et al., 2014). De fato, a β-oxidação é a principal forma de geração de energia nas amastigotas. Todavia, a Leishmania é incapaz de utilizar ácidos graxos como única fonte de carbono, por isso utilizam também frutose, manose e glicose. Além disso, o acetil-coA gerado é co-catabolizado com glicose no ciclo de Krebs que está direcionado para a biossíntese de glutamato/glutamina (SAUNDERS et al., 2014). Nesse processo, a unidade de dois carbonos derivada do ácido graxo é combinada com o ácido dicarboxilíco de quatro carbonos provenientes da fermentação glicossomal do succinato. Isso resulta na formação de citrato, que é convertido em α-cetoglutarato e glutamato (SAUNDERS et al., 2014) (figura 5) Saunders et al (2014) demonstraram também que as amastigotas são altamente dependentes da síntese mitocondrial de novo de glutamato e glutamina. As amastigotas utilizam esses aminoácidos para síntese de glutationas/tripanotionas, pirimidinas e amino glicídios, considerados essenciais para o crescimento e resposta ao estresse do interior do vacúolo parasitóforo (SAUNDERS et al., 2014). A compreensão das diferenças metabólicas entre os dois estádios evolutivos de Leishmania e entre esses estádios e o hospedeiro humano permite identificar potenciais 18 alvos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania. Como visto anteriormente, a maioria das reações envolvidas na glicólise ocorre no glicossomo, organela exclusiva dos Kinetoplastídeos. Essas reações são catalisadas por enzimas bem conhecidas em ambos os estádios promastigotas e amastigotas. Todavia, a atividade dessas enzimas não é a mesma em ambos os estádios. As enzimas malato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e glucose-6- fosfato isomerase, por exemplo, têm atividade muito maior do que as enzimas hexoquinase, fosfofrutoquinase e glicose-6-phosfato desidrogenase (OPPERDOES; MICHELS, 2008; SAUNDERS et al., 2014). Além disso, os nutrientes utilizados por ambos são diferentes, tornando algumas vias essenciais, como é o caso da gliconeogênese para as formas amastigotas (OPPERDOES; MICHELS, 2008). O metabolismo mitocondrial também apresenta alvos específicos para o desenvolvimento de inibidores seletivos. As enzimas succinil-CoA ligase e acetato:succinato-CoA transferase, por exemplo, só são encontradas praticamente nos tripanossomatídeos. Essas enzimas convertem acetil-CoA em acetato, que posteriormente é utilizado para produzir ATP (VAN HELLEMOND; OPPERDOES; TIELENS, 1998). Acrescenta-se ao repertório, o complexo I NADH:quinona oxidoredutase, ausente ou pouco ativa em mamíferos; a fumarato redutase, que converte succinato em fumarato, encontrada em Leishmania e Trypanossoma (FIDALGO; GILLE, 2011). Diferenças observadas no metabolismo energético de mamíferos hospedeiros e de Leishmania fornecem perspectivas animadoras na busca de fármacos específicos que atuam contra enzimas do parasito, sem afetar significativamente o metabolismo do hospedeiro (KAUR et al., 2011; VERLINDE et al., 2001). 19 Figura 5 Metabolismo do carbono de Leishmania mexicana nas formas promastigotas (A) e amastigotas (B). Maior fonte de carbono (azul) e metabólitos produzidos. Abreviações: αKG, α-cetoglutarato; AcCoA, acetil-CoA; Ala, alanina; Asp, aspartato; Cit, citrato; Fum, fumarato; FA, ácido graxo; G6P, glicose-6-fosfato; G3P, gliceraldeído-3-fosfato; Gln, glutamina; Glu, glutamato; Mal, malato; OAA, oxaloacetato; OAc, acetato; PEP, fosfoenolpiruvato; PPP, via pentose fosfato; Pro, prolina; Pyr, piruvato; SCoA, succinil-CoA; Suc, succinato; TCA, ciclo do ácido tricarboxílico. Adaptada de Saunders et al. (2014). 20 1.3 Malária A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium, com cinco espécies de importância médica: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. A espécie P. falciparum causa a malária grave, sendo responsável pela maioria das mortes pela doença. O P. vivax, embora cause malária não grave, é de grande importância em razão de sua ampla distribuição e por apresentar um estádio dormente chamado hipnozoíto, responsável pelas recaídas de malária. Além disso, o P. vivax é capaz de sobreviver nos mosquitos anofelinos encontrados em altas altitudes e temperaturas mais baixas (WHO, 2014). No Brasil, não há casos autóctones de malária por P. ovale e por P. knowlesi. As ocorrências mais comuns são de P. vivax e P. falciparum e relatos de casos de P. malariae (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2010). 1.3.1 Ciclo biológico do Plasmodium sp O ciclo do Plasmodium spp requer a participação de dois hospedeiros: um hospedeiro invertebrado (mosquito) e um hospedeiro vertebrado (aves, répteis ou mamíferos). Normalmente, o invertebrado é o hospedeiro definitivo, porque nele ocorre a fase sexuada de reprodução do parasito. Nos tecidos dos vertebrados ocorre a fase assexuada, por isso são denominados hospedeiros intermediários (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009). O ciclo se inicia quando a fêmea anofelina infectada injeta a forma esporozoíta no hospedeiro humano durante o repasto sanguíneo (figura 6). Em seguida, os esporozoítos invadem os hepatócitos ou outros órgãos, dependendo da espécie de Plasmodium. Ao entrar nas células do fígado iniciam o ciclo assexuado denominado ciclo pré-eritrocítico ou esquizogonia exoeritrocítica primária. No interior dos hepatócitos, os esporozoítos se transformam em trofozoítos, que passam a se alimentar do citoplasma da célula hospedeira. Após uma semana, dependendo da espécie, os trofozoítos sofrem maturação e começam a esquizogonia. Inicialmente, são formados vários núcleos filhos, transformando o parasito em um esquizonte. Após várias mudanças no citoplasma e nos núcleos, a esquizogonia termina com a formação dos 21 merozoítos. Essas formas rompem os hepatócitos, invadem as hemácias e iniciam o ciclo eritrocítico. No interior das hemácias, os merozoítos se transformam novamente em trofozoítos que passam apresentar uma forma anelar, resultante da formação de um grande vacúolo alimentar no citoplasma. Na medida em que o trofozoíto cresce, seu citoplasma se torna menos visível e os grânulos de hemozoína aparecem mais destacados. A hemozoína é o produto final resultante da degradação da hemoglobina do hospedeiro (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009). Os merozoítos se desenvolvem rapidamente em esquizontes ou merontes. Na esquizogonia eritrocítica, o citoplasma aglutina-se ao redor do núcleo antes da citocinese ocorrer. Quando a merogonia termina, os merozoítos rompem as hemácias e resíduos metabólicos, incluindo a hemozoína, são liberados. Esses compostos são responsáveis pelos principais sintomas agudos da malária. A maioria dos merozoítos é destruída pelo sistema imunológico do hospedeiro, mas mesmo assim, a parasitemia continua alta devido à esquizogonia eritrocítica produzir um grande número de novos merozoítos. Além disso, a hemozoína é tóxica para os macrófagos, diminuindo sua eficiência fagocitária. Após indeterminadas gerações, alguns merozoítos entram nos eritrócitos e se transformam em macrogametócito e microgametócito. Essas formas variam nas diferentes espécies de Plasmodium e são infectantes para o hospedeiro definitivo. Se não forem ingeridas pelo mosquito, esses estádios morrem e são fagocitados pelas células de defesa (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009) O ciclo começa no mosquito quando os gametócitos são ingeridos juntos com as hemácias parasitadas do hospedeiro durante o repasto sanguíneo. As hemácias são digeridas e os gametócitos são liberados e sofrem transformação. O macrogametócito forma o macrogameta (feminino), enquanto o microgametócito origina o microgameta (masculino). O processo de maturação do macrogametócito é acompanhado de mudanças discretas no núcleo, enquanto que a transformação do microgametócito em microgameta é bem mais expressiva e é denominada exoflagelação. Após se tornar extracelular, o núcleo do microgametócito se divide e forma seis a oito núcleos filhos, cada um dos quais está associado com elementos de um axonema desenvolvido. Após completar todas as mudanças necessárias, o microgameta nada até encontrar o macrogameta e fertiliza-o. O zigoto formado alonga-se e torna-se oocineto. O oocineto, então penetra na membrana peritrófica no intestino do mosquito e migra intracelular e 22 extracelularmente até a hemocela próxima ao intestino (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009). O oocineto evolui para oocisto, que sofre meiose dando origem a massas nucleares haploides, denominadas esporoblasto. Múltiplas divisões mitóticas do esporoblasto formam os esporozoítos. Estas formas então migram pelo corpo do mosquito e quando atingem as glândulas salivares penetram em canais existentes nas glândulas e podem ser injetados no hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo. O desenvolvimento do esporozoíto ocorre em um período de dez dias a duas semanas, dependendo da espécie e da temperatura (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009). Os mosquitos do gênero Anopheles spp são os principais vetores da malária humana e uma vez infectados permanecem transmitindo a doença por toda a vida. O gênero Anopheles abriga cerca de 400 espécies, mas apenas 30 espécies são de importância epidemiológica. No continente africano, a espécie A. gambiae é a mais importante na transmissão da doença e no Brasil é a espécie A. darlingi. O Plasmodium pode também ser transmitido por transfusão de sangue, transplante de órgãos, compartilhamento de seringas entre usuários de drogas, materno-fetal e acidentes de laboratório (WHO, 2014). 23 Figura 6 Ciclo biológico do Plasmodium spp. A fêmea do mosquito Anopheles sp adquire o parasito ao alimentar-se de sangue de indivíduos infectados. Após completar o ciclo no mosquito, o protozoário é transmitido para os indivíduos saudáveis nos quais realiza um novo ciclo, passando por vários estádios. Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/malaria/. Página do Centro de Controle de Doenças, governo dos Estados Unidos. Conteúdo de domínio público, conforme política de acesso. 1.3.2 A doença As manifestações clínicas da malária dependem de fatores relacionados ao parasito, aos hospedeiros e a fatores geográficos e sociais. Em relação ao parasito são considerados a resistência aos fármacos utilizados, a taxa de multiplicação, as vias de invasão, a citoaderência, o polimorfismo antigênico, a variação antigênica e as toxinas maláricas. Os fatores relacionados aos hospedeiros são: a imunidade, as citocinas próinflamatórias, a idade, a gravidez e a predisposição genética. Acesso ao tratamento, fatores econômicos e culturais, estabilidade política, intensidade da transmissão na qual se consideram a espécie transmissora, a sazonalidade e epidemias estão relacionados aos fatores sociais e geográficos. Todos esses fatores contribuem para as variações clínicas da malária entre os quadros assintomáticos aos casos mais graves, geralmente fatais (MILLER et al., 2002). 24 Todas as espécies de Plasmodium que infectam humanos podem causar febre, cefaleia, mal-estar, dores musculares, tremores e anemia hemolítica. Mas somente P. falciparum causa as complicações neurológicas, hipoglicemia, acidose metabólica e dificuldade respiratória. Esses sintomas, se não administrados corretamente, podem levar o pacientes à morte, principalmente crianças e mulheres grávidas. O P. falciparum apresenta cepas virulentas capazes de invadir todos os estádios eritrocíticos e formas não virulentas que infectam um número limitado de eritrócitos, sendo responsáveis por quadros clínicos menos severos (MILLER et al., 2002). As manifestações clínicas da malária grave são reconhecidas por afetar vários órgãos, incluindo o cérebro. A acidose metabólica é a principal causa dessas manifestações e o fator responsável pela dificuldade respiratória, que pode levar o paciente a óbito. A acidose é devido à produção de ácido láctico, atribuída a vários fatores, incluindo aquele produzido pelo parasito, à insuficiência hepática e a redução da oxigenação tecidual. Além disso, os pacientes com malária grave podem apresentar desidratação e choque hipovolêmico causados por alterações vasculares. Outro sintoma inerente à infecção pelo Plasmodium spp é a anemia, causada pela destruição das hemácias parasitadas e não parasitadas (MILLER et al., 2002). 1.3.3 Epidemiologia e controle Estima-se que, globalmente, cerca de 3,4 bilhões de pessoas estão sob o risco de contrair malária. Em 2012, foram relatados 207 milhões de novos casos e aproximadamente 627 mil pessoas morreram pela infecção. A doença é endêmica em 104 países, com predomínio dos países africanos nos quais também ocorre o maior número óbitos pela doença, principalmente menores de cinco anos e mulheres grávidas. No Brasil, 4,5 milhões de pessoas estão sob alto risco de contrair a infecção e cerca de 2,4 milhões de casos suspeitos foram relatados em 2012. Nesse mesmo ano, o número de casos confirmados foi, aproximadamente, 243 mil casos, com 64 mortes, o maior das Américas (figura 7) (WHO, 2014). 25 Figura 7 Mapa da população mundial sob-risco de contrair malária. World Health Organization, WHO, 2014. A principal forma de transmissão da malária é a vetorial. Aproximadamente, 400 espécies de mosquitos do gênero Anopheles são capazes de transmitir a doença. Entretanto, apenas cerca de trinta dessas espécies são de importância epidemiológica por serem mais susceptíveis à infecção pelo Plasmodium spp. Na África, a principal espécie é A. gambiae que compreende um complexo composto de seis espécies indistinguíveis morfologicamente, mas com comportamentos e ecologia bem distintos. A espécie A. gambiae stricto sensu é a mais perigosa e competente vetora da malária, por ser altamente antropofílica e susceptível ao P. falciparum. Além disso, tem hábito endofílico (ato de permanecer no interior das habitações humanas), se reproduz em coleções de água limpa, cisternas e poços de água (BAYOH et al., 2010). No Brasil, a principal espécie vetora é A. darlingi, considerada a mais perigosa da América do Sul, estendendo-se da Venezuela ao sul do Brasil. O A. darlingi tem hábito exofílico, se reproduz em água limpa dos escombros e da vegetação. Essa espécie costuma invadir as casas e tem preferência por sangue humano (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009). A malária é uma parasitose prevenível e tratável, desde que as medidas adequadas sejam adotadas. As estratégias de controle empregam o combate vetorial, através da aplicação de inseticidas no interior das casas e no ambiente externo; 26 quimioprofilaxia, recomendada para crianças e mulheres grávidas; confirmação da infecção dos casos suspeitos através do exame parasitológico de sangue e tratamento adequado dos doentes, por meio da confirmação da espécie causadora e da eventual resistência dos parasitos aos fármacos utilizados (WHO, 2014). 1.3.4 Tratamento e resistência O uso apropriado de fármacos para tratar os casos de malária e o uso de quimioprofiláticos por aqueles que estão sujeitos à infecção são partes integrantes do controle eficiente da malária nos países endêmicos. Na América do Sul, nativos usavam chá da casca da Cinchona para aliviar a febre. Descobriu-se depois que esse extrato continha alcaloides com propriedades antimaláricas eficientes e seguras. O principal alcaloide extraído da Cinchona foi o quinino, a partir do qual se produziu outros fármacos antimaláricos (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009). Na China, extratos de algumas plantas têm sido usados durante séculos para tratar pacientes com febre. Na década de 1970, um grupo de cientistas chineses descobriu que o extrato da Artemisia annua era altamente eficiente contra o P. berghei e o P. cynomolgi. Mais tarde, esse mesmo grupo identificou o princípio ativo da A. annua, um terpeno que eles denominaram artemisinina, do qual derivam vários compostos sintéticos de excelente atividade antimalárica (TU, 2011). Os principais fármacos atualmente utilizados para tratar a malária pertencem a diferentes classes de compostos químicos, mas que compartilham modos de ação semelhantes. Esquemas monoterápicos são desencorajados e os combinados são sempre recomendados. A tabela 2 apresenta os principais fármacos antimaláricos da atualidade. A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda políticas para o tratamento da malária por região. A terapia de combinação baseada em artemisinina é adotada em 79 dos 88 países nos quais o P. falciparum é endêmico. A cloroquina ainda é utilizada por alguns países onde não foi detectada resistência, como nas Américas, por exemplo. Outros 33 países da África e 52 países do globo adotam política de tratamento preventivo de casos graves com quinina ou arteméter por via intramuscular, ou com supositórios de artesunato. Para o tratamento de casos graves por P. vivax, 52 dos 58 países com transmissão em curso utilizam primaquina. Outros 13 países, dos 52 citados 27 anteriormente, recomendam testes para a deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase antes do tratamento com primaquina (WHO, 2014). Tabela 2 Principais fármacos antimaláricos. World Health Organization. Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010. Fármaco Classe Indicação Artemesinina e Endoperóxido Tratamento das infecções por P. derivados sesqueterpeno lactona falciparum; terapias combinadas orais para malária não complicada; artesunato intravenoso para doença grave. Cloroquina 4-aminoquinolina Tratamento e quimioprofilaxia de infecção por parasitos sensíveis Amodiaquina 4-aminoquinolina Tratamento da infecção por algumas cepas de P. falciparum resistentes à cloroquina e em combinação fixa com o artesunato. Piperaquina Biquinolina Tratamento da infecção por P. falciparum em combinação fixa com di-hidroartemisinina. Quinina Quinolina metanol Tratamento oral e intravenoso das infecções por P. falciparum. Quinidina Quinolina metanol Terapia intravenosa das infecções graves por P. falcipararum. Mefloquina Quinolina metanol Quimioprofilaxia e tratamento das infecções por P. falciparum. Primaquina 8-aminoquinolina Cura radical e profilaxia terminal das infecções por P. vivax e P. ovale; quimioprofilaxia alternativa para todas as espécies. Sulfodoxina- Combinação piremetamina antagonistas do folato de Tratamento das infecções por P. falciparum resistente à cloroquina, inclusive com combinação com 28 artesunato; terapia preventiva intermitente nas regiões endêmicas. Atovaquona- Combinação de quinina- Tratamento e quimioprofilaxia da proguanila antagonista do folato infecção por P. falciparum Doxiciclina Tetraciclina Tratamento (com quinina) das infecções por P. falciparum e quimioprofilaxia Halofantrina Fenantreno metanol Tratamento das infecções por P. falciparum. Lumefantrina Aril álcool Tratamento da malária por P. falciparum em combinação com arteméter. No Brasil, o Ministério da Saúde disponibiliza gratuitamente o tratamento da malária em todo território nacional. Os fármacos recomendados visam aos sintomas clínicos, matando as formas assexuadas sanguíneas; às recaídas tardias, que agem contra as formas dormentes do fígado (hipnozoítos); à interrupção da transmissão, que atuam contra as formas sexuadas sanguíneas. O esquema terapêutico utilizado considera a idade, a espécie de Plasmodium, a gravidade da doença, as condições associadas (gravidez) e exposição anterior do paciente ao parasito. Os fármacos mais utilizados são: cloroquina e primaquina, para a malária não complicada ou arteméter e lumefantrina; artesunato e mefloquina para infecções por P. falciparum. Ainda são utilizados clindamicina, quinina e artesunato para formas graves de P. falciparum (BRASIL, 2010). As políticas adotadas para o tratamento da malária visam aumentar a eficácia, reduzir custos e evitar a seleção de cepas resistentes aos fármacos utilizados. Quanto à resistência, os esforços não têm conseguido evitar o surgimento de cepas resistentes aos antimaláricos. A seguir são discutidos os mecanismos de ação e de resistência dos principais antimaláricos. 29 Artemisinina e derivados A artemisinina é extraída da Artemisia annua utilizada pela medicina popular da China por milhares de anos para tratar doenças febris, incluindo a malária. A descoberta se deu na década de 1970, quando um grupo de jovens cientistas chineses, liderados por Youyou Tu, investigou as propriedades antimaláricas de várias plantas da farmacopeia chinesa. Após vários ensaios frustrantes, eles identificaram o qinghaosu, Artemisia annua para os ocidentais, com excelente atividade antimalárica em modelos de malária animal. Dadas as dificuldades de realizarem ensaios clínicos para novos fármacos, YouYou Tu e seus colegas ingeriram o extrato para averiguar a segurança para humanos. Após servirem de cobaias para seus próprios ensaios, eles realizaram testes em pacientes infectados com P. falciparum e P. vivax e obtiveram excelentes resultados (TU, 2011). Encorajados pelos resultados dos ensaios, empreenderam uma busca para identificar o principio ativo da A. annua. Um ano depois, eles isolaram uma substância cristalina, incolor de peso molecular de 282 Da, fórmula molecular C15H22O5, com ponto de fusão entre 156-157 ºC, a qual denominaram artemisinina, o principio ativo do extrato. A partir desse composto natural, eles produziram ainda outros três compostos com excelente atividade antimalárica: a di-hidroartemisinina, forma reduzida da artemisinina; a arteméter, um metil éster solúvel em óleo; e o artesunato, sal hemissuccinato hidrossolúvel da di-hidroartemisinina (figura 8) (TU, 2011). Desde então milhões de pessoas com malária na China, Ásia, África e em diversas outras regiões do mundo têm sido tratadas com a artemisinina e seus derivados semissintéticos de modo eficiente e seguro. Artesunato Di-hidroartemisinina Artemisinina Arteméter Figura 8 Fórmulas moleculares da artemisinina e seus derivados. A artemisinina e seus derivados são esquizonticidas potentes, atuando rapidamente contra todos os estádios assexuados sanguíneos de todas as espécies de Plasmodium que afetam humanos. Esses fármacos atuam também direta e indiretamente 30 contra gametócitos, exoflagelação e produção de oocistos de P. falciparum e contra o desenvolvimento de esquizontes hepáticos de P. yoelii (DELVES et al., 2012). A artemisinina e seus derivados são administrados por diferentes vias. A dihidroartemisinina é administrada por via oral; o arteméter por via oral ou intramuscular; a artemisinina por via oral ou supositório; o artesunato por via oral, supositório, intravenosa ou intramuscular. As formulações orais apresentam absorção rápida, atingindo concentração plasmática entre uma e duas horas e meia-vida de uma a três horas após administração. Ao passar pelo fígado a artemisinina, artesunato e arteméter são convertidos em di-hidroartemisinina, a forma ativa do fármaco (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). Esses fármacos são bem tolerados, mas alguns efeitos colaterais são comumente observados, tais como: tonturas, zumbido, reticulopenia, neutropenia e anormalidades eletrocardiográficas (REYBURN, 2010). O uso desses fármacos em esquemas monoterápicos é desencorajado pela OMS, que preconiza a terapia combinada denominada Terapia de Combinação baseada na Artemisinina (TCA). Uma das razões é a meia-vida curta desses fármacos, responsável pelas recidivas pós-tratamento. Além disso, a artemisinina e seus derivados não atuam contra os esquizontes hepáticos, tão pouco atuam contra os hipnozoítos de P. vivax e P. ovale. Outro fato relevante é desenvolvimento de resistência, muito comum em esquemas monoterápicos (REYBURN, 2010). Os esquemas combinados recomendados pela OMS estão apresentados na tabela 3. 31 Tabela 3 Terapia combinada baseada em artemisinina. World Health Organization. Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010. Esquema terapêutico Notas Arteméter-lumefantrina Formulação primeira Formulações. conjunta; 20 mg de arteméter mais linha de 120 mg de lumefantrina. tratamento em regiões com Plasmodium multidroga resistentes. Artesuntato-amodiaquina Formulação conjunta. 25/67,5 mg, 50/135 mg ou Malária não complicada 100/270 mg. em regiões epidêmicas. Formulação Artesunato-mefloquina primeira conjunta; 50mg de artesunato e 250 linha de mg de mefloquina. tratamento em regiões com Plasmodium multidroga resistentes. Di-hidroartemisinina- Formulação conjunta; 40 piperaquina primeira de terapia em hidroartemisinina e 320 de países do sudeste da Ásia. Artesunato-sulfadoxina- Primeira linha pirimetamina. tratamento em ou tetraciclina Segunda doxyciclina clindamicina ou tratamento de di- piperaquina. de 50 mg de artesunato, 500 alguns mg sulfadoxina e 25 mg países. Artesunato- mg pirimetamina. linha em de Sem formulações. alguns países. A artemisinina e seus derivados atuam inibindo a enzima adenosina cálcio trifosfatase, PfATPase. Além disso, suspeita-se que a atividade antimalárica desses fármacos inclui também a clivagem da ligação endoperóxido, na presença do íon férrico. Quando essa ligação é quebrada, são liberadas formas reativas de radicais de carbono que danificam biomoléculas importantes do parasito, incluindo proteínas e fosfolipídios (O’NEILL; BARTON; WARD, 2010). Ao danificar os fosfolipídios da membrana do Plasmodium, por exemplo, tais compostos poderiam afetar diferentes 32 estádios do ciclo de vida do parasito: formas assexuadas sanguíneas, esquizontes hepáticos, oocistos e microgametócitos, como discutido anteriormente (WHITE, 1997). A resistência à TCA é a mais temida pelos programas de erradicação da malária. E, infelizmente, já foi confirmada em várias regiões. Recentemente, foi demonstrado forte indício de resistência do P. falciparum ao artesunato usado como monoterápico e combinado com mefloquina. Os ensaios foram conduzidos na fronteira da Tailândia com o Camboja, em dois estudos randomizados. Os autores compararam a eficácia de dois tratamentos para a malária não complicada por P. falciparum em duas localidades vizinhas, uma situada no oeste do Camboja e a outra no nordeste da Tailândia. Os resultados demonstraram que a susceptibilidade do P. falciparum ao artesunato está reduzida na região do Camboja, quando comparada à Tailândia. Além disso, a resistência ficou caracterizada pela baixa redução da parasitemia nos testes in vivo sem ser acompanhada de redução nos testes susceptibilidade in vitro (DONDORP et al., 2012). O surgimento de resistência à artemisinina e seus derivados é desastrosa para os programas de controle da malária, pois são os mais eficientes fármacos antimaláricos atualmente utilizados. Cloroquina Desde a década de 1940, a cloroquina tem sido utilizada como quimioterápico de escolha, tanto para tratamento como para prevenção de todos os tipos de malária. Entretanto, o surgimento de cepas resistentes de P. falciparum restringiu seu uso. A cloroquina é uma 4-aminoquinolina, um sal de fosfato para uso oral. Ela apresenta alta taxa de absorção, concentração plasmática máxima em poucas horas e é amplamente distribuída aos tecidos (DE REVIERS, 2013). A cloroquina atua eficientemente contra esquizontes sanguíneos e é moderamente gametocida para as espécies de P. vivax, P. malariae e P. ovale. A sua ação, no entanto, não contempla as formas hipnozoítas hepáticas e, portanto, não evita recidivas da malária (DE REVIERS, 2013). O mecanismo de ação da cloroquina consiste na ligação do fármaco a hematina, impedindo a detoxificação de radicais heme livres. Esse efeito provoca o acúmulo de monômeros de heme que aumentam a permeabilidade da membrana, resultando na morte do parasito (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). Atualmente, a cloroquina é empregada também para o tratamento da artrite reumatoide, lúpus, 33 giardíase e hepatite amebiana. Apesar de ser um fármaco seguro, alguns de seus efeitos tóxicos podem limitar seu uso em mulheres grávidas, idosos e crianças. A cloroquina tem meia-vida em torno de 60 dias, por isso tem sido usada também como quimioprofilático. A OMS recomenda a quimioprofilaxia em regiões nas quais há maior risco de infecção em determinadas épocas do ano. Essa prática mantém altas concentrações sanguíneas do fármaco, prevenindo os casos graves de malária (WHO, 2014). Os primeiros relatos de resistência à cloroquina vieram da fronteira TailândiaCamboja e da Colômbia. Suspeita-se que a resistência à cloroquina chegou até à África via Sudeste da Ásia por volta de 1970. Além disso, é possível que a resistência tenha emergido independentemente de focos em Papua Nova Guiné e das Filipinas (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). O P. falciparum resistente à cloroquina está presente em praticamente todas as regiões endêmicas e a resistência do P. vivax tem aumentado ao longo dos anos. O mecanismo proposto para a resistência é uma mutação no gene que codifica o transportador de cloroquina PfCRT, localizado na membrana do vacúolo digestivo. A proteína mutante reduz significativamente o afluxo do fármaco para o vacúolo, diminuindo seu efeito sobre o parasito (FIDOCK et al., 2000). Embora tenha sido demonstrada a reversibilidade da resistência com uso de verapamil, desipramina e clorfeniramina, a aplicabilidade clínica dessa estratégia não foi ainda estabelecida (DE REVIERS, 2013). A resistência à cloroquina é também atribuída ao gene que codifica o transportador ABC PfMDR1, possivelmente envolvido na resistência à mefloquina, lumefantrina, quinina e artemisinina. Foi demonstrado que a redução do número de cópias desse gene, aumenta a susceptibilidade do P. falciparum a esses fármacos (SIDHU, 2006). Recentemente, foi sugerido também que a presença da mutação do gene para o PfCRT e do polimorfismo do gene ABC PfMDR1 existente P. falciparum podem ser um fator de risco responsável pela redução da eficácia da terapia combinada arteméter-lumefantrina e artesunato-amodioquina (VENKATESAN et al., 2014). Amodiaquina e Piperaquina Amodiaquina é também uma 4-aminoquinolina, semelhante à cloroquina e tem sido usada por décadas contra a malária. Diferentemente da cloroquina, amodiaquina 34 tem meia-vida curta, em torno de 3 horas apenas. Por essa razão, sua ação antimalárica é exercida pelo seu metabólito primário, monodesetilamodiaquina, que tem meia-vida entre 9 a 18 dias (CHURCHILL et al., 1985). Os efeitos tóxicos da amodiaquina como antimalárico têm sido debatidos ao longo dos anos. Agranulocitose, anemia aplástica e hepatotóxicidade têm sido os efeitos mais comuns (NEFTEL; WOODTLY, 1986). Além desses, outros efeitos colaterais tais como: vômitos, cefaleia e febre têm sido relatados em esquemas únicos ou combinados. Entretanto, ambos os efeitos são dosedependente e são mais comuns em esquemas quimioprofiláticos do que em esquemas terapêuticos (CAIRNS et al., 2010). A amodiaquina substitui muito bem a cloroquina em regiões onde há relatos de P. falciparum resistente. Além disso, ela é mais barata e, portanto, economicamente viável para muitos países pobres onde a malária é um sério problema de saúde pública (HWANG et al., 2006). A utilização mais frequente da amodiaquina é em esquemas combinados. A OMS recomenda amodiaquina mais artesunato para tratar malária por P. falciparum resistentes aos fármacos mais antigos, principalmente em países africanos. De fato, 17 países africanos utilizam esse esquema terapêutico como primeira ou segunda linha de tratamento (REYBURN, 2010). Entretanto, tem sido sugerido o esquema terapêutico amodiaquina mais sulfadoxina-piremetamina por ser mais vantajoso no que diz respeito a maior disponibilidade dos fármacos, ao baixo custo e a maior familiaridade para os médicos (HWANG et al., 2006). O mecanismo de ação e de resistência da amodiaquina são os mesmos da cloroquina. A resistência à amodiaquina e ao seu metabólito primário tem sido relatada em vários países africanos, alertando às autoridades sobre o risco da utilização de esquemas terapêuticos inadequados. A piperaquina pertence à classe das quinolinas, sendo uma biquinolina de alta atividade antimalárica. Testes clínicos realizados na China nos ano 1970 demonstram que a piperaquina apresentava boa tolerância, efeitos colaterais leves, alta eficácia profilática e rápida ação esquizonticida contra P. falciparum. Mais tarde, estudos comprovaram que a piperaquina era também eficaz contra isolados de P. falciparum resistentes à cloroquina. Imediatamente esse fármaco substituiu a cloroquina em muitas regiões da China com resistência comprovada (BASCO; RINGWALD, 2003). Infelizmente, a utilização da piperaquina em esquema monoterápico levou à seleção de cepas resistentes de P. falciparum e seu uso foi descontinuado. Todavia, recentemente, a 35 utilização de piperaquina em terapia combinada com di-hidroartemisinina tem sido fortemente recomendada para o tratamento da malária por P. falciparum resistente à cloroquina (BASCO; RINGWALD, 2003; FIVELMAN; ADAGU; WARHURST, 2007). Por ser uma quinolina o mecanismo de ação e de resistência são os mesmos da cloroquina e da amodiaquina. Quinina e quinidina Quinina é um alcaloide extraído de uma árvore sul-americana denominada Cinchona. É considerado o mais antigo antimalárico, sendo utilizada por nativos do Peru por séculos. A quinina é usada atualmente para tratar casos graves de malária e como segunda linha de tratamento em combinação com antibióticos para tratar malária resistente (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A quinidina é um estereoisômero dextrorrotatório da quinina de atividade antimalárica semelhante. Seu uso é recomendado para tratamento de infecções graves por P. falciparum. A quinina administrada por via oral apresenta alta taxa de absorção gastrointestinal e alcança níveis plasmáticos elevados após poucas horas. Ela se distribui amplamente nos tecidos, sendo metabolizada no fígado e excretada na urina. A meia-vida da quinina varia entre 11 e 18 horas nos controles saudáveis e aqueles com malária grave, respectivamente. A quinidina tem meia-vida mais curta do que a quinina em razão da menor afinidade com proteínas plasmáticas (DE REVIERS, 2013). Em ambos os casos, esse fato contribui para menor resistência do Plasmodium a esses fármacos. Entretanto, já existem relatos de resistência em algumas regiões do sudeste asiático, principalmente na fronteira entre o Camboja e a Tailândia (LIM et al., 2013). Suspeita-se que o mecanismo de ação da quinina e da quinidina seja semelhante ao da cloroquina, embora ainda não tenha sido demonstrado. (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). Esses fármacos atuam contra esquizontes sanguíneos, sendo efetivos contra as quatro espécies de Plasmodium mais importantes que infectam humanos. Sua ação gametocida, no entanto, restringe às espécies P. vivax e P. ovale. A quinina e quinidina também não são efetivas contra os hipnozoítos hepáticos (DE REVIERS, 2013). 36 Embora o mecanismo de resistência à quinina seja complexo, há evidências claras que três genes estejam envolvidos no processo: PfCRT e PfMDR1, mencionados anteriormente e o PfNHE1, ambos codificadores de proteínas transportadoras localizadas no vacúolo digestivo do parasito (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). O aumento da frequência desses genes, e em particular do polimorfismo do gene PfNHE1 nas diferentes regiões malarígenas pode comprometer seriamente o futuro da terapia contra a malária (MÉNARD et al., 2013). Mefloquina Quimicamente relacionada com a quinina, a mefloquina é uma 4-quinolina metanol efetiva contra cepas de P. falciparum resistentes à cloroquina. Ela também é o fármaco de escolha na quimioprofilaxia de todas as espécies de Plasmodium, apesar de seus fortes efeitos tóxicos. A administração parenteral da mefloquina não é recomendada devido à grave irritação local, restringindo sua administração a comprimidos orais. A mefloquina apresenta alta taxa de absorção intestinal, alcançando concentrações plasmáticas efetivas em poucas horas. Ela apresenta alta afinidade por proteínas plasmáticas, distribuindo-se rapidamente pelos tecidos corporais. Por apresentar baixa taxa de excreção e meia-vida longa (18-20 dias), a mefloquina é administrada em dose única que varia entre 62,5 mg a 250 mg, dependendo da idade e da massa corporal do paciente. Essas características farmacológicas fazem da mefloquina o fármaco quimioprofilático de escolha (DE REVIERS, 2013). A mefloquina tem forte ação esquizonticida, mas não atua contra gametócitos e formas dormentes hepáticas. Por essa razão, é recomendada a administração posterior de primaquina para evitar recidivas (WHO, 2014). Embora o mecanismo de ação da mefloquina não esteja completamente esclarecido, há evidências de que ela se liga ao grupo heme no vacúolo digestivo e inibe o mecanismo de detoxificação do parasito. A resistência à mefloquina está associada ao gene PfMDR1, que codifica a proteína Pghl localizada na membrana do vacúolo digestivo do P. falciparum. Essa proteína diminui o efluxo da mefloquina para interior do vacúolo digestivo, impedindo o encontro do fármaco com seu alvo. A amplificação e superexpressão desse gene têm sido apontadas como as causas de falhas no tratamento e da resistência in vitro do P. falciparum à mefloquina (COWMAN; GALATIS; THOMPSON, 1994). 37 Recentemente, foi demonstrado que a amplificação do gene MDR1 também ocorre em P. vivax (KHIM; ANDRIANARANJAKA, 2014). Esses autores apresentaram também dados epidemiológicos que confirmam que a amplificação do gene PvMDR1 é menos frequente nas regiões onde a mefloquina nunca foi utilizada (Mandagascar e Sudão) do aquelas nas quais (Camboja e Guiana Francesa) a mefloquina foi ou ainda é utilizada para tratamento ou como quimioprofilático (KHIM; ANDRIANARANJAKA, 2014). Primaquina A primaquina é utilizada como quimioprofilático e atua eficientemente contra os hipnozoítos hepáticos de P. vivax e P. ovale, sendo o único fármaco aprovado para esse fim. É uma 8-aminoquinolina sintética com boa absorção intestinal, atingindo concentração plasmática máxima em 1 a 2 horas, mas com meia-vida de 3 a 8 horas apenas (DE REVIERS, 2013). A primaquina atua contra esquizontes teciduais e gametócitos das quatro espécies de Plasmodium, mas é pouco efetiva contra as formas assexuadas sanguíneas. O uso de primaquina, no entanto, não é recomendado para pacientes com deficiência de G6PD, glicose-6-fosfato desidrogenase, devido ao risco de anemia hemolítica severa (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A prevalência desse fenótipo varia muito nas diferentes regiões de malária endêmica. Por essa razão, a OMS recomenda o teste de deficiência da G6PD antes da terapia com primaquina (WHO, 2014). O mecanismo de ação da primaquina é desconhecido, porém há evidências que esse fármaco se liga ao PfCRT e inibe o transporte de cloroquina, levando a ação sinérgica dos dois antimaláricos e à reversão da resistência à cloroquina (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A resistência de esquizontes sanguíneos ao fármaco é de pouca importância clínica devido a sua fraca atuação contra essas formas. No entanto, a resistência de esquizontes hepáticos, que poderia produzir prejuízos para terapia da malária, não tem sido seriamente detectada por mais de 50 anos de uso da primaquina (BAIRD; HOFFMAN, 2004). Tal fato pode estar relacionado à curta meia-vida ou à ação gametocida do fármaco. Além disso, relatos de resistência ao fármaco podem estar relacionados à ausência de uma melhor análise dos fatores de confundimento, tais como êmese da dose, inadequação da terapia prescrita, tolerância do parasito, resistência à 38 cloroquina e reinfecção (BAIRD; HOFFMAN, 2004). Embora seja um assunto controverso, a resistência do P. vivax à primaquina foi relatada na Nova Guiné, no sudeste da Ásia e nas Américas Central e do Sul (KRUDSOOD; TANGPUKDEE, 2008; PHILLIPS; KEYSTONE; KAIN, 1996). Por esse razão, as doses usualmente empregadas para erradicar os hipnozoítos hepáticos tiveram que ser ajustadas. Assim, atualmente é empregada a dose de 30 mg (padrão 15mg) por dia, por um período de 14 dias. Para tratamento da malária por P. vivax não complicada emprega-se a cloroquina combinada com primaquina, para infecções por cepas sensíveis à cloroquina. A cloroquina elimina as formas sanguíneas e a primaquina mata os esquizontes hepáticos. Nas regiões onde a prevalência da deficiência de G6PD é moderada, emprega-se dose de 0,75mg/kg de massa corporal, dada uma vez por semana, durante 8 semanas. Nos casos de deficiência severa de G6PD a primaquina não é recomendada (REYBURN, 2010). Nas regiões onde é adotada a terapia di-hidroartemisinina mais piperaquina como primeira linha de tratamento para P. falciparum, pode também ser usada para malária por P. vivax a combinação com primaquina para a cura radical (REYBURN, 2010). Sutanto et al (2013) sugeriram a terapia di-hidroartemisina mais piperaquinaprimaquina por apresentar maior tolerabilidade, maior eficácia e maior segurança do que aquela que emprega a cloroquina (SUTANTO et al., 2013). Atovaquona Atovaquona é um análogo da hidroxinaftoquinona estruturalmente relacionado ao ubiquinol. Embora tenha sido desenvolvido como antimalárico, ela atua também contra outros parasitos apicomplexa, incluindo Toxoplasma, Theileria e Babesia (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A atovaquona é administrada por via oral, tem baixa absorção intestinal, mas possui boa afinidade pelas proteínas plasmáticas e meia-vida de dois a três dias. Devido a seu caráter lipofílico é recomendado que a administração da atovaquona seja concomitante com o alimento, preferencialmente gordurosos (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). Ela é excretada principalmente nas fezes, na forma de fármaco inalterado. Ela atua contra as formas assexuadas sanguíneas, hepáticas e contra o desenvolvimento dos oocistos no mosquito. O mecanismo de ação consiste na ligação com o citocromo c, interrompendo a cadeia 39 transportadora de elétrons (DE REVIERS, 2013; PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A atovaquona é um fármaco bem tolerado, embora febre, cefaleia, insônia, náusea, diarreia e vômitos sejam os efeitos colaterais recorrentes da terapia (REYBURN, 2010). Recentemente, uma hidroxinaftoquinona sintética denominada N3, mostrou alta atividade in vitro para P. falciparum e limitada toxidade para células humanas (SCHUCK et al., 2013). O uso da atovaquona como monoterápico não é recomendado em razão de sua baixa eficácia. Entretanto, o efeito combinado da atovaquona com proguanila sobre P. falciparum é altamente efetiva, tanto para o tratamento como para profilaxia. O uso como profilático apresenta vantagem em relação à mefloquina devido ao curto período de tratamento ao qual o indivíduo se submete ao viajar para regiões não endêmicas. Por outro lado, o maior custo e a facilidade de desenvolver resistência são pontos negativos da terapia (DE REVIERS, 2013; PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A resistência do P. falciparum à atovaquona está relacionada a polimorfismo de nucleotídeo único, snp (single nucleotide polymorphism) do gene que codifica o citocromo b (PfCYTB), alvo molecular da atovaquona. A monoterapia com atovaquona apresenta uma das mais altas taxas de indução de resistência durante o tratamento, com a recrudescência para P. falciparum variando entre 30 a 40%. Essa tem sido uma das razões pelas quais a atovaquona é administrada com proguanila (PLUCINSKI et al., 2014). Inibidores do folato Sulfadoxina, dapsona, pirimetamina e proguanila são fármacos antifolatos usados na terapia da malária. Os dois primeiros inibem a enzima di-hidropteroato sintetase de P. falciparum, codificada pelo gene PfDHPS, enquanto que os dois últimos inibem a enzima di-hidrofolato redutase, codificada pelo gene PfDHFR. A enzima dihidropteroato sintetase é necessária para a conversão do PABA a ácido fólico. Como o ácido fólico é essencial para síntese, reparo e metilação do DNA do P. falciparum, a falta desse nutriente dificulta a reprodução do parasito (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). O ácido fólico (ácido di-hidrofólico), formado na reação anterior, é substrato da enzima di-hidrofolato redutase, que o converte em ácido tetra-hidrofólico. 40 Essa molécula, por sua vez, é precursora das bases nitrogenadas purinas e pirimidinas (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A combinação sulfadoxina mais pirimetamina foi introduzida na terapia da malária após o advento da resistência à cloroquina. As características farmacológicas das sulfadoxina, incluindo absorção, ligação à proteína, distribuição, excreção e toxidade não estão disponíveis nos melhores compêndios de Farmacologia (DE REVIERS, 2013) ou bancos de fármacos (LAW et al., 2014) A pirimetamina pertence à classe das diazinas e subclasse pirimidina. Ela tem boa absorção intestinal, alta taxa de ligação às proteínas plasmáticas, metabolismo hepático e meia via de aproximadamente 4 horas. A pirimetamina e sulfadoxina agem sinergicamente contra as formas evolutivas do Plasmodium. A pirimetamina atua contra esquizontes sanguíneos e fracamente contra os gametócitos e esquizontes hepáticos. Já a sulfadoxina é pouco efetiva contra as formas sanguíneas, mas atua eficazmente contra os esquizontes hepáticos e gametócitos (DE REVIERS, 2013). A combinação foi considerada altamente efetiva contra P.falciparum resistente à cloroquina. Por ser uma combinação barata, bem tolerada e administrada em dose única, a pirimetaminasulfadoxina deveria ter se tornado uma combinação perfeita para terapia da malária. Entretanto, o surgimento de casos de resistência em várias regiões restringiu bastante o seu uso (EMÍLIA et al., 2007; PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A resistência aos antifolatos está relacionada às mutações nos genes PfDHPS e PfDHFR, citados anteriormente. Ela ocorre em razão do acúmulo do polimorfismo de nucleotídeo único nesses genes. No gene PfDHFR ocorre três mutações pontuais envolvendo os códons 51, 59 e 108, conhecidas como DHFR triplo. Já no gene PfDHPS ocorrem duas mutações nos códons 437 e 540, conhecida como DHPS duplo. Em conjunto, elas são conhecidas como mutação quíntupla e estão fortemente associadas com a resistência in vivo e in vitro à pirimetamina-sulfadoxina bem como a resistência clínica a esses fármacos na África e na Ásia (EMÍLIA et al., 2007; RAMAN et al., 2010). A proguanila é um derivado da biguanida metabolizada no fígado pela enzima citocromo C 450 a seu metabólito ativo cicloguanila. Administrado oralmente na forma de sal hidroclorídrico, atinge níveis plasmáticos máximos em 5 horas. Ela tem meiavida de 16 horas, por isso quando utilizada como profilático deve ser administrada diariamente. Aproximadamente 50% do fármaco é excretado na urina, dos quais 60% 41 são eliminados como fármaco inalterado e 30% na forma cicloguanila e o restante é perdido nas fezes. A cicloguanila atua contra formas sanguíneas e hepáticas, incluindo esporozoítos e gametócitos. Na terapia convencional, a proguanila é administrada em associação com a atovaquona, com a qual tem efeito sinérgico. Como os antimaláricos em geral, a proguanila não é administrada em esquemas monoterápico por desenvolver resistência rapidamente. (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). A resistência está relacionada à mutação do gene PfDHFR, o mesmo que confere resistência a pirimetamina . Halofantrina e lumefantrina A halofantrina é um fenantreno metanol administrada na forma de cloridrato de halofantrina. Ela tem absorção intestinal variável, atinge níveis plasmáticos máximos em 16 horas, e tem meia-vida de quatro dias (DE REVIERS, 2013). A excreção ocorre principalmente pelas fezes. Suspeita-se que o mecanismo de ação seja o mesmo da mefloquina e quinina, sendo efetiva apenas contra as formas assexuadas sanguíneas. A halofantrina é efetiva contra a maioria das cepas de P. falciparum, embora seu uso seja limitado em razão da absorção irregular e toxicidade cardíaca (REYBURN, 2010). Apesar de ser um fármaco bem tolerado, é comum observar no paciente: dor abdominal, vômito, diarreia, tosse e exantema. Os efeitos tóxicos mais graves são dosedependente e incluem arritmias, que podem levar à morte. Ela é contraindicada para pacientes que receberam mefloquina e para gestantes (REYBURN, 2010). A lumefantrina é um aril álcool, semelhante à halofantrina, mefloquina e quinina, com os quais compartilha o mesmo mecanismo de ação. Ela está disponível apenas em preparações orais em associação com arteméter, sendo usada eficazmente contra P. falciparum multidroga resistente (REYBURN, 2010). A absorção da lumefantrina é variável, mas é aumentada pela ingestão de alimentos gordurosos. A concentração plasmática máxima é alcançada em 10 horas e o fármaco tem meia-vida terminal de três a cinco dias. Embora seja semelhante com halofantrina, a lumefantrina não provoca alterações cardíacas, tão pouco produz efeitos tóxicos significativos. Ela é bem tolerada e os efeitos colaterais mais comuns são: cefaleia, náuseas, desconforto abdominal e tonturas (DE REVIERS, 2013). 42 Dois fatores são comumente relacionados à redução da eficácia ao lumefantrina na África e na Ásia: o polimorfismo do PfMDR1, principalmente a variante N86 e amplificação do gene pfMDR1 (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). O polimorfismo de nucleotídeo único do PfMDR1 resulta na substituição de aminoácidos na posição 86 (N86Y), 184 (Y184F) e 1246 (D1246Y) e estão relacionados a resistência da maioria dos antimaláricos, incluindo a terapia combinada baseada em artemisinina. Recentemente, foi demonstrado que a implementação da combinação lumefandrinaarteméter como primeira linha de tratamento para P. falciparum na África aumentou a prevalência da variante N86, incluindo o mutante 184F e do haplótipo triplo N86-184FD1246, considerados marcadores moleculares importantes de resistência à terapia combinada baseada em artemisinina (LOBO et al., 2014). Além disso, ensaios de campo, in vitro e in vivo sugeriram que a presença do gene selvagem PfCRT em isolados e cepas de P. falciparum tem sido responsável por falhas no tratamento com lumefantrina (SISOWATH et al., 2009). Tetraciclina As tetraciclinas são antibióticos produzidos por bactérias do gênero Streptomyces. Na prática clínica são utilizados derivados sintéticos em formulações orais ou intravenosas, na forma de cloridrato ou fosfatos, ambas solúveis em água. As tetraciclinas são bacteriostáticos que inibem a síntese proteica, ligando-se ao aminoacilRNA. Nesse contexto, elas têm sido usadas para tratar infecções causadas por Chlamydia, Rickettsia, Mycoplasma, Brucella, Vibrio cholerae. A doxiciclina é um derivado sintético de meia-vida longa (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010) Absorção das tetraciclinas é relativamente alta, variando entre 60 a 80% da dose ingerida. No entanto, a absorção e a atividade do fármaco podem ser comprometidas em razão da capacidade de quelar íons metálicos bivalentes (DE REVIERS, 2013). Por isso certos alimentos, incluindo leite podem prejudicar a absorção do fármaco. Por outro, as formulações em fosfato têm melhor absorção (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). Após absorção, as tetraciclinas apresentam concentração plasmática máxima entre uma e três horas, taxa de ligação às proteínas em torno de 65% e meia-vida de 8 horas. A excreção ocorre principalmente pela urina e o restante via secreção biliar e fezes (REYBURN, 2010). 43 Os efeitos colaterais mais comuns das tetraciclinas são: náusea, vômito e diarreia. Outras reações tóxicas também são relatadas, tais como boca seca, glossite, estomatites, disfagia e ulcerações esofágicas. Além disso, as tetraciclinas interferem com metabolismo do cálcio nos ossos e dentes, comprometendo a formação dessas estruturas em recém-nascidos e crianças. Por essa razão, as tetraciclinas não são recomendadas para gestantes, lactantes e crianças menores de oito anos (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). Tetraciclina e doxiciclina são ativas contra as formas assexuadas sanguíneas de todas as espécies de Plasmodium humana. As combinações recomendadas pela OMS são: artesunato mais tetraciclina (ou doxiciclina ou clindamicina) e quinina mais tetraciclina (ou doxiciclina ou clindamicina) usadas como segunda linha de tratamento da malária não complicada por P. facliparum (REYBURN, 2010). Em 2011, a FDA aprovou uso de doxiciclina como quimioprofilático para malária por P. falciparum. Ela é recomendada para viajantes que permanecem por um período de até quatro meses em regiões onde o P. falciparum é resistente à cloroquina ou pirimetamina-suldoxina (TAN et al., 2011). Existem evidências que esses fármacos se ligam à subunidade 16S do RNA ribossômico do apicoplasto, bloqueando a expressão de seu genoma, resultando na distribuição de apicoplastos não funcionais aos merozoítos filhos (DAHL et al., 2006). 44 1.3.5 O apicoplasto e terapia antimalárica Plastídeos são organelas encontradas em plantas e algas, podendo ser verdes, vermelhos, amarelos, marrons ou incolores. Os plastídeos coloridos participam do processo fotossintético por conter pigmentos de clorofila ou carotenoides, enquanto que os incolores são de reserva energética (MCFADDEN; ROOS, 1999). Essas organelas se originaram a partir da endossimbiose entre um eucarioto não fotossintetizante e procariotos semelhantes às cianobactérias atuais. As evidências que corroboram essas suspeitas são: existência membranas duplas, DNA próprio e sistemas transcricionais e traducionais independentes (MCFADDEN; ROOS, 1999). Embora houvesse suspeitas da existência de plastídeos em parasitas humanos, a evidência mais clara foi demonstrada em 1996 por McFadden et al (MCFADDEN et al., 1996). Esses autores demonstraram que um DNA circular de 35 kb encontrado em P. falciparum e Toxoplasma gondii pertencia a uma outra organela, que não a mitocôndria. Eles descreveram nesses organismos uma estrutura ovoide, situada anteriormente ao núcleo, com duas ou mais membranas e capacidade de replicação (MCFADDEN et al., 1996). Mais tarde, essa organela foi reconhecida como um plastídeo e denominada apicoplasto, por ser encontrada em todos os protozoários do filo Apicomplexa, exceto Criptosporidium spp (MCFADDEN; ROOS, 1999; MCFADDEN, 2011). O apicoplasto, diferente dos demais plastídeos, originou-se por endossimbiose secundária, que consiste na transferência lateral entre inúmeros eucariotos durante o curso da evolução. Nesse processo, o endossimbionte primário contendo o plastídeo é englobado e mantido por outros eucariotos sem plastídeos (figura 9) (MCFADDEN; ROOS, 1999). 45 Figura 9 Esquema para a origem de todos os plastídeos por endossimbiose primária e secundária. Uma única endossimbiose entre um eucariótico heterotrófico desconhecido (cinza) e uma cianobactéria levou às três linhagens de plastídeos de origem primária (topo). Dois eventos de endossimbiose secundária envolvendo duas diferentes algas verdes e hospedeiros não relacionados levaram aos euglenídeos (azul) e cloraraquiniófitos (amarelo). Uma única endossimbiose entre uma alga vermelha e um hospedeiro heterotrófico levou a todas as algas eucarióticas remanescentes (púrpura). Perda da fotossíntese é comum em muitos dessas linhagens e, nos ciliados, a linhagem inteira não fotossintetizante. Nessas linhagens é desconhecido se os plastídeos se perderam ou se plastídeos ocultos permaneceram. Baseado em Archibald e Keeling (2002). A evidência da ocorrência de endossimbiose secundária é corroborada pela existência de quatro membranas, ao invés de duas resultantes da endossimbiose primária. Todavia, a controvérsia mais difícil de resolver foi a origem do eucarioto doador do plastídeo (MCFADDEN, 2011). Alguns autores defendiam a origem a partir 46 de uma alga verde (FUNES; DAVIDSON; REYES-PRIETO, 2002), enquanto outros apostavam na endossimbiose de uma alga vermelha (WALLER et al., 2003). Estudos realizados com Chromera velia, fotossintetizante unicelular que vive em corais, deram fim a controvérsia (MOORE et al., 2008). A C. velia pertence ao reino Chromoalveolata, superfilo Alveolata aos quais pertencem também os apicomplexas e os dinoflagelados. Esses organismos têm um plastídeo fotossintético envolvido por quatro membranas, derivado de uma alga vermelha (MCFADDEN, 2011; MOORE et al., 2008). Foi demonstrado que o plastídeo de C. velia, o apicoplasto e o plastídeo dos dinoflagelados compartilham o mesmo ancestral (JANOUSKOVEC et al., 2010). Assim, o apicoplasto é resultado do englobamento de uma alga vermelha adquirida antes dos apicomplexas e dinoflagelados se divergirem (figura 9) (JANOUSKOVEC et al., 2010). As funções do apicoplasto não foram ainda completamente esclarecidas. Todavia, algumas vias metabólicas têm sido propostas e outras confirmadas, tais como: biossíntese de ácidos graxos e de isoprenoides, síntese do heme para respiração mitocondrial e produção de aminoácidos aromáticos (MCFADDEN; ROOS, 1999; MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004). Sejam quais forem as funções dessa organela, o apicoplasto é indispensável para reprodução e sobrevivência do P. falciparum (MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004). Interferência farmacológica ou genética no apicoplasto provoca a morte do parasito (MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004). Essencialmente, o apicoplasto é uma bactéria dentro de um protozoário. Por essa razão, vários antibióticos, tais como tetraciclina, doxiciclina e clindamicina são efetivos contra os parasitos da malária. O mecanismo de ação desses fármacos permaneceu desconhecido por muito tempo. Atualmente, sabe-se que esses fármacos bloqueiam a expressão do genoma do apicoplasto, resultando em parasitos com apicoplastos inativos (DAHL et al., 2006). Em razão de sua origem e peculiaridades metabólicas, essa organela tem se tornado alvo promissor para identificação, desenho e produção de novos fármacos antimaláricos específicos. Tais fármacos poderiam interferir no metabolismo do P. falciparum sem causar efeitos tóxicos em humanos. Os alvos metabólicos mais visados no apicoplasto são a replicação do DNA, a transcrição e processamento do RNA, a tradução, síntese de ácidos graxos e biossíntese de isoprenoides (MCFADDEN; ROOS, 1999; MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004). 47 1.4 O reposicionamento in silico de fármacos para as leishmanioses e malária A terapêutica das leishmanioses e da malária tem enfrentado graves obstáculos, incluindo a baixa eficácia dos fármacos, a resistência dos parasitos e o alto custo dos fármacos mais efetivos (NWAKA; HUDSON, 2006). Sendo assim, é urgente a necessidade de melhorar os fármacos existentes e desenvolver novos fármacos que garantam a continuidade dos programas de controle dessas endemias. O processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos, em geral, é lento e muito caro (ADAMS; BRANTNER, 2006). Visando diminuir os custos e o prazo para o licenciamento de novos fármacos, bem como melhorar sua segurança e eficiência, as indústrias farmacêuticas e centros de pesquisa acadêmicos têm adotado a estratégia de reposicionamento de “velhos” fármacos, dando-lhes outras aplicações (OPREA; MESTRES, 2012; OPREA et al., 2011). A tabela 4 sumariza alguns fármacos já reposicionados. O reposicionamento é vantajoso porque tais fármacos já estão aprovados e, em geral, seus aspectos farmacocinéticos e farmacodinâmicos já são conhecidos. No que diz respeito às doenças tropicais negligenciadas o interesse das indústrias farmacêuticas em produzir novos fármacos é menor ainda. Elas alegam que o custo para pesquisar e desenvolver novos fármacos é alto e a recuperação do investimento e a lucratividade são de longo prazo (EKINS et al., 2011). Nos últimos anos, entretanto, grandes indústrias farmacêuticas, bem como a OMS têm investido milhões de dólares no reposicionamento de fármacos para tratar doenças parasitárias (EKINS et al., 2011). Em muitos casos, a descoberta do novo uso de um fármaco ocorreu de modo fortuito ou inesperado. Os exemplos mais conhecidos são a talidomida, sildenafila (viagra) , bupropiona e a fluoxetina, que atualmente apresentam novas aplicações além daquelas para as quais foram originalmente aprovados (EKINS; WILLIAMS, 2011; SARDANA et al., 2011). Entretanto, a farmacologia tem usado cada vez mais ferramentas computacionais para reposicionar fármacos e utilizá-los para o tratamento de diferentes doenças (BRAGA et al., 2014). 48 Tabela 4 Fármacos reposicionados com êxito para novas indicações. Fármaco Indicação original Nova Indicação Amantadina Influenza Doença de Parkinson Anfotericina B Infecções fúngicas Leishmaniose Aspirina Dor e inflamação Antiplaquetário Atomoxetina Antidepressivo Déficit de atenção e hiperatividade Bromocriptina Doença de Parkinson Diabetes mellitus Bupropiona Depressão Antitabagismo Colchicina Gota Pericardites recorrentes Gabapentina Epilepsia Dor neuropática Metotrexato Câncer Artrite reumatoide, Psoríase Miltefosina Câncer Leishmaniose Propranolol Hipertensão Profilaxia da enxaqueca Ácido retinoico Acne Leucemia promielocítica aguda Ropinirole Doença de Parkinson Síndrome das pernas inquietas Zidovudine Câncer HIV/AIDS Adaptada de Padhy e Gupta, 2011. A ciência farmacológica sempre dependeu da realização de testes in vitro e in vivo para descobrir e desenvolver novos fármacos. No entanto, com o avanço da bioinformática essas atividades foram complementadas pela análise in silico. Assim, nasceu a farmacologia computacional, terapêutica computacional ou farmacologia in silico (EKINS; MESTRES; TESTA, 2007). A estratégia in silico utiliza softwares que capturam, analisam e integram dados biológicos e médicos disponíveis nas variadas bases de dados de acesso livre da internet ou de outras fontes. Utilizando essa abordagem é possível construir modelos tridimensionais virtuais ou simulações que 49 permitem ao pesquisador fazer previsões, sugerir hipótese e contribuir para o avanço na área médica e farmacêutica, incluindo o reposicionamento de fármacos (ANDRADE; BRAGA, 2014; EKINS; MESTRES; TESTA, 2007). A bioinformática é considerada ferramenta crucial para a análise genética e bioquímica com vistas à descoberta, desenho e validação de novos fármacos contra diversos patógenos. Utilizando essa ciência é possível tornar mais rápido o processo de descoberta de novos fármacos, identificando os melhores alvos e simulando virtualmente a interação entre o fármaco e seu alvo (BRAGA et al., 2014; EKINS; MESTRES; TESTA, 2007). Além disso, é possível identificar um inibidor específico de uma molécula chave realizando uma busca nas bases de dados de fármacos existentes na internet, tais como Drug Bank e Therapeutic Targets. Essas bases de dados disponibilizam milhares de compostos aprovados ou em fase de testes e os alvos correspondentes ou hipotéticos. A natureza química do alvo pode ser um lipídio, um carboidrato ou ácido nucléico, todavia os melhores alvos são aqueles de natureza proteica (OVERINGTON; AL-LAZIKANI; HOPKINS, 2006). A proteína, por sua vez, pode ser um receptor, um canal ou uma enzima. O conhecimento de genômica e de metabolômica de parasitos de interesse médico aumentou muito, fornecendo enorme número de moléculas que podem ser usadas como alvos quimioterápicos. O desafio da bioinformática é reduzir esse número e criar uma lista menor de alvos que são essenciais para sobrevivência do estádio do parasito que causa a doença em humanos (CROWTHER et al., 2010; MAGARIÑOS et al., 2012). Além disso, é possível comparar as sequências por alinhamento e verificar a semelhança entre o alvo desejado e o peptídeo correspondente presente no hospedeiro. Essa busca por similaridade do alvo permite identificar novos usos para velhos fármacos (OPREA; MESTRES, 2012). Vários parasitos de interesse médico já tiveram seus genomas sequenciados, incluindo Trypanosoma cruzi, Plasmodium spp, Leishmania spp, Schistosoma mansoni, dentre outros. As informações moleculares sobre esses parasitos encontram-se disponíveis em bases de dados online. Acessando essas bases de dados é possível identificar o gene de interesse, o peptídeo correspondente, a via metabólica envolvida e compará-los com outros organismos. A partir daí é possível simular a ação de inibidores, desenhar novo inibidor ou reposicionar um fármaco (BRAGA et al., 2014; MAGARIÑOS et al., 2012). 50 O processo de investigação de novos fármacos é altamente complexo e dispendioso que demandam esforços integrados em muitos aspectos importantes envolvendo inovação, conhecimento, informação e tecnologia. Por isso, compensa realizar a análise in silico de proteínas-chaves, como as enzimas do metabolismo energético e do metabolismo do apicoplasto que possam ser alvos de inibidores seletivos. Essa análise considera essencialidade, drogabilidade, ensaiabilidade, especificidade/seletividade e importância para o estádio do ciclo de vida do patógeno de relevância para a saúde humana (CROWTHER et al., 2010). 51 2 JUSTIFICATIVA As leishmanioses e a malária são graves problemas de saúde pública em dezenas de países, incluindo o Brasil. Juntas, essas parasitoses são responsáveis por milhões de casos, que resultam em deformações, incapacitações e mortes (HOTEZ et al., 2014; WHO, 2014). Infelizmente, a quimioterapia é praticamente a única forma efetiva de reduzir a morbidade e a mortalidades provocadas por essas parasitoses. Todavia, o alto custo, a toxicidade e especialmente a resistência dos parasitos aos principais fármacos têm sido os maiores desafios enfrentados pela quimioterapia dessas parasitoses (NWAKA; HUDSON, 2006). Diante disso, é urgente a necessidade de se desenvolver novos fármacos que contornem esses problemas. Entretanto, as indústrias farmacêuticas não tem interesse em investir na pesquisa e na produção de novos fármacos porque os custos são elevados e o retorno é pouco significativo (ASHBURN; THOR, 2004). Assim, o reposicionamento de fármacos tem se mostrado uma estratégia valiosa no sentido de diminuir o tempo e os custos para desenvolvimento de novos fármacos. No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de reposicionamento in silico que consiste na busca de fármacos aprovados os quais atuam seletivamente sobre alvos específicos do metabolismo energético de Leishmania spp e do metabolismo do apicoplasto de Plasmodium falciparum. A busca por tais fármacos é mediada por excelência devido à existência de bases de dados sobre fármacos que disponibilizam ferramentas que permitem encontrar inibidores baseados na similaridade dos alvos. As bases de dados Therapeutic Targets (TT), Drug Bank, STITCH e PubChem disponibilizam mais de 28 mil fármacos, sendo que quase quatro mil são aprovados para uso em humanos. Além disso, essas bases de dados fornecem informações sobre os alvos, os testes realizados, a toxicidade e outros dados farmacológicos. 52 3 OBJETIVOS 3.1 Geral Identificar fármacos aprovados que atuam contra enzimas do metabolismo energético de Leishmania spp e contra alvos moleculares do metabolismo do apicoplasto de P. falciparum por meio de uma busca sistemática em bases de dados sobre fármacos disponíveis. 3.2 Específicos Identificar na base de dados TDR Targets cada um dos genes codificadores das enzimas do metabolismo energético, usando como referência o genoma de Leishmania major; Obter na base de dados TriTrypDB a sequência peptídica de cada uma das enzimas do metabolismo energético; Identificar fármacos anti-leishmania aprovados nas bases de dados DrugBank e TTD por similaridade do alvo; Identificar na base dados Gene DB os genes envolvidos no metabolismo geral do apicoplasto de Plasmodium falciparum; Obter na base de dados Gene DB e PlasmoDB a sequência peptídica de cada das proteínas codificadas pelo genoma do apicoplasto; Buscar nas bases de dados DrugBank, TTD e STITCH fármacos aprovados que atuam especificamente no apicoplasto de P. falciparum; Buscar informações adicionais sobre os fármacos aprovados na base de dados Pubchem. 53 4 MÉTODO(S) 4.1 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo energético de Leishmania A lista dos alvos hipotéticos foi obtida a partir da base de dados TDR Targets (http://tdrtargets.org). A base de dados TDR Targets é um projeto da Organização Mundial da Saúde que prioriza doenças tropicais negligenciadas. Seus dados são de livre acesso e fornecem informações genômicas de espécies específicas que permitem ao usuário identificar e priorizar alvos de interesse (ASLETT et al., 2010; MAGARIÑOS et al., 2012). Na página inicial selecionamos targets, em seguida, na primeira aba, selecionamos o patógeno de interesse, L. major. Na aba seguinte, foram fornecidos filtros baseados em: Name/Annotation, Features, Structures, Expression, Antigenicity, Phylogenetic distribution, Essentiality, Validation data, Druggability, Assayability e Bibliographic references. Entretanto, limitamos os filtros para aumentar a chance de nossa busca retornar resultado esperados. Mesmo assim, nem todos os genes relacionados ao metabolismo energético foram identificados nessa base de dados. Desse modo, abrimos a aba Name/Annotation e selecionamos em KEGG high-level pathway a nossa via metabólica de interesse: metabolismo energético. Em seguida abrimos o filtro Druggability e selecionamos Druggability index ≥ 0,2 (varia de 0 a 1). A página salvou automaticamente a pesquisa em my history e disponibilizou os dados em uma tabela para upload. Utilizando o nome de cada gene obtido na base de dados TDR Targets, interrogamos a base de dados TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/). Essa base de dados integra informações genômicas de patógenos da família Trypanosomatidae que incluem os gêneros Leishmania e Trypanosoma (WISHART et al., 2006). Na página inicial da TriTrypDB inserimos o nome do gene na caixa Gene ID e clicamos em search. Conferimos nome e produto de cada gene e extraímos a sequência peptídica prevista para cada um deles. Nos casos em que o gene codificador de uma enzima conhecida não fora identificado pela base de dados TDR Targets a busca era feita com o nome da enzima inserido na caixa Gene Text Search. Cada um dos peptídeos previstos de Leishmania foi tratado como potencial alvo e sua sequência foi usada para interrogar duas bases de dados disponíveis na internet que nos forneceram informações básicas 54 sobre os fármacos, seus alvos primários ou hipotéticos: DrugBank (www.drugbank.ca/), Therapeutic Target Database (bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp). A base de dados DrugBank é de livre acesso e oferece aos seus usuários informações sobre fármacos (química, farmacêutica e farmacológica) e seus alvos (sequência, estrutura e via metabólica). Atualmente base contém, aproximadamente, 8.000 fármacos, incluindo 1.700 aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration) e 6.000 fármacos experimentais (LAW et al., 2014; WISHART et al., 2006). A base de dados TTD contém 2.360 alvos, incluindo 388 bem sucedidos, 461 em triagem clínica, 44 descontinuados e 1.331 alvos em investigação. Quanto aos fármacos são 20.667, incluindo 2.003 aprovados, 3.147 em triagem clínica, 14.853 fármacos experimentais. Além disso, fornece informações sobre alvos, tais como sequência, função, via metabólica, validação e estrutura 3D através de links com outras importantes bases de dados (CHEN; JI; CHEN, 2002; QIN et al., 2013; ZHU et al., 2012) Nossa estratégia de busca nas duas bases de dados foi baseada no princípio da similaridade do alvo, no qual cada comando (enzimas do metabolismo energético de Leishmania) era comparado por similaridade com todos os alvos de fármacos conhecidos contidos dentro de cada uma das bases de dados citadas anteriormente. No caso onde foram identificados alvos de fármacos homólogos, todas as proteínas com um output Expectation value (E-value) menor do que 1e5 para as três bases de dados foram listados como potenciais alvos (CROWTHER et al., 2010). Dessa lista, selecionamos aqueles que interagem com compostos já aprovados para uso clínico em humanos. Informações adicionais sobre cada um das fármacos foram obtidas na base de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Na base de dados DrugBank escolhemos a opção search, usando sequence search da barra do menu. A sequência da proteína inquerida foi então introduzida no formato FASTA e os parâmetros de busca usados foram selecionados automaticamente. Na página inicial de acesso, selecionamos a opção target similarity search. A sequência do peptídeo desejado foi introduzida, no formato FASTA, clicando em seguida no ícone search. Quando os resultados da busca eram positivos, apenas os alvos com um Expectation value (E-value) menores do que 1e5 foram considerados para análises adicionais. Na base de dados PubChem Database escolhemos a aba compound, inserindo cada uma das fármacos identificadas nas bases de dados Drugbank e TTD citadas 55 anteriormente. Aqui, o objetivo foi obter informações detalhadas sobre cada composto, tais como: farmacologia, patentes, propriedades físicas e químicas, além de resultados de testes biológicos e interações biológicas e vias metabólicas. Após o trabalho de busca de cada uma das enzimas do metabolismo energético de Leishmania nas duas bases de dados, todas as proteínas com resultados negativos foram descartadas, enquanto que os demais alvos previstos para cada base de dados foram compilados para planilha de alvos obtida no TDR Targets. Os seguintes parâmetros associados com cada hit positivo foi introduzido na planilha Homologous target(s) name(s) and target ID(s) (DrugBank and TTD), E-value(s) (DrugBank and TTD), Drug type(s) (DrugBank, and TTD), Drug name(s) (DrugBank and TTD), Drug ID(s) (DrugBank) and Toxicity (DrugBank), Drug ID(s) e CID (Pubchem). Além das informações fornecidas pela base de dados PubChen, buscamos na literatura, usando PubMED, fármacos aprovadas que nunca foram testadas contra Leishmania. Interrogamos todas os fármacos associadas com cada hit positivo da nossa lista. Nossa definição de “avaliação” envolvia testes in vivo e/ou in vitro e quaisquer espécies de parasito da leishmaniose. Portanto, se uma dado fármaco era observado como “não testado” significava que não havia publicação e assim um dos seguintes detalhes de busca era introduzido no PubMED: 1. (drug name [MeSH Terms] OR drug name [All Fields]) AND (Leishmania [- MeSH Terms] OR Leishmania [All Fields]) and 2. (drug name [MeSH Terms] OR drug name [All Fields]) AND ( Leishmaniasis [MeSH Terms] OR Leishmaniasis [All Fields]), ou que o(s) estudo(s) recuperado(s) foi(ram) insuficientemente informativos para inferir a potencial utilidade da fármaco como leishmanicida. 4.2 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo do apicoplasto de Plasmodium falciparum Uma lista de proteínas alvos do apicoplasto foi previamente publicada por Ralph et al, 2004 (RALPH et al., 2004). Para o presente trabalho, essa lista foi consultada e cada proteína foi transportada para uma planilha. As proteínas foram agrupadas em colunas, dependendo de sua função prevista e de acordo com a classificação disponível na página da internet Malaria Parasite Metabolic Pathways (http://priweb.cc.huji.ac.il/malaria/). Seus códigos de identificação (ID) foram então 56 recuperados da base dados do P. falciparum do GeneDB e inserido numa coluna correspondente. Nós checamos a anotação de cada peptídeo previsto e o corrigimos, quando necessário, de acordo com as anotações atualizadas da base de dados GeneDB. Em seguida, recuperamos cada sequência de aminoácido prevista e a copiamos para uma coluna correspondente para cada proteína. Cada uma das sequências peptídicas previstas de P. falciparum da lista compilada acima foi tratada como alvo de fármaco hipotético e consequentemente usado para interrogar três diferentes bases de dados públicas disponíveis na internet. Essas bases nos forneceram informações básicas dos fármacos e de seus alvos primários ou hipotéticos: DrugBank (LAW et al., 2014) STITCH (KUHN et al., 2011) e Therapeutic Target Database (TTD) (QIN et al., 2013). Nossa estratégia de busca nas três bases de dados foi baseada no princípio da similaridade do alvo, no qual cada consulta (proteína do apicoplasto de P. falciparum) era comparada por similaridade com todos os alvos de fármacos conhecidos contidos em cada uma das bases de dados. Nos casos em que foram identificados alvos de fármacos homólogos, todas as proteínas com um Expectation value de saída (E-value) menor do que 1e-5 para DrugBank e TTD foram listados como alvos potenciais. Para a da base dados STICH, uma pontuação (score) de 0 a 1.0 foi atribuída, ao invés de um Expectation value. Desse modo, apenas proteínas com uma pontuação acima de 0.7 foram consideradas como alvo. Nós filtramos um pouco mais todos os alvos positivamente identificados, incluindo numa lista apenas aquelas proteínas que indicaram interagir com compostos aprovados para uso clínico em humanos. Comandos para a base de dados DrugBank Na página inicial, na opção “search”, selecionamos “sequence search”. Em seguida, introduzimos a sequência proteica a ser consultada no formato FASTA, deixando os parâmetros de busca padrão adotados pela base de dados. 57 Comandos para a base de dados STITCH Na página inicial, selecionamos a opção ‘‘protein sequence’’. A sequência peptídica a ser consultada foi então introduzida no formato FASTA e em seguida clicamos em “Go”. Foram considerados para análise apenas alvos positivos com pontuação acima de 0.7. Comandos para a base de dados Therapeutic Targets Database Na página inicial, foi selecionada a opção ‘‘target similarity search’’. A sequência proteica a ser consultada foi introduzida na caixa do menu de busca e a opção “search” foi acionada. Quando positivos, somente resultados com E-value menores do que 1e-5 foram considerados para análise. A compilação da Lista de Alvos Previstos Após submeter cada uma das sequências proteicas de P. falciparum nas três bases de dados, todos os resultados negativos foram excluídos, enquanto que os alvos previstos de cada base de dados foram compilados em uma planilha Excel, posteriormente chamada de lista de alvos previstos. Os seguintes parâmetros associados com cada “hit” positivo foram colocados nessa planilha: Homologous target(s) name(s) e target ID(s) (DrugBank and TTD), E-value(s) ou score(s) (DrugBank, STITCH e TTD), Drug type(s) (DrugBank, STITCH e TTD), Drug name(s), (DrugBank, STITCH e TTD), Drug ID(s) (DrugBank) e Toxicity (DrugBank). Cada um dos hits positivos foi mais uma vez interrogado na base de dados TDR targets para seus índices de drogabilidade, que é uma estimativa da chance de uma proteína ser drogável. Esse índice varia entre 0 e 1, com o valor de aproximadamente 0,2 correspondendo à média de drogabilidade. Para fazer isso, clicamos no item targets no menu inicial da página da base de dados, selecionamos Plasmodium falciparum da lista de patógenos . Em seguida, filtramos os alvos introduzindo o identificador de cada proteína na caixa correspondente nas opções de busca Filter targets based on. Após clicar no ícone search a variável acima foi recuperada e registrada na lista de alvos previstos. 58 Lista de fármacos ainda não testados contra malária Finalmente, realizamos uma busca no PubMED por fármacos aprovados que nunca foram avaliados contra os parasitos da malária, consultando todos os fármacos associados com cada “hit” positivo da lista. Nossa definição de avaliação envolvia testes in vivo e in vitro em qualquer espécie de Plasmodium. Portanto, se um dado fármaco era tido como não testado, significava que não havia registro de publicação após entrar com os seguintes detalhes de busca no PubMED 1. (drug name [MeSH Terms] OR drug name [All Fields]) AND (plasmodium [- MeSH Terms] OR plasmodium [All Fields]) and 2. (drug name [MeSH Terms] OR drug name [All Fields]) AND ( malária [MeSH Terms] OR malária [All Fields]), ou que o estudo (s) retornado foi (ram) insuficientemente(s) informativo (s) para inferir o potencial do fármaco como antimalárico. 59 5 RESULTADOS 5.1 Artigo 1 – In Silico Search of Energy Metabolism Inhibitors for Alternative Leishmaniasis Treatments 5.2 Artigo 2 – A Systematic in Silico Search for Target Similarity Identifies Several Approved Drugs with Potential Activity against the Plasmodium falciparum Apicoplast 60 ARTIGO 1 Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International Article ID 965725 Research Article In Silico Search of Energy Metabolism Inhibitors for Alternative Leishmaniasis Treatments Lourival A. Silva,1,2 Marina C. Vinaud,2,3 Ana Maria Castro,1,3 Pedro Vítor L. Cravo,2,3 and José Clecildo B. Bezerra2,3 1 Federal Institute of Education, Science and Technology of Goiânia, 76300000 Ceres, GO, Brazil Goiás Network of Research in Biotechnology and Metabolomics of the Host-Parasite Relationship, Goiás Research Support Foundation (FAPEG), 74605050 Goiânia, GO, Brazil 3 Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, 74605050 Goiânia, GO, Brazil 2 Correspondence should be addressed to Pedro Vı́tor L. Cravo; [email protected] Received 5 July 2014; Revised 8 August 2014; Accepted 14 September 2014 Academic Editor: Suresh Sundaram Copyright © Lourival A. Silva et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Leishmaniasis is a complex disease that affects mammals and is caused by approximately 20 distinct protozoa from the genus Leishmania. Leishmaniasis is an endemic disease that exerts a large socioeconomic impact on poor and developing countries. The current treatment for leishmaniasis is complex, expensive, and poorly efficacious. Thus, there is an urgent need to develop more selective, less expensive new drugs. The energy metabolism pathways of Leishmania include several interesting targets for specific inhibitors. In the present study, we sought to establish which energy metabolism enzymes in Leishmania could be targets for inhibitors that have already been approved for the treatment of other diseases. We were able to identify 94 genes and 93 Leishmania energy metabolism targets. Using each gene’s designation as a search criterion in the TriTrypDB database, we located the predicted peptide sequences, which in turn were used to interrogate the DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD), and PubChem databases. We identified 44 putative targets of which 11 are predicted to be amenable to inhibition by drugs which have already been approved for use in humans for 11 of these targets. We propose that these drugs should be experimentally tested and potentially used in the treatment of leishmaniasis. 1. Introduction Leishmaniasis affects 12 million people worldwide, and approximately 350 million people from 98 countries are at risk of contracting the disease [1]. Leishmaniasis is caused by approximately 20 distinct species of Leishmania and is transmitted by two genera of phlebotomine sandflies: Phlebotomus in the Old World and Lutzomyia in the New World. From a clinical point of view, leishmaniasis is classified as cutaneous, mucocutaneous, or visceral; the latter is a severe form of the disease that becomes fatal if left untreated [1, 2]. As effective vaccines are unfortunately not available for either animals or humans, prevention is restricted to the combat of vectors, control of reservoirs, and treatment of affected individuals [3, 4]. The drugs currently approved for the treatment of leishmaniasis are directed at various molecular targets. Pentavalent antimonials interfere with the synthesis of DNA, 𝛽oxidation of fatty acids, phosphorylation of ADP, and inhibition of glycolysis. Amphotericin B exhibits a high affinity for ergosterol, which is an important component of the cell membrane in fungi and Leishmania. Miltefosine induces apoptosis as a consequence of its intracellular accumulation. Although paromomycin inhibits cytochrome C in Candida krusei, its mechanism of action in Leishmania has not yet been elucidated; it is believed that its site of action is in the mitochondria, where it possibly interferes with the synthesis of proteins by hindering the translocation and recycling of ribosomal subunits. Pentamidine appears to reduce the membrane potential and inhibits the enzyme topoisomerase 61 2 in the mitochondria [5]. However, all of these drugs exhibit serious problems, including drug resistance (antimonials), severe side effects (amphotericin and miltefosine), and a prohibitively high cost for use in a public healthcare setting (paromomycin and miltefosine) [6–8]. For these reasons, there is an urgent need for new drugs against leishmaniasis. Although drugs may target lipids, nucleic acids, or polysaccharides, the drugs with the greatest efficacy are directed against protein targets [9]. The energy metabolism pathways of Leishmania include several protein targets that are interesting for the development or testing of new drugs [10, 11]. Glycosomes (similar to mammal peroxisomes) and mitochondria are the main sites of energy production in the promastigote forms of Leishmania. The glycosome is the site of glycolysis, which consists of seven reactions that break glucose down into two pyruvate molecules, while the mitochondria are the sites of the Krebs cycle and oxidative phosphorylation. In addition to glucose, amino acids are also important sources of energy. The final products of promastigote metabolism are carbon dioxide, succinate, pyruvate, Dlactate, alanine, ammonia, and urea [10]. The inhibition of one or more enzymes at each of these metabolic steps represents progress in the elimination of the parasite. Prior to targeting a metabolic pathway, its importance for both the parasite and the host must be taken into consideration. The selectivity of inhibitors is also important, that is, how much they are able to inhibit a parasitic enzyme without causing any damage to the host [11]. Several enzymes in the Leishmania glycolytic pathway have been indicated as interesting therapeutic targets, including hexokinase, fructose-1,6-bisphosphate aldolase, triosephosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, pyruvate kinase, and glycerol3-phosphate dehydrogenase [11]. However, the following question remains unanswered: which drugs inhibit these or other enzymes involved in the energy metabolism of Leishmania? In general, the strategy for drug development includes both de novo discovery and the improvement of inhibitors of individually validated targets. Although this strategy is efficient for the development of new drugs against leishmaniasis, it is time-consuming and expensive. One interesting alternative approach is a strategy commonly known as drug repositioning. Drug repositioning makes use of known genomic data to search for drugs already approved for clinical use in humans for other diseases and for which the drug targets are already known. This approach uses the principle of “target homology” and can be put in practice using bioinformatics drug-target repositories, such as DrugBank [12] and Therapeutic Targets Database [13]. Such chemogenomics strategies considerably increase the likelihood of success in drug discovery, cutting down the costs and time spent in the process of research and development, in comparison with “traditional” methodologies. For this reason, pharma industries are increasingly using drug repositioning in order to find alternative applications for their drugs, reducing time and costs involved in the process of developing new compounds [14, 15]. BioMed Research International In the present study, we used the concept of drug repositioning to identify new drugs with potential activity against Leishmania parasites. We first used genomic data to compile a list of energy metabolism drug targets in Leishmania of possible therapeutic interest. Each of these potential targets was then used as query in databases that include information on thousands of therapeutic compounds active against specific protein targets, the metabolic pathways that are involved, and the diseases for which they have been tested or for which clinical tests are currently in progress [12, 13, 16–19]. 2. Materials and Methods 2.1. Compilation of a List of Potential Leishmania Energy Metabolism Targets. A list of hypothetic targets was extracted from the database TDR Targets (http://tdrtargets.org). TDR Targets is a project of the World Health Organization that prioritizes neglected tropical diseases. The database has open access and provides genomic information on specific species that allows users to identify and prioritize targets of interest [15, 20]. We selected targets on the first page, and in the first field, we selected L. major as the pathogenic species of interest. The next field provided a filter based on the following: Name/Annotation, Features, Structures, Expression, Antigenicity, Phylogenetic distribution, Essentiality, Validation data, Druggability, Assayability, and Bibliographic references. We decided to limit the number of filters to increase the odds that the search would produce results. Despite this, some of the genes related to Leishmania energy metabolism could not be found in the TDR Targets database. For this reason, we expanded the filter Name/Annotation and chose the option “Energy metabolism” in the field KEGG high-level pathway. Next, we expanded the filter Druggability and selected a druggability evidence range (which varies from zero to one) ≥0.2 in the option Druggability index. This query was automatically saved in the my history section; the results were organized into a table that could be uploaded. 2.2. Identification of Potential Drug Targets in Available Drug Databases: General Strategy. We ran searches of the name of each gene identified as TDR Targets in the database TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/), which contains genomic information on pathogens of the family Trypanosomatidae, to which the genera Leishmania and Trypanosoma belong [21]. In the TriTrypDB homepage, we wrote the names of the genes in the field Gene ID and selected the search option. We checked each gene’s name and product and extracted their predicted peptide sequences. In the cases of known enzymes whose encoding genes could not be identified among the TDR Targets, we wrote the enzyme name in the field Gene Text Search to run the search. Every Leishmania predicted peptide was considered as a potential target, and the sequences were used to run searches in the online databases DrugBank (http://www.drugbank.ca/) and Therapeutic Target Database (TTD) (http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp), which 62 BioMed Research International provide basic information on drugs and their primary or hypothetical targets. DrugBank is an open-access database that provides users with information on drugs (chemical, pharmaceutical, and pharmacological data) and their targets (sequence, structure, and metabolic pathway). The database currently contains data on approximately 8,000 agents, including 1,700 drugs already approved by the FDA (Food and Drug Administration) and 6,000 experimental drugs [12, 17, 22]. The TTD stores information on 2,400 targets and approximately 21,000 drugs, of which 2,000 are already approved and 460 are currently undergoing clinical testing. In addition, it provides information on targets, such as sequence, function, metabolic pathway, and three-dimensional structure, through links to other relevant databases [13, 18, 19]. In both databases, our search strategy was based on the target-similarity principle, whereby each command (energy metabolism enzymes in Leishmania) was compared by similarity to all known drug targets included in all of the abovementioned databases. Whenever homologous drug targets were identified, all of the proteins with an output expectation value (𝐸-value) less than 1𝐸 − 5 relative to all three databases were included in the list of potential targets [14]. From this list, we selected the targets that interact with compounds that are already approved for clinical use in humans. Additional information on each drug was obtained from the PubChem database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). 2.3. Compilation of a List of Predicted Targets. Following the search of all of the enzymes involved in Leishmania energy metabolism in the two databases, all of the proteins for which the search results were negative were discarded. The remaining predicted targets from each database were compiled for the target spreadsheet provided by the TDR Targets. The following parameters associated with each positive hit were introduced in the spreadsheet: “Homologous target(s) name(s) and target ID(s)” (DrugBank and TTD), “𝐸value(s)” (DrugBank and TTD), “Drug type(s)” (DrugBank and TTD), “Drug name(s)” (DrugBank and TTD), “Drug ID(s)” (DrugBank), “Toxicity” (DrugBank), and Drug ID(s) and CID (PubChem). 2.4. List of Drugs for In Vitro Tests against Leishmania spp. In addition to the information gathered from the PubChem database, we performed a literature search of the PubMed database of approved drugs that have not yet been tested against Leishmania. We searched for all of the drugs associated with each positive hit on our list. Our definition of “test” included in vivo and/or in vitro tests and any species of Leishmania. Drugs were classified as “untested” when no related publication could be found. In these cases, one of the following search terms was introduced in PubMed: (1) (“drug name”[MeSH Terms] OR “drug name”[All Fields]) AND (“Leishmania”[-MeSH Terms] OR “Leishmania”[All Fields]) and (2) (“drug name”[MeSH Terms] OR “drug name”[All Fields]) AND (“Leishmaniasis”[MeSH Terms] OR “Leishmaniasis”[All Fields]). Drugs were also classified as “untested” when the information provided by the located 3 94 Leishmania energy metabolism targets 94 peptide sequences 44 positive targets 33 discarded targets 11 remaining targets 11 targets capable of interacting with 15 drugs that have been approved but not yet tested against Leishmania Figure 1: Flowchart depicting the overall strategy and results of this work. study(ies) was insufficient to infer the potential usefulness of the drug as a leishmanicidal agent. 3. Results 3.1. Compilation of a List of Predicted Targets. To clarify the procedure we used for the identification and selection of the energy metabolism targets, all of the steps are depicted in Figure 1. We identified 94 genes associated with the energy of Leishmania. All of the products of these genes were considered as potential therapeutic targets. The predicted amino acid sequence of all these peptides was searched based on target similarity in the databases TTD and DrugBank. A list of 44 positive hits (approximately 47% of the predicted peptides corresponding to Leishmania energy metabolism) was generated. Two databases were used to avoid missing important targets because the information they contained on drug targets was not the same (Figure 1). We identified 26 predicted targets in TTD, four of which appeared only in this database, and 40 predicted targets in the DrugBank database, 14 of which were exclusive to it. Twelve of the targets are enzymes that participate in glycolysis and/or the Krebs cycle, 13 participate in oxidative phosphorylation, and 11 participate in amino acid metabolism. From the list of positive hits, we selected targets that had been previously tested in any organism and that had a corresponding commercially available drug. Detailed information on these targets and the corresponding compounds is provided in Table 1. 3.2. Untested Drugs. To establish which target-related drugs had been previously tested against leishmaniasis, we performed a literature search in the PubMed database, as 63 4 BioMed Research International Table 1: New drug-target associations disclosed in the present study. Drug (brand names) Drug category(ies) Toxicity Leishmania target(s) ID Lonidamine (Doridamina) Anticancer, antitrypanosomal NA Hexokinase, putative LbrM.21.0310 Antiprotozoal NA ATP-dependent phosphofructokinase LbrM.29.2480 NA Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase LbrM.30.2950 POLYSIN Saframycin A Anticancer No reports of overdose; however, high doses of Chagas disease, NADH (10 mg a day or Nadide parasitic diseases, and more) may cause sleeping sickness jitteriness, anxiety, and insomnia Oral LD50 mouse: 16500 mg/kg. Side effects include moderate to severe erythema Sulfacetamide; (redness) and moderate sulfanilamide; Bacterial infections edema (raised skin), sulfoxone nausea, vomiting, headache, dizziness, and tiredness. Higher exposure causes unconsciousness Helicobacter pylori infection, Mature Overdosage may be Morantel tartrate, gastrointestinal associated with transient oxantel pamoate, and nematode infections, disturbances of vision thiabendazole Trichuris trichiura and psychic alterations infection African trypanosomiasis; CEPHARANTHINE; Chagas disease; NA CONESSINE Leishmania infections; parasitic diseases; Glutamate causes neuronal damage and eventual cell death, Aciglut, Glusate, particularly when the Glutacid, Glutamicol, Antibacterial; NMDA receptors are Glutamidex, antitrypanosomal activated. High dosages Glutaminol, and of glutamic acid may Glutaton include symptoms such as headaches and neurological problems 2-Oxopropanoic acid, pyroracemic acid, and Bacterial infections acetylformic acid Succinic acid (Katasuccin, Kyselina jantarova) NA Oral rat LD50: 2260 mg/kg Identity to (𝐸-value) Hexokinase D (3𝐸 − 54) Pyrophosphatedependent phosphofructokinase (2.00𝐸 − 06) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, muscle 2𝐸 − 91 TDRT druggability NA NA NA Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD+], cytoplasmic 2𝐸 − 31 0.2 Phosphomannose isomerase (PMI) LbrM.32.1750 Mannose-6-phosphate isomerase 3𝐸 − 59 0.6 NADH-dependent fumarate reductase LbrM.34.0820 Fumarate reductase flavoprotein subunit 2.00𝐸 − 13 0.5 Glutathione reductase, mitochondrial 6𝐸 − 65 NA Aspartate aminotransferase, mitochondrial 8𝐸 − 89 0.3 Pyruvate kinase LbrM.34.0010 Pyruvate kinase 1.00𝐸 − 117 NA Succinate dehydrogenase LmjF15.0990 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial 2𝐸 − 28 NA Glycerol-3-phosphate dehydrogenase LbrM.10.0640 Trypanothione reductase LmjF05.0350 Aspartate aminotransferase, putative LbrM.24.0370 64 BioMed Research International 5 Table 1: Continued. Drug (brand names) Drug category(ies) Adenovite, Cardiomone, Lycedan, My-B-Den, Phosaden, and Phosphaden NA Toxicity Leishmania target(s) ID NA Acetyl-coenzyme A synthetase, putative LbrM.23.0580 described above. We found that only one of the target-related compounds had been previously tested against leishmaniasis. 4. Discussion The aim of the present study was to identify drugs that are specifically active against Leishmania energy metabolism enzymes and have been previously tested against nonparasitic diseases or other human parasitic diseases. Below, we discuss the identified drugs and their effects on Leishmania energy metabolism. Lonidamine (Doridamina) (LND, (1-[(2,4-dichlorophenyl)methyl]-1H-indazole-3-carboxylic acid) was developed as an antispermatogenic agent that proved to be effective against cells with high metabolic activity, such as cancer and protozoan cells [23, 24]. In tumor cells, LND impairs glycolysis and lactate production by inhibiting mitochondrial hexokinase [23]. This inhibition was achieved with a lethal dose (LD50) of ∼260 𝜇M and ∼80 𝜇M in L. mexicana promastigote forms and Trypanosoma cruzi epimastigote forms, respectively. The mechanism of action of LND was attributed to inhibition of the energy metabolism [23]. In Trypanosoma brucei, which causes African trypanosomiasis, LND inhibits the enzyme hexokinase in the procyclic forms of the parasite, indicating that hexokinase is a relevant therapeutic target for LND [25]. Nadide has been approved for the treatment of Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, and cardiovascular diseases (DrugBank data). Recent studies on breast cancer and longevity have revealed the importance of this small molecule. Nadide is the commercial form of the NADH molecule that living organisms produce through the reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Appreciation of the importance of this small molecule has greatly increased since it was discovered at the beginning of the 20th century. The best-known role of NAD is as an electron carrier in oxidation-reduction reactions. However, several other functions have been attributed to it, including signal transduction and protein and DNA modification [26]. Recently, [27] reported that NAD+ homeostasis is crucial for Leishmania biology and virulence. The authors showed that nicotinamidase, which catalyzes the conversion of nicotinamide into nicotinic acid, is the key enzyme for the production of NAD+ from its precursors.Interestingly, the involved Identity to (𝐸-value) TDRT druggability Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic 3𝐸 − 159 0.2 precursors (nicotinamide, nicotinic acid, and nicotinamide riboside) are derived from the host, and nicotinamidase cannot be found in mammals [27]. Sodium sulfacetamide or sulfacetamide is a bacteriostatic agent that is active against sulfonamide-sensitive Gramnegative and Gram-positive bacteria, including Streptococci, Staphylococci, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas pyocyanea, Salmonella spp., Proteus vulgaris, and Nocardia, which are usually isolated in secondary infections of the skin. The LD50 of sulfacetamide for mice is 16,500 mg/kg by the oral route. In humans, the side effects include erythema, moderate swelling, nausea, vomiting, and headache. In addition to these side effects, the occurrence of StevensJohnson syndrome was reported in HIV-positive patients who received sulfacetamide drops for eye infections. All of these side effects, however, are associated with oral administration or high drug absorption through the skin, mucous membranes, and the conjunctiva, whereas topical use is not associated with strong side effects, except in the case of individuals with a hypersensitivity to sulfonamide. Sulfacetamide inhibits mannose-6-phosphate isomerase (also known as phosphomannose isomerase (PMI)), which is considered the key enzyme in kinetoplastid energy metabolism. PMI catalyzes the isomerization of fructose-6phosphate into mannose-6-phosphate. As the identity of the kinetoplastid PMI with human PMI is low (𝐸-value = 3𝐸 − 59), it represents an interesting target on which to test new drugs. 5. Conclusions We identified potential inhibitors of Leishmania energy metabolism by searching the information available in databases based on the target-similarity principle. Although approved for use in humans, none of the drugs identified have yet been tested against the parasite Leishmania. In vitro and in vivo tests may confirm the efficacy of these drugs, potentially leading to their use in the treatment of leishmaniasis. Appendix Database Details and Commands DrugBank Database Commands. In this database, the search was initiated by selecting the options “search” and then “Sequence Search” from the toolbar menu. The sequence of 65 6 each protein investigated was entered in FASTA format in the appropriate field, and the search parameters were selected automatically. TTD Commands. On the homepage of this database, we selected the option “target similarity search.” The sequence of the protein being investigated was entered in FASTA format in the appropriate field, and the option “search” was selected. In the cases with positive search results, only the targets with an 𝐸-value less than 1𝐸 − 5 were considered for further analysis. PubChem Database Commands. In this database, the tab “compound” was selected, and every drug identified in DrugBank and TTD was entered in the appropriate field. The PubChem database was searched to gather detailed information on each compound, including the pharmacology, patents, physical and chemical properties, results of biological tests, biological interactions, and metabolic pathways. Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper. References [1] J. Alvar, I. D. Vélez, C. Bern et al., “Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence,” PLoS ONE, vol. 7, no. 5, Article ID e35671, 2012. [2] D. O. Santos, C. E. R. Coutinho, M. F. Madeira et al., “Leishmaniasis treatment—a challenge that remains: a review,” Parasitology Research, vol. 103, no. 1, pp. 1–10, 2008. [3] B. Chawla and R. Madhubala, “Drug targets in Leishmania,” Journal of Parasitic Diseases, vol. 34, no. 1, pp. 1–13, 2010. [4] L. M. Fidalgo and L. Gille, “Mitochondria and trypanosomatids: targets and drugs,” Pharmaceutical Research, vol. 28, no. 11, pp. 2758–2770, 2011. [5] N. Singh, M. 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Silvestre et al., “The Leishmania nicotinamidase is essential for NAD+ production and parasite proliferation,” Molecular Microbiology, vol. 82, no. 1, pp. 21–38, 2011. 66 ARTIGO 2 A Systematic In Silico Search for Target Similarity Identifies Several Approved Drugs with Potential Activity against the Plasmodium falciparum Apicoplast Nadlla Alves Bispo1, Richard Culleton2, Lourival Almeida Silva1, Pedro Cravo1,3* 1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/Universidade Federal de Goiás/Goiânia, Brazil, 2 Malaria Unit/Institute of Tropical Medicine (NEKKEN)/Nagasaki University/ Nagasaki, Japan, 3 Centro de Malária e Doenças Tropicais.LA/IHMT/Universidade Nova de Lisboa/Lisboa, Portugal Abstract Most of the drugs in use against Plasmodium falciparum share similar modes of action and, consequently, there is a need to identify alternative potential drug targets. Here, we focus on the apicoplast, a malarial plastid-like organelle of algal source which evolved through secondary endosymbiosis. We undertake a systematic in silico target-based identification approach for detecting drugs already approved for clinical use in humans that may be able to interfere with the P. falciparum apicoplast. The P. falciparum genome database GeneDB was used to compile a list of <600 proteins containing apicoplast signal peptides. Each of these proteins was treated as a potential drug target and its predicted sequence was used to interrogate three different freely available databases (Therapeutic Target Database, DrugBank and STITCH3.1) that provide synoptic data on drugs and their primary or putative drug targets. We were able to identify several drugs that are expected to interact with forty-seven (47) peptides predicted to be involved in the biology of the P. falciparum apicoplast. Fifteen (15) of these putative targets are predicted to have affinity to drugs that are already approved for clinical use but have never been evaluated against malaria parasites. We suggest that some of these drugs should be experimentally tested and/or serve as leads for engineering new antimalarials. Citation: Bispo NA, Culleton R, Silva LA, Cravo P (2013) A Systematic In Silico Search for Target Similarity Identifies Several Approved Drugs with Potential Activity against the Plasmodium falciparum Apicoplast. PLoS ONE 8(3): e59288. doi:10.1371/journal.pone.0059288 Editor: Fabio T. M. Costa, State University of Campinas, Brazil Received November 20, 2012; Accepted February 13, 2013; Published March 26, 2013 Copyright: ß 2013 Bispo et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work was funded by Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior/PVE of Brazil (http://www.capes.gov.br/). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: [email protected] synthesis, such as sulfadoxine, pyrimethamine and proguanil, is largely conferred by point mutations in genes encoding two enzymes, dihydrofolate reductase (DHFR) and the dihydropteroate synthase (DHPS) [3]. When considering the design of new antimalarial drugs, it is, therefore, imperative to investigate alternative antimalarial molecular targets. One such strategy has focused on the apicoplast, a non-photosynthetic malarial plastid which was first described in the 1990’s [4,5] and recently confirmed to have been acquired by secondary endosymbiosis of a plastid-containing red alga [6]. The apicoplast’s genome is small (<35 kb), and the organelle harbors several unique metabolic functions, mostly accomplished by proteins that are nuclear-encoded and later imported into its lumen [7]. These unique metabolic features represent an attractive starting point for therapeutic intervention, since they are mostly of plant/algal origin, a fact that may heighten the target selectivity of antimalarial drugs and/or reduce the probabilities of toxicity to humans. Importantly, previous studies have already confirmed that the apicoplast is vulnerable to drugs that affect its metabolic functions, such as replication, nucleic acid metabolism, translation, fatty acid synthesis and isoprenoid biosynthesis [8]. A conventional drug development strategy may involve both de novo drug discovery and the improvement of inhibitors of individually validated targets. Although this process represents an efficient strategy to develop novel antimalarial drugs, it is Introduction Malaria remains a serious public health problem in many tropical countries [1]. As there is still no effective vaccine available, treatment and prevention of the disease is primarily based on antimalarial drug administration and anti-vector measures, respectively. The efficacy of antimalarial drug treatment is compromised by the malaria parasite’s ability to develop drugresistance, and by the dearth of new and effective antimalarials in the drug-design pipeline. There is, therefore, an urgent need for the discovery of new antimalarial drugs. The main antimalarials presently approved for clinical use act mainly on two parasite metabolic pathways: haemoglobin degradation and nucleic acid synthesis. However, with the exception of artemisinin derivatives, parasite resistance has evolved and become common for the currently used antimalarial drugs. One of the underlying phenomena contributing to the emergence of drug resistance, is that resistance to different drugs is often controlled by similar molecular mechanisms and consequently the evolution of resistance to one particular compound may impact on the efficacy of others. For instance, resistance to quinine-derived drugs, such as mefloquine and lumefantrine, as well as to the structurally unrelated artemisinin derivatives, has been shown to be modulated by mutations and/or amplification of the Multidrug Resistance Protein homologue-1, PfMDR1 [2]. Similarly, resistance to drugs that block parasite nucleic acid PLOS ONE | www.plosone.org 1 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288 67 Antimalarial Drugs usually costly and time-consuming. An alternative and/or complementary approach is to screen existing clinically approved drugs for previously unidentified antimalarial activity, thus speeding up the discovery of new therapies. As such drugs are already approved for use in humans for other purposes, they can more easily enter human clinical efficacy trials under existing drug administration guidelines. There are a number of different publicly available web-based databases which provide information on thousands of known therapeutic protein targets, the diseases that they are involved in, evidence for which pathways they play a role in, and the corresponding drugs which are directed at each of them. Using three of these databases, DrugBank [9], STITCH3.1 [10] and Therapeutic Target Database (TTD) [11], we adopted an in silico ‘‘top-down’’ approach to identify proteins localized to the P. falciparum apicoplast that may be targeted by drugs which are already in use in human clinical practice. Database Commands for DrugBank [9] Starting from the homepage, the option ‘‘search’’ R ‘‘sequence search’’ was chosen from the toolbar menu. The query protein sequence was then entered in FASTA format and the remaining default search parameters were used. Database Commands for STITCH3.1 [10] Starting from the homepage, the option ‘‘protein sequence’’ from the menu box was clicked. The query protein sequence was then entered in FASTA format and the ‘‘Go’’ icon was clicked. When positive results were obtained only targets with a score above 0.7 were considered. Database Commands for Therapeutic Targets Database [11] Starting from the homepage, the option ‘‘target similarity search’’ from the menu box was clicked. The query protein sequence was then entered in FASTA format and the ‘‘Search’’ icon was clicked. When positive results were obtained only targets with an Expectation value (E-value) score lower than 1e25 were considered for further analyses. Materials and Methods Compilation of a List of Apicoplast-targeted Proteins A list of Plasmodium falciparum apicoplast-targeted proteins has been previously published by Ralph et al, 2004 [7]. The description of the methods that were used to identify proteins predicted to contain apicoplast-targeting sequences is detailed in that paper [7]. For the present work, this list was accessed and each protein entry was logged on to an Excel file datasheet. Proteins were grouped consecutively in a datasheet column depending on their predicted metabolic function and according to the classification available in the ‘‘Malaria Parasite Metabolic Pathways’’ web page [12]. Their identification codes (IDs) were then retrieved from the GeneDB P. falciparum genome database [13] and logged onto the corresponding column as a clickable hyperlink. We further checked the annotation of each single predicted peptide and corrected it, if necessary, according to the recent updated annotations of the GeneDB database. Next, we retrieved each individual predicted amino acid sequence and copied it to the corresponding column for each protein. Compilation of the ‘‘Predicted Targets List’’ After running each of the P. falciparum protein sequences in the three databases, all proteins with negative results (negative hits) were excluded from further analyses, whilst predicted targets from each database were compiled into a single Excel file, hereafter named ‘‘predicted targets list’’. The following parameters associated with each positive hit were entered into the spreadsheet: ‘‘Homologous target(s) name(s) and target ID(s)’’ (DrugBank and TTD), ‘‘E-value(s) or score(s)’’ (DrugBank, STITCH3.1 and TTD), ‘‘Drug type(s)’’ (DrugBank, STITCH3.1 and TTD), ‘‘Drug name(s)’’ (DrugBank, STITCH3.1 and TTD), ‘‘Drug ID(s)’’ (DrugBank) and ‘‘Toxicity’’ (DrugBank). Each positive hit was further cross-examined in the TDR targets Database [14] for its ‘‘druggability index’’, which is an estimate of the likelihood of a protein being druggable and ranges from 0 to 1.0, with a value of <0.2 corresponding to average druggability. To do this, we clicked on the ‘‘targets’’ item in the web site’s menu and then ticked ‘‘Plasmodium falciparum’’ from the pathogen species list. We next filtered targets by entering each protein’s identifier (ID) in the corresponding box in the ‘‘Filter targets based on’’ search options. After clicking on the ‘‘search’’ icon, the above variable was retrieved from the target’s page and was subsequently recorded in the ‘‘predicted targets list’’ file. Identification of Putative Drug Targets Using Publicly Available Drug Databases Overall Strategy Each of the P. falciparum predicted protein sequences from the list compiled above was treated as a putative drug-target and consequently used to interrogate three different publicly available web databases that provide synoptic data on drugs and their primary or putative drug targets: DrugBank [9], STITCH3.1 [10] and the Therapeutic Target Database (TTD) [11]. Our search strategy for all three databases was based on the principle of ‘‘target similarity’’ whereby each query (P. falciparum apicoplast protein) is compared for similarity with all known drug targets contained within each of the databases. In cases where homologous drug targets were identified, all proteins with an output expectation value (E-value) lower than 1e25 for DrugBank and TTD were listed as potential targets. In the case of STICH3.1, a score from 0 to 1.0 is given, rather than an expectation value. Thus, only proteins with a score above 0.7 were considered potential targets. We further filtered all positively identified targets through inclusion in the list of only those proteins that were indicated to interact with compounds that have already been approved for clinical use in humans. PLOS ONE | www.plosone.org List of Drugs Yet to be Tested Against Malaria Finally, we carried out a literature search using PubMED in order to identify approved drugs that have never been evaluated against malaria parasites by querying all drugs associated with each positive hit in the list. Our definition of ‘‘evaluation’’ embraces in vitro and/or in vivo testing and any malaria parasite species. Therefore if a given drug is noted as ‘‘not tested’’, it means that no publication records were found after either of the following search details were entered in PubMED: 1. (‘‘drug name’’[MeSH Terms] OR ‘‘drug name’’[All Fields]) AND (‘‘plasmodium’’[MeSH Terms] OR ‘‘plasmodium’’[All Fields]) and 2. (‘‘drug name’’[MeSH Terms] OR ‘‘drug name’’[All Fields]) AND (‘‘malaria’’[MeSH Terms] OR ‘‘malaria’’[All Fields]), or that the study(ies) retrieved were insufficiently informative to infer the potential usefulness of the drug as an antimalarial. 2 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288 68 Antimalarial Drugs between four main metabolic function groups: ‘‘Replication, Transcription and Nucleic acid metabolism’’, ‘‘Translation’’, ‘‘Fatty acid and Phospholipid Metabolism’’ and ‘‘Post-translational Modification and Proteolysis’’. Results Schematic Summary For ease of understanding, the overall results of this work are represented as a flow chart in Figure 1, the detailed results of which are given in the following sections. Previously Untested Drugs In order to evaluate which of the drugs associated with the predicted targets had been tested against malaria parasites and which had not, we ran a literature search in PubMed as described above. Out of a total of 47 positive hits from the list compiled above, 32 targets were associated with drugs whose activity has been previously evaluated against malaria parasites. Examples of some of these drugs and their corresponding targets are given in Table 1. However, for 15 of the predicted targets, there were a total of 13 corresponding drugs that have never been experimentally or clinically tested against malaria or whose evaluation required further studies (Table 2). The metabolic functions predicted to be targeted by each of these drugs in the apicoplast are the following: Replication, Transcription and Nucleic acid metabolism (5 drugs: azelaic acid, lucanthone, bleomycin, rifabutin and gemcitabine), Fatty acid and Phospholipid Metabolism (3 drugs: ethionamide, nitrofurazone and isoxyl) and posttranslational modification and proteolysis (5 drugs: nitroxoline, gallium nitrate, sulcrafate, remikeren and aliskeren). Two of these drugs (azelaic acid and sulcrafate) are predicted to interfere with more than one peptide and one particular predicted target (plasmepsin X) is expected to have affinity to more than one drug. The list of these drugs, their targets, associated toxicity (if any) and each target’s druggability index is depicted in Table 2. Compilation of the ‘‘Predicted Targets’’ List Each of the Plasmodium falciparum proteins predicted to contain an apicoplast target signal was entered into a single Excel file as described in Materials and Methods. A list of a total 595 candidate target protein sequences was thus compiled and each was subsequently allocated either of the following predicted metabolic functions: ‘‘Replication, Transcription and Nucleic acid metabolism’’, ‘‘Translation’’, ‘‘Fatty acid and Phospholipid Metabolism’’, ‘‘Transport’’, ‘‘Antioxidant’’, ‘‘Protein Folding’’, ‘‘Fe-S Cluster Production’’, ‘‘Porphyrin Biosynthesis’’, ‘‘Post-translational Modification and Proteolysis’’ and ‘‘Other/unknown function’’ (Table S1). Each of these protein sequences in the list was interrogated for target similarity in the three databases used (DrugBank, STITCH3.1 and TTD), producing a list of a total seventy-two (72) ‘‘positive hits’’ (<12% of the total predicted apicoplast peptides) (Table S2). We decided to use all three databanks because each of them may contain different drug-target datasets and, consequently, the probability of targets being missed due to insufficient screening is reduced. Indeed, no single database was capable of identifying all 72 predicted targets: DrugBank, STICH3.1 and TTD identified exclusively 45, 8 and 11 predicted targets, whilst the remaining 8 targets were identified by two or three of the databases. Detailed information about the predicted targets and their associated compounds is provided in Table S2. Approximately one third of the positively identified targets (N = 25) were predicted to react with compounds belonging to the ‘‘Dietary supplement/nutraceutical’’ class. Since these compounds are unlikely to exhibit antimalarial activity, these targets and their associated compounds were excluded from further analyses. The distribution of the remainder 47 potential targets according to their predicted metabolic function is depicted in Figure 2. Eighty percent (80%, N = 38) of these 47 positive hits are distributed Discussion The main objective of this work was to identify drugs that have been approved for clinical use in humans for conditions other than malaria, which may have the potential to interfere with the function of the apicoplast. In validation of our approach, all the main drugs previously shown to target the apicoplast and their known targets were identified by our methodology (Table S2, Table 1) and the following illustrative examples are given. The Figure 1. Flowchart summarizing the work pipeline and corresponding results. (*denotes the targets that were discarded on the basis of having chemical affinity to dietary supplements/nutraceuticals). doi:10.1371/journal.pone.0059288.g001 PLOS ONE | www.plosone.org 3 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288 69 Antimalarial Drugs [17], involved in the process of translation, were correctly pinpointed and associated. Consequently, we were confident that our overall strategy for identifying anti-apicoplast drugs is valid. Following this precondition, we were able to identify thirteen drugs that have not yet been evaluated against malaria parasites. These drugs are supposed to inhibit targets that are involved in metabolic functions of the apicoplast that have been shown to render the parasite vulnerable to drugs [8]. For this reason we suggest that the antimalarial activity of at least some of these compounds should be investigated further. In the ensuing paragraphs we refer specifically to five of these drugs that we suggest may be good candidates for antimalarial testing, highlighting their advantages but also the constraints that may limit their direct use in vivo. Azelaic acid (AA) has been shown to interfere with DNA synthesis in bacteria [18] and its oral toxicity in mice appears to be low (.5 g/kg, data from DrugBank). In the present work, our search suggests that AA may be able to interfere with two targets involved in DNA repair within the P. falciparum apicoplast: a peptide with a 59-39 exonuclease, N-terminal resolvase domain (PF3D7_0203900) and a plastid replication-repair enzyme (PREX) (PF3D7_1411400). Additionally, according to the data available in the DrugBank database, AA has a log P value of 1.7, indicating that the drug may diffuse well through biomembranes [8]. Although this property is not a pre-requisite for the success of drugs targeting the apicoplast’s biology [8], it may come as a benefit for apicoplast-targeting drugs, which have to cross a total of six membranes. However, AA is used commercially in the form of a topically applied cream and thus the practical aspects of testing it as an antimalarial may present some challenges. Lucanthone is one of the earliest described schistosomicides [19] and was predicted to target the apicoplast’s putative APendonuclease (PF3D7_0305600) in the present work. It was later replaced largely by hycanthone, its active metabolite. Although there are no records in the literature about the evaluation of lucanthone’s antimalarial activity, hycanthone has been hypothesized to possess antimalarial activity in a virtual screen against P. falciparum with an IC50 value below 5 microM [20]. In the present day lucanthone is used as an anti-cancer agent where it has been shown to be well tolerated by humans with no hematological or gastro-intestinal toxicity at clinically tolerated doses (data from DrugBank). However, this contrasts with earlier suggestions where in past shistosomiasis treatment with lucanthone was reported to produce side effects such hepatotoxicity and gastrointestinal disturbances following intramuscular injection [21]. Isoxyl (Thiocarlide), a thiourea derivative that was used successfully for the clinical treatment of TB during the 1960s, has been shown to display significant antimycobacterial activity in vitro and is effective against multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis [22]. In Mycobacteria, isoxyl (ISO) has been shown to inhibit the synthesis of oleic acid and this effect is directly attributable to the inhibitory effect of the drug on the membrane-associated stearoyl-coenzyme A (CoA) (D9) desaturase DesA3 (Rv3229c) [23]. Results from the present work suggest that isoxyl may also be able to inhibit the P. falciparum apicoplast homologue (E-value = 2e252), a putative stearoyl-CoA delta 9 desaturase (PF3D7_0511200). Also, ISO has no known side-effects [24], which makes it highly appropriate for clinical use in humans. One likely downside of ISO is the fact that it has a high logP value of <5.8 (http://www.chemspider.com/Chemical-Structure. 2272774.html), which makes it virtually insoluble in water with consequent poor dissolution and bioavailability when it is delivered exclusively by the oral route [24]. Figure 2. Distribution of the expected apicoplast targets according to their predicted metabolic function in the apicoplast. doi:10.1371/journal.pone.0059288.g002 antibiotics ciprofloxacin and doxycycline and their respective targets, the apicoplast’s DNA gyrase and small ribosomal subunits [8], were correctly pinpointed by our approach. Fosmidomycin, a drug that is known to target the apicoplast’s 1-deoxy-D-xylulose 5phosphate reductoisomerase (DOXP) [15,16], was appropriately identified. Fusidic acid and its likely target, elongation factor G PLOS ONE | www.plosone.org 4 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288 70 Antimalarial Drugs Table 1. Examples of drug-target associations previously determined, that were correctly identified in the present study. Drug(s) P. falciparum target(s) ID Identity to (E-value or score) Pathway Reference(s) Several quinolones DNA GyrAse a-subunit, putative PF3D7_1223300 DNA gyrase subunit A (P72524 GYRA_STRPN) (1e250) Replication [8] Fusidic acid elongation factor G, putative PF3D7_0602400 Elongation factor G (P13551 EFG_THETH) (8.7e275) Translation [17] Tetracycline apicoplast ribosomal protein S14p/S29e precursor, putative PF3D7_1137500 30S ribosomal protein S14 (P0AG59 RS14_ECOLI) (7.5e215) Translation [32] Fosmidomycin 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase PF3D7_1467300 0.99 Isoprenoid biosynthesis [16] Triclosan enoyl-acyl carrier reductase PF3D7_0615100 0.99 Fatty acid synthesis [8] Geldanamycin heat shock protein 90, putative 0.80 Protein folding [33] Halofantrine plasmepsin VIII PF3D7_1465700 Plasmepsin-2 (P46925 - PLM2_PLAFA) (9e223) Proteolysis [31] (codes in brackets represent the target Identity Code of DrugBank. In the cases of Fosmidomycin, Triclosan and Geldanamycin, there are no homologous targets represented because they were identified using STITCH3.1 which uses an algorithm where homologous targets are not displayed). doi:10.1371/journal.pone.0059288.t001 to reach systemic therapeutic levels in patients treated orally. However, since sulcrafate is commercially available in powder form, it may be tested directly after dilution in an appropriate vehicle in experimental in vivo models of malaria with administration via a route other than oral, such as intra-venous or intraperitoneal. Besides the drugs highlighted above, eight further drugs are predicted to be capable of interfering with apicoplast targets (Table 2). They were not discussed in detail because we envisage that some of their inherent properties may render them less suitable than the above as antimalarial agents. For instance, bleomycin, gemcitabine and gallium nitrate are three antineoplastic agents and for this reason are more likely to cause severe side-effects/toxicity in humans in case their direct use is considered. Indeed, although gallium nitrate’s toxicity parameters are not available, considerable toxicity is expected from bleomycin and gemcitabine (Table 2). In other cases, such as those of rifabutin and ethionamide, we considered that the output expectation value (E-value) for target homology insufficiently significant to infer the target’s prediction with a high degree of confidence. Remikeren and aliskeren are two antihypertensive agents and for that reason, should present increased challenges as to their short-term applicability as antimalarials. Nitroxoline (synonym 5-Nitroxin) is an active urinary antibacterial agent which has been used since 1962 against susceptible gram-positive and gram-negative organisms commonly found in urinary tract infections [25]. It has been suggested that its antibacterial activity may stem from the metal ion complexation vital for bacterial growth [26]. More recently, it was discovered that that nitroxoline has antiangiogenic properties, which also makes it useful as an anti-cancer drug [27]. We found that Nitroxoline may be able to interfere with the apicoplast-targeted P. falciparum putative methionine aminopeptidase 1c (PF3D7_0804400), which is homologous to the human enzyme and is expected to be involved in proteolysis within the apicoplast. Interestingly, nitroxiline was tested in early in vitro studies where it was shown to display exceptional activity against P. falciparum, exhibiting an ED50 of approximately 63 nM at 48h postexposure, a value which reflected roughly 10X higher potency than quinine sulfate in that same study, under identical conditions [28]. In addition to what appears to be a level of high potency in vitro, nitroxoline displays a logP of 1.9 (data from DrugBank), which should favor its ability to cross the membranes required to reach its target. Curiously, the assessment of nitroxoline as a potential antimalarial for clinical use in vivo appears to have never been followed-up. For all reasons cited, we argue here that nitroxoline should be prioritized for further evaluations of its potential value as an antimalarial drug. Lastly, we refer to sulcrafate, possibly one of the least obvious drugs to hold antimalarial activity, due to the fact that it is not an anti-infective agent per se, but rather an anti-ulcer compound. Sulcrafate is an approved small molecule, which is a basic aluminum complex of sulfated sucrose and is orally employed for prevention and treatment of several gastrointestinal diseases including gastroesophageal reflux, gastric and duodenal ulcer [29]. Sucralfate acts, at least partially, through inhibition of the human pepsin A enzyme [30], which was shown here to be homologous to four P. falciparum plasmepsins localized to the apicoplast (plasmepsin X: PF3D7_0808200, plasmepsin I (PMI): PF3D7_1407900, plasmepsin III,histo-aspartic protease (HAP): PF3D7_1408100 and plasmepsin VII: PF3D7_1033800). Interestingly, halofantrine, a well-known highly effective antimalarial has been recently suggested to inhibit plasmepsin X, one of sulcrafate’s predicted targets [31]. Due to its own therapeutic nature, sulcrafate is only minimally absorbed from the gastrointestinal tract (data from DrugBank) and consequently it is unlikely PLOS ONE | www.plosone.org Conclusions We describe a systematic in silico approach to identify drugs that have been clinically approved for human use, but have never been evaluated against malaria parasites based on the principle of ‘‘homologous drug target screening’’. In doing so, we were able to identify thirteen such drugs that we suggest justify evaluation as antimalarials. We stress the fact that we have no experimental evidence to suggest that any of the newly identified drugs will either display antimalarial activity and/or affect the suggested targets. It also is possible that their in vivo potencies may be compromised by absorption, distribution, metabolism, excretion ad toxicity (ADMET) properties or by lack of appropriate chemical affinity with their putative target(s). Nevertheless, primary in vitro drug screens may provide insights into their ability to inhibit parasite growth and, if any promising activities are disclosed, they could constitute important leads to the discovery of novel antimalarials. 5 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288 71 PLOS ONE | www.plosone.org Antimetabolites Antibiotics, Antineoplastic Anti-Bacterial Agents Antibiotics, Antitubercular Bleomycin (Blenoxane, Bleo) Rifabutin (Alfacid, Ansamycin, Mycobutin) 6 NA NA NA Anti-Infective Agents Anti-Infective Agents, Local Trypanocidal Agents Anti-Infective Agents, Urinary Anti-bacterial agents Nitrofurazone (Actin-N, Aldomycin, Alfucin, Amifur, Babrocid, Becafurazone, Biofuracina, Biofurea, Chemofuran, Chixin) Isoxyl (Thiocarlide) Nitroxoline (Galinok, Isinok, Nicene Antifungal Agents forte, Noxibiol, Noxin) Anti-Infective Agents, Urinary Gallium Nitrate (Ganite) Antineoplastic Agents enoyl-acyl carrier reductase PF3D7_0615100 UMP-CMP kinase, putative PF3D7_0111500 DNA-directed RNA polymerase alpha chain, putative PF3D7_1307600 protein phosphatase, putative PF3D7_1469200 methionine aminopeptidase 1c, putative PF3D7_0804400 stearoyl-CoA delta 9 desaturase, putative PF3D7_0511200 Rat LD50 = 590 mg/kg; Allergic contact lipoamide dehydrogenase, putative PF3D7_0815900 dermatitis is the most frequently reported adverse effect, occurring in approximately 1% of patients treated. Symptoms of overdose include convulsions, nausea, and vomiting Ethionamide (Aethionamidum, Aetina, Aetiva, Amidazin, Amidazine, Atina, Bayer 5312, Ethimide, Ethina, Etimid) Leprostatic Agents Antitubercular Agents Fatty Acid Synthesis Inhibitors Myelosuppression, paresthesias, and severe rash were the principal toxicities, LD50 = 500 mg/kg (orally in mice and rats) Gemcitabine (DDFC, DFDC, Antineoplastic Agents Gemcin) Gemcitabine hydrochloride, Antiviral Agents Gemtro, Gemzar, GEO) Radiation-Sensitizing Agents Antimetabolites Enzyme Inhibitors Immunosuppressive Agents LD50 = 4.8 g/kg (mouse, male) NA NA TDRT Druggability Protein-tyrosine-phosphatase (Q9S427–Q9S427_9GAMM) (2e216) Methionine aminopeptidase 1 (P53582 - AMPM1_HUMAN) (2e229) Acyl-CoA desaturase (TTDS00516) (2e252) Glutathione reductase (P06715 GSHR_ECOLI) (1e218) Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase [NADH] (P0A5Y6 INHA_MYCTU) (4e29) UMP-CMP kinase (P30085 KCY_HUMAN) (9e222) DNA-directed RNA polymerase alpha chain (P0A7Z4 - RPOA_ECOLI) (1e28) DNA ligase 1 (P18858 DNLI1_HUMAN) (4e2118) NA 0.3 0.1 0.3 NA NA NA NA DNA-(apurinic or apyrimidinic site) NA lyase (P27695 - APEX1_HUMAN) (8e224) DNA polymerase I (P00582 DPO1_ECOLI) (4e250) plastid replication-repair enzyme (PREX) PF3D7_1411400 AP endonuclease (DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase), putative PF3D7_0305600 DNA polymerase I (P00582 DPO1_ECOLI) (2e212) Identity to (E-value) 59-39 exonuclease, N-terminal resolvase-like domain, putative PF3D7_0203900 P. falciparum target(s) ID Excessive exposure may cause fever, DNA ligase 1 PF3D7_1304100 chills, nausea, vomiting, mental, confusion, and wheezing. Bleomycin may cause irritation to eyes, skin and respiratory tract. It may also cause a darkening or thickening of the skin. It may cause an allergic reaction. NA Radiation-Sensitizing Agents Anticancer Agents Schistosomicides Lucanthone (Miracil D, Miracol, Nilodin, Scapuren, Tixantone) Toxicity Oral LD50 in rat: .5 g/kg Drug category(ies) Azelaic acid (Azelex, Emerox 1110, Antineoplastic Agents Emerox 1144, Emery’s L110, Finacea, Dermatologic Agents Finevin, Skinoren) Drug (brand names) Table 2. New drug-target associations disclosed in the present study. Phosphorylation Proteolysis FAS FAS Antioxidant FAS Nucleic acid metabolism Replication Replication DNA repair DNA repair DNA repair Metabolic Function Antimalarial Drugs March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288 72 Table S1 List of apicoplast-targeted proteins with predicted aminoacid (AA) sequences. (XLSX) (NA: not available; codes in brackets represent the target Identity Code of DrugBank. Toxicity data is cited from DrugBank; FAS: Fatty Acid Synthesis; LD50: drug dose that results in death of 50% of the animals). doi:10.1371/journal.pone.0059288.t002 Proteolysis 0.6 Antihypertensive Agents The most likely manifestation of overdosage would be hypotension Aliskiren (Rasilez, Tekturna) plasmepsin X PF3D7_0808200 Renin (P00797 - RENI_HUMAN) (1e226) Proteolysis 0.6 Renin (P00797 - RENI_HUMAN) (1e226) plasmepsin X PF3D7_0808200 Antihypertensive Agents NA Protease Inhibitors Remikiren Proteolysis Pepsin A (P00790 - PEPA_HUMAN) 0.3 (2e225) plasmepsin VII PF3D7_1033800 Proteolysis Pepsin A (P00790 - PEPA_HUMAN) 0.8 (2e234) plasmepsin III,histo-aspartic protease (HAP) PF3D7_1408100 Proteolysis Proteolysis PLOS ONE | www.plosone.org plasmepsin I (PMI) PF3D7_1407900 Pepsin A (P00790 - PEPA_HUMAN) 0.8 (5e241) TDRT Druggability Pepsin A (P00790 - PEPA_HUMAN) 0.6 (7e243) Identity to (E-value) P. falciparum target(s) ID plasmepsin X PF3D7_0808200 Acute oral toxicity (LD50) in mice is .8000 mg/kg. There is limited experience in humans with overdosage of sucralfate. Sucralfate is only minimally absorbed from the gastrointestinal tract and thus risks associated with acute overdosage should be minimal. Toxicity Drug category(ies) Drug (brand names) Table 2. Cont. Supporting Information Sucralfate (Antepsin, Apo-sucralfate, Anti-Ulcer Agents Carafate, Sucramal, Sulcrate, Sulcrate Suspension Plus, Ulcar, Ulcerban, Ulcerlmin, Ulcermin) Metabolic Function Antimalarial Drugs Table S2 Predicted targets list. (DB: DrugBank; TTD: Therapeutic Targets Database: DS: dietary supplement or nutraceutical. TDRT: Tropical Disease Research Targets; Blank cells denote that no data was available). (XLSX) Acknowledgments The authors wish to thank Professor José Clecildo Barreto Bezerra for his encouragements throughout the course of this work. Author Contributions Conceived and designed the experiments: PC. Performed the experiments: NB RC LAS PC. Analyzed the data: NB RC PC. Wrote the paper: PC RC. 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Nossa busca baseou-se no principio da similaridade do alvo, que consiste na identificação de fármacos ou inibidores que atuam contra alvos semelhantes, mas pertencentes a organismos diferentes. Utilizamos a sequência peptídica de cada alvo para interrogar as bases de dados: Therapeutic Targets, Drug Bank e STITCH para obter inibidores ou fármacos aprovados para cada alvo de interesse. Nossa busca resultou em 15 fármacos que atuam especificamente contra enzimas do metabolismo energético (artigo1) e 13 fármacos inibidores proteicos do metabolismo do apicoplasto de P. falciparum (artigo 2). Alguns desses fármacos apresentam maior potencial terapêutico e maior viabilidade para testes in vitro e in vivo, por essas razões, os descrevemos em detalhes nas seções seguintes. 6.1 Fármacos que atuam no metabolismo energético de Leishmania spp A Lonidamina ou Ionidamina (Doridamina) (LND, 1-(2,4-dichlorobenzyl)-1,Hindazol-3-carboxylic acid) foi desenvolvida como agente antiespermatogênico, mas provou ser eficaz contra células de alta atividade metabólica, tais como células cancerígenas e de protozoários (FLORIDI et al., 1981; SHARLOW et al., 2010). Em células tumorais, LND afeta a glicólise e a produção de lactato pela inibição de uma hexoquinase ligada à mitocôndria (FLORIDI et al., 1981). Em formas promastigotas de L. mexicana e epimastigotas de Trypanosoma cruzi, a inibição foi alcançada com LD50 de ~260 M e ~80 M, respectivamente. O mecanismo de ação de LND foi atribuído à inibição do metabolismo energético (FLORIDI et al., 1981). Em T. brucei, causador da tripanossomíase africana, foi demonstrado que o LND atua inibindo a hexoquinase de formas pró-ciclicas desse parasito. Os resultados desse experimento indicam a 75 hexoquinase como um importante alvo terapêutico para lonidamina (CHAMBERS, 2007). O Nadide é um fármaco aprovado para o tratamento da doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doença cardiovascular (dados do Drugbank). Mais recentemente, estudos com câncer de mama e de longevidade têm revelado a importância dessa pequena molécula. Nadide é a forma comercial da molécula de NADH produzida pelos seres vivos a partir da redução da Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD). Desde sua descoberta no começo do século XX até os dias atuais, o conhecimento da importância dessa pequena molécula aumentou muito. O papel mais conhecido do NAD é o de transportador de elétrons, nas reações de oxi-redução. Entretanto, outras funções, tais como transdução de sinal, modificação de proteínas e DNA, são também atribuídas a ela (CHEN et al., 2008). Recentemente, (GAZANION et al., 2011) demonstraram que a homeostase do NAD+ é essencial para a biologia e virulência de Leishmania. Esses autores verificaram que a nicotinaminidase, que converte a nicotinamida em ácido nicotínico, é a enzima chave para gerar NAD+ a partir de seus precursores. Interessantemente é que os precursores (nicotinamida, ácido nicotínico, ribosídeo nicotinamida) são derivados do hospedeiro e a referida enzima não é encontrada em mamíferos (GAZANION et al., 2011). Sulfacetamida de Sódio ou sulfacetamida é um bacteriostático que atua contra bactérias Gram positivas e Gram negativas sensíveis à sulfonamida, geralmente isoladas de infecções secundárias da pele. Os micro-organismos susceptíveis são Streptococci, Staphylococci, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas pyocyanea, espécies de Salmonella, Proteus vulgaris, Nocardia. A dose letal oral (LD50) para camundongos é 16500 mg/kg. Para humanos, os efeitos colaterais incluem eritema, edema moderado, náusea, vômito, cefaleia. Além desses efeitos, a síndrome de Stevens-Johnson foi relatada em pacientes HIV positivos após receberem gotas de sulfacetamida para tratamento de infecções oculares. Todos esses efeitos, entretanto, estão relacionados à administração oral ou alta absorção na pele, mucosas e conjuntivas. O uso tópico da medicação não produz fortes efeitos colaterais como citados anteriormente, a não ser em indivíduos com hipersensibilidade à sulfonamida. A sulfocetamida atua como inibidor da manose-6-fosfato-isomerase (também conhecida como fosfomanose isomerase, PMI), enzima considerada chave para o metabolismo energético de Kinetoplastídeos. Essa enzima faz isomerização da frutose76 6-fosfato em manose-6-fosfato. A PMI de Kinetoplastideos tem baixa identidade com a enzima humana (E value de 3E-59) que a torna um alvo interessante para teste com novas drogas. 6.2 Fármacos que atuam no apicoplasto de P. falciparum O ácido azelaico (AA) atua na síntese de DNA em bactérias (GALHAUP, 1988) e apresenta baixa toxicidade em modelos animais. No presente trabalho, nossa busca sugere que o AA interfere com dois alvos envolvidos no reparo do DNA do apicoplasto de P. falciparum: uma exonuclease 5’- 3’ , resolvase de domínio N-terminal e uma enzima de replicação e reparo de plastídeo. Além disso, de acordo com as informações disponíveis na base de dados DrugBank, o AA tem um valor do coeficiente de partição (logP) de 1,7 , indicando que o fármaco tem alta capacidade de atravessar as membranas celulares. Embora essa propriedade não seja um pré-requisito para os fármacos que interferem na biologia do apicoplasto (BOTTÉ; DUBAR; MCFADDEN, 2011), ela poderia ser vantajosa para aqueles que agem nessa organela, pois teriam que atravessar seis membranas até atingir a molécula-alvo. Todavia, o AA está disponível comercialmente apenas na forma de creme de uso tópico e assim, em termos práticos, testá-lo como antimalárico poderia apresentar alguns desafios. O Lucantone foi primeiramente descrito como esquistossomicida (ARCHER, 1974) e supostamente atua contra uma AP-endonuclease, um alvo hipotético do apicoplasto. Posteriormente foi substituído pelo hicantone, seu metabólito primário. Embora não haja relato na literatura sobre a avaliação antimalárica do lucantone, o hicantone apresentou atividade antimalárica em screening virtuais contra P. falciparum com um IC50 abaixo de 5,0 microM (MAHMOUDI et al., 2006). Atualmente, o lucantone tem sido testado na terapia anticâncer, apresentando boa tolerância em humanos sem toxicidade hematológica ou gastrointestinal para doses clinicamente toleradas. Entretanto, isso contrasta com sugestões anteriores nas quais o tratamento da esquistossomose com lucantone relatava produzir efeitos colaterais tais como: hepatoxicidade e distúrbios gastrointestinais após administração intramuscular (SHEKHAR, 1991). O isoxil (Tiocarlida), um derivado da tioureia, foi amplamente usado durante os anos 1960 para tratamento clínico da tuberculose e tem demonstrado ser efetivo em 77 atividade in vitro contra cepas multidroga resistente de Mycobacterium tuberculosis (PHETSUKSIRI; BAULARD, 1999). Em M. tuberculosis, isonoxil (ISO) atua inibindo a síntese de ácido oleico e este efeito está diretamente relacionado à ação inibitória do fármaco a uma desnaturase esteroil-coenzima A associada à membrana, DesA3 (PHETSUKSIRI; JACKSON, 2003). Os resultados do presente trabalho sugerem que o isoxil é capaz de inibir uma suposta desnaturase esteroil-CoA delta 9 homóloga (valor de E= 2e252) encontrada no apicoplasto de P. falciparum. Além disso, o ISO não tem efeitos colaterais conhecidos (WANG; HICKEY, 2010) o que o torna altamente apropriado para uso clínico em humanos. O aspecto negativo do ISO e que ele tem um alto valor de logP de aproximadamente 5,8, que o faz virtualmente insolúvel em água com consequente pobre dissolução e biodisponibilidade quando administrado por via oral (WANG; HICKEY, 2010) O nitroxolina (sinônimo 5-Nitroxina) é um agente antibacteriano urinário que tem sido usado desde 1962 contra organismos gram-positivos e gram-negativos, comumente encontrados em infecções do trato urinário (BERGOGNE-BEREZIN, 1987). O mecanismo de ação sugerido é a quelação de íons metálicos vitais para o crescimento bacteriano (PELLETIER; PROGNON; BOURLIOUX, 1995). Mais recentemente, foi descoberto que a nitroxilina tem propriedades antiangiogênicas, que o faz útil como fármaco anticâncer (SHIM; MATSUI; BHAT, 2010). Nossos resultados indicam que a nitroxolina poderia interferir com uma suposta metionina aminopeptidase 1c encontrada no apicoplasto de P. falciparum, que é homóloga da enzima humana e supõe estar envolvida na proteólise dentro do apicoplasto. Notavelmente, a nitroxilina demonstrou excepcional atividade in vitro contra P. falciparum exibindo uma Dose Efetiva (ED50) de aproximadamente 63 nM em 48h pós exposição, um valor que reflete sensivelmente uma potência 10 vezes mais alta do que o sulfato de quinina neste mesmo estudo, sob as mesmas condições (SCHEIBEL; ADLER, 1981). Além disso, pelos resultados observados in vitro, a nitroxilina apresenta um logP de 1.9 o qual poderia favorecer sua habilidade de atravessar a membrana e alcançar seus alvos. Curiosamente, a avaliação da nitroxilina como um potencial antimalárico para uso clínico in vivo parece nunca ter sido investigado. Por essas razões, consideramos que a nitroxilina poderia ser priorizada para maiores avaliações de seu potencial valor como um fármaco antimalárico. 78 Por último, referimos ao sucralfato, possivelmente um dos fármacos de menor atividade antimalárica, em razão de não ser um agente anti-infectivo propriamente dito, mas um composto antiúlcera. O sucralfato é uma pequena molécula aprovada, basicamente formada de sulfato de sacarose e hidróxido de alumínio, administrada oralmente para a prevenção e tratamento de várias doenças gastrointestinais, incluindo refluxo gastroesofágico, úlcera gástrica e duodenal (REES, 1991). O sucralfato age, pelo menos parcialmente, através da inibição da pepsina A humana (JENSEN; JENSEN, 1992), na qual identificamos aqui ser homóloga a quatro plasmepsinas localizadas no apicoplasto: plasmepsina X, plasmepsina I, plasmepsina III, histoaspártico protease (HAP) e plasmepsina VII. Interessantemente, foi recentemente sugerido que o holofantrine inibe a plasmepsina X, um dos alvos previstos do sucralfato (FRIEDMAN; CAFLISCH, 2009). Devido a sua própria natureza terapêutica, o sucralfato tem baixa absorção gastrointestinal e, consequentemente, é improvável que alcance níveis terapêuticos sistêmicos em pacientes tratados por via oral. Entretanto, visto que o sucralfato está disponível na forma de pó ele poderia ser testado diretamente, após ser diluído em veículo apropriado, em modelos experimentais in vivo com via de administração além da oral, tais como a intravenosa ou intraperitoneal. Além dos fármacos discutidos acima, mais oito fármacos são previstos ser capazes de interferir com alvos do apicoplasto. Eles não foram discutidos em detalhes porque consideramos que algumas de suas propriedades intrínsecas poderiam torná-los menos adequados do que os agentes antimaláricos discutidos acima. Por exemplo, bleomicina, gemcitabina e nitrato de galium são três agentes antineoplásicos e por essa razão são mais prováveis causar efeitos colaterais/toxicidade em humanos em caso de uso direto. Sendo assim, embora os parâmetros de toxicidade do nitrato de galium não estejam disponíveis, considerável toxicidade é esperada para a bleomicina e gemcitabina. Em outros casos, tais como aqueles da rifabutina e etionamida, nós consideramos que o valor esperado (E-value) para a homologia do alvo é insuficientemente significante para inferir a previsão do alvo com um alto grau de confiança. O remikeren e aliskeren são dois agentes hipertensivos, por esta razão, a aplicabilidade a curto prazo desses fármacos como antimaláricos exigiria maiores desafios. 79 7 CONCLUSÕES GERAIS Utilizando as bases de dados TDR targets, Gene DB, TriTrypDB e PlasmoDB fomos capazes de identificar 94 genes relacionados ao metabolismo energético de Leishmania spp e seus produtos, bem como aproximadamente 600 genes e seus produtos do metabolismo geral do apicoplasto. A partir da sequência de aminoácidos de cada alvo, identificamos nas bases de dados DrugBank, Therapeutic Targets e Stitch fármacos aprovados para uso humano que atuassem seletivamente sobre os alvos de interesse. Nossa busca baseou-se no princípio similaridade do alvo de fármacos do metabolismo energético de Leishmania spp e do apicoplasto de P. falciparum. Para o metabolismo energético de Leishmania spp identificamos 44 alvos capazes de interagir com moléculas inibidoras e fármacos aprovados. Desse total, 33 alvos foram descartados por interagir com substância classificadas como nutracêuticas, utilizadas como suplementos energéticos. Os 11 alvos restantes demonstraram interagir com 15 fármacos aprovados para uso humano e que nunca foram usados para tratamento da leishmaniose. Para o metabolismo geral do apicoplasto, 72 alvos apresentaram interação com inibidores, dos quais 25 foram descartados por apresentar afinidade com suplementos dietéticos. Os demais 47 alvos foram positivos para fármacos aprovados e não aprovados e/ou em fase de testes. Desse total, 13 fármacos aprovados para uso humano demonstraram interagir com 15 alvos do metabolismo geral do apicoplasto. Nós enfatizamos que não temos evidências experimentais para sugerir que esses fármacos recém-identificados poderiam apresentar atividade antileishmania ou antimalárica e/ou afetar os alvos sugeridos. Além disso, é possível que sua efetividade in vivo pudesse ser comprometida por fatores, tais como: absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade ou por falta de afinidade química apropriada com seus supostos alvos. Contudo, triagens de fármacos in vitro poderiam fornecer insights na sua capacidade para inibir o crescimento do parasito e, se algumas dessas atividades reveladas forem promissoras, elas poderiam constituir importantes iniciativas para a descoberta de novos fármacos antileishmania e antimalárico. 80 8 REFERÊNCIAS ADAMS, C. P.; BRANTNER, V. V. Estimating the cost of new drug development: is it really 802 million dollars? Health affairs (Project Hope), v. 25, n. 2, p. 420–428, 2006. ALVAR, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS ONE, v. 7, n. 5, p. e35671, jan. 2012. AMATO, V. S. et al. Treatment of mucosal leishmaniasis in Latin America: systematic review. 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